Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизмов влияния Na/K-АТФазы на регуляцию экспрессии генов и развитие клеточной смерти

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов влияния Na/K-АТФазы на регуляцию экспрессии генов и развитие клеточной смерти"

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ПШЕЖЕЦКИЙ Дмитрий Валерьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ВЛИЯНИЯ Ш/^АТФазы НА РЕГУЛЯЦИЮ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И РАЗВИТИЕ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ

специальность 03.00.02 - «Биофизика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, а также в

лаборатории патофизиологии ионного транспорта факультета медицины Монреальского университета.

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

С. Н. Орлов Г. В. Максимов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, доцент А. М. Рубцов

Доктор биологических наук, в.н.с. Т. Г. Сазонтова

Ведущая организация: Институт Биологии Развития им. Кольцова РАН,

Защита состоится 27 Мая 2004 г. В 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д.501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета

МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук,

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Na/K-АТФаза - это интегрированный в клеточную мембрану белок, ответственный за транспорт 3Na+ и 2К+ ионов против их электрохимических градиентов. Трансмембранные градиенты одновалентных катионов, создаваемые Na/K-АТФазой, необходимы для поддержания мембранного потенциала, клеточного объема и транспорта других ионов и низкомолекулярных органических соединений за счет систем сопряженного транспорта, как то систем и обмена, а также котранспорта с

аминокислотами, глюкозой, фосфатами и нейротрансмиттерами (Blanco and Mercer, 1998; Lang et al., 2000; Mongin, Orlov, 2001). В этой связи неудивительно, что ингибирование этого фермента влияет на целый ряд клеточных параметров. Так, сердечные гликозиды (например, уабаин или дигоксин), природные ингибиторы Na/K-АТФазы, использовались для лечения сердечной недостаточности, некоторых аритмий и отеков с конца XVIII-ro столетия (Withering 1785; Hoffman, Bigger, 1985). Механизм их действия заключается в том, что, ингибируя Na/K-АТФазу, сердечные гликозиды деполяризуют клеточную мембрану и повышают внутриклеточный уровень Na+. Вследствие этого через обменник и потенциал-активируемые Саг+ каналы

повышается уровень внутриклеточного что приводит к увеличению силы

сокращений кардиомиоцитов и увеличивает чувствительность клеток гладких мышц к вазоконстрикторам (Blaustein, Lederer, 1999; Glitsch, 2001). При этом, увеличение концентрации кальция внутри клеток часто вызывает активацию

зависимых которые усиливают отток калия из клетки, вызванный

ингибированием Na/K-АТФазы и, таким образом, приводят к ее сжатию, что в клетках ряда тканей может инициировать апоптоз. С другой стороны, увеличение концентрации натрия и отрицательно заряженных осмолитов может привести к набуханию клетки и к некрозу.

В 1999 году было установлено, что обработка клеток гладкой мускулатуры сосудов (ГМК, VSMC) уабаином резко замедляет развитие апоптоза, вызванного устранением факторов роста (Orlov et al., 1999). При исследовании механизма антиапоптотического действия уабаина на ГМК было показано, что этот ингибитор Na/K-АТФазы резко активирует синтез РНК (Orlov et al., 2000b) и что его антиапоптотический эффект устраняется в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белка (Orlov еt al., 2001). Эти результаты позволили предположить, что защита ГМК от апоптоза в присутствии уабаина осуществляется через экспрессию антиапоптотических генов, которые в свою очередь

response genes - ERG). В отличие от ГМК и клеток ряда других тканей (Falciola et al., 1994; Orlov et al., 1999; Murata et al., 2002), длительная инкубация с уабаином приводит к смерти эпителиальных клеток (MDCK), характеризующейся наличием маркеров некроза (Ledbetter et al., 1986; Bolivar et al., 1987). Механизм двоякого действия ингибиторов Na/K-АТФазы на апоптоз и некроз клеток остается неизвестным. В этой связи целью нашей работы было исследование механизмов вовлечения -АТФазы

в активацию экспрессии генов и развитие клеточной смерти.

Основные задачи исследования

1. Установить характер влияния Ма+/К+-АТФазы на развитие апоптоза в ГМК, вызванного ионизирующей радиацией.

2. Установить природу начального сигнала, приводящего к запуску экспрессии генов раннего ответа в ГМК, вызванной ингибированием Ка+/К+-'АТФазы уабаином.

3. Установить природу начального сигнала, приводящего к развитию некроза в клетках эпителия почечных канальцев, обработанных уабаином.

Научная новизна работы. В нашей работе мы впервые показали, что включение в структуру ДНК изотопа (3Н) является достаточным условием для запуска апоптоза в клетках ряда тканей. В этой части работы нами было также установлено, что сигнальный каскад, запускаемый ингибиторами Na/K-АТФазы, воздействует скорее на универсальное звено апоптотического механизма, нежели на процессы, которые связаны с более специфическими начальными сигналами, возникающими при действии индукторов апоптоза различной природы. Мы впервые показали, что ингибирование уабаином Na/K-ЛТФазы вызывает индукцию экспрессии c-Fos через увеличение внутриклеточной концентрации натрия. Этот сигнальный каскад не был опосредован изменением внутриклеточного рН, объема клеток или концентрацией Ca2t в клетке. Последнее наблюдение является наиболее важным, так как позволяет предложить новый механизм сопряжения возбуждения и транскрипции, который запускается изменением концентрации в клетке и не зависит от вовлеченный в подавление апоптоза. Нами впервые обнаружено, что некроз эпителиальных клеток, развивающийся при действии уабаина, не связан ни с ингибированием ионных потоков, обеспечиваемых Na/K-АТФазой, ни с резким увеличением соотношения [NaVlTCV Это наблюдение позволило нам выдвинуть предположение, что в клетках эпителия почечных канальцев уабаин вызывает изменение конформации Na/K-

АТФазы, что является достаточным условием для ее взаимодействия с

неидентифицированным белком, приводящим к активации сигнального каскада, завершающегося некрозом клеток.

Научно-практическая значимость работы. Данные, полученные нами при исследовании действия ионизирующего излучения на апоптоз, позволяют учитывать этот эффект для предотвращения артефактов, возникающих при использовании 3Н-тимидина для измерения синтеза ДНК и образования фрагментов хроматина. Кроме того, ДНК быстро делящихся опухолевых клеток накапливает большие количества радиоактивно меченных пуриновых и пиридиновых оснований и тем самым, должно быть, наиболее подвержены апоптозу. В связи с этим, разработка методов доставки этих соединений к местам скопления опухолевых клеток, минуя здоровые клетки, может быть полезным приемом в противоопухолевой терапии. Некомпенсированный пролиферацией апоптоз принимает участие в развитии таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера, тератогенез, мышечная дистрофия, измените регуляции иммунной системы. С другой стороны, потеря клетками способности к апоптозу приводит к гиперплазии сердечно-сосудистой системы, отмеченной при гипертонии и атеросклерозе. Мы полагаем, что полученные в нашей работе данные о двояком механизме действия ингибиторов Na/K-АТФазы на апоптоз и некроз будут использованы при разработке новых фармакологических подходов, которые могут быть применены для лечения болезней, связанных с нарушением процессов регуляции клеточной смерти.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конгрессе Гипертонического общества Квебека (Монреаль, 2001); четвертом ежегодном конгрессе молодых ученых Монреальского университета (Монреаль, 2001); ХК-й конференции международного общества гипертонии (Прага, 2002); международном симпозиуме по сердечно-сосудистой фармакотерапии (Монреаль, 2002); четвертом конгрессе по патофизиологии (Будапешт, 2002); конгрессе Канадского сердечно-сосудистого и гипертонического обществ (Эдмонтон, 2002); VI Российской онкологической конференции (Москва, 2002) и М-м собрании гипертонического общества Квебека (Монреаль, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из Я^^&азваний. Работа изложена на^§ранипах. иллюстрирована_2_таблицами и ^/рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили клетки гладких мышц сосудов (ГМК, VSMC), клетки гладких мышц сосудов трансфицироваиные Е1А аденовирусом (ГМК-Е1А), клетки эпителия почек С7 и С11 MDCK и эндотелиальные клетки сосудов (ЭКС, ЭКС). Все указанные типы клеток растили в модифицированной среде Дульбекко (DMEM) в присутствии 10% или 20% (в случае ЭКС) бычьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 500 мкг/мл. G418 (Е1А ГМК). Для оценки жизнеспособности клеток была использована фазово-контрастная микроскопия и окраска клеток трипановым синим. Для определения количества клеток, сохранивших связь с подложкой, мы применяли модифицированный метод определения белка по Лоури (Haгtee, 1972). Для определения жизнеспособности клеток мы исследовали также деградацию красителя МТТ (З-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтстразолий бромида), который превращается, в формазан функционально активными митохондриями. Для выявления апоптоза и некроза использовалась флуоресцентная микроскопия клеток, окрашенных иодидом пропидия и 4\6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлоридом (DAPI). В качестве маркера клеточной смерти мы проводили определение клеточного объема, измеряя пространство, доступное для радиоактивно-меченной мочевины. В качестве маркеров апоптоза мы измеряли количество фрагментированного хроматина, по ранее описанной методике ^г^эт et э1., 1999), а также проводили разделение фрагментов ДНК на агарозном геле. Активность каспазы-3 измерялась по флуоресценции продукта ее селективного субстрата DEVD-AMC. Активность измерялась как уабаин-чувствительная компонента скорости

входа Внутриклеточное содержание и было измерено как равновесное

распределения вне- и внутриклеточных ,6ЯЬ и ^Иа, соответственно (Oгlov et э1., 1996a). Для определения концентрации свободного кальция в клетках мы анализировали флуоресценцию его комплекса с фура-2 с помощью спектрофлуориметра (суспензия клеток) или флуоресцентного микроскопа (одиночные клетки). Для определения входа кальция и содержания обмениваемого внутриклеточного кальция мы.использовали радиоактивный изотоп Для измерения внутриклеточного рН клетки инкубировали 30 минут при комнатной температуре в растворе, содержащем 10 мкМ рН индикатора (BCECF-AM) и измеряли его флуоресценцию. Содержание обшей ДНК определялось на спектрофлуориметре Speks Fluoгomaks (Edisson, №, USA). Для определения экспрессии белков и РНК использовали стандартную методику Вестерн и Нозерн блот-анализа. Полученные в ходе исследования результаты обрабатывали статистически,

б

рассчитывая ошибку средней арифметической величины, для выявления достоверности использовали критерий Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение 1. Ингибирование ^/Х-АТ^Фа^ уабаином защищает клетки гладких мышц от апоптоза, вызванного радиоактивным мечением ДНК.

