Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование новой короткой открытой рамки считывания в геноме вируса табачной мозаики

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Исследование новой короткой открытой рамки считывания в геноме вируса табачной мозаики"

с" ' - МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ __ сЬ

« - имени М.В.ЛОМОНОСОВА

<=> О-_:_

ш НИИ ФЮИКО-ШШЕСКОЙ БИОЛОГИИ имени А.Н.БЕЛОЗЕРСКОГО

и-

О- ■г—

На правах рукошси

ФЕДОРКИН Олег Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ НОВОЙ КОРОТКОЙ ОГКШТСИ РАМКИ СЧИТЫВАЕМ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ.

03.00.06. - Вирусология

Автореферат диссертаций на соискание ученой степенз кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского, МГУ.

Научные руководители: академик РАН, профессор И.Г.АтаОеков

доктор биологических, наук С.Ю.Морозов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С.К.Завриев

доктор биологических наук И.В.Скарлат

Ведущее учрея&зние: • Институт Бежа РАН

Защита состоится \ JлJLS< 1395 г. в '1000час. на заседании Диссертационного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М. В.Ломоносова по ' адресу 11989Э, Москва, Воробьевы Горн, МГУ, НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " " 1995 г.

' . Учезый Секретарь дассертацион&го сов

кандидат химических наук /& /у .Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРЖГЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одним из основных направлений

современной молекулярной вирусологии является исследование структуры и функций вирусных геномов, экспрессии вирусных генов и функщгональное изучение кодируемых ими белковых продуктов. В последнее время у значительного числа вирусов растений' были обнаружены короткие открытые рамки .считывания, кодирующие маленькие белковые продукты, вовлеченные в осуществление важнейших -функций вирусного геномз - репликацию вируса, транспорта вирусной инфекции, экспрессию вирусных генов и т.д..Исследование подобных маленьких генов позволяет приблизиться к детальному изучению структуры, экспрзссии и функций геномов фйтовирусов, что имеет также, и практическое значение, поскольку может послужить основой для создания новых векторных систем и разработки эффективных

а ' -

методов борьбы с, вирусными заболеваниями растений. ^

Объектом данной работы были тобамовирусы субгрушы 1а, к которым относится типовой представитель груши вирус табачной мозаики, являющийся не только экономически вашим патогеном растений, но и известным модельным объектом вирусологии и молекулярной биологии.4Тобамовирусы представляют собой группу нитевидных Еиру.сбв растений,, геномная +РНК которых длиной около 6400 нуклеотиотвдов в составе вирионов одета капсндным белком с молекулярной массой 17 КДа (Goelec ее а1., 1982).

Цель н задачи исследования. Целью данной работы было функциональное изучение открытой нами короткой рамки считывания - (ОРТ-Х) в геномах тобамовирусоз. В ходе исследования решались следующие задачи: сравнительный анализ ОРТ-Х трех тобамовирусов субгрушш 1а, клонирование и трансляция in vitro в бесклеточных, белск-синтезирувдих системах ОРГ-Х, изучение природы образуемых белковыми продуктам ' ОРТ-Х ^высокомолекулярных ; комплексов, разработка методики внесения множественных мутаций в нуклеотидную последовательность ОРТ-Х, исследование возможней способов экспрессии ОРТ-Х путем создания конструкций - аналогов субгеномных тобамовпруеннх РНК.

Научная новизна и практическая ценность работа. В настоящей работе впервые открыта новая маленькая консервативная ОРТ у тобамовирусов. "Обнаружено, что белковый продукт- ОРТ-Х тобамовирусов образует in vitro устойчивые высокомолекулярные

С

комплексы с белками трансляционной системы. Показано, что мажорный 54К-комплекс продукт ОРТ-Х образует с а-субъедашщей зукариотилеского фактора трансляции eSF-i. Разработана методика внесения множественных точечных мутаций с помощью полкмеразяой цепной реакции (ЩР) в ОРТ-Х и локализован регион в ОРТ-Х, ответственный< за ь образование 54К-комплекса. Созданы' ДНК-конструкции, Т7 транскрипты которых являются аналогами субгеномных РНК тобамовирусов. Показано, что4 продукт ОРТ-Х синтезируется in vitro с тобамовирусных' РНК субгеномных размеров.

Апробация работы. Материалы исследований были представлены на iv Международном конгрессе по Молекулярной биологии растений, . Амстердам, 1994. Рзуяьтаты работа изложены в 2. публикациях и I сообщении. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела .биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биолох^и им.А.Н.Белозерского 19 октября 1994 года.

, Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения подученных результатов и их обсуждения, выводов. Работа изложена на 130 страницах, содержит 34 рисунка и I таблицу. Список литературы включает 196 публикаций.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей -геномов тобамовирусов. ■

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 3'-концевого района транспортного гена тобамовирусов показал, что У тобамовирусов субгруппы 1а (по классификации Ikeda ее а!.. 1993) существует короткая рамка трансляции, которая перекрывается, с одной _стороны, с транспортным геном, а, с другой стороны, с геном бежа оболочки тобамовирусов, находясь с "ними в ра'зра фазах трансляции. Эту новую короткую рамку мы назвали Х-ра:йса (ОРТ-Х). По отношению к транспортному гену Х-рамка в фазе +1, а по отношению к белку оболочки - в фазе -I (всс три гена находятся в разных фазах трансляции). Х-рамка тобамовирусов субгруппы 1а — (вируса табачной шзаихи, tmv-ui,.варуса (,:озаики томатов, tomv-l, вируса слабой зеленой г/озаики табака, iwgmv-U2, Рис.1) способна кодировать маленький, положительно заотаеный белок с молекулярной массой примерно,4 кД?. Ишщкатора'М кодоаы соответствующих белков

