Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Алгоритм отбора и предварительной оценки кандидатов в вакцинные штаммы туляремийного микроба

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Алгоритм отбора и предварительной оценки кандидатов в вакцинные штаммы туляремийного микроба"

На правах рукописи

г"

КОМБАРОВА ТАТЬЯНА ИВАНОВНА

АЛГОРИТМ ОТБОРА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ КАНДИДАТОВ В ВАКЦИННЫЕ ШТАММЫ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА

03.02.03 -микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 Я НОЯ 2013

Оболенск - 2013

005540479

005540479

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Павлов Виталий Михайлович- доктор биологических наук

Мокриевич Александр Николаевич- кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

Светоч Эдуард Арсеньевич -доктор ветеринарных наук, профессор, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заведующий отделом молекулярной микробиологии.

Дядищев Николай Романович -доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное учреждение науки «Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов» ФМБА, директор

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «20» декабря 2013 года в 10-30 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Ученый секретарь

Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция, представляющая серьезную опасность для населения из-за почти 100 % восприимчивости к ней людей (Олсуфьев, 1975). Возбудитель туляремии был впервые выделен в 1911 г. от сусликов с симптомами, подобными чуме, в графстве Туляре (Tulare), Калифорния, США. И, хотя история изучения возбудителя туляремии насчитывает более ста лет, до настоящего времени нет исчерпывающих сведений о факторах патогенности бактерий Francisella tularensis, их молекулярных структурах и механизмах действия (Barker, 2007; Павлов, 2012). Современные знания о патогенезе туляремийной инфекции основываются, главным образом, на изучении экспериментальной туляремии на мышиной модели (Lyonsand, 2007).

Туляремия достаточно легко лечится антибиотиками, но, в случаях заражения F. tularensis subsp. tularensis биотипом А, частота летальных исходов при отсутствии лечения может достигать 10—50 % в зависимости от "входных ворот" инфекции (Sjostedt, 2003). Наиболее опасные — абдоминальная (тифоидная) и торакальная (легочная) - формы без надлежащего лечения летапьны в 30 % случаев (Dennis, 2001). Высокая патогенность F. tularensis subsp. tularensis и тяжелое течение заболевания при аэрозольном заражении обусловливают возможность использования штаммов этого подвида в качестве агента биотерроризма (Rotz, 2002).

Для профилактики туляремии в Российской Федерации используется живая ту-ляремийная вакцина на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, которая была создана в СССР в 40-50 годах двадцатого столетия (Олсуфьев, 1975). На основе вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ в США был создан экспериментальный вакцинный штамм LVS (Eigelsbach, 1961).В соответствии с МУ 3.3.1.2161-07 "Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба", утвержденными Главным государственным санитарным врачом РФ в 2007 году, свойства потенциальных вакцинных штаммов сравниваются со свойствами вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Для изучения приживаемости, безвредности, реактогенности, иммуногенности кандидатов в вакцинные штаммы, а также их влияния на иммунную систему используются морские свинки. На мышах, согласно МУ 3.3.1.2161-07, определяют только степень остаточной вирулентности испытуемого штамма при подкожном заражении.

Использование морских свинок при оценке вакцинных штаммов туляремийного микроба связано с высокой чувствительностью мышей даже к низковирулентным штаммам, таким, как F. tularensis 15 НИИЭГ и LVS (Fortier, 1991). Кроме того, согласно литературным данным, экспериментальная туляремия у морских свинок более приближена к характеру течения этой инфекции у человека и приматов (Cowley, 2011). Тем не менее, для изучения иммунопатогенеза туляремии традиционно используется мышиная модель, поскольку из всех лабораторных животных только для мышей разработаны тест-системы, позволяющие исследовать различные звенья иммунитета (Lyonsand, 2007). Наличие моноклональных антител к отдельнымСО-рецепторам иммунокомпетентных клеток, а также коммерческие наборы для определения цитокинов позволяют изучать тонкие механизмы формирования специфического иммунитета у мышей (Chiavolini, 2007; Ray, 2009). Использование различных линий мышей с определенно измененными генотипами также способствует детальному изучению этого процесса (Shen, 2004; Трунова, 2011; Cowley, 2011).

/

Большая часть опубликованных зарубежных работ по исследованию иммунного процесса при туляремии выполнена на штамме F. tularensis LVS, для которого F. tularensis 15 НИИЭГ является родительским. Возбудитель туляремии является внутриклеточным паразитом (Culkin, 1997;Forestal, 2007), поэтому он вызывает развитие преимущественно клеточно-опосредованного иммунитета (Elkins, 1993; Ki-rimanjeswara, 2008; Eneslatt, 2011). Иммунизация мышей штаммом F. tularensis LVS приводит к индукции пулов специфичных CD4+ и CD8+ Т-клеток, способных секре-тировать большой спектр провоспалительных цитокинов, в частности, ФНО-а и гамма-интерферон (Conlan, 1994). Наряду с синтезом специфических антител, роль Ei-клеток связана и с регуляцией притока нейтрофилов в селезенку на ранней стадии инфицирования иммунных мышей (Bosio, 2001).

К недостаткам существующих живых вакцин следует отнести их высокую ре-актогенность и остаточную вирулентность, что не исключает возможность возникновения инфекционного процесса у лиц с нарушениями иммунного статуса (Hollis, 1989; Whipp, 2003; Leelaporn, 2008). Реактогенность, являющаяся одним из важных признаков вакцинного штамма, коррелирует с остаточной вирулентностью. Высокая чувствительность мышей к туляремии (Elkins, 2003; Conlan, 2003) и расширенный к настоящему времени спектр методов изучения физиологических параметров у этих животных обусловливают целесообразность использования этой модели для оценки реактогенности потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы. В качестве критерия тяжести клинических проявлений при экспериментальной туляремии у мышей используют динамику изменения веса животных (Chiavolini, 2008; Ray, 2009)

Таким образом, подбор критериев реактогенности и разработка алгоритма отбора и оценки создаваемых генетически детерминированных кандидат-вакцин на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ является актуальной задачей современных исследований в области туляремии. Следует подчеркнуть важность скрининговой оценки генетически детерминированных вакцинных штаммов F. tularensis, поэтому ключевым этапом в изучении свойств кандидат-вакцин может являться обоснованное применение клеточных тестов in vitro, позволяющих минимизировать использование экспериментальных животных, что соответствует мировым этическим стандартам.

Цель исследования- разработка алгоритма отбора и предварительной оценки иммунобиологических свойств потенциальных вакцинных штаммов F. tularensis на мышиной модели.

Задачи исследования:

1. Выбрать линию мышей, позволяющую адекватно оценивать иммунопротектив-ные свойства потенциальных вакцинных штаммов/-", tularensis.

2. Оценить возможность использования макрофагоподобных клеток линии J774.1 А для предварительной характеристики (способности к внутриклеточному размножению) и отбора потенциальных вакцинных штаммов F. tularensis.

3. Выбрать критерии реактогенности и иммуногенности потенциальных вакцинных туляремийных штаммов на мышиной модели туляремии.