Мы показали, что 24-часовая преинкубация ГМК-Е1А с [3Н]-тимидином, но не с [3Н]-уридином, приводит к трехкратному ингибированию пролиферации клеток, измеренному по содержанию белка. То, что ингибирование пролиферации клеток, выявленное в этом эксперименте, связано с встраиванием радиоактивного тимидина в ДНК подтверждается тем, что при содержании в растворе радиоактивного тимидина в концентрации 1 мкКи/мл, общая его концентрация, вычисленная из его специфической радиоактивности (35 Ки/ммоль), составила ~ 0,03 мкМ. В отсутствие радиоактивного тимидина повышение концентрации тимидина до 100 мкМ не влияло на пролиферацию ГМК-Е1А (рис. 1, линия 2).

Рис 1. Влияние немеченого тимидина на включение [^[-тимидина в ДНК (кривая 1) и пролиферацию ГМК-Е1А клеток в отсутствие (кривая 2) и присутствии (кривая 3) 1 мкКи/мл [3Н]-тимидина.

В присутствии 10 мкМ нерадиоактивного тимидина включение [3Н] -тимидина в ДНК уменьшалось в 20 раз (рис. 1, линия 1). Параллельно с этим устранялось влияние -тимидина на пролиферацию клеток (рис. 1, линия 3).

Из таблицы 1 видно, что [3Н]-тимидин по-разному ингибирует пролиферацию клеток различных линий. Уменьшение эффекта радиоактивного тимидина в ГМК и клетках эндотелия (ЭКС) не связано с уменьшением количества меченого ДНК в этих клетках. Наоборот, встраивание [3Н]-тимидина в ДНК этих клеток было в ~7 и ~3 раза выше по сравнению с С7 и С11 ЭК. Добавление 100 мкМ обычного тимидина к С7-MDCK, ЭКС и ГМК, как и в случае с Е1А-ГМК полностью устраняло эффект радиоактивного аналога.

Таблица 1. Влияние включения в ДНК [3П]'-тимидина на пролиферацию гладкомышечных (VSMC), эндотелиальных (ЭКС) и эпителиальных (MDCK) клеток.

Тип клеток Без нерадиоактивного тимидина - С нерадиоактивным тимидином

Мечение ДНК Число клеток на Мечение ДНК Число клеток на

[3Н]-тимвдином, лунку, [3Н]-тимидином, лунку,

ёрт/нг общего % от контроля ёрт/нг общего % от контроля

ДНК ДНК

С7-МОСК 8,7+0,2 25+6 0,26±0,04 101+8

СП-ШЭСК 9,7±1,7 33+3 Не определено Не определено

ЭКС 30,6+3,0 76+8 0,62+0,08 91+6

ГМК 66,0+2,2 83+4 0,8+0,04 98+7

ГМК-Е1А 36,9+2,9 18+3 Не определено Не определено

Фазово-контрастная микроскопия показала, что обработка клеток C7-MDCK, С11-MDCK и ГМК-Е1А -тимидином приводит к их смерти и появлению круглых клеток, потерявших связь с подложкой. В соответствии с меньшим влиянием 1 мкКи/мл -тимидина на пролиферацию ГМК и ЭКС его эффект на смерть клеток этих типов также был значительно ниже. Обнаружив различный эффект [3Н]-тимвдина на пролиферацию ГМК и ГМК-Е1А (таблица 1), мы исследовали рать апоптоза в этом процессе. Мечение ДНК в присутствии 0,1 мкКи/мл радиоактивного тимидина не оказывало значительного влияния на пролиферацию клеток, измеренную по количеству белка в клетках, сохранивших связь с подложкой (рис. 2а, линии 2 и 3). Увеличение

концентрации тимидина до 1 мкКи/мл сопровождалось 22%-м увеличением количества внутриклеточных фрагментов хроматина в Е1А-ГМК в присутствии ростовых факторов (рис. 2 б, линия 4). Приблизительно такое же увеличение фрагментации хроматина наблюдалось при 5-часовой инкубации в присутствии 0,1 мкКи/мл радиоактивного тимидина в отсутствие ростовых факторов. Повышение концентрации тимидина в среде преинкубации также повышало фрагментацию хроматина в отсутствие сыворотки (рис. 2 б, линия 5).

Рис 2. Влияние [ Н]-тимидина на мечение ДНК (1), число клеток (2), содержание белка (3) и деградацию хроматина в. клетках ГМК-Е1А, инкубированных в присутствии (4) или отсутствие (5) сыворотки.

Увеличение фрагментации хроматина после преинкубации в присутствии 1 мкКи/мл радиоактивного тимидина было также обнаружено в других типах клеток (таблица 2). Важно отметить, что степень фрагментации хроматина хорошо коррелировала с увеличением количества мертвых клеток. Смерть клеток, вызванная [3Н]-тимидином сопровождалась также примерно 10-кратным увеличением активности каспазы-3 и накоплением низкомолекулярных фрагментов ДНК, которые выявляли по образованию лестничной структуры при разделении экстрактов клеточного ДНК на агарозном геле (рис. 3 Б).

а. в. е.

по

Рис 3. Активность каспазы-3 (А), фрагментация ДНК (В) и содержание низкомолекулярных фрагментов ДНК (С) в клетках ГМК-Е1А в различных условиях.

Клетки растили в течение 24 часов в отсутствие или в присутствии 1 мкКи/мл [3Н]-тимидина. После удаления этого раствора клетки растили еще 48 часов в отсутствие тимидина.

Это дало возможность заключить, что [3Н]-тимидин вызывал замедление роста ГМК-Е1А клеток инициируя апотоз. Мы подтвердили это, показав, что универсальный ингибитор каспаз, Z-VAD.fmk полностью блокирует прирост активности каспазы-3, вызванный преинкубацией клеток с -тимидином (данные не приведены), и в 2 раза уменьшает эффект [3Н]-тимидина на фрагментацию хроматина и пролиферацию ГМК Е1А.

Ранее было показано, что апоптоз в Е1А-ГМК, вызванный устранением ростовых факторов, подавляется при увеличении отношения внутриклеточных концентраций ЫаТк*. вызванным ингибированием Na/K-АТФазы уабаином ^г^ et 8!., 1999). Мы обнаружили, что уабаин подавляет апоптоз в ГМК-Е1А, обработанных радиоактивным тимидином также как и апоптоз, вызванный устранением ростовых

Ю

факторов, уменьшая фрагментацию хроматина и активность каспазы-3 в 2,5 и 4 раза соответственно (данные приведены в диссертации).

Таблица 2.Эффект [3Н]--тимцдина на выживание и фрагментацию хроматина в гладкомышечных, эндотелиальных и эпителиальных клетках.

Тип клеток Количество живых клеток, % Фрагментация хроматина, %

0,1 мкКи/мл 1 мкКи/мл 0,1 мкКи/мл 1 мкКи/мл

[эН]-тимидина [3Н]-тимвдина [3Н]-тимидина [3Н]-тимидина

ГМК 98+1 96±2 1,9+0,7 4,1±1,3

ГМК-Е1А 97+2 82+5 2,2±0,6 19,6+2,3

C7-MDCK 98+3 77+5 2,1+1,0 12,0+1,9

C11-MDCK 96+3 67+4 2,4+0,4 12,3±2,3

ЭКС 98+1 94+3 2,4+1,2 6,3±1,4

Таким образом, данные, полученные в этой части работы, позволяют нам сделать вывод, что уменьшение пролиферации и смерть клеток, вызванные включением в ДНК радиоактивного тимидина, являются результатом инициированного тимидином апоптоза, обусловленного по-видимому воздействием ионизирующей радиации на ДНК, причем ингибирование Na/K-АТФазы уабаином способно подавлять этот процесс на стадии предшествующей активации каспазы-3.

2. Механизм экспрессии генов раннего ответа в ГМК сосудов, вызванный ингибированием Na/K-АТФазы.

Как видно из рис. 4, двухчасовая инкубация ГМК с 1 мМ уабаином приводила к ~6-кратному увеличению экспрессии белка c-Fos, которая спадала до базального уровня через 24 часа Поскольку мы не обнаружили влияния уабаина на экспрессию активирующего транскрипционного фактора (ATF-2), белка связывающегося с элементом ответа цАМФ-Са2+ (CREB-1), и фактора транскрипции с-Мус, а рост экспрессии белка c-Jun был зарегистрирован после максимального прироста экспрессии c-Fos, мы сфокусировали наши дальнейшие усилия на изучении механизма, отвечающего за индукцию экспрессии c-Fos в клетках, обработанных уабаином. Мы обнаружили, что подобно уабаину, 6-часовая инкубация ГМК в среде без К* приводит к резкому возрастанию содержания c-Fos (рис. 5).

И

А.

Б.

Рис. 4. Влияние уабаина на экспрессию генов раннего ответа в клетках ГМК.

А Вестерн блот, показывающий влияние уабаина на экспрессию c-Fos, ATF-2,c-Myc и CREB-l.

Б. Кинетика экспрессии c-Fos и ^цп в клетках, обработанных уабаином. За 1,0 принято содержание генов раннего ответа в необработанных клетках. Представлены средние значения трех экспериментов ст. ошибка.

Рис. 5. Влияние концентрации внеклеточных ионов и уабаина на экспрессию c-Fos.

На основании этих данных мы заключили, что действие уабаина на экспрессию c-Fos опосредовано взаимодействием уабаина с Na/K-АТФазой. Для выяснения

механизма влияния Na/K-АТФазы на экспрессию c-Fos мы исследовали как различные концентрации уабаина влияют на активность Na/K-насоса, соотношение [Ка^иДК*].,,, и экспрессию c-Fos.

Рис. б. А. Зависимость активности №/К-насоса (кривая 1) и внутриклеточного содержания натрия и калия (кривые 2 и 3, соответственно) от концентрации уабаина. Б и В. Зависимость экспрессии с-Боб от концентрации уабаина.

Начальные содержания калия и натрия соответствуют физиологическим концентрациям этих ионов в клетке.

Добавление 100 мкМ уабаина к клеткам ГМК приводило к приблизительно двукратному ингибированию скорости входа радиоактивного аналога калия в

клетки загруженные натрием (рис. 6А, кривая 1). Однако из-за ответной активации Na/K-АТФазы внутриклеточным натрием, соотношение внутриклеточных концентраций натрия и калия практически не изменилось, но значительно увеличилось при прибавлении уабаина в концентрации 500 мкМ и выше (рис. 6, кривые 2 и 3). 100 мкМ уабаин почти не влиял на экспрессию c-Fos, в то время как в концентрации 500 и 1000 мкМ это вещество увеличивало экспрессию c-Fos в 4 и 7 раз соответственно (рис. 6Б, 6В). Эти данные показывают, что увеличение соотношения [Ыа^мДК^ю является необходимой составляющей для инициирования повышенной экспрессии c-Fos уабаином.

На рис. 7А видно, что увеличение содержания мРНК с^св наблюдалось через 10 минут после обработки клеток уабаином и возрастало в четыре раза к 30 минутам. За это время уабаин не успевал оказать значительного влияния на увеличивая при

этом внутриклеточную концентрацию приблизительно в четыре раза. Эти

результаты свидетельствуют о том, что увеличение экспрессии вызванное

уабаином, опосредовано, по-видимому, увеличением нежели уменьшением

Мы исследовали влияние внутриклеточного рН, и объема клетки на

экспрессию вызванную уабаином. После часовой обработки ГМК 1 мМ уабаином мы не зафиксировали изменения внутриклеточного рН (данные приведены в диссертации), по-видимому, потому что в отсутствие стимулов, вызывающих существенное закисление цитоплазмы, -обменник в ГМК функционирует в

режиме эквимолярного Ка+-№+- обмена (Ог1от SN et а1., 2000а). Ранее было показано, что сжатие клетки способно вызывать экспрессию различных мРНК, в частности, мРНК, кодирующих а1- и |51 -субъединицы Ыа+/К+-АТФазы (Мис et а1., 1998). Однако в нашем случае применение гиперосмотической среды не меняло ни базальную, ни вызванную уабаином экспрессию (данные приведены в диссертации).

Поскольку №/К-АТФаза электрогенна, она может влиять на экспрессию через быструю деполяризацию ГМК, что в свою очередь может влиять на ряд мембраносвязанных белков, активируя, например, потенциал-зависимые Ь-типа (Oгlсv et а1., 1996Ь). В подтверждение этого, мы показали, что деполяризация клеток в среде с высокой концентрацией приводит к существенному увеличению экспрессии (рис. 8).

А

Рис 7. А. Кинетика изменения внутриклеточной концентрации Na* (1) и К* (2), а также соотношения мРНК c-Fos/S18 (3) в ГМК, обработанных 1 мМ уабаином. Б. Репрезентативный Нозерн-блот анализ экспрессии c-Fos и маркера S18

контрольная среда высококалиевая среда уабаин - + + -

никардипин + + - +

Рис. 8. Влияние 0,1 мкМ никардипина на экспрессию белка с-Боб

Контрольная среда содержала 1,8 мМ СаС1г, 0,8 мМ М£504, 8,4 мМ HEPES, 29,8 мМ ЫаНСОз, 5 мМ глюкозы, 0,9 м ТМЩЭ^ , 4 мМ ШО, 5,4 мМ КС1, витамины и аминокислоты аналогично среде DMEM. В высококалиевой среде №0 был заменен на КС1.

Однако механизм стимуляции экспрессии c-Fos при деполяризации, вызванной присутствием К*, и воздействием уабаина, различен. Инкубация ГМК в среде с высокой концентрацией К* вызывала увеличение входа 45Са2+ с 327 ¿33 до 831 ± 52 пмоль/мг белка/5 мин. Этот эффект полностью блокировался 0,1 мкМ никардипином -ингибитором Са2+-каналов L-типа (данные приведены в диссертации). Как и вход кальция, повышенная экспрессия с^св в среде с высокой концентрацией К+ также блокировалась никардипином (рис. 8). При этом никардипин не влиял на экспрессию с-Fos, вызванную уабаином. Это показывает, увеличение экспрессии c-Fos под влиянием уабаина не зависит от -каналов L-типа.

С целью дальнейшего выяснения роли кальция в экспрессии c-Fos, вызываемой уабаином, мы измерили

в обшей популяции клеток, загруженных фура-2. Мы не обнаружили значительного эффекта 1 мМ уабаина ни на ни на -сигнал,

вызванный ингибитором -насоса саркоплазматического ретикулума тапсигаргином. Более того, мы не нашли достоверных изменений внутриклеточного измеренного в единичных клетках загруженных фура-2 и существенного влияния 6-часовой инкубации с уабаином на содержание обмениеваемого кальция (данные представлены в диссертации).

И наконец, мы исследовали влияние Са2+ на экспрессию c-Fos в клетках, обработанных уабаином. Оказалось, что присутствие в среде инкубации не

влияет на этот параметр (рис. 9).

Рис 9. Влияние уабаина на экспрессию белка е^га? в среде без добавок Са1+ (концентрация Са,+ -10-40 мкМ) и в присутствии хелатора Са1+ ВАРТА

Применяя хелатор внеклеточного кальция (ЭГТА), мы снизили концентрацию

Са*

в среде инкубации до 0,1 мкМ. Однако ни это воздействие, ни проникающий в клетку хелатор внутриклеточного кальция ВАРТА не устраняли экспрессию c-Fos в ГМК, вызванную добавлением уабаина. Эти результаты позволили нам сделать вывод о

наличии нового механизма запуска транскрипции генов независимого от Са но регулируемого [Ыа^.н

3. Исследование первичных механизмов, приводящих к гибели клеток эпителия

при действии уабанна.

Ингибирование Na/K-АТФазы вызывает отслоение от подложки и смерть эпитетиальных ЭК клеток, полученных из дистального отдела нефрона собаки (Ledbetter ML et al, 1986, Bolivar JJ et al, 1987) С помощью фазовоконтрастной микроскопии мы установили, что 24-ти часовая инкубация в присутствии 3 мкМ уабаина приводит к смерти C7-MDCK, регистрируемой по резкому снижению доли клеток, прикрепленных к подложке, и по появлению плавающих набухших клеток (рис 10 А), а также по изменению количества клеточного белка на подложке и резкому снижению деградации красителя МТТ

Рис 10. А) Влияние 3 мкМ уабаина на морфологию С7- и С11-МОСК клеток, Б) влияние уабаина на связь С7-МОСК клеток с подложкой, В) влияние уабаина на переработку С7-МОСК клетками МТТ. Время инкубации 24 часа.

Клетки MDCK гетерогенны и состоят из главных клеток (С7) и клеток прослойки (СИ). Поскольку уабаин аналогично влиял на жизнеспособность обоих типов клеток (рис. 10 А), то в дальнейшем все эксперименты проводились на линии главных клеток С7 MDCK. В соответствии с данными Контрерас и соавт. (Contreras et al., 1999) мы наблюдали, что основной отрыв клеток от подложки наблюдается между 12 и 24 часами ингибирования Na/K-АТФазы уабаином

Важно, что при этом ни находящиеся в супернатанте, ни оставшиеся на подложке клетки, не окрашиваются трипановым синим или иодидом пропидия (данные не показаны). Это свидетельствует о целостности плазматической мембраны клеток. Подобное окрашивание наблюдается только после 48-часовой инкубации и показывает, что нарушение целостности клеточной мембраны происходит на конечных этапах развития клеточной смерти.

Как и потеря клетками способности трансформировать МТТ (рис. 11А кривая 1), двукратное клеточное набухание являлось одним из ранних событий, вызываемых ингибированием Na/K-АТФазы (данные приведены в диссертации), и предшествовало морфологическим изменениям клеток и их отрыву от подложки (рис. 11А, кривая 2).

О I I ■ ■ .

О в 12 13 24

чаоы

Рис 11. Влияние 3 мкМ уабаина на переработку клетками красителя МТТ (1) и связывание MDCK с подложкой (2).

Это позволило нам предположить, что в клетках протекает некротический процесс. Инкубация клеток с уабаином значительно повышало количество внутри- и внеклеточного хроматина, которое через 24 часа достигало ~20% и -65% от общего количества хроматина, соответственно (данные приведены в диссертации).

Ингибирование №/К-АТФазы в МБСК вызввало -7-кратное транзиторное повышение активности каспазы-3 с максимумом через б часов после начала инкубации (рис. 12Б) и спадом до базального уровня к 24-часам инкубации. Применение проникающего ингибитора каспаз 2-УАО.йк. полностью блокировало активность каспазы-3 в С7 клетках, обработанных уабаином, и даже понижало ее ниже контрольного уровня (рис. 12Б). Однако снижение активности не влияло ни на переработку МТТ в формазан, ни на отрыв клеток от подложки (рис. 12В). Эти данные позволяют заключить, что в отличие от большинства моделей апоптоза, временная активация каспазы-3, отмеченная в обработанных уабаином С7 клетках - скорее паралельное явление, нежели центральный механизм развития клеточной смерти.

Одними из известных субстратов каспазы-3 являются специфические эндонуклеазы, которые ответствены за разрезание ДНК на фрагменты кратные 180-200 пар оснований. Разделение фрагментов ДНК, выделенной из клеток, обработанных уабаином в течение 24 часов, показало, отсутствие этих специфических фрагментов (рис. 12А). ДНК клеток была деградирована до фрагментов нефиксированного размера, что служит маркером некроза (^уШе, 1980).

Рис 12. Разделение ДНК на агарозном геле (А), активация каспазы-3 (Б) и влияние ингибитора каспаз Z-VAD.lmk на переработку клетками красителя МТТ и сохранение ими связи с подложкой (В) в контрольных и обработанных 3 мкМ уабаином клетках МОСК

Таблица 3. Влияние уабаина и внеклеточных концентраций одновалентных ионов на их внутриклеточное содержание, скорость входа **Ю)+, жизнь и смерть

клеток C7-MDCK.

Раствор 1 (коншшЛ Раствоо 2 f среда без Ю Раствор 3 (высокий К.7ншкий Na"")

Концентрапии Na+. К* и СГ в среде инкубации! шМ

Na+-141,1; К+-5,4; СГ -118,4 NaT • 146,5; К* - 0; СГ -118,4 Na+- 31,7; К+-114,8; СГ -118,4

Внутриклеточное содержание Na+. нмоль/мг §елка

Котроль Уабаин контроль | уабаин Контроль Уабаин

49+3 966+46 498+12 1 1237+70 ( 32+2 436±35

Внутриклеточное содержание К*, нмоль/мг белка

Контроль Уабаин контроль ■ уабаин 1 контроль; Уабаин

1495±35 53±3 ND ! ND 1 1110±53: 1486+20

Скорость входа "Rh*. нмоль/мг,,белка/5 мин

контроль; Уабаин ■ контроль уабаин контроль Уабаин

115±18 ; 48+7 0,12+0,01 0.04+0,01 ND ND

Количество клеток на подложке. %

контроль! Уабаин 1 контроль! уабаин 1 контроль! Уабаин •

100±5 ; 29+3 1 95+5 ; 25+3 1 61±3 i 25+2

Переработка МТТ в «Ьоомазан. %

контроль Уабаин контроль уабаин контроль Уабаин

100±3 15±4 123+5 18+5 92+4 7+1

Контрольная среда содержала 1,8 мМ СаС12, 0,8 мМ MgSC>4, 8,4 мМ HEPES, 29,8 мМ ЫаНСОз, 5 мМ глюкозы, 0,9 мМ NaH2PO4,109,4 мМ NaCl, 5,4 мМ КС1, витамины и аминокислоты аналогично среде DMEM. В безкалиевой среде КС1 был заменен на NaCl. В среде с высоким К'Гнизким Na+NaCl был заменени на КС1. ND - данные не определены, т.к. в среде без К* нельзя измерить содержание калия не добавляя его аналогов, а в среде с высоким содержанием К* измерение скорости входа ,6Rb+ было бы неточным т.к. невозможно загрузить клетки натрием чтобы предотвратить Na-вызванную активацию Na/K-АТФазы.

Для исследования связи между некротическим действием уабаина и ингибированием ионных потоков, опосредованных Na/K-АТФазой, мы сопоставили влияние уабаина на внутриклеточное содержание натрия и калия и смерть С7 клеток в средах с различным содержанием К+, Na+ и СГ. Эквимолярное замещение NaCl на КС1 (раствор 3) полностью устраняло эффект уабаина на [К4],к, в то время как, например, частичное замещение натрия холином или почти полное замещение хлора глюконатом, уменьшало вызванный уабаином рост (данные не приведены).

Как и в случае добавки уабаина к контрольной среде, ингибирование Na/K-АТФазы в среде без К+ (раствор 2) приводило к 10-кратному увеличению концентрации Na+ в клетке. В отсутствие уабаина мы не обнаружили влияния ионного состава среды инкубации на смерть клеток, за исключением сравнительно слабого эффекта среды с повышенной концентрацией калия (раствор 3, табл. 3), что, возможно, является следствием резкого увеличения концентрации внутриклеточного кальция, вызванного деполяризацией клеток и активацией потенциал-зависимых каналов.

Независимо от изменения концентрации ионов внутри клетки, 24-часовая инкубация с 3 мкМ уабаином приводила к одинаковому уменьшению жизнеспособности клеток и потере их связи с подложкой. Эти результаты позволили нам предположить, что токсический эффект уабаина не связан ни с ингибированием Na/K-АТФазы, ни с изменением соотношения [Ыа^ыДК*].,,.

Известно, что сродство Na/K-АТФазы к уабаину в среде без К+ значительно выше (Akera et al., 1985; Wallick, Schwartz, 1988; Gekle et al., 1994; Lingrel et al., 1998). Учитывая это, мы сравнили влияние уабаина на скорость входа e6Rb и выживаемость -клеток в контрольной среде и среде без Как и следовало ожидать, преинкубация в среде без К* повышала чувствительность Na/K-АТФазы к уабаину (рис. 13А). Аналогичный сдвиг влево можно наблюдать и на кривых описывающих зависимость переработки клетками красителя МТТ (рис. 13В) и потери ими связи с подложкой (рис. 13Б) от концентрации уабаина в среде без К* по сравнению с контролем. Результаты этих экспериментов показывают, что инициирование уабаином смерти С7 клеток опосредовано его взаимодействием с Na/K-АТФазой, но не связано с ингибированием потоков натрия и калия и увеличением соотношения [Ш^ыДК4],,,.

Увбаии, мкМ

Рис 13. Влияние уабаина на активность №+/К*-АТФазы (А), содержание белка (Б), и жизнеспособность клеток С7-МЭСК (В) в контрольной среде (1) и среде без К* (2).

Контрольная среда содержала 1,8 мМ СаС1г, 0,8 мМ N^04, 8,4 мМ НЕРЕ8, 29,8 мМ ЫаНСОз, 5 мМ глюкозы, 0,9 мМ КаН2РС>4, 109,4 мМ №01, 5,4 мМ КС1, витамины и аминокислоты аналогично среде ЭМЕМ. В безкалиевой среде КС1 был заменен на ШС1.

Ранее было также показано, что проникающий внутриклеточный кальциевый хелатор ВАРТА-АМ полностью подавлял внутриклеточное высвобождение в

МЭСК клетках, вызванное активацией Ргу пуринорецепторов • или ингибитором эндоплазматической Са -АТФазы тапсигаргином (Gagnon й а1., 1999). Однако ни в присутствии, ни в отсутствие внеклеточного кальция этот хелатор не защищал С7 клетки от токсического эффекта уабаина (данные приведены в диссертации).

Как уже отмечалось выше, антиапоптотический эффект уабаина в ГМК-Е1А клетках, лишенных ростовых факторов, исчезает при ингибировании синтеза РНК и белков актиномицином Д и циклогексимидом, соответственно (Ог1оу й а1., 2000Ь). В клетках С7, повышение концентраций актиномищша Э и циклогексимида до 1 мкг/мл ингибировало синтез РНК и белков, измеренный после 30-минутной преинкубадии с этими веществами на 90 и 60% соответственно. Необходимо отметить, что после 2422

часовой инкубации, циклогексимид и актиномицин Д сами по себе уменьшали связь С7 клеток с подложкой с IDso ~0,1 И ~1 мкг/мл соответственно, при этом ни циклогексимид, ни актиномицин D не уменьшали токсического действия уабаина.

Заключение

В первой части нашей работы мы показали, что включение в структуру ДНК изотопа [3Н] является достаточным условием для запуска апоптоза в клетках ряда тканей, включая ГМК, клетки эпителия почечных канальцев и клетки сосудистого эндотелия. Как и апоптоз, вызванный химическими воздействиями, данный процесс прекращается ингибированием Na/K-АТФазы уабаином. Это свидетельствует о воздействии ингибирования Na/K-АТФазы на универсальное звено апоптотического механизма, локализованное на участке, предшествующем активации каспазы-3.

Во второй части работы, мы установили, что ингибирование уабаином Na/K-АТФазы вызывает индукцию экспрессии генов раннего ответа, в частности, c-Fos вследствие увеличения внутриклеточной концентрации натрия. Этот процесс не зависит от концентрации Саг+ в клетке, внутриклеточного рН, или от объема клеток. Последнее наблюдение позволяет предложить новый механизм сопряжения возбуждения и транскрипции, вовлеченный в подавление апоптоза. Этот каскад не зависит от и вызывается изменением внутриклеточной концентрации

В третьей части нашей работы мы показали, что токсическое действие уабаина на С7 клетки не связано ни с ингибированием ионных потоков, обеспечиваемых Na/K-АТФазой, ни с резким увеличением соотношения Кроме этого мы

обнаружили, развитие некротического сигнала индуцированного уабаином не связано с изменением внутриклеточной концентрации Са2+ и синтезом белка de novo. Тот факт, что в отсутствие [К4],,, чувствительность клеток MDCK к уабаину возрастала в 10 раз, позволил предположить, что смерть MDCK клеток, при действии уабаина является результатом изменения конформации Na/K-АТФазы и ее взаимодействием с неидентифицированным белком, запускающим некротический каскад (рис. 14). Анализ, полученных нами данных позволяет предложить модель, объясняющую различный характер вовлечения уабаина в развитие апоптоза и некроза.

Рис 14. Процессы, вовлеченные в блокирование апоптоза и инициирование некроза, вызванные воздействием уабаина на различные типы клеток.

В клетках эпителия почечных канальцев уабаин вызывает конформационное изменение а-субьединицы №/К-АТФазы, что является достаточным условием для ее взаимодействия с неидентифицированным белком, приводящим к активации

сигнального каскада, завершающегося некрозом клеток. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о наличии ряда белков, непосредственно связанных с Na/K-АТФазой (Akimova ОА et al., 2003). Так как некроз С7 клеток, обработанных уабаином, наблюдался в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белков, можно заключить, что все компоненты этого сигнального каскада уже присутствуют в этих клетках, и он не требует дополнительной экспрессии белков. Судя по всему, ГМК лишены одного или нескольких компонентов этого сигнального каскада, что и определяет их устойчивость к уабаину. Именно благодаря этой особенности удалось исследовать механизм ингибирования апоптоза в присутствии уабаина. Было обнаружено, что антиапоптотический эффект этого соединения связан с увеличением соотношения [Na+]„/[K+]1I, (Orlov et al., 1999) и опосредован экспрессией белков, подавляющих апоптоз (Orlov et al., 2001), включая морталин (Taurin et al., 2002). Данные, полученные в нашем исследовании, позволяют предположить, что начальным фактором этого процесса является прирост внутриклеточной концентрации натрия, а не потеря клеткой калия.

Выводы

1. Длительное (более 48 часов) пребывание 3Н-тимцдина в культуре клеток гладкой мускулатуры сосудов (ГМК), эпителиальных клеток и клеток эндотелия, вызывает развитие апоптоза, что обусловлено включением источника ионизирующей радиации в структуру ДНК.

2. В ГМК ингибирование Na/K-АТФазы уабаином приводит к резкому подавлению апоптоза, запускаемого включением в ДНК меченого тимидина.

3. Двух- трехчасовая инкубации ГМК с уабаином приводит к шести- восьмикратному увеличению содержания белка c-Fos. Активация экспрессии этого белка вызвана увеличением внутриклеточной концентрации натрия и не связана с изменением объема клеток, внутриклеточного рН и концентрации кальция. Эти данные позволяют предположить существование нового механизма сопряжения возбуждения и транскрипции, в котором регулирующим фактором является изменение внутриклеточной концентрации

4. В отличие от ГМК, 24-часовая инкубация клеток эпителия почечных канальцев в присутствии уабаина вызывает смерть клеток, которую, судя по быстрому увеличению клеточного объема и отсутствию чувствительности к ингибитору каспаз, можно классифицировать как некроз.

5. Токсическое действие уабаина на эпителиальные клетки опосредовано взаимодействием этого соединения с Na/K-АТФазой, и не зависит от ингибирования ионных потоков, осуществляемых этим ферментом, равно как и от изменения внутриклеточных концентраций калия и натрия.

6. Уабаин оказывает двойственное действие на жизнедеятельность клеток. Защита этим соединением от программируемой смерти клеток, изученная на примере ГМК и связываемая с экспрессией антиапоптотических генов, опосредована через увеличение концентрации внутриклеточного натрия. Напротив, некротический тип смерти клеток вызван неидентифицированным сигналом, генерируемым при взаимодействии уабаина с Na/K-АТФазой, не связанным с известной функцией этого фермента - поддержанием неравновесного распределения натрия и калия.

Основные публикации по теме диссертации

1. Pchejetski D., Taurin S., Thorin-Trescases N.. deBlois D., Tremblay J., Hamet P., Orlov S. N. Na/K pump inhibition differently affects survival of vascular smooth muscle cells (VSMC) and endothelial cells (EC)._Quebec Hypertension society, 2001, Montreal, Quebec. Med. Sci. 2002, Vol. 18, Supl 1, p. 83.

2. Pchejetski D. V., Thorin-Trescases N, Taurin S., Farhat N., deBlois D., Tremblay J., Hamet P., Orlov S. N. Na/K pump inhibition differently affects vascular smooth muscle and endothelial cell survival. 19th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension, 2002, Prague, Czech Republic. Journal of Hypertension, 2002, Vol. 20, suppl 4, p. 39.

3. Taurin S., Pchejetski D., Grygorczyk R., Tremblay J., Hamet P., Orlov SN.

Na/K pump inhibition in vascular smooth muscle cells (VSMC) triggers c-FOS expression via Na+i - sensitive Ca2*i - independent pathway. 1911 Scientific Meeting of the International Society of Hypertension, 2002, Prague, Czech Republic. Journal of Hypertension, 2002, Vol. 20, suppl 4, p. 34.

4. Pchejetski D., Thorin-Trescases N.. Taurin S., Farhat N., Tremblay J., Hamet P., Orlov SN. Apoptosis and necrosis in vascular cells: distinct effect of Na/K-pump inhibition and membrane potential. International Congress on Cardipovascular Pharmacotherapy, 2002, Montreal, Quebec. Cardivascular Drugs and Therapy, 2002, suppl l,p. 64.

5. Pchejetski D. V., Taurin S., deBlois D., Tremblay J., Hamet P., Orlov S. N. Apoptosis and necrosis in vascular cells: distinct effect of Na/K-pump inhibition and membrane

potential. 4th International Congress ofPathophysiology, 2002, Budapest, Hungary. Acta Physiologica Hungarica 2002, Vol. 89, p. 22

6. Pchejetski D., Der Sarkissian S., deBlois D., Grygorczyk R., Pshezhetski A., Tremblay J., Hamet P., Orlov SN. Inhibition ofNa/K pump in renal MDCK cells induces combined activation ofapoptosis and necrosis. Canadian Cardiovascular Congress 2002, Edmonton Alberta Book ofAbstracts, p. 21.

7. Пшежецкий Д., Дер Саркисян С, деБлуа Д., Пшежецкий А., Трамбле Д., Хамет П., Орлов С.Н. Дуалистическая природа смерти клеток почечного эпителия, вызванной ингибированием №/К-насосауабаином.\Г Российская Онкологическая конференция, ноябрь 2002, Москва, Россия. Сборниктезисов, с. 38.

8. Pchejetski D., Taurin S., Der Sarkissian S., deBlois D., Pshezhetsky A., Trerablay J., Hamet P., Orlov S. N. Dualite de l'effet de la ouabaine sur l'activation de la caspase-3 et sur la survie des cellules endotheliales. 11" Meeting of Quebec Hypertension society 2003, Montreal, Quebec. Book ofAbstracts, p. 25.

9. Taurin S., Dulin N., Pchejetski D., Grygorczyk R., Tremblay J., Hamet P., Orlov SN. C-FOS expression in cultured vascular smooth muscle cells from rat aorta: evidence for Na+i- • mediated Ca2+ - independent excitation-transcription coupling. J Physiol. L 2002, Vol. 543.3, p. 835-847

10. Orlov S. N.. Pchejetski D., Der Sarkissian S., Adarichev V., Taurin S., Pshezhetsky A., Tremblay J., Maximov G., deBlois D., Bennet M., Hamet P. [3H]-thymidine labelling of DNA triggers apoptosis potentiated by ElA-adenoviral protein. Apoptosis 2003, Vol. 8, p. 199

11. Pchejetski D., Taurin S., Der Sarkissian S., Lopina O. D., Pshezhetsky A. V., Tremblay J., de Blois D., Hamet P., Orlov S. N. Ouabain triggers renal epithelial cell death: role ofNa,K-ATPase-mediated ion fluxes and the intracellular Na/K ratio. BBRC 2003, Vol. 301, p. 735-744

12. Orlov S. N., Pchejetski D., Taurin S., Thorin-Thrcscases N., Maximov G. V., Pshezhetsky A., Rubin А В., Hamet P. Apoptosis in serum-deprived vascular smooth muscle cells: evidence for cell volume-independent mechanism. Apoptosis 2004, Vol. 9, p. 55-66.

»-77 46

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 15.04 2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл печ л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 432. Тел. 939-3890, 939-3891,928-1042. Тел /Факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пшежецкий, Дмитрий Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Na/K-АТФаза: молекулярная структура, механизм функционирования и регуляция.

1.1.1. Основные кинетические характеристики Na/K-A ТФазы.

1.1.2. Состав и изоформы No/K-АТФазы.

1.1.3. Структура No/K-АТФазы, сайты связывания ионов и АТФ.

1.1.5. Регуляция No/K-АТФазы.

1.1.5. Ингибиторы Na/K-A ТФазы.

1.1.6. Эндогенные уабаин-подобные соединения (EOLS) и их роль в патогенезе гипертонической болезни.

1.2. Na/K-АТФаза как универсальный регулятор трансмембранного градиента натрия и калия.

1.2.1. Генерация мембранного потенциала.

1.2.2. Системы транспорта, сопряженные с переносом Na+ и 1С.

1.2.3. Регуляция объема клеток.

1.3. Na/K-АТФаза и внутриклеточная сигнализация.

1.3.1. Гены, экспрессия которых регулируется активностью No/K-АТФазы.

1.3.2. Сигнальные каскады, запускаемые ингибированием No/K-АТФазы.

1.4. Роль Na/K-АТФазы в развитии клеточной смерти.

1.4.1. Апоптоз и некроз - два вида клеточной смерти.

1.4.2. ИнгибированиеNo/K-АТФазы как фактор защиты клеток от апотоза.

1.4.3. Уабаин как инициатор клеточной смерти.

1.5. Основные положения следующие из обзора литературы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культура клеток.

2.1.1. Клетки гладких мышц сосудов (VSMC) (vascular smooth muscle cells).

2.1.2. Клетки гладких мышц, трансфицированные Е1А аденовирусом (Е1А VSMC).

2.1.3. Эпителиальные клетки С7 и СП MDCK.

2.1.4. Эндотелиальные клетки сосудов (РАЕС).

2.2. Морфологические методы оценки жизнеспособности клеток.

2.2.1. Фазово-контрастная микроскопия.

2.2.2. Сохранение связи клеток с подложкой.

2.2.3. Окраска клеток трипановым синим.

2.3. Биохимические критерии оценки жизнеспособности клеток.

2.3.1. Деградация МГГ.

2.4. Морфологические и биохимические критерии апоптоза и некроза.

2.4.2. Определение клеточного объема.

2.4.3. Определение количества фрагментированного хроматина.

2.4.4. Определение содержания низкомолекулярных фрагментов ДНК.

2.4.5. Активность каспазы-3.

2.5.методы изучения ионного гомеостаза клеток.

2.5.1. Определение активности Na*/1С-насоса.

2.5.2. Определение содержания обмениваемого калия и натрия

2.5.3. Определение свободного и обмениваемого внутриклеточного кальция.

2.5.4. Измерение внутриклеточногорН.

2.6. Молекулярно-биологические методы исследования.

2.6.1. Определение общей и меченой3Н-тимидином ДНК.

2.6.2. Определение экспрессии белков (Western Blot).

2.6.3. Определение экспрессии РНК (Northern Blot).

2.6.4. Измерение синтеза РНК и белка.

2.7. Реактивы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Ингибирование Na/K-АТФлзы уабаином защищает клетки гладких мышц от апоптоза, вызванного радиоактивным мечением ДНК.

3.1.1. Ингибирование клеточного роста f Щ-тгшидином протекает через его включение в ДНК.

3.1.2. Сравнительный анализ эффекта [ Н]-тимидина на рост VSMC, эпителиальных и эндотелиальных клеток.

3.1.3. Влияние I3Н]-тимидина на синтез ДНК.

3.1.4. Обработка клеток [3Н]-тимидином вызывает их смерть.

3.1.5. Внедрение f HJ-тимидина в ДНК клеток вызывает их апоптоз.

3.2. Механизм экспрессии генов раннего ответа в vsmc сосудов, вызванный ингибированием Na/K-АТФлзы.

3.2.1. Ингибирование No/K-АТФазы вызывает резкое увеличение экспрессии c-Fos.

3.2.2. Уабаин вызывает экспрессию c-Fos через увеличение соотношения [Na*]/[iC]i.

3.2.3. Вызванная уабаином экспрессия c-Fos проходит через увеличение [Na*]t.

3.2.4. Роль клеточного объема, внутриклеточного рНи Са2* в инициированной у абаином экспрессии с-Fos.

3.3. Поиски начального сигнала, приводящего к гибели клеток эпителия почечных канальцев при действии уабаином.

3.3.1. Маркеры смерти C7-MDCK клеток при действии уабаина.

3.3.2. Роль No/K-АТФазы и внутриклеточных концентраций калия и натрия.

3.3.3. Роль кальция.

3.3.4. Роль макромолекулярного синтеза в смерти эпителиальных клеток, инициированнойуабаином

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Ингибирование уабаином Ыа/К-атфазы в VSMC подавляет апоптоз, вызванный радиоактивным мечением днк.

4.2. Экспрессия генов раннего ответа в VSMC сосудов, запускаемая уабаином: доказательства нового Ыа+,-опосредованного Са2+,-независимого механизма сопряжения возбуждения и транскрипции.

4.3. Некроз в клетках эпителия почечных канальцев, обработанных уабаином, не связан с ингибированием ионных потоков, опосредованных Ыа/К-АТФазой.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизмов влияния Na/K-АТФазы на регуляцию экспрессии генов и развитие клеточной смерти"

В 1997 году Нобелевская премия по химии была присуждена профессору Иенсу Кристиану Скоу за открытие в 1957 году Ыа/К-АТФазы (Skou JC, 1957), фермента, который поддерживает баланс калия и натрия в клетке.

3941- f biociumica'кт biofhysica-; acta volii 23 (ig57)> the influence of some": cations on an adenosine; triphosphatase froms peripheral nerves? jens chr. skoui Institute of Physiology, Univtrsiiy oj Aarfius ^Denmarh)

В своей первой статье профессор Скоу показал, что в мембранной фракции, изолированной из нервных волокон краба Carcinus maenas, содержится аденозин-трифосфатаза, активируемая при совместной добавке натрия и калия. Вскоре было установлено, что этот фермент является универсальным молекулярным механизмом, который использует энергию гидролиза АТФ для поддержания неравновесного распределения этих катионов между клеткой и внеклеточной средой (Skou JC, 1965).

Последующие исследования показали, что Ыа/К-АТФаза - это интегрированный в клеточную мембрану белок, ответственный за транспорт 3Na+ и 2К+ против их электрохимических градиентов. Электрохимические градиенты моновалентных катионов, создаваемые Ыа/К-АТФазой, необходимы для поддержания мембранного потенциала, клеточного объема (Lang F et al., 2000; Mongin AA and Orlov SN, 2001) и транспорта других ионов и низкомолекулярных органических соединений за счет систем сопряженного транспорта, как то Na+/H+ и Ыа+/Са2+-обменники, Ыа+,К+,СГ-котранспорт, котранспорт Na+ с аминокислотами, глюкозой, фосфатами и нейротрансмиттерами (Blanco G and Mercer RW, 1998) (см. рис. 1).

Осмолиты

Системы активируемые при набухании

Системы активируемые при сжатии

Рис. 1. Взаимосвязь между объемом клетки и системами, регулирующих ионный гомеостаз

Учитывая ключевую роль Ыа/К-А'ГФазы в регуляции ионного гомеостаза, неудивительно, что ингибирование этого фермента влияет на целый ряд клеточных параметров. Так, сердечные гликозиды (например, дигитоксин, уабаин), одни из наиболее сильных природных ингибиторов Na/K-АТФазы, использовались для лечения сердечной недостаточности, некоторых аритмий и отеков с конца XVIlI-ro столетия (Withering W, 1785;Hoffman and Bigger. Ic>85). Механизм их действия заключается в том, что, ингибируя Na/K-А'ГФазу, сердечные гликозиды деполяризуют клеточную мембрану и повышают внутриклеточный уровень Na\ Вслед за этим через NaVCa"' -обменник (Lang F et al., 1998а) и потенциал-активируемые Са2,-каналы (Lang F et aL, 1992) повышается концентрация внутриклеточного Са2+, что приводит к усилению сокращений кардномиоцитов и увеличивает чувствительность клеток гладких мышц к вазоконстрикторам (Glitsch, 200UBIaustein and Lederer, 1999). При этом увеличение [Са2+] часто вызывает активацию Са* -завйен мых К "-каналов, которые усиливают вызванный мотивированием Na/K-АТФэзы отток калия из клетки н, таким образом, приводят к ее сжатию. В клетках ряда тканей это может инициировать апоптоз. С другой стороны, увеличение концентрации натрия и отрицательно заряженных осмоднтт может привести к набуханию клетки и некрозу (рис. 2).

Ж"

Out

In оЯЩ1

Актив «лид NsK^O-котржнспорI1

Уабаин за? i

Na+

Апоптоз или его маркеры

Транзиеншое сжатие Т

Са-шливнруеыьг? К-каналы

Набухание

Некро* диссипация Ем Na/Ca::+ обменник

Потенциал-активируемые Са2+ каналы —

Са2+/ I

Сокращение кардиомиоцитов

Рис. 2. Ng/K-АТФаза как регулятор ионного гомеостаза и объема клетки

Наряду с этими явлениям»! в последнее время было обнаружено, что активность Ыа/К-АТФшы регулирует экспрессию некоторых генов, в том числе генов, контролирующих проведение сигналов, пролиферацию клеток и программируемую клеточную смерть (апоптоз) (Taurin S el al., 2002а). С использованием в качестве модели сердечных миоцитов было обнаружено, что частичное ингнбированне Na'K-АТФазы стимулировало рост клеток, синтез белка, вызывало активирование некоторых протоонкогенов и факторов транскрипции (McGowan МП el al., 1999; Xie Z et al , 1999). Несмотря на то, что вышеперечисленные эффекты уабакна на пролиферацию клеток и экспрессию генов изначально были приписаны изменению концентрации [Са~ (Peng М et al., 1996c), в данный момент установлено, что хотя увеличение [Са2+] и является необходимым, но не достаточным условием для протекания этих процессов. Более того, ряд наблюдений указывает на то, что уабаин может влиять на функционирование клеток в остутствие существенного изменения внутриклеточных концентраций натрия и калия (Xie Z and CaiT, 2003).

В соответствии со схемой, представленной на рис. 2, первоначальными сигналами, приводящими к формированию клеточного ответа на ингибирование Na/K-АТФазы уабаином, могут быть увеличение [Na+]j или уменьшение [К*];, изменение клеточного объема (связанное с перераспределением одновалентных ионов), [Na+]j -зависимое увеличение внутриклеточной концентрации свободного кальция и/или закисление цитоплазмы, деполяризация мембраны и изменение активности чувствительных к электрическому потенциалу (Ем) мембранносвязанных белков. Кроме того, нельзя исключить и тот факт, что достаточным условием для генерации сигнала являются конформационные превращения Na/K-АТФазы при ее взаимодействии с середечными гликозидами, а также наличие рецепторов этих соединений, отличных от Na/K-АТФазы. Целью нашего исследования являлось изучение вклада вышеперечисленных факторов, инициированных ингибированием Na/K-АТФазы уабаином, в регуляцию экспрессии генов и смерть клеток. При разработке стратегии нашего исследования мы исходили из следующих основополагающих данных.

В 1999 году в нашей лаборатории было установлено, что обработка клеток гладкой мускулатуры сосудов (VSMC) уабаином резко замедляет развитие апоптоза, вызванного устранением ростовых факторов (Orlov SN et al., 1999). Известно, что наряду с химическими соединениями, апоптоз может быть вызван, воздействием физических стимулов, наиболее универсальным из которых является ионизирующая радиация. В связи с этим в первой части исследования мы разработали модель запуска апоптоза при действии радиации на культуру клеток и исследовали влияние на этот процесс уабаина.

При изучении механизма антиапоптотического действия уабаина на VSMC было установлено, что этот ингибитор Na/K-АТФазы резко активирует синтез РНК (Orlov SN et al., 2000b) и что его антиапоптотический эффект устраняется в присутствии ингибиторов РНК и белкового синтеза (Orlov SN et al., 2001). Эти результаты позволили предположить, что защита уабаином VSMC от клеточной смерти опосредована через экспрессию антиапоптотических генов, которые в свою очередь контролируются генами раннего ответа (early response genes - ERG). Это положение было подтверждено во второй части работы, где нам также удалось установить начальные звенья генерации сигнала, запускаемого ингибиторами Na/K-АТФазы.

В отличие от VSMC, долгосрочное воздействие уабаина приводит к некротическому типу смерти ряда других типов клеток, включая клетки эпителия почечных канальцев. В заключительной части работы мы исследовали механизм этого феномена на примере культуры клеток, полученных из собирательных канальцев почки собаки.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Пшежецкий, Дмитрий Валерьевич

Выводы.

1. Длительное (более 48 часов) пребывание 3Н-тимидина в культуре клеток гладкой мускулатуры сосудов (VSMC), эпителиальных клеток и клеток эндотелия, вызывает развитие апоптоза, что обусловлено включением источника ионизирующей радиации в структуру ДНК.

2. В VSMC ингибирование Na/K-АТФазы уабаином приводит к резкому подавлению апоптоза, запускаемого включением в ДНК меченого тимидина.

3. Двух-трехчасовая инкубация VSMC с уабаином приводит к шести-восьмикратному увеличению содержания белка c-Fos. Активация экспрессии этого белка вызвана увеличением внутриклеточной концентрации натрия и не связана с изменением объема клеток, внутриклеточного рН и концентрации кальция. Эти данные позволяют предположить существование нового механизма сопряжения возбуждения и транскрипции, в котором регулирующим фактором является изменение внутриклеточной концентрации Na+, а не Са2+.

4. В отличие от VSMC, 24-часовая инкубация клеток эпителия почечных канальцев в присутствии уабаина вызывает смерть клеток, которую, судя по быстрому увеличению клеточного объема и отсутствию чувствительности к ингибитору каспаз, можно классифицировать как некроз.

5. Токсическое действие уабаина на эпителиальные клетки опосредовано воздействием этого соединения на Na/K-АТФэзу, но не зависит от ингибирования ионных потоков, осуществляемых этим ферментом, равно как и от изменения внутриклеточных концентраций калия и натрия.

6. Уабаин оказывает двойственное действие на жизнедеятельность клеток. Защита этим соединением от программируемой смерти клеток, изученная на примере VSMC и связываемая с экспрессией антиапоптотических генов, опосредована через увеличение концентрации внутриклеточного натрия. Напротив, некротический тип смерти клеток вызван неидентифицированным сигналом, генерируемым при взаимодействии уабаина с Na/K-АТФэзой, не связанным с известной функцией этого фермента — поддержанием неравновесного распределения натрия и калия.

В заключении работы я пользуюсь возможностью выразить благодарность людям, без которых я никогда не смог бы ее выполнить.

Прежде всего я хотел бы поблагодарить своего научного руководителя Сергея Николаевича Орлова за возможность работать в его лаборатории, за огромное терпение и неиссякаемое присутствие духа, за его доброту и помощь, за то, что открыл для меня двери в мир науки, за все, чему он меня научил. Также я бы хотел выразить благодарность Георгию Владимировичу Максимову, в первую очередь, за его научное руководство моей диссертацией в Москве, за его советы и правки, за помощь и доброе отношение.

Не менее я благодарен Алексею Пшежецкому за помощь, ценные советы и предоставленную мне возможность приехать в Канаду и осуществить мою работу. Я также благодарен Себастьяну Торану, за то что он оказал мне большую поддержку и на первых порах был моим гидом в лаборатории, и многому меня научил. Я бы также хотел поблагодарить Александра Александровича Красновского за его ценные замечания в процессе подготовки этой работы, за его помощь в поиске данных.

Мне также хотелось бы поблагодарить Андрея Борисовича Рубина и Татьяну Евгеньевну Кренделеву за ценные замечания по поводу моей диссертации, с их помощью мне удалось исправить много ошибок и привести мою работу к законченному виду.

И, наконец, хочу выразить огромную благодарность своим друзьям, близким и родным за ту помощь и поддержку, которую они мне оказали на протяжении последних лет.

Список использованных сокращений.

ANF - предсердный натрийуретический фактор ATF-2 - активирующий транскрипционный фактор AVD - апоптотическое уменьшение объема BSA - альбумин из бычей сыворотки [Ca+]j — внутриклеточная концентрация кальция [Са+]0 - внеклеточная концентрация кальция CAD - активируемая каспазами эндонуклеаза сАМР - цикло аденозинмонофосфат

CREB-1 - белок связывающийся с элементом ответа цАМФ-Са2+

DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол дегидрохлорид

DD - домены смерти

DED - эффекторные домены смерти

DFF40 - фактор фрагментации ДНК

DMEM - модифицированная среда Дульбекко

EGF - ростовой фактор выделенный из эндотелия

EOLS - эндогенные уабаин-подобные стероиды

FADD - домены смерти ассоциированные с Fas

FGF - ростовой фактор фибробластов

IGF-1 - ростовой фактор инсулинового типа

K+]i — внутриклеточная концентрация калия

К+]0 - внеклеточная концентрация калия

MLC-2 — легкая цепь миозина

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид

Na+]j - внутриклеточная концентрация натрия

Na+]0 — внеклеточная концентрация натрия

NVI - некротическое увеличение объема

PBS — физиологический раствор забуференный фосфатом.

PGE2 - простагландин Е2

PI - иодид пропидия

PLC - фосфолипаза С

ROS - Активные формы кислорода

RVD - регуляторное уменьшение объема

RVI - регуляторное увеличение объема

SDS - додецилсульфат натрия skACT - скелетный актин TGFp — опухолевый фактор роста р

Заключение.

Данные, полученные в нашей работе, могут быть суммированы следующими основными положениями.

I. Включение в структуру ДНК низкоэнергетического изотопа (3Н) является достаточным условием запуска апоптоза в клетках ряда тканей, включая VSMC, клетки эпителия почечных канальцев и клетки сосудистого эндотелия. Это наблюдение имеет несколько важных последствий. Во-первых, обнаруженное нами явление следует учитывать, дабы избежать артефактов, возникающих при использовании 3Н-трития для измерения синтеза ДНК и образования фрагментов хроматина. Во-вторых, мы полагаем, что накопление мутации в структуруе ДНК при включении в него пуриновых и пиридиновых оснований, содержащих радиоактивные изотопы, и связанный с этим явлением апоптоз вносит вклад в развитие радиационных осложнений. В-третьих, быстроделящиеся опухолевые клетки должны накапливать большие количества радиоактивно меченных оснований и тем самым быть наиболее подвержены апоптозу. В связи с этим, разработка методов доставки этих соединений к местам скопления опухолевых, быстро делящихся клеток, минуя здоровые клетки, может быть полезной для их использования в противоопухолевой терапии.

II. Подобно апоптозу стимулированному химическими воздействиями, апотоз VSMC, вызванный радиоактивным распадом 3Н, подавляется при ингибировании Na/K-АТФазьг уабаином. Это наблюдение указывает на то, что сигнальный каскад, запускаемый ингибиторами Na/K-АТФазы, воздействует скорее на универсальное звено апоптотического мезанизма, нежели на процессы, которые связаны с более специфическими начальными сигналами, возникающими при действии индукторов апоптоза различной природы.

III. При исследовании апоптоза, вызванного лишением VSMC ростовых факторов и защиты клеток ингибированием Na/K-АТФазы, было показано, что она опосредована через индукцию экспрессии антиапоптотичееких генов (Orlov SN et al., 2000b), включая ген морталина (Taurin S et al., 2002b). Однако начальные звенья этого процесса оставались невыясненными. Мы исследовали этот вопрос на примере экспрессии c-Fos, относящегося к суперсемейству генов раннего ответа. В этой части работы нами было установлено, что ингибирование уабаином No/K-АТФазы вызывает индукцию экспрессии c-Fos через увеличение внутриклеточной коцентрации натрия. Этот сигнальный каскад не был опосредован через модификацию внутриклеточного рН, объема клеток и [Са2*], Последнее наблюдение является наиболее важным, т.к. позволяет предложить новый опосредованный Са' -независимый механизм сопряж ения возбуждения и транскрипции, вовлеченный в подавление апоптоза,

IV. В заключительной части нашей работы мы исследовали механизм токсического действия уабаина, зарегистрированный в ряде клеток, включая эпителиальные клетки С7, выделенные нз днетального отдела нефрона. Нами было впервые обнаружено, тго некроз эпителиальных клеток, развивающгп/ся при действии уабаина не связан с инмюировиние и ионных потоков, опосредованных Ыа К-АТФазой, и с резким увеличение.* соотношения [No J/fK }„ наблюдающимся при действии yafxiuna.

Рассмотренные в совокупности, полученные нами данные позволяют предположить модель, объясняющую различный характер вовлечения сердечных глнкозндов в развит? апоптоза и некроза.

Гипотеза

2Кнекроз

1 Г апоптоз . каспаза-З

Рис. 48. Процессы, вовлеченные в блокирование апоптоза и инициирование некроза, вызванные воздействием уабаина

В клетках эпителия почечных канальцев уабаин вызывает конформационое изменение а-субъединпцы Na/K-АТФазы, что является достаточным условием для ее взаимодействия с неидснтифицированным белком, приводящим к активации сигнального каскада, завершающегося некрозом клеток. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о наличии ряда белков, напрямую связывающихся с Ыа/К-АТФазой, обнаруженных группой О.Д. Лопиной (Akimova OA et al., 2003). Так как некроз С7 клеток, обработанных уабаином, наблюдался в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белков (рис. 45), можно заключить, что все компоненты этого сигнального каскада уже присутствуют в этих клетках, и он не требует дополнительной экспресии белков, вовлеченных в передачу сигнала, приводящего к некрозу. VSMC лишены одного или нескольких компонентов этого сигнального каскада, что и определяет их устойчивость к уабаину. Именно благодаря этой особенности, удалось исследовать механизм ингибирования апоптоза в присутствии уабаина. Было обнаружено что антиапоптотический эффект этого соединения связан с увеличением соотношения [Na+]j/[K+]i (Orlov SN et al., 1999) и опосредован экспрессией супрессоров апоптотического механизма (Orlov SN et al., 2001), включая морталии (Taurin S et al., 2002b). Данные, полученные в нашем иследовании, позволяют предположить, что начальным фактором этого процесса является прирост внутриклеточной концентрации натрия, нежели потеря калия.

Предложенная модель включает несколько основных нерешенных аспектов. Какова природа белка, взаимодействующего с Na/K-АТФазой в присутствии уабаина и ответственного за начальные звенья сигнального каскада, завершающегося некрозом? При ряде заболеваний, включая гипертонию, обнаружено увеличенное содержание циркулирующих эндогенных соединений, идентичных уабаину и другим сердечным гликозидам (см. 1.1.6.). Каков вклад этих соединений в развитие некроза и нарушение фурнционирования ряда органов, включая развитие почечной недостаточности? Какова природа [Na+]i-ceHCopa, ответственного за экспрессию генов, вовлеченных в подавление апоптоза? Взаимодействует ли этот сенсор напрямую с промотором c-Fos невозможно, других генов, включая морталин, либо это взаимодействие опосредовано неидентифицированным фактором транскрипции? Наряду с уабаином и его эндогенными аналогами, активность Na/K-АТФазы регулируется целым спектром гормонов и нейромедиаторов. Кроме того, увеличение [Na+][ может быть следствием активации каналов и переносчиков, осуществляющих поступление этого катиона в клетку. Способны ли эти воздействия подобно уабаину подавлять развитие апоптоза? Мы надеемся, что эти вопросы станут предметом предстоящих исследований.

В нашей работе мы сфокусировали свое внимание на дуалистической роли ингибирования Na/K-АТФазы в клеточной смерти. Действительно, множество болезней связаны с патологией в клеточной пролиферации или смерти. При изучении гипертонии, болезни, являющейся одной из основных причин человеческой смерти, было показано, что нарушение функции сосудистой стенки и увеличение отношения толщины стенки к ширине сосуда влияет на патологию этого заболевания (Folkow В, 1982;Heagerty et al., 1993). Подобные нарушения являются следствием интенсивной клеточной смерти в стенке сосуда, и ее механизм играет ключевую роль в этом процессе (Hamet, 1995). Некомпенсированный пролиферацией апоптоз принимает также большое участие в таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера, тератогенез, ухудшение регуляции иммунной системы и многих других. С другой стороны, потеря клетками способности к апоптозу приводит к возникновению раковых заболеваний, где экпрессия антиапоптотических генов в клетках приводит к их трансформации с образованием злокачественных структур (Hockenbery DM et al., 1990). Мы полагаем, что полученные в нашей работе данные о двояком механизме действия ингибиторов Na/K-АТФазы на апоптоз и некроз будут использованы при разработке новых фармакологических подходов коррекции болезней, связанных с нарушением процессов регуляции клеточной смерти.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пшежецкий, Дмитрий Валерьевич, Москва

1. Варфоломеев С.Д., 1981, Конверсия энергии био-каталитическими системами., (Моск. Ун-т., Москва).

2. Орлов СН, 1985, "Транспорт моновалентных ионов через плазматическую мембрану клеток электрически невозбудимых тканй," Усп, Совр. Биол. 100,47-65.

3. Рубин А.Б., 1984, Термодинамика биологических процессов., (Моск. Ун-т., Москва).

4. Скулачев В.П., 1989, Энергетика Биологических мембран., (Изд. Наука, Москва).

5. Торан С, Хамет П, and Орлов СН, 2003b, "Na/K насос и внутриклеточные моновалентные катионы: новый механизм сопряженния возбуждения с транскрипцией, участвующий в подавлении апоптоза.," Мол. Биология 37, 371.

6. Aizman О, Uhlen Р, Lai М, Brismar Н, and Aperia А, 2001, "Ouabain, a steroid hormone that signals with slow calcium oscillations.," PNAS 98, 13420-13424.

7. Akera T, Yuk-Chow NG, Shieh IS, Bero E, Brody TM, and Braselton WE, 1985, "Effects of К on the interaction between cardiac glycosides and Na,K-ATPase.," Eur J Pharmacol 111, 147-157.

8. Akimova OA, Dolgova NV, Mast NV, Rubtsov AM, and Lopina OD, 2003, "Revealing of Proteins Interacting with Na,K-ATPase," Biochemistry in press.

9. Alvarez-Leefmans FJ, Gamino SM, and Reuss L, 1992, "Cell volume changes upon sodium pump inhibition in Helix aspersa neurones.," J Physiol 458, 603-619.

10. Amarente-Mendes GP, Finucance DM, Martin SJ, Cotter T, Salvesen GS, and Green DR, 1998, "Antiapoptotic oncogenes prevent caspase-dependent and independent commitment for cell death.," Cell Death and Differentiation 5,298-306.

11. Ameisen JC, 2002, "On the origin, evolution and nature of programmed cell death: a timeline of four billion years.," Cell Death and Differentiation 9,367-393.

12. Anderson, M. E., 2000, "Connections count. Excitation-contraction meets excitation-transcription coupling," Circ. Res. 86, 717-719.