Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение антигенных свойств вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей при помощи моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение антигенных свойств вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей при помощи моноклональных антител"

8 0 6 9 $

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕЛИЦЯНСКИХ НАУК Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского

На правах рукописи УДК 576. 858; 576. 8. 077; 616.831.9.002.

ШПИЛЕВАЯ Марина Валентиновна

Изучение антигенных свойств влруса . венесуэльского энцефаломиелита лошадей при'помощи моноклональных антител

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1992

Работа выполнена в институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАЖ.

Научные руководители: профессор, доктор медицинских наук

Р. а Дилн^кил

доктор биологических наук А. А. Кущ

Официальные оппоненты: профессор, доктор медицинских наук

Л. Е Зльберт

доктор биологических наук С. О. Вяаов

Ведущая организация: ВНИИ Молекулярной биологии НПО "Вектор"

Госконцерна "Биопрепарат" ( п. Кольцово, Новосибирская обл.)

Защита состоится 22 июня 1992г. в//Сас. на заседании специали рованного совета Д 001.20.01 Института вирусологии им. Д. И. Иванове го РАМН (Москва, 123098, ул. Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института виру логии.

Автореферат разослан ' мая 1992г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

А. к. Жукове

. - 2 -

■ ^..^Актуальность проблемы. Изучение структурно-функциональных-

хе^^йф основных вирусных белков является актуальной задачей ----

как для понимания молекулярно-биологических особенностей, лежащих в основе ттаммовых различий, так и для выявления изменений, возникающих в процессе мутирования или аттенуации. Структурные гликопротеиды вирусов комплекса БЭЛ определяет1 ряд биологических свойств этих вирусов: нейтрализующую, анткге-магглютинирущую, протективяую активности, а также играют важнейшую роль в индукции противовирусного иммунитета. Использование моноклональных.антител (МКА) к вирусным гликопротеидам позволяет изучить их антигенную структуру и биологические свойства. .В настоящее время советскими и зарубежными исследователя^ создаются. карты расположения эпитопов на обоих поверхностных гликопротеидах вируса БЭЛ - Е1 и Е2, исследуются зпитопные особенности вирусов различных типов и подтипов данного комплекса, определяется связь того или иного эпитопа с ■ серологическими свойствами гликопротеидов, Армируются новые подходы для поиска различий между вирулентными и аттенуирован-ными штаммами. Описание в течение короткого интервала времени ■нескольких новых сайтов и эпитопов на обоих структурных гликопротеидах указывает, что в данных исследованиях еще рано ставить точку-

МКА, обладающие вируснейтрализуюшей активностью, используются для получения мутантов, устойчивых к нейтрализации. Получение таких вариантов дает возможность выявить мишень мутационного воздействия и связать с конкретным механизмом функциональной активности. Поскольку мутации, получаемые под действием МКА, являются точечными, это позволяет определять

- з - ■ .

частоту мутаций соответствующих эпитопов', а такхе их протяженность и молекулярный механизм возникновения.

В отечественной печати пока нет работ, посвященных получению таких мутантов вируса ВЗЛ и описанию их свойств. Актуальность настоящей работы заключается в том, чтобы восполнить этот пробел.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение ША к вирусу БЭЛ и их использование для получе-. ния мутантов вируса, устойчивых к нейтрализации а также изучение свойств мутантных штаммов.

Для достижения этой цели ставились следующие задачи:

1. Отработать оптимальные условия гибридизации и получить гибридомные линии, стабильно продуцирующие МКА к структурным гликопротеидам вируса БЭЛ.

2. Изучить эпитопную специфичность' ЫКА в отношении . гликопротеидов вируса ВЭ&

3. Еолучить мутанты вируса, устойчивые к нейтрализации ЫКА, определить частоту мутаций зпитопа, комплементарного селективным ЫКА.

4. С помощью МКА исследовать эпитопные различия между родительскими и мутантными штаммами вируса

5. Исследовать возможность репродукции родительского и му~ тантного штаммов вируса в популяции гибридомных клеток, .продуцирующих нейтрализующее МКА.

Научная новизна работы. В результате работы были описаны новые этггопы гликопротеида Е2 вируса ВЭЛ, Шлучены устойчивые к нейтрализации мутанты двух штаммов • данного вируса и показано

влияние точечной мутации на свойства модифицированного и соседних эпитопов у двух штаммов вируса ВЭЛ. Описана инфекция миеломных и гибридомных клеток, продуцирующих специфические и неспецифические МВД, вирусом БЭЛ.

Теоретическая значимость и практическая ценность. Работа имеет преимущественно теоретическое значение. Полученные данные позволяют расширить наш представления об эпитопном строении структурных гликопротеидов вируса БЭЛ и влиянии на нее точечных му!аций.

Апробация диссертации. Фрагмент работы докладывался ■ на конференции молодых ученых института вирусологии им. Д. И. Ивановского в 1991г. и на всесоюзной конференции по арбовирусным инфекциям (Лыткино', 1991г.). В завершенном виде диссертационная работа доложена на заседании отдела "Общей и молекулярной вирусологии" при Институте вирусологии им..' Д. И. Ивановского РАМН 23 апреля 1992 года

Публикация результатов исследования. Основные положения диссертации отражены в трех опубликованных научных работах.

