Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологические свойства штаммов вируса болезни Ауески

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства штаммов вируса болезни Ауески"

! I и

1 1 ВОЛ Шэ

На правах рукописи УДК 576.858.43:577.

3:578.086

БАБОРЕНКО Елена Павловна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ

03.00.06 "Вирусология"

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Владимр•1996

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском ннстнтуте зашит животных МСХиП Российской Федерации

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

МИЩЕНКО Владимир Александрович

Официальные оппоненты: Дымин Михаил Арвидович, доктор биологических наук,

старший научный сотрудник. (ВНИИВВиМ.г.Покров)

Шаяско Жорж Антонович, кандидат ветеринарных нау старший научный сотрудник. (ВНИИЗЖ, г.Владимир)

Ведущая организация: 1

Всероссийский государственный научно-исследовательский ' институт контрол! стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, г. Москва.

Зашита состоится "10 " ^ 1996 г. в 11 часов на заседании диссертационног

совета Д 120.60.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте защит] животных МСХиП (600900. г. Владимир, пос. Юрьевец).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ. Автореферат разослан " Д.А " ОК^^Орс^ 1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета - Мищенко В.А.

1. Общая характеристика работы.

1.1. Актуальность темы. Болезнь Ауескн (псевдобешенство) регистрируется с начала текущего столетия на всех континентах , кроме Австралии, и наносит большой экономический ущерб животноводству даже развитых стран, особенно с интенсивно развитым свиноводством и пушным звероводством. Так, в Англии стоимость затрат на выполнение программ по борьбе с основными болезнями свиней за 30 летний период (1958-1989 г.) составили: по ящуру - 39,5 , болезни Ауески -28,0 , везикулярной болезни свиней -14,6 и классической чуме свиней - 5,9 млн.фунтов стерлингов (Базингер, 1990 г.).

Болезнь Ауески необходимо рассматривать, как опасное инфекционное заболевание, которое может протекать в острой, подострой, хронической и латентной формах.

Вирус болезни Ауески может быть искоренен проведением крупномасштабных серологических исследований для выявления свиней -вирусоносителей и последующей их выбраковки. Эта программа успешно используется в ряде европейских стран ( Англия, Дания и др.). При данной стратегии борьбы существует проблема дифференциации вакцинированных и инфицированных свиней.

Опосредованные оценки защищенности животных, основанные на нейтрализующей способности антисыворотки считаются наиболее важными ! (Т11а1тапп ег а!. 1987) и в некоторых странах выступают в качестве референтного показателя иммунного статуса вакцинированных животных. В связи с этим представляют практический интерес исследования направленные на изучение сравнительной эффективности иммунного воздействия одинаковых антигенов на стадии развитого гуморального иммунитета (реакция нейтрализации).

Современные меры борьбы с болезнью Ауески в России и ряде других стран основываются на осуществлении комплекса ветеринарных мероприятий. Вакцинация является одной из наиболее эффективных мер, поскольку обеспечивает формирование иммунитета в популяции восприимчивых животных.

Процесс изготовления вакцин включает ряд этапов, таких как выбор штамма вируса, его нароботка, составление препарата и испытание его иммуногенности. Для выбора перспективного штамма, позволяющего получить эффективный конечный продукт, необходимо иметь многосторонние штаммовые характеристики .

Опыт исследовательской работы показывает, что должны учитываться следующие параметры: I

- Стабильность структурного состояния антигена (сохранение целостности вириона при воздействии различных физико-химических факторов, обусловленных технологией производства вакцины).

- Эффективность гетерологичных иммунных реакций внутри данного типа вируса, т.е. свойство антигена индуцировать возможно более широкий спектр гетерологичных иммунных ответов.

- Оценка защищенности животных по нейтрализующей способности антисывороток считается наиболее объективной, и в некоторых странах принята в качестве референтного показателя иммунного статуса вакцинированных животных.

В последнее время появились ряд сообщений о гетерогенности штаммов вируса болезни Ауески и несоответствия вакцинных эпизоотическим штаммам. Выделенные на территории СНГ штаммы вируса болезни Ауески недостаточно охарактеризованы с указанных выше позиций.

Поэтому, было актуально изучение иммунобиологических свойств доступных нам штаммов вируса болезни Ауески и выбор, после сравнения полученных характеристик, наиболее перспективных из них, для производства вакцин.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлся выбор наиболее перспективного для получения эффективных вакцин штамма вируса болезни Ауески. Принимая во внимание актуальность изучения иммунобиологических свойств штаммов вируса болезни Ауески и усовершенствование средств и методов диагностики болезни , перед нами были поставлены следующие задачи:

-Определить иммунобиологические свойства штаммов вируса болезни Ауески.

- Установить уровень накопления вируса болезни Ауески в органах и тканях животных;

- Определить сроки выделения вируса болезни Ауески во внешнюю среду с выдыхаемым воздухом;

-Изучить устойчивость штаммов вируса болезни Ауески к различным физико-химическим факторам;

-Определить диагностическую ценность различных модификаций постановки реакции нейтрализации;

- Изучить антигенное родство штаммов вируса болезни Ауески;

- Провести анализ генома штаммов вируса болезни Ауески методом рестркционно-эндонуклеазного анализа;

-Разработать способ индикации вируса болезни Ауески .