находятся В благоприятном контексте ПО Когак (1989) - РиХСАиСА, начинаясь с 5669 нукле.отида. геномной РНК тму-ш, с 5660 нуклеотида тстг-ь и с 5617, нуклэотида тмсму-иг. Маленькие ^белки длиной 39 аминокислот у тму-тп., 33 аминокислоты у тода-ь и 45 аминокислот у тмсму-иг облздэют некоторым сходством аминокислотной последовательности (Рис.2). Сходство мета? продуктами Х-рамок тшю-т к тот-ь выражается в 5,92 бо, медду ют-иг з тому-ь - в 7,03 бе, между тмсму-та и ют-т - 5,78 бп. Статистическая значимость выравнивания аминокислотных последовательностей продуктов Х-рамки всех трех тобамовирусов выражается в 8,82 бс. Интересно, что подобные Х-рамке последовательности, но без ишпщаторнсго лиз кодона, найдены у тобамовирусов зеленой

(39)

tmv-u1

(267)

ТР деле

38nt

74nt

(158)

СР депе

ToKV-L

(263)

ТР gene

(33)

38nt

56nt

(158)

СР депе

(45)

32nt

(255)

96nt

tmgmv

TP gene .

(158)

СР депе

Рисунок Г. Взаимное расположение х-рамки, транспортного и капсидного генов тобамовирусов суСгрушы 1а. В скобках указано количество аминокислотных.остатков в белках. Цифрами показано количество нуклеотицов в районах перекрывания Х-рамки с транспортным ж капсидным белками.

ТМУ-Ш. ( + 8) пи г ЕЛ. 1Лр НШ{РК УШ,ауНУЗIsVrVT.iVIБ УСЛРпгVI,' ТМЗМУ (+3) шtsLSEhEVI!FпgУALтаgLSepICLLIFrLrEScaADgsvy ТоМУ-Ь (+6) т]ф!1ггЗЕ111К1К-УУШШР31аЮТГУ1сМа

Рисуиок 2. Сравнение аминокислотных последовательностей предполагаемых продуктов Х-рамок гобамовирусов субгрупш 1а. В скобках указан суммарный заряд протеинов без учета гистидиновых остатков. Аминокислотные остатки, идентичные в' двух последовательностях, указаны большими буквами. Аминокислотные остатки, идентичные во всех трех последовательностях, указаны жирным шрифтом.

TMV-Ul ORF-X : VbQyHY-siSVrVlvisVGRpnrvn

cr-TMV 2ЭК protein: VLQ-HYkpeSVpVfrsgVGRahsda

Рисунок 3. Сравнение аминокислотных последовательностей --С-концевого региона транспортного бежа тобамовируса, заражащего крестоцветные растения, и соответствующего района продукта Х-рамКИ TMV-U1 (ПО Dorokhov et al., 1994).

крапчатой мозаики огурца (cgmmv) , слабой крапчатости перца (pmmvj и tmv-cc. У- тобамовируса кольцевой пятнистости одонтоглоссума . (orsv) есть маленькая рамка в соответствующем положении . с инициаторным adg-кодоном и определенным сходством аминокислотной

• последовательности преядолаг-аешго кодируемого продукта -с продуктами р4 генов тобамовирусов субгруппы- 1а. Однако у orsv маленькая рамка способна потенциально кодировать не положительно заряяенный, а гидрофобный белок. У тобамовируса, заражанцего крестоцветные растения (сг-тм?), недавно обнаружили, что С-концевая часть продукта вирусного транспортного гена имеет гораздо большее сходство с р4 белком tmv-ui, чем с

• соответствующими рзгаонамя тоОжовирусвкх транспортных . генов

(Dorokhov ЙС al., 1994)(РИС.3).

Трансляция Х-р&аа в Оесклаточной белок-синтезирушей системе приводит к образованию вдсокомолзкулярхюго комплекса.

При создании конструкции/ содержащая Х-рзмку tomv-l под Т7 промотором для экспрессии in vitro, использовался метод амплификации с помощью ПЦР. В качестве матрице» был использован клон pL6, любезно предоставленный С.К.Зэгриевжл. Клон pbs представлял собой кДКК 3'-коппевой части вируса мозаики томатов, включающую последовательности трзнспортпсго гене и гена белка оболочка, в шшааяв ptsisr. ПраЕмзр для ПЦР, соответствовавши 5'-концу Х-рашси Tomv-i, представлял собой

олигодезоксирибонуклзотид(32-мер): orx-p

d (5' -CCGAATTCTTGAAGJCGAAGCCGAGACGTCGG) , ВКЛИЧаВШЙ ' ВОСеМЬ

нзвирусных нуклеотгдов, содержащих Ecoin-сайт, шесть вирусных нуклеотидов до НЕИциаторного aug и шесть кодонов Х-рамки, включая äug. Праймер, комплементарный З'-концу Х-рамки tomv-l, представлял собой . , оллгодезоксирибонуклеотид(32-мер): orx-m

d (5' -CCAAGCTrTTAGCCCATAraGATGACAAAAAC) , ВКЛЮЧаВШИЙ ВОСвМЬ

невирусных нуклеотидов, содержащих ^Hindin-сайт, три нуклеотида, комплементарных герминаторному кодону и 21 нуклеотид, комплементарный семи 3'-концевым ко донам Х-рамки. Полученный в результате ПЦР ДНК-фрагмент длиной 118 нуклеотидов разрезался по EcoRI - Hindi 11 И клонировался В разрезаННуВ ПО EcoRI-Hindlll плазшду pTzi8R. Сконструированный таким образом клон, названный pPCR-Lx, содержал четырнадцатинуклеотидную лидерную последовательность S'-gggaattcttgaag между Т7 промотером и иншщаторным adg кодоном Х-рамки и использовался для трансляции in vitro. ДНК клока pPCR-Lx линериазовалась рестриктазой Hindin, транскрибировалась Т7 РНК-полимеразой и транслировалась в лизате ретикулоцитов кролика.