4. Провести сравнение иммунобиологических свойств потенциального вакцинного туляремийного штамма F. tularensis 15/23-1ДгесА и вакцинного штамма 15 НИИЭГ.

5. Разработать алгоритм отбора и оценки потенциальных туляремийных вакцинных штаммов.

Научная новизна

Приоритет в способе стабилизации и аттенуации вакцинного туляремийного штамма защищен патентами на изобретение № 2457247 и № 2460791 РФ и подана заявка на получение патента на изобретение под № 2013147130 от 23.10.2013 г. «Штамм Francisella tularensis 15/23-ДгесА со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способа ее получения».

Впервые установлено, что использование мышиной макрофагоподобной клеточной линии J774.1A позволяет предварительно оценить способность кандидатов в вакцинныештаммы F. tularensis к размножению, распространению и приживаемости в организме мышей линии BALB/c.

Впервые показана возможность использования мышей линии BALB/c для определения реактогенности, приживаемости и иммуногенной активности кандидатов в вакцинные штаммы туляремийного микроба.

Показано, что изменение веса и гематологические показатели крови у мышей достоверно изменяются в зависимости от остаточной вирулентности туляремийных штаммов и могут служить критериями реактогенности потенциальных вакцинных штаммов/*1, tularensis.

Практическая значимость

В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ («ГКПМ-Оболенск») депонированы штаммы F. tularensis subsp. holarctica 15 ДгесА (per. номер 6622) с делецией гена г ее A, F. tularensis subsp. holarctica 15ArecD (per. номерВ-6823)с делецией гена recD, F. tularensis subsp. holarctica 15/23-lArecA (per. номер 6623) с делецией одной копии генаiglC и гена г ее A, F. tularensis subsp. holarctica 15/23-lArecD (per. номер B-6821) с делецией одной копии KHaiglC и гена recD (федеральный уровень внедрения).

По материалам диссертации составлены методические рекомендации: «Порядок работы с СПФ животными в современных исследованиях», одобренные Ученым советом ФБУН ГНЦ ПМБ и утвержденные директором ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ № 7 от 11.09.2013 г.); «Использование современных средств содержания животных», одобренные Ученым советом ФБУН ГНЦ ПМБ и утвержденные директором ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ № 7 от 11.09.2013 г.). «Оценка напряженности специфического клеточного иммунитета у людей к возбудителю туляремии in vitro», одобренные Ученым советом ФБУН ГНЦ ПМБ и утвержденные директором ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ № 8 от 07.10.2011 г.) (учрежденческий уровень внедрения).

Разработанный алгоритм отбора и предварительной оценки иммунобиологических свойств потенциальных вакцинных штаммов F. tularensis используется для изучения свойств потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы против туляремийной инфекции (учрежденческий уровень внедрения).

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при ФБУН ГНЦ ПМБ (учрежденческий уровень внедрения).

Методология и методы исследования

В исследованиях использовали экспериментальные методы: микробиологические, биологические, биохимические, иммунологические, оценки физиологического состояния животных, методы статистической обработки результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Мыши линии BALB/c являются адекватной моделью для характеристики потенциальных туляремийных вакцинных штаммов.

2. Размножение штаммов F. tularensis с разной степенью аттенуации в макро-фагодобных клетках линии J774.1A коррелирует с приживаемостью и иммуно-генностью этих штаммов в организме мышей линии BALB/c.

3. Вес и гематологические показатели у мышей являются интегральными критериями реактогенности туляремийных вакцинных штаммов.

4. Уровень синтеза гамма-интерферона спленоцитами мышей, иммунизированных штаммами F. tularensis с разной степенью аттенуации, коррелирует с про-тективными свойствами этих штаммов и может использоваться как один из критериев иммуногенности.

5. Штамм F. tularensis 15/23-1ДгесА обладает сниженной реактогенностью, стабильностью биологических свойств и сохраняет иммуногенность, сравнимую с существующим вакцинным штаммом 15 НИИЭГ.

Апробация результатов

Результаты исследований получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.

Материалы диссертации представлены на четырех Всероссийских и международных научных конференциях: международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013 года), 2-ой ежегодной научно-практической конференции «Наука о лабораторных животных: современные подходы» (Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2012 г.), 5-ой Балтийской международной конференции «Микробные углеводы» (Суздаль, 2-6 сентября 2012 г.) ина научно-практической школе конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г.).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 20 апреля 2012 г. (протокол №5, приказ №118 от 27 апреля 2012г.). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 33 от 1 октября 2013 г.). Публикации

Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях, в том числе в 5 статьях в журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК, два патента на изобретение, одна заявка на патент ичетыре работы - в материалах конференций. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, четыре главы результатов исследований с их обсуждением, заключение, выводы и список использованных источников, включающий 45 работ отечественных и 192 зарубежных авторов. Работа содержит 14 таблиц и иллюстрирована 24 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы

При проведении исследований были использованы восемь штаммов F. tularensis: вакцинный штамм 15 НИИЭГ и пять его производных с одинарными или сочетанными делециями по генам iglC, гесА и recD, вирулентные штаммы

F. tularensis sitbsp. holarctica 503 и F. tularensis subsp. tularensis Schu. Все штаммы были получены из «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.

Экспериментальные исследования проводили на нелинейных мышах (6-8 недель, масса 20-24 г), мышах линий BALB/c и С57В1/6 (6-8 недель, масса 18-20 г) и на морских свинках (5-7 недель, вес 350-450 г). Животные получены из филиала института биоорганической химии питомника «Пущино» и филиала «Андреевка» Федерального Государственного бюджетного учреждения «Научный центр биомедицинских технологий» Российской академии медицинских наук.

Содержание и манипуляции с животными проводили в соответствии с методическими рекомендациями: «Использование современных средств содержания животных» (ФБУН ГНЦ ПМБ № 7 от 11.09.2013 г.); «Порядок работы с СПФ животными в современных исследованиях» (ФБУН ГНЦ ПМБ № 7 от 11.09.2013 г.) и с соблюдением требований санитарных правил: СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» -М., 2003; СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-1V групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных инфекций» - М., 2008.

Для оценки внутриклеточного размножения штаммов F. tularensis была использована перевиваемая макрофагоподобная клеточная линия J774.1А, предоставленная РККК (Санкт-Петербург), и перитонеальные макрофаги, полученные из мышей линии BALB/c. Для изучения иммуногенеза при экспериментальной туляремии мышей использовали спленоциты селезенок мышей линии BALB/c.

Микробиологические методы

Бактерии F. tularensis выращивали на плотной питательной среде ТА: эритрит-агар, 1 % высушенной крови крупного рогатого скота, 1 % глюкозы, 0,05 % цистеина, 0,0025 % тиамина хлорида, рН 7,2, либо на FT-arape (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск); при необходимости в среду добавляли антибиотик сульфат полимиксина В (Рш) (100 мкг/мл). Размножение F. tularensis в макрофагоподобных клетках линии J774.1A и пе-ритонеальных макрофагах оценивали через 3, 24 и 48 часов после внесения микроорганизмов по рысевам клеточных лизатов на плотную питательную среду (Golovliov, 1997). Приживаемость штаммов в организме лабораторных животных оценивали по высевам из селезенки. Гомогенат селезенки готовили в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) и высевали на плотную питательную среду ТА в серии разведений. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли через 72 часа инкубации чашек Петри при 37°С.

