Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЧИСЛЕННОСТИ МЕЛКИХ И КРУПНЫХ ФОРМ БАКТЕРИЙ В ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЕ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЧИСЛЕННОСТИ МЕЛКИХ И КРУПНЫХ ФОРМ БАКТЕРИЙ В ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЕ"

Л-4 £>5&3

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи АСФУР АБДУЛЬРАХМАН ЗИЯД

ь . УДК 631.427.2: 631.445.24

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЧИСЛЕННОСТИ МЕЛКИХ И КРУПНЫХ ФОРМ БАКТЕРИЙ В ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЕ

Специальность 03.00.07 —микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Диссертация выполнена в Московской сельскохозяйственной академии имени К. Л Тимирязева

Научные руководители — доктор биологических наук, профессор В. Т. Емцев, кандидат биологических наук П. И. Иванов.

Официальные оппоненты- доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник В. С. Гузев, кандидат биологических наук, доцент Н. П. Покровский.

Ведущее предприятие — Маучно-исследовательскии институт сельскохозяиственной биотехнологии, г Москва

Защита диссертации состоится , О . .

1992 г. в час на заседании специализированного совета

К 120 35 06 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А Тимирязева.

Адрес. 127550, г. Москва, И-550, Тимирязевская ул., 4 ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан «2.9» . СенКЯ€рЯ . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

Л. В. Моей!:.

' Актуальность проблемы. .Многие современные проблемы-оельского хозяйства не. могут быть преодолены бее понимания особенностей функционирования микроорганизмов в почве. К одной: из вадач почвенной, микробиологии относится решение вопроса о физиологическом состоянии бактерий, находящихся непосредственно в почве (Виноградский, 1952; Звягинцев, 1987).' Как было по, казано рядом исследований, многие виды бактерий m vitro ' способныобразовыватьклеткиудатрмвла.равмв^в.'Л. которые по ! физиологическим характеристикам принципиально отличаются от г крупных клеток (Щюзоровекийидр., 1981)/ Шло обнаружено, Î что в природных условиях некоторые бактерии так» существуют в : виде мелких форм (Новогрудский, 1933; Красильников. 1954). : Вели для водяой среда обитания ; микроорганизмов были , проведены. детальные исследования (Steburth et al., \ 1978; Мишустина, Батурина. 1984), то дляпочвы имеете» отрывочные данныэ о количестве и характере распространения микроформ и они в ряде слу-! ' чаев - имеют описательный характер (Красильников. 1934; Bas et ' al.. .1972; Ананьина, йпостин, .1979; Baooeru Olsen. 1087). Bo; лее точные представления о равмерах активно : функдаонируювдх ' бактерий в почве иодинамике численности шлюк\ююгЬк. ю»во-: лят по-новому подойти к актуальным биотехнологическим приемам • сельскоховяйственного производства.: : : :

/ дед работы. V Изучение динамики численности мелких форм бактерий в почве и в корневой зоне растений. -' Основные задачи исследования: \ i : . ; Г

' : " 1. Изучить 'возможность использования; питательной среды на . основе гидролизата бычьего .сердца:для решения задач почвенной

\ микробиологии;" ^.' - ,■ %;'..,'"•*'•„''•■''.''.''■'■'■' ■ "

2. В сравнении > с динамикой общей численности бактерий

. * ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сельскохоз. академии им. К. А. Тимирязева

Инв.

различных физиологических групп изучить динамику численности фильтрующихся форм в почве, ризосфере и ризоплане люцерны;

3. Изучить морфологию фильтрующихся форм бактерий я характер их распространения в почве.

Научная новизна. Впервые экспериментально показано, что большая часть активно функционирующих бактерий в почве представлена мелкими по размерам клетками. Показано также, что численность фильтрующихся форм бактерий в почве и их процентное количество в популяциях увеличивается в летний период"и снижается в зимнее время. Обнаружено, что за время вегетации растений численность мелких форм бактерий, за исключением оли-готрофов, увеличивается в ризосфере и снижается в риаопдане.

Практическая значимость. На основании полученных результатов рекомендуется питательная среда на основе гидролизах.* бычьего сердца для Ио иа экологии почвенных микрооргание мов. Материалы диссертации необходимо учитывать при разработке активных и стабильных бактериальных удобрительных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на

конференции молодых ученых МСХА им К. А Тимирязева (1Ô91), на

«

конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пушино, 1992) и на заседании кафедры микробиологии ЫСХЛ.