Объем и структура работы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста,включая 9 таблиц и 6 рисунков, сос- . тоит из введения, обзора литературы (8 глав), собственных исследований (5 глав), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы,включающего 157 источников отечественных и .зарубежных авторов.

СОЕСТВРииЫЕ 1ЮСЛЬд013АЛИа Материалы и методы.

Штаммы вирусов. Для выполнения работы использовали тест-штамм вируса ВЭЛ- штамм Тринидад, полученный из Государствен-

ной коллекции вирусов в институте вирусологии им Д. И. Ивановского РАМН , а также аттенуированные штаммы СМ-27 и ТМ-14 вируса ВЭЛ, селекционированные в этом же институте из вирулентного штамма Тринидад на основе принципов популяционной генетики.

Культивирование вируса, определение гемагглютинирующей, нейтрализующей и инфекционной активностей проводили общепринятыми методами.

Животные. Для работы использовали мышей линии Balb/c и нелинейных белых мышей (НБМ) весом "18-20г.

Схемы иммунизации тавотных. Для получения иммунного ответа к вирусу ВЭЛ мышей -Balb/c иммунизировали инактивированным формалином вирусом штамма ТМ-14, в дозе 15 -25мкг с полным адшвантом Фрейнда внутрибрюшинно 2-3 раза с различными временными интервалами. Одна из схем включала дополнительный этап

б

иммунизации вирусом штамма Тринидад в дозе ЮДЦ^/животное. За

3 суток до слияния гкивотным внутривенно вводили Юмкл 10% моз-

í"

говой суспензии вируса ВЗЛ/ТМ-14 в дозе 10 Б0£/мл.

Получение моноклональкых.антител. Гибридизацию клеток мы-■ шиной шеломы со спленоцитами иммунизированных мышей проводили по общепринятой методике (Kohler, Milsteín, 1975). Для гибридизации использовали клетки мышиной миеломы линии Sp2/0. Слияние проводили с помощью 50% раствора полиэтиленгликоля (Serva, ФРГ) V.M. 1500.

Иммунологические методы. Иммуноферментный анализ-'-(ИФА) осуществляли в соответствии с методиками Engval и Pasee (1978). Конкурентный твердофазный радиоиммуноанализ (ТРИА) для картирования эпитопов связывания МКА на вирусных гликопротеи-дах был проведен в лаборатории к. б. н. Локтева Е Б. ( НПО "Век-

тор" госконцерна "Биопрепарат" ), для чего использовали мечен--

125" *

ные Г очищенные МКА ' известной зпятопной специфичности, полученные Локтевым В. К с соавт. (1991)

Приготовление конъюгатов МКА. Конъюгацию МКА с пероксида-аой хрена проводили методом перийодатного окисления ( Какапо, Ка*ао1, 1974).

Определение протективных свойств моноклональных антител. Нелинейным белым мышам вводили МКА и через 2-4 часа подкожно инокулировали около 5тыс. 1£у?ирус ЮЛ штамма "Тринидад*! - -

Электрофоретический иммуноблотинг. Вертикальный электрофорез проводили в 5-15% полиакриламидном геле в присутствии до-децилсульфата натрия по'методу Ьаетт1у (1970). Иммуноблотинг выполняли по методу. КоеЬПдИ, 1985.

Отбор мутантов вируса, устойчивых к нейтрализации МКА. Отбор устойчивых к нейтрализации мутантов двух штаммов вируса ВЭЛ -СМ-27 и ТМ-14 проводили в реакции титрования вируса методом бляшек с постоянным разведением асцитрой жидкости, содержащей МКА. Частоту получаемых вариантов (ЧВ) определяли по формуле:

Титр вируса в присутствие МКА к вирусу ВЭЛ

Титр вируса в отсутствие МКА Изучали способность полученных изолягов вируса давать 'бляшки как в присутствии, так и без МКА.

Заражение гибридомных и миеломных клеток. Клеточные культуры заражали- родительским вирусом ВЭЛ/ТМ-14 или мутантом УСбТМ-14, устойчивым к нейтрализации МКА, с множественность» инфекции 30 БОЕ/кл. В опыт брали как гибридомы, продуцирующие

1 7 -

МКА с нейтрализующей активностью (НА), без НА, а также гибри-домы, синтезирующие МКА другой специфичности. Кроме того, воспроизводили инфекцию клеток шеломы Бр2/0 как одного из партнеров по слиянию. Время контакта вируса с клетками составляло 1чае при 4С. Инокулят вируса с клеток не смывали. Клетки инкубировали в ростовой среде при 37С и 5Х СО^в атмосфере. С .интервалом 2 суток клетки пассировали в соотношении 1:2. С-таким же интервалом брали пробы культуральной среды для определения инфекционного титра вируса. Инфекционную активность вируса определяли по наличию цитопатического эффекта в культуре ФЭК. Срок наблюдения составлял 10 суток.

При постановке опытов по заражению вирусом ВЭЛ культур клеток учитывали падение инфекционного титра в ростовой среде в результате термоинактивации и пассирования клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение гибридом, продуцирующих МКА к вирусу ВЭЛ. Разработка схемы иммунизации,' позволяющей обеспечить достаточно высокий титр антител к вирусу ВЭЛ, в том числе и антикапсид-■ ных, включала проверку иммунного ответа у мышей после введения антигена и определение оптимальной концентрации последнего для иммунизации. Исследовано несколько схем, отличающихся по длительности, частоте иммунизация, а также по виду использованного антигена (табл.1). Эффективность схемы иммунизации оценивали по активности антител в сыворотке крови зшвотных ко дню слияния в КФЛ,

Данные, приведённые в табл.1, показывают, что в схемах, .длительность которых составляла 1.5- 2мес. титр антител к ви-

■ ■ ' - 8 -Табл.1. Схемы иммунизации животных.

N • Кол-во Длительность Доза Титр антител N

схемы иммуни- иммунизадий антигена ** в сыворотке опыта заций* /мес/ /мкг/ /обратные ве- по сли-

личины xloV янию

1 4 6 20-25 16-32

2 3 4 15-20 16-32 3

3 3 1 15-20 14-28 2

4 2 1/2 25 9-18 1

5 2 . 1/2 4 4-8

6 3 2 15-20 40-80 4

*)Последняя иммунизация - введение бустерной дозы - была одинаковой во всех схемах: Юмкл 10Х мозговой суспензии вируса ВЭЛ/ТМ-14; Ю^БОЕ/мл.

. **)Во всех схемах первая иммунизация проводилась вирусом с полным адъюваятом Фрейнда, а все последующие, кроме ■ . бустерной,- с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта В схеме 6 перед введением бустерной дозы мышей иммунизировали вирусом ВЭЛ/Тринидад ю'ля^мышь.

русу ВЭЛ не превышал 1:32тыс. Сокращение длительнЬсти иммунизация . и дозы вводимого антигена сопровождалось уменьшением титра специфических антител. Величина титра зависела от дозы вируса при первой иммунизации и достигала 1: 4тыс.-1:8тыс при введении 4мкг антигена (схема 5) и 1:8тыс.- 1:18тыс при введении 25мкг (схема 4).

С целью увеличения количества специфических антител и числа антителообраэующих клеток в селезенке через 2 недели после двукратной иммунизации мышей по схеме 1 животным подкожно вводили вирус ВЭЛ/Тринидад 106ДЦ /мышь. Введение дополни-

тельного этапа иммунизации вирусом вирулентного штамма-позволило получить титр антител в сыворотке 1:40тыс. -1:80тыс., а в отдельных случаях он достигал 1:120тыс.-1:150тыс. Указанные значения титров сохранялись в течение 1.5-2мес.

Селезенки мышей, иммунизированных по приведенным схемам, использовали в экспериментах по слиянию, с целью получения .гибридом, продуцирующих МКА к вирусу ЮЛ Результаты опытов представлены в табл.2.

Таблица 2. Зависимость выхода гибридных клонов

и активности МКА от схемы иммунизации.

N опыта N число лунок, число лунок Титр ЬША по слия- схемы содержащих с позитивными в нию иммуниэ. клоны (в X) клонами (в 2) КЖ х 10*

' 1 4* 20 3 • 0. 3-0. 5**

2 3 25 8 0. 2-0.4

3 2 25 40. 1-5

4 6 40 50 • . 1-Ь

. а ст. табл. 1 . ' .

** Титры ЫКА даны в обратных величинах.

В двух первых слияниях наблюдался относительно низкий выход гибридных ионов. Хотя обцее число лунок с клонами составляло Z0-25Z, однако, число положительных проб при первом тестировании колебалось от 3 до BZ. Полученные гибридные • 1аоны отличались слабь»,! ростом. Б третьем и четвертом экспериментах выход гибридных клонов составлял 25-40%. Нисло положительных проб колебалось от 40 до 50%. 'Титр культуральной жидкости из

лунок с гибридными клонами, когда клоны занимали 1/3 поверхности лунки, составлял от 1:100 до 1:500. Мы расценили этот титр достаточным для проведения дальнейшей работы. По мере образования ■ моноелоя титр антител увеличивался до 1:500 -1:1000. В конечном итоге для последующей работы нами были отобраны 5 стабильно продуцирующих клонов. Продукция антител проверялась многократно по мере размножения клеток и получения массовых монокультур вплоть до их криокоясервации.

Продуктивность гибридомных клеток значительно повышалась при культивировании in vivo. Титры специфических антител увеличивались на 2-3 порядка по сравнению с культуральной жидкостью (табл.3 )

Таблица 3. Свойства моноклональных антител к вирусу ВЭЛ.

Титр МКА /обратные величины/ Тип Сайт "_Класс

МКА И Ф А МКА

.КЖхЮ5 AKxlO* РТГА РНхЮ1

ВЭЛ С6 Е2-6 4-6 5-10 10 5 G1

ВЭЛ А5 Е2-4 0.2-0. 4 0.3-0. 5 10 G2a

ВЭЛ А4 • Е2-4 0. 4-0. 7 0. 5-1 640 - G1

ВЭЛ В5 Е2-4 6-10 5-10 2560 - 01

ВЭЛ G1 El 0.5-1 0.3-0.5 640 - 62а

КЖ-культуральная жидкость АЖ-асцитная жидкость . РТГА-реакция торможения гемагглютинации РН-реакция нейтрализации.

Свойства МКА к вирусу ВЭЛ. Были изучены свойства МКА, накапливающихся в культуральных жидкостях (К® при пассировании пяти типов гибридокных клеток in vitro, а также в асцитной жидкости (АЖ) при их пассировании in vivo (табл.3).

1.Способность тормозить гемагглотинацию (ГА) определяли в реакция торможения гемагглотинации (РТТА). Титры МКА в АЖ были одинаковы для обоих использованных штаммов вируса-СМ-27 и ТМ-14. Наибольшей активностью в РТГА (титр 1:2560) отличались МКА ВЭЛВ5. У двух МКА - B3JIA4 и ВЭЛ01 титр составлял 1:640. ЫКА ВЭЛСб и ВЭЛА5 в данной реакции были неактивны - титр не превышал 1:10, что совпадало с величиной отрицательного контроля.

2. Способность МКА нейтрализовать вирус ВЭЛ была изучена в реакции нейтрализации. Согласно данным опьгга четыре типа МКА -ВЭЛА4, БЭЛВ5, ВЭЛА5 я ВЭЛ31 не обладали способностью нейтрализовать вирус: инкубация вируса ВЭЛ обоих штаммов с АЖ в разведениях 1:10 -1: 5тыс. не снижала бляшкообразующую активность вируса, которая сохранялась на уровне 25-27Б0Е/суспензию. МКА ВЭЛСб обладали выр&танной вируснейтрализущей активностью (ВНА). Они вызывали подавление бляшкообразования до разведения 1:5тыс. Индекс нейтрализации для штамма ВЭЛСб составлял 4,5LogTim.ro

3. Принадлежность ЫКА. к классу и субклассу иммуноглобулинов (Ig) проводили после предварительного выделения их из АЖ. Для определения класса lg использовали метод иммунопреципита-ции с аитисыворотками к иммуноглобулинам каши классов IgQ, IgA, IgU Оказалось,что все полученные МКА принадлежат к иммуноглобулинам класса IgG.Ho относятся к двум субклассам: ЫКА

штаммов ВЭЛ В5, ВЭЛ А4, ВЭЛ Сб- к , а штаммов ВЭЛ А5 и ВЭЛЙ1- к 1г02а (табл 3).

4. Активность взаимодействия МКА с вирусом ЮЛ была 'изучена с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты, представленные в табл.3 показали, что максимальной активностью обладали МКА ВЭЛСб и ВЭЛВ5 - титры 1:6тыс. и 1:10тыс. соответственно. Титр МКА ВЭЛМ составлял 1:1тыс. , а МКА ВЭЛ А5 и ВЭЛА4 - 1:400 и 1:700 соответственно. При тестировании МКА в асцитных жидкостях, полученных от мышей, титры в ИФА возрастали в несколько раз и достигали 1:1млн. для МКА ВЭЛС6 и ВЭЛВ5 и 1: 50тыЬ. для МКА трех других клонов (табл.3).

5. Специфичность МКА в отношении белков вируса ВЭЛ. Идентификация вирусных белков, с которыми взаимодействуют полученные МКА, проводилась методом иммуноблотинга /рис1/. Оказалось, что МКА ВЭЛА5 и ВЭЛС6 реагируют с белком 152,' МКА ВЭЛ61-с белком Е1, а МКА ВЭЛА4 и ВЭЯВ5 в данной реакции не активны. Это позволяет предположить, что МКА ВЭЛА4 и ВЭЛВ5 взаимодействуют с конфоркационными детерминантами вируса ВЭЛ, разрушающимися при проведении электрофореза в денатурирующих условиях. Данные конкурентного ТРИА подтвердили это предположение.

6. Определение эпитопной специфичности МКА было выполнено с помощью конкурентного ИФА. Результаты анализа представлены на рис.2. Кривая титрования МКА ВЭЛВ5 с пероксидазным конъ-югатом, приготовленным нами на основе одноименных антител, практически совпадает с кривой титрования МКА А4 с тем же конъюгатом. Это позволяет предположить, что _ у вирусов ВЭЛ штаммов СМ-27 и ТМ-14 детерминанты, к которым ^направлены МКА

А-

Рис.1. Взаимодействие МКА с белками очищенного вируса ВЭЛ/ТМ14 в реакции иммуноблота.

1. Положительный контроль- поликлональные антитела в Ш& к гликопротеидам вируса ВЭЛ.

2. МКА ВЭЛ А5

3. МКА БЭЛ й

4. МКА ВЭЛ Сб

ОН

Рис.2. Конкурентный ЙФА связывания МКА с вирусом ЕЭЛ/ТШ4. Реакция осуществлялась инкубацией ЮОмкл конъюгата ИИ ВЗЛВ5 в разведении 1:200 с двукратными разделениями антител клона ВЭЛ А4 (•), клона КЭЛ А5 <?<). и антител из АЖ , индуцированной мышиной миеломой БрйЧО (и)(отрицательный контроль).

ВЭЛВ5 и ВЭЛА4. имеют близкое пространственное расположение или идентичны. МКА ВЭЛА5 и ВЭЛСб, относящиеся к гликопротеиду Е2, не 'конкурируют ни друг с другом, ни с другими МКА и, следовательно, реагируют с неперекрывающимися эпитопами гликопротеи-•да Е2,

7. Конкурентный ТРИА. С целью Солее детального картирования эпитопов связывания полученных МКА был проведей конкурентный ТРИА между Лечеными МКА известной специфичности и исследуемыми немечеными МКА. Согласно полученным результатам,. МКА ВЭЛА4, ВЭЛВ5 и ВЗЛА5 распознают четвертый, а МКА ВЭЛСб - шестой сайт гликопротеида Е2. МКА ВЭЛБ1, направленные к Е1 гликопротеиду,в то же время распознают сайты Е2-2 (25-40% конкуренции) и Е2-6 (50%' конкуренции).

Таким образом, полученные нами МКА к гликопротеиду Е2 вируса ВЭЛ можно разделить на три группы:

1. НКА ВЭЛА4 и ЕЭЛВ5, распознающие конкурирующие между собой конформационные детерминанты четвертого сайта.

2. МКА БЭЛА5,' " гамплементарные нэконформационной детершнанте того же четвертого сайта и не конкурирующие с предыдущими.

3. МКА ВЭЛСб, направленные к шестому сайту.

Район гликопротеида Е2, распознаваемый МКА ВЭЛА4 и БЭЛВ5, представляет определенный интерес. Согласно данным Разумова 'II А. И'Соавт. МКА, комплементарные сайту Е2-4, не обладают активностью -в РТГА при постановке с вирусами штаммов ТС-83 и 230. Кроне того, в данной схеме не указано на наличие у сайта 4 гликопротеида Е2 конформационных- детерминант. Отнесенные на основании конкурентного ТРИА к данному сайту 1ЖА ВЭЛА4 и ВЗЛЕЗ

согласно нашим данным являются конформацианными и способны вызывать торможение ГА при постановке данной реакции с вирусом ВЭЛ штаммов СМ-27 и ТМ-14. Таким образом, наш показано наличие конформационной детерминанты сайта 4 гликопротеида Е2 и описаны ее свойства, отличные от свойств неконформационных детерминант.

Свойства сайга б гликопротеида Е2 в опубликованных к настоящему времени работах не описаны. Мы считаем, что изученные нами свойства МКА ВЭЛС6, идентифицирующих один из сайтов данного эпитопа, могут дать некоторые представления о его особенностях.

МКА ВЭЛ31, согласно данным иммуноблота, направлены к гли-копротеиду Е1, в то же время результаты конкурентного ТРИА свидетельствуют, что сайт, комплементарный этим МКА, перекрывается со вторым и шестым сайтами ' гликопротеида Е1. Можно предположить,что сайт, к которому направлены МКА ВЭЛ31, наряду' с линейным имеет и конформационный компонент, дающий отмеченный эффект.

Изучение протективной активности МКА проводили, используя известный феномен пассивной иммунизации МКА. Для разрешения иммунизированных животных использовали высоковирулентный штамм ВЭЛ/Тринидад 5тыс. Ц^/мышь. При введении животным АЖ, титр которых составлял 1! 100 тью.-11 ЗООтыс. .были получены данные, представленные в таблице 4. Они показывают, что протективным эффектом обладали антитела к обоим вирусным гликопротеидам. При этом МКА к гликопротеиду Е1 (ВЭЛ в!) обеспечивают лучшую защиту при подкожном введении за 2часа до инфицирования. МКА к

Таблица 4. Сравнительный анализ протективной активности МКА.

Тип МКА Способ ■ введения МКА Время введения вируса* Дни наблюдения 123456789 ** Пало Выжило

ПК, хО. 2 2ч 2 2 8

ВЭЛ Сб 44 1 2 3 7

вб, хО. 2 24 1 1 2 8

44 2 2 1 5 5

пк.хО. 2 2ч 0 10

ВЭЛ В5 44 0 10

вб.хО. 2 2ч 0 10

44 0 10

пк.хО. 2 24 0. 10

ВЭЛ А4 4ч - 0 10

вб.хО. 2 24 1 1 9

44 о • 10

ПК, хО. 2 24 0 10

ЮЛ 31 44 • 1' 1 2 8

вб.хО. 2 24 2 1 1 4 5

44 1 3 1 5 Л

пк.хО.'2 24 0 10

ВЭЛ А5 44 2 2 8

вб, хО. 2 • 24 0 10

• 44 0 10

* Во всех вариантах опыта 'использовали по 10 НЕМ.

* Количество кивотных, павших в данный день.

гликопротеиду Е2 по выраженности протективного эффекта можно разделить на две группы:

1. МКА ВЭЛ В5, БЭЛ А4 и БЭЛ А5 - обеспечивают 80-100Z выживаемость животных при обоих способах введения - подкожном и внут-рибрюшинном.

2. МКА ВЭЛ Сб обладают менее выраженной протективной способностью - выживаемость хивотных составляет 50-80%.

Получение мутантов, устойчивых к нейтрализации МКА. МКА ВЭЛСб, обладающие нейтрализующей активностью in vitro, были использованы для отбора устойчивых к нейтрализации мутантов двух штаммов вируса ВЭЛ- ТМ-14 и СМ-27.

В условиях эксперимента при действии нейтрализующих МКА мы получали бляши несколько меньшего размера или такого же, как в контроле. Учитывая,, что полученные бляшки могут бьггь образованы как мутантными вариантами вируса' с антигенными изменениями в зпитопе,■ комплементарном активному центру селективных антител, так и немутанткми вариантами, размножение которых подавлено в присутствие антител, клонирование в присутствие нейтрализущих МКА повторяли дважды. Результаты эксперимента по отбору устойчивых к нейтрализации мутантов представлены в таблице 5.

Из 11 клонов штамма ВЭЛ/ТМ-14 и 4-х штамма СМ-27 отобран-. ных в первом скрининге, после второго скрининга устойчивость к нейтрализации сохранили 6 и 3 клона соответственно. Полученные клоны за исключением одного, . практически не отличались от исходного по размеру бляшек, диаметр которых составлял 7-15мм. Один мелкобляшечный вариант получен из штамма ВЭЛ/ТМ-14 (диаметр бляшек 1-5мм).