Проведение иммунизации и заражения животных

Животных иммунизировалиподкожно в паховую область, объем вводимого раствора 0,2 мл, а для морских свинок 0,5 мл. Визуальную оценку состояния и поведения животных, а также их взвешивание проводили ежедневно. Определение остаточной вирулентности штаммов F. tularensis проводили на мышах и морских свинках при подкожном введении им десятикратных разведений бактериальных суспензий в ЗФР в дозе от 108 КОЕ до 1 КОЕ для мышей и от 5 х 103 до 5 х 109 КОЕ для морских свинок. Наблюдение за иммунизированными животными проводили в течение 28 суток.

Определение протективной активности проводили путем заражения животных вирулентными штаммами на 28-е сутки после иммунизации. Погибших в ходе эксперимента и умерщвленных после его завершения животных вскрывали, органы и ткани подвергали бактериологическому исследованию.

Определение реактогенности

Для определения реактогенности ежедневно взвешивали морских свинок и мышей в течение 14 дней после иммунизации. Взвешивание животных проводили на электронных весах марки Scout Pro SPU, («Ohaus», США). Температуру измеряли с помощью чипов (ImplantableElectronicIDTransponders («BMDS», США), которые вводили подкожно животным, показания сканировали устройством Pocketscanner («BMDS», США). Общий анализ крови исследовали на автоматическом гематологическом анализаторе для ветеринарии PCE90Vet («HighTechnology», США). Забор крови у иммунизированных животных проводили в микропробирки с антикоагулянтом К2-ЭДТА.

Иммунологические методы

Титр антител в сыворотке крови мышей определяли иммуноферментным мето-дом(ИФА). Уровень цитокинов (ФНО-альфа и гамма-интерферона) в сыворотке крови и супернатанте спленоцитов мышей определяли методом ИФА с использованием наборов фирмы Bender MedSystems.

Спленоциты получали из селезенок иммунизированных мышей и культивировали в присутствии туляремийного антигена при 37°С в течение 72 ч, в атмосфере 5 % С02 и 100 % влажности. Далее отбирали супернатант для определения количества гамма-интерферона.

Статистическая обработка результатов и программное обеспечение

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы Excel для Windows версии 2010, рассчитывая среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической, доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием критерия Стьюдента (р < 0,05). При определении вирулентности и иммунно-генной активности штаммов вычисление величин LD50 и EDjo, а также доверительных интервалов (для вероятности 95 %) проводили по методу КагЬег в модификации И.П. Ашмаринаи A.A. Воробьева (Ашмарин, Воробьев, 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выбор линии мышей, позволяющей адекватно оценивать биологические свойства туляремийного вакцинного штамма

В рамках настоящей диссертационной работы мы провели сравнение экспериментальных моделей туляремии на морских свинках и мышах инбредных линий BALB/c (H2d) и С57В1/6 (Н2Ь) и аутбредных Swiss Webster. У животных оценивали динамику веса, температуру тела и гематологические показатели крови после иммунизации, остаточную вирулентность и защитные свойства для существующего вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ.

Одним из показателей физиологического состояния организма животных после иммунизации штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ является изменение их веса. Согласно полученным результатам, начиная с первых суток после введения вакцины отмечалось снижение веса у иммунизированных морских свинок (109 м.к./свинку), причем наибольшую потерю веса регистрировали на 4 сутки после иммунизации (рис. 1 А). У аутбредных мышей снижение веса началось только на 3 сутки. Снижение веса у иммунизированных мышей линий BALB/c и С57В1/6 (102м.к./мышь) имело сходную с морскими свинками динамику - падение веса у них началось уже через сутки (рис. 1А). В отличие от морских свинок, у иммунизированных инбредных мышей максимальное снижение веса наблюдалось на 7 - 9 сутки. У мышей линии BALB/c к

11 суткам начиналась постепенная прибавка в весе. Мыши линии С57В1/6, иммунизированные Р. Ш1агепз1$\5 НИИЭГ, к 8 суткам погибли.

20

10 -

£

0-

и

3 а -10-

о -20-

а

1 -30 -

-40

О 1 3 4 7 8 9 10 11 12 14 Время наблюдений, сут

0 1 3 4 7 8 9 10 11 12 14 Время наблюдений, сут

, — Морские свинки — BALB/c „

— C57BL/6 — Swiss Webster Ь

Рисунок 1 - Динамика изменения веса (%) (А) и изменения температуры (Б) лабораторных животных после подкожного введения вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ по отношению к первому дню иммунизации. Доза вакцинации - 10® м.к./свинку, 10" м.к./мышь

Изменения температуры у мышей и морских свинок носили характер постоянной лихорадки, свойственной острым инфекционным заболеваниям. Различия в динамике температуры у мышей разных экспериментальных групп не были статистически достоверны (рис. 1Б). Вероятно, этот показатель в значительной степени зависит от многих внешних факторов и поэтому является ненадежным критерием для оценки реактогенности.

Основные изменения в крови вакцинированных животных были выявлены при определении количества лейкоцитов и тромбоцитов (рис 2).

4 сут 7 сут

Время наблюдений

11 сут

4 сут 7 сут Время наблюдений

11 сут

ы морские свинки □Balb/c 0C57BL/6 □ Swiss Webster

Рисунок 2 - Динамика изменения количества лейкоцитов (А) и количества тромбоцитов (Б) в крови лабораторных животных после подкожного введения вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Доза вакцинации-109 м.к./свинку, 10"м.к./мышь

На 4-7 сутки после иммунизации у всех экспериментальных животных наблюдали лейкоцитопению (рис 2 А) и тромбоцитопению (рис 2 Б). У мышей линий BALB/c и С57В1/6 эти изменения носили более выраженный характер. К 11 суткам количество лейкоцитов и тромбоцитов у морских свинок, аутбредных мышей и мышей линии BALB/c восстановилось до нормы. Большой разброс значений количества форменных элементов в крови мышей Swiss Webster, вероятнее всего, объясняется генетической гетерогенностью этих животных.

Показано, что при оценке остаточной вирулентности самыми восприимчивыми к вакцине оказались мыши линии С57В1/6 (LD50 = 5 м.к.), а наиболее устойчивыми -аутбредные мыши Swiss Webster (LD50 = 316 м.к.), а мыши линии BALB/c занимали промежуточное положение (LD50 = 79 м.к.). Следует отметить, что показатели вирулентности вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ для различных видов мышей коррелировали с изменением гематологических показателей и веса лабораторных животных.

Суммируя приведенные выше результаты, можно сделать вывод, что сходная динамика изменения веса и гематологических показателей морских свинок и мышей позволяет использовать мышей в качестве альтернативной модели при изучении ре-актогенности штаммов туляремийного микроба. Аутбредные мыши,' обладая значительной устойчивостью к туляремийной инфекции, являются генетически неоднородной популяцией и не позволяют получать статистически достоверные результаты на малых группах животных. Следовательно, наиболее адекватной моделью для проведения исследований и оценки перспективных туляремийных вакцин являются мыши линии BALB/c.