Предполагалось, исходя из нуклеотидной и предсказанной аминокислотной последовательности, что транскрипт. Х-рамки будет . направлять в лизате ретикуловдтов кролика синтез белкового продукта с молекулярной массой около 4 кДа. Однако, анализ в ПААГе неожиданно выявил,.что трансляция моноцистронной Х-рамки приводит к появлению не только полосы, соответствупцей полипептиду 4К, размер которого был независимо определен в 20% ПААГе, но и мажорной полосы 54К (далее называемой 54К-комплекс), а также полосы средней интенсивности 37К и минорной зоны 66К (Рис.4).

Формирование 54К-комплекса также было отмечено в экстракте клеток асцита xrebs-2 и в экстракте зародышей пшеницы. Однако, в > последних двух случаях 54К-комплекс присутствовал в значительно меньших количествах, чем в лизате ретшсулоцитов кролика, а зоны 37К и 66К детектировались только в' следовых количествах. В дальнейшем основное взимание было уделено изучению 54К-комплекса, который в лизате ретикулоцитов кролика однозначно определяется как мажорный продукт. Было предположено, что зона 54К соответствует стабильному высокомолекулярному комплексу . меченного ' по [35s] -метиояину кодируемого Х-рамкой р4 полипептида с компонентом белок-синтезирующей системы. Основанием - такому предположению послужил, во-первых,' тот факт, что трансляция РНК-транскриптов,

полученных с клона ррск-ьх, который линериазовался рестриктазой нл.пн, сайт которой находится внутри Х-рамки, показывала полное отсутствие меченного 54К-комплекса. Таким образом, возникновение 54К-комплекса хп .гitro прямо зависит от. экспрессии Х-рамки и синтеза р4-пояшептида. Во-вторых, было продемонстрировано, что 54К-комплекс, стабильный в буфере по ьаетга!!, диссоциировал в 8М

.1 2 з"ТТ

Рисунок 4. Корреляции 'между экспрессией р4 • продукта при трансляции Х-рамкк е образованием 54К-кошлекса. Продукты трансляции в бесклеточной белок-сянте?Ерущзй састеме (лизат ретикулоцатов кролика) с исшльвоважем в качестве матрац некэпированных Т7 транскриптов клона ргск-ьх (40 мг/мл), линеаризованного по нгташ-сайту, локализованному сразу за терминаторшм кодовом Х-рамки (дорожка 2); по р^и-сайту, локализованному внутри векторной последовательности (дорожка 3); по эсал-сайту, . локализованному внутри векторной последовательности (дорожка 4); по Нд-пП-сайту, локализованному внутри Х-рамки (дорожка 5). Дорозка I соответствует эндогенному продукту. 4К - продукт Х-раксн, Е - зндогенпый продукт бесклеточпой башк-синтезируетей скстеш, С - 54К-комплекс, С* -37К-комплекс, С" - ббК-комплекс.

е

мочевине. Полученные результаты однозначно позволили предположить, что кодируемый Х-рамкой белок р4 вовлечен в формирование комплекса с белком, универсальным для всех орех белок-синтезярувдих систем -лизата ретикулоцитов кролика, клеток КгеЬэ-г и клеток зародышей пшеницы -

Характеризамя 54К-комплекса, возникающего в лизате ретшсулощтов кролика с транскриптами Х-рамки в качестве матрицы.

С помощью различных экспериментальных подходов проводилось изучение молекулярного состава 54К-комплекса и механизмов, вовлеченных з формирование 54К-комплекса с участием р4 белка. Учитывая тот факт, что продукт Х-рамки содержит два цистеиновых остатка, был" поставлен эксперимент с целью определить, не образуются ли дисульфид-связанные мультимерные формы р4 белка. Продукты трансляции в лизате ретикулоцитов кролика анализировались в ПААГе в присутствии ЗМ 2-меркаптоэтанола. В этих условиях не было обнаружено ни изменения молекулярного веса, ни изменения ^ количества 54К-комнлекса. Сходный результат был получен при обработке злектрофоретической пробы 6% додецил-сульфатом лития. Такие были проведены эксперименты с целью определить устойчивость 54К-кжплекса к обработке РНКазой и ДНКазой, которые показали, что комплекс к обработке этими ферментами устойчив (Рис.5). Напротив, обработка трансляционной смеси трипсином (200 мг/мл) в течение двух часов при 37°С приводила к разрушению 54К-комплекса. Полученные' данные свидетельствуют о том,- что в формирование 54К-комплекса вовлечена мономерная' форма р4 белка и клеточный протеин.

Влияние делеционвых, инсерциоттых и точечных мутаций в ни С-концевых блоках аминокислот продуктов Х-рамок на формирование 54К-кошлекса ■

Сравнение аминокислотных последовательностей продуктов Х-рамок тобамовирусов субгруппы.1а позволяет выделить в них три аминокьслотных блока Первый из них локализован на н-конце р4 белкоз я представлен чередунцимися положительно заряженными, сериновыми и гидрофобными аминокислотными остатками. На С-конце р4 белков расположен блок из гидрофобных аминокислотных остатков. Между ними находится _ консервативная последовательность наибольшего сходства между р4 белками.

Для того, ч чтобы определить участки аминокислотной последовательности -^р4 белка, вовлеченные в образование 54К-комплекса, был создан набор конструкций с различными

4

Рисунок 5. Характеризация 54К-коыплекса, образующегося в лизате ретикулоцитов кролика. Продукты трансляции в. бесклеточной белок-синтезирупцей системе (лизат ретикулоцитов ' кролика)4 с использованием в качестве матриц некэпированных 17 гранскрштов.клэяа ррсн-ьх (40 мг/мл) и последующим . фракционированием центрифугированием в • 100мМ кс1 (рибосомный осадок, дорожка I, супернатант, дорожка 2, нефракционированная смесь, дорожка 3), или обработанных &% ьшз (дорожка 4), 2-меркаптоэтанолом (дорожка 5), РНКазой и ДНКазой (дорожка 6). Сокращения расшифрованы в тексте к рисунку 4.

мутациями (точечным заюаами, дзлецаонншга и инсерционными), затрагивающими все три блока ашпокислотннх остатков,указанных выше. ПЩ?-фрагмент. полеченный с использованием драйверов ояр-р и оер-м. (см. тана) предварительно разрезался рестриктазой н±п£1, сайт которой расположен внутри Х-рамки тоот-ь, что приводит к удалению десяти 5'концевых кодопов . Х-рамки. Затем продукт рестрикции подвергайся обработке Т4 ДНК-полимеразой для затупления концов и лигировадся с вап-ах-линкером (октаыерсм), после чего разрезался рестршогазаш ватН1 и Шпат. полученный'ватш-Шпаш фрагмент V клонировался.й. аяазивду ?ьт, содержащую лвдерную последовательность ы тиу' С инициаторша! АОЙ-кодсшом (Бпигпуад:ша ^ а1., 1991), находящимся в одной рзмке трансляции с последовательностью З-рамки. - В результате у сконструированного

клона pXHiNF первые девять N-концевых аминокислотных остатков Х-рамки tomv-l заменялись на не гомологичную-последовательность. Тем- не менее, трансляция in vitro клона pxhinf приводила -к образованию 54К-комплекса (Рис.6,А).

Ранее в пашей лаборатории было показано, что инициация трансляции in vitro с использованием конструкций, содержащих ар-лидер pvx, может происходить на нетрадиционном инициирующем • кодоне ACG, который входит в Последовательность а. Эта особенность а/з-яидера была использована для создания конструкций, несущих мутантные последовательности Х-рамки tomv-l. Были созданы плазмиды, в которых под Т7 промотером находились я-последовательность . pvx либо душшцированные аа• или aaß последовательности. В зти плазмиды, разрезанные по BamHi-Hindiu, вставлялся'' фрагмент BamHI-HindIII из клонэ pXHINP. . Полученные конструкции кодировали различные N-концевые последовательности и одинаковую с 23мя аминокислотами С-конца Х-рамки Tomv-l С-концевую s последовательность.. При трансляции этих конструкций in vitro 54К-ко[шлзкс также эффективно образовывался.

Клоны pxae'piHSi и pxaaßINS2, также содержащие мутированные удлиненные и-концевые последовательности, были получены с помощью ПНР. Для амплификации ДНК были использованы в качестве праймеров олигодезоксирибонуклеотид-25-членник ins-x

d(5' -gcàgct'cgagcattcgtattaaata) , Содержащий XhoI-СЭЙТ, "И ORX-M.

'•Клон-- pxaaß ins 1 ■ был -получен разрезанием . амшшфицированного фрагмента ДНК . рестриктазами xhoi и Hindin . с последующим клонированием в плазмиду paaß по сайтам saiGi-Hindiu. Клон pxaaßins2 был получен разрезанием амшшфицированного фрагмента ДНК рестриктазой Hindin с последупцим клонированием в плазмиду paaß по сайтам Pstl-HindIII. Трансляция ЭТИХ конструкций in vitro также -. приводила к появлению 54К-комплекса.

Таким образом, аджно заключить,, что неконсервативный N-концевзй блок из положительно заряженных аминокислот продуктов

.Х-рамки не является необходимым для образования 54К-комплекса, так как замены этого блока на различные негомологичные последовательности не влияют на появление 54К-комплекса (Рис.7). Надо отметить, что, хотя, как и в исходной последовательности, -негомологичные к-концевые структуры содержат положительно .. заряженные (и сериновые) остатки, суммарный заряд этих структур компенсируется введенными отрицательно заряженными аминокислотными остатками.

В наших экспериментах подобные 54К-комплексу комплексы образовывались и при участии мультимерных полипептидов, состоящих из ^нескольких (два, четыре, восемь, шестнадцать) N-концевых (содержащих N-концевой и центральный регионы) фрагментов-мономеров Х-рамки, и только одного с-концевого фрагмента. Это позволило предположить, что- связывавший район может быть локализован вне с-концевого региона.

Чтобы изучить влияние С-концевого региона продуктов Х-рамок на образование 54К-комш:екса, сайт-направленным мутагенезом с помощью ПЦР били созданы конструкции, у которых цистеиновый аминокислотный остаток в положении 31 р4 белка, tomv-l заменялся на аргининовый, а глициновый в положении 33 . - на остаток аспарагиновой кислоты. Для этого использовались праймеры orx-p и модифицированный цраймер orx-m (orx-mi

: d ( 5' - CCAAGCTTTTAGTCCATACGGATG ACAAAAAC ) ) . При ТраНСЛЯЦИИ in Kit го полученных конструкций 54К-комнлекс образовьшался. Следующим шагом было создание конструкции рхвет., у которой между 3'-концевой частью Х-рамки, _ кодирующей С-концевой "блок аминокислот, и остальной нуклеотидной последовательностью Х-рамки tomv-l был введен Bgiii-сайт. Для этого в качестве цраймеров ЩР-ной реакции использовались олигодезоксирибонуклеотид-4(Кмер х-вдм:

d(5' -GGÇGATCCTCATG^GCCEA^CGTœCTCGAGGATTCTG) , СОДержаЩИЙ

BamHi-сайт, и олигоде зоксирибонукле о тид-53-мер. x-bgl:

d ( 5 ' - ccaagcntttagcccatacggatgacaaaaatacaa/ittgcgatggagatctg )

содержащий Bgin и Hindin-сайты. ~ Полученный фрагмент ДНК разрезался рестриктазаии BamHi-Hindiix и клонировался в плазмиду pT218R, разрезанну® BamHI-HindIII. КОНСТРУКЦИЯ pXBGL линериазовалась для транскрипции рестриктазами Hindin (в этом случае Х-рамка. сохранялась полностью) и вдш (в этом случае С-концевая часть р4 бежа не могла синтезироваться).. В обоих случаях 54К-кощшекс элективно образовьшался (Рис.6,В, 8).

Эти эксперименты показали, что С-концевой регион продуктов Х-рамки, как и н-концешй, по-видимому, не вовлечен в образование 54К-комплекса.

Влияние сайт-направленного мутагенеза в консервативном районе Х-рамки на формирование 54К-комдлекса.

Для изучения влияния центрального консервативного региона р4 белков на. образование 54К-кошлекса было • решено использовать множественный сайт-нацрзЕленниЯ мутагенез в этом регионе. Была разработана методика множественного сайт-направленного мутагенеза

шя

1

Е—

BS®

•'v -• .-г -) »^ti. i- г. г"

1 2 3

РИС.б.А-

. Рис.6,В. .

Рисунок 6. Делеционный мутагенез х-рамки и формиоование 54К-комплекса. Продукты трансляции в бесклеточной белок-сиитезирущей системе (лизат ретикулоцитов кролика) с использованием в качестве матриц некэпированных Т7 ■ транскриптов клонов: А. рхнют (40 мг/мл), линеаризованного по Hindin-сайту, локажзованному сразу за терминаторным кодоном Х-рамки (дорожка -I); по BamHi-сайту, локализованному внутри химерной последовательности Х-рамки (дорожка 2). На дорожке 3 нанесен эндогенный продукт. В. pxbgl (40 мг/мл), линеаризованного по Hindiii-сайту, локализованному сразу за терминаторным кодоном Х-рамки (дорожка 2); по здш-сайту, локализованному, внутри химерной последовательности Х-рамки (дорожка I). На дорожке 3 нанесен эндогенный продукт. Сокращения расшифрованы в тексте к рисунку 4.

с помощью ПЦР. В качестве праймеров использовались удлиненный 56-нуклеотидный вариант оях-р (ойх-ер:

а (5' -СССЛАТТСТГСААаАТаААаСССАСАСвТСССТСССОаАТТА

СС/сАТ/сТС/тСТАТ/сТА/аАА) , У. КОТОРОГО' бЫЛИ 1,2,3,4 ИЛИ 5 нуклеотидных замен, приводящих к аминокислотным заменам в

^tomv-l mkprrrsril-23AK

pXHINF kasvpgdplestcrsr—23AK

pXc mpnsssvpgdplestcrsr—23AK

pXap mpncytpawksk3ngdplestcrsr—23AK

pXaa mpnsktkpytknttketmpn3esvpgdplestcrsr—23AK

pXaap - othsktkpytnnttkpraipmcytpawksksngdpiiestcrsr—23ak

pXaajSINSl mpnsktkpytnnttkp,impncytpawksksmgdplesr-23AK

pXaa/3INS2 №NSlCrK.PYTNNTTKPTMPNCVTPAWKSKSNGDPLEDTCSSR—23AK

• tmv-u1 mierllspir-

tmgmv-u2 • mtsiisrhr-

Рисунок 7. и-ковцевые районы продуктов Х-рамок тобамовирусов субгрувш 1а и конструкций, содержащих негомологичные к-концевые последовательности ж- 23 аминокислотных остатка, идентичных С-концу продукта Х-рамки тому-ь.

ToMV-L 19 ак-KFSIAI CVFVICMG

pXBGL 19ak—QISIAICVFVIRMG

Рисунок 8. С-концевые районы продуктов Х-рамки tomv-l и конструкции, содержащей Bgin-сайт перед С-концом Х-райки -

tomv-l.

10м-14м положениях р4 белка том\г-ь, и orx-m. Отжиг праймеров проводшш при температуре 48а5,- то - есть более низкой; -чом стандартная. Клонирование- проводили так, как ранее было описано для конструкции ppcr-lx. Преимуществом данной методики является использование одного олигонуклеотидного праймера для получения набора различных мутаций. Полученные клоны секвенировали, а затем транслировали ¿л- vitro. Как следует из Таблицы I, единичные аминокислотные замены в позициях 10, 12, 13, 14 с к-конца продукта Х-рамки на отдаленные по свойствам аминокислоты (лейцин i>1Q на аргинин r или серии s, аргинин Rj£ на цкстеш С, изолейцин ijg на треонин т, лизин. к14 на глутамиковую кислоту Е) не влияют на формирование 54К-комплекса. В то же время единственная замена изолейцина . в позиции II на треонин полностью ингибирует способность р4 белка участвовать в образовании 54К-кошлекса. Также к исчезновению 54К-комплекса приводит изменение суммарного заряда сегмента 10-14 с положительного йа отрицательный.

Клон Последовательность анализиру.мого сегмента Суммарный заряд анализирумого сегмента Формирование ' 54К-комшгекса

рРСЯ-ЬХ -1Л1ШС- - +2 +

рЕ45б _ -яхмк- +3 +

рЕ118 ' -ЭПаК- +2 +

рЕ117- -ЫС1К- +2 +

рЕЮЗ - -мнтк- +3 +-

рЕ122 -Р.Ш1Е- +1 +

рЕ98 -ЭГЕТК- +2 +

рЕИЗ -31С1К- +1 +

рЕ101 -ЗГСШС- +2 -

рЕ114 . -ЛТШК- +3

рЕ108 -ЭТСГК- +1 -

рЕ105 0 -

рЕЮб -ЭТЕДЕ- • 0 -

рЕ127 -ИТСТЕ- ■ 0 - -

рЕ104 -31С1Е- -1 -

рЕ125 -1 -

рЕ107- . -ЗТС1Е- -1 . • -

тт П1 -ЯГЕРК- +3 +

ТМСМУ П2 -иташ- +2 не опред

г

Таблица I. Влияние сайт-направленного мутагенеза в регионе с 10 по 14 нуклеотид Х-раМки тоот-ь на формирование 54К-комплекса. .

Грубое фракционирование бесклеточной белок-синтезирушей системы после трансляции Х-рамки: частичная ассоциация 54К-комплекса с рибосомами. .

Для того, чтобы определить, не входит ли продукт Х-рамки в • молекулярные комплекса, большие, чем 54К-комплекс, но неустойчивые при электрофорезе в ПААГе и связанных с этим процедурах, полисомы и рибосомы были осаждены из -трансляционной смеси лизата ретикулоцигов кролика' центрифугированием через глщерольвую подушку в ""буфере, содержащем низкую, среднюю и высокую'

концентрация kci (50, 100 и 500мМ, соответственно). После центрифугирования в IOOmM xci 54К-комплежс частично оставался ассоциированным с рибосомами (приблизительно на 50%), в то время как растворимый. эндогенный продукт белок-синтезирующей системы (молекулярным весом 46К) полностью присутствовал в супернатанте. • Однако, центрифугирование в 50мМ kci приводило к почти полному связыванию 54К-комплекса с рибосомами , (85-В0Я, а в 500мМ kci только минорная фракция (10-15%) 54К-комплекса осаждалась при центрифугировании вместе с рибосомами.

Конструирование Х-рамки, кодирующей н-концевой ' блок гистидинов, и аффинная очистка соответствующего бежа.

Для получения конструкции, содержащей последовательность Х-рамки С ГИСТЩЩЕОВЫМ ы-концевым блоком, в плазмиду pXaaj3INSl, разрезанную рестриктазаш EcoRi-BamHi (цри этом полностью удаляется аа£-лидер), вставлялся фрагмент EcoRI-BamHI из-шязмвды PQE31 (вектор для суперэкспрессии генов). Итоговая конструкция, названная Е199, находилась под Т7 промотером и несла на 5!-конце шесть кодирующих гистидин кодонов (Рис.9). Конструкция EI99 * транскрибировалась, а затем РНК-транскрипт транслировался в лизате ретикулоцитов кролика, и трансляционная проба наносилась на колонку с Ni-агарозой. Фракция р4 белке выходила в Е буфере (рН 4,5, рис.10). Очищенный на колонке р4 белок тестировался на способность связываться с экстрактами из клеток растений, животных и дрожжей. В лизате ретикулоцитов кролика,- клетках аецктной-карциномы Krebs-2, клетках зародышей пшеницн и дрожжах происходило образование высокомолекулярных комплексов с молекулярной массой, близкой 54 кДа. Таким образом, очищенный аффинным способом продукт Х-рамки сохраняет свою способность участвовать в формировании 54К-комплекса in ritro.

Очищенный Х-белок формирует 54К-комплекс с фактором ТраНСЛЯЦШ eBP-lg.

Исходя из предполагаемого молекулярного веса неидентифицированного белка - компонента 54К-комплекса (около 50 кДа) и его ожидаемой ассоциации с рибосомами, было выдвинуто предположение, что этим протеином может быть какой-либо кз фактороз трансляции. йммунопрецишгаащщ антителами к eEF-i показала, что в состав 54Е-комплекса входит одна из субъединиц первого фактора элонгации трансляции (Рис.11). Используя установленное свойство продукта Х-рамки сохранять способность участвовать в формировании 54К-комплексз после аффинной очистки,

М Л II Б

71ТЛЛТАСЕАСТСДСТАТР.6ССАй.ТТСАТТДДАСАССАСААаТТДАСТйААТСА6АССЛТС 17 промотер ЕсоРЛ

ННННННТОРЬЕ Э И I I* I Е У V Ь ТСАССАТСАССАТСАССАТАССЗАТССТСТАОАСТССАССАТТССТАТТСААТАТСТСТТА ВатНХ ХЪа1

Ь N Н Р 5 1А1СУ.?У1СМС* СТСААТСАСТТСТССАТСССААТТТСТОТТТТТСТСАТСТСТАТССССГААААССТТ

ШпсШ!

Рисунок Э. Нуклеотщщая и колируемая аминокислотная последовательности клона Е199.

У

1

г

* % 1 I

«■ р

V .V "1 :-/.- , V ~Ги

' Г.

-4к

4

Рисунок 10. Аффинная очистка р4 продукта Х-рамки. Продукты, формируемые при трансляции з бесклеточной белок-синтезирущей системе (лизат ретикулоцитов кролика), с использованием в качестве матриц некэпированши Т7 транскрштов клона Е199, дорожка I, смыв буфером А, дорожка 2, буфером С, дорожка 3, буфером ю, дорожка 4, буфером Е, дорожка 5. Сокращения расшифрованы в тексте к рисунку 4.

были поставлены эксперименты по изучении взаимодействия меченного

ос _

го [ з]-метионину очищенного р4 белка с фактором трансляции е.ЕР-1 с последующим ПААГ-электрофорезом проб (Рис.9). Эксперименты показали, что 54К-комплекс образуется при добавлении препарата субъединицы еЕЯ-хос к очищенному Х-белку. Таким образом,

1 2

Рис.II. ' Рис.12.,

Рис.11. Ишунодрецштитация меченных . Б-метионином .продуктов, йормируемых в лизате рзтихулоцитов при трансляции 0РТ-2, антителами к еЕР-1 с последущим анализом "иммунных комплексов электрофорезом в 8-20% градиентном ШАГе. В качестве матриц использовались Т7 транскрипты (40 мг/мл) клона ррсж-ьх (ОРТ-Х). Дорожка I: тсансляционная проба (контроль); "дорожка. 2: анализ иммунопоецшштата антител к еЕР-1 с мечеными шйдуктами трансляционной пробы. 4К - продукт Х-рамки, Е эндогенный продукт бескле'точной белок-синтезирущей системы, С - 54К-комплекс, С'. -37К-комплекс, С" - 66К-комплекс.

. Рис.12. Связывание очищенного, меченного по [ S]-метионину р4 продукта Х-рамки с фактором элонгации трансляции eEF-i i Дорожка I: очищенный р4 белок; дорожка 2: сйыв с рибосом (500мМ kci), включащий все трансляционные факторы (50мкг белка), инкубировали • с р4 белком; дорожка 3: препарат eEF-ifa (холофермент, включающий все субъединицы, 0,5мкг) инкубировали с р4 белком; дорожка 4: препарат eEF-ia (0,2мкг) инкубировали с р4 белком; дорожка 5: поепарат eEF-ia (0,5мкг) инкубиоовали с р4 белком. 4К - продукт Х-рамки, С - 54К-комш1екс, С' - 37К-комплекс.

» »'

установлено, что in vitro продукт Х-рамнж тсбамовирусов субгруппы 1а взаимодействует с 50К субъединицей фактора элонгации трансляции eEF-ia с образованием устойчивого 54К-комплекса.

л-субъединица эукариотического фактора элонгации'трансляции, с которой продукт маленького тобамовирусного гена образует устойчивый комплекс, выражается в клетках растений с помощью Небольшого мулЬТИГеННОГО семейства генов (Axelos ее al.f "1989, Pokalsky et al., 1989, Aguilar et al., 1991, Kawahara et al., 1992, Dunn et al., 1993), которые все активно транскрибируются (Liboz ec al., 1990). eEF-ia - высококонсервативный бэлок, участие в трансляции которого заключается в направлении аминоацил-тРНК к соответствующим кодонам. ыРНК в А-сайтз рибосом в GTP-зависимой реакции (Riis et al., 1990). ПО-ВИДИМОМУ, eEF-la ЯВЛЯеТСЯ мультифункциональным белком. Gonen et al. (1994) показ am, что eEF-ia, действующий с 26s протеазным комплексом, необходим для убикуитин-зависимой деградации N-ацетилированных белков (примерно ^ 802» клеточных белков n-ацетилировано). Роль eEF-ia в этом процессе, связывается с функцией С-концевой убикуитин-гидролазн (изопептидазы). Yang et al. (1993) идентифицировали в качестве eEF-ia одш из активаторов фосфатидилинозитол-4-киназы, выделенный из клеток моркови, который связывает актин и облегчает полимеризацию . актина.' фосфатидилинозитол-4-киназр регулирует работу сшоптосомзльной протеинкиназы, ма'ь-к+-АТФазы, са2+- АТФазы и ванадат-чувствительной Н+-АТФазы. Активность самой фосфатидилинозитол-4-юшазн, детектируемая как в мембранной, так и растворимой фракции, быстро повышается в ответ на такие факторы, как осмотический стресс, разрушающие клеточную стенку ферменты, свет, что говорит, видимо, о том, что фосфатидилинозитол-4-киназа мокет играть важную роль в передаче внешних сигналов, влияшда на рост растений. Durso and Cyr (1994) Обнаружили' са2+/кальмодулин-зависимое связывание eEF-ia с микротрубочками (тубулином).' Shiina et al. (1994) Показали, что eEF-la СПОСОбеН расплетать микротрубочки, выступая, тагам образом, в. роли, регулятора цитоскелетных перестроек. Иначе говоря, кроме участия з_ трансляции, eEF-ia зовлечен в различные регуляторЕае процессы в клетке и в функционирование цитоскелета.

Интересно, что бактериальный аналог eEF-ia - ef-tu - вместе с другим прокариотическим фактором элонгации трансляции ef-ts и рибосомным белком si входит в состав РЖ-реплика зы РНК-фагов. Также известно, что eEF-ia взаимодействует с тРНК-подобнымл

структурами рибовирусов растений. Таким образом, нельзя с полной уверенностью говорить о том, что связывание Х-белка с eEF-ia in vivo определяет модификацию трансляционного аппарата клетки, хотя это представляется , достаточно вероятным.

Трансляция in vitro искусственных субгеномных тобамовирусных РНК, содержащих Х-рамку.

Структурно полицистронные РНК многих вирусов функционально моноцистронны: у них только 5'-проксимальные геш способны црл,:о . транслироваться, в то время как З'-цроксзшэльше недоступна для рибосом. Эти "молчащие" гены часто выражаются с помощью отдельных субгеномных РНК, которые 3*-котерминальны геномной РНК, прдставляя собой ее 5'-ус§ченные формы. Так, для tmv было показано, что "транспортный ген и ген белка оболочки экспрессируются со свои соответствующих субгеномных РНК (Meshi et al., 1982, Beachy et ai., 1977). Как уже отмечалось ранее, Х-рамки тобамовирусов расположены между транспортным геном и -'геном белка оболочки, пе'рекрываясь с ними (Рис.1), и,' следовательно, присутствуют в субгеномной РЕК для транспортного гена. С целью изучить возможность экспрессии Х-рамок с вирусных РЖ субгеномных размеров, были использованы два модельных кДНК клона, . "соответствующих 3'-проксимальным регионам ют-ui и tokv-l. Клон рьб содержал под Т7 щхжтром 3' -концевую часть tomv-l, включая транспортный и капсидный гены. Клон pxui был получен переносом фрагмента Apai из полной кДНК копии tmv-пг (сайты рестриктазы соответствуют позициям 5455 и 6389 геномной РНК; полная кДНК копия TMV-Ш.была любезно предоставлена Dr. W.D.О.Dawson) в плазмиду pGSM-5z(f+). Линеаризация этих двух модельных клонов на 3'-концах вставок с последующей транскрипцией Т7 РНК полимеразой приводила к синтезу аналогов субгеномных РНК, которые оба были потенциально трицистронны, но различались своими 5'-концевыми регионами: клон рьб содержал полные последовательности транспортного гена, Х-рзмки и гена бежа оболочки tomv-l, а клон pxui - только 3'-концевую . треть транспортного гена ímv-oi, начинающегося с внутреннего инициаюрного кодона, и полные последовательности Х-рамки и капсидного гена.

Как уже отмечалось выше, трансляция in vitro Х-рамки в присутствии p^s] —мзтионина с последующим электрофорезом в ПМГе 'V приводит к образованию мажорной полосы, соответствующей 54К-комплексу. Следовательно, экспрессия in vitro кодируемого Х-рамкой р4 белка с. РНК транскриптов субгеномного размера могла

быть выявлена обнаружением присутствия 54К-комплекса среди меченных продуктов. Трансляция in vitro РНК транскрялта клона рхш. приводит к образованию минорной, однако отчетливо видимой полосы продукта, соответствующей 54К-комплексу, а также мажорней-полосы, соответствующей укороченному продукту транспортного гена tmv-ui. Точно так же 54К-комплекс в минорных количествах образуется при трансляции in vitro аналога субгеномной РНК транспортного гена ■ tomv-l (клон рьб) в дополнение к образующемуся в мажорных количествах гЗСК продукту транспортного гена (Рис.13). Из этого эксперимента следует, что in vitro х-рамка может экспрессироваться с PIJK субгеномных размеров.

ч\

-

. v

! - '

Ъ'Ж .-yr-'W /- : -

Vli

-зок

12 3 4

Рисунок 13. Экспрессия Х-рамки с аналогов вирусных' РНК субгеномного размера .и формирование 54К-комплекса. Продукты трансляции в бесклеточной белок-синтезирунцей системе (лизат 1 ретикулоцитов кролика) с использованием в качестве матриц некэпированЕЫХ Т7 транскриптов клона рхп1 (80 мг/мл, дорожка 1, 40 мг/мл, дорожка 2) и клона рьв (80 мг/мл, дорожка з, 40 мг/мл, дорожка 4). Сокращения расшифрованы в тексте к рисунку 4.

вывода.

1. Идентифицирована новая короткая рамка трансляции,названная Х-рамка, в геномах тобамовирусов субгруппы 1а (вируса табачной ; мозаики, вируса томатной мозаики, вируса слабой зеленой мозаики : огурца), которая кодирует маленький, положительно заряженный протеин с молекулярной массой около -4 кДа и перекрывается с

^ транспортным геном и геном белка оболочки. - -

2. Показано, что трансляция in vitro ионоцистронной Х-рамки в бесклеточных белок-синтезирующих системах . лизата 'ретикулоцитов,- . • кролика, асцитной карциномы Krebs-г и зародышей пшеницы приводит к образованию высокомолекулярных белковых комплексов. ;

3. Получен очищенный аффинным способом рекомбинантный р4 i

I

белок, который сохранял способность участвовать в формировании I

высокомолекулярных комплексов в экстрактах из клеток животных, растений и дрожжей. !

4. Показано, что очищенный р4 белок формирует 54К-комплекс с фактором трансляции eEF-ia, также образующийся как мажорный продукт при трансляции in vitro Х-рамки^ :

5. Показано, что 54К комплекс обладает аномально высокой стабильностью и диссоциирует только в растворах с 8М мочевиной.

6. Делеционным, инсерционным и сайт-специфическим мутагенезом ■ .идентифицирована .аминокислотная последовательность р4 -белка,

вовлеченная в образование 54К-комплекса.

7. Показано, что Х-рамка может экспрессироваться in vitro с . j тобамовирусных РНК субгеномных размеров. |

список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Mcrozov S.Yu., Denisenko O.N., Zelenina D.A., Fedorkin O.N., Solovyev A.G., Maiss E., Casper R. and Atabekov J.G. - A novel open reading frame in tobacco mosaic virus, genome coding for a putative small, positively charged protein. — Biochimie, 1993, 75, 659-665.

2. O.N.Denisenko, O.N.Fedorkin, D.A.Zelenina,- A.G.Solovyev and S.Yu.Morozov - Analysis of the probable functioning of the small positively-charged protein encoded by the area overlapping transport protein and coat protein genes of tobacco mosaic virus. - 4th International Congress of Plant Molecular Biology, Amsterdam, June 19-24, 1994, Abstracts, N1501.

3. О.н.Федоркин, 0. H.Денисенко, А.С.Ситиков, д.а.Зеленина, Л.И.Лукэшева, С.Ю.Морозов и И.Г.Атабеков - Белковый продукт открытой рамки трансляции (ОРТ-Х) тобамовируса образует устойчивый комплекс с фактором элонгации трансляции eEF-ю. - Доклады ран, I9S5, в печати.