Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вирусные инфекции как факторы риска в атерогенезе (экспериментальные и клинические исследования)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Вирусные инфекции как факторы риска в атерогенезе (экспериментальные и клинические исследования)"

Ррссийская Академия медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова

ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ КАК ФАКТОРЫ РИСКА

(экспериментальные и клнннческие исследования) (03.00.06 - вирусология)

Автореферат дпссерташш на соискание ученой степени доктора меднцннских наук

на правах рукописи

УДК 6] 6.13-004.6-022.7:578.8]-07

АМВРОСЬЕВА Тамара Васильевна

В АТЕРОГЕНЕЗЕ

Москва - 1994

Работа выполнена в Белорусском НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Республики Беларусь.

Научный консультант; академик рамн, доктор медицинских наугс, профессор ВОТЯКОВ В.И.

Официальные 0ПП011еНТЫ:член-коррвспондвНФ РАЕН, доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки России,

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.

на заседании Специализированного Совета Д 001.27.1 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.

профессор С.С.Марекникова;

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.А.ЛшпКвЗИЧ; член-корреспондент РАМН,доктор медицинсхнх наук, профессор С. М. КЛИМвНКО.

Защита состоится

I

часов

Учений секретарь Специализированного совета

О. А. Медведкчна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Известно, что вирусные инфекции чрезвычайно широко распространены в природе. Это обеспечивает неоднократную встречу человека в течение его жизни с различными вир;<сными агентами. По современным представлениям вирусы могут существовать а организме хозяина в активном состоянии, вызывая острые, хронические и медленные инфекции, з также в латентной форме, при которой отсутствуют какие-либо признаки инфекционной патологии. Они могут проявляться а результате периодической активации латентного,"спящего'1 вируса. Для многих чирусов человека характерно именно такое хтительное. порой пожизненное иерсистирование, обеспечивающее им постоянство существования. Вышеизложенное делает очевидным тот факт, что соматические заболевания претерпевают свое формирование не в абстрактных, чистых от присутствия вирусов организмах, а в условиях их инфицированности. При зтом закономерно возникает вопрос, могут ли заражающие организм вирусы вносить свой вклад в развитие этих заболеваний. В »той связи заслуживают внимания данные последних дет о способности некоторых вирусных агентов нарушать функции специализированных клеток и, как результат, индуцировать в »раженном организме различные патологические синдромы. Такие сведения получены, например, в отношении вируса лимфоцитарного хориоменингита, вызывающего задержку роста у мышей, обусловленную его прямым влиянием на производящие гормон роста клетки гипофиза (Олдстоун МБ.. 1989). Описана также способность рада энтеровирусов (вирусов энцефаломиокарлмта, Коксахи В) нндуцировать у экспериментальных животных диабетоподобный синдром (Бочаров А.Ф., 1979; Сл^|»еа<1 .1.Е., ¡985). Таким образом, складывается впечатление , что вирусы могут быть не только этиологическими агентами манифестных классических вирусных инфекций, но и участниками развития

иного роль патологических состояний, связанны* с нарушениями гомеостазь, патогномоничными тая соматических заболеваниь

Ка> известно, атеросклероз является одним из самых массовых и распространенных болезней человека. Имея довольно древнюю историю своего, изучена* он продолжает относиться к числ> заболеваний с невыясненным этиопатогенезом. Незнание истинных причин, лежащих в основе его возникновения и развитая, привело к появлению учения о так называемых атерогенньга факторах риска. В настоящее время известно несколько десятков таких фактороБ (гиперхолестеринемия, артериальная гипертензия, курение и т.д.1. Вирусные инфекции среди них до сих пор не значатся, что оправдывается малой изученностью проблемы связи их с атерогенезом. Между тем. в свете последних достижений вирусологии и медицины изучение роли вирусных инфекиий - как возможных факторов риска в атерогенезе - представляется весьма актуальным хотя бы по двум причинам. Во-первых, в связи с тем, что многие вирусные инфекции протекают с вирусемией, что создает предпосылки для прямого повреждающего действия вирусов на артериальные клетки. Во-вторых вследствие тропкости ряда вирусов к клеткам органов (печени, кишечника), активно участвующих в метаболизме липкдов. благодаря чему создается риск нарушения структуры н функции соответствующих специализированных клеток. В то же время общеизвестно, что именно повреждение артериальной стенки, так же как и нарушения липидного обмена, являются признанными звеньями атерогенеза. С зтих позиций изучение специфического вклада вирусных инфекиий в развитие данных патогномоничны.\ для атерогенеза нарушений, а также поиск вирусологических подходов к их vcтpaнeнию является важным и своевременным.

ЦЕЛЬ И ЗАДА ЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель/и тботы было изучение роли вирусных инфекций в нарушениях липидного обмеиа и альтерации клеток артерий с последующей разрабопсой

подходов > их коррекции.

Основные задачи исследований состояли в следующем:

1. Изучить атерогенный потенциал распространенных вирусных инфекций в отношении их влияния на липидный спектр сыворотки крови и содержание липидов в клетках артерий.

2. Изучить возможность альтерации вирусами клеток и тканей кровеносных сосудов.

3. Выяснить возможность коррекции вирусиндуцированных атерогенных нарушений с помощью антивирусных химиопрепаратов.

4. Изучить применяемые при лечении больных атеросклерозом химиопрепараты на наличие у них противовирусных свойств.

5. Разработать новые лечебно-профилактические подходы, направленные на коррекцию вирусиндуцированных атерогенных нарушений у атеросклеротических больных с вирусологически отягощенным анамнезом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Основным итогом выполненной работы явилось доказательство способности ряда вирусов человека вызывать патогномоничные для атеросклероза нарушения, которые можно корректировать применением антивирусных химиопрепаратов.

В результате проведенных исследований

- впервые установлено, что ряд экспериментальных вирусных инфекций: герпетический кератоконъюнктивит кроликов, клещевой энцефалит мышей, амиотрофический лейхоспонгиоз морских свинок, ротавирусная инфекция кроликов сопровождается развитием дислипидемий;

- впервые доказана возможность развития дислипидемий у больных офтальмогерпесом и вирусным гепатитом А;

- впервые показано, что Ьирус герпеса человека может вызывать увеличение содержания липидов в артериальных клетках;

- впервые на примере герпетической инфекции и клещевого энцефалита. экспериментально доказана принципиальная возможность коррекции

вирусиндуцированных атерогенных нарушений антивирусными химиопрепаратами;

- впервые установлено, что клетки артерий являются реальной мишенью для повреждающего действия вирусов, в том числе прионного типа, не только в системе in vitro, но и в организме (на примере ВПГ-1 и агента амиотрофического лейкоспонгиоза);

- впервые установлено, что при лечении больных атеросклерозом и его осложнениями применяется "незапланированная" антивирусная терапия благодаря наличию антивирусных свойств у рутинно используемых сердечнососудистых химиопрепаратов;

- впервые выдвинуто положение о целесообразности применения антивирусных химиопрепаратов для лечения атеросклеротических больных с вирусологически подгвержденнным диагнозом вирусной инфекции в комплексе с другими обычно используемыми лечебно-профилактическими средствами.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯЗНА ЧИМОСТЬ.

В результате проведенных исследований получены приоритетные данные о новых патогенных свойствах ряда вирусов, которые могут иметь отношение к развитию соматических болезней. Полученные результаты дополняют и расширяют существующие представления о причинах, факторах риска и механизмах развития атеросклероза человека и, возможно, других соматических заболеваний, в патогенезе которых решающее значение имеют нарушения липидного обмена и повреждение сосудистой стенки. Полученные данные пополняют также имеющиеся сведения о патогенезе самих вирусных инфекций в плане происходящих в ходе развития инфекционного процесса нарушений липидного обмена и состояния артериальной стенки.

Ряд полученных в настоящей работе результатов может иметь прикладное значение. Это касается, прежде всего, открывшейся возможности совершенствования методов патогенетического лечения атеросклероза путем включения в него антивирусных средств с целью предупреждения и/или

подавления атерогенного действия персистирующих в больном организме вирусов. Открываются также новые возможности для совершенствования патогенетической терапии вирусных инфекций, сопровождающихся выраженными дислипидемиями и повреждениями артериальной стенки.

Практическое значение имеют разработанные нами методические документы и оригинальные разработки:

- "Способ получения клеточных культур из эксплантов кровеносных сосудов человека" (инструкция, утверждена УС БелНИИЭМ 04.07.86г.);

- "Способ моделирования атеросклероза" (авторское свидетельство СССР N 1684801 от 15.06.91r.);

- "Противовирусное средство" (авторское свидетельство СССР N 1835291 от 13.10.92г.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Ряд вирусных инфекций сопровождается нарушениями липидного обмена в виде дислипидемий и повышенного накопления липидов в клетках кровеносных сосудов.