Сравнительный анализ иммунобиологических свойств потенциальных кандидатов в новые вакцинные штаммы против туляремии

Основным недостатком существующей живой туляремийной вакцины являются ее реактогенность и нестабильность (Дунаева, 1960). В рамках выполнения федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 г.г.)» в ФБУН ГНЦ ПМБ была создана серия штаммов F. tularensis без одной и двух копий гена iglC, а также штаммы с инактивированными генами гесА и reel). Ген iglC является одним из важнейших генов, отвечающий за размножение клеток F. tularensis в макрофагах (Golovliov, 2003). Два других гена, гесА и recD, входящие в систему генов гомологичной рекомбинации recABCD, влияют на механизмы генетической изменчивости микроорганизмов.

По нашим данным, инактивация гена recD негативно влияла нарост и значительно снижала остаточную вирулентность мутантного штамма. Удаление обеих копий гена iglC не оказывало влияния на ростовые свойства бактерий, но приводило к полной потере вирулентности штамма. Удаление одной копии гена iglC и делеция гена гесА также не влияли на ростовые свойства бактерий, но снижали остаточную вирулентность.

Бактерии F. tularensis- внутриклеточные паразиты, и их способность к выживанию и размножению в клетках макроорганизма является необходимым условием развития инфекционного процесса (Sjostedt, 2007). По данным Т. |М. Maier (2004) успешность иммунной перестройки организма хозяина также зависит от способности вакцинного штамма к внутриклеточному размножению.

Мы изучили способность к внутриклеточному размножению в мышиной мак-рофагоподобной клеточной линии J774.1А штаммов F. tularensis с разной степенью

аттенуациии сравнили полученные результаты с данными по персистенции исследуемых штаммов в организме мышей линии ВАЬВ/с (рис. 3).

Рисунок 3 - Влияние делеции одной (15/23-1) и двух (15/23-2) копий гена iglC, генов гесА и гес/Ж Ыагет^в на процесс внутриклеточного размножения бактерий в макрофагоподобных клетках линии .1774.1А (А) и на обсемененность селезенки мышей линии ВАЬВ/с (доза иммунизации 100 м.к./мышь) (Б)

Делеция двух копий гена iglC приводила к значительной потере способности бактерий к внутриклеточному размножению в макрофагоподобных клетках (рис. 3 А). Кроме того, штамм с делециями двух копий гена при одинаковой с другими изучаемыми штаммами дозе иммунизации (100 м.к./мышь) был неспособен к персистенции в организме мышей (рис. 3 Б). Штаммы с инактивированной одной копией гена iglC или геном гесА сохраняли вышеуказанные свойства на уровне родительского штамма Р. Ы1агеп$1$ 15 НИИЭГ. Штамм с делетированным геном гесЭ занимал промежуточное положение по способности к внутриклеточному размножению и персистенции в организме мышей (рис. 3 А, Б).

Таким образом, размножение штаммов К Ш1агепя1.ч с разной степенью аттенуа-ции в мышиных макрофагах 1774.1 А коррелировало с приживаемостью этих штаммов в организме мышей линии ВАЬВ/с. Штаммы, сохранившие способность к размножению в макрофагкэподобных клетках, обладали лучшей приживаемостью в организме мышей и выделялись из селезенок мышей вплоть до 21 суток наблюдения. Следовательно, изучение способности к размножению исследуемых мутантных штаммов в макрофагах .1774.1А позволяет проводить предварительный отбор наиболее перспективных кандидатов в вакцинные штаммы.

В качестве критериев реактогенных свойств потенциальных вакцинных штаммов Р. Ы1агет15 в данной работе были выбраны такие показатели, как динамика изменения веса животных, гематологические показатели (количество лейкоцитов, тромбоцитов), а также количество гамма-интерферона в сыворотке крови у мышей после их иммунизации.

Иммунизация мышей линии ВАЬВ/с штаммами Р. Ш1агепз'1$ 15/23-2 и 15ДгесО не приводила к снижению веса и изменению гематологических показателей. Иммунизация штаммами Р. шЬгети 15/23-1 и 15ДгесА, так же, как и родительским штаммом Р. шЬгепв'^ 15 НИИЭГ, вызывала у животных снижение веса и статистически достоверное изменение гематологических показателей, наиболее выраженных у мышей, иммунизированных штаммом/7. /а/ягеиж' 15 НИИЭГ.

8

7

15 НИИЭГ 15/23-1 15/23-2 15ДгесА 15ДгесО К Магепзй, штаммы Н 3 часа □ 24 часа Э 48 часов А

15НИИЭГ 15/23-1 15/23-2 15ДгесА 15ДгесБ Еш1агепл1з, шталшы □ 4 сутки □ 7сутки ЕЗ14 сутки И 21 сутки Б

-20

-25

-зфр

"15/23-2

3 5 6 7 !

ремя наблюдений, сутки —— 15 НИИЭГ —» —15ЛгссА

10

'15/23-1 ' 15ЛгесБ

Иммунизация мышей штаммами 15/23-! и 15ДгесА вызывала снижение веса к 6 дню наблюдения не более, чем на 10 %, в то время, как иммунизация исходным штаммом 15 НИИЭГ приводила к потере веса у животных почти на 20 % (рис. 4). Период снижения веса животных при иммунизации штаммами 15/23-1 и 15ДгесА был непродолжительным (45 дней) и затем вес восстанавливался до исходных значений. В то же время, при введении штамма /•'. гм/агегаи 15 НИИЭГ вес животных не восстанавливался до первоначального уровня в теченир всего периода наблюдения.

Рисунок 4 - Динамика изменения веса мышей линии ВАЬВ/с после иммунизации по отношению к первому дню иммунизации (%). В качестве контроля - мыши линии ВАЬВ/с, иммунизированные исходным штаммом Р. иДагетю 15 НИИЭГ и ЗФР. Доза иммунизациидля всех штаммов 100 м.к./мышь.

Наши исследования показали, что при иммунизации штаммами 15/23-1 и 15ДгесА у мышей лейкопении не наблюдали, а лейкоцитоз был кратковременным и незначительным. В то время, как при иммунизации вакцинным штаммом Р. Ш1агепя15 15 НИИЭГ развивалась лейкопения в период 4-7 суток, которая сменялась лейкоцитозом в период 14-21 суток, иммунизация мышей штаммами Р. 1и1агеш1В 15 НИИЭГ, 15/23-1 и 15ДгесА приводила к развитию тромбоцитопении, которая сменялась тромбоцитозом, причем наибольшие колебания этого показателя наблюдали после вакцинации штаммом Р. Ш1агет'1$ 15 НИИЭГ. В сыворотках, полученных от мышей на 7 сутки после иммунизации, регистрировали повышение уровня гамма-интерферона, причем для штамма 15 НИИЭГ количество гамма-интерферона в сыворотке было почти в 10 раз выше, чем в сыворотках мышей после введения штамма 15ДгесВ, и 6-7 раз выше, чем при иммунизации штаммами 15/23-1 и 15ДгесА (данные не приведены).

