Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика вирусспецифических макромолекул вакцинных и вирулентных штаммов вируса болезни Ауески

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Арсентьева, Татьяна Михайловна

ВВЕДЕНИЕ V.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологические и антигенные свойства,ВБА

1.2. Структура вириона ВБА

1.3. Репродукция ВБА.

1.4. Генетический состав вирусной популяции

2. МАТЕРИАЛЫ И 1ЕГ0ДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Рестрикционннй анализ вирусной ДНК вакцинного и вирулентного, штаммов ВБА

3.2. Изучение вирусспещГфических белков вакцин, ных и вирулентных штаммов ВБА

3.3. Анализ структурных белков вакцинного и вирулентного штаммов ВБА

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика вирусспецифических макромолекул вакцинных и вирулентных штаммов вируса болезни Ауески"

Актуальность проблемы. Болезнь Ауески (Herpesvirus suis) продолжает оставаться одной из распространенных инфекций сельскохозяйственных и домашних животных, пушных зверей и грызунов, нанося большой экономический ущерб животноводству и, особенно, свиноводству (Никитин М.Г., 1966; Сюрин В.Н., Фомина Н.В., 1979; Татаров Г., 1978; Borgen H.G.,Bendixen H.I., 1967? Stear R.L., 1978; Muirhead M.R., 1978; Mayг A., 1984).

Существование постоянной угрозы возникновения и быст*-рого распространения, наличие длительного вирусоносительст-ва у переболевших животных, а также использование живых вирусных вакцин в целях борьбы и профилактики с этой инфекцией вызвало необходимость разработки эффективных и быстрых средств идентификации и дифференциации вакцинных и вирулентных штаммов вируса, так как они не имеют между собой надежных различий ни в биологическом построении, ни по серотипам, несмотря на разнообразные биологические маркеры (Bartha а., 1969; Kaplan A.S.,1969; Lloyd G., Baskervilli А., 1978; Toma В» et al, 1979? Piatt К.В*,Mare C.I.,Hlnz Р.И., 1979, 1980; colais P.,Sabo S., 1982).

Существенное значение в решении этих задач призваны сыграть исследования по изучению молекулярной биологии вируса болезни Ауески (ВБА).

В литературе не было обнаружено работ, посвященных систематическому изучению макромолекул вакцинных и вирулентных штаммоЕ ВБА, Исследования в этой области способствовали бы разработке более эффективных методов мегштаммовой дифференциации возбудителя, а такге пониманию механизмов приспособления вирусов к варьирущиы условиям репродукции в организме различных хозяев и такого важнейшего свойства как вирулентность ВБА. Такое исследование штаммов вируса вахно и в теоретическом плане изучения причин многообразия и путей эволюции герпес вирусов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась разработка методов дифференциации вакцинных и вирулентных штаммов ВБА на основе изучения их вирусспецифических макромолекул.

В задачи данного исследования входило:

1. Выявить, есть ли различия в продуктах рестрикциоиного гидролиза вирусной ДНК между вакцинным и вирулентным штаммами вируса.

2. Определить, имеется ли разница по составу вирусспецифических белков у вакцинных и вирулентных штаммов вируса.

3. Отработать метод получения концентрированных суспензий очищенного вируса и провести анализ структурных белков вакцинного и вирулентного штаммов вируса.

Научная новизна. Впервые установлено., что штаммы ВБА (вакцинные - ГНКИ, БУК-628 и вирулентные - Арский, "К", Эмбриональный), циркулирующие на территории нашей страны, четко различаются мехду собой по белковому профилю. Выявлена такге разница мезду вакцинным и вирулентным штаммами и по продуктам гидролиза вирусной ДНК рестриктирующими эндонуклеа-зами. Показано, что при аттенуации вирулентного штамма Эмбриональный ВБА до степени вакцинного (штамм ГНКИ) произошли изменения в структуре его ДНК и в составе белкового профиля.

Практическая ценность. На основе результатов исследований разработано и опубликовано "Методическое указание по изучению штаммовых различий вируса болезни Ауески с помощью электрофоретического анализа белкового профиля и рестринти-рующих эндонуклеаз" (КВИ,1985 г.) и получено удостоверение на рационализаторское предложение (КВИ,Казань, 1984 г.). Предлагается метод очистки и концентрирования ВБА, основное содержание которого представлено в опубликованных "Методических рекомендациях по получению очищенных, высокоочищенных и концентрированных препаратов некоторых ДНК-содержащих вирусов (оспы коз, оспы овец, оспы птиц и болезни Ауески)" (ВАСХНИЛ, 1984 г.) и получено удостоверение на рационализаторское предложение отраслевого значение (1985 г.).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на У.и У1 конференциях молодых ученых ВГНКИ (Москва, 1983,1984 гг^), на совместном заседании научных сотрудников лабораторий биофизики, биохимии, вирусологии, иммунологии и аэрозолей КВИ (Казань, 1984).

Публикация. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на SS страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собствен ных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов практических предложений и списка литературы, включающего 170 источников, в том числе 130 зарубежных. Диссертация содержит 8 рисунков и 5 таблиц,

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Арсентьева, Татьяна Михайловна

ВЫВОДЫ

1. При аттенуации вирулентного штамма Эмбриональный ВБА до степени вакцинного (ГНКИ) произошло изменение числа и электрофоретической подвижности олигонуклеотидов, на которые расщепляется геном при воздействии специфических эндо-нуклеаз. Соответственные изменения были обнаружены и в составе белкового профиля.

2. Расщепление ДНК мутанта (штамма ГНКИ) эндонуклеаза-ми рестрикции на меньшее число фрагментов - 12 и 4 в сравнении с вирусом дикого типа (штамм Эмбриональный) - 13 и 5 фрагментов указывает на возможную делецию в геноме, захватывающую специфический участок разрезания. Наличие в продуктах рестрикционного гидролиза полос меньшей интенсивности (минорных фрагментов) позволяет судить о существовании изомер? ных форм генома.

3. Вакцинные штаммы (ГНКИ, БУК-628) и вирулентные (Арский, "К", Эмбриональный) различаются между собой по белковому профилю: штамм БУК-628 отличается от всех других штаммов наличием дополнительного белка с молекулярной массой 28 кД; штамм "К" в отличие от штамма ГНКИ имеет белок с молекулярной массой 116 кД; Штамм Арский отличается от штамма ГНКИ наличием дополнительных белков с молекулярными массами 58,30 и 21 кД; в спектре белков вакцинного штамма ГНКИ отсутствует белок с молекулярной массой 118 кД, присутствующий у штамма Эмбриональный, но отмечается появление нового с молекулярной массой 112 кД.

4. Среди вирусспецифических белков ВБА 10 являются гликозилированными. Вирулентный штамм Арский отличается от вакцинного штамма ГНКИ наличием гликозилированных белков с молекулярными массами 83 и 86 кД, а последний в отличие от штамма Арский имеет в своем составе гликозилированные белки - 80 и 96 кД.

5, Введение дополнительного этапа селективной преципитации с помощью ПЭГ-6000 в метод очистки ВБА, включающий дифференциальное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, дало возможность получить высокоочищенную вирусную суспензию, содержащую не более 0,01% клеточных белков.

6.В составе зрелого вируса болезни Ауески выявлено 30 белков с молекулярными массами от 142 до.18 кД. Обнаружено, что вирулентный штамм Арский отличается от вакцинного штамма ГНР наличием белков с молекулярными массами 106,100,90, 82,77,52,32 кД, а последний в отличие от штамма Арский имеет белки с молекулярными массами 94,64,56,49 кД.

7. Получены новые сведения о структуре вирусспецифических макромолекул вакцинных и вирулентных штаммов ВБА, которые расширяют существующие представления о биологии возбудителя и создают основу для разработки и совершенствования методов его межштаммовой дифференциации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЩ01ЕНИЯ

1. Рекомендуется методика для изучения штаммовых различий ВБА с помощью электрофоретического анализа белкового профиля и продуктов гидролиза вирусной ДНК эндонуклеазами рестрикции (Методическое указание,Казань,КВИ,1985 г.).

2. Предлагается метод получения высокоочищенного и концентрированного культурального ВБА, который может быть использован для определения белкового состава вируса, для выделения Еирусной ДНК, при изучении его антигенных свойств, для получения гипериммунных специфических сывороток, антигена для постановки РСК, РДП, иммуноосмофореза и др. (Методические рекомендации,Москва,ВАСХНИЛ,1984 г.).

Автор выражает глубокую благодарность и признательность научным руководителям профессору Новошинову Г.П. и к.б.н., с.н.с. Прохоровой Э.М., а также профессору Селиванову А.В., профессору Простякову А.П,, д.м.н., с.н.с, Склянской Е.И., профессору Каверину Н.В., к.м.н.,о.н.с. Филатову Ф.П. за неослабленное внимание, практическую оценку полученных в ходе исследований результатов и ценную помощь в приобретении необходимых в научной работе навыков.

Очень признательна к.б.н., с.н.с. Цыганковой С.И., к.б.н., с.н.с. Ермаковой Г.И. за деятельную помощь в выполнении отдельных разделов работы.

Благодарю научных сотрудников и весь коллектив всех лабораторий, где мне приходилось работать, за консультативную и практическую помощь в повседневной работе.

- 78

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема дифференциации вакцинных и вирулентных штаммов ВБА является актуальной, но шесте с тем слабо разработанной. Существующие методы дифференциации, основанные на разнообразных биологических маркерах, являются косвенными и потому не дают прямого ответа, а систематическому молеку-лярно-биологическому и биохимическому изучению до настоящего времени штаммы вируса не подвергались, что, как нам представляется, позволит разработать.более эффективные методы меж-штаммовой дифференциации вируса.

В связи с этим, нами была поставлена цель - разработать методы дифференциации вакцинных и вирулентных штаммов ВБА на основе изучения их вирусспецифических макромолекул. Для этого были проанализированы продукты гидролиза вирусной ДНК вакцинного и вирулентного штаммов вируса эндонуклеазаш рестрикции, изучены с помощью пластинчатого электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия вирусспеци-фические белки штаммов вируса; отработан метод получения концентрированных суспензий очищенного вируса и проведен анализ структурных белков вакцинного и вирулентного штаммов вируса.

Изучение макромолекул вакцинных и вирулентных штаммов ВБА позволило установить, что все исследуемые штаммы, как вакцинные (ГНКИ, БУК-628), так и вирулентные (Арский, "К", Эмбриональный) четко различаются между собой по белковому профилю. Обнаружено, что в процессе аттенуации вирулентного штамма Эмбриональный до степени вакцинного штамма (ГНКИ) ч5У произошли изменения в структуре ДНК, а это в свою очередь нашло отражение в составе белкового профиля. Причем, наборы фрагментов исследуемых штаммов, полученные в результате рестрикций иного анализа, существенно различались между собой, образуя характерное для каждого штамма распределение, что дало возможность четко их дифференцировать.

Полученные сведение о выявленных различиях между вакцинным и вирулентным штаммами ВБА по структуре генома могут рассматриваться как разработка рестрикциоиного анализа штаммов вируса с целью их дифференциации, а способ получения концентрированных и высокоочищенных препаратов вируса - использоваться в научно-исследовательской работе институтов.

Изучение гетерогенности вирусных популяций и ,в частности, штаммов ВБА имеет определенное теоретическое и практическое значение. Во-первых, это может расширить представления о естественной вариабельности вирусов и гетерогенности их популяций в биоценозах, что важно учитывать при разработке вакцин и диагностических препаратов. Во-вторых, комплексное исследование вирионов и продуктов их дезинтеграции с помощью современных методов молекулярной биологии позволит не только оценивать особенности вирионов в целом, но и анализировать роль активных центров различных субъединиц, что способствовало бы в свою очередь созданию так называемых субъединичных вакцин, свободных от нуклеиновых кислот и другого балласта вирусных частиц.

Таким образом, наша работа находит свое место среди исследований, посвященных изучению путей эволюции вирусов группы герпес.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Арсентьева, Татьяна Михайловна, Казань

1. Анджапаридзе О.Г., Гаврилов В.М., Семенов Б.Ф., Степанова Л.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях. М., Медгиз, 1962, 236 с.

2. Ау эр бах К. Проблемы мутагенеза. М.~, 1978.

3. Бавылев П.М., Прохорова Э.М. Об изменчивости биологических свойств вируса болезни Ауески. В кн.: Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. Москва, 1966, т.1, с. 164.

4. Быковский А.Ф., Базылев П.М., Прохорова Э.М. Элект-ронноюикроскопическое исследование вируса болезни Ауески.- Ветеринария, 1964, Р 12, с. 13-15.

5. Владыко Г.В., Цилинский Я.Я. Изучение температуро-чувствитальных мутантов вируса ВЭЛ в тесте на комплементар-ность. Вопр.вирусол., 1979, Р 4, с. 406-409.

6. Гендон Ю.З. Молекулярная генетика вирусов человека и животных. М., Медицина, 1975, 302 с.

7. Горшунова Л.П. Вакцинопрофилактика живыми вирусными вакцинами и персистенция аттенуированных вирусов. В кн.: Тезисы докладов 16 Всесоюзного съезда микробиологов и эпидемиологов. М., 1977, ч.2, с.82-83.

8. Жданов В.М., Букринская А.Г. Репродукция миксовирусов. М., Медицина, 1969, 280 с.1.. Кданов В.М., Гайдамович С.Я. Общая и частная виру- 79 сология. Н., Медицина, 1982, т.1 и 2.

9. Едано в В.М., Львов Д.К. Эволюция возбудителей инфекционных болезней. М., Медицина, 1984, 270 с.

10. Зуева Н.Я« Изучение проницаемости плаценты животных для вируса болезни Ауески. Дисс. канд., Казань, 1979, 172 с.

11. Инге-Вечтомов С.Г., Сойдла Т.Р. Эволюционная и попу-ляционная генетика. Сер. "Общая генетика", 1978, т.З.

12. Инге-Вечтомов С.Г. Введение в молекулярную генетику. М., Высшая школа, 1983, 343 с.

13. Камалов Г.Х., Сюрин В.Н. Чувствительность лабораторных животных и культуры ткани к вирусу болезни Ауески. Ветеринария, 1964, F 8, с. 23-24.

14. Канторович-Прокудина Е.Н,, !данов В.М. Динамический полиморфизм вирусных популяций. Вопр. вирусол., 1976, F 6, с. 650-655.

15. Лобашев М.Е. Физиологическая гипотеза мутационного процесса. В кн.: Исследования по генетике. Л., 1976, вып.6, с. 3-14.

16. Лурия С., Дарнелл Д., Балтимор Д., Кемпбелл Э. Общая вирусология. М., Мир, 1981.

17. Лукина В.А., Блехерман Б.Е., Писеева Г.П., Марыгина A.M. Оценка эффективности образования локусов очищенного вируса герпеса индеек в культуре клеток. Докл. ВАСХНИЛ, 1981, Р 12, с. 31-33.

18. Лучник А.Н. Спонтанный мутационный процесс и скорость эволюции. В кн.: Общая генетика. М., 1978, т.З, с.38-73.

19. Мёллер Г.Г. Образование мутаций. В кн.: Генетика. М., 1968, с. 562-575.

20. Никитин М.Г. Вирус псевдобешенства (болезнь Ауески). В кн.: Руководство по ветеринарной вирусологии. М, Колос, 1966, с. 594-600.

21. Поляновский 0.JI., Носиков В.В. Рестрикционнне эндо-нуклеазн в генетической инженерии. вВ кн.: Биологическая химия. М., сер. "Итоги науки и техники", 1978, т. 14.

22. Прохорова Э.М. Получение модифицированного вируса болезни Ауески и изучение его иммунобиологических свойств. Дисс. канд., М., 1971, 181 с.

23. Пшеничнов В.А., Донченко В.В., Мотков А.Е. О некоторых закономерностях изменения структуры вирусных популяций.

24. В кн.: Экология и популяционная генетика микроорганизмов. Свердловск, АН СССР, 1975, с. 89-91.

25. Пшеничнов В.А., Воробьев А.А., Балаева Н.М, Аттенуа-ция вирусов и риккетсий, М., Медицина, 1976.

26. Сенкевич Т.Г., Гибадуллин Р.А. Простой метод получения ДНК вируса герпеса. Вопр. вирусол., 1982, $ 4, с. 505506.

27. Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г. Структура и биология вирусов животных. М., Колос, 1983.

28. Серебровский А.С., Дубинин Н.П. Искусственное получение мутаций и проблема гена. В кн.: Классики советской генетики. JI., 1968, с. 294-302.

29. Сюрин В.Н., Фомина Н.В. Частная ветеринарная вирусология. М., Колос, 1979, 472 с.32» Тихоненко Т.Н. Биохимия вирусов. М., Медицина, 1966.

30. Тихоненко Т.И. Биохимия вирусных частиц (нуклеиновые кислоты). М., Медицина, 1977.

31. Тихоненко Т.И. Генно-инженерные подходы к созданиюпротивовирусных вакцин. Сельскохозяйственная биология, -1983, Р 9, с. 97-107.

32. Тихоненко Т.И. Вирусы и генная инженерия. Вестн. АМН СССР, 1983, F 12, с. 67-75.

33. Феннер Ф., Мк Ослан Б., Уайт Д. Биология вирусов животных. М., Мир, 1977, 402 с.

34. Филатов Ф.П. ДНК вирусов группы герпеса. Успехи современной биологии, 1980, т. 89, с. 90-103.

35. Цилинский Я.Я., Гущин Б.В., Клименко С.М.;, Львов Д.К. Генетическое и морфологическое изучение смешанной инфекции, вызванной клонами вируса ВЭЛ. Акта вирологика, 1972, т.16, с. 281-291.

36. Цилинский Я.Я., Львов Д.К. Популяционная генетика вирусов позвоночных. М., Медицина, 1977, 192 с.

37. Albrecht P., Blaskovic J., Jakubik and Lesso J.

38. Demonstration of pseudorabies virus chik embryo cell cultures and infected animals by the fluorescent antibody technigue. -Acta.virol., 1963* v. 7, p.289-296.

39. Arnon R., Shapira M., Jacob C. Synthetic vaccines. J. Jmnrunoi* Meth., 1983, v. 61, p. 261-273.

40. Aupelian L., Roizman B. The host range of herpes " siplex virus: interferon virai DNA. and antigen synthesis inabortive infection of dog kidney cells. Virolgy, 1964,v. 22, p. 452-461.

41. Ben-Porat T.,. Shimono Н», Kaplan A. Synthesis of

42. Proteins in Cells Infected with Herpesvirus. II. Plow of Structural Viral Proteins from Cytoplasm to Nucleus. Virology, 1969, v» 57,.p. 56-61.

43. Ben-Porat Т., Kaplan A.S*, Stehn B. and Rubenstein A. Concafenerik forms of intracellular herpesvirus DNA. Virolgy,1976, v. 69, P. 54-7-560.

44. Ben-Porat Т., Rixon F.G., Blankenship M.L. Analysis of the Genome of Pseudorabies Virus. Virol., 1979, v. 95, p. 285-294.

45. Ben-Porat T. and Rixon P. Replication of herpesvirus

46. Chamberlain I .P. Fluorographic detection of radioactivity in polyacrylamide gels with the watersoluble fluer sedium salicylate. Analyt.Biochem.» 1979» v. 98, p. 132135.

47. Chanock R.M. Vaccines -new developments. -"Viral Diseases South-East Asia and West, Pacif,Proc,Int,Semin,, Canberra, 8-12 Febr., 1982", Sydney I982> I39^I55e

48. Feldman L., Rixon F, J., Jong-Ho-Jean et al. Transcription of the Genome of Pdeudorabies Virus (A. Herpesvirus)is Strictly Controlled» Virol., 1979, v. 97, p. 316-327.

49. Geek P., Medveczky I., Lomniczi B. A Bartha-fele vakcinatOrzs es termeszetes esetbol izolalt avirulers Аидeszkyvirusttfrzsek viszonya. Magyar allatorv.Lap3a,I982, evf.37, sz.10, p. 657-661.

50. Генов Hi-, Йорданов X. Върху живата вакцина срещу болеста на Ауески по свинете получаване с щам "Русе" и результате от прилагането й. Ветеринарна сбирка, 1964, Р 3, с.3-6.

51. Gi elk ens A.L.J, and B6rns ДЛвМ. Differentiation of

52. Aujeszku's disease virus strains by restriction endonuclease sualysis of the viral ША. Current Topics in Vet.Med. and Animal Sci. Aujeszkyfe Disease. 1982, v. 17, p. 3-13.

53. Gibson W., Roizman B. Proteins psecified by herpes simpler virus. VIII. Characterisatich and composition of multiple capsid forms of subtypes I and 2. J.Virol., 1972, v» 10, p. 1044-1052.

54. Golais Р», Sabo A. Die Unterscheidung von virulen-ten und attenuierten Pseudorabiesvirusst&mnen durch biolo-gische und genetische Marker. Dt.tier£rztl,Wschr., 1982,1. Jg. &9, S. 377-580.

55. Grigorlew T.B.', Litenko A.M., Tsilinsky Y.Y., Kli-menko S.M. The surface structure of venesuelan eguine encephalomyelitis Virus» Arch.Virol., 1980, v. 63, p. 165-169.

56. Gutekunst D.A. Latent Pr virus infection in swine detected Ъу RNA-DNA hybridization. Am. J.Vet.Res., 1979, v. 40, p. 1568-1571.

57. Hamada c., Kaplan A.S. Kinetics of synthesis of various types of antigenic proteins in cell infected with pseudorabies virus. J. Bacterid., 1965» v. 89r p. 13281334.

58. Hampl IU, Kaplan A.S. Studies on the envelope of the pseudorabies virus. Zbl.Bacterid., I9Q3, Abt. I A, v. 254, p. 162.

59. Heine U.I. Intranuclear viruses. In t Cell nucleus Newark-London, 1974, v. 3, p. 489-536.

60. Heppner В., Darai G., Podesta B. et al. Strain differences in pseudorabies viruses. Med.Microbiol.,Immunol., 1981, v. 169, p. 128.

61. Holmes L.H., Watsoh D.H. An Electron Microscope S^lldy of the attachment and Penetration of Herpes Virus in

62. BHK-2I Cells. Virolgy, 1963, v. 21, p. II2-I23.89» Honess R., Roizman B. Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis. I.Cascade regulation of the synthesis of at least three groups of viral proteins. J.Virol., 1974, v. 14, p. 8-14.

63. Juckes I.K.M. Fractionation of proteins and viruses with polyethylene glycol. Biochem.biophys.acta, 1971,v* 229, p. 535-541.

64. Kaaden O.R., Deitzschold В., Matheka H.D., Tokui T. Konzentrierung und Reinigung von Maul-und Klauenscuche Virus durch Polyathylenglycol (PEG). Arch. ges.Viirasfor cob., 1971, v. 35, P. Ю4-ИЗ.96

65. Kaplan A.S., Vatter A.E. A comparison of herpes simplex and pseudorabies viruses. Virol., 1959, v. 7,p. 594-407.- 88 97» Kaplan A.S. Herpes simplex and pseudorabies viruses, Virol.Monographs, 5 (Springer, Berlin), 1969*

66. Kaini^a T., Ben-Porat Т., Kaplan A. Control of certain aspecte of the infective process- by progeny viral DNA. Virol., 1965, v. 26, pt 7-14.

67. Ladin B»F., Ihara S., Hampl H., Ben-Porat T. Pathway of Assembly of Herpesvirus Capsids: An Analysis Using DNA+ Temperature-Sensitive Mutants of Pseudorabies Virua.-Virol., 1982, v, 116, p. 544-561.

68. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins duringthe assemly of the head bacteriophage T 4. Nature (London),1970, v, 227, p. 680-684,103» Lawrence W.C. Purification of Eguine Herpes virus O^pe I. J.gen.Viroi,, 1976, v. 31, p. 81,- 91.

69. Lomniczi В., Blankenship M.L*, Ben-Porat T. Deletions in the Genomes 0f Pseudorabies Virus Vaccine Strais and Existence of Four IsomBrs of the Genomes. J.Virology, 1984, v. 49, p. 970-979.

70. Matthews R.E.F. Classification and nomenclature of viruses. Fourth report of the International Commitee on Taxonomy of Viruses. Intervirology, 1982, v. 17, p.I-199.

71. Mayr A. Aujeszkysche Krankheit. Handbuch der Schutzimpfungen in der Tiermedizin, 1984, p. 676-694»

72. Mc Combs R»M. Concentration and purification of herpes viruses (simplex, cytomegalo-and EB) zonal ultracent-rifuge. Applied microbiolgy, 1969, v» 17, p. 636-638.

73. Mc Cracken R.N., Clarke J.K. A Thin Section Stpdy of the Morphogenesis of Aujeszky's Disease Virus in Synchro-nonsly Infected Cell Cultures» Arch»for gesamte Virusforsch. 1971» v. 34, p. 189-201»

74. Muirhead M.R. Aujeszky's disease. Vet.Rec., 1978, v. 24, p.561.

75. Muz3rczlca.il., Poland R,L., Bessman M.I. Studies on the biochemical basis of spontonaus mutation. Biol.Chem., 1972, v. 247, p. 7II6-7I22.

76. Nrapendra N. Purification of hepatis В surface antigen using polyethylene glycol, pepsin and tucch.80. Vox. sang., 1976, v.31,p.84—95.

77. Oirschot I.Т., Gielkens A.L.I. Some characteristicsof four attenuated vaccine virus strains and a virulent sttain of Aujeszky's disease virus. Tijdschr.diergencesk.,1984, Ю9, v.I7, p.225-229.

78. Olshevsky U., Becker Y. Herpes simplex virus structural proteins. Virol., 1970, v.40, p.948-960*

79. Paul P.S., Mengeling W.S. and Pirtle E.C. Differentiation of Pseudorabies (Aujeszky's Disease) Virus Strains by Restriction Endonuclease Analysis. Arch.of Virol., 1982, v.73, p.193—198.

80. Pedersen C., Eddy G. Comparative analysis of members of the venezuelen eguine encephalomyelitis virus complex. Am.J.Epidemiol*, 1975, v.IOI, p.245-252.

81. Piatt K.B., Mare C,I., Hinz P.N. Differentiation of vaccine strains and field isolates of pseudorabies (Aujeszky^ disease) virust Thermal sensitivity and rabbit- 91 • .virulence markers, Arch.Virol., 1979, v.60, p.I3-23.

82. Piatt K.B., Mare C.I., Hinz P.N. Differentiation of vaccine strains and field isolated of pseudorabies CAujjeszky* s disease virus): trypsin sensitivity and mause virulence markers. Arch.Virol», 1980, v.63, p.I07-II4.

83. Pringle C.R., Howard D.K. and Haj I. Temperature-sensitive mutants of pseudorabies virus with differential effects on viral and host DNA synthesis. Virol., 1973,p.4-95-505*

84. Roizman В., Keller I.M., Spear P. Structural Qly-coproteins and Classification of Herpes Simplex Viruses. -Nature, 1970, v.227, p. 1253-1254-.

85. Roizman В., Spear P.G. Herpesviruses. In: ultra-structure of animai viruses and bacteriophages. New-York: Acad.Press., 1973, p.83-109.

86. Roizman B. In: Molecular biology of animal viruses. 1978, v»2, p.769.

87. Roizman B. Genome variation and evolution among herpes viruses. Annals.New-York Acad.Sci., 1980, v.354, p.472-483.

88. Roizman В», Carmichael L.E., Deinhardt P. et al. Herpesviridae. Definition, Provisional Nomenclature and Taxonomy. Intervirology, 1981, v.l6, p.201-217.

89. Roizman B. The Herpesviruses. New-York, London. Plehum Press, v.2, 1983, 439 p.

90. Rock D.L., Reed D.E. 2he evaluation of an experimental porcine Herpesvirus I (Aujeszky^ disease virusO) su-bunit vaccine in mice. Vet.Microbiol*, 1980, v*5, p.2^1-299.

91. Sabo A. and Grunert S. Persistence of virulent Pr virus in herds of vaccinated and nonvaccinated pigs. Acta

92. Tirol., 1971, v.I5, p.87-94.

93. Schaffer P.A., Courtney R.I. Genetics of herpesviruses. In: Animal virol.Ed.by A.Huang. D.Baltimore-New-York -London. Plenum Press., 1976, p.545-617.

94. Skare I., Summers W.P., Summers T/.G. Structure and functions of herpesvirus genomes. I.Comparison of five HSV-I and five HSV-2 Strains by cleavage of their DNA with EcoR I restriction endonucleasTe. J.Virol., 1975, v.15, p.726-732.

95. Skoda R. und Zuffa A. Die Diagnostik der Aujeszky'-©chen Krankheit in Gewebekulturen. Arch.exp.Vet.Med., 1962, v.l6, p.491-500.

96. Spear P.O., Roizman B. Proteins specified by herpes ^implex virus. V.Purification and structural proteins of the herpesvirion. J.Virol., 1972, v.9, p.143-159.

97. Stear R.L. Pseudorabies update. 19 th Ahn.Nebraska SPP Conference 8, 1978.

98. Stevely W.S. Virus-Induced Proteins in Pseudorabies1.fected Cells. Il.Proteins of the Virion and Nucleocapsid. J.Virol., 1975, v.16, p.944-950»

99. Татаров Г. Вирусьт на болестта на Ауески. София, Земиздат, 1978.

100. Tihonenko T.I. Structure- of Viral nucleis acid in situ. Ins Comprechensive virology (Ed.H.Fraenkel-Conrat, R.Wagner) New-York? Plenum Press., 1975, v.5, p.2—118.

101. TomarB., Delagueau I.F., Loguerie R., Prunet P. Etude d*un nonvean vaccin a virus inactive etadjuve cantre la Maladie d'AuJeszky. Bull.Office.int.episoot., 1975, v.84, p.223-237.

102. Toma В., Brun A., Chappnis G. and Terre I. Prop-rietes biologigues d'une souche thermosensible (Alfort 6) de la maladie d'Aujeszky. Ree.Med.Vet., 1979, v.I55*p.245-252.

103. Тонева В. Болестта на Ауески. Монография. София, Земиздат, 1958, 120 с.

104. Tuhaci I., Bran L. Lutilisation des vaccins vivants dans la lutte contre la Maladie d'Aueszky cher les pores. -Bull.Office.int.episoat., 1975, v.84,p.299-304.

105. Weber K., Osborn M. !Ehe reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfste-polyacrylamide gei electrophoresis. J.Biol.Chem., 1969, v.244,p.4406-4412.

106. Zhdanov V.M., Zakstelskaja L.G., Isachenko V.I. Return of epidemic Al (HiNi) influenza virus. Lancet, 1978, v.I, p.294-295.

107. Zuffa A. Studium uztahu medzi vilikoston plakov na kulturach kuracich embryonalnych bunoch (KEB) a virulencion virusu AuJeszkycho choroby. Vet.Med., 1965, v.I0(38), P.85-292.