Публикации По материалам диссертации опубликованы две печатные работы

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, 5 глав результатов, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 15 о страницах машинописного текста, включая рисунков, / таблиц. Список литературы содержит2.2.4 названий, из них 1-2-5- зарубежные.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовали дерново-подзолистую хорошо окультуренную почву стационара МЗХА под посевами люцерны (Medicago sativa), а также микроорганизмы, выделенные из почвы, из ризосферы и ризопланы люцерны.

Методы исследования. Учет численности бактерий в почве, ризосфере и ризоплане производили методом Лосева на питательные среды по методике Е. S. Теппер (Теппер и др., 1987). Для разделения . почвенных бактерий на мелкие и крупные формы пользовались методом фильтрации черев мембранные фильтры (диаметр пор.0,22 мкм. Milliроге) на стерильных фильтровальных установок Зейтца под давлением 0.2 Атм. Из фильтрата готовили серию последовательных разведений для посева. • Анализ численности мелких форм бактерий в почве, ризосфере и ризоплане люцерны проводили одновременно с анализом общей численности бактерий. Посев производили на пять различных питательных сред: мясо-пептонный агар (МПА), крахмало-аммиачный агар (КАА), среду Эшби, почвенный агар (ПА) и среду, приготовленную на основе гидролизата бычьего сердца (ГБС). Первые четыре указанные сре-* ды готовили по стандартной.методике (Теппер и др., 1987). Питательная среда на основе гидролизата бычьего сердш (ГВО) была получена на предприятии по производству ,бакпрепаратов ИЭМ им. ; Е Ф. Гамалеи и имела следующий состав: ; 400 мл гидролизата ■бычьего.сердца; 400 мл мясной воды; 100 мл 10% свежего дрожжевого экстракта: \lPOv мл . водопроводной ' воды; NaCl - 0.52; arap-arap¿- 1.6*;.' Прямой счет бактерий % почве осуществляли о помощью люминесце нтномикроскопического метода. , Препараты для микроскопии готовили по стандартной:методике (Звягинцев и др..

1980) и просматривали под люминесцентным микроскопом ЛОМАМ-ИЗ. Подсчет численности бактерий производили в 3-х кратной повтор-ности. Результаты обрабатывали с помощью традиционных методов (Доспехов, 1972) и с использованием программ "StatgraT* и "Harvard Graphics" на компьютере IBM pc/xt. Изучение морфологии и ультраструктуры фильтрующихся форм бактерий проводили с

помощью электронной микроскопии. Для данного анализа использо-

2

вали почвенную суспензию (разведение 10 ), полученную после фильтрации через мембранные фильтры, то есть ту суспензию, ко-

• г

торую испольэовали для посева на питательные среды. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием и подготавливали, по стандартной методике (Уикли, 1975). Полученные образиы просматривали в электрод л микроскопе марки Hitachi-500.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Питательная среда на основе гидролизата бычьего сердца для учета численности и выделения почвенных бактерий

Неспособность традиционных питательных сред выделять и учитывать Почвенные бактерии со сложным метаболизмом может приводить"к ограничению наших представлений о характере функционировав микроорганизмов в почве. В связи с этим мы считали необходимым при работе с мелкими формами бактерий проверить возможность и целесообразность использования применяющейся в медицинских исследованиях питательной среды на основе гидролизата бычьего сердца (ГВС) для учета численности и выделения почвенных бактерий.

Выяснить возможность использования питательной среды ГВО

для решения традиционных задач почвенной микробиологии мы посчитали необходимым на основе изучения с ее помощью характера, динамики численности почвенных бактерий в течение года, в сравнении с- характером динамики, , полученным при посеве .на традиционные питательные среды - , мясо-пептонный агар (МПА) и почтенный агар (ПА). • " -•••/■Результаты ежемесячного в течение, года посева .образцов дерново-подзолистой почвы стационара МСХА на три указанные выше питательные среды,показали наименьшую численность бактерий

В декабре (Рис. 1): 4. ШО^кл/г почвы - МПА; 2.1х105кл/г - ПА;

■ $ ■■■■■■ - -■ ' ■ '

1;3х10 кл/г - ГБС.; Наибольшее, число бактерий наблюдалось в

■■■•-'■■'■•■■■• '-'-..■■''. а з

сентябре при посеве почвы на ГБС и ПА: 10 кл/г и 9.6x10

кл/г, соответственно. При посеве,на МПА максимум численности бактерий был зарегистрирован в октябре .- 2x107 кл/г почва

. Характер динамики численности бактерий в почве, или тенденции процесса, полученные как с использованием анализируемой среды ГБС, ; так и с помощью МПА и ПА, идентичны друг другу (Рис. 1). : Как видно из рисунка, три.различные питательные среды одинаково выявили повышенную численность бактерий в летний период и постепенное, практически с единой скоростью для трех сред, снижение этото показателя к зимнему времени,

. На оснований дааученного материала можно .-закатить, что использованная нами питательная среда на. основе' гидролизата бычьего сердца выявила характер сезонной динамики почвенных бактерий, соответствующий общепринятым представлениям, полученным методом- посева на традиционные питательные среды - МПА' и почвенный агар. ,

Для большей доказательности сделанного предположения нами было проведено сравнение характера динамики численности , поч-\

хЮ7 клеток/г почвы

а з * месяцу

— 1 -ь- 2 3

Рис.1. Тенденция ""'гмики численности бактерий в дерн во-подзояистоя )ве по -результатам посева на среды: ША (П, ГБС (2) и ПА (з1

им клеток/г почвы

месяцы

— | — ^ | | ^ ^ 0 ^

Рис.2. Динамика численности бактерий в дерново-попэо-листой почве по результатам посева на МПА ПА (3) и прямого счета (4)

венных бактерий по посеву на среды ГБС, МПА и ПА с динамикой численности, определенной прямым счетом с помотаю люминесцентной микроскопии. .

Были получены следующие результаты (Рис. 2). Микроскопически установлено достоверное снижение общей численности поч-

<? 9

венных бактерий с уровня 6.2x10 кл/г почвы (апрель) до 2.5x10 кл/г почвы (май), ватем восстановление первоначального значения (ишь) и к октябрю повторное снижение численности до 2.4х1С? кл/г почвы.

Посевом на плотные питательные среды в эти же сроки зарегистрирована следующая динамика: 8а первые три месяца анализа на среде МПА не установлено достоверных изменений численности 8х105кл/г почвы; на ПА и среде ГБС получена одинаковая тенденция динамики численности бактерий - снижение численности в 6-7 раз и последующее ее возрастание до начального уровня - 2x101 кл/г почвы. . к октябрю отмечено единое для питательных сред снижение численности бактерий до уровня Ю^кл/г почвы.

Как видно из рисунка 2, характер динамики численности бактерий в почве, определенный по посеву на МПА, не соответствует характеру динамики, полученному прямым счетом. Тогда как закономерности, выявленные с помощью почвенного агара, среды ГБС и микроскопии полностью совпадают.

Свойства питательной среды на основе гидролизата бычьего сердца были ■ также проверены при изучении: динамики численности микроорганизмов в ризосфере и ризоплане растений люцерны..

Выявленные особенности питательной среды на основе гидролизата бычьего, сердца свидетельствуют о целесообразности ее .использования для изучения экологии почвенных'микроорганизмов и - получения оригинальных результатов. : • • ,

2. Сравнительный анализ численности мелких и крупных форм почвенных бактерий

При анализе общей численности бактерий в образцах дерново-подзолистой почвы были получены следующие результаты

(Рис.3). Максимальные величины были получены в сентябре: на

7 7

МПА - 2. ЗхЮ кл/г почвы, на среде КАА - 3 5x10 кл/г; на среде 7 8 t

Эшби - 2.4x10 кл/г; на среде ГБС - 1X10 кл/г; на ПА - 9.6х10г

кл/г почвы. Минимальные значения (5или получены в декабре на

всех средах, за исключением среды Эшби, на которой минимум

численности был отмечен в марте. В абсолютных величинах данное

положение выражается следующим, на МПА - 4.1x10 кл/г почвы; на

среде КАА - 6.2x10 кл/г; на среде Эшби - 4.2x10 кл/г; на среде ó

ГБС - 1.3x10 кл/г; на Ü' " 1,10 кл/г почвы.

Посев почвы после фильтрации через мембранные фильтры показал, что на все использованные питательные среды высевается большое количество мелких клеток бактерий (Рис. 4). *Их числен* ность колеблется в широком диапазоне значений в течение года. Наибольшее количество фильтрующихся форм на всех питательных

средах, эа исключением МПА, было обнаружено в сентябре (на

? Т-

среде КАА - 5x10 кл/г почвы; на среде Эшби - 2.6x10 кл/г; на

среде ГБС - 4x10* кл/г; на ПА - 3.4х10?кл/г почвы). На МПА

максимум численности мелких клеток был получен в августе и

составил 3.7x10* кл/г почвы. Минимальные значения численности

фильтрующихся форм бактерий были отмечены в марте на средах:

МПА (7.Qxio'' кл/г почвы). КАА (6.9хю'' кл/г), Эшби (4.6x10^

кл/г), в апреле на среде ГБС (1.1x10 кл/г) и в декабре на поч-$

венном агаре (3.6x10 кл/г почвы).

Полученные результаты обнаружили, что в некоторые сроки

хЮ клеток/г почвы

мвсявд

... ■! Шг @з Н4 вШВв

Рис.3. Числеиностьбактерийв дерново-подзолистой почве ■

хЮ клеток/г рочвы

10 ■ 11 12 1 2 .-■ Э 4 '.. месяцы

М1 Нг. ЕПЗз Вб

Рис.4. Численность мелких форе бактерий в дерново-попзо-

численность бактерий, высеваемых после фильтрации, маю численности, получаемой по посеву без фильтрации. Так. результаты посева почвы на среду МПА после фильтрации в августе превышают результаты посева того же образца почвы до фильтрации в 7. Б раз. Посевы после фильтрации на среды ГБС и почвенный агар в декабре и на среду КАА в сентябре имеют превышение над общим посевом в среднем в 1.5 раза, а на среде Эшби в октябре првы-шение составило 2.5 раза

Сравнивая результаты посевов до и после фильтрации можно отметить, что на некоторых питательных средах имеются совпадения по периодам максимальной и минимальной численности бактерий. Одновременный всплеск обшей численности и числа межр* клеток подучен на всех, \>э МПА, средах в сентябре. Шиш-ыальные значения совпадают только по результатам посевов на среду Эшби (март) и на почвенный агар (декабрь).

По полученным результатам нами* были расчитаны тенденции

«

динамики численности бактерий. Сказалось, что тенденции процессов, полученные по результатам посевов до и после фильтрации почвы, имеют схожий вид. В обоих случаях имеется постепен-йое снижение численности бактерий при переходе от летнего периода времени к зимнему. Показано, что скорость уменьшения численности бактерий по всем питательным средам практически одинакова, что выражается единым углом наклона линий, отражающих тенденцию процесса.

Для выяснения количественной доли мелких форм в почве нами было расчитано их процентное количество от обдай численности бактерий. Такое процентное выражение не лишено погрешности, так как часть колоний, вырастающих после фильтрации, как было нами обнаружено, не развивается при посеве почвы без

'■■-... ' - 11 "

фильтрации. Очевидно, полученный процент имеет завышенное значение, однако данное допущение необходимо принять, так как ив полученных результатов не представляется, возможным выяснить величину ошибки.

Как видно из рисунка Б, доля ультраформ от общего числа почвенных бактерий высока и колеблется в широком диапазоне значений за исследуемый период времени. В летние и осенние месяцы, то есть! в теплый период года, в среднем больше 50Х бактерий имеют в почве ультрамалые размеры. В отдельные месяцы некоторые физиологические группы представлены, в.основном, фильтрующимися формами. Это обнаружено для бактерий, высеваемых на среде КАА в сентябре, на среде Эшби в сентябре и октябре, на средах ГВС и почвенном агаре в декабре. В холодное время года и в первые весенние месяцы основная масса бактерий представлена в почве крупными формами и доля мелких клеток составляет несколько процентов (Рис.5). Тагам образом, в течение года имеется тенденция к снижению к вимнему времени доли мелких клеток в общей массе почвенных бактерий. Из всех использованных,питательных сред следует выделить почвенный агар, на котором доля мелких форм от общего числа учитываемых на этой среде бактерий хотя и снижается к холодному периоду времени,: но в меньшей степени, чем на других средах.

: 3. Сравнительный анализ численности мелких н крупных форм бактерий в ризосфере лшерны '^;

При анализе еобщей численности бактерий в образцах ри-'эосферной.почвы были получены следующие-'.результаты (Рис. б). Как видно из рисуяка, в течение 'анализируемого периода коли-

0'« Ч месяцу

£ Vi-t X 1«

числа бактерии »,дерново-поязолистой neWfe nö посеву на МПА (I), КАА (%)* Эшби (3\ ГВС (4) и ПА (6)

■ i Шг ЕИз ШШ* Рис.5. Процентное количество фил'.труицихся

Рис.6. Численность бактерия в ризосфере люцерны по ре-

Рюв?4)ни те(2)-

чество клеток бактерий колеблется в широком диапазоне значений в зависимости от времени и от использованной питательной среда На средах КАА, Эшби и ПА минимальные значения были получены в сентябре и составили 3. Бх107кл/г почвы, 3. 4хю' кл/г и 1.2х1(Г кл/г почры, соответственно. На МПА минимальное количество клеток обнаружено в июле (1.1x10*кл/г), на ГБС в августе (3. 4хЮ7кл/г). Максимальные значения были получены в июле на всех средах, за исключением МПА, и составили: 4.2x10 кл/г почвы (КАА). 2.6хЮ? кл/г (Эшби). 6.7х107кл/г (ГБС), 6.9x10*кл/г (ПА). На МПА максимальное количество бактерий было обнаружено в сентябре и составило 3.2хЮ7кл/г почвы.

Посев риэосферной почвы на питательные среды после фильтрации показал, что количество фильтрующихся форм варьирует в зависимости от времени анализа и от выбранной питательной среды (Рис.7). На средах МПА. КАА и Эшби минимальные значения были получены в июле и составили 5.1x10 кл/г почвы. 2. Зхю'кл/г б

и 1.6x10 кл/г. соответственно. На среде ГБС наименьшее количество ультраформ было учтено в августе (3.2x10** кл/г), а на

€

почвенном агаре - в сентябре (6.6x10 кл/г почвы).

Максимальные аначения численности мелких форм бактерий

б

были отмечены в сентябре для сред МПА. Эшби и ГБС (5.3x10 кл/г 6 1

почвы, 4.2X10 кл/г, а8x10 кл/г почвы, соответственно) и в августе для сред КАА и ПА (2.8x10 кл/г почвы, 3x1-л/г почвы).

Сравнивая результаты общего посева риэосферной почвы с численностью мелких форм, можно отметить, что на некоторых питательных средах имеются совпадения по времени максимальных и (или) минимальных значений. Так, на среде МПА по ультраформам и по обшему посеву минимум отмечен в июле, а максимум - в сентябре. На средах ГБС и ПА совпадают только минимальные значе-

Рис.7. Численность мелких форм бактерий вризос<!

¿те, тт* г <гда;

______; г~пя

Рис.в. Прожитков количество числа бактерий в ризоо среда: МПА а), КМ (2

, ..осяцы •

мльтрующихся форм ОТ 9бВ(вГО ере лчцерны по посеву иа .'Эшби (3), ГБС (4),ПА(5)

Пия На средах КАА и Эшои выявлена обратная зависимость, так как минимальные значения по ультраформам совпадают по времени с максимальными значениями по сбшему посеву, и, наоборот, максимальные величины по ультраформам совпадают с минимальными по общему посеву.

Указанная особенность свидетельствует о неодинаковом характере динамики численности бактерий, учитываемых на различных питательных средах в ризосфере люцерны, что отличает эту среду обитания от почвы по закономерностям развития бактерий. Более четко это положение демонстрируется расчитанными на компьютере тенденциями динамики численности бактерий. Показано, что постоянным остается направление тенденции динамики численности как мелких форм, так и общей численности бактерий, учитываемых на почвенном агаре и на МПА. и в том, и в другом случае в течение вегетации растений численность бактерий на МПА возрастает, а на почвенном агаре снижается. На средах КАА, Эшби и ГВС в течение вегетационного периода растений выявлена тенденция к снижению общей численности бактерий, тогда как количество ультраформ, учитываемых на этих средах в ризосфере, возрастает. Особо следует выделить питательную среду на основе гидродиаата бычьего сердца. На этой среде обиес количество бактерий, хотя и незначительно, но снижается Тогда, как численность мелких форм имеет ярко выраженную тенденцию к резкому росту в течение анализируемого периода

Важным дополнением к выявленным особенностям может служить рисунок 8, на котором показано процентное количество мелких форм от общего числа бактерий. Как видно из рисунка, Минимальная и максимальная доля мелких клеток от общего числа бактерий была выявлена в одни и те же сроки для всех питательных

* 16 - "/. : ;/ ■ ''.•'." " ' " сред: минимальная количественная доля в июле (МПА - 4.642; КАА ; - 54.76Х; Эшби - 6.15Х; Г0С - 6. 72Х; ПА - 20.' 29Х), а максимальная доля - в сентябре (МПА - 16.562; КАА - 74.Й9Х; Эшби - ; 42.42X1 ГБС - 71.7%; ПА - 762). *..:_■ .V!'V •

Также видно, что наименьшее число мелких клеток в ризосфере люцерны учитывается на среде МПА (не более 20% :■ от об- V щего числа клеток)^ На среде ГБС зто-r показатель в течение первых двух месяцев анализа не превышал нескольких процентов, а в сентябре составил 72Z. Большой процент ультраформ был получен на ПА в августе - 722, однако в июле он снизился до 212. Из всех питательных сред следует выделить КАА агар^ на котором . количественная доля мелких форм не "снижалась нияда 54Х, - а в августе и сентябре их количество составило 752. *.

. Однако, вне зависимости ог количества мелких клеток, учи1 * тываемя на той или иной среде, на всех питательных субстратах . была выявлена тенденция к росту количественной.доли v фильтрую-воюя форм бактерий в течение вегетационного периода растений. :

На основании отмеченных особенностей можно сделать предположение, что растения в; процессе вегетации соадаиг в ри-эосферной области усжжяя^'' стюотимгпдол'мдоодо бактериальных клеток.

. 4. Сравнительный анализ численности мелких и крупных . • V',';- •','_' форм бактерий в ризоплане люцерны , , ; • bf '; -' ■

При анализе обвой численности бактерий в ризоплане люцер- ■ ны были получены следующие результаты (Рис. 9). . Как видно из' '.', . рисунка, в течение анализируемого периода,', количество ; клетск •'. бактерий колеблется в широком диапазоне значений. На 1 средах ,

МПА, Зшби и ГВС минимальные значения численности бактерий оыли

Ц и

полнены в сентябре и составили Г<хЮ кл/см ко~"ей, 1.7x10 и

кд/см, 2.3x10 кл/см, соответственно. На средах КАЛ и ПА наи-

и

меньшие значения получены в августе и составили 1x10 кл/см на

обоих средах. Максимальные значения обнаружены в ию/с на сре-

5 5

дах КАА (1.2x10 кл/см) и Эш0и-(1.3хЮ кд/см), ь августе н* 5

средах МПА (1.2x10 кл/см) и ГБС (1x10 кл/см), в сентябре на почвенном агаре (б 7x10^ кл/см корней).

Посев на питательные среды водной суспензии ризопланотк бактерий после С-ильтрации показал, что количество фильтрун>-шихся форм также варьирует в широком диапазоне значений (Рис.10). Минимальные бначения численности фильтрующихся форм

на питательных средах МПА, ЭшОи и ГБС отмечены в сентябре

3 ч ч

(3 9x10 кл/см корней; 1.5x10 кл/см и 1.7x10 кл/см. соответственно). На средах КАА и ПА минимальные значение получены

V 3

в августе (6.7x10 кл/см и 7.9x10 кл/ом, соответственно).

Максимальная численность мелких клеток в ризоплане люцерны была получена в июле на всех питательных средах, за исключением

Ч • ц

почвенного агара, и составила. МПА - 1. ьхЮ кл/см, КАА - 5x10

Ч ч

кл/см, Эшби - 5.3x10 кл/см, ГБС - 5 бхЮ кл/см корней На гоч-

венном агар-г максимум численности был получен в сентябре и составил 5.2х1С^кл/см корней.

Сравнивая результаты общего посева с результатами посева после фильтрации можно отметить, что на каждой .итательной среде имеется полное совпадение по времени минимальных значений общей численности бактерий и мелких клеток. Максимальные значения совпадают только на средах КАА, Эшби и ПА

Важной выявленной особенностью ризопланы, как места обитания бактерий, отличающей ее от ризосферы, является то, что

650

в

месяцы

* „ „ Нг ЕШз ШЗа -

гйс.9. Численность бактерий в ризоплане люцерны по та™* посева на срэды: НПА (I), КАА (2), Эшби ГШ (4) и ПА (5)

ль-

60 50 8 6 Ч 2 0

хЮ^ клеток/см корней

Щ

"Р

г—ЩЯ И ■ шш ш

а1 - В1«! Г"Г 1 т! м

V »1 Ц •14« Ш1:: Щя ЕЙ]

: в Г~1г

8 '■ месяцы

Рис.10. Численность мелких форм бактерий в ризоплане

"церны по результатам посева на среды: МПА (I), ■ УшбиЛЗ), ГБС (4) и НА (5Г -

полностью совпадает на всех питательных средах характер динамики как общей численности бакгерий, так и численности филь трующихся форм На средах МПА, КАА, Эшби л ГБО регистрируется тенденция к снижению общего количества бактерий и количества мелких клеток в процессе вегетации растений На почвенном агаре в обоих случаях выявлена тенденция к увеличению численности бактерий за тот же период времени

Для фильтрующихся форм обнаружено, чхо на средах Эшби, ГБС и КАА регистрируется одинаковая скорость снижения численности бактерий На средах ЗшОи и ГБС определяется также одинаковое усредненное количество мелких клеток Нл. среде МПА численность фильтрующихся форм убывает с меньшей скоростью, а также выявляется в среднем в три раза меньше клеток, чем на других рассмотренных питательных средах.

Дополнительную информацию о влиянии растений на образование мелких бактериальных клеток в ризоплане люцерны представляет рисунок 11 , на котором показано количество фильтрующихся форм в процентах от общего числа бактерий на всех испмьзован-ных питательные средах Как видно из рисунка, минимальная количественная доля мелких клеток была выявлена в июле на питательной среде Эшби (40.77%), в августе на средах МПА (10 84Х) и ГБС (32X). в сентябре на средах КАА (10 79%) и ПА (7.76Х). Максимальная доля мелких клеток была выявлена р "юле на среде МПА (26 67Х), в августе на средах КАА (67%) и ПА l 9%), в сентябре на средах Эшби (88 24%) и ГБС (73 91%) На средах МПА, КАА и ПА обнаруживается тенденция к снижению количественной доли мелких клеток в течение вегетационного периода растений На средах МПА и КАА отмеченная тенденция совпадает по направлению с тенденцией динамики общей численности бактерий и филь-

х

100 I-

7 8 9

__месяцу

МП НЗг СИ з ■Ич ШИЭб Рис.II. Процентное количество фильтрующихся форм от • общего числа бактерий в,риэоплане люцерны по посеву на среды: МПА (I), КМ (2), Эшби (3)" ГВС (4), ПАД5)

трующихся форм. На почвенном агаре выявленное■ снижение доли мелких клеток происходит при одновременном увеличении обвдай численности бактерий и количества мелкихклеток, учитываемых на этой питательной среде. На средах Эшби и.ГБС регистриоуется тенденция к увеличению доли фильтрующихся форм в обвей кассе бактерий ризопланы, в то время, как общая численность бактерий и количество мелких<клеток ва тот же период времени на этих средах снижается. ■ , . , * -т

Из полученных; pieзyльтaтoв следует. что мп :гльный процент фильтрующихся форм регистрируется в то время, когда, численность всей бактериальной массы в риэоплане достигает максимальных значений (на всех питательных средах, кроме КАА). С другой стороны, период максимальной количественной доли мел-.

ких клеток совпадает с периодом минимальной численности бактерий (на всех средах, кроме ЫПА).

Отмеченная закономерность, вероятно, связана с наличием определенных механизмов регуляции численности мелких и крупных клеток в ризоплане растений, однако, по нашим данным не представляется возможным дать объяснения этому эффекту.

6. Электронно-микроскопический анализ фильтрующихся форм почвенных бактерий

Из полученных результатов следует, что основное количество фильтрующихся через мембранный фильтр клеток имеет размеры, лежащие в интервале О. 3-0.7 мкм. Следующими по частоте встречаемости являются клетки с размерами от О 3 до 1.0 мкм однако, бактерии, относящиеся ко второй группе, имеют вытянутую форму и в поперечном сечении имеют размеры 0.3-0 7мкм, что характерно для первой группы организмов. Встречаются также единичные клетки с размерами до 1.2 мкм и 2,5 мкм, но в поперечном сечении их размер не превышает О 8 мкм Среди всех просмотр чьых под микроскопом тонких срезов было выявлено два образца, на которых обнаружены крупные клетки. Одна из них имеет размеры 1.5x1.75 мкм, а другая 1,6x1.2 -м Однако, наиболее крупная клетка лишена регидной клеточной стенки и ее проникновение через поры фильтра возможно за счет "протекания" жидкой клеточной массы, окруженной эластичной цитоплаэмати-ческой мембраной.

Многие обнаруженные мелкие бактерии имеют полноценную клеточную стенку. Выявить клеточную стенку или сысать ее состояние на других образцах не представляется ьозможным из-за

- 22 - ;-/■ " •" недостаточного для этого качества препаратов. Ухудшение фиксации биологических объектов произошло . из-за наличия органического материала почвы, прочно закрепленного на поверхности бактериальных клеток.

В некоторых мелких бактериях выявляются внутриклеточные , включения липидов, возможно,: полибетаоксимасляной кислоты, а также включения полифосфатов, которые свидетельствуют, что данные бактерии либо находятся в стадий активного роста и накапливают запасные вещества, либо находились в таком физиоло-. гическом состоянии незадолго до фиксации препаратов.

В пользу физиологической активности мелких форм в почве ' говорит также тот факт, что на всех препаратах обнаруживается , только микроколониальный характер их распространения. .

С помощью электронной микроскопии удалось также выявить важную особенность существования микроформ в почве. На всех препаратах мелкие. клетки находятся в сорбированном состоянии ; на поверхности почвенных частиц или они погружены в почвенный органический раствор. '-*-.■■■*.,:, .' ;

В ряде работ.было показано, что в почве основная масса-бактерий имеет размеры меньше 1 мкм и только несколько процен- . тов клеток превышает эту величину (Никитин, 1964; Bae et al., 1972;: Balkwill; Casida, 1973; Ананьина, Никитин, 1979), Одна' ; ко, из наших результатов следует,- что,' - дейстгьт--~-«оу в ряде . случаев бактериальные популяции состоят,- в основном, из,мелких ' меток, но,, например, в зимний период времени их. доля может ; составлять единицы процеггчзв. . ; ./

Существуют различные точки зрения на экологическое значе- ' ние ультраформ (Ананьина, Никитин, 1979; Koch, 1979; Marita, •

1982, 19й5; Ъшустина, Батурина, 1987). Обнаруженные нами значительные всплески численности фильтрующихся форм, а также йикроколониальный характер их функционирования, могут быть Косвенным доказательством в пользу того, что мелкие формы яв-хлятся активной частью популяции почвенных бактерий.

Из экспериментов с чистыми культурами известно, что в корневой зоне растений усиливается образование мелких клеток ризобий и азотобактера (Красильников, 1934, Игнатова, ЮЬО, Urban. Dazzo. 1Q82; Ballesterob et al. , 1S56). Полученные в нашей работе результаты показали, что растения в ризосферной области стимулируют образование мелких Форм у всех изученных физиологических групп бактерий, но по мере приближения к поверхности корней начинает проявляться избирательность

ВЫВОДЫ

1. Большая часть бактерий, активно функционирующих в лоч-ве и в корневой воне растений, имеет ультрамикроскопу,чески малые размеры Их численность колеОлется а широких пределах в зависимости от физико-химических условий среды обитания.

2. Численность фильтрующихся форм в почве, а также их процентное количество от обшэго числа бактерий, увеличиваете» в летнее время и снижается к зимнему периоду. Показано, что некоторые популяции почвенных бактерий в ряде с-""аев состоят в основном из мелких клеток.

3 В ризогфере люцерны за период вегетации увеличивается количество мелких форм всех изученных групп бактерий, за исключением олиготрофов. На всех использованных питательных средах обнаружено увеличение количественной доли Фильтрующихся

'■■ ' •"> ' ' . '' •■-: - 24 " ',.'" '■ > " • : - V -■"' 4

клеток в общей массе, бактерий ризосферы ва время вегетации растений. - • . ••. V .VЛ'.'.- /'.*/

4. В ризоплане люцерны за период вегетации снижается количество мелких клеток всех.изученных групп бактерий,■ за иск- . лючением олиготрофов, численность- которых возрастает. .При. . этом, количественная доля фильтрующихся форм в популяциях оли-; гонитрофилов и бактерий, выделяемых на^ среде ГВС, увеличивается. '" '-. ; ■ "-'.■•-.■••. .'--_ ,. •■■• / 5/ Показано, что'¡после фильтрации .почвенной суспензии через мембранные фильтры в некоторые сроки выделяется-больше ; бактерий, чемпри посеве на питательные'среды без фильтрации. : 6. Питательная среда на основе- гидролизата бычьего сердца сравнима с традиционными питательными средами по способности ' выявлять обшие закономерности динамики почвенных бактерий, , но^ позволяет выделить относительно бо'льшее их количество й обна- . руживает важные'особенности динамики -численности бактерий в корневой зоне растений, что делает целесообразным ее испольэо-;, вание для изучения экологии почвенных микроорганизмов и для ; Сиотехнологических целей. • ' -■'/".'■ *- . ■ - '

По теме диссертации опубликованы следующие работы: ; .

1. Асфур 3., Панчишкина М. Е , Иванов П. И. Сравнение дина-; мики численности бактерий дерново- подзолистой почвы,;. учитывав- , мых лшинесцентно-микроскопическим методом и посевом на раз-: личные питательные среды//Тезисы докл.- 1У Всес. конф. "Микро- > организмы в сельском хозяйстве'*,. Пущино, 1992,' с. ' 16. .. • , •

2. Панчишкина Ы. Б., ■ Асфур 3., Иванов П. И. Сценка динамики бактериального комплекса дерново-подзолистой почвы с йомошью -интегрального показателя// Шкробиология (в печати); С' • ■

Объем 1 '/г п л

Заказ 1455

Тираж 100

Типография Московской с * академия ни К А Тимирязева 127550, Москва И 650, Тимирязевская ул, 44