1.3. Научная новизна. В сравнительном аспекте изучены антигенные, некоторые физико-химические и биологические свойства штаммов выделенных на территории СНГ. Изучены иммунобиологические свойства 9 штаммов вируса болезни Ауески, различающихся по адаптационным, патогенным и антигенным свойствам.

Усовершенствован метод постановки реакции нейтрализации, благодаря чему появилась возможность надежно обнаруживать небольшие колличества антител, а также более успешно дифференцировать штаммы вируса болезни Ауески.

Разработана методика выделения и очистки геномной ДНК и рестрикционно-эндонуклеазного анализа вируса болезни Ауески.

Получены моноклональные антитела к вирусу болезни Ауески и изучены их свойства.

Впервые изучена болезнь Ауески у верблюдов и определено накопление вируса в органах и тканях этих животных.

1.4. Практическое значение. Проведенные исследования позволили охарактеризовать штаммы вируса болезни Ауески выделенные на территории СНГ в сравнении с европейскими и предложить наиболее подходящий из них для получения вакцинных препаратов.

Оптимизированная методика реакции нейтрализации, расширяет шкалу измерения антигенного спектра и позволяет более достоверно 'обнаруживать антигенные различия между штаммами.

Разработана методика выделения и очистки геномной ДНК вируса болезни Ауески для анализа полевых изолятов.

Разработан метод индикации вируса болезни Ауески в органах и тканях животных и объектах внешней среды.

1.5. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту :

1.5.1. Результаты сравнительных исследований антигенных свойств и некоторых признаков, характеризующих устойчивость структурного состояния вирионов штаммов вируса болезни Ауески (МК-25, БУК-628, БРАН, Женевский, Арский, "К"-ВИЭВ. УНИИЭВ-18ВС. Мараштанский. Туркменский) к воздействию физико-химических факторов. 1. 5.2. Показатели антигенного родства штаммов вируса болезни Ауески.

1.5.3. Результаты позволяющие дать оценку диагностической ценности модификаций постановки реакции нейтрализации.

1.5.4.Данные рестрикционно-эндонуклеазного анализа генома вируса болезни Ауески. свидетельствующие о существовании среди изолятов генетической гетерогенности.

1.6. Апробация работы. Основные материалы диссертации изложены на научных конференциях ВНИИЗЖ г. Владимир (1995г), втором международном симпозиуме по искоренению вируса болезни Ауески, Копенгаген (1995).

1.7.Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.

1.7.0бъем и структура работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, иллюстрирована 17 таблицами и 6 рисунками. Список используемой литературы включает 117 наименований, из них 44 источника на русском языке. 73 работы зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Вирусы.В исследованиях использовали вирулентные штаммы вируса болезни Ауески:

1. Арский- полевой изолят, выделен от свиней. Татарская АССР в 1967 году, любезно предоставлен док.вет.н. Камаловым Г.Х. (ВНИВИ. г. Казань) .

2. Мараштанский- полевой »золят, Татарская АССР, 1968 год, любезно предоставлен док.вет.н. Камаловым Г.Х. (ВНИВИ, г. Казань)

3. Туркменский- полевой изолят, изолирован в 1992 г. от верблюдов Ахалской области Туркменистана док.вет.н. Мищенко В.А.

4. УНИИЭВ -18 ВС - полевой изолят, выделен от свиней, Харьков, 1962 год, получен из УНИИЭВ г.Харькова.

5. БРАН- любезно предоставлен из коллекции док.вет.н. Камалова Г.Х. (ВНИВИ, г.Казань).

6. Женевский - любезно предоставлен док.вет.н. Камаловым Г.Х. (В НИВИ.г. Казань).

7. "К"-ВИЭВ- любезно предоставлен док.вет.н. Бондаренко А.Ф. -завод Юрьевецветбнопрепарат".

8. МК-25- полевой изолят. Болгария, 1983 год.

9. БУК-628- любезно предоставлен из коллекции док.вет.н. Камалова Г.Х. (ВНИВИ, г. Казань).

2.1.2. Животные. В процессе получения диагностических гнлериммунных сывороток и для экспериментов использовали лабораторных и естественно восприимчивых животных.

Все растворы готовили на бидистиллированной воде ГОСТ 6709-72.

2.1.3. Инактивация. Инактивацию штаммов вируса болезни Ауески проводили теплом и с помощью днмера зтиленнмнна.

2.1.4.Способы идентификации вируса БА. Для диагностики и идентификации вируса болезни Ауески использовали: биопробу на животных и культуре клеток. РСК. реакцию нейтрализации, нмуноферментный анализ.

2.1.5.Статистическая обработка результатов опытов.Для статистической обработки результатов исследований использовали типовые методы оценки дисперссии, среднеквадратичного отклонения и доверительного интервала варьирующих переменных. Выпадающие значения выборки определяли стандартным способом, используя табличные коэффициенты. Сопоставление величин дисперсий производили приближенным методом Батлера на основе статистики х2. Для оценивания связи разнокачественных переменных применяли стандартные способы коррелятивного анализа .

2.2.Результаты исследований

2.2.1. Контр о ль репродуктивных свойств штаммов вируса болезни Ауескн.

В процессе наработки вирусного материала штаммов болезни Ауески в монослойной перевиваемой культуре клеток ВНК-21 установили, что к 4-6 пассажам вирус достигал максимальных титров. Оценивали величину накопления инфекционности вируса по наступлению 70-90% цитопатнческого эффекта.