2. Артериальная стенка подвергается выраженному повреждающему действию вируса простого герпеса в условиях генерализованной инфекции в организме животных и больных людей. Альтерацию артериальных клеток в культуре вызывает широкий круг других РНК- и ДНК-содержащих вирусов, а также возбудители медленных инфекций прионного типа.

3. Вирусиндуцированные нарушения липидного обмена и повреждения артериальной стенки можно корректировать с помощью антивирусных химиопрепаратов.

4. Наличие антивирусной активности у лекарственных химиопрепаратов, применяемых при лечении больных атеросклерозом и его осложнениями, является весьма распространенным феноменом, что свидетельствует о применении в отношении этих больных параллельной ("незапланированной") антивирусной химиотерапии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертационной работы обсуждались на ЬХ сессии общего собрания АМН СССР (Москва, январь, 1990г.); совместном заседании президиума АМН СССР и проблемной комиссии "Химиотерапия и -химиоирофилактика вирусных инфекций" (Москва, май, 1992г.); Международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (Санкт-Петербург, сентябрь, 1992г.): биомедицинском совещании Юнеско (Венеция, июнь, 1993г.). Результаты работы представлялись в виде стендовых докладов на УИ Международном конгрессе вирусологии (Берлин, август, 1990г.); на У и У1 Международных конференциях Общества антивирусных исследований (Ванкувер, март, 1992г.; Венеция, апрель, 1993г.). По теме диссертации сделано 23 научные публикации.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертационная работа изложена на 221. стр. машинописи и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводое. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 42 графиками и рисунками. Список цитируемой литературы включает 292 отечественных и иностранных источника.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Контингент больных. В работе исследован материал (биоптаты кровеносных сосудов, сыворотки крови) от 92 больных атеросклерозом и ИБС, а также 88 больных вирусными инфекциями, из которых 16 больных офтальмогерпесом (ОГ), 37 больных вирусным гепатитом А (ВГА), 9 взрослых больных, умерших от генерализованной герпетической инфекции (ГТИ), 26 детей, умерших от ГТИ.

Вирусы. В экспериментах использовали вирус простого герпеса I типа (ВПГ-1). штаммы 1-С, Л-2 и Коптев; вирус простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), штаммы ВН и "Мр: вирус гриппа (ВГ), штаммы А/РРУЛ^озгоск [Н7М1],

A/WSN/33[H1NI] и A/Aichi/2/68[H3N2]; респираторно-синцитиальный вирус (PCB), штамм Long II; вирус болезни Ньюкасла (ВБН), штамм Н; вирус везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана; вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ), лабораторный штамм 230; вирусы Коксаки типов BI и В4; вирус ECHO типа 6; вирус энцефаломиокардита; риновирус типа 13; аденовирус типа 3; вирус Ласса, штамм Съера-Леоне; ротазирус, штамм SA и Минск-86; вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-I), штамм ВИЧ-1/ШВ; возбудитель болезни Крейтцфеяьда-Якоба (БКЯ); возбудитель амиотрофического лейкоспонгиоза (АЛ), штамм АЛ-Д; вирус клещевого энцефалита^КЭ), штамм 110; вирус лихорадки Западного Нила (ВЛЗН), штамм Египет 101; вирус осповакцины (ВОВ), серый клон дермовакцины производства БелНИИЭМ (Минск).

Культуры клеток. В исследованиях in vitro использовали диплоидную культуру кожно-мышечных клеток эмбриона человека (КМКЭЧ), перевиваемые культуры клеток: легкого кролика (RL), почки зеленой мартышки (Vero), почки обезьяны (МА-104), мышиных фибробластов (L-929), а также куль туту лимфобластоидных клеток МТ-4 и первичнотрипсинизированную культуру фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). В работе использовали также культуры гаадкомышечкых клеток (ГМК) кровеносных сосудов эмбрионов и взрослого человека, полученные нами из биопсийного материала.

Животные. В исследованиях in vivo использовали кроликов породы "Шиншилла" массой 2.0-2.5 кг (96 особей), морских свинок - новорожденных (70 особей) и взрослых массой 250-300 г (18 особей), белых беспородных мышей массой от 7 до 20 г (1210 особей).

. Химические препараты и вещества. В работе использовали трентал, строфантин, хоргликон, папаверина гидрохлорид, кислоту никотиновую, ксактииола никотинат, курантил, кавинтон, изоптин, пармидин, галидор, линкомицин, ацикловир, метисазой. В исследованиях на животных в качестве противогерпетичесжих ингибиторов использовали ациклогуанозин - аналог

ацикловира и фуравир - новое ациклическое производное гуанина (синтезированы в Институте органического синтеза АН Латвии).

Получение культур ГМК из биоптатов артерий осуществляли методом эксплантов (Ме1шск I., 1983) в собственной модификации, которая заключалась в замене роллерного культивирования на культивирование в стационарных флаконах. Цитоморфологический анализ полученных культур с целью доказательства принадлежности клеток к гладкой мускулатуре осуществляли путем применения прижизненной микроскопии с использованием оптики фазового контраста, а также сканирующей электронной микроскопии.

Индикацию вирусных агентов в биоптатах кровеносных сосудов больных атеросклерозом проводили путем получения клеточных культур с последующим их анализом на присутствие вирусных антигенов. Детекцию антигенов осуществляли методом иммунофлуоресценции с использованием наборов диагностических антивирусных сывороток.

Моделирование экспериментальных вирусных инфекций на животных осуществляли известными методами. При моделировании герпетического кератоконъюкктивита (ГК) кроликов (ВПГ-1, штамм Коптев, 100 1-Д50. инфицирование на скарифицированную роговицу) использовали метод Э.Е.Кухарь (Кухарь Э.Е., 1968), герпетического менингоэнцефалита (ГМЭ) мышей (тот же штамм и инфицирующая доза при виутриыозговом или внутрибрюшинном способе заражения) - метод, предложенный В.И.Вотаковым и соавт. (Вотяков В.И. и др., 1986), западно-нильского энцефалита (ЗНЭ) мышей (штамм Египет 101,3 ЬД5о. подкожное заражение) и клещевого энцефалита (КЭ) мышей (штамм 110, 5 ЬД50, подкожное заражение) - метод, предложенный Н.П.Мишаевой и соавт. (Мишаева Н.П. и др., 1991), гриппозной инфекции мышей (штамм А/А1сЫ/2/68[НЗК2], 3,5 ЬД50, интраназальное заражение) - метод В.И.Ильенко (Ильенко В.И., 1977), амитрофический лейкоспонгиоз (АЛ) морских свинок (штамм АЛ-Д. 2,6 1Д50- ретробульбарное заражение) -метод, предложенный В.И.Вотяковым и соавт. (Вотяков В.И. и др., 1986). При

заражении кролш<ов ротавирусом (штамм Минск-86, Ю'О ТЦД50) использовали внутривенный способ инфицирования. О репродукции вируса в организме зараженных животных судили по присутствию в сыворотке крови вирусспецнфических антигенов и динамике нарастания противовирусных антител.

Изучение липндемического состояния экспериментальных животных и больных людей осуществляли путем определения общепринятых показателей, патогномоничных механизмам дейстзия атерогенных нагрузок: концентрации общего холестерина (ХС), КС липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП, или сС-ХС), ХС липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП, в сумме составляющие ^-ХС), а также триглицеридоз (ТО. Содержание ХС в разных экспериментах, в зависимости от целей, определяли тремя различными методами: ферментным методом с помощью наборов фирмы "Копе", на автоанализаторе "Техникой" (США) и методом Илька (Пса S., 5962). Триглицериды определяли известным методом (Gottfried S.P., 1973). Выделение ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП осуществляли методом препаративного ультра-' цеатрифугирования (Пероза Н.В. и др., 1933) на ультрацентрифуге UP-65 (Германия). В отдельных случаях сыворотку делили на «с- и js-липопротеины путем осаждения последних гепарином в присутствии солей марганца (Титов В.Н. и др., 1979). При этом «л-ХС (так же как и общий ХС) определяли методам Ильха, Ji-XC - путем нахождения разности между общим ХС и Ы--ЯС. Холестериновый коэффициент атерогенности (КА) высчитывали по формуле: jj-XGU,XC.

Оценку содсрггдш'я липядоа а клетках кровеносных сосудов человека проводили с помощью метода сравнительной фотометрии на цитофотометре MPV-2 (Lcitz, Германия) путем определения коэффициента экстинкции и на приборе "Интеграл" ("Квант", Киев) путем определения уровня цветности окрашенных яа липвды (суданозым черным В) клеток.

Морфометрические исследования (измерение площадей клетки, ядра и цитоплазмы) осуществляли на телевизионном анализаторе TAS (Leitz, Германия) по специально разработанной программе.

Патоморфологические исследования проводили стандартными методами с применением окраски гематоксилином и эозином, по Ван Гизону и по Харту.

Иммунологический анализ для обнаружения вирусспецифических антигенов в культурах клеток и тканях кровеносных сосудов экспериментальных животных и инфекционных больных проводили с помощью прямого и непрямого вариантов стандартных методов флюоресцирующих антител и иммунопероксидазного. Титры антител и антигенов в сыворотках крови определяли путем проведения иммуноферментного анализа (ИФА) или реакции нейтрализации на культуре клетох.

Изучение противовирусных свойств препаратов в системе in vitro осуществляли методом "скриниг-тест" с последующим определением количественных параметров выявленного антивирусного действия методом редукции бляшек. Противовирусные свойства препаратов на лабораторных животных изучали известными методами (Мншаева Н.П. и др., 1991; Ильенко В.И., 1977; Кухарь Э.Е., 1968; Вотяков В.И. и др., 1986), оценку результатов осуществляли по летальности леченных животных в сравнении с группой "плацебо", получавшей 0.85% раствор NaCl по той же схеме.

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым стандартным методам (Kimberlin R.H., 1983; Reed L.J., Muench H., 1979; Рокицкий П.Ф., 1967; Урбах В.Ю., 1975). Достоверность числовых результатов оценивалась по критерию Стьюдента (t). Вероятность ошибки (р) определяли по таблице с помощью вычисленного значения 1. Разницу считали статистически достоверной при Р < 0.05.

I. ВИРУСИНДУЦИРОВАННЫЕ ДИСЛИПИДЕМИИ.

Исходя из общеизвестного положения о патогенетической связи атерогеиеза с нарушениями липидного обмена мы сосредоточили свое внимание на изучении возможности участия вирусных агентов в данных нарушениях. Учитывая уже имеющиеся в литературе сведения на этот счет (Fabricant СЛ. et al., 1986) в качестве главного предмета исследований были выбраны липиды сыворотхи крови (СК). Исследования проводились в условиях моделирования вирусных инфекций на животных, а также в клинике инфекционных больных. Для исследований были, выбраны вирусы, в отношении которых можно было бы предположить атерогенную роль. Ими стали, во-первых, наиболее признанные ассоцианты атеросклероза, вирусы, тропные к активно участвующим в метаболизме липидоз органам - печени и кишечнику, а также другие вирусы -возбудители массовых, часто повторяющихся или тяжелых, фатальных инфекций человека.

1.1. Экспериментальные исследования

Экспериментальные исследования проводили на 5 вирусных инфекциях: ГК кроликов, КЭ мышей, ротавирусная инфекция кроликов, АЛ морских сгинох, гриппозная инфекция мышей.

ГК кроликов - как экспериментальная модель офтальмогерпеса (ОГ) -среда других известных герпетических моделей in vivo была выбрана нами в этих и других исследованиях не случайно. По современным представлениям ОГ у людей, особенно при тяжелом и рецидивирующем течении с вирусемией, часто сопровождается вовлечением в патологический процесс тканей глаза эхто-, энто-и мезодермального происхождения, а также внутренних органов (Коломиец А.Г. и др., 1992). Данный факт свидетельствует о том, что ОГ, хотя и носит характер регионального патологического процесса, на самом деле имеет тенденцию к

распространению на весь организм, и в ряде случаев заканчивается генерализованной инфекцией.

Моделируемый ГК характеризовался типичными клиническими признаками, пик проявления которых наблюдался на 4-5 «утки (рис.1). Инфекция сопровождалась выраженной вирусемией. Вирус выделялся также из мозга к печени. Количественное изучение лииидного спектра СК зараженных животных уже на 4 сутки еыявило четкое и достоверное увеличение, по сравнению с контролем, содержания общего ХС, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП (р-ХС) и ТГ, при отсутствии достоверных различий в концентрациях ХС ЛПВП фс-ХС). На 7-е сутки инфекции наблюдалось снижение уровней липидов и приближение их на 21-е сутки к регистрируемым в начале инфекции, хотя полной нормализации к этому сроку не происходило (рис.1). Анализируя полученные биохимические данные в сравнении с результатами вирусологических исследований, нельзя не заметить наличие четко выраженной корреляции между динамикой изменения сывороточных липидов зараженных животных и динамикой развития у них клинических проявлений ГК. Подсчет КА показал, что у зараженных животных он был значительно выше, чем у контрольных; на пике инфекшш (4 сутки) он составил 4.74±0.43 при 1.9±0.21 в контроле (рис.1).

Модель КЭ была использована в наших 'исследованиях как пример тяжелой нейроинфекции, сопровождающейся поражением ЦНС, а также других органов и тканей, в том числе участвующих в поддержании нормального гомеостаза.

Моделируемый КЭ у мышей протекал классически: вирус выделялся из крови и мозга (рис.2). Сравнительное изучение липидов СК зараженных к контрольных животных выявило различия, которые были особенно выражены (статистически достоверны) на 14-е сутки инфекции. В этот период имело место достоверное увеличение всех трех показателей ХС (общего ХС, <>с-ХС к ^-ХС) при отсутствии изменений со стороны ТГ. При этом КА зараженных животных практически не отличался от такового контрольных.

Л.» ü li i i iHi ii 11,i.i i.j ii

и I I II II I It I Я t I I 1 j I I I i I i 1 I I 1, 11 I H i I i I

«ь IM А en o> Г . ■ . ■ ^

Uli/ n

aíM/Л

О "С

О

о

Kí

с

ob

о to

о Ь>

i ив и S I Е й г * дй й й 5 ~~

Oti >В Е 5 Й О О

яс ч >? к œ и £3 Й a.-eflt ас «я

Т! Е ° 5 (0

ц52ишю2к £ ? " отз-с-а „tj-ö Е-

t о Juw к а о S

^S в ш с а - к g и ï^^.vbfle » sac*S5oS

и S» e-e 5 g s а

* 3 «-v-чй œ M S s -

S^^-s-r5 a

-

5a

sr

àl 3!

ora

i. i i m i i и i i t m i m i i I.

i i i ) i ..i j I .i i .i t. i i i I

о X

%

f ri II

¡lili

о г4

Ii/RH

I I) ) I

: fei

I i i 11 i i i 11 i i i 111 i i 11

o q

гч --

и/ЦП

«S V

85

8v._

_ к

4

i

¿««vSÏfïg. »SgbB fJ ë g g n о »Д g

ní

К ^

sg§gSgaS

в о.о (>ч0>о S f. я к d.o.g.0 г ь

Su» о « Ь

гикало?—

О я я g

^ttOSSJ»* . о fcs н еХ

S S i ra 1

I I

кшшк&з зивдаимяо

Ol ~_

[ i i i i i i п i i i 1 1 i i i i i г | l i п'гдгт

1//ЙИ

Использование ротавирусной инфекции • в наших исследованиях определили следующие обстоятельства: все возрастающая ее роль в патологии человека и тропность возбудителя к тонкому кишечнику, который, как известно, играет важную роль в поддержании липидного- гомеосгаза.

Получить классическую модель ротавирусной инфекции у кроликов со специфической клиникой и выделением вируса нам не представилось возможным.. Однако, развитие инфекционного процесса в организме зараженных животных в наших условиях эксперимента имело место, о чем свидетьствовали наличие в СК вирусспецифичесхих АГ и динамика нарастания противовирусных АТ. Исследование липидного спектра СК зараженных животных на 7-е сутки инфекции не выявило существенных различий по сравнению с контролем; изменения появились лишь на 14 сутки. При этом имело место достоверное увеличение общего ХС и р-ХС, что нашло свое отражение в КА, который в группе опытных' животных был достоверно выше, чем в контроле (рис.3).

В привлечении к нашим исследованиям модели медленной инфекции, какой является АЛ, сыграли роль 2 важных обстоятельства: неполная изученность его патогенеза и высказанное в литературе предположение об атеросклерозе - как медленной инфекции (Зуев В.А., 1988).

Моделируемый АЛ протекал у морских свинок классически; возбудитель выделялся из мозга (титр его на 5-ый месяц инфекции составил 5.5 ^ 1.Д50).

Изучение липидного спектра СК зараженных агентом АЛ животных до появления у них клинических признаков заболевания не выявило каких-либо отличий от такового, контрольных животных. Отличия появились с развитием клиники инфекции (на 4.5-5-й месяц). В этот период имело место увеличение общего ХС и^-ХС, хотя оно не было статистически достоверным. Тем не менее, КА у животных с экспериментальным АЛ бьщ почти в 2 раза выше, чем у контрольных (рис.4).

3.2

2.8 2.4 2.0 1.6

1.2

0 Л 0.4: 0.0'

-т

а

I"

КА

ОбШИЙ ХС аС.~ХС тг

Рис.3. Липидкый спектр сыворотки крови кроликов и КА на 14 сутки после заражения тотавпрусом \х- £> (п=12 "2 с 0,01) " х

По оси ординат:

1 - концентрации липидов мМ/л

2 - КА. относительные единицы

2 - зараженные рставирусом кролики Я - контрольные (неэараженные) кролики

2Л

2.4 2.0 1.6 и 0.8 0.< о.с!

Б

А

ОБЩИЙ ХС ¿.-ХС £-ХС

ТГ

КА

Рис.4. Липидный спектр сыворотки крови морских свинок АЛ (х^ £е?И0^п.КЛб!)ИЧеСККХ проявлений моделируемого на них

По оси 9рдинат: I - Концентрации липидов (мМ/л) <; - «А '.относительные единицы)

1 ■ !- засаженные агентом АЛ 4морские свинки Я}- контрольные (незасаженные) морские свинки

Модель гриппозной инфекции была использована нами ь экспериментальных исследованиях - как пример наиболее массовой инфекции человека, с которой он сталкивается в своей жизни неоднократно и довольно часто. Несмотря на то, что экспериментальная гриппозная инфекция у мышей протекала классически с типичной клиникой и выделением вируса из легких, количественных изменений в липидном спектре СК зараженных животных, по сравнению с контролем, в наших условиях эксперимента не было выявлено. Хотя исследования проводились в динамике с небольшим интервалом, начиная с момента заражения и заканчивая сроком клинического выздоровления выживших животных.

1.2. Клинические исследог&тя

Полученные в эксперименте результаты свидетельствовали о том, что из изученных вирусов наиболее выраженную и стойкую дислипидемгао вызывал вирус простого герпеса. Учитывая также доминирующее положение этого вируса среди известных ассоциантов атеросклеротической патологии, мы посчитали необходимым перенести исследования из эксперимента в клинику герпетических больных, а именно, больных ОГ. В том же русле клинические исследования проведены на группе больных ВГА. При этом нами руководило желание восполнить пробел в разделе экспериментальных исследований, который возник из-за отсутствия адекватной модели ВГА на животных.

Биохимические исследования по изучению липидемического статуса больных ОГ проводили на 16 пациентах (соотношение мужчин и женщин 2:1) в возрасте 20-40 лет. 9 из них страдали рецидивирующим герпетическим кератитом, у остальных герпетический кератит развился впервые. Диагноз ставили на основании типичной клиники, результатов офтальмологического обследования, а также вирусологического исследования материала больных: обнаружения ВПГ-специфических АГ в клетках соскоба хонъюшггивы и

лейкоцитах периферической крови, а также АТ к ВПГ в СК. В качестве контроля была использована группа доноров в таком же как и опытная группа количественном, возрастном и половом составе.

Изучение липидного спектра СК больных ОГ в период пика клиники заболевания в сравнении с донорами выявило существенные различия. Содержание общего ХС и р-ХС у больных было достоверно выше при отсутствии достоверных различий в уровнях «А-ХС И ТГ. КА в группе больных был также достоверно выше, чем в группе доноров (рис.5).

Индивидуальный анализ показателей каждого больного выявил следующие интересные Тенденции. Прослеживалась четкая связь между тяжестью заболевания и уровнем сывороточного ХС. Чем более длительно и тяжело протекал ОГ, тем выше было содержание ХС. Кроме того, прослеживались количественные различия в содержании ХС' у больных с рецидивирующим ОГ и впервые заболевших. В первой группе больных, у которых заболевание к тому же протекало более тяжело и длительно, уровень общего ХС был выше (7.3±0.21 и 6.1 ±0.18, соответственно).

Изучение липидного спектра СК при ВГА осуществляли на группе больных из 37 пациентов (соотношение мужчин и женщин 4:1) в возрасте от 20 до 42 лет с преобладанием лиц молодого' возраста до 29 лет (65%). Клинический диагноз был подтвержден серологически путем определения титра противовирусных АТ в парных сыворотках и обнаружения внрусспецифиче-ского АГ. Контрольная группа, состоящая из доноров, по своему количественному, половому и возрастному составу была адекватна опытной группе.

Изучение сывороточных липндов больных в динамике развития инфекции на 1-5-е, 6-20-е, 30-40-е сутки и в период реконвалесценции (более 40 суток) выявило существенные липидемические нарушения. Так, начиная с 6-х суток инфекции наблюдался рост общего ХС, который достигал максимума на 30-40-е сутки. В этот период у больных регистрировалась гиперхолестеринемия

7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 Й.О 1.0 о.с-

ОБЩИЙ ХС *с-ХС /-ХС

тг

%

КА

Рис. 5. Липидный спектр сыаоротки крови на пике инфекции (п=1б,*р < 0.01)

больные ОГ Ц}- доноры

По оси ординаг:

1 — концентрации лилздоэ (ыМ/ л)

2 - КА (относительные единицы)

больных ОГ

(содержание общего ХС > 6.7 мМ/л). При этом содержание *<-ХС, начиная с 30-х суток инфекции, достоверно снижалось (по сравнению с контролем), а _р-ХС достоверно повышалось. Данные изменения «V и _р-ХС носили стойкий характер и продолжали быть достоверными (по сравнению с контролем) на 40-е сутки и позже к моменту клинического выздоровления, когда другие общепринятые показатели метаболизма гепатоцитов (уровень билирубина, ферментов AJIT и ACT) нормализовались. Достоверных различий в концентрациях ТГ у больных и доноров во все наблюдаемые сроки не было отмечено, хотя абсолютные значения средних величин у больных были все же несколько выше. КА у больных ВГА начиная с 21-х суток инфекции был Значительно выше нормы и почти не снижался в период рехонвалесценции, что свидетельствует о высоком атерогенном потенциале их CK (рис.6). Саму дислипидемию у больных на пике инфекции можно обозначить как гипер-^-холестеринемию на фоне гипо-яС-холестеринемиа, что соответствует параметрам липидемических нарушений, носящих атерогенный характер.

Таким образом, из проведенных экспериментальных и клинических исследований можно заключить, что ряд вирусных инфекций как антропогенных, так и природно-очаговых, сопровождается липидемичесжнми нарушениями. Характер и степень выраженности дислипидемий для каждой вирусной инфекции были индивидуальными. Наиболее стойкая и выраженная дислипидемия наблюдалась при герпетической инфекции и ВГА. Липидемические изменения, вызываемые в эксперименте вирусом КЭ, ротавирусом и агентом АЛ, были менее выражены и кратковременны. Все регистрируемые в эксперименте и клинике дислипидемии носили характер общих пшерхолестеринемий, т.е. сопровождались повышенным (по сравнению с контролем)'содержанием общего ХС. При ОГ и ВГА у людей этот показатель был выше кормы (> 6.7 мМ/л). У больных ВГА дислипидемия носила зтерогенный характер. При всех изучаемых инфекциях, за исключением экспериментальных инфекций, вызываемых вирусами гриппа и КЭ, КА,

стС-XC

6-20

Дни 4

21-40

<40

гтттп

21-40 <40

Рис. 6. Динамик» изненения шшидиого спектра сыворотки крови болышх ВГА ( п-57,*р < 0,01)

1 - вольные ВГА

2 - доноры

j~J — КА (отнооитепьныв единицы)

го

U1

отражающий атерогенный потенциал СК, был повышен; у больных ОГ и ВГА он значительно превышал норму.

2. АЛЬТЕРАЦИЯ КЛЕТОК АРТЕРИЙ ВИРУСАМИ

По современным представлениям гиперлипидемия, протекающая даже по атерогенному типу, считается не единственным условием развития атерогенных нарушений. Другим не менее важным патологическим явлением, во многом определяющим риск инициации и/или развития атеросклероза, является повреждение (альтерация) артериальной стенки. При этом альтерация становится особенно значимой, если ей сопутствует гиперлипидемия. В этом случае она способствует возникновению в стенке "открытых дверей" для проникновения в нее атерогенных липопротеинов и воздействия других плазменных компонентов, участвующих в атерогенезе. Более того, по мнению ряда авторов, наблюдаемая при атеросклерозе липидная инфильтрация артерий является вторичной по отношению зс более раннему повреждению их стенки (СоПгеИ Я-Б. е1 а!., 1987; Каппе! « а1„ 1974). Исходя из этого, следующий этап наш ад исследований мы посвятили изучению возможности участия -различных вирусов - возбудителей распространенных инфекций человека - в повреждении клеток и тканей артерий.

Приступая к изучению данной проблемы предварительно нами были проведены исследования по выявлению в кровеносных сосудах больных атеросклерозом вирусов, которые принято называть вирусами-ассоциантами. Несмотря на то, что мировая научная литература содержит немало сведений, касающихся вирусной контаминации сосудистого русла атеросклеротических больных, мы посчитали необходимым сложить собственное мнение на этот счет.

Предметами исследования были биоптаты атеросклеротически измененных сосудов оперируемых больных. Для индикации вирусов в биопсийном материале был использован методический прием, основанный на

получении из сосудистых биоптатов клеточных культур .с последующим и* исследованием на присутствие вирусспецифических антигенов иммунологическими методами. Как показали результаты проведенного иммунофлуоресценткого анализа с использованием большого набора диагностических сывороток, в полученных из биоптатов культурах клеток присутствовали АГ трех вирусов - ВПГ-1, вируса гриппа и аденовируса. При этом наиболее часто обнаруживались ВПГ-специфические АГ. АГ аденовируса н вируса гриппа были обнаружены нами лишь едикыжды в культурах почечной артерии и аорты, соответственно. Полученные данные согласуются с имеющимися литературными' сведениями о присутствии вирусов герпеса в сосудах больных атеросклерозом, а также впервые показывают, что в клетках артерий могут обнаруживаться АГ других вирусов и, в частности, аденовируса и вируса гриппа.

Изучение альтерирующих в отношении клеток артерий свойств вирусов было начато с исследований 1n vitro. Этим исследованиям предшествовала работа по получению адекватных для решения поставленной задачи клеточных культур. Ясно, что такие культуры должны были иметь сосудистое' происхождение. Модифицировав известный метод эксплантатов и используя биопсийнын материал нам удалось получить -6 культур ГМК, из них 4 были получены из материала (аорты, бедренной, подвздошной и почечной артерий) взрослого человека и 2 - из сосудистых биптатов (аорты, легочной артерии), эмбриона человека. Полученные культуры имели ограниченный срок жизни который колебался в пределах 4-18 пассажей. Более долгоживушими оказались культуры эмбриональных клеток, которые, к тому же обладали выраженными ростовыми потенциями, по сравнению с клетками взрослого человека. Среди культур ГМК, полученных из сосудов взрослого человека, наибольшую продолжительность жизни имела культура клеток аорты, вследствие чел-именно ее мы использовали в качестве лабораторной модели при проведении вирусологических исследований in vitro, в которых участвовало 14 классически*

вирусов из 8 РНК- и ДНК-содержащих семейств, а также 2 представителя unconventional viruses - возбудители медленных инфекций ЦНС - агенты БКЯ и АЛ.

Изучение чувствительности культуры ГМК аорты человека к повреждающему действию классических вирусов показало, что она является вполне пермиссивной системой для размножения подавляющего большинства из них. Из изученных 14- вирусов лучше всего репродуцировались 8: вирус гриппа, ВВС, ВПГ-i, ВПГ-2, вирус ECHO, ВОВ, ВВЭЛ, риновирус. Инфицирование клеток данными вирусами сопровождалось выраженным ЦПД в ранние сроки инфекции (1-4 сутки) и образованием высокоинфекционного потомства. Заражение клеток другими вирусами: вирусом Коксаки В. ВБН. вирусом Ласса и аденовирусом также сопровождалось продуктивной инфекцией с формированием вирусного потомства, однако, с менее выраженным ЦПД, которое появлялось в более отдаленные сроки инфекции (5-8-г сутки). И только для 2 вирусов - вируса эицефаломиокардита и РСВ инфекция носила абортивный характер, хотя и сопровождалась ЦПД.

Что касается влияния неклассических вирусных агентов АЛ и БКЯ на ГМК аорты в культуре, то оно было сходно с такогьш, описанным'другими исследователями дня хлетох нссосудистого происхождения (Ройхель В.М., 1S88; Вотяков В.И. и др., 1990). При этом агенты. хорошо репродуцировались в культуре и трансмиссировалчсь при ее субпассивировании.

Логическим продоложением изучения альтерирующих свойств вирусов в системе in vitro явились наши исследования по их проверке на способность изменять содержание липидов в артериальных клепках. При этом содержание липидсв в зараженных ГМК аорты человека по сразнешш с контролем (интактные клетки) было использовано нами не только как критерий оценки возможных последствий альтерирующего действия вирусов, но и как показатель их влияния на липидный гомеостаз. Для исследований было взято 3 вируса: ВПГ-i, ECHO - как наиболее признанные ассоцианты атеросклероза - и вирус

гриппа - как возбудитель самой массовой и часто повторяющейся инфекции человека. Применение метода сравнительной фотометрии окрашенных на липиды клеток позволило установить, что из 3 изученных вирусов изменение содержания внутриклеточных липидов вызывал только ВПГ-1. Об этом свидетельствовал показатель уровня цветности, отражающий содержание липидов в клетках. Так, уровень цветности зараженных ВПГ клеток был достоверно выше, чем в контроле. В то время хак данный показатель з условиях заражения двумя другими вирусами практически не отличался от контрольных значений.

Полученные in vitro данные о патогенных в отношении сосудистых хлетох свойствах вирусов стали основанием для изучения состояния артериальной стенки в условиях инфекций в живом организме. Вначале были проведены экспериментальные исследования на животных. Главной моделью зыбора стала герпетическая инфекция, а именно ПС кроликов. Микроскопическое исследование препаратов аорты кроликов с типичной клишпеой ГК и выраженной дислипидемией выявило существенные внрусспецифические морфологические изменения. Так, в отдельных участках аорты отмечалась пролиферация эндотеяиальных клеток интимы, вследствие чего эти клетки образовывали несколько рядов. При этом их ядра были гиперхромными, а хлгточные границы отсутствовали. В яругах участках отмечалась десквамация зндотелиальных клеток с утолщением и гомогенизацией базальной мембраны. В отдельных участках обнаруживалась гомогенизация основного вещества внутренней оболотхи аорты. При этом в процесс вовлекались эластнчесхие волокна среднего слоя. Эти участки выглядели гомогенными, эозинофильно-базофнльными с заметным уменьшением числа клеток. Кое-где встречались увеличенные ядра ГМК с перннухлеарными просветлениями. Элзстичесхне волокна среднего слоя были . утолщенными, закуолизированными, имели извитой вид. В ядрах ГМК и отдельных фибробластов обнаруживались вирусные включения 1 типа. При этом ядра были увеличены в размерах и

гиперхромны. Наряду е включениями 1 типа в ядрах рядом лежащих клеток отмечалась вакуолизация с мелкими точечными включениями в каждой вакуоли, что соответствовало внутриядерным включением II типа, характерным для герпетической инфехции. Местами такие вахуолизированные ядра напоминали тутовую ягоду. Наряду с трансформацией ядер за счет вирусных включений обнаруживались очаги деструкции и гомогенизации эластических волокон с признаками метахромазии основного вещества. В адвентиции аорты встречалась скудная круглокяеточная инфильтрация и признаки начинающегося склероза.

Таким образом, в аорте зараженных ВПГ-1 кроликов с типичной клиникой ГК были выявлены характерные дня герпетической инфекции морфологические нарушения уже частично описанные в литературе для других органов (Коломиец А.Г. и др., 1992). Полученные данные указывали на тот факт, что ВПГ инфекция в живом организме может сопровождаться вирусспецифической альтерацией стенки сосудов.-Подтверждением тому явились результаты патсгиотологического исследования сосудов больных людей, умерших от ГТИ. Диагноз ГТИ имел не только клиническое и морфологическое, но и вирусологическое подтверждение, полученное путем обнаружения ВПГ-специфичесхих АГ в разных органах и тканях (мозг, печень, селезенка и др.), в том числе в артериальных стенках.

Микроскопическое исследование сосудов умерших от ГТИ больных показало, что артериальные клетки и ткани весьма подвержены вирусному воздействию. Наблюдаемые при этом морфологические изменения характеризовались наличием в эндотелиоцитах, фибробластах и ГМК включений I и И типа. Наряду с десквамацней эндотелия и разрушением базазьной мембраны в одних участках, в других - имела место пролиферация эндотешшдышх клеток. Пролиферация и трансформация их ядер за счет вирусных включений приводила к заметному сужению, а в ряде случаев облитерации просвета сосудов. Довольно часто в стенках сосудов определялась пролиферация ядер ГМК. Их ядра были увеличены, неправильной формы, гиперхромные. В четырех из девяти

анализируемых случаях указанные изменения сопровождались выраженными нарушениями кровообращения с развитием тромботических изменений к последующим формированием вокруг них некротических очагов.

Таким образом, проведенный морфологический анализ экспериментального и клинического материала однозначно показал, что сосудистая стенка является вполне реальной мишенью для альтерирующего действия ВПГ-1.

Кроме ВПГ-1, в наших исследованиях ельтерирующее действие в отношении стенки артерий установлено для агента АЛ. Так, микроскопическое исследование препаратов аорты морских свинок, заболевших АЛ, выявило выраженные морфологические изменения всех ее слоев. При этом наиболее типичными признаками поражения была сильная вакуолизация цитоплазмы ГМК и фибробластов по типу балонной дистрофии, а также наличие в клетках внутриядерных эозинофильных включений, которые при этом заболевании ранее были описаны для клеток.ЦНС (Лысцова Е.Г., Недзьведь М.К., 1984). Из других характерных морфологических признаков поражения стенки аорты агентом АЛ можно отметить пролиферацию энцотелиальных клеток, перемежающуюся с их десквамацией и налипанием в этих участках значительного числа эритроцитов.

Полученные в настоящей работе данные о способности вирусов индуцировать изменения липидного обмена в виде дислипидемий и повышенного накопления артериальными клетками лнпвдов, а также вызывать повреждения клеток и тканей сосудистой стенки дали нам основания для предположения о том, что вирусные агенты в случае развития продуктивной инфекции могут играть роль опосредованных факторов риска в атерогенезе. Если с этих позиций судить об изучаемых вирусах с точки зрения их приоритетности, то первыми на эту роль могут претендовать, по нашим данным, вирусы герпеса.

3. КОРРЕКЦИЯ ВИРУСИНДУЦИРОВАННЫХ АТЕРОГЕННЫХ

НАРУШЕНИЙ АНТИВИРУСНЫМИ ХИМИОПРЕПАРАТАМИ

Предполагая атерогенную роль определенных вирусов, принципиальным для нас стал вопрос о том, можно ли вирусиндуцированные нарушения липидного обмена и альтерацию артериальной стенки подавлять и/или уменьшать (корректировать) с помощью противовирусных препаратов. Для выяснения этого вопроса на фоне моделируемых инфекций мы применили антивирусную химиотерапию. Наиболее показательные результаты были получены при герпетической инфекции. Так, применение фуравира -эффективного ингибитора активности ВПГ (Лшк а а1„ 1990) в условиях ГК кроликов приводило к существенному смягчению повреждающего действия вируса на стенку аорты: Микроскопическое исследование препаратов аорты кроликов с ГК в условиях лечения фуравиром, хотя и выявило наличие' морфологических признаков, характерных для герпетической инфекции, однако они были гораздо менее выражены, чем у нелеченных животных. Тазе, эластические волокна внутреннего и среднего слоя имели извитой вид, но были более упорядоченными. Несмотря на некоторые изменения формы ядер фибробласты и ГМК в основном, сохраняли свою вытянутую форму и правильную ориентацию. Лишь кое-где обнаруживались участки метахромазии и гомогенизации основного вещества. Внутриядерные включения I и II типа практически отсутствовали. Аналогичная коррекция под действием фуравира и ациклогуанозина наблюдалась также в отношении липидемического статуса кроликов с ГК (рис.7). Применение упомянутых селективных ингибиторов активности ВПГ приводило к выраженному снижению концентраций сывороточных липидов (общего ХС, р-ХС и ТГ), значительно повышенных, по сравнению с контролем, у нелеченных кроликов с ГК. При этом сами препараты в рабочих концентрациях не влияли на липидный спектр СК животных (здоровых и интактных). Такой же корректирующий эффект, но уже на

1 - нелеченные кролики с ГК (получившие гшацебо)

2 — леченные фуравиром кролики с ГК (гОнг/кг ■в/в + У/, р-р меетно)

3 - леченные ациклогуаноэином кролики п ГК (10 иг/ кг в/в+З^р-р иестпо)

4 - контрольные (аезараженкые) кропики

П = 12* р < 0.01 ы

М ьн

накопление клетками аорты липидов, имел в наших исследованиях коргликон, который, как будет показано ниже, обладал выраженным противогерпетичесхим действием. Содержание липидов в зараженных ВПГ клетках и обработанных каргликоном совсем незначительно отличалось от такового контрольных (незараженных и обработанных коргликоном) клеток, В то время как содержание липидов в зараженных и необработанных коргликоном клетках было значительно выше, чем в контроле.

Таким образом, из представленных данных очевидно, что зируснндуцированные атерогенные нарушения можно корректировать с помощью антивирусных химнопрепаратов.

4. НАЛИЧИЕ АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ У ОФИЦИНАЛЫГЫХ ХИМНОПРЕПАРАТОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ ПРИ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ АТЕРОСКЛЕРОЗОМ И ЕГО ОСЛОЖНЕНИЯМИ

Представленные выше результаты о корректирующем. действии агпивирусных средств в отношении вирусиндуцированных изменений со стороны дипидного обмена и состояния сосудистой стенки представляют на наш взгляд двоякий интерес. Во-первых, они косвенно указывают на вирусобусловленность (специфичность) наблюдаемых при вирусных инфекциях атерогенных нарушений. Во-вторых, они поднимают новую проблему - проблему целесообразности использования антивирусной терапии для лечения соматической патологии, _ сопровождающейся вирусин-дуцированными патогномоничнымн нарушениями. В этой связи и учитывая накопленные мировой литературой данные о наличии противовирусного действия у различных фармокопенных препаратов (например, антибиотиков, спазмолитиков, цитостатихов и т.д.), мы решили проверить, обладают ли антивирусной активностью лечебные средства, рутинно применяемые в клинике для терапии сердечно-сосудистых больных. Для исследований были выбраны

препараты, относящиеся к известным и хорошо зарекомендовавшим себя в вирусологическом скрининге химическим классам веществ, таким как нуклеозиды (трентал, никоткнамид), N-гетероциклические соединения (курантил, кавинтон, папаверин, кислота никотиновая, ксантинола никотинзт, пармидин), стероиды (строфантин, коргликон), ароматические углеводороды (изоптин), производные алициклического ряда (галидор). По механизму фармакологического действия они относятся к нескольким классам лекарственных средств: сердечные гликозиды (строфантин, коргликон). антиангинальные средства (курантил, изоптин), ангиопротекторы (пармидин), спазмолитики (трентал, галидор, папаверин, ксантинола никотинат), средства, улучшающие мозговое кровообращение (кавинтон), витамины и их аналоги (кислота никотиновая, никотинамид). Всего было исследовано 12 препаратов. В экспериментах in vitro и in vivo участвовало 13 вирусов, являющихся возбудителями известных и широко распространенных вирусных инфекций человека и животных. ,

Из 12 изученных препаратов противовирусным действием обладали 10 (табл.1), что составило~80%. Примерно одинаковый спектр действия проявили строфантин, коргликон и папаверин. Они оказались наиболее активными в отношении ВПГ, ВОВ, вируса ECHO и ротавируса. При общей оценке направленности действия исследуемых препаратов нельзя не заметить, что большинство из них обладали ингибирующей активностью в отношении ДНК-содержащих вирусов, а также ротавируса. Что касается РНК-содержащих вирусов (за исключением ротавируса, вирусов JIacca и ECHO), то они слабо подавлялись (ВКЧП, ВВС, PCB) или вовсе не интибировались (ВВЭЛ) испытуемыми препаратами.

В отношении степени выраженности антивирусного действия следует указать, что около половины изученных препаратов обнаружили высокую ингибирующую активность, сочетающуюся с большой дозовой широтой ее проявления (ХТИ > о), т.е. оказались высокоэффективными ингибиторами

Таблица!

Характеристика антивирусной активности изученных в системе in vitro официнальных сердечно-сосудистых препаратов

Препарат 1 МПК. Антивирусная активность в отношении

мл ВПГ BOB J Brj BBC PCB ВВЭЛ ECHO Рота-вирус Вирус JIacca

Трсктал ¡30« i i - i * - - - ++++ -

Никотинамид 180 i - ! - - - - КД

Строфантин 0.6 + + -t- * * — ++++

Коргликон 0.72 ■f - _ + + + + + ++-t-

Курантил 1.5 - - - - - нд

i |Кавитон 0.7 - - - - * нд

Папаверин 2.8 ++++ + + > ++ - - - + ++

Кислота никотиновая 400 ' ад

Ксантшюла юпсотанат 800 - . - + + - - пд

¡йопгкг 300 - - - ад-

Пармидиа 6

Гашздор 12

Примечание: нд - нет данных,г отсутствие активности,

"-s-.+V - слабая (ХТИ=1,2), "+.++" - срздиая (ХТИ-4), "+++V - высокая (ХТИ>2) активность.

вирусной активности. К числу наиболее перспективных в этом отношении препаратов, обладающих к тому же широким спектром противовирусного действия, можно отнести 4: трентал, строфантин, коргликон и папаверин. Именно оки и были подвергнуты далее более глубокой вирусологической проработке.

При изучении данных препгртов на интерферониндуцирующую активность в системе in vitro (иа культурах L-929, КМКЭЧ, ФЭК) положительные результаты были получены только в отношении двух из ннх-строфгнтика и папаверина. Согласно принятой системе оценки интерферониндуцирующей активности (Садьпсов А.С. и др., 1978), по нашим данным папаверин можно отнести к высокоактивным, а строфантин - к умеренным индукторам интерферона.

Учитывая тот факт, что все четыре препарата, отобранные как наиболее перспективные, обладали в скрининге in vitro ингибируюгцим действием в отношении ВПГ, было решено исследовать их в системе in vivo - на модели ГМЭ мышей. Как оказалось, изучаемые препараты обладали выраженным защитным действием. При внутрибрюшинном инфицировании и внутривенной терапии трентал, коргликон и папаверин снижал!} летальность в достоверно эффективных дозах на 70-62.5% и характеризовались широким диапазоном химиотерапевтического действия: ХТИ > 100. В отличие от них, строфантин действовал в весьма узком диапазоне, однако толерантная и эффективная его доза е 0.01 мг/хг обеспечила достаточно высокий уровень защите мышей от гибели (76.3%) при летальном ГМЭ.

Выявленное противовирусное действие прапаратоз было далее подтверждено в следующей серии экспериментов при инфицировании животных непосредственно в мозг и подкожном лечении (в более жестких условиях для проявления защитного действия). В этих условиях принципиальных отличий при сравнении с результатами экспериментов по вышеописанной схеме не выявлено.

Тем не менее, при подкожном введении строфантин оказался эффективным в более широком диапазоне доз, его ХТИ составил 10.

Из выявленных; среда сердечно-сосудистых препаратов ингибиторов вирусной активности наибольший интерес для нас в плане возможных перспектив использования в качестве антивирусного средства представил трентал, что было обусловлено наличием у него следующих характеристик: малая токсичность, отсутствие эффекта аккумуляции в организме, характерного, например, для сердечных гликозидов, и , вследствие этого, возможность длительного применения, относительная мягкость фармакологического действия. Изучение грентала в системе in vitro и in vivo в отношении лабораторных штаммов 13 вирусов показало, что данный официнальный препарат является высокоэффективным ингибитором вирусной активности широкого спектра действия. Так, в экспериментах на клеточной культуре он обладал выраженным ингибирующим действием в отношении 4 вирусов: ВПГ-1 (в том числе его ацнкловиррезистентного штамма), ВОВ (в том числе его метисазонрезистентного штамма), ротавируса, ВИЧ. Менее выраженную ингнбнрующую активность он прозам в отношении ВГА и ВВС. В опытах на лабораторных животных трентал оказался эффективным при лечении ГМЭ мышей, ГК кроликов, КЭ мышей и западно-нильского энцефалита мышей. Если оценивать защитное действие трентала при применении его для лечения летальных вирусных энцефалитов, то оно было наиболее выражено при КЭ и ГМЭ мышей. Летальность животных в условиях лечения их препаратом в максимально эффективных дозах снижалась на 80% и 75%, соответственно. Хороший лечебный эффект проявил трентал при ГК кроликов, о чем свидетельствовало значительное снижение клинических признаков кератита и кератоконъюнктивита, а также уменьшение титров вируса в крови, мозге и печени экспериментальных животных по сравнению с "контрольными (нелеченными). В данном случае, лечебный эффект трентала празстически не

уступал таковому известного противогерпетического средства ациклогуанозин (ацикловир).

Резюмируя полученные в экспериментах in vitro и in vivo данные можно заключить, что наличие антивирусной активности у сердечно-сосудистых препаратов является весьма распространенным феноменом. При этом в данной группе лекарственных средств имеются высокоэффективные ингибиторы вирусной активности, обладающие довольно широким спектром противовирусного действия. Исходя из этого, становится очевидным тот факт, что лечение такими препаратами сердечно-сосудистых больных включает в себя не только известный для них фармакологический эффект, но и дополнительное действие в виде противовирусного. Иными словами, становится очевидным, что в процессе традиционного леченйя больных неосознанно применяется антивирусная терапия. Она является "незапланированной", а потому неучитываемой и неизвестной по своим последствиям. Между тем эти последствия, как показали наши исследования, могут иметь вполне реальное приложение. Так, в экспериментах in vitro нами установлено, что трентал при внесении его в культуру ВПГ-зараженных диплоидных клеток в возрастающих концентрациях может вызывать образование трентал-резистентного штамма. Полученные в отношении трентала сведения показывают принципиальную возможность бесконтрольного изменения биологических свойств вирусов под влиянием широко применяемых в лечебной практике препаратов с "дополнительным" антивирусным действием.

Полученные в настоящей работе данные, указывающие на способность ряда вирусов индуцировать патогномоничные для атерогенеза патологические процессы, с учетом накопленных по данной проблеме литературных сведений являются, на наш взгляд, достаточно вескими основаниями для того, чтобы задуматься над вопросом о целесообразности использования для лечения атеросклеротических больных антивирусной химиотерапии. Ясно, что такую терапию, имеющую целью устранить или скорректировать

вирусиндуцированные атерогенные нарушения, можно рекомендовать только в отношении больных с вирусологически отягощенным диагнозом и только в комплексе с другими традиционными лечебно-профилактическими мерами.

В заключение следует отметить, что когда настоящая работа была закончена в литературе появились данные K.Lemstrom и coaBT.(Lemstrom К. et al., 1993) об успешном применении ганцикловира в условиях моделирования аллографтного атеросклероза на фоне цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции. Ранее этими исследователями было показано, что ЦМВ инфехция ускоряет и усиливает развитие экспериментального атеросклероза у крыс. Применение же ганцикловира полностью снимало усиливающий атерогенный эффект ЦМВ инфекции. Таким образом, высказанная в настоящей работе идея о целесообразности коррекции вирусиндуцированного атерогенного действия с помощью антивирусной химиотерапии уже нашла свое экспериментальное подтверждение в работах других исследователей.

ВЫВОДЫ

1. В экспериментах на животных установлена возможность развития дислипидемий при раде вирусных инфекций. Липидемические нарушения обнаружены при герпетическом кератоконъюшстивкге кроликов, клещевом энцефалите мышей, ротазируской инфекции кроликов, амитрофическом лейкоспонгиозе морских свинок. При гриппозной инфекции мышей липидемические расстройства не выявлены.

2. Выраженные липидемические нарушения имеют место при офтальмогерпесе и вирусном гепатите А у людей. Дислипедемия у больиьк вирусным гепатитом А на 30-40-е сутки инфекции носит атерогенный характер и сохраняется после клинического выздоровления больных.

3. В экспериментах in vitro установлено увеличение содержания внутриклеточных липидоа в культуре гяадкомышечных клеток аорты человека

при заражении ее вирусом простого герпеса 1 типа (штамм 1С). Содержание липидов в артериальных клетках под действием вирусов гриппа (штамм A/WSN/33) и ECHO (теп 6) не изменяется.

4. Артериальная стенка подвергается выраженному повреждающему действию вируса простого герпеса в условиях генерализации инфекции в организме животных и больных людей.

5. Культура гладкомышечных клеток аорты человека является пермиссивной системой для репликации в ней широкого круга классических вирусов (14 вирусов, в том числе вирусов простого герпеса, гриппа, ECHO, Коксаки и др.), а тахже возбудителей медленных инфекций типа лрионов (агентов амиотрофического лейкоспонгиоза и болезни Крейтцфельда-Якоба).

6. В культурах артериальных клеток, полученных из биоптатов больных атеросклерозом, обнаружены антигены трех вирусов: вируса простого герпеса 1 типа, аденовируса, вируса гриппа. Наиболее часто с атеросклеротически измененными клетками артерий ассоциируются антигены вируса простого герпеса.

7. Вирусиндуцированные атерогенные нарушения в виде характерных изменений липидоого обмена и повреждений артериальной стенки в эксперименте можно корректировать с помощью антивирусных химиопрепаратов.

8. Широко используемые в кардиологической практике препараты (трентал, папаверин, коргяикон, строфантин, иикотинамид, хурантил, хавинтон, кислота никотиновая, ксантинола нгасотинат, изоптин) обладают антивирусными свойствами, что указывает на применение "незапланированной" антивирусной терапии при лечении такими препаратами соматических больных.

9. Полученные данные о возможности ряда вирусов вызывать атерогенные нарушения, поддающиеся коррекции антивирусными химиопрепаратами, свидетельствуют о необходимости проведения специальных исследований по изучению целесообразности включения антивирусной химиотерапии в комплекс

лечебно-профилактических мер, применяемых для лечения атеросклеротических больных.

10. На основе полученных в эксперименте и клинике данных о способности вирусных агентов индуцировать патогномоничные для атерогенеза нарушения очевидно, что вирусные инфекции могут играть роль атерогенных факторов риска. Таким образом, вирусы, будучи возбудителями известных инфекций, могут быть участниками развития патологических процессов, свойственных соматическим заболеваниям, что значительно расширяет существующие представления о их значении в патологии человека и дает исиование для развития нового направления вирусологии, связанного с изучением вклада вирусных инфекций в соматическую патологию.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Андреева О.Т., Владыко Г.В., Николаева С.Н., Орлова C.B., Азарова И.А., Згировская A.A. Новые свойства трентала - как ингибитора вирусной активности широкого спектра действия // Вопр.вирусологии.- 1993,- N 5.- С.230-233.

2. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Андреева О.Т., Серебрякова Е.В., Владыко Г.В., Самарина М.П. Липидный обмен при вирусных инфекциях в эксперименте // Бюл.эксперим.биологии и медицины.- 1992.- N 9.- С.302-304.

3. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Андреева О.Т., Серебрякова Е.В., Чещевик А.Б., Самарина М.П., Мишаева Н.П., Згировская A.A. Дислипидемия, повышенное содержание в клетках липидов при экспериментальной герпетической инфекции и их коррекция антивирусными химиопрепаратами // Вопр.вирусологии.- 199Z-N 1.-С.61-64.

4. Амвросьева Т.В., Вотяков'В.И., Владыко Г.В., Андреева О.Т., Горецкая И.С., Клнмашевская Л.М. Антивирусные свойства различных фармакологических групп препаратов II Антибиотики и химиотерапия.- 1992.- N11.- С.5-7.

5. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Владыко Г.В., Ерохина И.Р., Марьянковз Р.Ф. Репликация вирусов в культуре гладкомышечных клеток аорты человека // Вопр. вирусологии.- 1988.- N 2.- С.239-242.

6. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Владыко Г.В., Николаева С.Н., Андреева О.Т., Верветченко С.Г. Официнальные сердечно-сосудистые препараты - как ингибиторы вирусной активности // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций.- Москва, 1991.-C.U-13.

7. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Николаева С.Н., Горецкая И.С., Романович В.П. Антивирусные свойства коргликона - каково их значение в терапии сердечно-сосудистой патологии? II Медицинский реферативный журн.- 1991,-Вып.1-3- С. 15.

8. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Орлова С.В., Гудков В.Г., Виринская A.C., Илькевин Ю.Г., Самарина М.П., Мишаева Н.П. Вирусиндуцированные дислипидемии - как возможные факторы риска в развитии соматических заболеваний // Вопр. вирусологии.- 1994.- N 2.- С.87-91.

9. Амвросьева Т.В., Серебрякова Е.В., Николаева С.Н. Использование морфометрии при создании тест-систем экспериментального атерогенеза // Новые приложения морфометрии и математического моделирования в медико-биологических экспериментах.- Харьков, 1990.- С.10.

10. A.c. 1684801 СССР, МКИ 5 G09 В 23/28. Способ моделирования атеросклероза i Т.В.Амвросьева, В.И.Вотяков, И.Р.Ерохина, С.Д.Беззубик; БелНИИ эиидемиол. и микробиол. - N 4673392/14; Заявлено 04.04.1989; Опубл. 15.10.1991 //Бюл. N38.

11. A.c. 1835291 СССР. Противовирусное средство / В.И.Вотяков, Т.В.Амвросьева, Г.В.Владыко, С.Н.Николаева, О.Т.Андреева, С.Г.Верветченко, Н.Д.Коломиец, Г.А.Галегов, И.И.Протас, М.М.Гараев, В.В.Покровский; НИИ вирусологии им.Ивановского.-N 4909731; Заявлено 07.02.1991.

12. Вотяков В.И., Амвросьева Т.В. Вирусиндуцированный атсрогенез - как медленный инфекционный процесс и подходы к антивирусной терапии и профилактике атеросклероза человека II Медицинский реферативный журн.- 1991.-Вып.1-3.- C.1S.

13. Вотяхо'в В.И., Амвросьева Т.В. О роли вирусных агентов в индукции атерогенеза с позиций этиопатогенетических аспектов медленных инфекций и ассоциации атеросклероза с вирусами I/ Вестник АМН СССР.- 1991.- N 5,- С.59-64.

14. Вотяков В.И., Амвросьева Т.В., Владыхо Г.В., Бореко Ё.И. Обнаружение противовирусной активности у известных сердечно-сосудистых препаратов II IX Всесоюз.симпозиум по целенаправленному изысканию лекарственных веществ,- Рига, 1991.- С.26.

15. Самарина М.П., Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Андреева О.Т.. Серебрякова Е.В., Чещевик А.Б. Нарушение липидного обмена при герпетической инфекции II Актуальные проблемы современной биохимии.-Минск, 1991.-С.91.

16. Серебрякова Е.В., Амвросьева Т.В., Глушен С.В., Владыко Г.В. Влияние трентала на структурно-функциональные параметры диплоидных клеток в культуре на ранних сроках герпетической инфекции II Влияние химических и медикаментозных препаратов на структурно-функциональные системы организма,- Минск, 1992.-С.48-52.

17. Amvrosieva T.V., Votyakov V,I., Cheschevik А.В., Gudkov V.G., Andreeva O.T., Novikova J.E., Orlova S.V., Zgyrovskaya A.A. Virus-induced dyslipidemias and problem of their antiviral chemotherapy // Antiviral Res.- 1993.- Vol.20, suppl.l.-P.177.

18. Amvrosieva T.V., Votyakov V.I., Vladyko G.V.,Andreeva O.T. On antiviral properties of some drugs and possible role of viruses in formation of cardiovascular diseases II Antiviral Res.- 1992,- Vol.17, suppl.l.- P.155.

19. Orlova S.V., Mishaeva N.P., Tarasenko A.B., Zgyrovskaya A.A., Amvrosieva T.V. Revealing of virus hepatitis A inhibitors among spasmolytic drugs // Antiviral Res.- 1993,- Vol.20, suppl.I.- P. 162.

20. Votyakov V.I., Amvrosieva T.V. On the role of viral agent in the induction of atherogenesis and approaches to antiviral therapy and prophylaxis of human • atherosclerosis IIYIII International congress of virology.- Berlin, 1990.- P.282.

21. Votyakov V.I., Amvrosieva T.V., Andreeva O.T., Serebryakova E.V., Samarina M.P., Virinskaya A.S. Disturbances of lipid metabolism as a link pathogenesis of certain virus infection // International symposium "100 years of virology".- St.Petersburg, 1992.- P.101.

22. Votyakov V.I., Amvrosieva T.V., Serebryakova E.V., Andreeva O.T., Samarina M.P., Cheschevik A.B., Chekina A.Y. Correction of herpes simplex virus-

23. Votyakov V.I., Amvrosieva J.V., Vladyko G.V., Andreeva O.T., Nikolaeva S.N., Mishaeva N.P. Trental as a wide-spectrum inhibitor of virus activity // Antiviral Res- 1993.-Vol.20, suppl.l.- P. 168.