Как известно, повышение синтеза гамма-интерферона отражает уровень воспалительного процесса (Апёегезоп, 2006; Соп1ап, 2008). Очевидно, что характер и степень изменения количества лейкоцитов и гамма-интерферона в наших исследованиях свидетельствуют о более выраженном инфекционном процессе при вакцинации штаммом 15 НИИЭГ, по сравнению с его аттенуированными производными. Феномен тромбоцитопении, сменяющейся тромбоцитозом, выявленный нами при иммунизации штаммами Р. 1и1агеп$18 15 НИИЭГ, 15/23-1 и 15ДгесА, требует более детального изучения для понимания патогенеза туляремийной инфекции.

Таким образом, мы предлагаем использовать гематологические показатели, уровень гамма-интерферона в сыворотке крови мышей и изменение веса животных в качестве критериев оценки реактогенности атгенуированных туляремийных штаммов.

Данные по изучению специфического гуморального иммунитета свидетельствуют, что иммунизация штаммами Р. Ш1агепх15 15/23-1 и 15ДгесА в дозе Ю2м.к./мышь вызывает выработку специфических антител в титрах, сопоставимых с титрами, индуцируемыми существующим вакцинным штаммом (табл. 1), тогда как для штаммов15/23-2 и 15АгесО только иммунизация более высокой дозой 105м.к./мышь позволяет получить высокоиммунные сыворотки.

Таблица 1 - Влияние инактивации генов iglC (одной и двух копий), гесА и гесй в штамме Р. МагемЬ 15 НИИЭГ на формирование гуморального иммунитета у мышей линии ВАЬВ/с

Штаммы Е /¡¡¡агепь!! Доза вакцинации, м.к./мышь Средние значения титров антител к УЗД Е Ш1агеп51! (пределы колебаний)

15НИИЭГ 10" 1/400(1/200-4/1600)

15/23-1 ю" 1/400(1/200+1/1600)

15/23-2 2 10 1/100 (1/50-1/200)

5 10 1/400(1/200+1/1600)

154гесА 2 10 1/400 (1/200+1/1600)

15АгесБ 2 10 1/200(1/100+1/400)

5 10 1/400(1/200+1/1600)

Клеточное звено иммунитета оценивали по индуцированному антигеном К Ыагв1Ш8 синтезу гамма-интерферона спленоцитами иммунных мышей. Уровень продукции этого цитокина в группах мышей, иммунизированных штаммами Р. Ы1агет1в 15 НИИЭГ, 15/23-1 и 15ДгесА, был в 5-8 раз выше, чем в группе, иммунизированной штаммом 15/23-2, и в 2-3 раза выше, чем в группе, иммунизированной

штаммом ] 5ДгесО

(рис. 5). Это позволяет считать, что иммунизация штаммами с делениями одной копии гена ¡'¿1С или гена гесЛ приводит к формированию клеточного иммунитета, сравнимого по напряженности с клеточным иммунитетом, формируемым исходным штаммом

К 1и1агепт 15 НИИЭГ. В то же время, иммунизация штаммами с делениями двух копий гена или гена г ее О

3000

2000

1000

—

гЬ

п

15 НИИЭГ 15/23-1 15/23-2 15ЛгесА 15ДгесО контроль иммунизирующие штаммы Е1и1агеп815

Рисунок 5 - Влияние инактивации генов ig/C, гесА и гсс!) в штамме У7. /ы/аге/шя 15 НИИЭГ на индуцированный синтез гамма-интерферона спленоцитами на 30-е сутки после иммунизации мышей

приводит к меньшей выраженности клеточно-опосредованного иммунного ответа, т.е. эти штаммы менее иммуногенны.

Показано, что инактивация исследуемых генов по-разному влияет на остаточную вирулентность и иммуногенность (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние инактивации генов iglC (одной и двух копий), гесА и гесО в штамме Р. шШгетю 15НИИЭГ на вирулентность и иммуногенность

Штаммы Е Шагеюгя ЬБ50(КОЕ/мышь) ЕО50(КОЕ/мышь)

15 НИИЭГ 79,0(40-110) 8,5 (1,8 -53,7)

15/23-1 794,0 (251-3162) 10,9 (2,8-43,6)

15/23-2 У >10 нет защиты

15ДгесА 5,0 х ю (1,99 х Ю -7,94 х ю ) 15,5 (7,8-73,1)

15ДгесО 5,0 х Ю (2,51 х ю -3,16 х Ю ) 915,3 (574,1- 1303,1)

Делеция одной копии гена щ!С повышала ЬО50 штамма К Ш1агепя15 на порядок, а делеция гена гесА - почти на два порядка. Делеция гена гесО приводила к повышению ЫЭ50 более, чем на шесть порядков, а отсутствие в хромосоме Р. ги1агеп$1ч обеих копий гена 1%1С делало штамм практически авирулентным (табл. 2).

Иммуногенные свойства штаммов оценивали по выживаемости мышей после заражения бактериями К 1и1агет1.ч 503 дозой 1 х 103 м.к./мышь (1000 1)СЬ) (табл. 2). Протективность штаммов Р. Ы1агспз15 15/23-1 и 15ДгесА для мышей была сопоставима с защитой после иммунизации штаммом 15 НИИЭГ. Для штамма 15ДгесО величина Е05о была на два порядка выше, чем у исходного штамма. Штамм с делециями обеих копий гена не защищал от заражения вирулентным штаммом, но имело место увеличение средней продолжительности жизни (9,3 суток против 5,6 суток в контрольной группе).

Таким образом, изучение штаммов К Шагет'ю 15/23-1, 15/23-2, 15ДгесА и 15ДгесО позволило сделать выводы, что для улучшения свойств существующей туля-ремийной вакцины, в частности, для снижения ее реактогенности и повышения стабильности, наиболее рационально создать на основе штамма Р. Магепз'и 15 НИИЭГ штамм с инактивацией одной копии гена iglC и гена г ее А. Такой штамм был создан группой генетиков нашего Центра во главе с к.м.н. Мокриевичем А.Н.

Сравнение иммунобиологических свойств потенциального вакцинного штамма К Ш1агепш 15/23-1АгесА и вакцинного штамма 15 НИИЭГ

Путем генетических манипуляций на основе вакцинного штамма Р. ш1агепзЫ 15 НИИЭГбыл получен штамм К 1и1агеп$1$ 15/23-1 ДгесА. Достоинствами этого штамма являются его стабильность и генетическая маркированность. Штамм был депонирован в Государственной коллекции «ГКПМ-Оболенск» под номером В-6623. Мы сравнили свойства полученного нового штаммаР. /ы/йггеи.ш 15/23-1ДгесА с вакцинным штаммом 15 НИИЭГ с использованием морских свинок и мышей линии ВАЬВ/с.