Из полученных данных следует, что репродуктивная способность изучаемых штаммов сходна: к 6 пассажу репродуктивная активность для всех штаммов вируса достигала максимума и составляла 6.85-8.85 ^ТЩЬо/мл. И дальнейшее пассирование не повышало исходной активности.

Установлено, что наиболее высокое накопление отмечалось у таких штаммов вируса БА. как БУК-628, Женевский. УНИИЭВ-18ВС, МК-25, титры которых достигали 8,5; 8,25; 8,20; 8,45 ^ТЦДзо/мл. соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют, что динамика адаптации изучаемых штаммов вируса не имела существенных различий, и после адаптации штаммы стабильно сохраняли свойственный им уровень репродуктивной активности в течение всего периода исследований.

Также проводилось изучение накопления вируса в различных монослойиых перевиваемых и первично-трнпсинизированньи культурах клеток.

В результате проведенных опытов установлена высокая цитопатическая активность штаммов в первичной линии клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, 3-КГ. Более стабильные результаты по адаптации и накоплению вируса получены на культурах клеток СП и ВНК-21, где титры инфекционности достигали 6,85-8,85 ^ТЦЦзо/мл. Наименьший инфекционный титр вируса был получен на культуре клеток МБВК и ППК. ,

2.2.2.11сследованне свойств штаммов вируса болезни Ауески, отражающих устойчивость к физико-химическим факторам.

Используя инфекционный вирус различных штаммов, исследовали резистентность структуры их вирионов к воздействию физико-химических факторов. Изучали сохраняемость инфекционности вируса при +4°С в течение 60 дней, терморезистентность при +55°С и резистентность к процедуре эмульгирования. Оценивали характеристики динамики сохраняемости вируса и величин контраста титров контрольных и обработанных проб в этих тестах.

Установлено, что :

1. В тесте на сохраняемость при +4°С во временном интервале наименьшее снижение инфекционной активности ( 0,30-0,37 ^ТЦДго/мл) наблюдается у штаммов БУК-628, Женевский, тогда как у штаммов Арский. Бран, Туркменский, МК-25, Мараштанский и УНИИЭВ-18ВС инфекционная активность снизилась на 0,55-0,85 1«ТЦДзо/мл. Из представленных данных видно, что все изучаемые штаммы постепенно теряли свою инфекционность, титры которых на 60-й день хранения снижались на 0,35-0,85 ^ТЦДзо/мл

2. Все исследуемые штаммы относились к категории термолабильных. Наиболее устойчивыми оказались штаммы Арский, Туркменский, Женевский -полевые изоляты. Менее устойчивыми - МК-25, УНИИЭВ-18ВС.

3. Различия в устойчивости вируса к процедуре эмульгирования (Д Эм)

оказались весьма незначительными и при взаимном сопоставлении не имели

существенных различий (р<0.5) для изучаемых штаммов не были статистически значимы, так как находились в пределах ошибки эксперимента.

Таким образом все штаммы имели очевидные различия лишь по абсолютным значениям величин титров, тогда как по относительным характеристикам существенными различиями не обладали.

2.2.3.Видовая восприимчивость животных к различным штаммам вируса болезни Ауески.

Для расширения представлений о биологических особенностях штаммов вируса болезни Ауески, были проведены исследования по изучению зависимости концентрации вируса в органах животных от штамма вызвавшего заболевание, а также вирулентности отобранных штаммов для разных видов животных.

Сравнительная оценка вирулентности штаммов вируса БА, проведенная на лабораторных животных, показала.что изучаемые штаммы вируса БА имели различную степень патагенности для разных видов лабораторных животных (табл.1).

Наиболее патогенными для морских свинок оказались штаммы вируса болезни Ауески - УНИИЭВ-18ВС, Арский. Для кроликов патогенными оказались штаммы вируса УНИИЭВ-18ВС, Арский, Мараштанский, Бран.

Наиболее патогенными для белых мышей проявили себя штаммы УНИИЭВ -18ВС, Мараштанский. К слабопатогенным можно отнести штамм Женевский. К авирулентным штаммам вируса можно отнести МК-25 и Туркменский.

Таблица 1.

Патогенность изучаемых штаммов вируса болезни Ауески для подопытных животных

Штамм Мыши Морские свинки Кролики

пп ВБА начало летальный начало летал. начало летальный

проявления исход (в проявления исход (в проявления исход (в

признаков сутках признаков сутках признаков супсах

болезни после болезни после болезни после за

(час) заражения (час) заражен.) (час) ражашя)

1 Арский 60-70 4 24 4 24-30 3

2 БРАН 50-70 4 24 4-5 20-24 3

3 "К"ВИЭВ 30-36 3-4 24-36 3-5 30-36 4-5

4 Туркмен 60-70 - 48 - 30-48 9-10

5 Женевск н.п. 8-9 48 - 48 5-6

6 Марашт. 24-48 3 16-20 3 24-40 2-3

7 МК-25 н.п. - 48 9-10 48-60 6

8 УНИИЭВ 15-24 2 16-20 2-3 16-20 2

Примечание: "-"животные не пали

н.п. - признаков болезни не проявляли

Принимая во внимание эти данные, дальнейшие исследования проводились со штаммом вируса болезни Ауески - УНИИЭВ-18ВС.