Оценка частоты антигенных вариаций данного эпитопа для

Таблица 5. Селекция резистентных мутантов вируса ВЭЛ после нейтрализации МКА ВЗЛС6.

Штамм "Селективное- БОЕ/флакон при разведении вируса (Ьд) Диаметр вируса воздействие ____________ бляшек

(разведение) -1 -2 -3 -4 -5 -б - ■7 -8 (мм)

ТЫ-14 нет са; С •с С С >100 9 2 10-15

ВЭЛС6 С >100 45 У 3 0 1-5

(1:20) (8/4)' (3/2)

СИ-27 .* нет с с С С 80 5 1 0 7-10 •

ВЭЛС6 >100 5 1 0

■■ (1:20} (3/2)(1/1) 6-10

а) С - сливаются •

б) Общее число бляшек

в) Цифры в скобках - результат проверки клонов, полученных в результате данной селекции: в числителе-число клонов вируса, не нейтрализующихся гибридомой ВЗЛСб,отобранных после первой селекции; в знаменателе - число кланов, сохранивших устойчивость к нейтрализации пйсле второй селекции.

обоих пгашов вируса ВЭЛ дает значение 10 .

Для определения стабильности полученных вариантов вируса мутанты пассировались на клетглх ФЭК в отсутствие МКА. Было установлено, что посла четырех пассаж¿1 устойчивость к нейтрализующему действию антител сохранялась. -

Изучение свойств мутантпых штаммов вируса ВЭЛ. Свойства мутантов изучались в ИФЛ, РТГА и РН с гоьго- и гетерологичпыми МКА (табл. 6) Для этого были отобраны два ыутавта- по одному от каждого' родительского пгшша.

ИФА показал, что обоим мутантам свойственно ушныяэние способности связываться с антителами, взят® для селешсш.

- 19 -

Таблица 6. Свойства мутантов вируса БЭЛ, устойчивых к нейтрализации МКА ВЭЛС6.

Вирусн. Обоз- Тип Штамм вируса белок наче- реакции_._

(сайт) ние . CU-27 ТМ-14 МКА _- •_

исходный шт; 152 мутантн. шт. VC5CM-27 исходный шт. 153 мутантн. шт. YC6TM-14

EZ- ■6 вал се ИФА 1. ООО ООО 100 ' 1.000 ООО 100

РТГА > 100.000 <10 > 100 ООО <10

РН 4.5LgTimso -* 3.5Ц?ТЦЦ50 - . '

Е2- •4 ВЭЛ А5 ИФА 10 ООО. 10 QOO 10 ООО 10 ООО

РТГА 10 <10 10. <10 •

РН - - • ■ - г

Е2- ■4 БЭЛ В5 ИФА- 700 ООО '700'ООО ' 700 ООО 700 ООО

РТГА 2 560 640 ' 2 560 • 2 560

РН — - -

Е2- ■4 ВЭЛ А4 ИФА 300 ООО 6 ООО 300 ООО ' 6 ООО

РТГА 640 160 640 . 640

РН - - - - -

Е1 ВЭЛ G1 ИФА 200 ООО 200 ООО 100 ООО 200 ООО

РТГА 640 80 640 SO

РН - i

* - ЫГА не обладают вируснейтрализующей активностью.

Антигенный анализ мутантов с использованием других МКА позволяет выделить два типа реактивности: 1). МКА ВЗЛА4 "узнают" антигенные изменения обоих мутантов,

т.е. демонстрируют уменьшение связывающей активности с ними и в этом отношении данные ЖА аналогичны селективным - ВЗЛС6. 2) . Другие МКА не узнают антигенных изменений. Антитела этой группы,по-видимому,идентифицируют эпитопы, не имеющие общих с МКА ЕЭЛС6 модифицированных антигенных областей.

Изучение свойств мутантных вирусов в РТГА и РН позволило разделить и вторую группу МКА:

1). МКА ВЭЛА5 идентифицирует эпитопы, не обладающие антигемаг-глютинирующей и нейтрализующей активность*» ни у родительских, ни у мутантных штаммов.

2). МКА ВЭЛ31,очевидно»идентифицирует эпитоп, одинаково модифицированный у обоих мутантов. Изменения в этом эпитопе вызывают четырехкратное снижение титра в РТГА у полученных вариантов по сравнению с родительскими.

3). МКА ВЭЛВ5 позволяют выделить эпитоп, модифицированный только у мутанта штамма ОД-27,что выражается четырехкратным падением реактивности в РТГА с мутантяым вирусом по сравнению с родительским.

Таким образом, анализ взаимодействия МКА с родительскими и мутантныш . штаммами вируса ВЭЛ позволяет сделать следующие выводы:

1). Шдификащш МКА ВЗЛС6 комплементарного эпитопа у двух итам-мов■вируса ВЭЛ влечет изменения других эпитопов. При изучении свойств • МКА нами отмечены конкурентные взаимодействия между МКА ВЭЛА4 и ВЭЛВ5. У мутантных пгтаммов эпитопы, идентифицируемые данными Ш1А, по-видимому, не имеют обших областей. В то та время перекрывающиеся области появляются у эпитопов,комплементарных МКА ВЗЛСб и ВЗЛА4. '

2). Использованные для анализа 5 типов МКА не выявляли различий между родительскими штаммами СМ-27 и ТМ-14. В селекционирован-' ных вариантах МКА ВЭЛВ5 позволяют выделить эпитопные различия мевду мутантами, происходящими от двух штаммов вируса ВЭЛ.

Инфекция гибридомных клеток вирусом ВЭЛ Для изучения возможности выявления вируса ВЭЛ в инфицированных клетках использовали клеточный вариант ИФА (СеП-ЕИБА). Исследовали ми-еломные и гибридомные клетки через 4 часа после инфицирования вирусом ЮЛ/ГМ-14 с множественностью 30 БОЕ/кл. . Анализ окрашенных препаратов' показал, что использование • конъюгатов как на основе специфической поликлональной антисыворотки, так и на основе МКА к структурным гликопротеидам Е1 и ЕЙ-ВЭЛ31 и ВЭЛС6 соответственно может быть примейен.для идентификации клеток, инфицированных ВЭЛ. При прямом иммуноферментном методе комплексы антиген-антитело в мембранах клетки окрашиваются в коричневый цвет, ■ что дает возможность отличить зараженные клетки от незараженных.

1. Заражение гибридом, продуцирующих не нейтрализующие МКА. Использовали культуры гибридных клеток, продуцирующих МКА специфичные к Е1 гликопрогеиду вируса ВЭЛ (БЭЛ31). В качестве контроля использовали гибридомные клетки, продуцирующие МКА другой специфичности, а именно - к поверхностному антигену вируса гепатита В (НШ-22).

Титр антител в культуре гибридомы ЕЭЛ81 до заражения составлял 1:500. В культуре, продуцирующей МКА к вирусу гепатита В активность МКА по отношению к -НВЗ-антигену составляла 1:1000 (РИГА с эритроцитарным диагяостикушм Горьковского НИИ ЭМ) Через 4 . часа после инфицирования в культурах всех гибридомных

клеток обнаруживаются цитопатические изменения, которые выражаются в аггллотинации клеточных мембран. Методом Coll-FMSA в мембранах ио-602 ' ¡слсток обнаруживаются ьируеные белки. Отмеченные цитопатические изменения сохраняются в течение всего периода наблюдения ( 8- 10 суток).

В культуре происходит активная репродукция вируса - титры достигают 9-10Lg ТЦД,/мл. (табл.7) Определение титра антител не

50

выявило изменения их активности - продуцирующие вирус культуры гибридом секретируют МКА с такой же активностью, как и незара-женные.

2. Заражение гибридомы, продуцирующей нейтрализующие МКА. Для инфицирования брали культуры гибридомы ВЭЛС6, продуцирующие МКА с различной активностью (титры 1:500 - 1:1000). Во всех культурах, зараженных с множественностью 30 БОЕ/кл,через 4 часа после заражения цитопатических изменений не отмечено. Методом Cell-ELISA зараженных клеток также не обнаружено. Продукция МКА гибридомными клетками в течение 10 дней продолжалась без изменений. Инфекционный титр вируса в ростовой среде, составляющей после заражения около 7ЬдТЦД^мл, снижается: в -культуре гибридом с титром МКА 1:1000 вирус не обнаруживается на вторые,а в культуре с титром МКА 1:500 - на шестые сутки после заражения (Табл. 7)

• 3. Заражение клеток миеломы Sp2/0. 'Для заражения брали культуру шеломы Sp2/0. Через 4 часа после инфицирования методом Cell-ELISA в культуре обнаруживается 40-60% зараженных меток. Еа вторые сутки после заражения инфекционный титр вируса в КЖ составлял 10 Lg ТЦД^ыл. и в последующие сутки колебался в пределах 9-10.7Lg ТЦ^ай. '

Таблица 7.

! Титр вируса в КЖ (LgTIi^/мл)

Время ! миеломы!

после I. инфициров.! (сутки) !

!

_ 1

Репродукция вируса ВЭЛ в гибридомных и ' миеломных клетках.

в клетках

гибридом

!_

Sp2/0 1ВЗЛ G1 I ■ ВЭЛ Сб I HBS-22 ! термо-f f f 1(1:1000) i инактив. ! (1: 500)*! (1:500)! (1:1000)! контроль! _!_1 I 1_I __

2 4 6 . 8 10

I 10.0 !

! 9.3 !

! 10.7 '!

! 9.0 !

9.1 10. 5 9.5 10.8

!

I

I 10.5 ! 10.0 !

3.5 ! 0 ! 10.5 ! 5.6

0.8 'l ! 9.5 I 1.2

0 ! I 10.0 ! 0.

! ! 9.2 ! .

! ! 10.4 !

* - Активность МКА в КЖ данной гибридомы..

4. Заражение клеток вирусом мутантного штамма. Гибридомные клетки, продуцирующие ненейтрализующие (Ва/Ш) и .нейтрализующие (ВЭЛСб) МКА заражались вирусом мутантного штамма с множественностью 30 БОЕ /кл. Через 4 часа после инфицирования 40 -60% клеток содержали вирус. Как и в предыдущих опытах, в клетках отмечены цитопатические изменения. Синтез МКА во всех культурах сохранялся и сопровождался активной репродукцией вируса.

Наш изучены свойства гибридомных клеток при экспериментальной инфекции вирусом ВЭЛ in vitro. Сопоставлялись параметры репродукции вируса в гибридных клетках, продуцирующих специфические и неспецифические МКА с разными биологическими свойствами, а также в клетках мышиной миеломы Sp2/0 как одного из партнеров по слиянию. Несмотря на относительно короткий пе-

риод, в течение которого наблюдались инфицированные клетки, представляет интерес два факта:

1)."В популяциях миеломных и гибридных клеток инфекция протекает по типу персистентной.

2). В инфицированных гибридомных клетках репродукция вируса не угнетает процесс синтеза МКА, -интенсивность которого не отличается от таковой у интактных клеток, т. е. нет нарушения специфической функции клеток.

Изучение инфекции гибридомных клеток было проведено как логическое продолжение ряда работ по изучению персистенции альфавирусов в различных клеточных системах как в отсутствие, так и с добавлением противовирусных антител. Изучение системы гибридомные клетки-вирус'ВЭЛ имеет свои особенности. Прежде всего, обращает на себя вшшание тот факт, что продуцируемые гибридомами МКА не являются нейтрализующими, а в одном случае даже неспецифичны для вируса ВЭЛ. Проникновение вируса в эти клетки может осуществляться как через специфичесие рецепторы, так, вероятно, и через Гс-рецепторы продуцируемых иммуноглобулинов. Шпуляция инфицированных клеток уже через 4 часа после заражения морфодогичеаед отличается от интактной наличием агглютинированных клеток, что вероятно, можно рассматривать как цитопатический эффект. Через межклеточные контакты также может осуществляться распространение вируса. В большинстве клеток начинается экспрессия вирусных белков. Тем не менее, нами не отмечено подавления клеточного метаболизма - клетки продолжают делиться и продуцировать иммуноглобулины.

Такш образом, начет впервые была получена модель персистентной инфекции гибридомных клеток вирусом ВЭЛ. ' Отличительной

чертой данной инфекции является высокое содержание- вируса без потери большинством клеток способности к делению и продукции специфических иммуноглобулинов. Подученные результаты требуют дополнительного исследования, а описанная система может быть использована для изучения механизмов, обеспечивающих сосуществование вирусной и клеточой популяций. ,

ВЫВОДЫ:

1. Разработана оптимальная схема иммунизации для получения стабильных гибридом, продуцирующих МКА к структурным гликопро-теидам вируса ВЭЛ,, которая включает введение на одном из этапов вируса вирулентного штамма.. Получены 5 типов гибридом, 4

?

из которых продуцируют МКА к Е2 и 1 - к Е1 гликопротеиду вируса ВЭЛ. Синтезируемые гибридомами антитела относятся к двум субклассам - 1^01 и 1д(32а

2. Свойства полученных ЫКА изучены в иммуноферментном анализе (ИФА), твердофазном радиоиммуяоанализе (ТРИА), реакции торможения пассивной гемагглтоинации (РТГА), реакции нейтрализации. Показана высокая активность взаимодействия всех МКА с вирусом ВЭЛ и выявлены нейтрализующие свойства МКА ВЭЛС6.'

3. Ери изучении апитопной специфичности МКА показано наличие не описанных раннее конформационных детерминант сайта 4 гликопротеида Е2, обладающих ангигемагглюгинирующей, но не нейтрализующей активностью. Специфичные к этим сайтам МКА обеспечивают 80-100* протекцию животных при введении вируса вирулентного штамма.

4. Описаны свойства одного из эпитопов сайта 6 гликопроте-

ида Е2 вируса БЭЛ, обладащего наряду с антигемагглютинирующей выраженной нейтрализующей активностью. Изучение m vivo про-тективной способности комплементарных данному сайту ЖА показало, что они обеспечивают 50 -80% выживаемости животных при введении вируса вирулентного штамма.

5.Получены мутанты двух штаммов вируса ВЗЛ - СМ-27 и ТМ-14, устойчивые к нейтрализации МКА БЭЛСб. Частота появления одноэпитопных вариантов в клонированных штаммах вирусов составляет 10~4. Показано влияние единичной мутации на свойства модифицированного и соседних зпитопов у двух указанных штаммов вируса ВЭЛ

6.Изучена инфекция миеломных и гибридомных клеток вирусом . ВЭЛ. Особенностью инфекции гибридомных клеток является сохранение зараженными клетками способности продуцировать иммуноглобулины.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Шпилевая Ы.Е , Тугизов Ш. К, Кущ А. А., Цилинский Я. Я., Макарова RE. Биологические и иммукохимические свойства монокло-нальных антител к вирусу венесуэльского энцефаломиелита лошадей. // Вопр. Вирусол. - 1991. -NS. -стр. 495-498.

2. Штилевая М. Е , • Цилинский Я. Я , Кущ А. А. Получение мутантов вируса ВЭЛ с помощьюлргоклональных антител. // Итоги науки и техники, «-сер. Вирусология. -1991. -т. 24. -стр. 65-66.

3. Шпилевая М. В., Кущ А. А., Тугизов Ш. М., Цилинский а Я. Получение моноклональных шгтител • • к вирусу венесуэльского энцефаломиелита лошадей. //. Итоги науки и техники, -сер. Вирусология. -1991. -т. 24. -стр. 67.

Подписано в печать 15.05.92. Заказ 599 Формат 60x84/16 Tapas 100

Москва. Типография Россельхозакале?,™*