При изучении культурально-морфологических свойств штамма ш1агепз1$ 15/23-1 ДгесА было показано, что он подобен туляремийному вакцинному штамму15 НИИЭГ(рис. 7). Сравнительную оценку способности к внутриклеточному

размножению штамма 15/23-1ЛгесА проводили на культуре клеток линии J774.1A и перитонеальных макрофагах мышей (рис. 7 А). Новый потенциальный вакцинный штамм размножался в макрофагоподобных клетках J774.1A в 8-10 раз хуже, чем исходный штамм. Размножение бактерий в перитонеальных макрофагах практически не отличалось у обоих штаммов.

Способность штамма 15/23-1ДгесА к персистенции исследовали на морских свинках и мышах (рис. 7 Б). Представленные результаты свидетельствуют ободина-ковой динамике элиминации штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и 15/23-1ДгесА из морских свинок и мышей. Бактерии штамма F. tularensis 15/23-1ДгесА практически полностью элиминировались из организма мышей и морских свинок после 14 суток персистенции, в то время как клетки штамма 15 НИИЭГ высевались из селезенок мышей и морских свинок на 21 сутки.

мыши BALB/c !'. tularensis, штаммы g

□ 7 сутки Р 14 сутки Н21 сутки

Рисунок 7 - Сравнение способности к размножению вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ и штамма 15/23-1 ДгесА в макрофагоподобных клетках линии J774.1A и перитонеальных макрофагах мышей линии BALB/c (А) обсемененности селезенок морских свинок и мышей линии BALB/c после иммунизации штаммами F. tularensis 15 НИИЭГ и 15/23-1 ДгесА (Б)

10 12 13 14 15 16 17 19 21

Время наблюдений, сутки

" мыши Balb/c 15 НИИЭГ - морские свинки 15 НИИЭГ

-мыши Balb/c 15/23-1ДгесА - морские свинки 15/23-1дгесА

Рисунок 8 - Динамика изменения веса животных (%)после иммунизации штаммами К Ыагепх/а 15 НИИЭГ и 15/23-1 ДгесА по отношению к первому дню иммунизации

15 НИИЭГ сходным образом:максимум снижения веса приходился на 8 сутки, затем вес животных плавно к 21 дню возвращался к исходному значению. На иммунизацию

Иммунизация морских свинок штаммом 15 НИИЭГ приводила к наибольшему снижению веса к 5 дню наблюдения (23 %), затем вес у животных постепенно повышался, однако к 21 суткам вес все еще был ниже исходного. У морских свинок, иммунизированных штаммом 15/23-1ДгесА, наибольшая потеря веса наблюдалась в те же сроки, однако была менее выражена (10 %), и уже в период 6-13 суток весвозвра-щался к исходному значению (рис. 8).

Мыши BALB/c реагировали на иммунизацию штаммом

штаммом 15/23-1ДгесА мыши ВАЬВ/с реагировали незначительным снижением веса в период 3-10 суток и уже к 11 суткам вес достигал исходного значения и далее увеличивался (рис. 8).

При сравнении гематологических показателей морских свинок и мышей линии ВАЬВ/с, иммунизированных штаммами 15НИИЭГ и 15/23-1ДгесА, были выявлены определенные отличия в количестве лейкоцитов и тромбоцитов в крови экспериментальных животных (таб. 3). В сыворотках этих же животных была определена концентрация гамма-интерферона (таб. 3).

Изменение количества лейкоцитов у морских свинок и мышей линий ВАЬВ/с, иммунизированных штаммом К ¿и/агепш 15 НИИЭГ, имело сходный характер. У животных наблюдали выраженную лейкопению в период 4-7 суток после иммунизации и лейкоцитоз в период 14-21 суток. Иммунизация штаммом 15/23-1ДгесА вызывала менее выраженное уменьшение числа лейкоцитов у морских свинок на 14-21 сутки, а у мышей лейкопении не наблюдали.

Схожие изменения были обнаружены и при определении количества тромбоцитов: на 4-7 сутки у морских свинок и мышей, иммунизированных штаммом Р. Ш1агепз'1$ 15 НИИЭГ, отмечали тромбоцитопению, которая у мышей сменялась тромбоцитозом. Иммунизация штаммом Р. Ш1агет1$ 15/23-1ДгесА существенно меньше влияла на изменения этих показателей: тромбоцитопению у морских свинок наблюдали к 4 суткам после введения вакцины, а затем концентрация тромбоцитов восстанавливалась к исходному уровню на 7 сутки. У мышей уровень тромбоцитов практически не менялся. Уровень гамма-интерферона в сыворотке у мышей линии ВАЬВ/с, индуцированный вакцинацией, достигал максимума на 7 сутки, превышая исходные значения в 18 раз у мышей, вакцинированныхштаммом 15 НИИЭГ, и 3,5 раза у мышей, вакцинированных штаммом К ш1агеп$1з 15/23-1ДгесА.

Величина ЬО50 штамма Р. ы1агеж1$ 15/23-1ДгесА, как и родительского штамма Р. Шагет'и 15 НИИЭГ, для морских свинок была выше 109 КОЕ. Для мышеи линии ВАЬВ/с ЬО;о штамма 15/23-1ДгесА увеличилась на 2,5 порядка по сравнению с ЬВ50 вакцинного штамма 15 НИИЭГ (таб. 4), что свидетельствует о снижении его остаточной вирулентности для мышей.

Таблица 4 — Вирулентность и иммуногенная активность штаммов Р. Ш1агеп$13 15 НИИЭГ и 15/23-1ДгесА для морских свинок и мышей линии ВАЬВ/с

Лабораторные животные Штаммы /\ Шчгепш 1Л)50 ЕБ5о

К Ш1агети 503 ЮООБСЬ К (и/агетк всЬи ЮОООСЬ

морские свинки 15 НИИЭГ > 10* 12,6 (5,7-96,5) н/д

15/23-1ДгесА >109 79,0 (13,8 + 316) н/д

мыши линии ВАЬВ/с 15 НИИЭГ 79,0 (40+110) 8,5 (1,8 + 53,7) 34,5(3,6+97,3)

15/23-1ДгесА 2,0 х ю4 (6,4*103+6,0х104) 10,3 (3,6-78,5) 42,3(8,6+109,6)

Таблица 3 - Гематологические показатели и уровень гамма-интерферона в сыворотке лабораторных животных после иммунизации штаммами К шЬгегит 15 НИИЭГ и 15/23-1ДгесА

Показатели крови Лабораторные животные Штаммы Р. ш1агеп$1$ Время наблюдений

0 сутки (ин-тактные животные) 4 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки

Количество лейкоци- 9 товхЮ морские свинки 15 НИИЭГ 6,0±1,5 1,7±0,5 3,9±1,1 9,3±0,4 8,6±2,5

15/23-1ДгесА 3,9±0,5 1,6±0,3 6,0±0,9 6,5±0,8 5,6±0,5

мыши ВА1_В/с 15 НИИЭГ 4,6±0,7 2,5±0,4 2,6±0,5 8,20±0,9 6,8±0,9

15/23-1ДгесА 4,6±0,7 5,3±0,4 4,10±0,3 7,80±1,0 5,9±0,6

Количество тромбоци- 9 ТОВ*10 морские свинки 15НИИЭГ 607,8±136,1 69,5±24,5 117,0±29,6 269,5±29,6 518±212,5

15/23-1ДгесА 431,8±68,2 156,0±53,8 523±182,6 442,8±69,7 377,3±110,0

мыши ВАЬВ/с 15 НИИЭГ 562,8±34,8 385,2±83,2 241,8±58,7 892,8±173,8 789,1±71,6

15/23-1ДгесА 562,8±34,8 618,5±129,7 455,8±47,4 842,7±322,4 698,2±112,1

Гамма-интерферон пкг/мл мыши ВАЬВ/с 15 НИИЭГ 94,1±12,9 381,б±43,3 1702,3±187,5 71,5±12,0 н/д

15/23-1ДгесА 94,1±12,9 269,4±23,5 331,9±38,3 79,7±13,6 н/д

Изучение иммуногенных свойств двух штаммов показало, что развитие гуморального и клеточно-опосредованного иммунитета приводит к формированию хорошего уровня защиты, обусловленного кандидат-вакцинным штаммом Р. Ш1агепз1$ 15/23-1ДгесА. Этот уровень практически не отличается от уровня защиты, который обеспечивается вакцинным штаммом Р. Магепз^я 15 НИИЭГ (таб. 4).

Таким образом, показано, что штамм Р. 1и1агепз1$ 15/23-1ДгесА обладает сниженной реактогенностью, достаточной иммуногенностью и может рассматриваться в качестве перспективного при создании новой менее реактогенной вакцины против туляремии.

Алгоритм оценки штаммов /•". Шагеюгх - кандидатов для создания туляремийной вакцины

Проведенные нами исследования показали, что использование мышей линии ВАЬВ/с позволяет адекватно оценивать реактогенные и иммуногенные свойства ту-ляремийных штаммов.

Анализ данных, полученных при сравнительной характеристике штаммов Р. 1и1агеп.?1.5 с разной степенью аттенуации и развернутые исследования кандидат-вакцины Р. ш1агеп515 15/23-1ДгесА в сравнении с существующей туляремийной вакциной Р. Шагепя'я 15 позволил нам разработать алгоритм отбора кандидатов в вакцинные штаммы туляремийного микроба, приведенный на рис.8.

Рисунок 8 — Алгоритм отбора кандидатов в вакцинные штаммы туляремийного микроба

Предложенные нами критерии оценки реактогенности и иммуногенности туля-ремийных вакцинных штаммов, а именно: изменение веса мышей, количества лейко-

цитов и тромбоцитов, количества гамма-интерферона в сыворотке крови и уровня индуцированного синтеза гамма-интерферона спленоцитами иммунных животных позволяют судить о перспективности исследуемого штамма. Важным критерием также является способность туляремийного микроба размножаться в макрофагоподобных клетках линии J774.1 А.

Таким образом, исследование кандидатов аттенуированных штаммов F. tularensis в вакцинные складывается из следующих этапов (рис.8):

1. Изучение свойств кандидатов в вакцинные штаммы in vitro.

1.1 Изучение ростовых свойств бактерий и их чувствительности к нормальной кроличьей сыворотке (НКС).

1.2. Изучение стабильности биологических свойств созданного штамма.

1.3. Изучение свойств новых штаммов на клеточных культурах in vitro.

Если исследуемый штамм обладает необходимой способностью к росту, стабилен при пересевах, устойчив к НКС и сохранил способность к внутриклеточному размножению в макрофагах, то можно переходить к исследованиям на мышах линии BALB/c.

2. Изучение иммунобиологических свойств кандидатов в потенциальные вакцинные штаммы на мышиной модели in vivo.

2.1. Определение остаточной вирулентности штамма (подкожное введение испытуемого штамма в дозах 5*10', 5*102, 5х 103, 5x104, 5x10s, 5*10б м.к./на мышь, по 5 мышей на каждое разведение). Если получаемые результаты свидетельствуют о снижение вирулентности, то исследования продолжают.

2.2. На этом этапе проводят взвешивание мышей для предварительной оценки реактогенности (в сравнении с контрольным вакцинным штаммом).

2.3. У выживших животных через 28 суток после заражения исследуют клеточный иммунитет (по количеству гамма-интерферона в супернатанте спленоцитов иммунизированных мышей). При повышении уровня интерферона в опытных образцах более чем 5 раз можно предполагать, что штамм перспективен.

2.4. Для оценки реактогенности и приживаемости испытуемого штаммавак-цинируют еще 40 мышей дозой на порядок ниже LD50, определенной для этого штамма.

2.4.1. Для изучения реактогенности штамма у животных отбирают кровь на 4, 7, 14, 21 сутки для определения гематологических показателей и уровня гамма-интерферона в сыворотке (по 5 мышей на каждый срок — всего 20 животных). При взятии образцов крови отделяют аликвоту для получения сыворотки и определения нарастания титров антител. Исследуемые группы мышей взвешивают для убедительности доказательства снижения реактогенности.

2.4.2. У мышей из п. 2.4.1. определяют степень обсемененности органов (селезенка, печень и легкие) для оценки приживаемости исследуемого штамма F. tularensis (в сравнении с контрольным вакцинным штаммом).

3. Оставшихся 20 иммунизированных мышей линии BALB/c заражают вирулентным штаммом в дозе 1000 DCL. Определяют выживаемость к 21 дню после заражения и рассчитывают среднюю продолжительность жизни. На этом этапе можно исследовать разные способы заражения (подкожный и интраназальный), или штаммы F. tularensis разных подвидов.

Выводы

1. Установлено, что мыши линии BALB/c являются адекватной моделью для определения реактогенности, остаточной вирулентности и иммуногенной активности испытуемых аттенуированных туляремийных штаммов, позволяющей изучать гуморальное и клеточное звено формируемого специфического иммунитета.

2. Показано, что способность к переживанию и размножению бактерий испытуе-" мого аттенуированного штамма/Г tularensis в культуре клеток мышиной мак-рофагоподобной клеточной линии J774.1A коррелирует с приживаемостью в организме мышей линии BALB/c и является необходимым условием прогнозирования перспективностиего использования в качестве кандидата в вакцинные штаммы.

3. Выявлено, что изменение массы тела и гематологических показателей (количества лейкоцитов, тромбоцитов), а так же концентрации гамма-интерферона в сыворотке крови вакцинированных мышей линии BALB/c отражает степень реактогенности испытуемых аттенуированных штаммов/-", tularensis.

4. Установлено, что штамм F. tularensis 15/23-1ДгесА, несущий делеции в одной копии гена iglC и гене г ее А, по сравнению с вакцинным штаммом 15 НИИЭГ, характеризуется сниженной остаточной вирулентностью и реактогенностью при сохранении высокой иммуногенности, что позволяет рассматривать его в качестве кандидата для создания новой живой туляремийной вакцины.

5. Разработан алгоритм изучения свойств перспективных для создания вакцины штаммов F. tularensis, позволяющий эффективно оценить их иммунобиологические свойства и включающий следующие этапы: изучение свойств in vitro (ростовые свойства, чувствительность к ИКС, стабильность, размножение в макрофагах); изучение свойств in vivo на мышиной модели (остаточная вирулентность, приживаемость, реактогенность, клеточно-опосредованный иммунитет); изучение протективных свойств на мышиной модели. Применение данного алгоритма позволяет систематизировать исследования, сократить их объем и уменьшить количество используемых для этих целей животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

а) статьи в рецензируемых научных журналах

1. Комбарова, Т. II. Сравнительная оценка реактогенности туляремийной вакцины на различныхбиомоделях. /Т. II. Комбарова, В. М. Павлов, Т. Б. Кравченко, Г. М. Титарева, И. В. Бахтеева, А. И. Борзилов, О. В. Коробова, Г. М. Вахрамеева, Р. И. Миронова, А. Н. Мокриевич // Эпндем. и вакцнно-проф. - 2013". - Т.71. - №4. - С. 54-62.

2. Мокриевич, А. Н. Создание и изучение вариантов вакцинного штамма Francisella lularensis без генов iglC. Сообщение 1 /А. Н. Мокриевич, Г. М. Вахрамеева, Р. И. Миронова, Т. II. Комбарова, Г. М. Титарева, Т. Б. Кравченко, И. В. Бахтеева, И. А. Дятлов, В. М. Павлов // Проблемы особо опасных инфекций. — 2013 .—№ 3. — С. 70-74.

3. Лапин, А. А. Иммунологические свойства вакцинного штамма Francisella tularensis 15/10 с делетированным геном гесА/ А. А. Лапин, А. Н. Мокриевич, Г. М. Вахрамеева, Т. II. Комбарова, И. В. Бахтеева, И. А. Дятлов, В. М. Павлов // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. — № 4. - Вып. 110. - С. 65-67.

4. Лапин, А. А. Изучение влияние УФ-облучения и воздействия налидиксовой кислоты на индукцию гесА-белка Francisella tularensis 15/10 /А.А.Лапин, Т. Б. Кравченко, А.Н. Мокриевич, Г. М. Вахрамеева, Т. И. Комбарова, И. А. Дятлов, В. М. Павлов //Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. -№ 3. - Вып. 109,-С. 36-39.

5. Мокриевич, А. Н. Биологические свойства и строение липополисахарида вакцинного штамма Francisella tularensis, полученного при инактивации гена системы «чувства кворума» qseC /А. Н. Мокриевич, А. Н. Кондакова, Э. Валаде, М. Е. Платонов, Г. М. Вахрамеева, Р. 3. Шайхутдинова, Р. И. Миронова, Д. Блаха, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, Т. Б. Кравченко, Т. И. Комбарова, Д. Видаль, В. М. Павлов, Б. Линднер, И. А. Дятлов //Биохимия. — 2010. - Т. 75. - № 4. - С. 539-548.

б) патенты

6. Пат. RU № 2457249 МПК51 C12N 15/00. Способ стабилизации вакцинного ту-ляремийного штамма /Павлов В.М. (RU), Мокриевич А. Н. (RU), Вахрамеева Г. М. (RU), Миронова Р. И. (RU), Комбарова Т. И. (RU), Лапин A. A. (RU); патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) (RU) - № 2010141704/10; заявл. 11.10.2010; опубл. 27.07.2012, Бюл. № 21 -9 с.

7. Пат. RU 2460791 МПК51 C12N 15/00, C12N 15/09, C12R 1/00. Способ аттенуа-ции вакцинного туляремийного штамма /Лапин A. A. (RU), Мокриевич А. Н. (RU), Вахрамеева Г. М. (RU), Миронова Р. И. (RU), Комбарова Т. И. (1Ш),Игнашипа Е. Н. (RU), Павлов В. М (RU); патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) (RU) -№ 2011131560/10;заявл. 28.07.2011; опубл. 10.09.2012, Бюл. № 25 - 8 с.

в) заявка па патент

8. Мокриевич, А. Н. Штамм Francisella tularensis 15/23-1 ДгесА со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способа ее получения/А. Н. Мокриевич, Т. И. Комбарова, В. М. Павлов, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, Т. Б. Кравченко, Р. И. Миронова, Г. М. Вахрамеева,

И. А. Дятлов // Заявка на получение патента на изобретение под№ 2013147130 от 23.10.2013.

г) тезисы докладов на научных конференциях

9. Павлов, В. М. Иммунобиологические свойства вакцинного miaMuaFrancisel-la tularensis сделетированным геном гесА /В. М. Павлов, В. С. Тимофеев, А. Н. Мокриевич, А. А. Лапин, Г. М. Вахрамеева, Т. И. Комбарова, И. В. Бахтеева, И. А. Дятлов // Молек. эпидем. актуальных инфекций (Сб. тезмеж-дународной конференции) Санкт-Петербург. - 2013. -С. 160-161."

10. Kombarova, Т. I. Study of immunogenic properties of Francisella tularensis vaccine strain 15 NIIEG with inactivated genes iglC, recA and recD.IT. I. Kombarova, A. N. Mokrievich, I. V. Bakhteeva, T. B. Kravchenko, G. M. Titareva, V. M. Pavlov// Microbial Carbohydrates (5lh BalticMeeting) -Suzdal. - 2012. - P. 45.

11. Комбарова, Т. И. Чувствительность инбредных и аутбредных мышей к вакцинному штамму 15 НИИЭГ /Т. И. Комбарова, В. М. Павлов, А. И Борзилов, Т. Б. Кравченко, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, А. Н. Мокриевич //Наука о лабораторных животных: современные подход (2-ая ежегодная научно-практическая конференция). - Санкт-Петербург. - 2012г. - С. 11-12.

12. Лапин, А. А. Получение дефектного по recD гену вакцинного варианта Fran-cisellatularensis 15/10 и изучение его свойств. /А. А. Лапин,А. Н. Мокриевич, Г. М. Вахрамеева, Т. И. Комбарова, И. В. Бахтеева, В. М. Павлов // Современные технологии обеспечения биологической безопасности (Материалы научно практической школы конференции молодых ученых и специалистов) -Оболенск. - 2010. - С. 282-284.

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность своим научным руководителям д.б.н. Павлову В. М. и к.м.н., Мокриевичу А. Н. за осуществление руководства и оказание методической помощи в проведении исследовательских работ.

Благодарю директора ФБ22УН ГНЦ ПМБ чл.-корр. РАМН, д.м.н., профессора Дятлова И. А. за предоставленную возможность защитить диссертацию в диссертационном совете Д 350.002.01 при ФБУН ГНЦ ПМБ, а ученого секретаря диссертационного совета к.б.н. Фурсову Н.К. - за организацию ее проведения.

Глубоко признательна ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, вопросы и рекомендации.

Благодарю сотрудников ФБУН ГНЦ ПМБ к.м.н. Титареву Г. М., к.м.н. Бахтее-ву И. В., K.6.H. Кравченко Т. Б., к.м.н. Борзилова А. И., к.б.н. Коробову О. В., Вахра-мееву Г. М., Миронову Р. И., Петрову А. Г., Телешеву Е. А., Молчан И. В. и Игнату-щенко А. М. за помощь при проведении экспериментов на разных этапах работы.

Подписано в печать:

15.11.2013

Заказ № 9133 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru