Роль апоптоза и пролиферации клеток сосудистой стенки в атерогенезе

Восканьянц, Альбина Нерсесовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль апоптоза и пролиферации клеток сосудистой стенки в атерогенезе
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль апоптоза и пролиферации клеток сосудистой стенки в атерогенезе"

На правах рукописи

Восканьянц Альбина Нересовна

РОЛЬ АПОПТОЗА И ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК СОСУДИСТОЙ СТЕНКИ В АТЕРОГЕНЕЗЕ

03.00.25 — гистология, цитология, клеточная биология 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук.

Научные руководители: доктор медицинских наук,академик РАМН, профессор Нагорнев Владимир Анатольевич доктор медицинских наук, профессор Денисенко Александр Дорофеевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Белянин Владимир Леонидович доктор биологических наук, Рыбакина Елена Георгиевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И. П. Павлова»

.......2004 г. в « /У,

Защита состоится йС^Жк/СГ.ГЛГ^ЛуТ^.*.-........¿ШН Г. В «т/г » часов на

заседании диссертационного совета Д.001.022.02.при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адре-су:197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376. Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12.

Автореферат разослан

.2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Петрова Е. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1.Актуальность проблемы

В последнее десятилетие представления об атеросклерозе существенно трансформировались. Использование высоких технологий позволило проводить на клеточно-молекулярном уровне изучение процессов, происходящих в стенке артерий как органе-мишени, в котором реализуются проявления атеросклероза.

Среди огромного количества литературы по различным аспектам этиологии и патогенеза атеросклероза только в последнее время появились фундаментальные работы, в которых формирование атеросклеротических поражений артерий обсуждается с позиций развития иммунного воспаления [Hansson G. К., 1996; Libby Р., 2002; Xu Q., 2002; Климов А. Н. и др., 2003; Нагорнев В. А., Восканьянц А. Н., 2004]. В то же время именно с этих позиций, вероятно, можно построить единую концепцию патогенеза атеросклероза, оценивающую должным образом роль как модифицированных липо-протеидов низкой плотности (мЛПНП) и облигатных паразитов (Chlamydia pneumoniae, Cytomegalovirus), так и клеток сосудистой стенки в становлении и развитии атеросклеротических поражений артерий.

Центральным положением в возможной роли иммунитета в атероге-незе является определение природы антигенов и характера клеточных взаимодействий. В настоящее время обсуждается несколько ключевых положений, объясняющих начало развития иммунного воспаления при ате-рогенезе. К ним относятся: 1) образование мЛПНП, приобретающих аутоиммунные свойства [ Klimov A. N., 1991; Denisenko A. D. et al., 1996, 1999]; 2) иммунный ответ на мЛПНП и формирование аутоиммунного комплекса in situ в стенке артерий [Klimov A. N. и др., 1985; Климов А. Н., Денисенко А. Д., 1988; Денисенко А. Д., 1991; Климов А. Н., Нагорнев В. А., 1999]; 3) иммунный ответ на облигатных паразитов, проникающих в стенку артерий [Mahony J. В., Coombes В. К., 2001; Нагорнев В. А. и др., 2002; Лобзин Ю. В., Рудакова А. В., 2003]; 4) иммунный ответ на антигены сосудистого происхождения, образующиеся в процессе разрушения атеро-склеротических бляшек [Hansson G. К., 1996; Нагорнев В. А. и др., 2001]; 5) выделение факторов, сопровождающих развитие иммунного воспаления в стенке артерий: комплементарный комплекс (С5Ь-9), иммунорегулятор-ный сигнал (CD40-CD40L), пентраксины (С-реактивный белок, сывороточный амилоид Р), белки теплового шока (HSP60/65) [Назаров П. Г. и др., 1994; Stemme S., Hansson G. К., 1994; Mach F. et al., 1998; Нагорнев В. А., Кетлинский С. А., 1999; Xu Q., 2002].

Присутствие в стенке артерий в зоне формирования атеросклеротичес-ких поражений большого числа активированных негранулярных лейкоцитов (макрофагов, Т-лимфоцитов), экспрессирующих белки гистосовмести-мости II класса (HLA-DR, -DQ), прjвоспалительные цитокины, хемоаттрак-танты, стрессорные белки позволило

бляшку как стойкий очаг иммунного воспаления с саморегуляцией [Wick G., Xu Q., 1999; Hansson G. К., 2001; Климов А. Н. и др., 2003].

Начальное звено аутоиммунных реакций, протекающих в организме и сосудистой стенке при атеросклерозе, прежде всего связано с образованием мЛПНП под влиянием различных факторов. Эта проблема довольно широко и подробно изучена в отделе биохимии НИИЭМ РАМН под руководством А. Н. Климова [Klimov A. N., 1985,1991; Denisenko A. D. et al, 1985; Klimov A. N. etal., 1987; Денисенко А. Д., 1991]. В частности установлено, что концентрация аутоиммунных комплексов липопротеид-ан-титело в плазме больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в 10 раз выше, чем у здоровых лиц, а в интиме артерий с атеросклеротическими поражениями намного выше, чем в плазме крови [Климов А. Н. и др., 2003]. Иммунные комплексы мЛ ПНП-антитело связываются макрофагами в среднем на 49% активнее, чем свободные ЛПНП, а содержание эстерифициро-ванного холестерина в макрофагах, инкубированных с иммунным комплексом, примерно в 60 раз выше такового в клетках, инкубированных со свободными ЛПНП [Klimov A. N., 1985; Денисенко А. Д. и др., 1985].

Кроме того в настоящее время Chlamydia pneumoniae (ХЛП) также рассматривается как фактор риска развития атеросклероза на фоне образования мЛПНП и даже как одно из условий появления мЛПНП в стенке артерий. Установлено, что при титре в крови антител к ХЛП, равном 1:2561:512, риск обострения ИБС и развития острого инфаркта миокарда весьма высок [Лобзин Ю. В., Рудакова А. В., 2003]. Полученные в лаборатории атеросклероза им. Н. Н. Аничкова НИИЭМ РАМН в последние годы данные позволили рассматривать ХЛП как один из ведущих этиологических факторов развития атеросклероза. Хламидии в зоне атеросклеротиче-ских поражений артерий были обнаружены в 70% исследованных случаев [Нагорнев В. А. и др., 2004].

Таким образом, появление в стенке артерий мЛПНП и облигатных паразитов рассматривается как начальное звено иммунных реакций, характеризующих развитие воспаления in situ.

Как мЛПНП, так и облигатные паразиты активируют клетки гематогенного происхождения (моноциты/макрофаги, лимфоциты), мигрирующие в интиму артерий, и клетки местного происхождения (эндотелио-циты, звездчатые и гладкомышечные клетки), запуская каскад реакций, поддерживающих очаг воспаления в стенке артерий.

ции. Из Т-лимфоцитарной популяции 70% представлено CD4+ клетками, большинство из которых экспрессируют главный комплекс гистосовмес-тимости II класса (HLA-DR антиген), рецептор интерлейкина-2 (IL-2R) и интегрины [Hansson G. К., 1996]. Миграция Т-клеток в атеросклеротичес-кие поражения различной степени выраженности, их пролиферация in situ и экспрессия цитокинов рассматриваются как иммунный ответ на мЛ П Н П.

Присутствие Т-клеток и макрофагов в атеросклеротических бляшках делает возможным презентацию антигенов и иммунную активацию клеток сосудистой стенки, а в присутствии В-клеток, также и образование иммунных комплексов непосредственно в очагах атерогенеза [Климов А. Н., НагорневВ.А., 1996].

Из провоспалительных цитокинов в стенке артерий в наибольшем количестве определяются IL-lb и фактор некроза опухоли-а (TNF-a) [Libby et al., 1988;Clinton S. et al., 1992; Tipping P. G., Hancock W., 1993]. Причем экспрессия макрофагами TNF-a наблюдается уже на стадии адгезии и миграции клеток в субэндотелиальный слой интимы; выделена даже популяция макрофагов, экспрессирующих TNF-a и не участвующих в ске-венджер захвате мЛПНП [Nagornev V. A., Maltseva S. V., 1996].

Сходство клеточной популяции атеросклеротических поражений с клеточным составом тканей, в которых развивается иммунное воспаление, дает основание предположить, что атерогенез является хронической воспалительной реакцией, подобной реакции гиперчувствительности замедленного типа с саморегуляцией [Hansson G. К., 1993].

При изучении различных аспектов иммунного воспаления при атероге-незе остаются открытыми вопросы: 1. о цитотоксическом эффекте мЛПНП, т. е. захват макрофагами липопротеидов сопровождается только образованием пенистых клеток или мЛПНП могут вызывать апоптоз и/или некроз клеток сосудистой стенки; 2. о происхождении макрофагов, включающихся в реакции иммунного воспаления, т. е. возможности их пролиферации в стенке артерий. Поэтому комплексное изучение апоптоза и пролиферации клеток стенки артерий может существенно расширить представления о ме-ханизмах,поддерживающих иммунное воспаление при атерогенезе.

1.2. Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение цитотоксического эффекта мЛПНП и иммунных комплексов мЛПНП-антитело в опытах in vitro, а также исследование особенностей гибели клеток и их пролиферации в стенке артерий человека на фоне развития иммунного воспаления при атерогенезе.

Исходя из цели, определены задачи:

1. В опытах in vitro, используя нативные ЛПНП, в различной степени модифицированные ЛПНП и иммунные комплексы, включающие последние в качестве антигена, провести количественный анализ гибели клеток по типу апоптоза и некроза.

2. В динамике формирования атеросклеротических поражений артерий у человека осуществить анализ апоптоза клеток.

3. При атерогенезе у человека провести количественный и качественный анализ пролиферирующих клеток.

1.3. Научная новизна исследования

Комплексное цитохимическое и ультраструктурное исследование особенностей взаимодействия атерогенных липопротеидов с макрофагами и кинетики клеток стенки артерий при атерогенезе у человека позволило получить ряд новых данных, направленных на выяснение роли иммунного воспаления в патогенезе атеросклероза.

В настоящей работе впервые

- показано, что сильно перекисно модифицированные ЛПНГТ, при их инкубации с макрофагами вызывают апоптоз клеток; чем меньше выражена модификация ЛПНП, тем в меньшей степени проявляется их цито -токсический эффект на макрофаги;

- показано, что IgG, выделенный из иммунного комплекса мЛПНП-IgG, также оказывает цитотоксический эффект на макрофаги;

- установлено, что при атерогенезе наблюдается апоптоз эндотелио-цитов, мононуклеарных клеток и ГМК на всех стадиях процесса: наибольшее количество апоптозных телец отмечено в краевых отделах липидных бляшек и вокруг атеромы;

- показано, что апоптозу подвергаются преимущественно клетки не содержащие в цитоплазме липидных вакуолей;

- установлено, что наиболее высокий уровень пролиферации (45% всех присутствующих клеток) наблюдается в макроскопически неизмененных сегментах артерий («относительная норма»);

- в липидных пятнах количество мононуклеарных клеток в 2,5 раза выше, чем в макроскопически неизмененных сегментах артерий и составляет в среднем 73% от всех присутствующих клеток — 27% мононуклеа-ров от их общего количества — пролиферировали;

- установлено, что вокруг атеромы происходит пролиферация только мононуклеарных клеток;

- показано, что на всех стадиях атерогенеза пролиферация гладкомы-шечных клеток в среднем составляет 50% от общего количества гладко-мышечных клеток, присутствующих в интиме;

- установлено, что в фиброзных атеросклеротических бляшках индекс пролиферации клеток остается высоким и в зависимости от структуры бляшек преобладает пролиферация мононуклеарных или гладкомышечных клеток.

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы

Работа имеет теоретическое значение для расшифровки механизмов развития иммунного воспаления при атерогенезе. Полученные данные

показали, что перекисно модифицированные липопротеиды низкой плотности и иммунные комплексы, включающие их, откладываясь в стенке артерий, не только вызывают образование пенистых клеток, но и оказывают цитотоксический эффект, сопровождающийся апоптозом и некрозом клеток. В работе впервые показана интенсивная пролиферация мо-нонуклеарных клеток на всех стадиях атерогенеза, что указывает на источник образования пула клеток, включающихся в иммуновоспалительные реакции и не трансформирующихся в пенистые клетки.

Результаты данной работы могут быть использованы при изучении патогенеза атеросклероза и учитываться при разработке новых подходов к лечению этого заболевания, направленных на регуляцию кинетики клеток стенки артерий.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту.

Перекисно-модифицированные липопротеиды низкой плотности (мЛПНП) не только способствуют образованию пенистых клеток, но и вызывают массивный апоптоз макрофагов в опытах in vitro. Антитело (IgG) иммунного комплекса также оказывает цитотоксический эффект на макрофаги.

Минимально модифицированные ЛПНП (ммЛПНП) и иммунные комплексы, включающие последние, вызывают как апоптоз, так и некроз клеток в зависимости от степени модификации. Чем менее выражена модификация ЛПНП, тем меньше выражен цитотоксический эффект липо-протеидов для макрофагов.

При атерогенезе у человека наблюдается апоптоз эндотелиоцитов, мононуклеарных клеток и ГМК на всех стадиях формирования атероск-леротических поражений, причем апоптозу подвергаются клетки не содержащие в цитоплазме липидных вакуолей. С апоптотическими тельцами контактируют преимущественно макрофаги не трансформирующиеся в пенистые клетки. В то же время может наблюдаться разрушение макрофагов, фагоцитирующих апоптозные тельца.

Наиболее высокий уровень пролиферации происходит в макроскопически неизмененных сегментах атеросклеротически пораженных артерий («относительная норма»), В липидных пятнах и липидных атеро-склеротических бляшках происходит увеличение количества мононук-леарных клеток (макрофагов и лимфоцитов) по сравнению с «относительной нормой» более чем в 2 раза, при этом количество мононуклеаров превышает количество гладкомышечных клеток в 3 раза. В фиброзных атеросклероти-ческих бляшках процентное соотношение между мононуклеарными и глад-комышечными клетками примерно одинаковое.

В липидных пятнах и в липидных атеросклеротических бляшках проли-феративная активность мононуклеарных клеток в среднем составляет 30% от всех присутствующих в интиме мононуклеаров. В липидных и фиброз-

ных атеросклеротических бляшках индекс пролиферации клеток остается высоким и в зависимости от структуры бляшки преобладает пролиферация либо мононуклеарных, либо гладкомышечных клеток; вокруг атеромы происходит пролиферация только мононуклеарных клеток.

1.6. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (в 3 подглавах), материалы и методы, результаты исследования (в 3 подглавах), обсуждение полученных результатов и выводы. Библиографический список использованной литературы содержит 197 источников. Текс иллюстрирован 41 рисунком, преимущественно в виде блоков и 6 таблицами.

1.7. Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ в центральных журналах, рекомендованных ВАК. Материалы докладывались и обсуждались на заседании Президиума РАМН (Москва, 2000), на Международной конференции «Актуальные проблемы ангионеврологии. Мультифо-кальный атеросклероз, церебральная ишемия, инсульт» (Петрозаводск, 2002), на Международной конференции молодых ученых «Вченни Майбут-нього» (Одесса, 2002), на Пленарном заседании Санкт-Петербургской ассоциации патологоанатомов (Санкт-Петербург, 2002), на 7-ой (75) сессии Общего собрания РАМН (Москва, 2003), на конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2003).

Работа поддержана грантами РФФИ 00-04- 48487, 03-04-49484

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Общая характеристика использованного в работе материала

Исходя из цели и задач исследования, работа проводилась в двух направлениях: постановка опытов in vitro и исследование артерий человека с различными проявлениями атеросклеротических поражений.

В опытах in vitro были использованы первичные перитонеальные макрофаги мыши, липопротеиды низкой плотности в различной степени пе-рекисно-модифицированные и иммунные комплексы, включающие последние в качестве антигена (поставлено 6 серий опытов).

По второму разделу работы использовали аутопсийный (30 случаев) и биопсийный (15 случаев) материал. При аутопсийном отборе материала объектом исследования служили аорта и коронарные артерии, взятые у лиц, погибших от острой сердечно-сосудистой недостаточности и имевших клинические проявления коронарного атеросклероза в сочетании с гипертонической болезнью, во время проведения вскрытий в патологоа-

натомическом отделении Покровской больницы или Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им И. П. Павлова (средний возраст 62 г.).

Биопсийный материал представлял собой сегменты сонных артерий, полученных во время реконструктивных операций по поводу стенозирующего атеросклероза (средний возраст оперированных лиц составил 59 лет)*.

Для морфологического исследования брали макроскопически неизмененные участки артерий, которые принимали за «относительную норму», липидные пятна, липидные бляшки и фиброзные бляшки. В каждом ау-топсийном случае исследованию подвергали 4—5 сегментов аорты; при анализе биопсийного материала — 2-3 сегмента сонной артерии. В отдельных сегментах артерий, наряду с атеросклеротически-пораженным отделом, можно было выделить и участки без макроскопически видимых изменений.

2. 2. Методы, использованные для исследования атеросклеротических поражений артерий.

Для изучения апоптоза использовали иммуноцитохимический метод apoTACS-XL In Situ Apoptosis Detection Kit фирмы «R&D Systems» (Англия). Определение фрагментации ДНК — это широко распространенный метод анализа апоптоза: деструкция ДНК может быть выявлена методом гибридизации in situ с помощью включения метки с З'ОН конца, используя дезоксинуклеотидилтрансферазу ( 3'ends с TdT) с последующим обнаружением меченых клеток (связывание BrdU определяется анти-BrdU антителами). Такой метод исследования часто называется «TUNEL». Этот метод высокочувствителен и дает возможность выявлять апоптоз как в клеточных препаратах, так и в срезах формальдегид фиксированных тканей с заливкой в парафин, позволяя гистологически локализовать апопто-тические клетки. Учитывая, что состав набора рассчитан только на 30 проб, в работе были использованы 3 набора.

Для исследования пролиферации клеток использовали следующие методы:

1. Моноклональные мышиные антитела против ядерного антигена про-лиферирующих клеток [Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)], Clone:PC 10 («DAKO»), меченные пероксидазой хрена (HRP). Данные антитела реагируют с эпитопами ядерных антигенов в пролиферирующих клетках. Максимальная экспрессия PCNA происходит в клетках, находящихся в S-фазе. Использовали набор, позволяющий применять срезы формальдегид- фиксированных парафин-заключенных тканей.

2. Моноклональные мышиные анти-человеческие антитела к Ki-67 антигену (Ki-67 Antigen), Clon: Ki-67. («DAKO») серии М 7187, меченные

*3а любезное предоставление биопсийного материала приношу глубокую благодарность доктору медицинских наук Г. Ю. Сокуренко.

пероксидазой хрена (HRP). Данный иммуногистохимический метод также позволяет использовать фиксированные и парафин-заключенные ткани. Ki-67 ядерный белок экспрессируется в пролиферирующих клетках, находящихся в Gj, S, G2 и М фазах клеточного цикла.

Сопоставление двух вышеперечисленных методов показало, что применение PCNA-метода выявляет большее число меченных клеток, чем Ki-67-метод. Использование моноклональных антител Ki-67 не всегда давал стабильный положительный результат. Поэтому основной раздел работы с количественным анализом пролиферирующих клеток был выполнен с использованием моноклональных антител против PCNA.

При постановке иммуногистохимической реакции была использована система визуализации EPOS («DAKO»), «проявку» связанного антитела осуществляли хромогеном 3,3 диаминобензидином (ДАБ), докраску ядер не пролиферирующих клеток осуществляли метиловым зеленым.

В работе также был использован метод электронной микроскопии для изучения особенностей клеточной архитектоники атеросклеротических поражений различной степени выраженности. Основной задачей этого раздела работы было выявление клеток, находящихся на различных стадиях апоптоза, с последующим анализом особенностей клеточного повреждения.

Для электронной микроскопии использовали только биопсийный материал. Извлеченные сегменты артерий промывали в среде 199 и помещали в 2% раствор глютаральдегида на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4) при комнатной температуре. Подготовку материала для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) осуществляли по методике, разработанной в лаборатории атеросклероза им. Н. Н. Аничкова [Нагорнев В. А. и др., 1982].

При морфометрическом исследовании в каждом случае подсчету подвергали 100 клеток при X 500 в микроскопе «Opton», не используя морфо-метрическую сетку, численность изучаемых клеточных форм выражали в процентах. Отдельно подсчитывали количество пролиферирующих клеток в интиме макроскопически неизмененных сегментов артерий, липид-ных пятнах, липидных атеросклеротических бляшках (краевой и центральный отделы — отдельно), фиброзных бляшках. Значимость различий между изучаемыми выборками определяли с помощью t-критерия Стьюдента. С учетом того, что после иммуногистохимической окраски можно выявить два пула клеток: веретенообразновытянутые, среди которых преобладают ГМК, и округлой формы, среди которых присутствуют как макрофаги, так и лимфоциты, эти клетки были обозначены как мононуклеарные. Для нас наибольший интерес представляли именно мононуклеары, поскольку данные клетки в первую очередь являются отражением клеточных реакций, характеризующих развитие иммунного воспаления.

2. 3. Анализ цитотоксического эффекта липопротеидов низкой плотности

В опытах in vitro в культуре перитонеальных макрофагов изучали ци-топатогенный эффект ЛПНП с разными условиями перекисной модификации. Было проведено 6 серий экспериментов*.

ЛПНП (d= 1.025-1.055 г/мл) выделяли из донорской крови с помощью последовательного ультрацентрифугирования. Перекисную модификацию ЛПНП проводили путем инкубации в течение 18 ч при 37° С в присутствии CuSO4 для получения мЛПНП в концентрации 10 мкМ и минимально модифицированных ЛПНП (ммЛПНП) в концентрации 1 мкМ.

Аутоантитела к мЛПНП выделяли из сыворотки крови больных ИБС с помощью аффинной хроматографии на колонке с CNBr-сефарозой 4BCL, к которой были пришиты модифицированные МДА ЛПНП человека. Основным классом иммуноглобулинов в выделенных аутоантите-лах был IgG. Иммунные комплексы ЛПНП-антитело (молярное отношение 4:1) готовили добавлением к мЛПНП и ммЛПНП аффинно выделенных аутоантител.

Перитонеальные макрофаги получали от беспородных белых мышей-самцов по методике разработанной в отделе биохимии. Клетки культивировали в чашках Петри на покровных стеклах в среде Игла, содержащей 5 мг/мл белков сыворотки крови человека, лишенной липопротеидов, с добавлением свободных нЛПНП, мЛПНП и ммЛПНП (50 мкг белка/мл), в комплексе с аутоантителами или с добавлением только аутоантител (15 мкг/мл).

Цитотоксический эффект ЛПНП оценивали визуально, после обработки клеток белком Annexin-V в комбинации с Propidium iodide (PI). Применяли «Apoptest-FITC Kit» («Dako», Дания). Метод основан на способности связывания Annexin-V с фосфатидилсерином, который в клетках, гибнущих по типу апоптоза, локализуется на поверхности клеточной мембраны. Локализация фосфатидилсерина на поверхности мембраны клеток наблюдается, начиная с ранней стадии апоптоза и до полного распада клетки, т.е. характеризует все стадии апоптоза. Annexin-V, конъюгирован-ный с флюорохромом (FITC), связывался с апоптотическими клетками, тогда как PI выявлял некротизированные клетки.

После инкубации из чашек Петри с монослоем перитонеальных макрофагов удаляли инкубационную среду, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, далее на нефиксированную клеточную культуру наносили реагент, включающий 1 мкл белка Annexin-V (конъюгированный с флюорохромом FITC), 10 мкл PI и связывающий буфер («Annexin-V Binding Buffer», входящий в состав набора). Инкубацию с реагентом проводили в

*3а оказание помощи при проведении этого раздела работы приношу глубокую благодарность сотруднику отдела биохимии канд. биол. наук А. Г. Виноградову.

полной темноте в течение 15 минут. После промывки в связывающем буфере покровные стекла с культурой клеток монтировали на предметные стекла и сразу же подвергали исследованию.

Кроме того макрофаги каждой пробы окрашивали также на общие липиды красителем Oil Red, после предварительной фиксации 4% забу-ференным раствором параформальдегида, для оценки степени накопления липидов в макрофагах и их трансформации в пенистые клетки. Эта окраска позволила определить количественное соотношение нормальных макрофагов и пенистых клеток.

Подсчет апоптотических или некротических клеток в каждом из вариантов опытов проводили в люминесцентном микроскопе при X 400 в 10 полях зрения, а пенистых клеток — в микроскопе «Opton» при X 400 в 10 полях зрения.

В работе были поставлены следующие серии опытов:

1 серия — инкубация макрофагов с сильно перекисно-модифициро-ванными ЛПНП(мЛПНП); два контроля — инкубация клеток с нЛПНП и содержание клеток в безлипопротеиновой среде.

2 серия — инкубация макрофагов с мЛПНП и иммунным комплексом, содержащим мЛПНП (мЛПНП + IgG); в качестве контроля использовали IgG, выделенный из иммунного комплекса.

3 серия — инкубация макрофагов с минимально модифицированными ЛПНП (ммЛПНП), и иммунным комплексом, содержащим ммЛПНП (ммЛПНП+IgG), причем в данной серии опытов использовали слабую минимальную перекисную модификацию; в качестве контроля использовали нЛПНП и IgG, с которыми также инкубировали мышиные макрофаги.

4 серия — инкубация макрофагов с ммЛПНП, иммунным комплексом, содержащим ммЛПНП (ммЛПНП+IgG), IgG; в качестве контроля инкубировали клетки в диализате, против которого диализовали IgG после хроматографии, и в безлипопротеиновой среде.

5 серия — инкубация макрофагов с ммЛПНП, иммунным комплексом, содержащим ммЛПНП (ммЛПНП+IgG) и IgG; в качестве контроля инкубировали клетки с нЛПНП и в безлипопротеиновой среде.

6 серия — аналогичная 5 серии: инкубация макрофагов с ммЛПНП, иммунным комплексом, содержащим ммЛПНП (ммЛПНП + IgG), и IgG.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Морфологический анализ цитотоксического эффекта липопротеидов низкой плотности и иммунных комплексов, включающих последние, в опытах in vitro.

Несмотря на большое количество данных, показывающих роль мЛПНП в развитии атеросклероза, оставался до конца не изученным цитотоксичес-кий эффект таких модифицированных ЛПНП, а отсюда и их вклад в фор-

мирование очага иммунного воспаления в стенке артерий при атерогенезе. С этой целью в работе в опытах in vitro с использованием мЛПНП и иммунных комплексов мЛПНП-IgG был исследован цитотоксический эффект последних с анализом гибели клеток по пути апоптоза или некроза.

В первой серии опытов при инкубации макрофагов с сильно перекис-но модифицированными липопротеидами низкой плотности (мЛПНП) уже через 12 ч. опыта около 30%, а через 48 ч. — 91,5% макрофагов трансформировались в пенистые клетки. Эти результаты соответствуют ранее опубликованным данным о способности мЛПНП индуцировать накопление липидов в макрофагах (скевенджер-захват) и формирование пенистых клеток, составляющих основу атеросклеротических бляшек. Новым оказалось то, что при инкубации макрофагов с сильно модифицированными Л ПНП через 48 ч. опыта практически все клетки подвержены апоп-тозу, т. е. такие ЛПНП обладают резко выраженной цитотоксичностью для «скевенджер» клеток.

Во второй серии опытов, наряду с мЛПНП, использовали иммунный комплекс (мЛПНП+IgG) и в качестве контроля IgG, изолированный из иммунных комплексов ЛПНП-антитело. В этой серии опытов при инкубации макрофагов с мЛПНП получили данные близкие к вышеописанным: через 24 ч. опыта 50% клеток подвергаются апоптозу, а через 48 ч. — наблюдали апоптоз практически всех клеток. Иные результаты были получены в опытах с инкубацией макрофагов с мЛПНП+IgG. В этом опыте 94% клеток уже к концу первых суток инкубации с иммунным комплексом разрушались по типу некроза или находились в состоянии позднего апоптоза.

Неожиданный, ранее не известный феномен, был обнаружен в опыте с инкубацией макрофагов с IgG, выделенным из иммунного комплекса. Оказалось, что такие антитела также цитотоксичны для макрофагов и через 24 ч и 48 ч. опыта клетки частично разрушаются по типу апоптоза или некроза. Поэтому не исключено, что IgG также оказывают цитотоксичес-кий эффект на макрофаги.

Учитывая то, что в вышеприведенных 2х сериях опытов из-за выраженного цитотоксического эффекта мЛПНП и мЛПНП+IgG наблюдалась 100% гибель клеток, в последующих сериях опытов использовали различные варианты минимально перекисно модифицированных ЛПНП (ммЛПНП). Постановка таких опытов была также важна и с учетом данных литературы, в которых показано, что ЛПНП, инфильтрирующие сосудистую стенку, подвергаются минимальной модификации уже на стадии их прохождения через эндотелиальный клеточный барьер, т. е. в начальных стадиях атерогенеза. Поэтому представляло интерес выяснение вопроса — являются ли такие ммЛПНП цитотоксичными для клеток сосудистой стенки и в первую очередь для макрофагов, скапливающихся в субэндотелиальном слое в местах отложения ЛПНП. Исходя из этого, в последующих сериях опытов in vitro использовали ммЛПНП разной сте-

пени модификации, которую анализировали по особенностям трансформации макрофагов в пенистые клетки.

В третьей серии опытов использовали ЛПНП с самыми минимальными условиями модификации. Во всех вариантах данной серии опытов не наблюдали образования пенистых клеток, лишь в отдельных макрофагах отмечали появление липидных вакуолей при окраске препаратов oil red О. Результаты опытов показали, что при самой минимальной модификации ЛПНП, а в равной степени и при использовании иммунных комплексов, включающих данные ммЛПНП гибель клеток по типу апоптоза и некроза составляет не более 10-13% и статистически не отличается от данных, полученных в опыте с использованием нативных ЛПНП, т. е. указанная реакция может рассматриваться как «фоновая». С другой стороны, представленные данные являются еще одним подтверждением того, что, чем менее изменены ЛПНП, тем в меньшей степени они приобретают цитотоксические свойства.

Основной задачей четвертой серии опытов была проверка ранее выявленного цитотоксического эффекта IgG, входящего в иммунный комплекс. С этой целью был поставлен дополнительный контроль с диализатом, в котором находился IgG. Отсутствие гибели клеток, инкубированных с диализатом, как впрочем и с безлипопротеиновой сывороткой, указывает на то, что цитотоксический эффект IgG связан только со свойствами антитела, выделенного из иммунного комплекса ммЛПНП+IgG.

В пятой и шестой сериях опытов использовали ммЛПНП, при которых наблюдали трансформацию макрофагов в пенистые клетки. Результаты опытов показали, что через 48 ч. инкубации можно выделить от 10 до 42% ( в зависимости от условий модификации ЛПНП) апоптотических клеток и от 35 до 54% некротизированных макрофагов. В случаях использования иммунных комплексов с теми же условиями модификации ЛПНП, число апоптотических клеток возрастало от 17 до 50% от общей клеточной популяции; еще в большей степени увеличивалось количество некротизиро-ванных клеток (60—80%). При инкубации макрофагов с IgG в течение 48 ч. было выявлено от 8 до 36% апоптотических клеток.

Кроме того в шестой серии опытов был поставлен дополнительный эксперимент с целью выяснения степени участия скевенджер-захвата ммЛПНП в цитотоксическом эффекте. Макрофаги инкубировали в течение 6 ч. с ммЛПНП, использованными в данной серии опытов, затем отмывали и содержали в безлипопротеиновой среде, т. е. клетки контактировали с ммЛПНП только в течение 6 часов. Эффект оказался таким же как в опыте с инкубацией макрофагов в течение 48 ч. с ммЛПНП. Даже при коротком сроке инкубации в 38,5±8% наблюдали апоптоз и в 36,7%±2,9% некроз клеток.

В целом, результаты шести проведенных серий опытов показали, что модифицированные ЛПНП и иммунные комплексы, включающие послед-

ние, оказывают выраженный цитотоксический эффект на макрофаги, причем больший процент клеток разрушается по типу апоптоза. Выраженность цитотоксического эффекта зависит от степени модификации ЛПНП. Еще в большей степени этот эффект проявляется в опытах с использованием иммунных комплексов, включающих ЛПНП. Цитотоксич-ностью обладают также антитела (IgG), выделенные из иммунного комплекса. Это явление требует дальнейшего всестороннего анализа.

Хотя эти данные были получены в опытах in vitro, нельзя исключить, что и в стенке артерий, при определенных условиях, вследствие сильного перекисного окисления ЛПНП могут образовываться мЛПНП с таким выраженным цитотоксическим эффектом. Учитывая, что уже в процессе прохождения ЛПНП через эндотелиальный клеточный барьер ЛПНП подвергаются минимальной модификации [Kovanen P. Т., 1990], образование сильно модифицированных ЛПНП в интиме артерий можно рассматривать как реальное событие.

3. 2. Морфологический анализ апоптоза клеток при атерогенезе у человека.

Несмотря на то, что в литературе имеется большое количество косвенных фактов, указывающих на апоптоз клеток стенки артерий при атеро-генезе, в нашей стране эта проблема не изучалась. В данном разделе работе, опираясь на результаты, полученные в опытах in vitro, было осуществлено ультраструктурное и иммуногистохимическое изучение возможности и особенностей апоптоза клеток стенки артерий с различной степенью выраженности атеросклеротических поражений.

При ультраструктурном анализе липидных пятен и атеросклеротичес-ких бляшек можно было выделить общие закономерности, связанные с трансформацией макрофагов и отчасти гладкомышечных клеток в пенистые клетки. Эта особенность атерогенеза известна и рассматривается как один из основных моментов формирования бляшек. В то же время нами было обращено внимание на то, что не все макрофаги в липидных пятнах и бляшках трансформируются в пенистые клетки, хотя и находятся среди последних, или в зоне атероматозного распада. То, что не вся популяция макрофагов, мигрирующих в сосудистую стенку при атерогенезе у человека, трансформируется в пенистые клетки в местах скопления мЛПНП, было показано в ранее проведенных в лаборатории атеросклероза исследованиях [Nagornev V. A, Maltseva S. V., 1996]. В цитоплазме таких клеток, не содержащих липиды, или содержащих только отдельные липидные вакуоли, в первую очередь отмечали дистрофические изменения митохондрий.

Эти изменения проявлялись в исчезновении крист и просветлении матрикса без гипертрофии неизмененных митохондрий. Еще в большей степени данный процесс происходил в макрофагах, содержащих в цитоплазме лишь единичные липидные вакуоли. В таких клетках, наряду с

исчезновением крист и просветлением матрикса, отмечали разрушение наружной мембраны митохондрий и распад последних. Параллельно в этих же клетках наблюдали конденсацию ядерного хроматина и частичное разрушение ядерной оболочки. В то время как в пенистых клетках, цитоплазма которых была полностью заполнена липидными вакуолями, структура ядра оставалась не измененной.

В литературе приведены сведения о роли митохондрий в индукции апоптотической клеточной смерти [Liu X. et al., 1996]. Нарушение регуляции функционирования митохондриальных ионных и/или водных каналов, в следствие изменения активности белков Bclx, Bcl2 приводит к блокаде прохождения ионов через внутреннюю митохондриальную мембрану и нарушению объема митохондрий. Ингибирование Вс1-активности сопровождается изменением мембранной проницаемости митохондрий, приводящей к выходу цитохрома С в цитозоль [Kluck R. M. et al., 1997]. Таким образом, отмеченные в нашей работе дистрофические изменения митохондрий, в первую очередь в макрофагах, полностью согласуются с данной концепцией. Причем эти изменения мы наблюдали на фоне полного «благополучия» других органелл клеток и ядра.

Выход цитохрома С в цитозоль, как один из начальных этапов апопто-за, является определяющим фактором для запуска механизма активации каспаз. В дополнение к реализации цитохрома С, в литературе обсуждается альтернативный путь, но опять же связанный с митохондриями. Этот путь связан с реализацией других освобождающихся в процессе разрушения митохондрий белков [Zamzami N. et al., 1996]. Наблюдаемые в нашей работе изменения митохондрий клеток могут запускать оба из приведенных путей активации каспаз, а следовательно запускать апоптоз. Поэтому обнаружение вокруг пенистых клеток макрофагов с дистрофическими изменениями митохондрий указывает на последующую гибель данных клеток через апоптоз, а значит и приход в эти зоны фагоцитарных макрофагов и активацию экспрессии данными клетками провоспалительных цитокинов. Ряд авторов также рассматривают морфологические изменения митохондрий как начальные необратимые проявления апоптоза [Petit Р. X. et al., 1995; Zamzami N. et al., 1995].

В процессе развития иммунного воспаления в стенке артерий контакт макрофагов и Т-лимфоцитов сопровождается экспрессией провоспали-тельных цитокинов [Нагорнев В. А. и др., 2001]. При этом активированные макрофаги продуцируют большое количество TNF-a и реализуют его в 10 раз больше, чем резидентные макрофаги [Vassalli P., 1992]. Как известно, TNF-a принимает активное участие в активации каспаз и инициации апоптотической клеточной смерти, что также может рассматриваться как одно из условий апоптоза клеток при атерогенезе.

В различных отделах липидных пятен и атеросклеротических бляшек среди пенистых клеток и особенно в зоне атероматозных масс наблюдали

апоптоз клеток (с образованием апоптозных телец) как макрофагального, так и гладкомышечного происхождения. При этом в клетках, подверженных апоптозу, не отмечали образования липидных вакуолей и их трансформации в пенистые клетки.

В липидных пятнах и бляшках (вокруг атероматозного ядра) можно было наблюдать контакт макрофагов и даже пенистых клеток с апоптотически-ми клетками, но в основном все же с последними контактируют макрофаги не содержащие в цитоплазме липидные вакуоли. Фагоцитоз макрофагами апоптотических телец, по-видимому, не всегда приводит к «очищению» ткани и в отдельных случаях может сопровождаться разрушением клетки, вероятно, при захвате большого числа апоптотических тел.

В отличие от клеток, разрушающихся по типу апоптоза, в пенистых клетках, как отмечено выше, не наблюдается конденсация ядерного хроматина и не столь отчетливо выражены дистрофические изменения митохондрий, несмотря на скопление в цитоплазме большого количества липидов. Такие клетки подвергаются некрозу с разрушением плазматической (макрофаги) или базальной (гладкомышечные клетки) мембраны клетки с выходом в экс-трацеллюлярное пространство липидов, составляющих основу формирующейся атеромы. Таким образом, апоптозу преимущественно подвергаются клетки, в цитоплазме которых отсутствуют липидные включения или последние представлены в незначительном количестве.

Данные электронной микроскопии по выявлению клеток, разрушающихся по типу апоптоза, нашли подтверждение и при иммуноцитохими-ческом исследовании атеросклеротических поражений артерий с использованием TUNEL-метода.

Апоптотические клетки (TUNEL-позитивные) выявляли в различных отделах липидных пятен и атеросклеротических бляшек. В отличие от электронной микроскопии, использование иммуногистохимического метода, хотя и чувствительного, не позволяет определить природу апоптотической клетки (кроме эндотелия). Поэтому можно говорить только о присутствии TUNEL- позитивных клеток в тех или иных отделах атеросклеротически пораженной артерии.

В липидных пятнах и бляшках прежде всего можно было наблюдать апоптоз отдельных эндотелиоцитов. Однако TUNEL-позитивные эндо-телиоциты выявляются редко. Вероятно, это связано с тем, что эндотели-оциты, как клетки барьерной ткани, при гибели слущиваются (смываются в ток крови). В большем количестве апоптотические клетки выявляли в поверхностных и глубоких отделах атеросклеротических бляшек и в меньшем количестве в липидных пятнах.

В липидных пятнах отдельные апоптотические клетки были локализованы в субэндотелиальном слое и в центральных отделах в окружении пенистых клеток. В краевых отделах липидных пятен на границе с неизмененной интимой апоптотические клетки практически не обнаруживали.

В липидных атеросклеротических бляшках апоптотические клетки выявляли как вокруг атеромы, так и среди (в окружении) пенистых клеток. Клетки, содержащие в цитоплазме липидные вакуоли и трансформирующиеся в пенистые клетки, не давали TUNEL-позитивной окраски. Отдельные апоптотические клетки были также локализованы под атеромами на границе со средней оболочкой. Наибольшую концентрацию апоптотичес-ких клеток наблюдали в краевых отделах бляшек, причем, TUNEL-позитив-ную реакцию преимущественно отмечали в гладкомышечных клетках, что согласуется с данными приведенными L Hegyi et al. [1996].

Основной причиной апоптоза клеток при атерогенезе по нашим данным (опыты in vitro) являются мЛПНП и клеточные реакции, сопровождающие развитие иммунного воспаления, а учитывая то, что в основе развития иммунного воспаления и клеточных реакций его сопровождающих при атерогенезе лежат мЛПНП, то последние можно рассматривать как ключевой фактор, запускающий апоптоз клеток.

Апоптоз тесно связан с пролиферацией клеток, нередко являясь стимулом последней и оба эти процесса входят в общее понятие «иммунное воспаление». Факторы развития иммунного воспаления — митогенные факторы роста и цитокины могут индуцировать как апоптоз, так и пролиферацию клеток в зависимости от концентрации. Например, апоптоти-ческая клеточная смерть гладкомышечных клеток положительно коррелирует с их репликацией. В частности, больше апоптотических клеток было выделено среди пролиферирующих ГМК, чем среди не пролифери-рующих гладкомышечных клеток [Bennett M. R. et al., 1998]. Таким образом, морфологический анализ пролиферации клеток в стенке артерий имеет также важное значение, как и апоптоз, в изучении механизмов развития иммунного воспаления при атерогенезе.

3. 3. Особенности пролиферации клеток при атерогенезе

В данной работе впервые предпринята попытка количественного им-муногистохимического анализа популяции пролиферирующих клеток, составляющих основу формирующихся атеросклеротических поражений артерий. Причем полученные сведения не представляется возможным сопоставить с данными литературы, т. к. последние отсутствуют. В литературе имеются лишь отдельные высказывания подтверждающие возможность пролиферации моноцитов/макрофагов в очагах атерогенеза. Но, с другой стороны, поддерживается точка зрения, что в начальных стадиях атерогенеза апоптозу подвержены пролиферирующие клетки [Polunovsky V. A. et al., 1994; Hasdai D. et al., 1997].

В интиме макроскопически неизмененных сегментов артерий, отдаленных от атеросклеротических поражений, преобладают ГМК, количество которых в 2 раза превышает количество мононуклеарных клеток (рис. 1), причем около 50% ГМК участвует в пролиферации (рис. 2). Однако при

этом следует учитывать, что в данных случаях речь идет о стенке неизмененных сегментов артерий на фоне прогрессирующего атеросклероза, что, конечно, отличает данный материал от истинной «нормы». Оценивать пролиферацию клеток в данной возрастной группе (средний возраст 61 год) в стенке артерий при полном отсутствии атеросклеротических поражений не представляется возможным, т. к в этой возрастной группе не реально получить аорты или коронарные артерии без проявлений атеросклероза.

В липидных пятнах и липидных атеросклеротических бляшках происходит увеличение количества мононуклеарных клеток более чем в 2 раза по сравнению с зоной относительной нормы и превышает количество глад-комышечных клеток в 3 раза (рис. 1). Тогда как в фиброзных атеросклеротических бляшках количество мононуклеарных и гладкомышечных клеток примерно одинаковое.

Несмотря на то, что в липидных пятнах процентное соотношение между мононуклеарными и гладкомышечными клетками меняется в пользу первых, т. е. мононуклеарных клеток в 3 раза больше, чем гладкомышеч-ных клеток, индекс пролиферации активированных гладкомышечных клеток остается высоким и составляет 59% от общего количества гладкомышечных клеток, присутствующих в липидных пятнах (рис. 2). Пролиферация данных клеток происходит преимущественно в краевых отделах липидных пятен и в глубине — на границе со средней оболочкой.

Рис. 2. Индекс пролиферации клеток в интиме артерий человека при атеросклерозе По оси абсцисс: обозначения те же, что и на рис. 1. По оси ординат: количество пролиферирующих клеток (мононуклеаров и ГМК) от общего количества клеток того же типа (в %)

К сказанному следует добавить, что в липидных пятнах происходит не только интенсивное очаговое скопление моноцитов/макрофагов и лимфоцитов, но и их пролиферация в субэндотелиальном слое. Хотя индекс пролиферации мононуклеаров в липидных пятнах несколько ниже, чем в зоне относительной нормы, но за счет значительного увеличения количества данных клеток (мигрирующих из тока крови и пролиферирующих) в интиме пул клеток с положительной РСКЛ-реакцией существенно отличается от нормы. Таким образом, в липидных пятнах происходит увеличение числа мононуклеарных клеток как за счет их миграции из тока крови, так и за счет пролиферации.

Пролиферирующие (РСКЛ-положительные) мононуклеарные клетки определяли в различных отделах липидных бляшек — как в поверхностных, так и в глубоких отделах, особенно в краевых зонах. РСКЛ-положительную реакцию дают только клетки не трансформирующиеся в пенистые.

Детальное описание локализации в атеросклеротических бляшках мононуклеарных пролиферирующих клеток сделано не случайно. Эта особенность морфогенеза атеросклероза ранее в литературе не была описана. При этом так же обращает на себя внимание то обстоятельство, что вокруг атером происходит пролиферация только мононуклеарных клеток при отсутствии положительной РСКЛ-реакции в ГМК.

Что касается гладкомышечных клеток, то в липидных бляшках количество этих клеток остается примерно на том же уровне, что и в липидных пятнах, при этом процент пролиферирующих клеток в среднем составляет около 50% от присутствующих гладкомышечных клеток. Пролифери-рующие ГМК расположены как в поверхностных, так и глубоких отделах

бляшек. Даже в глубине бляшек вокруг зоны атероматозного распада интимы и в местах образования кристаллов холестерина можно выделить пролиферирующие гладкомышечные клетки. Особенно интенсивно пролиферация ГМК происходит в краевых отделах бляшек на границе с ли-пидными пятнами.

Количество клеток, присутствующих в фиброзных атеросклеротичес-ких бляшках зависит от строения последних: в бляшках с рыхлой соединительнотканной покрышкой клеток больше, чем в бляшках, имеющих плотную фиброзную ткать. Это нашло отражение и при количественном анализе пролиферации клеток в фиброзных бляшках.

Относительное количество мононуклеарных клеток в фиброзных бляшках, по сравнению с липидными бляшками, значительно меньше, но индекс их пролиферации примерно на том же уровне как и в липидных бляшках (рис. 1, 2). Причем в основном пролиферацию мононуклеаров наблюдали в поверхностном отделе бляшек среди рыхлой соединительной ткани, что, вероятно, относится к клеткам, мигрирующими в субэн-дотелиальный слой из тока крови. В бляшках с плотной фиброзной покрышкой PCNA-положительные мононуклеарные клетки выделяли в единичном количестве только в глубине бляшек.

Иная картина была отмечена в фиброзных бляшках при анализе количества ГМК и уровня их пролиферации. В целом, как количество ГМК, так и индекс их пролиферации возрастают по сравнению с липидными бляшками и достигают примерно того уровня, который был отмечен в макроскопически неизмененных участках стенки артерий (относительная норма). Опять же такую картину наблюдали только в зоне образования рыхлой соединительной ткани. Возможно это относится к липидно-фиб-розным атеросклеротическим бляшкам, но при иммуногистохимической окраске препаратов дифференцировать бляшки на липидно-фиброзные и фиброзные не представляется возможным.

Таким образом, в атеросклеротических бляшках не происходит повышение индекса пролиферации клеток по сравнению с липидными пятнами, хотя последний остается достаточно высоким и около 30% клеток, присутствующих в бляшках, включаются в деление. Миграция мононук-леарных клеток из тока крови в атеросклеротические бляшки, их пролиферация, а также и пролиферация ГМК, определяют клеточно-структур-ную архитектонику очагов атеросклеротических поражений артерий.

В целом, наибольший индекс пролиферации клеток был отмечен в макроскопически неизмененных сегментах артерий. Это указывает на то, что при атеросклерозе во всех сегментах стенки артерий клетки находятся в активированном состоянии и «готовы» к пролиферации и участию в образовании бляшек, нужны только дополнительные факторы, например, гемо-динамические или какие-либо другие. В липидных пятнах, т. е. начальных стадиях проявления атерогенеза, индекс пролиферации также остается вы-

соким, что и способствует их трансформации в бляшки. Таким образом, высокий индекс пролиферации клеток наблюдается на тех стадиях процесса, когда в стенке артерий формируются очаги иммунного воспаления.

Подводя итог проделанной работе можно отметить, что мЛПНП, откладывающиеся в стенке артерий, вызывают как апоптоз клеток, так и стимулируют их пролиферацию, оба эти процесса взаимосвязаны и являются звеньями реакций, характеризующих развитие иммунного воспаления при атерогенезе.

ВЫВОДЫ

1. Перекисно-модифицированные липопротеиды низкой плотности человека обладают цитотоксичностью по отношению к перитонеальным макрофагам мыши, выраженность и характер которой зависит от степени модификации липопротеидной частицы. Минимально модифицированные липопротеиды низкой плотности вызывают гибель клеток путем индукции как апоптоза, так и некроза, в равной степени. Сильно модифицированные липопротеиды низкой плотности индуцируют, главным образом, апоптоз макрофагов, причем после 48 часов инкубации признаки апоптоза наблюдаются у всех инкубированных клеток.

2. В артериях человека наблюдается апоптоз эндотелиальных, моно-нуклеарных (макрофагов, лимфоцитов) и гладкомышечных клеток на всех стадиях формирования атеросклеротических поражений, причем апоптозу подвергаются клетки, не содержащие в цитоплазме липидные вакуоли.

3. В атеросклеротических поражениях с апоптотическими телами контактируют макрофаги, не трансформирующиеся в пенистые клетки. В некоторых случаях наблюдается гибель макрофагов, фагоцитирующих апоптотические тела.

4. Наиболее высокий уровень пролиферативной активности клеток наблюдается в интиме макроскопически неизмененных участков атеро-склеротически пораженных артерий.

5. В липидных пятнах и липидных атеросклеротических бляшках происходит увеличение количества мононуклеарных клеток по сравнению с зоной относительной нормы более чем в 2 раза и превышает количество гладкомышечных клеток в 3 раза. В фиброзных атеросклеротических бляшках процентное соотношение между мононуклеарными и гладкомы-шечными клетками примерно одинаковое.

6. В липидных пятнах общая пролиферативная активность мононук-леарных клеток выше, чем гладкомышечных клеток.

7. В липидных и фиброзных атеросклеротических бляшках индекс пролиферации клеток остается высоким и в зависимости от структуры бляш-. ки преобладает пролиферация либо мононуклеарных, либо гладкомышеч-ных клеток; вокруг атеромы происходит пролиферация только мононук-леарных клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нагорнев ВА., Мальцева СВ., Пигаревский П.В., Восканьнц А.Н., Яковлева О.А., Суворов А.Н., Дмитриев А.В. Роль Chlamydia pneumoniae в патогенезе атеросклероза // Медицинский академический журнал. — 2002. — Т.2. — № 4. — с. 18-28.

2. Нагорнев ВА, Пигаревский П.В., Восканьянц А.Н., Яковлева ОА., Мальцева С В. Современные взгляды на проблему патогенеза атеросклероза с позиции инфекционной патологии // Вестник РАМН. — 2002. — № 12. — с. 9-15.

3. Нагорнев ВА., Восканьянц А.Н., Виноградов А.Г., Жданова О.Ю., Денисенко А.Д. Цитотоксический эффект липопротеидов низкой плотности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2003. — Т. 135. — № 1. — с. 107-109.

4. Нагорнев ВА., Мальцева СВ., Восканьянц А.Н. Эволюция взглядов на роль макрофагов в атерогенезе от Н.Н. Аничкова до наших дней // Архив патологии. - 2003. - Т.65. - № 2. - с. 8-12.

5. Нагорнев В.А., Восканьянц А.Н. Апоптоз и его роль в атерогенезе // Медицинский академический журнал. — 2003. — Т.З. — № 4. — с. 3-19.

6. Нагорнев ВА., Мальцева СВ., Селиверстова В.Г., Сокуренко Г.Ю., Воскань-янц А.Н. Chlamydia pneumoniae как патогенетический фактор риска в развитии атеросклероза и его осложнений //Архив патологии. — 2004. — Т.66. — № 2. — с. 52-59.

7. Нагорнев В.А., Восканьянц А.Н. Атерогенез как иммуновоспалительный процесс // Вестник РАМН. - 2004. - № 7. - с. 3-11.

8. Восканьянц А.Н., Нагорнев В.А. Пролиферация клеток стенки артерий человека при атерогенезе как фактор проявления иммунного воспаления // Цито-кины и воспаление. — 2004. — Т.З. — № 4. — с. 15-19.

#22196

РНБ Русский фонд

2005-4 22943

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Восканьянц, Альбина Нерсесовна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Роль апоптоза и пролиферации клеток сосудистой стенки в атерогенезе.13 •

1.1. Атеросклероз как иммунное воспаление.

1.1.1.Клеточно-молекулярные механизмы начальной стадии атерогенеза с позиций иммунного воспаления.

1.1.2. Медиаторы воспаления и адгезия лейкоцитов на эндотелии.

1.1.3. Взаимоотношения макрофагов и лимфоцитов в атеросклеротических поражениях артерий.

1.1.4. Цитокины и факторы роста, регулирующие кинетику клеток в сосудистой стенке.

1.2. Апоптоз и его роль в атерогенезе.

1.2.1. Физиология и патофизиология апоптоза.

1.2.2. Морфология и идентификация апоптоза.

1.2.3. Роль апоптоза в развитии сердечно-сосудистой патологии.

1.2.4. Модифицированные липопротеиды как фактор, вызывающий апоптоз при атерогенезе.

1.2.5. Иммунное воспаление как фактор, вызывающий апоптоз при атерогенезе.

1.3. Пролиферация клеток стенки артерий при атерогенезе.

1.3.1. Особенности пролиферации клеток стенки аорты кроликов при экспериментальном атеросклерозе.

1.3.2. Пролиферация клеток интимы артерий при атеросклерозе у человека.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Общая характеристика использованного материала.

2.2. Методы, использованные для исследования атеросклеротических поражений артерий.

2.3. Анализ цитотоксического эффекта липопротеидов низкой плотности.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Морфологический анализ цитотоксического эффекта липопротеидов низкой плотности и иммунных комплексов, включающих последние, в опытах in vitro.

3.2. Морфологический анализ апоптоза клеток при атерогенезе у человека.

3.3. Особенности пролиферации клеток при атерогенезе.

Глава 4. Обсуждение результатов исследования.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль апоптоза и пролиферации клеток сосудистой стенки в атерогенезе"

Актуальность темы. В последнее десятилетие представления об атеросклерозе существенно трансформировались. Использование высоких технологий позволило проводить на клеточно-молекулярном уровне изучение процессов, происходящих в стенке артерий как органе-мишени, в котором реализуются проявления атеросклероза.

Среди огромного количества литературы по различным аспектам этиологии и патогенеза атеросклероза только в последнее время появились фундаментальные работы, в которых формирование атеросклеротических поражений артерий обсуждается с позиций развития иммунного воспаления [Hansson G. К., 1996; Libby Р., 2002; Xu Q., 2002; Климов А. Н. и др., 2003; Нагорнев В. А., Восканьянц А. Н., 2004]. В то же время именно с этих позиций, вероятно, можно построить единую концепцию патогенеза атеросклероза, оценивающую должным образом роль как модифицированных липопротеидов низкой плотности (мЛПНП) и облигатных паразитов (<Chlamydia pneumoniae, Cytomegalovirus), так и клеток сосудистой стенки в становлении и развитии атеросклеротических поражений артерий.

Центральным положением в возможной роли иммунитета в атерогенезе является определение природы антигенов и характера клеточных взаимодействий. В настоящее время обсуждается несколько ключевых положений, объясняющих начало развития иммунного воспаления при атерогенезе. К ним относятся: 1) образование мЛПНП, приобретающих аутоиммунные свойства [ Klimov A. N., 1991; Denisenko A. D. et al., 1996, 1999]; 2) иммунный ответ на мЛПНП и формирование аутоиммунного комплекса in situ в стенке артерий [Klimov А. N. и др., 1985; Климов А. Н., Денисенко А. Д., 1988; Денисенко А. Д., 1991; Климов А. Н., Нагорнев В. А., 1999]; 3) иммунный ответ на облигатных паразитов (антигены вирусной и липидной природы), проникающих в стенку артерий [Mahony J. В., Coombes В. К., 2001; Нагорнев В. А. и др., 2002; Лобзин Ю. В., Рудакова А. В., 2003]; 4) иммунный ответ на антигены сосудистого происхождения, образующиеся в процессе разрушения атеросклеротических бляшек [Hansson G. К., 1996; Нагорнев В. А. и др., 2001]; 5) выделение факторов, сопровождающих развитие иммунного воспаления в стенке артерий и вызывающих повреждение эндотелия на фоне образования мЛПНП: комплементарный комплекс (С5Ь-9), иммунорегуляторный сигнал (CD40-CD40L), пентраксины (С-реактивнй белок, сывороточный амилоид Р), белки теплового шока (HSP60/65) [Назаров П. Г. и др., 1994; Stemme S., Hansson G. К., 1994; Mach F. et al., 1998; Нагорнев В. А., Кетлинский С. A., 1999; Xu Q., 2002].

Некоторые из перечисленных антигенов, вероятно, выполняют протекторную функцию, тогда как другие могут играть ведущую роль в начальной фазе процесса, в первую очередь это мЛПНП. Присутствие в стенке артерий в зоне формирования атеросклеротических поражений большого числа активированных негранулярных лейкоцитов (макрофагов, Т-лимфоцитов), экспрессирующих белки гистосовместимости II класса, провоспалительные цитокины, хемоаттрактанты, стрессорные белки позволило рассматривать атеросклеротическую бляшку как стойкий очаг иммунного воспаления с саморегуляцией [Wick G., Xu Q., 1999; Hansson G. К., 2001; Климов A. H. и др., 2003].

Начальное звено аутоиммунных реакций, протекающих в организме и сосудистой стенке при атеросклерозе, прежде всего связано с образованием мЛПНП под влиянием различных факторов. Эта проблема довольно широко и подробно изучена в отделе биохимии НИИЭМ РАМН под руководством А. Н. Климова [Klimov A. N., 1985, 1991; Denisenko A. D. et al., 1985; Klimov А. N. et al., 1987; Денисенко А. Д., 1991]. В частности установлено, что концентрация аутоиммунных комплексов липопротеид-антитело в плазме больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в 10 раз выше, чем у здоровых лиц, а в стенке артерий намного выше, чем в крови [Климов А. Н. и др., 2003]. Иммунные комплексы мЛПНП-антитело связываются с макрофагами на 49% активнее и эфиров холестерина в них в 60 раз больше, чем в клетках, инкубированных со свободными ЛПНП, что приводит к быстрой трансформации макрофагов в пенистые клетки и их разрушению [Klimov A. N., 1985; Денисенко А. Д. и др., 1985].

Кроме того в настоящее время Chlamydia pneumoniae (ХЛП) также рассматривается как фактор риска развития атеросклероза на фоне образования мЛПНП и даже как одно из условий появления мЛПНП в стенке артерий. Установлено, что при титре антител к ХЛП в крови, равном 1:256 - 1:512, риск обострения ИБС и развития острого инфаркта миокарда весьма высок [Лобзин Ю. В., Рудакова А. В., 2003]. Полученные в лаборатории атеросклероза им. Н. Н. Аничкова НИИЭМ РАМН в последние годы данные позволили рассматривать ХЛП как один из ведущих этиологических факторов развития атеросклероза. Хламидии в зоне атеросклеротических поражений артерий были обнаружены в 70% исследованных случаев [Нагорнев В. А. и др., 2004].

Таким образом, появление в стенке артерий мЛПНП и облигатных паразитов рассматривается как начальное звено аутоиммунных реакций, характеризующих развитие иммунного воспаления in situ.

Как мЛПНП, так и облигатные паразиты активируют клетки гематогенного происхождения (моноциты/макрофаги, лимфоциты), мигрирующие в интиму артерий, и клетки местного происхождения (эндотелиоциты, звездчатые и гладкомышечные клетки), запуская каскад реакций, поддерживающих очаг воспаления в стенке артерий.

Другим важным фактором, позволившим рассматривать атерогенез, как проявление иммунного воспаления явились данные, показывающие, что, наряду с моноцитами/макрофагами, в сосудистую стенку мигрируют в большом количестве Т-лимфоциты. Анализ атеросклеротических поражений аорты людей молодого и пожилого возраста показал, что в зоне начальных поражений независимо от возраста Т-лимфоциты преобладают над макрофагами [Xu Q., et al., 1990], а в атеросклеротических бляшках составляют около 20% от общей клеточной популяции. Из Т-лимфоцитарной популяции 70% представлено CD4+ клетками, большинство из которых экспрессируют МНС HLA-DR антиген, рецептор интерлейкина-2 (IL-2R) и интегрины [Hansson G. К., 1996]. Миграция Т-клеток в атеросклеротические поражения различной степени выраженности, их пролиферация in situ и экспрессия цитокинов рассматриваются как иммунный ответ на мЛПНП.

Присутствие Т-клеток и моноцитпроисходящих макрофагов в атеросклеротических бляшках делает возможным презентацию антигенов и иммунную активацию клеток сосудистой стенки, а в присутствии В-клеток, также и образование иммунных комплексов непосредственно в очагах атерогенеза [Климов А. Н., Нагорнев В. А., 1996].

Из провоспалительных цитокинов в стенке артерий в наибольшем количестве определяются IL-ip и фактор некроза опухоли-а (TNF-а) [Libby et al., 1988;Clinton S. et al., 1992; Tipping P. G., Hancock W., 1993]. Причем экспрессия макрофагами TNF-a наблюдается уже на стадии адгезии и миграции клеток в субэндотелиальный слой интимы; выделена даже популяция макрофагов, экспрессирующих TNF-a и не участвующих в скевенджер захвате мЛПНП [Nagornev V. A., Malseva S. V., 1996].

При изучении различных аспектов иммунного воспаления при атерогенезе. остаются открытыми вопросы: 1. о цитотоксическом эффекте мЛПНП, т. е. захват макрофагами липопротеидов сопровождается только образованием пенистых клеток или мЛПНП могут вызывать апоптоз и/или некроз клеток сосудистой стенки; 2. о происхождении макрофагов, включающихся в реакции иммунного воспаления, т.е. возможности их пролиферации в стенке артерий. Поэтому комплексное изучение апоптоза и пролиферации клеток стенки артерий может существенно расширить представления о механизмах, поддерживающих иммунное воспаление при атерогенезе.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение цитотоксического эффекта мЛПНП и иммунных комплексов мЛПНП-антитело в опытах in vitro, а также исследование особенностей гибели клеток и их пролиферации в стенке артерий человека на фоне развития иммунного воспаления при атерогенезе.

Исходя из цели, определены задачи:

1. В опытах in vitro, используя нативные ЛПНП, различной степени модификации ЛПНП и иммунные комплексы, включающие последние в качестве антигена, провести количественный анализ гибели клеток по типу апоптоза и некроза.

3. При атерогенезе у человека провести количественный и качественный анализ пролиферирующих клеток

Основные положения, выносимые на защиту.

Перекисно-модифицированные липопротеиды низкой плотности (мЛПНП), и иммунные комплексы, включающие последние, не только способствуют образованию пенистых клеток, но и вызывают массивный апоптоз макрофагов в опытах in vitro. Антитело (IgG) иммунного комплекса также оказывает цитотоксический эффект на макрофаги.

При атерогенезе у человека наблюдается апоптоз эндотелиоцитов, мононуклеарных клеток и ГМК на всех стадиях формирования атеросклеротических поражений, причем апоптозу подвергаются клетки, не содержащие в цитоплазме липидные вакуоли. С апоптотическими тельцами контактируют преимущественно макрофаги не трансформирующиеся в пенистые клетки. В то же время наблюдали разрушение макрофагов, фагоцитирующих апоптозные тельца.

Наиболее высокий уровень пролиферации происходит в макроскопически неизмененных участках атеросклеротически пораженных артерий. В липидных пятнах и липидных атеросклеротических бляшках происходит увеличение мононуклеарных клеток (макрофагов и лимфоцитов) по сравнению с «относительной нормой» более чем в 2 раза и превышает количество гладкомышечных клеток в 3 раза. В фиброзных атеросклеротических бляшках процентное соотношение между мононуклеарными и гладкомышечными клетками примерно одинаковое

В липидных пятнах пролиферативная активность мононуклеарных клеток выше, чем гладкомышечных клеток. В липидных и фиброзных атеросклеротических бляшках индекс пролиферации клеток остается высоким, и в зависимости от строения бляшки преобладает пролиферация либо мононуклеарных, либо гладкомышечных клеток; вокруг атеромы происходит пролиферация только мононуклеарных клеток.

Научная новизна. Комплексное цитохимическое и ультраструктурное исследование особенностей взаимодействия атерогенных липопротеидов с макрофагами и кинетики клеток стенки артерий при атерогенезе у человека позволило получить ряд новых данных, направленных на выяснение роли иммунного воспаления в патогенезе атеросклероза.

В настоящей работе впервые: - показано, что сильно модифицированные ЛПНП и иммунные комплексы, включающие последние, при их инкубации с макрофагами вызывают апоптоз клеток; чем меньше выражена модификация ЛПНП, тем в меньшем объеме проявляется их цитотоксический эффект на макрофаги;

- установлено, что при атерогенезе наблюдается апоптоз эндотелиоцитов, мононуклеарных клеток и ГМК на всех стадиях процесса: наибольшее количество апоптозных телец отмечено в краевых отделах липидных бляшек и вокруг атеромы;

- показано, что апоптозу подвергаются преимущественно клетки не содержащие в цитоплазме липидные вакуоли;

- осуществлен количественный иммуногистохимический анализ популяции пролиферирующих клеток, составляющих основу атеросклеротических поражений артерий;

- в липидных пятнах число мононуклеарных клеток в 2,5 раза выше, чем в макроскопически неизмененных сегментах артерий и составляет в среднем 73% от всех присутствующих клеток - 57% клеток дают положительную РСЫА-реакцию.; установлено, что вокруг атеромы происходит пролиферация только мононуклеарных клеток - при отсутствии положительной РСЫА-реакции в ГМК;

- показано, что в липидных и фиброзных атеросклеротических бляшках пролиферация ГМК возрастает по сравнению с липидными пятнами;

- установлено, что в фиброзных бляшках процент мононуклеарных клеток по отношению к общему количеству клеток снижается, по сравнению с последними в липидных пятнах, но индекс их пролиферации остается на том же уровне.

Теоретическая и практическая значимость работы. Работа имеет теоретическое значение для расшифровки механизмов развития иммунного воспаления при атерогенезе. Полученные данные показали, что модифицированные липопротеиды низкой плотности и иммунные комплексы, включающие их, откладываясь в стенке артерий, не только вызывают образование пенистых клеток, но и оказывают цитотоксический эффект, сопровождающийся апоптозом и некрозом клеток. В работе впервые показана интенсивная пролиферация мононуклеарных клеток на всех стадиях атерогенеза, что указывает на источник образования пула клеток, включающихся в иммуновоспалительные реакции и не трансформирующихся в пенистые клетки.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ в центральных журналах, рекомендованных ВАК. Материалы диссертации доложены на заседании Президиума РАМН (Москва, 2000), на Международной конференции «Актуальные проблемы ангионеврологии. Мультифокальный атеросклероз, церебральная ишемия, инсульт» (Петрозаводск, 2002), на Международной конференции молодых ученых «Вчени Майбутнього» (Одесса, 2002), на Пленарном заседании Санкт-Петербургской ассоциации патологоанатомов (Санкт-Петербург, 2002), на 7-ой (75 ) сессии Общего собрания РАМН (Москва, 2003), на конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2003).

Работа поддержана грантами РФФИ 00-04-48487, 03-04-49484

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Восканьянц, Альбина Нерсесовна

ВЫВОДЫ

2. В артериях человека наблюдается апоптоз эндотелиальных, мононуклеарных (макрофагов, лимфоцитов) и гладкомышечных клеток на всех стадиях формирования атеросклеротических поражений, причем апоптозу подвергаются клетки, не содержащие в цитоплазме липидные вакуоли.

4. Наиболее высокий уровень пролиферативной активности клеток наблюдается в интиме макроскопически неизмененных участков атеросклеротически пораженных артерий.

5. В липидных пятнах и липидных атеросклеротических бляшках происходит увеличение количества мононуклеарных клеток, по сравнению с участками относительной нормы, более чем в 2 раза и превышает количество гладкомышечных клеток в 3 раза. В фиброзных атеросклеротических бляшках процентное соотношение между мононуклеарными и гладкомышечными клетками примерно одинаковое.

6. В липидных пятнах общая пролиферативная активность мононуклеарных клеток выше, чем гладкомышечных клеток.

7. В липидных и фиброзных атеросклеротических бляшках индекс пролиферации клеток остается высоким и в зависимости от структуры бляшки преобладает пролиферация либо мононуклеарных, либо гладкомышечных клеток; вокруг атеромы происходит пролиферация только мононуклеарных клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Восканьянц, Альбина Нерсесовна, Санкт-Петербург

1. Анестиади В. X., Нагорнев В. А. Морфогенез атеросклероза. Кишинев. «Штиинца». 1982. - Т. 1. -335с.

2. Денисенко А. Д. Роль аутоиммунных комплексов липопротеид-антитело в обмене липидов и в атерогенезе //Автореф. дис. д-ра мед. наук. Л. 1991. - 42 с.

3. Денисенко А. Д. Способ определения аутоиммунных комплексов липопротеид-антитело // Авторское свидетельство № 1527592, от 8. VIII. 1989.

4. Климов А. Н., Денисенко А. Д. О роли иммунных комплексов липопротеид-антитело в атерогенезе // Успехи, совр. биологии. 1988. - Т. 196. - № 2(5). - С. 279289.

5. Климов А. Н. Нагорнев В. А. О необычном пути выведения клеткой синтезированного белка // Бюлл. экспер. биол. 1996. - № 9. - С. 268-270.

6. Климов А. Н., Нагорнев В. А. Взгляд на решение проблемы атеросклероза. // Росс. Мед. Вестник. 1999. - № 4. - С. 31-36.

7. Климов А. Н., Никульчева Н. Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Санкт-Петербург. «Питер». 1999. - 504с.

8. Климов А. Н., Нагорнев В. А., Денисенко А. Д., Константинов В. О. Аутоиммунная теория патогенеза атеросклероза и новые пути его лечения // Вестн. РАМН. 2003. - № 12. - С. 29-34.

9. Лобзин Ю. В., Рудакова А. В. Роль инфекционно-воспалительного фактора в развитии атеросклероза // Мед. Акад. Ж. 2003. - Т. 3. - № 2. - С. 80-89.

10. Нагорнев В. А. Атерогенез и иммунное воспаление // Арх. пат. 1995. - № 3. -С. 6-14.

11. Нагорнев В. А. Атерогенез и иммунное воспаление //Бюл. экспер. биол. -1996.-№ 7.-С. 4-8.

12. Нагорнев В. А., Бабушкина Т. Г. Гисторадиоавтографический количественный нализ особенностей пролиферации клеток стенки аорты кроликов при экспериментальном атеросклерозе // Бюл. экспер. биол. 1987. - № 1. - С. 104-106.

13. Нагорнев В. А., Кетлинский С. А. Клеточно-молекулярные механизмы становления и развития атерогенеза: CD40-CD40L иммунорегуляторный сигнал // Бюл. экспер. биол. 1999. - № 10. - С. 364-371.

14. Нагорнев В. А., Восканьянц А. Н. Атерогенез как иммуновоспалительный процесс // Вестник РАМН. 2004. - №. 7. - С. 3-10.

15. Нагорнев В. А., Анестиади В. X., Зота Е. Г. Атерогенез и иммунное воспаление. Кишинев: "Tipogr. Centrala". 1997. -223с.

16. Нагорнев В. А., Анестиади В. X., Зота Е. Г. Атерогенез. Кишинев-Санкт-Петербург:

17. Tipogr. Centrala". 2001. - 332с (а).

18. Нагорнев В. А., Яковлева О. А., Рабинович В. С. Атерогенез и воспаление // Мед. акад. ж. 2001. - Т. 1. - № 1. - С. 36-43 (б).

19. Нагорнев В. А., Бобрышев Ю. В., Попов А. В., Виноградов А. Г. Транспорт ß-липопротеидов через эндотелий при экспериментальной гиперхолестеринемии (электронно-радиографическое исследование) // Арх. пат. 1982. - № 1. С. 10-17.

20. Нагорнев В. А., Назаров П. Г, Полевщиков А. В. и др. Атерогенез и реакция «острой фазы» печени // Арх. пат. 1998. - Т. 60. - №6. - С. 62-68.

21. Нагорнев В. А., Мальцева С.В., Пигаревский П.В. и др. Роль Chlamydia pneumoniaeв патогенезе атеросклероза // Мед. акад. ж. 2002. - Т. 2, - № 4. - С. 18-28 (а).

22. Нагорнев В. А., Пигаревский П. В., Восканьянц А. Н. и др. Современные взгляды на проблему патогенеза атеросклероза с позиций инфекционной патологии // Вестник РАМН. 2002. - № 12. - С. 9-15 (б).

23. Нагорнев В. А., Восканьянц А. Н., Жданова О. Ю. и др. Цитотоксический эффект липопротеидов низкой плотности // Бюл. экспер. биол. — 2003. № 1. — С, 107-109.

24. Нагорнев В. А., Мальцева С. В., Селиверстова В. Г. и др. Chlamydia pneumoniae как патогенетический фактор риска в развитии атеросклероза и его осложнений // Арх. пат. 2004. - Т. 66. - № 2. - С. 52-59.

25. Назаров П. Г., Берестовая Л. К., Полевщиков А. В. Значение взаимодействия Среактивного белка и липопротеидов плазмы для пролиферации лимфоцитов // Иммунология. 1994. - №4. - С. 15-17.

26. Огурцов Р. П., Пигаревский П. В., Попов В. Г. Показатели сенсибилизации к атерогенным липопротеидам у больных различными формами ишемической болезни сердца // В кн.: Иммунология атеросклероза и ишемической болезни сердца. Томск. 1985.-С. 34-36.

27. Пигаревский П. В., Нагорнев В. А. Функциональная морфология лимфатическихузлов и селезенки при атерогенезе // Арх. пат. 1995. - Т. - 57. - №3. - С. 44-49.

28. Упоров А. В. Активность пролиферации и ядрышковых организаторов клеток рака молочной железы как показатель биологического поведения опухоли // Автореф. канд. дисс. С-Петербург. 1998.

29. Саркисов Д. С. Очерки истории общей патологии. М. «Медицина». -1993.-509с.

30. Серов В. В. Воспаление, иммунитет, гиперчувствительность // Арх. пат. -1983,-№ 11. С. 3-14.

31. Серов В. В. Иммунологические и иммунопатологические аспекты воспаления // Воспаление / Под редакцией В.В. Серова и B.C. Паукова. М. «Медицина». 1995. -С.219-261.

32. Струков А. И. Механизмы иммунного воспаления // Вестник РАМН. 1979. -№ 11.-С. 76-85.

33. Alderson L. М., Endemann G., Lindsey S. et al. LDL enhances monocyte adhesion to endothelial cells in vitro // Am. J. Pathol. 1986. - Vol. 123. - P. 334-342.

34. Alderson M. R., Armitage T. W., Tough L. et al. CD40 expression by human monocytes: regulation by cytokines and activation of monocytes by the ligand for CD40 // J. Exp. Med. 1993. - Vol. 178. - P. 669-674.

35. AInemri E. S., Livingston D. J., Nicholson D. W. et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature // Cell. 1996. - Vol. 87. - P. 171-176.

36. Bauriedel G., Schluckebier S., Hutter R. et al. Apoptosis in restenosis versus stable-angina atherosclerosis: implications for the pathogenesis of restenosis // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1995. - Vol. 18.-P. 1132-1139.

37. Bennett M. R., Boyle J.J. Apoptosis of vascular smooth muscle cells in atherosclerosis // Atherosclerosis. 1998. - Vol. 138. - P. 3-9.

38. Bennett M. R., Evan G. I., Schwartz S. M. Apoptosis of human vascular smooth muscle cells derived from normal vessels and coronary atherosclerotic plaques // J. Clin. Invest. 1995. - Vol. 95. - P. 2266-2274 (a).

39. Bennett M. R., Gibson D. F., Schwartz S. M., Tait J. F. Binding and phagocytosis of phosphatidylserine // Circ. Res. 1995. - Vol. 77. - P. 1136-1142 (6).

40. Bennett M. R., Littlewood T. D., Schwartz S. M., Weissberg P. L. Increased sensitivety of human vascular smooth muscle cells from atherosclerotic plaques to p53-mediatedapoptosis//Circ. Res.- 1997.-Vol. 81.-P. 591-599.

41. Bennett M. R., Macdonald K., Chan S. W. et al. Cell surface trafficking of Fas: a rapid mechanism of p53 mediated apoptosis // Science. 1998. - Vol. 282. - P. 290-293.

42. Bergess R. R., Furuya Y., Remington L. et al. Cell proliferation, DNA repair, and P53function are not required for programmed death of prostatic grandular cells induced byandrogen ablation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - P. 8910-8914.

43. Bevilacqua M. P. Endothelial leukocyte adhesion molecules // Annu. Rev.1.munol. 1993.-Vol. 11. - P.767-804.

44. Bochaton-Piallat M. L., Gabbiani F., Redard M. et al. Apoptosis participates in cellularity regulation during rat aortic intimal thickening // Am. J. Pathol. 1997. - Vol. 146.-P. 1059-1064.

45. Brown S. B., Savill J. Phagocytosis triggers macrophage release of Fas ligand and induces apoptosis of bystander leukocytes // J. Immunol. — 1999. Vol. 162. - P. 480-485.

46. Cai W., Devaux B., Schaper W., Schaper J. The role of Fas/APO 1 and apoptosis in the development of human atherosclerotic lesions // Atherosclerosis. — 1997. — Vol. 131.— P. 177-186.

47. Campbell J. H., Reardon M. F., Kondounas S. et al. Influence of smooth muscle phenotype on lipid accumulation // Atherosclerosis. 1986. - Vol. 8. - P. 399-402.

48. Candipan R.C., Wang B.Y., Butrago R. et al. Regression or progression -dependency on vascular nitric oxide // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1996. - Vol. 16. - P. 44—50.

49. Catchpoole D. R., Stewart B. W. Inhibition of topoisomerase II by aurintricarboxylic acid: implication for mechanisms of apoptosis // Anticancer Res. 1994. -Vol. 14.-P. 853-856.

50. Cathcart M. K., Morel D. W., Chisolm G. M. Monocytes and neutrophils oxidise low density lipoprotein making it cytotoxic // J. Leukocyte Biol. 1985. - Vol. 38. - P. 341-350.

51. Cho A, Courtman D., and Langille L. Apoptosis (programmed cell death) in arteries of the neonatal lamb//Circ. Res. 1995.-Vol. 76.-P. 168-175.

52. Clinton S.K., Libby P. Cytokines and growth factor in atherogenesis // Arch. Pathol. Lab. Med.-1992.-Vol. 116.-P. 1292-1300.

53. Clinton S. K., Fleet J. C., Loppnow H. et al. Interleukin-1 gene expression in rabbit vascular tissue in vivo//Am. J. Pathol. 1991.-Vol. 138.-P. 1005-1014.

54. Clinton S. K., Underwood R., Hayes L. et al. Macrophage colony-stimulating factor gene expression in vascular cells and in experimental arid human atherosclerosis. // Am. J. Pathol. 1992. - Vol. 140. - P. 301-316.

55. Darley-Usmar V., Wiseman H., Halliwell B. Nitric oxide and oxygen radicals: a question of balance//FEBS Lett. 1995.-Vol. 369. - P. 131-135.

56. Daugherty A., Roselaar S. E. Lipoprotein oxidation as a mediator of atherogenesis: insights from pharmacological studies // Cardiovasc. Res. 1995. - Vol. 29. - P. 297311.

57. Denisenko A. D., Vinogradov A. G., Popov A. V. et al. Catabolism of immune complexes lipoprotein-antibody // Advances in Lipid and Atherosclerosis Research, Diagnostics, and Treatment. Dresden. 1985. - Vol. 1. - P. 25-28.

58. Denisenko A. D., Makovejchuk E. G., Vinigradov A. G. et al. Autoantibidies against oxidized low density lipoproteins and lipoprotein-antibidy autoimmune complexes in human atherosclerosis // Eur. J. Lab. Med. 1996. - Vol. 4. - P. 85-90.

59. Dimmeler S., Haeneler J., Sause A., Zeiher A. M. Nitric oxide inhibits APO-l/Fas-mediated cell death // Cell Growth Differ. 1998. - Vol. 9. - P. 415-422.

60. Earnshaw W. C. Nuclear change in apoptosis // Curr. Opin. Cell. Biol. 1995. -Vol. 7.-P. 337-343.

61. Eastman A., Barry M. A. The origins of DNA breaks a consequence of DNA damage, DNA repair, or apoptosis? // Cancer Invest. 1992. - Vol. 10. - P. 229-240.

62. Emeson E. E., Robertson A. L. T-lymphocytes in aortic and coronary intimas. Their potential role in atherogenesis. // Am. J. Pathol. 1988. - Vol. 130 - P. 369-376.

63. Fadok V. A., Savill J. S., Haslett C. et al. Different populations of macrophages use either the vitronectin receptor or the phosphatidylserine receptor to recognize and remove apoptotic cells // J. Immunol. 1992. - Vol. 149. - P. 4029-4035.

64. Frostegard J. Atherosclerosis an autoimmune disease? // Lakartidningen. - 1993. -Vol. 90. - P. 2739-2740.

65. Fyfe A. I., Quiao J. H., Lusis A. J. Immuno-deficient mice develop typical atherosclerotic fatty streak when fed an atherogenic diet // J. Clin. Invest. 1994. - Vol. 94.-P. 2516-2520.

66. Galle J., Schneider R., Heinloth A. et al. Lp(a) and LDL induce apoptosis in human endothelial cells and in rabbit aorta: role of oxidative stress // Kidney Int. 1999. - Vol. 55.-P. 1450-1461.

67. Geng Y. J., Libby P. Evidence for apoptosis in advanced human atheroma: colocalization with interleukin-1 beta-converting enzyme // Am. J. Pathol. 1995. - Vol. 147.-P. 251-266.

68. Geng Y. J., Henderson L. E., Levesque E. B. et al. Fas is expressed in human atherosclerotic intima and promotes apoptosis of cytokine-primed human vascular smooth muscle cells // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. - Vol. 17. - P. 2200-2208.

69. Gerrity R. G., Antonov A. S., Munn D. H. et al. The macrophage in human and experimental atherosclerosis // Atherosclerosis X / Eds. by F. P. Woodford, J. Davingnon and A. Sniderman. "Elsevier Sci. B. V". 1995. - P. 577-581

70. Gimbrone M. A., Kume Jr. N., Cybulsky M. I. Vascular endothelial dysfunction and the pathogenesis of atherosclerosis // Atheroscler. Rev. 1993. - Vol. 25. - P. 1-9.

71. Goldstein J. L., Brown M. S. The low-density lipoprotein pathway and its relation to atherosclerosis // Ann. Rew. Biochem. 1977. - Vol. 46. - P. 897-930.

72. Gordon D., Reidy M., Benditt E. et al. Cell proliferation in human coronary arteries // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 4600-4604.

73. Green D. R., Beere H. M. Gone but not forgotten // Nature. 2000. -Vol. 405. - P. 28- 29.

74. Grunwald J., Fingler J., Hammerle H. et al. Cytocontractile structures and proteins of smooth muscle cells during the formation of experimental lesions // Exp. Mol. Pathol. -1987.-Vol. 46.-P. 78-88.

75. Han D. K., Haudenschild C. C., Hong M. K. et al. Evidence for apoptosis in human atherogenesis and in a rat vascular injury model // Am. J. Pathol. 1995. - Vol. 147. - P. 267-277.

76. Hansson G. K. Immune and inflammatory mechanisms in the development of atherosclerosis // Br. Heart. J. 1993. - Vol. 69, Suppl. 1. - P. 3 8-41.

77. Hansson G. K. Immune response in atherosclerosis. Immune functions of the vessel wall / Eds. G. K. Hansson, P. Libby. "Harwood Acad. Publ". 1996. - P. 143-157.

78. Hansson G. K. Immune mechanisms in atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2001. - Vol. 21. - P. 1876-1890.

79. Hansson G. K., Holm J. Interferon-y inhibits arterial stenosis after injury // Circulation. 1991. - Vol. 84. - P. 1266-1272.

80. Hansson G. K., and Stemme S. Immunity, inflammation, and the role of T lymphocytes in atherosclerosis. Atherosclerosis X / Eds. by F. P. Woodford, J. Davignon and A. Sniderman. "Elsevier Sci. B. V". 1995. - P. 61-65.

81. Hansson G. K., Jonasson L., Holm J. et al. Gamma interferon regulates vascular smooth muscle proliferation and la expression in vivo and in vitro // Circ. Research. -1988.-Vol. 69.-P. 712-718.

82. Hardwick S. J., Hegyi L,, Clare K. et al. Apoptosis in human monocyte-macrophages exposed to oxidized low density lipoprotein // J. Pathol. 1996. - Vol. 179. -P. 294-302.

83. Hasdai D., Scheinnowitz M., Leibovitz E. et al. Increased concentrations of serum interleukin-ip in patients with coronary artery disease // Heart. 1996. - Vol. 76. - P. 2428.

84. Hasdai D., Barak V., Leibovitz E. et al. Elevated serum levels of basic fibroblast growth factor in patients with ischemic heart disease // Int. J. Cardiol. 1997. - Vol. 59. -P. 133-138.

85. Hasdai D., Sangiorgi G., Spagnoli L. G. et al. Coronary artery apoptosis in experimental hypercholesterolemia// Atherosclerosis. 1999. - Vol. 142. - P. 317-325.

86. Haunstetter A., Izumo S. Apoptosis. Basic mechanisms and implications for cardiovascular disease // Circ. Res. 1998. - Vol. 82. - P. 1111-1129.

87. Hegyi L., Skepper J. N., Cary N. R., Mitchinson M. Foam cell apoptosis and the development of the lipid core of human atherosclerosis // J. Pathol. 1996. - Vol. 180. - P. 423-429.

88. Heinloth A., Heermeier K., Raff U. et al. Stimulation of NADPH oxidase by oxidized LDL induces proliferation of human vascular endothelial cells // J. Am. Soc. Nephrol.-2000.-Vol. 11.-P. 1819-1825.

89. Heinloth A., Brune B., Fischer B., Galle J. Nitric oxide prevents oxidized LDL-induced p53 accumulation, cytochrom c translocation, and apoptosis in macrophages via guanylate cyclase stimulation //Atherosclerosis. 2002. - Vol. 162. - P. 93-101.

90. Hughes H., Matthews B., Lenz M. L., Guyton J. R. Cytotoxicity of oxidized LDL to porcine aortic smooth muscle cells is associated with the oxysterol 7-keto-cholesterol and 7-hydroxycholesterol // Arterioscl. Thromb. 1994. - Vol. 14. - P. 1177-1185.

91. Ikeda U., Oguchi A., Okada et al. Involvement of LDL receptor in the prolifaration of vascular smooth muscle cells // Atherosclerosis. 1994. - Vol. 110. - P. 87-94.

92. Imanishi T., Han D., Hofstra L. et al. Apoptosis of vascular smooth muscle cells is induced by Fas ligand derived from monocytes/macrophage // Atherosclerosis. — 2002. — Vol. 161.-P. 143-151.

93. Isner J. M., Kearney M., Bortman S., Passeri J. Apoptosis in human atherosclerosis and restenosis // Circulation. 1995. - Vol. 91. - P. 2703-2711.

94. Itoh N., Yonehara S., Ishii A. et al. The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis // Cell. 1991. - Vol. 66. - P. 233243.

95. Jonasson L., Holm J., Skalli O. et al. Regional accumulation of T cells macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque // Atherosclerosis. 1986. - Vol. 6. - P. 131-138.

96. Kayagaki N., Kawasaki A., Ebata T. et al. Matalloproteinase-mediated released of human Fas ligand//J. Exp. Med. 1995. - Vol. 182.-P. 1777-1783.

97. Kerr J. F., Wyllie A. H., Currie A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer. 1972. - Vol. 26. - P. 239-257.

98. Kiener P. A., Davis P. M., Rankin B. M. et al. Human monocytic cells contain high levels of intracellular Fas ligand: rapid release following cellular activation // J. Immunol.- 1997.-Vol. 159.-P. 1594-1598.

99. Kinscherf R., Claus R., Deigner H. P. et al. Modified low density lipoprotein delivers substrate for ceramide formation and stimulates the sphingomyelin-ceramide pathway in human macrophages // FEBS Lett. 1997. - Vol. 405. - P. 55-59 (a).

100. Kinscherf R., Deigner H. P., Usinger C. et al. Induction of manganese superoxide dismutase by oxidized-LDL its relevance in atherosclerosis of human and heritable hyperlipidemic rabbits // FASEB J. - 1997. - Vol. 11. - P. 1317-1328 (6).

101. Kinscherf R., Claus R., Wagner M. et al. Apoptosis caused by oxidized-LDL is manganese superoxide dismutase and p53-dependent // FASEB J. 1998. - Vol. 12. - P. 461-467.

102. Kinscherf R., Wagner M., Kamencic H. et al. Characterization of apoptotic macrophages in atheromatous tissue of humans and heritable hyperlipidemic rabbits // Atherosclerosis. 1999. - Vol. 144. - P. 33-39.

103. Klimov A. N. On the participation of Iipoprotein-antibody immune complexes in atherosclerosis // Angeiologie. 1991. - Vol. 43. - P. 95-102.

104. Klimov A. N., Denisenko A. D., Popov A. V. et al. Lipoprotein-antibody immune complexes. Their catabolism and role in foam cell formation // Atherosclerosis. 1985. -Vol. 58.-P. 1-15.

105. Klimov A. N., Nagornev V. A., Denisenko A. D. Immunoreactivity and athesclerosis. In "Human Atherosclerosis"/ Eds. E. I. Chazov, V. N. Smimov // Soc. Med. Rev. A. Cardiology. 1987. - Vol. 1. - P. 337-356.

106. Kluck R. M., Bossy-Wetzel E., Green D. R., Newmeyer D. D. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis // Science. 1997. - Vol. 275. - P. 1132-1136.

107. Kockx M. M., Herman A. G. Apoptosis in atherosclerosis: beneficial or detrimental? // Cardiovasc. Res. 2000. - Vol. 45. - P. 736-746.

108. Kockx M. M., Cambier B. A., Bortier H. E. et al. Foam cell replication and smooth muscle cell apoptosis in human saphenous vein grafts // Histopathology. 1994. - Vol. 25.-P. 365-371.

109. Kockx M. M., de Meyer G. R. Y., Muhring J. et al. Distribution of cell replication and apoptosis in atherosclerotic plaques of cholesterol-fed rabbits // Atherosclerosis.1996.-Vol. 120.-P. 115-124.

110. Kovanen P. Atheroma formation: defective control in the intimal roundtrip of cholestetrol // Eur. Heart J. 1990. - Vol. 11, Suppl. E. - P. 238-246.

111. Larrick J. W., Wright S. C. Cytotoxic mechanism of tumor necrosis factor-a // FASEB J. 1990. - Vol. 4. - P. 3215-3223.

112. Li H., Cybulsky M. I., Gimbrone M. A., Libby P. An atherogenic diet rapidly induces VCAM-1, a cytokine-regulatable mononuclear leukocyte adhesion molecule, in rabbit aortic endothelium // Arterioscler. Tromb. 1993. - Vol. 13. - P. 197-204.

113. Li P. F., Dietz R., van Harsdorf R. Differential effect of hydrogen peroxide and superoxide anion on apoptosis and proliferation of vascular smooth muscle cells // Circulation. 1997. - Vol. 96. - P. 3602-3609 (a).

114. Li P., Nijhawan D., Budihardjo I. et al. Cytochrome c and ATP-dependent formation of paf-l/Caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade // Cell.1997. Vol. 91. - P. 479-489 (6).

115. Libby P., Hansson G. K. Involvement of the immune system in human atherogenesis: Current knowledge and unanswered questions // Lab. Invest. 1991. - Vol. 64.-P. 5-15.

116. Libby P., Warner S. J. C., Fiedman G. B. Interleukin-1: a mitogen for human vascular smooth muscle cells that induces the release of growth-ingibitory prostanoids // J. Clin. Invest. 1988. - Vol. 88. - P. 487-498.

117. Libby P., Ridker P. M., Maseri A. Inflammation and atherosclerosis // Circulation. 2002.-Vol. 105.-P. 1135-1143.

118. Liles W. C., Kiener P. A., Ledbetter J. A. et al. Differential expression of Fas (CD95) and Fas ligand on normal human phagocytes: implications for the regulation of apoptosis in neutrophils // J. Exp. Med. 1996. - Vol. 184. - P. 429-440.

119. Liu Y., Cigola E., Cheng W. et al. Myocyte nuclear mitotic division and programmed myocyte cell death characterize the cardiac myopathy induced by rapid ventricular pacing in dogs // Lab. Invest. 1995. - Vol. 73. - P. 771-787.

120. Liu X., Kim C. N., Yang J. et al. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c // Cell. 1996. - Vol. 86. - P. 147-157.

121. Lizard G., Deckert V., Dubrez L. et al. Induction of apoptosis in endothelial cells treated with cholesterol oxides //Am. J. Pathol. 1996. - Vol. 148. - P. 1625-1638.

122. Loetscher H., Pan Y. C., Lahm H. W. et al. Molecular cloning and expression of the human 55 kd tumor necrosis factor receptor // Cell. 1990. - Vol. 61. - P. 351-359.

123. Longthorne V. L., Williams G. T. Caspase activity is required for commitment to Fas-mediated apoptosis // EMBO J. 1997. - Vol. 16. - P. 3805-3812.

124. Mach F., Schonbeck U., Libby P. CD40 signaling in vascular cells: A key role in atherosclerosis? //Atherosclerosis. 1998. - Vol. 137, Suppl. 1. - P. 89-95.

125. Mahony J. B., Coombes B. K. Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis: dose the evidence support a causal or contributory role? // FEMS Microb. Lett. 2001. - Vol. 197.-P. 1-9.

126. Majno G., Joris I. Apoptosis, oncosis, and necrosis: an overview of cell death // Am. J. Pathol. 1995. - Vol. 146. - P. 3-15.

127. Mallat Z., Ohen J., Leseche G., Tedgui A. Colocalization of CPP-32 with apoptotic cells in human atherosclerotic plaques // Circulation. 1997. - Vol. 96. - P. 424-428.

128. Martin S. J., Green D. R. Protease activation during apoptosis: death by a thousand cuts? // Cell. 1995. - Vol. 82. - P. 349-352.

129. Mayr M., Xu Q. Smooth muscle cell apoptosis in arteriosclerosis // Exper. Gerontology. 2001. - Vol. 36. - P. 969-987.

130. Mc Ever R. P. Receptor-mediated interactions of leukocytes with platelets and endothelium // Atheroscler. Rev. 1993. - Vol. 25. - P. 11-27.

131. Muller K., Dulku S., Hardwick S. J. et al. Changes in vimentin in human macrophages during apoptosis induced by oxidized low density lipoprotein // Atherosclerosis.-2001.-Vol. 156.-P. 133-144.

132. Mundle S. D., Gao X. Z., Khan S. et al. Two in situ labeling thechniques reveal different patterns of DNA fragmentation during spontaneous apoptosis in vivo and induced apoptosis in vitro // Anticancer Res. 1995. - Vol. 15. - P. 1895-1904.

133. Nagata S. Apoptosis by death factor // Cell. 1997. - Vol. 88. - P. 137-144.

134. Nagornev V., Maltseva S. The phenotype of macrophages which are not transformed into foam cells in atherogenesis // Atherosclerosis. 1996. - Vol. 121. - P. 246-251.

135. Nelken N. A., Coughlin S. R., Gordon D., Wilcox J. N. Monocyte chemoattractant protein-1 in human atheromatous plaques // J. Clin. Invest. 1991. - Vol. 88. - P. 11211127.

136. Nicholson D. W., Thornberry N. A. Caspases: killer proteases // Trends Biochem. Sci. 1997. - Vol. 22. - P. 299-306.

137. Nilsson J. Cytokines and smooth muscle cells in atherosclerosis // Cardiovasc. Res. -1993.-Vol. 27.-P. 1184-1190.

138. Nishio E., Arimura S., Watanabe Y. Oxidised LDL induces apoptosis in cultured smooth muscle cells a possible role for 7-ketochoIesterol // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1996. - Vol. 223. - P. 413-418.

139. Osterud B. and Bjorklid E. Role of monocytes in atherogenesis // Physiol. Rev. -2003.-Vol. 83.-P. 1069-1112.

140. Palladini G., Finerdi G., Bellomo G. Modifications of vimentin filament architecture and vimentin-nuclear interactions by cholesterol oxides in endothelial cells // Exp. Cell. Res. 1996. - Vol. 223. - P. 83-90.

141. Palinski W., Rosenfeld M. E., Yla-Herttuala S. et al. Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. -P. 1372-1376.

142. Pan G., O'Rourke K., Chinnaiyan A. M. et al. The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL//Science. 1997.-Vol. 276.-P. 111-113.

143. Parums D. V., Brown D. L., Mitchinson M. J. Serum antibodies to oxidized low density lipoprotein and ceroid in chronic periaortitis // Arch. Pathol. Lab. Med. 1990. -Vol.114.-P. 46-50.

144. Peng X., Kasran A., Warmerdam P. A. M. et al. Accessory signaling by CD40 for T-lymphocyte activation: Induction of Thl and Th2 cytokines and synergy with interleukin-12 for interferon-y production // Eur. J. Immunol. 1996. - Vol. 26. - P. 16211627.

145. Pertman H., Maillard L., Krasinski K., Walsh K. Evidence for the rapid onset of apoptosis in medial smooth muscle cells after ballon injury // Circulation. 1997. - Vol. 95.-P. 981-987.

146. Petit P. X., Lecoeur H., Zom E. et al. Alterations in mitochondreal structure and function are early events of dexamethasone-induced thymocyte apoptosis // J. Cell. Biol. -1995.-Vol. 130.-P. 157-167.

147. Pitti R. M., Marsters S. A., Ruppert S. et al. Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, new member of the tumor necrosis factor cytokine family // J. Biol. Chem. 1996. -Vol. 271.-P. 12687-12690.

148. Polunovsky V. A., Wendt C. H., Ingbar D. H. et al. Induction of endothelial cell apoptosis by TNF-a: modulation by inhibitors of protein synthesis // Exp. Cell. Res. -1994.-Vol. 214.-P. 584-594.

149. Raines E. W., Dower S. K., Ross R. Interleukin -1 mitogenic activity for fibroblasts and smooth muscle cells is due to PDGF-AA // Science. 1989. - Vol. 243. -P. 393-398.

150. Reed J. C. Double identity for proteins of the Bcl-2 family // Nature. 1997. -Vol. 387.-P. 773-776.

151. Reid V. C., Mitchinson M. J. Toxicity of oxidized low-density lipoprotein towards mouse peritoneal macrophages in vitro // Atherosclerosis. 1993. - Vol. 98. - P. 17-24.

152. Reid V. C., Hardwick S. J., Mitchinson M. J. Fragmentation of DNA in P388D1 macraphages exposed to oxidized low-density lipoprotein // FEBS Lett. 1993. - Vol. 332.-P. 218-220.

153. Rice G. E., Munro J. M., Bevilacqua M. P. Inducible cell adhesion molecule 110 (INCAM-110) is an endothelial receptor for lymphocytes. A CD1 l/CD18-independent adhesion mechanism//J. Exp. Med. 1990.-Vol. 171.-P. 1369-1374.

154. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s // Nature.- 1993. Vol. 362. - P. 801-809.

155. Rossig L., Fichtlscherer B., Breitschopf K. et al. Nitric oxide inhibits caspase-3 by S-nitrosation in vivo // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 6823-6826.

156. Rusinol A. E., Yang L., Thewke D. et al. Isolation of a somatic cell mutant resistant to the induction of apoptosis by oxidized low density lipoprotein // J. Biol. Chem.- 2000. Vol. 275. - P. 7296-7303.

157. Salonen J. T., Yla-Herttuala S., Yamamoto R. et al. Autoantibody against oxidized LDL and progression of carotid atherosclerosis // Lancet. — 1992. Vol. 339. - N. 8798. -P. 883-887.

158. Sata M., Perlman H., Muruve D. A. et al. Fas ligand gene transfer to the vessel wall inhibits neointima formation and overrides the adenovirus-mediated T-cell rasponse // Proc. Netl. Acad. Sci. 1998. - Vol. 95. - P. 1213-1217.

159. Stanton L. W., White R. T., Bryant C. M. et al. A macrophage Fc receptor for oxidized low density lipoprotein // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P.22446-22451.

160. Stemme S., Hansson G. K. Immune mechanisms in atherogenesis // Ann. Med. -1994.-Vol. 26.-P. 141-146.

161. Stemme S., Fager G., Hansson G. K. MHC class II antigen expression in human vascular smooth muscle cells is induction by interferon-gamma and modulation by tumor necrosis factor and lymphotoxin // Immunology. 1990. - Vol. 69. - P. 243-249.

162. Stemme S., Holm J., Hansson G. T lymphocytes in human atherosclerotic plaques are momery cells expressing CD45RO and integrin VLA-1 // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.-1992.-Vol. 12.-P. 206-211.

163. Stemme S., Faber B., Holm J. et al. T lymphocytes from human atherosclerotic plaques recognize oxidized low density lipoprotein // Proc. Natl. Sci. USA. — 1995. — Vol. 92-P. 3893-3897.

164. Suda T., Takahashi T., Golstein P., Nagata S. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family // Cell. 1993. - Vol. 75.-P. 1169-1178.

165. Taylor-Robirtson D. Chlamydia pneumoniae in vascular tissue // Atherosclerosis. —1998.-Vol. 140, Suppl. 1,-P. 21-24.

166. Tedder T. F., Penta A. C., Levine H. B., Freedman A. S. Expression of the human leukocyte adhesion molecule, LAM1. Identity with the TQ1 and Leu-8 differentiation antigens // J. Immunol. 1990. - Vol. 144. - P. 532-540.

167. Tedgui A., Bernard C. Cytokines, immuno-inflammatory response and atherosclerosis // Eur. Cytokine Netw. 1994. - Vol. 5. - P. 263-270.

168. Tipping P. G., Hancock W. W. Production of tumor necrosis factor and interleukin-1 by macrophages from human atheromatous plaques // Am. J. Pathol. 1993. -Vol. 142.-P. 1721-1728.

169. Vassalli P. The pathophysiology of tumor necrosis factors // Annu. Rev. Immunol. 1992.-Vol. 10.-P. 411-452.

170. Watanabe T., Fan J. Atherosclerosis and inflammation. Mononuclear cell recruitment and adhesion molecules with reference to the implication of ICAM-l/LFA-1 pathwey in atherogenesis // International J. Cardiol. 1998. - Vol. 66, Suppl. 1. - P. 4553.

171. Watanabe T., Haraoka S., Shimokama T. Inflammatory and immunological nature of atherosclerosis // Int. J. Cardiol. 1996. - Vol. 54. - P. 25-34.

172. Wick G., Xu Q. Atherosclerosis — an autoimmune disease // Exp. Gerontology.1999.-Vol. 34.-P. 559-566.

173. Wilson A., Schaub R., Goldstein R., Kuo P. Supression of aortic atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits by purified rabbit interferon // Arteriosclerosis. 1990. - Vol. 10. -P. 208-214.

174. Zamzami N., Marchetti P., Castedo M. et al. Reduction in mitochondrial potential constitutes an early irreversible step of programmed lymphocyte death in vivo // J. Exp. Med. 1995.-Vol. 181.-P. 1661-1672.

175. Zamzami N., Susin S. A., Marchetti P. et al. Mitochondrial control of nuclear apoptosis//J. Exp. Med.- 1996.-Vol. 183.-P. 1533-1544.

176. Zheng I., Fisher G., Miller R. E. et al. Induction of apoptosis in mature T cells by tumor necrosis factor // Nature. 1995. - Vol. 377. - P. 348-351.

177. Zwaal R. F., Schroit A. J. Pathophysiologic implications of memrane phospholipid asymmetry in blood cells//Blood. 1997.-Vol. 89.-P. 1121-1132.

178. Xu Q. Role of heat shock proteins in atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2002. Vol. 22. - P. 1547-1559.

Информация о работе

Восканьянц, Альбина Нерсесовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Роль апоптоза и пролиферации клеток сосудистой стенки в атерогенезе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы