Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование генетических методов лабораторной диагностики классической чумы свиней

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование генетических методов лабораторной диагностики классической чумы свиней"

LY

На правах рукописи

Для служебного пользования №10 дсп от 23.02.2000 г. экз.

УДК 619:616.98:578.833.31:616-076

БЕЗБОРОДОВА Светлана Владимировна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

03.00.Об - "Вирусология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир -2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных Минсельхозпрода России.

Научный руководитель: - кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник ДРЫГИН В.В.;

Научный консультант - доктор ветеринарных наук, профессор,

член-корреспондент РАСХН ГУСЕВ A.A.

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук, профессор,

ДУДНИКОВ А.И. (ВНИИЗЖ, г. Владимир);

-доктор биологических наук, ЦЫБАНОВ С.Ж. (ВНИИВВиМ, г. Покров);

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ВНИиТИБП)

Защита диссертации состоится " 18 " апреля 2000 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 120.60.01. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных Минсельхозпрода России по адресу: 600900, г. Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ.

Автореферат разослан " 14 " апреля 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Семенова Г.М.

t

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Классическая чума свиней (КЧС) - высококонтагиозная инфекционная болезнь группы А, характеризующаяся многообразием клинических форм и проявлений. Возбудителем заболевания является вирус, принадлежащий к роду Рез1мги5 семейства Р1аумгМае (Ногапек М.С.,1991).

КЧС длительное время регистрируется в России. В прошлом наблюдалось несколько периодов активизации этой болезни с последующим снижением интенсивности (Семенихин А.Л. и др., 1994). Наблюдается ее широкое географическое распространение. КЧС регистрируется практически во всех экономических регионах страны (от Калининграда до Дальнего Востока и от Архангельской области до Краснодарского края). В настоящее время классическая чума свиней занимает по актуальности одно из первых мест в инфекционной патологии свиней и считается для стран с интенсивной системой свиноводства одной из экономически значимых болезней, а в ветеринарно-санитарном плане - одной из наиболее трудно ликвидируемых эпизоотий (Куриннов В.В. и др.,1992). В связи с широким использованием профилактической вакцинации увеличилась частота случаев хронической, персистентно протекающей КЧС, бессимптомных и атипических форм течения болезни, при которых постановка диагноза по клиническим признакам и патоморфологичесхим изменениям затруднена и требуются дополнительные лабораторные исследования (Вишняков И.О. и др.,1994). В связи с широким применением живых вакцин и одновременной циркуляцией полевого вируса лабораторная диагностика общепринятыми средствами - методом флуоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментным анализом (ИФА) весьма проблематична (Куриннов В.В. и др., 1999). Для дифференциации штаммов по биологическим свойствам требуются дополнительные дорогостоящие опыты по постановке биопробы, которые являются длительными и не всегда эффективными. Применение методов МФА и ИФА для прямого обнаружения вирусного антигена осложняется не только неспособностью дифференцировать вакцинные штаммы и полевые изоляты, но и вируса КЧС от родственных пестивирусов - вируса диареи крупного скота (ВДКРС) и вируса пограничной болезни овец (ВПБО), инфицирующих свиней в естественных условиях. Такие случаи могут ошибочно диагносцироваться как

КЧС, со всеми последствиями, предусмотренными ветеринарным законодательством и экономическими потерями в свиноводстве. Быстрая и точная постановка диагноза в случае такого высококонтагозного заболевания, как КЧС, является ключевым этапом в ликвидации болезни. Перспективным направлением в этом плане является использование метода полимеразной цепной реакции ■ (ПЦР), основанного на амплификации участка вирусного генома с использованием специфических праймеров и термостабильной ДНК-полимеразы (Lin S.T. et al.,1991). Совершенствование генетических методов лабораторной диагностики КЧС позволяет не только улучшить чувствительность и специфичность, но и существенно ускорить процедуру анализа образцов. Определение и сравнительный анализ первичной структуры фрагмента генома, характеризующегося высокой степенью вариабельности, является наиболее точным критерием дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов, а также предоставляет возможность изучения генетической вариабельности вирусной популяции. Данные о первичной структуре пестивирусов позволяют выявить как консервативные, так и высоковариабельные фрагменты генома, и на основе этих данных разработать тест-систему индикации-дифференциации пестивирусов и метод дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов ВКЧС.

В связи с тем, что Россия относится к числу стран, проводящих плановую вакцинацию против КЧС (как правило, живыми вакцинами), вопрос дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов является весьма актуальным. ,••■

Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы являлась разработка метода индикации- дифференциации пестивирусов и штаммовой дифференциации ВКЧС, а также изучение генетической вариабельности между штаммами. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анализ первичной структуры генома пестивирусов 'и разработать тест-систему, позволяющую проводить:

а) детекцию рода пестивирусов; б) видовую детекцию представителей рода (ВКЧС, ВДКРС, ВПБО).

2. На основе нуклеотидного секвенирования вариабельной области гена Е2 разработать метод идентификации вируса КЧС, позволяющий дифференцировать вакцинные штаммы от полевых изолятов.

3. Провести анализ нуклеотидной последовательности вариабельной области гена Е2 вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса КЧС и изучить возможности рестрикционного анализа для их дифференциации.

4. Сравнить первичные структуры антигенно-значимой области гликопротеина Е2 полевых изолятов и вакцинных штаммов, применяемых на территории России, и оценить разрешающую способность метода.

Научная новизна исследований. Впервые определена нуклеотидная последовательность различных частей генома (5'-нетранслируемого региона -5'-МСЯ, 5'-фрагмент Е2, З'-фрагмент Е2) полевых изолятов вируса КЧС, выделенных на территории России в течение 1994-1999 гг., применяемых вакцинных штаммов и вирусов-контаминантов культур клеток. Определена принадлежность отечественных изолятов к различным геногруппам. Показана возможность дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов ВКЧС методом рестрикционного анализа продуктов ПЦР, полученных с ВКЧС-специфичными праймерами. Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей генома ВКЧС различных штаммов и изолятов.

Практическая значимость исследований. Разработана тест-система индикации генома пестивирусов на основе ПЦР, позволяющая выявлять геном всех известных представителей рода пестивирусов, как при моноинфекции, так и при смешанной инфекции, в различных вируссодержащих образцах в течение 4-6 часов.

С использованием данной тест-системы предложен метод анализа контаминирования лестивирусами культур клеток и серий сывороток крови КРС, используемых в производстве вакцин.

Разработан метод, позволяющий определять первичную структуру вариабельной области гена Е2, и на основе сравнительного анализа этих данных проводить дифференциацию полевых изолятов от вакцинных штаммов и идентификацию вновь выделенных изолятов ВКЧС.

С использованием разработанного метода проанализирована генетическая вариабельность 18 изолятов ВКЧС, выделенных на территории

России в 1994-1999 гг., 4 изолятов пестивирусов, выделенных в культурах клеток и 11 вакцинных штаммов ВКЧС.

На основе полученного банка данных первичных структур российских полевых изолятов и вакцинных штаммов разработан метод дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов рестрикцией продуктов ПЦР.

Разработанный "Метод индикации и дифференциации штаммов и изолятов вируса классической чумы свиней" одобрен ученым советом, прошел комиссионную апробации, утвержден директором ВНИИЗЖ и Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, и в настоящее время используется в практической работе. Публикация научных исследований.

По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на научно-практической конфереции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" ВНИИЗЖ, г.Владимир (1995г.), научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве и ветеринарии" г. Москва (1996г.) и на XI Конгрессе вирусологии, г. Сидней, Австралия (1999 г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 89 страницах

машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор

литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их

обсуждение, заключение и вывода. Список литературы включает 124

(

источника. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 13 таблицами и содержит приложения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Тест-система индикации пестивирусов на основе ПЦР, позволяющая выявлять и дифференцировать геномы всех представителей рода (вируса классической чумы свиней, вируса диареи крупного рогатого скота и вируса пограничной болезни овец).

2. Метод штаммовой дифференциации вируса классической чумы свиней (а также вируса диареи крупного рогатого скота и вируса пограничной болезни овец), основанный на определении и сравнительном анализе первичных структур фрагмента вариабельной области гена Е2.

3. Экспресс-метод дифференциации вакцинных штаммов вируса классической чумы свиней и полевых изолятов на основе рестрикционного анализа продуктов ПЦР.

4. Банк данных нуклеотидных структур генома полевых изолятов вируса КЧС, выделенных в России в 1994-1999 гг., вакцинных штаммов вируса, пестивирусов-контаминатов культур клеток.

СОБСТВЕННЫЕ ПССЛЕД01ШШЯ Материалы и методы Вирус классической чумы свиней.

В работе были использованы 18 полевых изолятов ВКЧС, выделенных в течение 1994 -1999 гг., 11 вакцинных штаммов и 4 пестивирусных штамма, выделенных из культур клеток ППК и РК-15. Вирус диареи КРС.

Референтные штаммы ■ ВДКРС, полученные из Nc !onal Veterinary Service Laboratories (США) и Instituto Zooprofilattico Sperimentale (Италия), а также штаммы, которыми были контаминированы культуры клеток FLK, ПО-2, МДВК. Вирус пограничной болезни овец¿

Референтные штаммы вируса ПВО, полученные из Instituto Zooprofilattico Sperimentale (Италия).

Выделение суммарной РНК из различных вируссодержащих материалов осуществляли, используя модифицированный метод Chomczynski et al. (1987), с помощью набора реактивов RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, США).

Комплементарную ДНК на вирионной РНК синтезировали с использованием РНК-зависимой ДНК-полимеразы (Piomega, США).

Полимеразную цепную реакцию проводили в программируемом амплификаторе РТС-100 TermoCycler (MJResearch Inc., США). Продукты ПЦР очищали с помощью набора реактивов PCR Preps DNA Purification Kit (Promega, USA).

Секвеиирование кДНК. Нуклеотидную последовательность исследуемых фрагментов генома определяли методом Сэнгера с использованием набора f-nnol DNA Sequencing System (Promega, США).

s

Компьютерный анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием пакета прикладных программ Seq Progs, версия 1.0 (N.J.Knowles).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование профиля вариабельности и теоретический расчет праймеров для создания тест-системы индикации лестивирусов

Определение участка генома, наиболее подходящего для штаммовой дифференциации вируса КЧС, было проведено выравниванием и анализом нуклеотидных последовательностей генома различных штаммов ВКЧС, представленных в банке данных и характеризующихся разнообразием молекулярно-биологических свойств. На основе выравнивания последовательностей с использованием программы "SQMAX" был построен профиль вариабельности генома ВКЧС (рис.1), который выявил наличие нескольких пиков, характеризующих вариабельные участки генома, потенциально пригодные для штаммовой дифференциации. ,

В блоке генов структурных белков максимальной степенью вариабельности (-37%) характеризуется участок генома, локализованный в 5'-концевой части гена Е2. В составе фрагмента гликопротеина Е2, кодируемого данным участком, находится иммунодоминантный регион, сформированный 4 антигенными доменами (В, С, А и D) (Van Rijn et al, 1992). Из графика видно, что эта область гена Ег является достаточно вариабельной и информативной не только для штаммовой дифференциации, но и для изучения структурно-функциональной организации вируса КЧС. Также было проведено выравнивание данного фрагмента нуклеотидной последовательности гена Е2 различных штаммов ВКЧС с гомологичными последовательностями нескольких штаммов ВДКРС и ВПБО.

В результате анализа выравненных последовательностей были определены четыре пары праймеров, составляющие единую тест-систему детекции-дифференциации пестивирусов (рис.2), которая состоит из следующих компонентов:

- родовые праймеры, являющиеся внешними, оптимизированы таким образом, чтобы обеспечить комплементарное взаимодействие с возможно большим количеством геномных матриц, принадлежащих'всем представителям

рода РеэК^гиз. Они используются для проведения реакции обратной транскрипции и первого этапа ПЦР.

- три пары видоспецифичных праймеров: ВКЧС-специфичные, ВДКРС-специфичные и ВПБО-специфичные праймеры, используются для проведения второго этапа ПЦР, а также для секвенирования ампликонов.

Положение в геноме (п н.)

Рис.1. Профиль вариабельности генома ВКЧС и локализация блока генов структурных белков (С; Е0; Еч; Вг). По оси абсцисс показана нумерация нуклеотидов генома, по оси ординат - процент вариабельности.

Продукт первой стадии ПЦР (692 п.и.)

Продукты второй стадии ПЦР:

с 0>ГУ.<тгсц»фиднымн прдДмсрам» (334 г к )|

сЛО!Лсг1«иф||'П|Г,гм(1 т"]пми (ни ]

тт

5'СИ

с ВТОУ-спщифичнмчи ира|1мфями tt79n.il.)

со тэ

ос

Ш

Ег

I

2304 2463 2596 2739 2797 2913 2952 2996

Рис. 2. Расположение на геноме родо- и видоспецифичных праймеров тест-системы идентификации пестивирусов и расчетные длины специфических продуктов реакции (нумерация нуклеотидов дана по штамму АИо(1).

I

2739

Определение структуры этих праймеров основывалось на принципе комплементарное™ консервативным участкам генома одного из представителей рода и одновременного максимально возможного несоответствия гомологичным участкам генома двух других представителей рода. При этом ВКЧС-специфичные праймеры выбраны таким образом, чтобы фланкированный ими участок генома кодировал неконсервативные антигенные домены (В, С и Д).

Разработанная тест-система имеет несколько положительных особенностей с точки зрения практического применения.

1. Возможность детекции и дифференциации вирусного генома не только в случае пестивирусной моноинфекции (ВКЧС, ВДКРС или ВПБО), но и в случае смешанной инфекции. Так, на поголовье, вакцинированном против ВКЧС данная система позволяет выявлять ВДКРС и ВПБО, которые могут инфицировать свиней и даже вызывать клинику, сходную с КЧС.

2. Тест-система позволяет контролировать качество выпускаемых вакцинных препаратов, так как технология производства кудьтуральных вакцин предполагает использование сыворотки КРС (которая в большинстве случаев контаминирована вирусом ВДКРС), а также культур клеток, которые могут быть контаминированы пестивирусами.

3. Возможность дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов ВКЧС анализом первичной структуры вариабельного фрагмента генома.

А. Возможность экспресс-дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов ВКЧС рестрикцией амплифицированных фрагментов. '

Проблема контаминации пестивирусами в производстве вакцинных препаратов Компонентами, используемыми в производстве противовирусных вакцин,

с которыми может быть связана проблема контаминаций являются: исходный

клеточный материал, сыворотка, трипсин, посевной вирус. С использованием

разработанной тест-системы был проведен анализ на контаминацию

пестивирусами клеточных культур и коммерческих сывороток крови КРС.

Вирусспецифические фрагменты были получены с использованием ВДКРС-

специфичных праймеров при проверке культур клеток Р1.К, ПО-2 (ЭК), МДВК.

Геном вируса КЧС был детектирован в культуре клеток ППК и РК-15

(полученной из Хорватии, Венгрии, Польши).

В результате проведенного анализа первичной структуры 5'-NCR фрагмента генома ВКЧС было показано, что хорватский, польский и венгерский изоляты ВКЧС близкородственны штамму К. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности вариабельной области гена Е2 изолята ВКЧС, выделенного из культуры клеток ППК, показал его близость с референтными представителями подгруппы 1.1. - штаммами ALD и Glentorf. Анализ первичной структуры ампликоноа вируса ВДКРС показал их принадлежность к группе I (рис. 3). Вирусы группы I используются, главным образом, для производства вакцин и компонентов диагностических наборов, в то время как вирусы группы II выделяются преимущественно из фетальной сыворотки персистентно инфицированных телят, рожденных от коров, вакцинированных против ВДКРС, а также от животных, погибших в результате острой формы диареи, именуемой геморрагическим синдромом (Ridpath et al, 1994; Pellerin et al,1994). При исследовании 15 образцов коммерческих серий сывороток крови КРС в 6 был детектирован геном ВДКРС.

_I с14

I 1494

-890

-4812

-cd 87

I— BVDV-MDBK '— BVDV-SK

-Oregon

-SD-1

-Singer

-cp-7

-BVDV-FLK

-New-York

i Osloss715 ^ Osloss - Indiana

la

lb

10 35 30 25 20 15 10 5 О

Процент нуклеотидных различий

Рис. 3. Дендрограмма, отражающая генетические связи между иэопятами вируса диареи КРС, выделенными из клеточных культур, и референтными представителями геногрупп.

Из дендрограммы видно, что все выделенные изоляты ВДКРС, контаминирующие клеточные культуры, относятся к группе I. Причем, изоляты ВДКРС-МОВК и ВДКРС-ЭК близкородственны, и отличаются от других

представителей подгруппы 1а, что позволяет предположить общий источник контаминации.

Таким образом, проблема предотвращения контаминации в процессе наработки вирусного сырья для изготовления вакцин представляет собой

I

актуальную задачу, решение которой в первую очередь зависит от разработки диагностического метода, позволяющего с высокой чувствительностью и специфичностью, как контролировать отсутствие вирусных контаминаций в компонентах культивирования, так и надежно идентифицировать контаминирующие агенты. В создании такой системы контроля и банка постоянно тестируемых клеточных культур разработанная нами тест-система индикации и идентификации пестивирусов может оказать существенную помощь.

Рестрикционный анализ, как альтернативный подход к дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов В связи с тем, что Россия относится к числу стран, проводящих плановую вакцинацию против КЧС (как правило, живыми вакцинами), вопрос дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов является весьма актуальным. Выполнение совокупности операций по определению первичной структуры генома возбудителя и сравнительному анализу (являющихся эффективным инструментом штаммовой дифференциации), требует не только квалифицированных специалистов, но и дорогостоящего оборудования, реактивов, специально оборудованных помещений, что не всегда доступно для ветеринарных лабораторий.

Поэтому нами была разработана рестрикционная тест-система дифференциации штаммов на основе анализа нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена Е2 (фланкированной ВКЧС-специфичными праймерами) российских полевых изолятов, выделенных в 1994-1999 гг. и вакцинных штаммов (в числе которых все штаммы, официально применяемые на территории России для производства вакцин). Методика основана на уникальности первичной структуры данного фрагмента генома. Сравнительный анализ показал, что структура фрагмента генома различных штаммов содержит разное количество сайтов для эндонуклеазы Тая1. Соответственно, в результате гидролиза данным ферментом образуется

р.азное количество продуктов рестрикции определенного размера, что позволяет осуществлять штаммовую дифференциацию. Специфичность продуктов рестрикции ВКЧС-специфичных ампликонов эндонуклеазой Taq 1, позволяющая дифференцировать вакцинные штаммы от полевых изолятов, показана на рисунке 4.

207 12 | 45 70

IS, TS

24 • 63 , 26 207 70 26 12 1 52 2727 27 115 97

ISV TS

5' I -"• 1С

2-163

—1-1—

2670 26S2

2797

212

115

TS

dSH

2463

2682

2797

Рис. 4. Расположение праймеров на геноме и расчетные длины продуктов рестрикции ампликонов эндонуклеазой Taq I.

а - штаммы ЛК-ВНИИВВиМ, ЛК-К, КС-Нарвак;

b - ВГНКИ, СИНЛАК, Pestiffa, Pest-vac, Rovac, Romvac, Pliva, штамм К. с - полевые изоляты группы Ши-Мынь.

Как видно из приведенной схемы, рестрикционный анализ продуктов ПЦР с использованием Taq I позволяет дифференцировать:

- полевые изоляты от вакцинных штаммов;

- вакцинные штаммы ЛК-ВНИИВВиМ, ЛК-К и КС-Нарвак от других штаммов (ВГНКИ, СИНЛАК, Pestiffa, Pest-vac, Rovac, Romvac, Pliva).

Предлагаемая нами рестрикционная тест-система дифференциации штаммов ВКЧС является быстрой, экономичной и простой в исполнении, сохраняя при этом высокий уровень чувствительности и специфичности.

Данный подход в решении вопроса дифференциации вакцинные штаммов от полевых изолятов при расширении спектра применяемых вакцин и

I

появлении полевых изолятов с измененной первичной структурой генома будет нуждаться в дополнении и коррекции, что предполагает постоянное пополнение банка данных нуклеотидных структур различных вариантов вируса.

Определение и сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена Ег полевых изолятов ВКЧС, выделенных в 1994-1999гг.

Метод идентификации на основе ПЦР и секвенирования

амплифицированных фрагментов генома был использован для анализа генетической вариабельности штаммов вируса КЧС, циркулирующих в хозяйствах России. Определена первичная структура вариабельной области гена Ez 13 изолятов вируса КЧС, выделенных в 1994-1999 годах Нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные' последовательности вариабельной области гена Е2 выделенных изолятов сравнивали между собой, и с гомологичными структурами из банка данных EMBL. На рис. 5 представлена дендрограмма, отражающая генетические взаимоотношения между исследованными изолятами и штаммами Alfort, Alfort 187, ALD, Glentorf и Brescia, которые являются референтными представителями системы групп и подгрупп, предложенной Lowings et al.

В результате анализа первичной структуры российских изолятов было показано, что все они, за исключением изолята "Ульяновск 01/99", вошли в группу 1 американских и европейских изолятов (40-60-х годов). Внутри данной группы изопяты распределились следующим образом: два изолята ("Молдавия 03/98" и "Белоруссия 09/94") вошли в подгруппу 1.2. с референтным штаммом Brescia, большинство же отечественных изолятов вошли в подгруппу 1.1., референтными представителями которой являются штаммы Glentorf, ALD и Alfortl 87. Выяснено, что большинство российских изолятов демонстрируют высокий уровень гомологии нуклеотидных последовательностей генома внутри своей группы и образуют обособленный кластер, отличаясь от референтных представителей подгруппы. Обособленность этой группы четко просматривается и на аминокислотном уровне (рис. 6).

r-£

Ульяновск Alfort EMBL Молдавия Brescia EMBL Белорусия Тверь

AID EMBL -Atfort 187 Glentorf EMBL Вад

Белгород.97 Пермь

Ши-МыньВГНКИ Тула I— Пронск _J— Могилев J I— Белгород.94 Ильиногорск I Мордовия -Ши-МыньЕМ BL

14 12 10 S в

Процент нуклеотидных различий

Рис. 5. Дендрограмма гомологии нуклеотидных структур вариабельной области гена Е2 исследованных полевых ^золятсв и референтных штаммов.

■й

Г4"

I- Б

Ульяновск Alfort EMBL Glentorf EMBl Alfort 187 ALD EMBL Мордовия Могилев

. ..ронск

Jl- Белгород.94

IP- Ши-МыньВГНКИ

'-Тула

- Пермь •

- Ши-мыньЕМВ1

Белгород.97

Ильиногорск

Молдавия

Brescia EMBL

Белорусия

Тверь

ю ь б 4

Процент аминокислотных различий

Рис.6. Дендрограмма, отражающая генетическое родство между полевыми российскими изолятами, референтными штаммами и штаммом Ши-Мынь.

Неожиданно высоким оказался уровень * гомологии представителей данного кластера со штаммом Ши-Мынь, который был выделен в 1945 году в одной из китайских провинций и использовался в СССР как в качестве штамма-пробойника для оценки вакцинных препаратов, так и для изготовления

инакгивированной вакцины. Полученные данные позволяют предполагать определенное влияние штамма Ши-Мынь на формирование российской популяции ВКЧС. Тот факт, что к группе 2 европейских изолятов (80-90-х годов), относится всего один полевой изолят "Ульяновск 01/99", может свидетельствовать о достаточной изолированности вирусной популяции ВКЧС в России и возможном заносе этого изолята.

Определение и сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена Ег штаммов ВКЧС, используемых для производства вакцин

Россия относится к числу стран, реализующих стратегию вакцинации в

борьбе с КЧС. Следовательно, лабораторная диагностика должна предполагать не только детекцию вируса КЧС и дифференциацию его от родственных пестивирусов, но и дифференциацию вакцинных штаммов от полевых изолятов. Таким образом, детальное изучение генетических особенностей вакцинных штаммов, применяемых как на территории России, так и в странах зарубежья, диктуется необходимостью проведения корректного лабораторного анализа патматериала, импортируемого мяса и племенного поголовья.

Для изучения генетической вариабельности вакцинных штаммов, создания банка первичных структур их геномов, проведения дифференциации между штаммами и выяснения соответствия антигенных структур полевых изолятов и вакцинных штаммов, была определена нуклеотидная последовательность вариабельной области гена Ег одиннадцати вакцинных штаммов. В результате проведенного сравнительного анализа было показано, что по аминокислотной структуре штаммы вакцинных препаратов ВГНКИ (Щелково), Riems С (Германия) и СИНЛАК (ВНИИЗЖ) идентичны лапинизированному штамму К (ВГНКИ). Первичная структура анализируемого фрагмента гена Ег других вакцинных препаратов, также изготовленных'на основе штамма К (согласно декларации производителя) отличалась от структуры штамма К (ВГНКИ) на различное количество нуклеотидных (н.з.) и аминокислотных (а.з.) замен: Pestiffa (Франция) -1 н.э.; 1 а.з.; Pliva (Словакия) -6 н.з.; 4 а.з.; Pest-vac (Бразилия) - 15 н.э.; 8 а.з.; ЛК-ВНИИВВиМ (Россия, Покров) - 29 н.э.; 13 а.з.; КС-Нарвак (Россия, Москва) - 29 н.з.; 13 а.з.; ЛК-К

(Россия, Покров) - 24 н.э.; 13 а.з. Графически генетические отношения между вакцинными штаммами представлены на рисунке 7.

Из дендрограммы видно, что штаммы К, ВГНКИ, Синлак и Г^етБС составляют единую группу, к которой можно отнести штаммы РеэШа и РКуа. Вакцинные же штаммы ЛК-ВНИИВВиМ, ЛК-К и КС-Нарвак формируют отдельную, генетически достаточно удаленную группу.

£

ЛК-Кс.45в ЛК-Кс.45а Нарвак

ЛК-ВНИИВВиМ

ВГНКИ

№егпБС

Синлак

С^певе

■ №аН'

• Р1Ь/а

" Яотуас

• ЭРЕ

■ АЮ

' |Чоуас

• Гудзон

" Ре$(-уас

14 12 т а 6 4 2 0

Процент аминокислотных различий

Рис. 7. Дендрограмма, отражающая генетическое родство между вакцинными штаммами вируса классической чумы свиней на основе структурной гомологии аминокислотных последовательностей вариабельной области гена Ег.

При интегрировании данных первичной структуры генома вакцинных штаммов в систему референтных представителей групп и подгрупп (рис.8) показано, что вакцины ВГНКИ, СИНЛАК, РезШа, гаетэС, Р1ма и Ротуас относятся к группе 1 подгруппе 1.1., а вакцины ЛК-ВНИИВВиМ, ЛК-К и КС-Нарвак - к подгруппе 1.2.

Проведен сравнительный анализ аминокислотной последовательности фрагмента гликопротеина Е2, наиболее широко применяемого на территории России вакцинного штамма ЛК-ВНИИВВиМ и группы полевых изолятов, имеющих высокий уровень гомологии первичной структуры со штаммом Ши-Мынь. В результате проведенных исследований было показано, что цистеины в позициях 737 и 792, необходимые для правильной сборки Е2, присутствуют в структуре аминокислотных последовательностей всех полевых изолятов и

Ульяновск

Alforl EMBL

Romvac -

AllorlW

ВГНКИ

К-лвп.ВГНКИ

PastMa

Rlams-C EMBL Plivs

AID EMBL

Gtantort EMBL

Past-vac

Пермь

Ши-Мынь

Пронск

Тула

Балгород<94

Могилев Ильиногор» В ад

Балгород-97 Shlman EMBL Брянск

Rovac _

Молдавия

Brescia EMBL

Балорусия

KC-Нарвак

ЛК-ВНИИВВиМ

ЛК-Ка

ПК-Kb

1.1

1.2

16

14 12 10 8

Процент нуклеотидных различий

Рис.8 Дендрограмма, отражающая генетические связи между изолятами ВКЧС, выделенными на территории России в 1994-1999 годах, вакцинными и референтными штаммами.

вакцинных штаммов, что подтверждает консервативность вторичной структуры гликопротеина. Однако характер аминокислотных замен внутри доменов, формируемых этими цистеинами, отличался у полевых изолятов группы Ши-Мынь и анализируемого вакцинного штамма. Эти отличия наблюдались в позициях, являющихся ключевыми для связывания с вируснейтрализующими моноклональными антителами на эту область (725, 738, 734 и 713 а.о.).

Хотя все штаммы ВКЧС относятся к одному серотипу, в реакции перекрестной нейтрализации, согласно литературным данным, показано 64-кратное различие титров для различных штаммов с гомологичными и гетерологичными сыворотками. Необходимо отметить, что все российские и известные нам импортные вакцинные штаммы принадлежат к группе 1, в то время как в Европе в последние годы регистрируются вспышки КЧС, вызываемые вирусами группы 2. Эти факты являются актуальными для стран, применяющих стратегию вакцинации в борьбе с КЧС, и определяют необходимость изучения соответствия антигенных структур вакцинных штаммов и полевых изолятов.

Таким образом, проведенный комплекс молекулярно-биологических работ позволил разработать тест-систему детекции-дифференциации пестивирусов и проанализировать клеточные культуры на наличие контаминаций пестивирусами, предложить метод рестрикционной дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов, а также разработать метод штаммовой дифференциации ВКЧС и изучить генетические взаимоотношения между российскими полевыми изолятами ВКЧС, отечественными и зарубежными вакцинными штаммами.

Выводы

1.Разработана тест-система индикации пестивирусов на основе ПЦР, позволяющая детектировать и дифференцировать геномы всех представителей рода Pestivirus (вируса классической чумы свиней, вируса диареи крупного рогатого скота, вируса пограничной болезни овец) как при моноинфекции, так и при смешанной инфекции в различных вируссодержащих материалах (органы инфицированных животных, вакцинные препараты, кровь, клеточные культуры).

2.На основе определения и сравнительного анализа первичной структуры амплифицированного фрагмента гена Ег разработан метод штаммовой идентификации вирусов классической чумы свиней, диареи крупного рогатого скота и пограничной болезни овец.

3.Определены нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности вариабельной области гена Е2 18 изолятов вируса классической чумы свиней, выделенных на территории России в 1994-1999 гг. и 11 вакцинных штаммов.

4.Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей отечественных и зарубежных штаммов вируса классической чумы свиней, позволяющий проводить сравнительный анализ и идентификацию вновь выделенных изолятов вируса.

5.Сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена Ег показано, что все российские изоляты (за исключением изолята "Ульяновск 01/99") принадлежат к группе 1 европейских и американских изолятов (40-60-х годов), внутри которой они формируют обособленный кластер, имеющий высокий уровень гомологии со штаммом Ши-Мынь. Тот факт, что к группе 2 современных европейских изолятов (80-90-х годов) относится только один полевой изолят, может свидетельствовать о достаточной изолированности вирусной популяции вируса классической чумы свиней в России.

6.На основе анализа нуклеотидной последовательности вариабельной области гена Е2 российских полевых изолятов, выделенных в 1994-1999 гг. и вакцинных штаммов вируса классической чумы свиней (в числе которых все официально применяемые на территории России) разработан экспресс-метод дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов рестрикцией продуктов ПЦР, позволяющий проводить анализ в течение нескольких часов.

Практические предложения На основании проведенных исследований предлагаются для использования в практической работе:

- "Методика индикации и дифференциации вируса классической чумы свиней с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования амплифицированных фрагментов генома";

- Тест-система индикации лестивирусов на основе ПЦР, позволяющая детектировать и дифференцировать геномы всех трех представителей рода Pestivirus (вируса классической чумы свиней, вируса диареи КРС и вируса пограничной болезни овец), что предоставляет возможность осуществления контроля пестивирусной контаминации в производстве вакцинных препаратов;

- Для проведения экспресс-дифференциации вакцинных штаммов вируса КЧС от полевых изолятов при анализе образцов предлагается рестрикционная тест-система на основе эндонуклеазного гидролиза амплифицированных фрагментов генома вируса КЧС.

Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Безбородова C.B., Дрыгин В.В., Перевозчикова H.A., Гусев A.A. Использование метода ПЦР для выявления вируса классической чумы свиней // Материалы научно-практической конференции ВНИИВВиМ по проблемам КЧС. (9-11 ноября 1994 г). - Покров, 1995. - С.73.

2. Безбородова C.B., Дрыгин В.В., Перевозчикова H.A., Гусев A.A. Повышение чувствительности метода ПЦР для выявления ВКЧС И Вирусные болезни с-х животных: тезисы докладов научно-практической конференции ВНИИЗЖ. - Владимир, 1995. - С. 15.

3.- Смирнова H.A., Безбородова C.B., Батченко Г.В., Перевозчикова H.A. Эсперссия фрагмента гена белка Е1 (др55) вируса КЧС под контролем промотора фага Т7 II Вирусные болезни с-х животных: тезисы научно-практической конференции ВНИИЗЖ. - Владимир, 1995. - С. 13.

4. Безбородова C.B., Дрыгин В.В., Перевозчикова H.A., Гусев A.A. Детекция вируса диареи КРС в биоматериалах II Актуальные проблемы в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: тезисы докладов научно-практической конференции. - Москва, 19S6. - С.26.

5. Bezborodova S.V., Andreyev V.G., Drygin V.V., Gusev A.A.

Genetic features of CSFV in Russia // Xith International Congress of Virology (9-13 august 1999), - Sydney, Australia, 1999. - P.329.

Отпечатано на полиграфической базе отдела координации научных исследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ. Тираж 80 экз., 2Г00 год.