Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ вакцинных и вирулентных штаммов пестивирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ вакцинных и вирулентных штаммов пестивирусов"

На правах рукописи

ии

Южаков Антон Геннадиевич

Молекулярно-генетический анализ вакцинных и вирулентных штаммов пестивирусов

03.00.06 - вирусология 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

1 9 но Я ^

Москва, 2009

003483610

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и Всероссийском НИИ Экспериментальной Ветеринарии им. Я. Р. Коваленко

РАСХН

Научные руководители:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Алексей Дмитриевич Забережный Галина Ивановна Устинова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук кандидат биологических наук

Гибадулин Рашит Абдрахманович Чермашенцева Наталья Анатольевна

Ведущая организация: Московская Государственная Академия Ветеринарной Медицины и Биотехнологии им. К. И. Скрябина

Защита состоится 7 декабря 2009 г. в 12.00 часов

на заседании диссертационного Совета Д.001.020.01 при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан 6 ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор медицинских наук Е.И.Бурцева

Актуальность проблемы

Пестивирусы - важные патогены КРС, овец и свиней, приносящие значительный экономический ущерб во всём мире. Пестивирусные инфекции вызывают различные расстройства, такие как проблемы воспроизводства, иммуносупресию, диарею, тромбоцитопению и часто протекают латентно. У беременных животных трансплацентарная инфекция может привести к аборту, мертворождению, уродствам и персистентной инфекции у потомков [Becher Р., et al.,2003; Сергеев В.А. и др., 2007].

В настоящее время классическая чума свиней (КЧС) и вирусная диарея КРС (ВД КРС) - заболевания, часто регистрируемые на территории России (и ряда других стран) и приносящие серьезный экономический ущерб промышленному животноводству. Так, потери стран ЕС в результате эпизоотий КЧС 1993-1998 гг. составили более 5 млрд. долларов. ВД КРС, вероятно самая распространенная вирусная болезнь жвачных, антитела к ней обнаруживают в сыворотке крови у 50-90% КРС во всем мире.

Род Pestivirus, входящий в семейство Flaviviridae, по современной классификации составляют 4 вида вирусов: вирус КЧС, вирус диареи КРС-1 и вирус диареи КРС-2, вирус пограничной болезни овец (ПБО) и пестивирус выделенный от жирафа (8-й доклад Международного комитета по таксономии вирусов, 2005). Вирусы данного рода представляют 7 антигенных групп: вирус КЧС, 2 вируса диареи КРС (ВД КРС-1 и ВД КРС-2), 3 группы вируса пограничной болезни овец (ПБО-1, ПБО-2, ПБО-3), и отдельную антигенную группу представляет штамм Н138, выделенный от жирафа в Кении [Patón D.J., et al., 2000].

Геном пестивирусов представлен однонитевой несегментированной молекулой РНК положительной полярности, длинной примерно 12,5 тыс. нуклеотидов. Меньшие или большие размеры обусловлены соответственно делециями или инсерциями. В 5' и 3'- концевых частях вирусной РНК содержатся нетранслируемые области размером около 400 и 350 нуклеотидов.

В соответствии с эпизоотологической важностью и затруднениями в диагностике пестивирусных инфекций, возникла потребность в разработке новейших методов быстрой детекции, идентификации вирусов, улучшении систем контроля циркуляции вирусов и молекулярного типирования. Применение методов молекулярной генетики значительно повысило уровень лабораторной диагностики и позволяет точнее охарактеризовывать существующие и появляющиеся новые вирусные изоляты [Vilcek S., Nettieton P.F., 2006].

Генетическую и антигенную вариабельность вирусов изучают методом филогенетического анализа, на основе сравнительного анализа определенных фрагментов геномов и аминокислотных последовательностей различных вирусных изолятов и сравнения их с рядом наиболее известных референтных штаммов. При анализе определённых фрагментов геномов в разных лабораториях, получают сходные, воспроизводимые результаты. Поэтому важно, чтобы во всём мире использовались стандартные методы исследований.

Типирование с моноклональными антителами и филогенетический анализ показали, что пестивирусы внутри вида могут быть отнесены в разные генетические группы и подгруппы [Patón D.J.et al., 2000; Lowings J.P. et al., 1996, Vilcek S., 2006]. Это создаёт возможность для изучения эволюции пестивирусов.

За рубежом созданы базы данных геномов вирусов, куда добавляются все вновь выделенные полевые изоляты. Это позволяет более полно видеть картину эпизоотического процесса, определять пути распространения вируса, и соответственно принимать меры по их пресечению. Необходимо создание в РФ базы данных пестививирусов, используя те же фрагменты геномов и другие биологические маркеры, что и во всем мире.

Сегодня, как и ранее, очень важно иметь наиболее полную информацию о циркулирующих на территории Российской Федерации штаммах вирусов КЧС и ВД КРС. Возможность точного генотипирования вирусных изолятов позволяет контролировать эпизоотологическую ситуацию по вызываемым данными вирусами заболеваниям, а также идентифицировать и определять происхождение новых изолятов вирусов.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось генотипирование и филогенетический анализ вакцинных и полевых изолятов пестивирусов (ВКЧС и ВД КРС), циркулирующих на территории РФ.

Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Создать системы праймеров для амплификации в ПЦР, и секвенирования фрагментов генома вирусов ВД КРС.

2. Выделить РНК из клеточных культур, зараженных различными изолятами вирусов ВД КРС и КЧС. Получить фрагменты кДНК трех фрагментов генома (ВД КРС: 5'-UTR (250 нуклеотидов), участок гена Е2 (800 нуклеотидов), и участок гена Npro (480 нуклеотидов); ВКЧС: 5'-UTR (149 нуклеотидов), участок гена Е2 (180 нуклеотидов), и участок гена NS5B (200 нуклеотидов)) вакцинных и вирулентных штаммов вирусов.

3. Определить нуклеотидную последовательность полученных фрагментов геномов вирусов ВД КРС и КЧС.

4. Провести филогенетический анализ изолятов вирусов, на основе полученных последовательностей.

5. Провести филогенетический анализ генетических подгрупп полевых изолятов вирусов КЧС и ВД КРС.

6. Определить нуклеотидную последовательность вакцинного штамма вируса КЧС JIK-K, Покров.

7. Выработать предложения по проведению филогенетического анализа вируса КЧС, разработать методические указания.

Научная новизна и практическая значимость

1. Впервые на территории Российской Федерации среди аборигенных стад крупного рогатого скота был обнаружен нецитопатогенный биотип 2-го генотипа вируса ВД КРС.

2. Генетическим типированием 61-го изолята, вызывавших вспышки КЧС на территории России в 1980-2007 гг. показана их принадлежность к группе 1 (подгруппа 1.1, 1.2) и группе 2 (подгруппа 2.3). Филогенетический анализ изолятов на основе 180-нуклеотидной последовательности фрагмента гена Е2 показал, что в 80-е годы прошлого столетия превалировал вирус подгрупп 1.2, 2.3 и единичные случаи - 1.1; в 90-е годы до 2002 г. - 1.1 и единичный случай 2.3; в 2002-2007 гг. - подгруппы 2.3.

3. Определена нуклеотидная последовательность вакцинного штамма ЛК-К вируса КЧС, Покров.

4. Разработаны методические указания по индикации и штаммовой дифференциации вируса классической чумы свиней с помощью ПЦР и секвенирования фрагментов генов Е2, Ы85В и 5'-нетранслируемой области. Утверждены заседанием научного совета ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им.Я.Р. Коваленко 16 июля 2009г., протокол №7.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Проведение филогенетического анализа изолятов вируса классической чумы свиней за период с 1980 по 2007 год и филогенетический анализ изолятов вируса диареи КРС, выделенных в 2006 и 2007 гг.

2. Подтверждение факта постепенного замещения циркулирующих генетических групп вируса классической чумы свиней в Российской Федерации. В 80-е, годы прошлого столетия превалировал вирус КЧС подгрупп 1.2, 2.3 и единичные случаи - 1.1; в 90-е годы до 2002 г. - 1.1 и единичный случай 2.3; в 2002-2007 гг. - подгруппы 2.3.

3. Выявление факта циркуляции на территории Российской Федерации 2 генотипа вируса диареи КРС.

4. Определение нуклеотидной последовательности вакцинного штамма ЛК-К вируса классической чумы свиней.

5. Разработка комплекта реагентов и методических рекомендаций по штаммовой дифференциации вируса классической чумы свиней с помощью ПЦР и секвенирования фрагментов генов Е2, №5В и 5' нетранслируемой области.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на следующих научных конференциях:

«Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I.Vavilov», Киев, Украина, 20-22 сентября 2007 г.

«Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» - Москва, 22-25 сентября 2008 г.

«II Московский конгресс молодых ученых НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского», Москва, 23 апреля 2009 г.

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 24 сентября 2009 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 2 докладов в материалах международных конференций.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 105 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 120 источников. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 19 рисунками.

Материалы и методы

Вирус диареи КРС

В работе использовали три нецитопатогенных штамма вируса диареи КРС из коллекции лаборатории биотехнологии - диагностический центр ГНУ Института Экспериментальной Ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии, любезно предоставленные профессором Глотовым А.Г..

Вирус КЧС

В работе использовали 68 полевых изолятов вируса КЧС из коллекции Всероссийского Научно-Исследовательского Института Ветеринарной Вирусологии и Микробиологии Россельхозакадемии, Покров

Вакцинные штаммы: КС (профессор Сергеев В.А.) и JIK-K (серия 06-08, Покров, Россия).

Реакция иммунофлуоресценции

Культуру клеток РК-15, выращенную на покровных стеклах в пробирках, заражали вирусом КЧС и инкубировали в течение 3 суток. Покровные стекла высушивали, обрабатывали холодным ацетоном в течение 30 мин и использовали в работе.

На монослой клеток наносили специфические к вирусу КЧС антитела, меченые ФИТЦ, в рабочем разведении. После инкубации в течение 1 часа при 37°С и отмывки несвязавшихся меченых антител проводили учет результатов, просматривая покровные стекла под инвертированным флуоресцентным микроскопом. При обнаружении в клетках специфической флуоресценции и отсутствии таковой в контрольной культуре клеток результат считали положительным.

Выделение вирусной РНК из различных образцов

Для выделения РНК вирусов КЧС и ВД КРС из монослоя и суспензии культуры клеток для проведения филогенетических исследований использовали следующие методики:

С тризолом (Trizol Reagent. Life Technologies. США). С тризолом (Trizol LS) для жидких образцов:

К 500 мкл жидкого образца добавляли 500 мкл тризола и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Для разделения фаз центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Затем отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола. Инкубировали при -20°С в течение 20 минут. Затем центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Образовавшийся осадок РНК, промывали дважды 75% этанолом. Затем осадок подсушивали при 37°С в течение 20-30 минут и растворяли РНК в 30-40 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом.

С тризолом (Trizol) для монослоя и тканевых образцов:

В культуральную чашку (диаметром 5 см) с клеточным монослоем добавляли 700 мкл тризола (из расчета 37.5 мкл на 1 см2), дожидались отделения монослоя от поверхности чашки, переносили суспензию клеток в тризоле в микроцентрифужную пробирку (1.5 мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Для разделения фаз центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Затем отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола. Инкубировали при -20°С в течение 20 минут. Затем центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С.

Образовавшийся осадок РНК промывали дважды 75% этанолом. Затем осадок подсушивали при 37°С в течение 20-30 минут и растворяли РНК в 30-40 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом.

Проведение «гнездовой» ОТ-ПЦР для выявления РНК вирусов КЧС и диареи KP С

«Гнездовую» ОТ-ПЦР проводили в тонкостенных пробирках объемом 0,5

мл.

Первый раунд ПЦР, совмещенный с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл РНК, 10 пМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 0,5 ед. ревертазы M-MLV, 20 ед. ингибитора рибонуклеаз RNAzin, 10 мМ Tris-HCl (рН=9.0), 50 мМ KCl, 0,1% Triton Х-100, 1,5 мМ MgCl2.

Второй раунд ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл ДНК, 10 пМ каждого праймера, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 10 мМ Tris-HCl (рН=9,0), 50 мМ KCl, 0,1% Triton Х-100, 1,5 мМ MgCl2. Проводили 30 циклов амплификации и 30 -реамплификации.

«Гнездовую» ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия).

Набор специфических олигонуклеотидов для проведения полимеразной цепной реакции и секвенирования участков 5'- нетранслируемой области (5'-UTR), генов Npro и Е2 вируса ВД КРС разрабатывали на основании известных последовательностей генов, полученных из банков данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) с помощью программ Amplify 1.0 ('Accelrys Inc.', США), BioEdit 7.0.1 (Ibis Therapeutics, Inc., США), Primer premier 5.0 (Premier Biosoft International, США). Синтез олигонуклеотидных праймеров произведён в ЗАО "Синтол" (Москва).

Олигонуклеотидные праймеры для амплификации трёх фрагментов генома вируса диареи КРС

Проведение ПЦР для амплификации фрагмента 5'-нетранслируемой области: F-BV-111 (CGA AAA GAG GCT AGC CAT GC), R1_BV (CAA CTC CAT GTG CCA TGT A), F1_BV (GCC CTT AGT AGG ACT AGC), R-BV-365 (GTG CCA TGT ACA GCA GAG ATT).

Проведение ПЦР для амплификации фрагмента гена Npro: F-BV-384 (ААТ CTC TGC TGT АСА TGG CA), R-BV-1289 (АСА GAT ТТТ CTC TGG ССА GAT), F2 BV (TGT АСА TGG САС ATG GAG TT).

Проведение ПЦР для амплификации фрагмента гена Е2: F3_BV (ТАА GAC CAG ATT GGT GGC), R-BV-3434 (YAG GTC AAA CCA RTA TTG), F-BV-2275 (AYT GGT GGC CWT ATG AGA С).

Праймеры использовались в следующих сочетаниях: фрагмент 5'-НТО ВД КРС: I амплификация: FBV111 и R1_BV, II амплификация: F1_BV и R_BV_365; фрагмент Npro ВД КРС: I амплификация: F_BV_384 и R_BV_1289, II

амплификация: F2_BV и R_BV_1289; фрагмент Е2 ВД КРС: I амплификация: F3JBV и R_BV_3434, II амплификация: F_BV_2275 и R_BV_3434.

Вырожденные буквы: Y = С или Т; W = А или Т; R = G или А

Праймеры для II амплификации, использовались для секвенирования.

Олигонуклеотидные праймеры для амплификации трёх фрагментов генома вируса КЧС

Проведение ПЦР для амплификации фрагмента 5'-нетранслируемой области: F 18 (GTA TAC GAG GTT AGT TCA) и R 483 (TGT GGG TGT ACC TCA CT).

Проведение ПЦР для амплификации фрагмента гена NS5B: F 11085 (TGC CGA TG G GGA AGT AT) и R 11595 (GCA CCA GTA AGC AGA ТС).

Проведение ПЦР для амплификации фрагмента гена Е2: Е2 out F (AGR CCA GAC TGG TGG CCN TAY GA) и E2 out R (TTY ACC ACT TCT GTT CTC A), E2 inn F (TCR WCA ACC AAY GAG ATA GGG) и E2 inn R (CAC AGY CCR AAY CCR AAG TCA TC).

Вырожденные буквы: Y = С или Т; W = А или Т; R = G или А

Для амплификации фрагмента Е2 вируса КЧС праймеры использовались в следующих сочетаниях: I амплификация: Е2 out F и Е2 out R, II амплификация: E2 inn F и E2 inn R.

Определение нуклеотидиой последовательности фрагментов генома

Для секвенирования ДНК по двум цепям использовали те же праймеры, что и для проведения ПЦР.

Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи секвенирования ПЦР-продукта с использованием Ha6opá Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Великобритания) согласно инструкции изготовителя. Электрофорез ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических дендрограмм

Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright © 1997-2004 гг.) и программы SeqMan из пакета программ Lasergene (version 7.1.0.(44) Copyright © 1993-2006 гг.).

Филогенетические деревья были построены при помощи программы MegAlign из пакета программ Lasergene (version 7.1.0.(44) Copyright © 19932006 гг. [), для определения степени филогенетического родства был использован метод «ближайшего соседа» [Felsenstein, 1989; Vilcek S., et al., 1996].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка олигонуклеотидных праймеров для амплификации методом ПЦР и последующего секвенирования трёх участков генома вируса ВД КРС, используемых для филогенетического анализа

В настоящее время методы молекулярной диагностики наиболее точны и удобны для генотипирования и дифференциальной диагностики пестивирусов. Они обладают высокой чувствительностью, малым временем, требуемым для проведения анализа, и сравнительно низкой трудоемкостью.

Для получения ПЦР-фрагментов и последующего секвенирования трёх участков генома вируса КЧС были взяты праймеры, разработанные в европейских референтных лабораториях по изучению вируса КЧС. [Lowings Р, 1996; StadejekT, Warg J, Ridpath JF. 1996]

Одной из задач данной работы было создание детекционных тест-систем, на основе ПЦР с обратной транскрипцией, для трех фрагментов геномной РНК вируса диареи КРС, совмещённых с определением генотиповой принадлежности ПЦР - положительных образцов на основе определения нуклеотидной последовательности амплифицируемых фрагментов ДНК.

В данной работе было решено использовать три участка генома вируса диареи КРС, наиболее часто используемые для генотипирования данного вируса. Проанализировав работы, опубликованные в последнее время, мы выбрали: участок 5'-НТО, участки генов Е2 и Npro. Участок 5'-НТО является наиболее консервативным в геноме вируса диареи КРС, а участок гена Е2 -наиболее вариабельным.

Тест-системы должны были отвечать следующим требованиям: дифференцировать вирус диареи КРС от других членов рода Pestivirus, и в то же время детектировать вирусы диареи КРС, как первого, так и второго генотипа.

Для создания такой тест-системы необходимо было выбрать участки генома для дизайна олигонуклеотидных праймеров. С этой целью нами было проведено сравнение полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома вирусов диареи КРС, опубликованных в базе данных GenBank, с использованием пакета компьютерных программ DNASTAR, Следует отметить, что к началу данной работы было опубликовано значительное количество коротких частичных последовательностей генома вируса диареи КРС и всего 19 полноразмерных последовательностей вирусного генома. Также нужно отметить, что в базе данных GenBank не было опубликовано ни одной нуклеотидной последовательности полного генома отечественного изолята вируса диареи КРС.

Наши исследования по разработке детекционных тест-систем на основе ОТ-ПЦР для вируса диареи КРС включали следующие этапы:

1. Подбор специфических олигонуклеотидных праймеров для амплификации РНК вируса диареи КРС.

2. Выбор оптимальных условий проведения ПЦР и оценка специфичности

теста.

Для осуществления первого этапа были использованы полноразмерные последовательности вирусов диареи КРС, относящиеся к первому и второму генотипам, опубликованных в базе данных вепВапк. Данные вирусы диареи КРС были выделены от КРС, овец, свиней и диких жвачных.

Далее были созданы "консенсусные" последовательности для каждого генотипа вируса диареи КРС, для каждого из трех участков генома. Затем был проведен сравнительный компьютерный анализ полученных последовательностей между собой. При анализе полученных данных были выбраны наиболее консервативные участки генома, ограничивающие выбранные нами участки. К ним были подобраны специфические олигонуклеотиды для проведения "гнездовой" ПЦР.

Так как 5'- НТО является наиболее консервативной областью генома вируса диареи КРС, нами были разработаны внешние и внутренние праймеры для проведения гнездовой ПЦР.

На рисунках 1 и 2 в качестве примера изображены выровненные между собой последовательности фрагмента 5'-НТО различных генотипов вируса диареи КРС.

Для участка гена Ырго вируса диареи КРС, нами были разработаны праймеры для проведения полу - гнездовой ПЦР.

Вследствие высокой вариабельности гена Е2, последовательности праймеров используемых для проведения полу - гнездовой ПЦР были созданы вырожденными.

Для секвенирования амплифицированных в результате ПЦР фрагментов кДНК с целью проведения филогенетического анализа, использовались праймеры, разработанные для второй амплификации.

Для осуществления второго этапа, т.е. выбора оптимальных условий проведения ПЦР и оценки специфичности теста, был использован вакцинный штамм ИАБЬ вируса диареи КРС, относящийся к первому генотипу, а также ряд штаммов вируса КЧС. В ходе оптимизации условий амплификации не использовался второй генотип вируса диареи КРС, так как на момент проведения эксперимента данный генотип на территории РФ не находили.

В g, ¡CourierNew Tjfïï 3 В

16 total sequences

Mode: ¡Select/Slide 4

Selection: nuH Position:

Sequence Mask: None Numbering Mask: None

* i d и elKlliiil';

CÄ

Г MI \

Scroll I I ^

speed stow ф »( fast

NADL

VEDEVAC(AJ5 85412) ZM-95(AF52 6381) Singer Arg(DQ088995) Pestivirus type 1 noi Osloss Oregon

KE9(EF101530)

ILbC

CP-7

CD-I

AP220247

strain 1373 (AF145 96' P24515 (AY149216) 890 (U18059) NewyORK* 93(AF502399)

I 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180

С T С T С AGC GAAGGC CGAAAAGAGGCTAGCCAT GCCCTTAGTAGGACTAGCA T AA TGAGGGG GGT A GC AA С AGT GGT GAGT T С GT T GGAT GGC T ' TCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAACAAGGAG GGTAGCAACAGT GGT GAGT T С GT T GGATGGC T ■ T С С T СAGC GAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATÇCCCTTAGTAGGACTAGCАААТ T GGGGGG GGTAGCAGCAGT GGC GAGT T С ATTGGATGGC T< !C С С T С AGC GAAGGCCGAAAAGAGGCT.^.GCC AT GCCCT T AGT AGGAC T AGCATAAAGAGGGG GGT AGC AGC AGT GGT GA GT T С GT T GGAT GGC T1 sTCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCC'pTAGTAGGACTAGCAAAATAAGGGG GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCT' iTCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATSCCC-i'TAGTAGGACTAeCAAAACAAGGA© GGT AGC AAC AGT GGT GAGTT CGT T GGAT GGC T' TCCTCCGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCATAGCGAGGGG GGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCT' TCCTTAGCGACGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAA CAAGGAG GGTAGCaacAGT GGT GAGT T С GT TGGAT GGC T ' TCCTCAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATÔCCCTTAGTAGGACTAGCAAAATAAGGGG GGT AGC.~_ЧС AGT GGT GAGT Т С GTT GGAT GGC T' TCCTTAGCGAA.GGCCGAAAAGAGGCTAACCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAATAAGGGG GGTAGCaacAGTGGC GAGT T С GT T GGA T GGC T ■ jCTCTCAGCGAAGGCCGAAAGGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCATAATGAGGGG GGT AGC aac AGT GGT GAGT T С GT TGGAT GGC T1 'TCCTTAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAACCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAATAAGGGG GGT AGCaacAGT GGC GAGT T С GT T GGAT GGC T ' ICCCTCAGCG.iA.GGCCGAAAAGA.GGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGC^^.GTAGGGGGACTAGCGGTAGCAGTGAGTTCGTTGGATGGCC" ICCCTCAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAAAAGTAGGGG ACTAGCGGTAGCAGTGAGTTCGTTGGATGGCC' |CCCTCGGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCAT6CCCTTAGTAGGACTAGCCAAAGGAGGGG ACTAGCGGTAGCAGTGAGTССATTGGATGGCС■ ICCCTCAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTYAGTAGGACTAGCLAAAAGTAGGGG ACTAGCGGTAGCAGTGAGTTCGTTGGATGGCC-

Рисунок 1. Области гибридизации прямых праймеров при амплификации участка 5'-НТО. Розовым цветом обозначена область гибридизации прямого праймера при первой амплификации участка 5'-НТО, зеленым - прямого праймера для второй амплификации

g g j Courier New Mode: | Select / Slide _£j

rf I Dllt

ГЗРГ-Зв

- -i-eg

Sequence Mask: None Numbering Mask: None

ämi¥ 1

Scroll -jJ_I _!

speed slow ф fast

NADL

VEDEVAC(AJ5 85412) 2M-95(AF526381) Singer Arg(DQ088995) Pestivirus type 1 no Osloss Oregon

KE9(EF1D1530)

IZiIiC

CP-7

CD-I

AF220247

strain 1373 (AF145 96' p24515 (AVT14 9216) 890(U18059) NewyORK'93(AF5023 99)

370 380 3 90 400 410 420 430 440 450

ttgctactaaaAatctctgctgtacatggcacatggagttgatcacaaatgaact^ tcgctactaj^aatctctgctgtacatggcacatggagttgattacaaatgaacttttatacaa^^

ttgctactajiaaatctctgctgtacatggcacatggagttgatttcaaatgaacttttatacaaaacatataaacaaaaaccttta ctgctactajl4aatctctgctgtacatggcacatggagttgatcacaaatg^

ttgctactga.aaatctctgctgtacatggcacatggagttgatcacaaatgaacttttatacaaaa.catacaaacaaaaacccact ТТССТАСТА^А-ААТСТСТ6СТСТАСАТС6САСАТвСА6ТТвАТТАС^^А.Т&ААСТТТТАТАС.'_^АА.САТА.С^А_ЛСАААА^ССС6СТ

ttgctactaaaaatctctgctgtacatggcacatggaattgattacaaatgaactcttatacaaaacatacaaacaaaaacccgtc ,TTGCTACTAAAMTCTCTGCTGTACAT<3GCA^

¡ttgctactgaa^tctctgctgtacatggcacatggagtt'gatcacaaatgaacttttatacaaaacatacaaacaaaaacccact ttgctactgaaaatctctgctgtacatggcacatggagttga.tcacaaatgaacttttatacaaaa.ca.tacaaacaaaaacccgct ttgctactaaaaatctctgctgtacatggcacatggagttgattacaaatgaacttttatacaaaacatacaaacaaaaacccgtc ttgctactgaaaatctctgctga\i.catggcacatggagttgatcacaaatgaacttttatacaaaa.catacaaacaaaaacccgct - ccgctagt.^ajlaactctgctgtacatggcacatggagttgttttcaaatg.^.cttttatacaaaacatataaacaaaaaccagca с с g с t a gt aaaaa с t с t gc t gt ac at ggc ac at ggagt t gt t t t с aaa t g aa. с t t t t a t а с aaaa с a tat aaac ааааа с с agc а ccgctagtaa-aaa CTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGTTTTCAAJvTGAACTTTTATACAAAACATA.taaacaaaaaccagca ccgctagtaaaaa ctctgctgtacatggcacatggagttottttcaaatgaacttttatacaaaacatataaacaaaaaccagca

Рисунок 2. Области гибридизации обратных праймеров при амплификации участка 5'-НТО. Розовым цветом обозначена область гибридизации обратного праймера при первой амплификации участка 5'-НТО, зеленым - обратного праймера для второй амплификации

В ходе оптимизации условий амплификации подбирались следующие параметры: концентрация ионов магния, температура отжига праймеров, временные режимы проведения ПЦР. При проведении гнездовой и полу -гнездовой ПЦР температурно-временные режимы, указанные в таблице 3, оказались оптимальными. Было обнаружено, что разработанные праймеры работают специфически в реакционной смеси со стандартной концентрацией М§С12 (1,5 мМ).

Для всех трех участков генома, в образце, содержащем вирус диареи КРС, при проведении электрофореза были обнаружены специфические фрагменты, что соответствовало положительному результату. Все образцы, содержащие вирусы КЧС, оказались отрицательны.

Филогенетическая характеристика полевых изолятов вируса диареи КРС, циркулирующих на территории России

На следующем этапе были использованы лабораторные тест-системы на основе ОТ-ПЦР для изучения полевых изолятов вируса диареи КРС, выделенных на территории России. Мы использовали три нецитопатогенных изолята вируса диареи КРС (Бизон, Бор и Благодатский) из коллекции лаборатории биотехнологии - диагностический центр ГНУ ИЭВС и ДВ СО Россельхозакадемии.

Данные изоляты были выделены от животных с различными клиническими проявлениями болезни в 2006-2007 годах в Сибири. Изолят Бизон был выделен из легких теленка с признаками острого респираторного заболевания из хозяйства, куда не вводились новые животные, включая поступающих по импорту. Изолят Бор был выделен от персистентно инфицированного животного, поступившего по импорту, у которой не регистрировали клинических признаков болезни. Изолят Благодатский был выделен из лимфоидных органов абортированного плода и мертворожденного теленка при наличии субклинической формы инфекции у коров-матерей.

При помощи разработанных тест-систем на основе ПЦР с обратной транскрипцией, были получены продукты амплификации трех участков генома вируса диареи КРС, и определена их нуклеотидная последовательность. Филогенетический анализ изолятов на основе последовательности участка 5'-нетранслируемой области показал, что согласно общепринятой классификации [УПсек Б., й а1., 2004], предполагающей наличие у вируса диареи КРС первого генотипа 11 подгенотипов, наши изоляты относятся: изолят Бизон относится к генотипу 1, подгруппе 1с1, изолят Бор относится к генотипу 1, подгруппе 1Ь, а изолят Благодатский ко второму генотипу вируса. Анализ участков генов Мр'° и Е2 подтвердил полученные данные. На рисунке 1 - 3 представлены филогенетические дендрограммы исследованных изолятов и референтных штаммов.

ч:

£

—С

-с

18.9.

BVDV- NAD L(M31182). s е

CD-I (№6751). seq l ВДКРС

KSffi-1 NCP(AB042713).; j la

Oregon C24V(AF091805) J ВДКРС

23 -15 (AF296059). s e q > п CP-7(U63479).seq Л

ILLC(U83599).seq ВДКРС Bor.seq т

24-15(299D60).seq Osloss(M96687).seq J Bizon.seq F(AF298C65).seq 16-111 (AF293056).seq шьфтщ.щ Su*aCp(AF1 17699).seq J(AF298067).seq > ВДКРС If A(AF2ffiC64).seq вдкрс r L(AF298C69).seq J G(AF2ffl063).seq \ ВДКРС KM(AF29BC68).seq ■> 890(U1 BC69).S8q N е*; О R KS3(AF£0 2309). Blago<latskii.se<|

ВДКРС

ВДКРС Ik

Ih

ВДКРСП

16

0

14 12 10 8 6 4 Nucleotide Substitutions (x100)

Рисунок 1. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства между российскими полевыми изолятами и референтными штаммами вируса диареи КРС, основанная на анализе нуклеотидной последовательности 5'-нетранслируемой области (250 п.о.)

Исследованиями Шульпина с соавт. [Шульпин М.И. и др., 2003] установлено широкое распространение вируса диареи КРС среди крупного рогатого скота в Центральном регионе РФ. Все выявленные авторами изоляты принадлежали к первому генотипу вируса диареи КРС, подгруппе 1а, а также к неидентифицированной подгруппе.

Генетические подгруппы вируса диареи КРС lb и Id широко распространены во всем мире. Так по данным 2005 года вирусы этих подгрупп доминировали в Германии (обе подгруппы), Италии (lb), Испании (lb), Словении (Id) [Vilcek S„ 2004].

вдкрс 1&

24.5.

СР-Т(иб3479).зеч Р(АР287288).8ес1 !ИС(и86599).$е(| -Вог.йв<|

-0£Ю5$(М96687).§еч

— итттма

_В1гоп.8е(| I ^

-В\'ОУ-МАОЦМ31182).зеч -| вдкрс 1а

-Огедоп С24У(АР091605).58ч |

-Оегг-М21(И80903).58ч } вдкрс 1с

-23-15Ш8?279).$вч У вдкрс 11

-} вдкрс i ь

--- 26-У639(АР287281).зеч } вдкрс I е

-/ЦАГ2$Ш).$ес! I вдкрс 18

■-ЦАР287287),384 -1

-4^288786) эеч \ вдкрс i г

I— Ме«$таЗ(^5(Ш99).$еч

1— 890ЛЛ 8059).зеч

вдкрс и

J

20 15 10 5 Мис1еоМеЗ(й51и1оп$(к100)

0

Рисунок 2. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства между российскими полевыми изолятами и референтными штаммами вируса диареи КРС, основанная на анализе нуклеотидной последовательности участка гена №гс (480 п.о.)

Вирусы диареи КРС второго генотипа впервые были обнаружены в начале 90-х годов прошлого века в США и Канаде. [Ре11епп С. 1994, 1ШраЙ1 Л. 1994] Впоследствии он был обнаружен в Европе, Азии, Японии, Англии и Южной Америке. [\Vofmeyer, 1997, \Vakeley Р., 2004] Теперь нами найдено экспериментальное подтверждение тому, что второй генотип вируса диареи КРС циркулирует и в Российской Федерации.

Однако небольшое количество изолятов, использованных в работе, не позволяет достоверно оценить их географическое распространение и преобладание, какого либо генотипа или биотипа.

Вероятно, нами впервые описан случай выделения вируса диареи КРС второго генотипа на территории России.

35.0 _

Nose(AB033?S2).seq Oregon C24V(AF0§16Q5).se<) C86(AF144611).seq CD-1(M98751).seq TOV-NADL(M311S2),seq S»nger-Ai?f083348}.seq • 518(AF144610).se<t "1 Deer-NZ1(^F144814).seq j ZM-95(AF526381).seq "| De«r-081(AFi4461§),seq j KS36-1(*)(AB033753)ieq > Boi.sei|

Osloss(M96687).seq CC-184(AF5263S0).seq H(Af09815?).seq CP-7(U6347S).Sêq ILLC(U86599).îeq SH9(AF1446tS).seq Bizoïmq 890(U18059)seq BlnyotMski.swi

ВДКРС I a

ВДКРС I с ВДКРС Ig

ВДКРС le

ВДКРС Ib

T ВДЕРСИ

ВДКРСП

80 70 gQ 50 40 30 20 10 Nucieotitle Substitutions ^100)

0

Рисунок 3. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства между российскими полевыми изолятами и референтными штаммами вируса диареи КРС, основанная на анализе нуклеотидной последовательности участка гена Е2 (800 п.о.)

Филогенетическая характеристика полевых циркулировавших на территории СССР и России

изолятов ВКЧС,

Для оценки генетического разнообразия и эволюционных связей полевых изолятов вируса КЧС, выделенных на территории СССР и России, было проведено их генотипирование. В данной работе использовали 68 изолятов вируса КЧС из коллекции ГНУ ВНИИВВиМ, РАСХН (Покров).

Данные изоляты были выделены от павших и вынужденно забитых животных во время вспышек КЧС на территории СССР и России с 1980 по 2007 годы.

В проводимых ранее исследованиях [Безбородова C.B., 2000, Власова А.Н., 2003 и др.] исследовались полевые изоляты выделеные с 1994-1999 г., когда в России отмечалось повышенное количество вспышек КЧС. Несмотря на широкий географический разброс, эти изоляты демонстрировали тесное генетическое родство. Все они относились к группе 1, подгруппе 1.1, представителями которой являются референтные штаммы Alfort 187, Glentorf.

В последующие годы данные о генетическом типировании вируса КЧС на территории РФ были очень немногочисленными. Наибольший интерес представляют исследования А. В. Щербакова с соавт. (2007, 2008), в которых сообщается о выделении на территории нашей страны подгрупп 1.1, 1.2, 2.1, 2.3

в период с 1994 по 2007 гг. Для выявления доминирующих подгрупп в разные периоды времени представляет интерес ретроспективный анализ представительной группы изолятов вируса КЧС.

Филогенетический анализ изолятов на основании секвенирования последовательности нуклеотидов участка гена Е2 показал, что в 80-е годы прошлого столетия доминировал вирус подгрупп 1.2, 2.3, 2.2 и единичные случаи - 1.1 и 2.1; в 90-е годы до 2002 г. - 1.1 и 2.3; в 2002-2007 гг. - подгруппы 2.3 (рисунок 6).

Хронологически, «ранние» изоляты 2-х спорадических вспышек 1981-1984 гг. (№№ 1,31- Амурская обл.; 2а - Хабаровский край) отнесены к группе 2, подгруппе 2.3, в которую также включены изоляты № 21 1983 года (Свердловская обл.), и подгруппе 2.2, изоляты №№ 40,46, выделенные от поросят 2-х разных вспышек КЧС в Одесской обл. (Украина) в 1984 году.

Подтверждение эпизоотологической связи и генетическое соответствие изолятов, вызвавших вспышки КЧС, можно видеть у изолятов №№ 40, 46 подгруппы 2.2 (Одесская область) и №№ 35 (Запорожская область), 42 (Полтавская область) подгруппы 1.2. С учётом географической локализации, хронологии вспышек и на основании данных секвенирования, можно с уверенностью предположить об идентичности изолятов № 40 Ренийского района Одесской области (вспышка 5 июля 1984 г. совхоз «Откормочный») и № 46 Болградского района Одесской области (вспышка 19 октября 1984 г., колхоз «им. Ленина»), первичным из которых является изолят № 40 (рисунок 4), и изолятов № 35 Запорожской области (вспышка 13 марта 1984 г.) и № 42 Полтавской области (вспышка 22 августа 1984 г.). Подтверждением этому можно также считать факт отсутствия регистрации в этих регионах других вспышек КЧС.

П и 8 6 I I О

Рисунок 4. Эпизоотологическая связь вспышек КЧС, подтверждённая генетическими исследованиями изолятов № 40 и 46 вируса КЧС (Украина, Одесская область, 1984 г.)

Изоляты №№ 26, 27, 44 и 47, выделенные при вспышках в начале 80-х годов при спорадических вспышках КЧС в свиноводческих хозяйствах Кавказа (Ингушетия, Краснодарский край), Татарстане и Владимирской области, а также №№ 9, 12, 35 и 36 - в Армении, Молдавии и Украине, соответственно, отнесены к группе 1, подгруппе 1.2.

Таким образом, филогенетический анализ изолятов, относящихся к спорадическим вспышкам КЧС 80-х годов, показал циркуляцию на территории СССР в этот период вируса генетических групп 1 и 2, преимущественно подгрупп 1.2 и 2.3.

Изоляты, вызывавшие спорадические вспышки КЧС в 2004-2007 гг., принадлежат к группе 2 подгруппе 2.3, как у домашних, так и у диких свиней. В некоторых случаях получено полное кластерное соответствие изолятов, выделенных при повторных исследованиях вирусов, выделенных от инфицированных свиней с интервалом в несколько недель (например, изоляты 841 и 843) или очень близкое совпадение (изоляты 781 и 805). Спорадические вспышки КЧС среди диких кабанов в вакцинированной зоне (Тверская область) также вызваны вирусом подгруппы 2.3 (рисунок 5).

Рисунок 5. Генотипическая принадлежность и кластерное соответствие изолятов вируса КЧС, выделенных от диких свиней при вспышках болезни в вакцинированных зонах в 2007 г. (вакцина на основе штамма ЛК-К)

Так как накопление мутаций в геноме вируса КЧС идет относительно медленно, изоляты, выделенные при последовательных вспышках, практически идентичны, что дает возможность отличать первичные случаи от новых случаев заноса вируса и получать подтверждение гипотез о факторах циркуляции вируса. А также дает возможность следить за генетической стабильностью вакцинных штаммов.

В ходе работы было показано, что для более точного разделения на генетические подгруппы вируса КЧС лучше использовать последовательность участка наиболее вариабельного гена поверхностного гликопротеина Е2. Для

разделения вирусов КЧС на группы, а также для дифференциации вирусов рода Pestivirus между собой, лучше использовать последовательность участка 5'-НТО.

Не было обнаружено ни одного изолята, эволюционно близкого к вакцинным штаммам КС и JIK-ВНИИВВиМ, несмотря на то, что данные вакцины применялись в Российской Федерации на протяжении более чем 30 лет; не обнаружено признаков их реверсии к дикому типу.

Рисунок 6. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства между российскими полевыми изолятами и референтными штаммами вируса КЧС основанная на анализе нуклеотидной последовательности гена кодирующего поверхностный гликопротеин Е2 (190 п.о.)

368.seq 370.seq 361.seq 338.seq 326.seq 285.seq

100,seq 126.seq 116.seq

21 _sverdlovski_reg_1983.seq

294.seq

760.seq

840.seq

841.seq

842.seq

843.seq

867.seq

868. seq 892.seq 870.seq 897.seq ALFTUB.SEQ

2_.habarovski_krai_1981.seq

1_amurski_reg_1981.seq

15_1984.seq

97 seq

143.seq

175.seq

188.seq

275.seq

324.seq

259.seq

40_ukraina_odesski_.reg_1984.sec 46_ukraina_odesskl-.reg_1984.se< Italian c3D.seq

101.seq 223.seq

individual isolate Italian s7D2.seq

663.seq

741.seq

6S2.seq

755,seq

778.seq

792.seq SHIMEN.SEQ 644.seq 642.seq 668.seq 702.seq

793.seq 805.seq 814.seq 781.seq 791.seq 798.seq 816.seq 681.seq 735.SEQ ¿i_F187.SEQ 233.seq GPE-.SEQ

47_v1adimirski_reg_1984.seq 72 seq

44_tatars tan_19 84.s e q 55 seq

35_ukraina_3aporozhie_1984.seq 38_ukraina_2aporozhie_1 984.seq 42_ukraina_poltavski_reg_1984se 26_ch echen ski_reg_1983 s eq 27_kras nodarski_krai_1983 s eq 96 seq 152.seq

12_moldaua_l982.seq

9_armenia_.1982.seq

LK.SEQ

P97.SEQ

10 8 6 4 2

Nucleotide Substitutions (xlOO)

5.4. Анализ полного генома вакцинного штамма JIK-K вируса КЧС

В РФ используется живая вакцина для пероральной иммунизации диких кабанов против КЧС на основе штамма J1K-K. Тем не менее, предотвратить распространение вирулентного вируса в популяции пока не удаётся.

В связи с продолжающейся регистрацией КЧС среди диких свиней в 2007 г. начата компания оральной вакцинации кабанов в Северо-Западном (Архангельская область), Центральном (Тверская, Московская, Владимирская, Калужская, Тульская, Смоленская, Рязанская, Липецкая, Воронежская), Приволжском (Нижегородская), Южном (Ростовская, Волгоградская), Сибирском (Красноярский край, Республика Бурятия) и Дальневосточном (Амурская область). К маю 2008 г. было вакцинировано приблизительно 50000 диких свиней.

Несмотря на широкое использование вакцины на основе штамма JIK-K, его нуклеотидная последовательность до сих пор не была опубликована.

Для определения нуклеотидной последовательности штамма JIK-K мы использовали консервативные праймеры разработанные [Забережный А.Д., 2004], для полноразмерного секвенирования вируса КЧС, штамм КС.

I-ShiminHVRI.s

— 1-LKK(2300).se

-Eystrup.seq

-—............... Alfott187.seq

- -Glentorf.seq

_I— Riems.seq

— Chinese.seq

..............................Brescia.seq

-CS.seq

-AlfortTub.seq

I-94.4TWN.sec

8 6 4 2 0

Ыис1еоМе БиЬгШопз (хЮО)

Рисунок 7. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства между российским вакцинным штаммом ЛК-К и референтными штаммами вируса КЧС

Мы определили нуклеотидную последовательность генома вакцинного штамма ЛК-К. Геном штамма содержит одну открытую рамку считывания, длинной 11685 нуклеотидов, фланкированную 5' и З'-нетранслируемыми областями. Геном не содержит делеции, описанной у вакцинного штамма КС [Забережный А. Д., 2004], в 3'-концевой области. Филогенетическая дендрограмма основанная на компьютерном анализе генома штамма ЛК-К и 10 референтных штаммов вируса КЧС, представлена на рисунке 7. Штамм ЛК-К относится к группе 1, подгруппе 1.1 по классификации, предложенной [Ьош^б ¿Р. а а1., 1996].

выводы

1. В результате проведения филогенетического анализа изолятов вируса КЧС за период с 1980 по 2007 годы и филогенетического анализа изолятов вируса диареи КРС, выделенных в 2006 и 2007 годах, на территории Российской Федерации установлена циркуляция вирусов КЧС, относящихся к генетическим группам 1 (подгруппы 1.1 и 1.2) и 2 (подгруппы 2.1, 2.2 и 2.3), и циркуляция вируса диареи КРС первого и второго генотипов.

2. Установлено, что в 80-е, годы прошлого столетия доминировал вирус подгрупп 1.2, 2.3, 2.2 и единичные случаи - 1.1 и 2.1; в 90-е годы и до 2002 г. -подгрупп 1.1 и 2.3; в 2002-2007 гг. - подгруппы 2.3. Таким образом, показано постепенное замещение циркулирующих групп вируса КЧС в Российской Федерации.

3. Впервые на территории Российской Федерации выявлен факт циркуляции 2-го генотипа вируса диареи КРС.

4. Определена нуклеотидная последовательность вакцинного штамма JIK-K вируса классической чумы свиней. Данный штамм принадлежит к генетической группе 1, подгруппе 1.1.

5. По данным проведенного филогенетического анализа не обнаружено ни одного полевого изолята, эволюционно близкого к вакцинным штаммам КС и ЛК-ВНИИВВиМ.

6. Разработан комплект реагентов для штаммовой дифференциации вируса классической чумы свиней с помощью ПЦР и секвенирования фрагментов генов Е2, NS5B и 5'-нетранслируемой области, утверждены методические рекомендации.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Yuzhakov A.G., Bunkova N.I., Grebennikova T.V., Kurinnov V.V., Zaberezhnuy A.D. Phelogenetic analysis of CSFV isolates that caused sporadic cases and epizooties in USSR and Russia. //Материалы конференции «Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I.Vavilov», Kyiv, Ukraine, 20-22 September 2007г., C.65.