Также проводились исследования по изучению видовой чувствительности сельскохозяйственных животных, пушных зверей и верблюдов к вирусу болезни Ауески. В опытах использовались 25 подсвинков, 16 норок, 22 кролика. Животных заражали вирусом БА штамм УНИИЭВ-18ВС, адаптированным к монослойной перевиваемой культуре клеток ВНК-21. Подсвинков заражали интрацеребрально в дозах 12-Ю3 мл и 107 ТЦДзо/мл, интраназально в дозе Ю7 ТЦД50/МЛ. Кроликов заражали внутримышечно в дозе 100 ЛД50, норок внутримышечно в дозе 103 ТЦДзо/мл, орально в дозе 3104 ТЦДзо/мл, морских свинок внутримышечно в дозах 104 и 10' ТЦД50/МЛ.

Таблица 2.

Патогенность штамма УНИИЭВ-18ВС для различных видов животных

Вид животных Масса (кг) Способ заражения Доза вируса появления клшшч.пршнаков.(часы)

появления ктшич.признаков гибели

подсвинки 25-30 интрацеребрально 10' ТЦД» 14-16 26-30

101ТЦД5О 72-96 100-120

интранаэально Ю'ТЦДм 120-140 168-172

кролики 2-2.5 внутримышечно 102 лДзо 60-68 70-76

морские свинки 0.4 внутримышечно Ю'ТЩЬо 14-18 20-26

10« ТЦДзо 48-60 60-72

норки внутримышечно 10"ТЦДи не болеют -

10«ТЦД5о 70-80 90-96

ЮМТЦД» 70-80 90-96

10"ТЩЬо 20-24 26-30

орально 3,104 "ТЦДзо 70-80 90-96

Из результатов, полученных при изучении видовой восприимчивости к различным штаммам вируса БА, следует, что штаммы различаются по воздействию на различные виды животных, т.е. обладают биологическими особенностями. Таюке наблюдается четкая закономерность в развитии клинических признаков болезни и гибели животных при одинаковом способе заражения (интрацеребрально), но разными дозами вируса.

Таким образом, из таблиц следует, что патогенность вируса болезни Ауески для подсвинков, норок, кроликов, морских свинок, верблюдов зависит от многих факторов:

• дозы вируса

• штамма вируса

• вида животного

• способа инокуляции

Наряду с этим было изучено течение болезни Ауески у одногорбых верблюдов в Туркменистане. В начале заболевание зарегестрировано среди 198 верблюдов колхоза "Большевик'', где заболели взрослые животные. Болезнь характеризовалась угнетением, отказом от корма, атонией

преджелудков, искривлением шеи. Температура тела животных в пределах физиологической нормы. Гибель наступала в течении суток после проявления клинических признаков заболевания. Каждый день погибало 2-3 верблюда. Через 5 дней началось заболевание и среди молодых животных с преобладанием сильного зуда на боковых поверхностях задней части туловища. В течение 17 дней пало 77 верблюдов и вынуждено убито 36.

По эпизоотологическим данным верблюды имели контакт с неблагополучной по болезни Ауески свинофермой за 7-8 дней до первого случая их гибели, т.е. через 2-3 дня после вакцинации свиней и прекращения выделения больных животных. В пробах патологического материала отобранных от верблюдов в атональном состоянии обнаружен вирус болезни Ауески. Антнген вируса БА обнаружен в РСК в 35.4%, в РДСК-41.2%, РРИД-41,2-82.4%, ИФА в 76.5% проб, а биопроба в культуре клеток ВНК-21 была положительной в 94,1% случаев. Вирус БА обнаруживался всеми методами в пробах печени, лимфоузлов, почек. В легких, сердечной мышце и селезенке вирус обнаруживался только биопробой в ВНК-21. в ИФА и РРИД. В головном мозге выявить вирус удалось только с помощью биопробы. Из проб спинного мозга вирус не был выделен. Не удалось доказать трансплацентарной передачи вируса БА. Суспензии органов обладали инфекционной активностью, наиболее высокие титры были в легких, почках, сердце ( 1,75 ^ТЦД зо/мл; 1,63 ^ТЦД 5о/мл; 1,55 1§ТЦД 5о/мл)

Полученные данные подтверждают сведения о широком спектре патогенности вируса болезни Ауески, и восприимчивости к этой инфекции большого круга животных. Проведенные исследования свидетельствуют о необходимости учитывать болезнь Ауески при дифференциальной диагностики болезни верблюдов.

2.2.4Локализация вируса болезни Ауески в органах и тканях зараженных

животных.

Инфицированные животные редко полностью освобождаются от вируса болезни Ауески и часто пожизненно остаются источником его распространения. Для лабораторной диагностики болезни Ауески пробы должны отбираться из тех органов и тканей исследуемого животного, в которых происходит наибольшее накопление вируса БА, или мест где возбудитель сохраняется наиболее длительный период времени.

Перед нами стояла задача выяснить, не зависит ли накопление вируса в органах и тканях от штамма вируса, вызвавшего заболевание. Вирус накапливался во многих органах и тканях больных животных, но отмечена зависимость наиболее максимального накопления вируса от штаммовой принадлежности.

Наши исследования показали, что вирус болезни Ауески может быть обнаружен в следующих органах больных животных: головной мозг, легкие, печень, лимфоузлы, сердце, мышцы. Ни разу вирус болезни Ауески не обнаружили в желудке, в низких титрах вирус выявлялся в селезенке, почках, слизистой оболочке кишечника (0,5-1.0 1« ТЩЬо/мл ). Вне зависимости от штамма, наибольшее колличество вируса БА выделялось из головного мозга и легких (2,57-3.35 ^ ТЦДзо/мл), что на порядок выше, чем из таких органов, как печень, лимфатитческих узлов и сердце ( 1,45-1,85 1» ТЩЬо/мл ).Наименьшее колличество вируса выделено из почки и селезенки ( 0.5 1§ ТЦДм/мл ).

Из данных рис.1 можно отметить, что наибольшие титры инфекционности были в пробах от кроликов и морских свинок зараженных штаммами Арский и УНИИЭВ-18ВС. Наименьшие титры инфекционности были в пробах от животных, зараженных штаммом Туркменский (1,75-0.5 ^ТЦЦУмл). Инфекционная активность вирусных суспензий из органов и тканей животных зараженных штаммами БУК-628 , Мараштанский и БРАН примерно одинакова и в среднем составляла 2,75-0,75 ^ТЩЫмл.

Таким образом можно сделать вывод, что вирус БА независимо от исследуемого нами штамма локализуется в одних и тех же органах, накопление же вируса зависит от используемого для заражения штамма.

Титр вируса, Ig ТЦД50/мл

легкие гол. мозг л.узлы печень сердце почки мышцы Штаммы вируса БА

□ УНИИЭВ БУК-628 Арский Мараигтан. БРАН Туркмен.

Рис. 1 Накопление вируса БА в органах и тканях

2.2.5. Результаты исследований по индикации вируса болезни Ауески, выделяемого больными животными, в объектах внешней среды.

В работах Belak К., Straub О. отмечается, что вирус начинает выделяться во внешнюю среду после появления у животных клинических признаков ■ заболевания болезни Ауески. Для выяснения роли вакцинированных животных в распространении ВБА проводили опыты по выделению возбудителя свиньями, имеющими различный статус:

• вакцинированных против болезни Ауески , с титром нейтрализующих антител 3,0-4,5 лоп;

• вакцинированных против болезни Ауески . с титром нейтрализующих антител 6,8-8.5 лог2",

• не вакцинированных против болезни Ауески. Опыты проводили на соответствующих группах животных.

Каждому животному интраназально вводили по 2 мл суспензии вируса БА (8,5 ^ТЦДм/мл), репродуцированного в культуре клеток ВНК-21.

В каждом боксе в течение 21 дня после инокуляции вируса исследовали смывы с кормушек и стен, а также пробы воздуха и воды из поилок. Наличие в пробах вируса болезни Ауески и его титры определяли по ЦПД, специфичность которого подтверждали в ИФА и РСК.

Клинические признаки болезни Ауески были замечены только у невакцинированных свиней. У них в течение 6 дней после заражения наблюдалось снижение активности, отказ от корма и повышение температуры на 1,5-2°С. Через сутки после заражения вирус БА обнаружили в пробах из боксов, в которых содержались невакцинированные животные и вакцинированные с титром антител 3.0-4.5 лог2.

В первые дни после заражения вирус из воздуха бокса с невакцинированными животными выделяли в значительно больших количествах (4.0 ТЦДзо/мл), чем из воздуха бокса с вакцинированными животными против болезни Ауески . с титром нейтрализующих антител 3.0-4.5 лог2- (1.5 ТЦД^/мл) с 4 по 7 день. В боксе с контрольными (невакцинированными ) животными максимальное колличество вируса выделяли на 4-6 сутки, а в боксе, где находились вакцинированные животные - с титром нейтрализующих антител 3.04,5 логг- с 6-10 дня после заражения (2.5 ТЦДм/мл) (см. рис.2-а).

Из воды вирус выделяли со второго дня после заражения, причем в воде бокса с невакцинированными животными тнтр вируса (4,35 ТЦДзо/мл) был значительно выше, чем в воде бокса с вакцинированными животными против болезни Ауески , с титром нейтрализующих антител 3,0-4,5 лог2(2.0 ТЩЬо/мл). Максимальное количество вируса выделялось на 4-6 день после инфицирования животных (см. рис.2-6).

В смывах из этих боксов вирус (0,25 1д ТЦДзо/мл) обнаружен на третий день после заражения, а максимальное количество (1.75 1ц ТЦДзо/мл) с 4 по 7 день . После 13-го дня вирус в смывах не обнаружили (см. рис.2- в).

4

3 2 1

0

5

4

3 2

1

0

3 2.5 2 1.5

1

05 0

Титр вируса (!д ТЦЦ50/мл) в КК ВНК-21

А. Воздух

8 9 10 11 12 13

Б. Вода

9 10 11 12 13

В. Смывы

/\

/ \

-ь-

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 Дни после заражения невакцинированные вакцинированные

Рис.2 Выделение ВБА из объектов внешней среды, (а, б, в).

. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что вирус выделяется за 24 часа до проявления клинической картины заболевания у животных. Несмотря на то, что при инфицировании свиней с титром вируснейтрализующих антител 3,0-4,5 лог2 клиническая картина болезни не проявлялась, вирус у них выделялся в окружающую среду, но в колличествах значительно меньших, чем от интактных , инфицированных свиней.

Вирус болезни Ауески не удалось обнаружить в боксах со свиньями у которых до введения вируса титр вируснейтрализуюших антител был выше 7,0 логг. Следовательно при большом иммунном статусе стада, иммунные животные не становятся передатчиками болезни.

- 2.2.6. Результаты исследований штаммов вируса болезни Ауески в реакции нейтрализации ( оценка антигенного спектра).

Реакция нейтрализации остается референтным методом диагностики болезни Ауески в справочных лабороториях МЭБ, а также используется для изучения антигенных свойств штаммов, в том числе и для оценки их антигенной близости.

Опираясь на положение Архети и Хорствала (1950г.), мерой одностороннего родства штамов считали оценку контраста логарифмических значений титров антисывороток НДм установленных в гомо и гетерологичных реакциях ( по типу = хЬе!-х1ют).

Каждая антисыворотка исследовалась в параллельном эксперементе с соответствующим гомологичным и гетерологичными штаммами. По результатам серии эксперементов для каждой гетерологичной реакции определяли среднее значение конраста ( Д) и для всей группы гетерологичных реакций с данной антисывороткой вычисляли общую среднюю оценку контраста (Дх). Эту величину и считали средней оценкой одностороннего антигенного родства данного штамма в данной группе. Кроме этого определяли дисперсию (аД) и верхнюю границу доверительного интервала контраста (Др<0,05).

Все оценки Дх были статистически значимы.Учитывая этот факт, существенно большими средними показателями Ье1- контраста обладали антисыворотки к штаммам Арский (Д=2,б8) и Туркменский (Л=2,58). Меньшим средним показателем Ьег-контраста (большей эффективностью гетерологичной реакции) обладали антисыворотки к штаммам Мараштанский (Д=1,28) и МК-25 (Д=1,21). Соответствующие показатели остальных антисывороток значимых различий не имели.

Таблица 3

Степень антигенного родства штаммов вируса болезни Ауески, где Дх - степень одностороннего антигенного родства

Вирусы (г,%) Общий

выворотки МК-25 Марашт. Туркмен БУК-628 БРАН Арский УНИИЭ В-18ВС средний показ.Дх

АК-25 ХНлт Д—0,42 Д=-2,8 Д=-1,22 Д=+0,15 Д=-1,93 Д=-1,27 Дх=-1,21

100 75,0 14,0 44,3 100 26,0 44,5

^Гараштан- Д=-!,75 Хкот Д—2.11 Д=-2,77 Д=-0,86 Л=-0,95 Д=-1,62 Дх=-1,28

кий 39,4 100 23,0 9,4 57,0 54,0 31,4

'уркмен- Д =-2,8 Д=-2,9 Х/ют Д=-2,77 Д=-0,85 Д=-2,43 Д=-3,12 Дх=-2,57

кий 14,0 13,25 100 14,0 57,0 19,0 11,5

.УК-628 Д=-0,92 Д=-1,35 Д=-2,42 ХНоп Д =-1,2 Д—1.3 д=-1,о Дх=-2,16

54,5 42,3 19,0 100 45.0 41,0 52,0

;ран Д—1,53 Д=-1,76 Д=-2,85 Д=-0,82 ХН<т Д=-1,85 Д=-1,63 Дх=-1,82

35.0 63,0 15.0 55,1 100 28,0 25,7

Юрский Д=-3,03 Д=-3,17 Д=-3,05 Д=-2.23 Д=-2,25 ХНот Д=-2,41 Дх=-2,68

13,0 11,3 13,0 21,0 21,5 100 19,0

/НИИЭВ- Д—1.62 Д=-К32 Д=-2,65 Д=-1,25 Д=-2,02 Д—2.21 ХЬот Дх=-1,69

8ВС 34.3 45,0 16,5 43,0 25,7 22,0 100

Из таблицы 3 видно, что:

• все исследуемые штаммы обладали антигенным радством по отношению друг к другу.

• при условии равенства иммунизирующих доз , антигенные воздействия штаммов имели существенные различия. В группе изученных штаммов достаточно широким спектром антигенного родства обладют штаммы Мараштанский, МК-25, УНИИЭВ-18ВС. Штаммы БУК-628 и в какой-то степени БРАН занимают промежуточное положение, имеют достаточную степень родства с другими штаммами. Наименьшей антигенностью обладали штаммы

Арский и Туркменский , им присущ самый низкий уровень связей с гетерологичными штаммами и они оказались в ряду штаммов, наиболее отдаленных от других.

Реакцию нейтрализации широко используют при изучении иммунобиологических свойств разных штаммов возбудителя. Некоторые исследователи (Vittraan et all, 1987 г.) утверждают, что РН в определенных модификациях позволяет получать существенно отличающиеся результаты, а также выявлять в испытуемом материале минимальное колличество антител.

Показатели РН зависят от используемого штамма вируса (Scherba et all, 1991 г.).

В одной из серии опытов было проведено испытание влияния методики постановки РН на величичину уровня вируснейтрализующих антител. Необходимость этих иссследований была обусловлена тем, что имеется ряд сообщений о дифференциации переболевших животных от вакцинированных по уровню вируснейтрализующих антител. В связи с этим были испытаны две модификации постановки РН:

• инкубирование вируса с испытуемой сывороткой 1 час при +37°С

• инкубирование вируса с испытуемой сывороткой 20 часов при +4°С

Иммунные сыворотки получали на кроликах по ранее разработанной и описанной методике ( В. А. Мищенко и соавт. 1993 г.).Каждую полученную сыворотку у исследовали в параллельном эксперементе с гомологичным и гетерологичными штаммами вируса (табл.4).

Для определения перекрестного родства между изучаемыми штаммами вируса болезни Ауески использовали данные перекрестного титрования штаммоспецифических сывороток с гомологичными и гетерологичными штаммами вируса. Показатели антигенного родства, расчитанные по результатам РН обеих модификаций, существенно не отличались. Исследования сывороток в двух модификациях РН показало, что результаты реакции, которая проходила при температуре +4°С в течение 20 часов, в преобладающем большинстве случаев были выше в 1,44-3,03 раза ( в среднем в 2,2 раза), чем в РН при +37°С в течение одного часа.

Таблица 4

Вируснейтрализующая активность гипериммуниых сывороток к вирусу болезни Ауески (НДм)

п=5-10

Сыворотка ^.С Штаммы вируса

МК-25 Мараш-танский Турк-менск. БУК-628 БРАН Арский УНИИ эв

МК-25 37 182* 79 12 45 128 27 39

4 275 128 23 97 194 42 91

Мараштанск. 37 84 182 32 70 128 64 49

4 194 447 97 169 256 147 97

Туркменский 37 30 20 239 24 64 28 23

4 69 54 676 64 112 64 54

БУК-628 37 182 128 27 302 158 97 182

4 338 275 64 850 320 169 256

БРАН 37 104 104 128 210 362 112 97

4 150 182 256 320 676 194 215

Арский 37 16 23 16 16 27 302 10

4 24 42 32 24 27 479 24

УНИИЭВ 37 60 80 30 70 54 42 215

4 97 128 57 91 85 95 380

Примечание: »-обратная величина разведения сыворотки нейтрализующей 100 ТЦДзо вируса.

Это преимущество удлиняет шкалу измерения и позволяет уловить минимальные различия между штаммами, а также установить наличие минимального количества антител. Таким образом, при серологическом обследовании стада, предпочтительней использовать метод постановки РН, при котором инкубацию смеси вирус-антитело проводят в течение 20 часов при +4"С, т.к. это позволяет выявить животных с небольшим количеством антител к ВБА более успешно, чем другие модификации РН.

2.2.7. Рестрикционно-эндонуклеазнын анализ генома вируса болезнн Ауески.

Целью исследовании являлось определение идентичности геномов вируса болезни Ауески у изучаемых штаммов. Для выполнения рестрикционного анализа необходимо наличие препаратов высокоочищенной ДНК - вируса. Наработка вируссодержащей суспензии, очистка, концентрирование осуществлялись в соответствии с ранее разработанными методиками . Второй этап работы заключался в выделении и очистке ДНК. Была разработана и утверждена методика. По результатам данной методики выход геномной ДНК составлял от 0.2 до 2 мкг из 10 мл инфицированной культуры в зависимости от титра вируса.

В результате проведенных исследовании показано, что по первым четырем рестрикционным фрагментам генома изучаемые штаммы не отличались друг от друга, и с вероятностью их можно отнести к 1-ой группе по принятой европейской классификации генома вируса (Hermann. 1986 г.) .

По остальным фрагментам изучаемые штаммы разделились на 3 подгруппы. В 1-ую подгруппу вошли штаммы "Мараштанский", "МК-25" и "УНИИЭВ-18ВС": во вторую подгуппу - "Туркменский". "БРАН" и "Женевский". Эта подгруппа отличается от первой уменьшением седьмого и исчезновением двенадцатого фрагмента генома вируса. В 3 -ю подгруппу вошел штамм "'Арский''. Он отличается от 1-ой подгруппы увеличением 12 фрагмента генома и появлением 14 фрагмента генома.

Рестрикционно- эндонукпеазный анализ геномов вируса болезни Ауески показал, что существует ряд рестрикционных профилей, свидетельствующих о существовании среди изолятов генетической гетерогенности. Эти различия видны в получении фрагментов разных размеров в результате утраты или преобретения сайтов расщепления рестрикционной эндуклеазой. У полевых штаммов наблюдались изменения вплоть до отсуствия некоторых фрагментов, присущих вакцинным штаммам ("МК-25" и "УНИИЭВ-18ВС").

Таким образом, можно сделать вывод, что рестрикционно-эндонуклеазный анализ ДНК с успехом может использоваться для изучения болезни Ауески. Для получения более полной информации о степени идентичности геномов вируса желательно использовать также рестрнктазы Pst и Kpnl, в сочетании с методом

блот-гибридизации. Все это свидетельствует о необходимости продолжения исследований поданной тематике.

З.Выводы

3.1 . Определены биологические свойства штаммов вируса болезни Ауески и установлено, что штаммы - "Арский", "УНИИЭВ -18ВС" являются высокопатогенными как для сельскохозяйственных так и для лабораторных животных. Штамм "Туркменский"- высокопатогенный для верблюдов, был слабопатогенен для свиней и лабораторных животных.

3.2. Установлено, что уровень накопления вируса болезни Ауески в органах и тканях, и выделение его во внешнюю среду с выдыхаемым воздухом находятся в прямой зависимости от патогенности возбудителя. Вирусовыделение у свиней начинается за 18-24 часа до проявления клинических признаков болезни.

Разработана схема индикации вируса болезни Ауески в объектах ветнадзора, предусматривающая выделение возбудителя, его концентрацию с помощью фильтра ФПП и обнаружение в ИФА, РСК или в культуре клеток ВНК-21.

3.3. Вирус болезни Ауески у больных сельскохозяйственных и лабораторных животных в наибольшем колличестве накапливается в головном мозге, легких, печени, средостенных лимфоузлах, поэтому для индикации возбудителя рекомендуется отбирать пробы из этих органов.

3.4. Устойчивость вируса болезни Ауески к воздействию различных физико-химических факторов не зависит от его штаммовой принадлежности.

3.5. Показана возможность использования МАТ к штамму УНИИЭВ-18ВС вируса болезни Ауески для индикации и идентификации возбудителя в кммуноферментном методе и реакции нейтрализации.

3.6. Оптимизирована методика постановки реакции нейтрализации и установлено, что при инкубации смеси вируса с антителами в течение 20 часов при + 4°С чувствительность метода повышается.

3.7.Установл'ено. что все исследуемые штаммы вируса болезни Ауески имели антигенное родство по отношению друг к другу, но степень имунного

ответа кроликов на введение одинакового количества антигена различных штаммов, существенно различалось. Наименьшей относительной антигенностью обладали штаммы - "Туркменский" и "Арский", наибольшей - "МК-25" и "Марашганский".

3.8. Предложен метод выделения и очистки геномной ДНК вируса болезни Ауески, обеспечивающий получение препарата пригодного для проведения рестрикционно-эндонуклеазного анализа.

3.9, Методом рестрикционно-эндонуклеазного анализа установлено, что у полевых изолятов вируса болезни Ауески (Арский, Туркменский, Женевский) наблюдались различия, в геноме, вплоть до отсутствия некоторых фрагментов, которые присуши вакцинным штаммам (МК-25, УНИИЭВ-18ВС).

4.Практическое значение.

Материалы работы использованы при составлении следующих научных документов:

1. "Методических указаний по индикации вируса болезни Ауески в объектах ветеринарного надзора" утвержденные директором ВНИИЗЖ 18.04.95 г.

2. Методики выделения и очистки геномной ДНК. утвержденные директором ВНИИЗЖ 12.08.94г.

3. Методики рестрикционно-эндонуклеазного анализа геномной ДНК вируса болезни Ауески. утвержденные директором ВНИИЗЖ 25.12.94 г.

4.Инструкции по изготовлению и контролю эмульсионной инактивированной вакцины против болезни Ауески из культурального вируса.

5.Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Мищенко В.А., Гочмурадов Г.К., Баборенко Е.П. Болезнь Ауески у одногорбых верблюдов. И Вирусные и микробные болезни животных: Сб. научных тр. Владимир, 1995, cl 13-115.

2. Мищенко В.А.. Дудников А.И., Баборенко Е.П. Иммунизация жвачных животных вакцинами против болезни Ауески. // Вирусные и микробные болезни животных: Сб. научных тр. Владимир. 1995, с201-204.

3. Аминева С.П.. Аминев А.Г., Баборенко Е.П.. Мищенко ВА. Использование рестрикционного картирования генома вируса в диагностике болезни Ауески // Вирусные болезни с.-х. ;к.-ных. Тез. докл. научно-практнч. конф. Владимир, 1995 г., с 47.

4. . Аминев А.Г, Аминева С.П., Баборенко Е.ГТ. Выделение и очистка геномной ДНК вируса болезни Ауески для анализа полевых изолятов // Вирусные болезни с.-х. ж.-ных. Тез. докл. научно-практич. конф. Владимир, 1995 г., с 48.

5. Глобенко Л.А., Жбанова Т.В., Баборенко Е.П. Получение гибридом и моноклональных антител к вирусу болезни Ауески // Вирусные болезни с ,-х. ж.-ных. Тез. докл. научно-практич. конф. Владимир. 1995 г., с 49.

6. Камалова Н.Е., Баборенко Е.П., Сатина Т.А. Получение диагностического антигена вируса болезни Ауески // Вирусные болезни с ,-х. ж.-ных. Тез. докл. научно-практич. конф. Владимир. 1995 г., с 64.

7. Мищенко В.А., Баборенко Е.П.. Корниенко Л.Н. Диагностика болезнии у верблюдов // Ветеринария 1994 г.. Xal 1.

8. Мищенко В.А.. Баборенко Е.П.. Корниенко Л.Н. Чувствительность животных разных видов к вирусу болезни Ауески // Ветеринария. 1994 г. №4, с. 20-22.

9. Мищенко В.А., Корниенко Л.Н. .Баборенко Е.П. РСК для обнаружения антигенов вируса болезни Ауески //Ветеринария 1993 г.. Xs8, с.54-55.

Ю.МищенкоВ.А., БаборенкоЕ.П.. ХухоровВ.М.. СмирновА.Б.

Иммунобиологические свойства вируса болезни Ауески //Ветеринария, 1996 г., №5. с. 20-21.

ll.Amineva S.P., Aminev A.G., Baborenko Е.Р. et all. Comparison of herpesvirus isolates from cis using restriction fragment pattern analysis. // Abstr. second intern symp. eradication of Aujesky's disease virus, 6-8 august 1995, Copenhagen. Denmark, 1995,44.

Отпечатано на полиграфической базе отдела патентных исследований и научной информации ВНИИЗЖ. Тираж 100 экз. октябрь 1996 г.