2. Южаков А.Г., Бунькова Н.И., Куриннов В.В., Забережный А.Д.. Молекулярно-генетический анализ пестивирусов. //Материалы Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» - Москва, 22-25 сентября 2008 г., С. 24

3. Южаков А.Г., Устинова Г.И., Глотов А.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Кунгурцева О.В., Забережный А.Д., Алипер Т.И. Филогенетический анализ нецитопатогенных изолятов вируса диареи крупного рогатого скота//Ветеринария - 2009 - №6, С. 29-32.

4. Костина JI.B., Непоклонов Е.А., Забережный А.Д., Южаков А.Г., Козлов А.Ю. Картирование антигенных детерминант белка Е2 вируса классической чумы свиней с помощью синтетических пептидов// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология - 2009 №3, С. 26-31

5. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Южаков А.Г., Забережный А.Д., Алипер Т.И. Выделение нецитопатогенного изолята вируса диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 2 генотипа на территории Российской Федерации //Вопросы вирусологии - 2009 №5, С.43-47

Заказ № 19-а/11/09 Подписано в печать 03.11.2009 Тираж 90 экз. Усл. пл. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Южаков, Антон Геннадиевич

1. Список сокращений

2. Введение

3. Обзор литературы

3.1. Общая характеристика и систематическое положение представителей рода Ревйу^ив

3.2. Клинические признаки и патогенез классической чумы свиней

3.3. Клинические признаки и патогенез вирусной диареи крупного рогатого скота

3.4. Эпизоотологические данные заболеваний, вызываемых вирусами рода Ревйу^ив

3.4.1. Эпизоотологические данные по классической чуме свиней

3.4.2. Эпизоотологические данные по вирусной диарее крупного рогатого скота

3.5. Морфология и молекулярно-биологическая характеристика представителей рода Ревйу^ив

3.5.1. Строение вириона представителей рода Резйу1гиз

3.5.2. Структура генома представителей рода Реэйуииз

3.6. Генетическая вариабельность пестивирусов и филогенетический анализ

3.6.1. Филогенетический анализ геномов вирусов

3.6.2. Генетическая вариабельность вируса классической чумы свиней

3.6.3. Генетическая вариабельность вируса вирусной диареи крупного рогатого скота

3.7. Диагностика и специфическая профилактика заболеваний, вызываемых пестивирусами 33 3.7.1. Диагностика заболеваний, вызываемых пестивирусами

3.7.2. Специфическая профилактика классической чумы свиней

3.7.3. Специфическая профилактика вирусной диареи крупного рогатого скота 38 3.8. Заключение по обзору литературы

4. Собственные исследования

4.1. Материалы и методы

4.2. Материалы

4.2.1. Штаммы и изоляты вирусов классической чумы свиней и диареи крупного рогатого скота

4.2.1.1. Штаммы и изоляты вируса диареи крупного рогатого скота

4.2.1.2. Штаммы и изоляты вируса классической чумы свиней

4.2.1.3. Анализируемые штаммы из базы данных вепБапк

4.2.2. Химические реагенты

4.2.3. Реагенты и наборы для проведения ПНР и секвенирования

4.2.4. Оборудование

4.2.5. Расходные материалы и лабораторная посуда

4.3. Методы

4.3.1. Реакция иммунофлуоресценции

4.3.2. Выделение вирусной РНК

4.3.3. Проведение «гнездовой» ПЦР с обратной транскрипцией для выявления РНК вирусов классической чумы свиней и диареи крупного рогатого скота

4.3.3.1. Праймеры и режимы проведения ПЦР для наработки трёх фрагментов генома вируса диареи крупного рогатого скота

4.3.3.2. Праймеры и режимы проведения ПЦР для наработки трёх фрагментов генома вируса классической чумы свиней

4.3.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле

4.3.5. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генома

4.3.6. Компьютерный анализ полученных первичных структур и построение филогенетических дендрограмм

5. Результаты собственных исследований

5.1. Разработка систем праймеров для анализа методом ПЦР и последующего секвенирования трёх участков генома вируса диареи крупного рогатого скота, используемых для филогенетического анализа

5.2. Филогенетическая характеристика полевых изолятов вируса диареи крупного рогатого скота, циркулирующих на территории России

5.3. Филогенетическая характеристика полевых изолятов вируса классической чумы свиней, циркулировавших на территории бывшего СССР и России

5.4. Анализ генома вакцинного штамма ЛК-К, вируса классической чумы свиней

6. Обсуяедение

7. Выводы

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Южаков, Антон Геннадиевич

7. ВЫВОДЫ

1. В результате проведения филогенетического анализа изолятов вируса КЧС за период с 1980 по 2007 годы и филогенетического анализа изолятов вируса диареи КРС, выделенных в 2006 и 2007 годах, на территории Российской Федерации установлена циркуляция вирусов КЧС, относящихся к генетическим группам 1 (подгруппы 1.1 и 1.2) и 2 (подгруппы 2.1, 2.2 и 2.3), и циркуляция вируса диареи КРС первого и второго генотипов.

2. Установлено, что в 80-е годы прошлого столетия доминировал вирус подгрупп 1.2, 2.3, 2.2 и единичные случаи - 1.1 и 2.1; в 90-е годы и до 2002 г. - подгрупп 1.1 и 2.3; в 2002-2007 гг. - подгруппы 2.3. Таким образом, показано постепенное замещение циркулирующих групп вируса КЧС в Российской Федерации.

3. Впервые на территории Российской Федерации выявлен факт циркуляции 2-го генотипа вируса диареи КРС.

4. Определена нуклеотидная последовательность вакцинного штамма ЛК-К вируса классической чумы свиней. Данный штамм принадлежит к генетической группе 1, подгруппе 1.1.

5. По данным проведенного филогенетического анализа не обнаружено ни одного полевого изолята, эволюционно близкого к вакцинным штаммам КС и ЛК-ВНИИВВиМ.

6. Разработан комплект реагентов для штаммовой дифференциации вируса классической чумы свиней с помощью ПЦР и секвенирования фрагментов генов Е2, И85В и 5'-нетранслируемой области, утверждены методические рекомендации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Южаков, Антон Геннадиевич, Москва

1. Безбородова C.B. Усовершенствование генетических методов лабораторной диагностики классической чумы свиней // Автореф. Канд. Дис., Владимир, 2000. -С.21.

2. Вишняков И. Ф., Мищенко Н. К., Куринов В. В. и др. Классическая чума свиней // Ветеринария. 1998. -№11. — С. 16-22.

3. Глотов А. Г., Глотова Т.И., Рябчикова Е.И. и др. Выделение и характеристика изолятов вируса диареи крупного рогатого скота // Вопросы Вирусологии.-2006.-№1 .-С.42-45.

4. Жидков С.А., Лебедев А.И., Гоголев М.М. и др. Роль вирусной диареи в этиологии респираторных и желудочно-кишечных болезней телят// Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. -1995. №3. - С. 50-53.

5. Забережный А.Д. Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно — синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов// Докт. Дис., Москва, 2004.- С. 254.

6. Куриннов В.В., Коломыцев A.A., Сергеев В.А. и др. Эпизоотология классической чумы свиней в Российской Федерации (1990-2007 гг.).-2008.

7. Прокофьев М.А. Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот // 1985. — Москва Изд-во МГУ

8. Салганник Р.И. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. //Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990.

9. Семенихин В.И., Пузырев А.Т., Орешкова С.Ф., Донченко A.C., Чекишев В.М., Ильичев A.A. Выявление вируса классической чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология-1999- 1-С.27-30.

10. Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.Н. Вирусы и вирусные вакцины//М.:Библионика, 2007.

11. Стариков A.M. Классическая чума свиней: территориальное распространение и анализ эпизоотического процесса в Волгоградской области // Автореф. канд. дис., Покров, 2005, -С. 26.

12. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных //1998, Москва, ВНИТИБП.

13. Херрингтон С., Макги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Методы// 1999. Москва, Мир.

14. Шульпин М.И., Аянот П.К., Мищенко В.А. Индикация вируса диареи крупного рогатого скота, генотипирование и филогенетический анализ изолятов, выявленных на территории Российской Федерации // Вопросы Вирусологии.-2003.-№5.-С.41-46.

15. Шульпин М.И. Выявление возбудителя вирусной диареи КРС с помощью полимеразной цепной реакции и генотипирование изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации // Дис. канд. биол. наук: 03.00.06: Владимир, 2004.-С. 132.

16. Щербаков А.В., Кукушкин С.А., Тимина A.M. и др. Мониторинг инфекционных болезней среди кабанов // Вопросы Вирусологии.-2007. №3 -С. 29-33.

17. Agapov E.V., Murray С. L., Frolov I. et. al. Uncleaved NS2-3 is required for production of infectious bovine viral diarrhea virus // J. Virol. 2004. - Vol.78. - pp.2414-2425.

18. Balint A., Baule C., Palfi V., et al. Retrospective genome analysis of a live vaccine strain of bovine viral diarrhea virus // J. Vet. Res. 2005.-Vol.36-pp. 89-99.

19. Becher P., Orlich M., Shannon A., Phylogenetic analysis of pestivimses from domestic and wild ruminants // J. of General Virology.-1997.-Vol. 78.-pp. 1357-1366.

20. Becher P., Ramirez R.A., Orlich M., et al. Genetic and antigenetic characterization of novel pestivirus genotipes: implications for classification // Virology-2003 .-Vol.311-pp. 96-104.

21. Bezborodova S., Andreev V., Drygin V. et al. XI International congress of virology 9-13 august 1999 Sydney 1999.-p.329.

22. Booker C.W., Abutarbush S.M., Morley P.S., et all. The effect of bovine viral diarrhea virus infections on health and performance of feedlot cattle // Can. Vet. J.- 2008.-Vol. 49.- pp. 253-260.

23. Brock, K.V. The persistence of bovine viral diarrhea virus // Biologicals-2003.- Vol.31 .-pp. 131 -135.

24. Brock, K.V., Deng R., and Riblet S. M. Nucleotide sequencing of 5' and 3' termini of bovine viral diarrhea virus by RNA ligation and PCR II Virol. Methods.- 1992.-pp. 38, 39-46.

25. Bruschke C. J., Hulst M. M., Moormann R. J. et. al. Glycoprotein of pestiviruses induces apoptosis in lymphocytes of several species // J. Virol. 1997. - Vol.71. - pp.6692-6696.

26. Collett M. S., Moennig V., Horzinek M. C. Recent Advances in Pestivirus Research // J. Jen. Virol. 1989. - Vol.70, part 2. - pp.253-266.

27. Dong X. N., Chen Y. H. Marker vaccine statagies and candidate CSFV marker vaccines // Vaccine. — 2007. Vol.25. — pp.205-230.

28. Edwards S., Moenning V., Wensvoort G. The development of an international referens panel of monoclonal antibodies for the differentiation of hog cholera virus from pestiviruses // Vet. Microbiol. — 1991. Vol.29. -pp.101-108.

29. Elbers K., Tautz N., Becher P. et. al. Processing in the pestivirus E2-NS2 region: identification of proteins p7 and E2p7 // J. Virol. 1996.1. Vol.70.-pp.4131-4135.

30. Ericson G.A. Hog Cholera (Swine fever)// In: Vet. Diagn. Virology. Mosby year book. USA, Ed. A.E. Castro, W.P.Heushele, 1992.-pp. 228230.

31. Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J. Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses // Elsevier. 2005.

32. Felsenstein, J. Phylip phylogeny inference package (version 3.5c) // Cladistics.- 1989.- Vol.5, -pp. 164-166.

33. Fletcher S. P., Jackson R. J. Pestivirus internal ribosome entry site (IRES) structure and function: elements in the 5' nontranslated region important for IRES function // J. Virol. 2002. - Vol.76. - pp.5024-5033.

34. Franki R.I. B., Faquet C.M., Knudson D.L., Brown F. ( editors), 1991 . Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Archives of Virology // Supplementum 2,-pp. 223-233.

35. Frolov I, McBride M.S, Rice C.M. cis-acting RNA elements required for replication of bovine viral diarrhea virus-hepatitis C virus 5' nontranslated region chimeras RNA // 1998.-Vol.4-pp. 1418-1435.

36. Gil L. H., Ansari I. H., Vassilev V. et. al. The amino-terminal domain of bovine viral diarrhea virus Npro protein is necessary for alpha/beta interferon antagonism // J. Virol. 2006. - Vol.80. - pp.900-911.

37. Grassmann C. W., Isken O., Tautz N., Behrens S. E. Genetic analysis of the pestivirus nonstructural coding region: defects in the NS5A unit can be complemented in trans // J. Virol. 2001. - Vol.75. - pp.7791-7802.

38. Grebennikova T.V., Zaberezhny A.D., Paton D.J., McGoldrick A., Aliper T.I., Nepoklonov E.A. Sequencing analysis of the Classical Swine

39. Fever Virus. O.I.E. Symposium on Classical Swine Fever (Hog Cholera)// Birmingham (United Kindom), 1998.-9-10 July, -p.53.

40. Greiser-Wilke I., Grummer B., Moenning V. Bovine viral diarrhoea eradication and control programmes in Europe // Biologicals-2003.-Vol.31-pp. 113-118.

41. Goens D. S. The evolution of bovine viral diarrhea: a review//Can. Vet. J.- 2002,-Vol. 43.- pp. 946-954.

42. Gu B., Liu C., Lin-Goerke J. et. al. The RNA helicase and nucleotide triphosphatase activities of the bovine viral diarrhea virus NS3 protein are essential for viral replication // J. Virol. 2001. - Vol.74. - pp. 1794-1800.

43. Harada T., Tautz N., Thiel H. J. E2-p7 region of the bovine viral diarrhea virus polyprotein: processing and functional studies // J. Virol. -2000. Vol.74. - pp.9498-9506.

44. Heinz F.X., Collett M.S., Purcell R.H., et al. Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy Viruses // 2000. -Academic Press San Diego.- pp. 859-878.

45. Hilton L., Moganeradj K., Zhang G. et. al. The Npro product of bovine viral diarrhea virus inhibits DNA binding by interferon regulatory factor 3 and targets it for proteasomal degradation // J. Virol. 2006. - Vol.80. -pp.11723-11732.

46. Hoff H.S, Donis R.O. Induction of apoptosis and cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by cytopathic bovine viral diarrhea virus infection // Virus Res.- 1997.-Vol.49-pp. 101-113.

47. Hofmann M.A., Brechtbuchl K., Stauber N. Rapid characterization of new Pestivirus strain by direct sequencing of PCR-amplified cDNA from5' noncoding region // Arch. Virol., 1994- Vol. 139-pp.217-229.

48. Houe H. Epidemiological features and economical importance of bovine viral diarrhea virus (BVDV) infection // Vet. Microbiol.- 1999.-Vol 64-pp. 89-107.

49. Houe H., Lindberg A., Moennig V. Test strategies in bovine viral diarrhea virus control and eradication campaigns in Europe // J. Vet. Diagn. Invest.-2006.-Vol. 18.-pp. 427-436.

50. Isken O., Grassman C. W., Yu H., Behrens S.-E. Complex signals in the genomic 3' nontranslated region of bovine viral diarrhea virus coordinate translation and replication of the viral RNA // RNA. — 2004. — Vol.10.-pp. 1637-1652.

51. Kim I., Hyun B., Shin J., et al. Identification of Bovine Viral Diarrhea Virus type 2 in Korean native goat (Capra hircus) // J.Virus Research-2006.-Vol.l21-pp. 103-106.

52. Lackner T., Muller A., Pankraz A. et. al. Temporal modulation of an autoprotease is crucial for replication and pathogenicity of an RNA virus // J. Virol. -2004. Vol.78, - pp. 10765-10775.

53. Lackner T., Thiel H. J., Tautz N. Dissection of a viral autoprotease elucidates a function of a cellular chaperone in proteolysis // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2006. - Vol. 103. - pp. 1510-1515.

54. Langedijk J. P. Translocation activity of C-terminal domain of Pestivirus Erns and ribotoxin L3 loop // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277, -pp.5308-5314.

55. Leforban J., Edwards S., Ibata G., Vannier P. A blocking ELISA to differentiate hog cholera virus antibodies in pig sera from those due to other pestiviruses // Ann. Rech. Vet.-1990.-Vol. 21-pp.119-129.

56. Lindenbach B. D., Rice C.M. Flaviviridae: the viruses and their replication. // In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E. et. al. (Eds.), Fields Virology. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia 2001.pp.991-1041.

57. Liang R., Babiuk A.L. and Van Drunen Littel-van den Hurk S. Compatibility of plasmids encoding bovine viral diarrhea virus type 1 and type 2 E2 in a single DNA vaccine formulation // 2007.- Vaccine- Vol. 25-pp. 5994-6006.

58. Lowings J.P., Ibata G., Needham J., Paton D.J. Classical swine fever virus diversity and evolution//J. Gen. Virol.-1996.-Vol.77.-pp. 1311-1321

59. Lowings J.P., Paton D.J., Sands J.J., De Mia G.M., Rutili D. Classical swine fever: genetic detection and analysis of differences between virus isolates//J. Gen. Virol.-1994.-Vol.75.-pp.3461-3468.

60. Mengeling W. L., Packer R. A. Pathogenesis of chronic hog cholera: host response // American Journal of Veterinary Research. 1966. -Vol.30.-pp.409-417.

61. Meyers G., Saalmuller A., Buttner M. Mutation abrogating the RNase activity in glycoprotein Erns of the pestivirus classical swine fever virus lead to virus attenuation // J. Virol. 1999. - Vol.73. - pp. 10224-10234.

62. Meyers G., Thiel H.-J. Molecular characterization of pestiviruses // Adv. Virus Res. 1996. - Vol.47. - pp.53-118.

63. Moening V. Introduction to classical swine fever: virus, disease and control policy // J. Veterinary Microbiology.- 2000.-Vol.73.- pp. 93-102.

64. Moening V., Liess B. Pathogenesis of intrauterine infections with bovine viral diarrhea virus // Vet Clin N Am Food Anim Pract 1995. -Vol. 11-pp. 477-487.

65. Moennig V., Plagemann P. G. W. The pestiviruses // Advances in Virus Research. 1992. - Vol.41. - pp.53-98.

66. Moening V., Schageman G., Dahle J. et al. A new approach for the diagnosis of hog cholera//Dtsch. Tierdtztl.,Wsch.-1990.-Vol. 97-pp.91-93.

67. Moormann R. J. M., Van Gennip H. G. P., Miedema G. K. W., Hulst M. M., Van Rijn P. A. (1996): Infection RNA transcribed from anengineered full-length cDNA template of the genome of a pestivirus // J. Virol.-1996.-Vol.70.-pp. 763-770.

68. Murray C.L., Marcotrigiano J., Rice C.M. Bovine Viral Diarrhea Virus Core Is an Intrinsically Disordered Protein That Binds RNA // J. Virol.-2007.- Vol.82.-pp. 1294-1304.

69. Nagai M, Hayashi M., Sugita S., et al. Phylogenetic analysis of bovine viral different viruses using five different genetic regions // Virus Research.-2004.-Vol.99- pp. 103-113.79.

70. Nagai M., Sakoda Y., Mori M., et al. Insertion of cellular sequence and RNA recombination in the structural protein coding region of cytopathogenic bovine viral diarrhoea virus // J. Gen. Virol.- 2003.-Vol.84(Pt 2).-pp. 447-452.

71. Pankraz A., Thiel H.-J., Becher P. Essential and nonessential elements in the 3' nontranslated region of bovine viral diarrhea virus // J. Virol. — 2005. Vol.79. - pp.9119-9127.

72. Paton D.J., Carlsson U., Lowings J.P., Sands J.J., Vilcek S., Alenius S. Identification of herd-specific bovine viral diarrhoea virus isolates from infected cattle and sheep // Veterinary microbiology.- 1995.-Vol. 43.-pp.283-294.

73. Paton D. J., McGoldrick A., Greiser-Wilke I., et al. Genetic typing of classical swine fever virus // J. Veterinary Microbiology.-2000.-Vol.73.-pp. 137-157.

74. Pellerin C., van de Hurk J., Lecomete J. et al. Identification of a newgroupe of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities // Virology- 1994.-Vol.203.-pp.260-268.

75. Qu L., McMullan L. K., Rice C. M. Isolation and characterization of noncytopathic pestivirus mutants reveals a role for nonstructural protein NS4B in viral cytopathogenicity // J. Virol. 2001. - Vol.75. - pp. 10651-10662.

76. Reimann I., Depner K., Trapp S., Beer M. An avirulent chimeric Pestivirus with altered cell tropism protects pigs against lethal infection with classical swine fever virus // Virology. 2004. - Vol.322. - pp. 143157.

77. Ridpath J., Bolin S.R., Dubovi EJ. Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes // Virology.-1994.-Vol.205.-pp.66-74.

78. Risatti G.R., Callahan J.D., Nelson W.M., Borca M.V. Rapid detection of classical swine fever virus by a portable real-time reverse transcriptase PCR assay // Journal of clinical microbiology.-2003-Vol. 41-pp.500-505.

79. Rumenapf T., Stark R., Meyers G., Thiel H.-J. Structural proteins of hog cholera virus expressed by vaccinia virus: futher characterization and induction of protective immunity// Journal of Virology.- 1991.-Vol. 65.-pp.589-597.

80. Schirrmeier H., Strebelow G., Depner K., et al. Genetic and antigenic characterization of an atypical pestivirus isolate, a putative member of a novel pestivirus species // J. of General Virology.-2004.-Vol. 85.- pp. 3647-3652.

81. Schweizer M, Peterhans E. Oxidative stress in cells infected with bovine viral diarrhoea virus: A crucial step in the induction of apoptosis // J Gen Virol-1999.-Vol.80.-pp.l 147-1155.

82. Seki Y., Seimiya Y.M., Motokava M. et al. Application of Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis to Simple and Rapid Genotiptng of Bovine Viral Diarrhea Virus Strains Isolated in Japan // J. Vet. Med.

83. Sci.-2008.-Vol.70(4)-pp. 393-395.

84. Stadejek T, Warg J, Ridpath JF. Comparative sequence analysis of the 5' noncoding region of classical swine fever virus strains from Europe, Asia, and America // Arch Virol.-1996.-Vol. 141.-pp.771-776.

85. Stark R., Rumenapf T., Meyers G., Thiel H.-J. 1990 Cenomic localization of hog cholera virus glycoproteins // Virology.-1990.- Vol. 174.-pp. 286-289.

86. Steffens S., Thiel H.-J., Behrens S. E. The RNA-dependent RNA polymerases of different members of the family Flaviviridae exhibit similar properties in vitro // J. Gen. Virol. — 1999. Vol.80. - pp.25832590.

87. Susa M., Konig M., Saalmuller A. et. al. Pathogenesis of classical swine fever: B-lymphocyte deficiency caused by hog cholera virus // Journal of Virology. 1992. - Vol.66, -pp.1171-1175.

88. Terpstra C. Hog cholera: an update of present knowledge // Br. Vet. J.-1991 .-Vol. 147.-pp.397-406.

89. Thiel H.J., Plagemann P.G.W., Moenning V. Pestiviruses // Fields Virology, Third Edition.- 1996-pp. 1059-1071.

90. Thiel H.J., Stark R., Weiland E., Rumenapf T., Meyer G. Hog Cholera Virus: Molecular Composition of virions from a pestivirus //J. Of Virology.- 1991.- Vol.65- pp.4705-4712.

91. Trautwein G. Pathology and pathogenesis of the disease // In: Liess B. (Ed.), Classical Swine Fever and Related Infections. Martinus Nijhoff Publishing, Boston. 1988. -pp.24-27.

92. Van Oirschot J.T., Terpstra C. Hog cholera virus // Virus infections of porcines. Amsterdam, 1989. -pp.113-130.

93. Van Oirschot J. T., Terpstra C. A. Congenital persistent swine fever infection. I. Clinical and virological observations// Veterinary Micribiology. 1977. - Vol.2, - pp.121 - 132.

94. Vilcek S., Durcovic B., Kolesarova M., et al. Genetic diversity of international bovine viral diarrhoea virus (BVDV) isolates: identification of a new BVDV-1 genetic group // Vet Res.-2004.-Vol. 35- pp. 609-615.

95. Vilcek S., Nettleton P.F. Pestiviruses in wild animals // Veterinary Microbiology-2006.-Vol.l 16-pp. 1-12.

96. Vilcek S., Stadejek T., Ballagi-Pordany A. et al. Genetic variability of classical swine fever virus // Virus Res.-1996.-Vol.43.-pp. 137-147.

97. Vlasova A., Grebennikova T., Zaberezhny A., Greiser-Wilke I., Floegel-Niesmann G., Kurinnov V., Aliper T., Nepoklonov E. Molecular epidemiology of classical swine fever in the Russian Federation // J. Vet. Med.- 2003.-Vol.50-pp.363-367.

98. Wakeley P.R., Turner J.L., Ibata G et al. Characterisation of a type 2 bovine viral diarrhoea virus isolated from cattle in the UK // Vet.Microbiol.-2004.-Vol. 102.-pp. 19-24.

99. Warrener P., Collett M. S. Pestivirus NS3 (p80) protein possesses RNA helicase activity // J. Virol. 1995. - Vol.69. - pp.1720-1726.

100. Weiland F., Weiland E., Unger G. et. al. Localization of pestiviral envelope proteins Erns and E2 at the cell surface and on isolated particles //J. Gen. Virol. 1999. - Vol.80, - pp. 1157-1165.

101. Wengler G. Flaviviridae // Arch, of Virology.- 1991.- (Suppl. 2).pp.223-233.

102. Wensvoort G., Terpstra C., deKluijver E.P., Kragten C., Warnaar J.C. Antigenic differentiation of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus // Vet. Microbiol.- 1989.- Vol.21- pp. 9-20.

103. Wiskerchen M., Beizer S. K., Collett M. S. Pestivirus gene expression: the first protein product of the bovine viral diarrhea virus large open reading frame, p20, possesses proteolytic activity // J. Virol. 1991. -Vol.65.-pp.4508-4514.

104. Wofmeyer A., Wolf G., Beer M et al. Genomic (5'-UTR) and serological differences among German BVDV field isolates // Arch.Virol.-1997.-Vol.l42.-pp.2049-2057.

105. Xia H., Liu L., Wahlberg N., et al. Molecular phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea virus: A Bayesian approach // Virus Res.- 2007-Vol.45-pp. 2143-2152.

106. Xiao M., Gao J., Wang W. et. al. Specific interaction between the classical swine fever virus NS5B protein and viral genome // Eur. J. Biochem. -2004. Vol.271-pp.3888-3896.

107. Xu X., Zhang Q., Yu X., et al. Sequencing and comparative analysis of a pig bovine viral diarrhea virus genome // J. Virus Research-2006.-Vol.-122.-pp. 164-170.

108. Yu H., Grassman C. W., Behrens S.-E. Sequence and structural elements at the 3' terminus of bovine viral diarrhea virus genomic RNA: functional role during RNA replication // J. Virol. 1999. - Vol.73. -pp.3638-3648.

109. Zaberezny A.D., Grebennikova T.V., Kurinnov V.V., Tsybanov S.G.,