Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностика буньявирусных инфекций и идентификация буньявирусов в Таджикистане (1991-1995 гг. )

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Диагностика буньявирусных инфекций и идентификация буньявирусов в Таджикистане (1991-1995 гг. )"

российская академия медицинских наук

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИ« ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

Г | 7 г ^ На правах рукописи

19 Ш

ТИШКОВА

Фарида Хаматгалиевна

ДИАГНОСТИКА БУНЬЯВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ БУНЬЯВИРУСОВ В ТАДЖИКИСТАНЕ (1991-1995 гг.)

03.00.06. — Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва — 1996

Работа выполнена в Таджикском научно-исследовательском институте профилактической медицины. Директор д.м.н., профессор Ф. И. Одинаев

Научные руководители:

доктор медицинских наук П. Г, Дерябин

доктор медицинских наук, профессор Ф. И. Одинаев

Официальные оппоненты-.

доктор медицинских наук С. Д. Львов

доктор биологических наук Г. А. Сидорова

Ведущая организация — Государственный институт стандартизации и контроля биологических и медицинских препаратов им. Тарасевича МЗ РФ.

Защита диссертации состоится 1996 г.

в часов на заседании специализированного совета

(Д.001.20.02.) при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Российской АМН по адресу : 123098, Москва, ул. Гамалеи д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан -ь

Ученый секретарь специализированного ученого совета

доктор медицинских наук Н. П. Косякова

ВВЕДЕНИЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Арбовирусные инфекции в связи с их многообразием, широкой распространенностью и тяжестью клинического течения привлекают пристальное внимание медицинской науки и здравоохранения во всем мире. Интенсивное изучение арбовирусов и вызываемых ими заболеваний проводятся во многих лабораториях США, Англии, Канады, Японии, франции, Китая, Австралии и других странах.

Хотя удельный вес арбовирусных инфекций в общей массе ин-

*

фекционных заболеваний относительна невелик, однако в силу тяжести их течения и нередко неблагоприятного исхода они представляют серьёзную проблему для здравоохранения.

Иэ числа арбовирусных инфекций в Таджикистане по-прежнему актуальной для здравоохранения остается крымская-Конго гемор- . рагическая лихорадка, немаловажное значение имеют москитные лихорадки, лихорадки Тягиня, Иссык-Куль и Западного Шла

Поэтому одной из ведунах задач,-поставленных перед здравоохранением, является борьба с арбовирусными заболеваниями и ключевым звеном этой программы служит лабораторная диагностика арбовирусных инфекций, разработка и совершенствование современных методов лабораторной' диагностики вирусных инфекций и индикации вирусов представляет собой одно из важнейших направлений прикладной вирусологии.

Необходимость существенного улучшения диагностической службы объясняется важностью более быстрого и эффективного вы-

явления заболеваний у людей и оперативной оценки элидситуации

I

в целях современного проведения противоэпидемических мероприятий. В соответствии о этим особое внимание уделяется проблеме экспресс-диагностики и быстрой индикации вирусов, повышению чувствительности и специфичности методических приемов, простоты выполнена и доступности для широкого применения.

Анализируя существующие методы быстрой диагностики и индикации, в том"числе разработанные в последние годы, мы остановили внимание на реакции иммуноферментного анализа (ИФА) как наиболее простом и пригодном для широкой практики. Несмотря на то, что основные принципы метода, разработаны 20 лет назад и достоинства его' неоднократно продемонстрированы при "экспресс- диагностике различных вирусных заболеваний, метод до сих пор не нашел широкого применения для диагностики арбовирусных инфекций в Таджикистане.'

К началу "налшх исследований ' в литературе имелись лишь единичные сведения о"применении ИФА при арбовирусных;инфекциях в -Таджикистане (0. И. Вшемускяй 1993 г),- попытки более широкого использования метода в лабораторной диагностике арбовирусных инфекций,' его внедрения в практику здравоохранения респуб-' лики не предпринимались, и ■ данные об их ' -диагностической возможности отсутствовал!).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ ■ "

Целью настояшгй -работы являлись адаптация ■ методов •иммуиофгрментного анализа для у.ског«нноЙ лабораторной диагностики арбовирусных инфекций, -циркулирующих на территории

Таджикистана, оценка эффективности их использования и внедрение в практическое здравоохранение республики. *

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

-провести вирусологическое и серологическое обследование больных с лихорадками неясной этиологии для выявления случаев заболеваний, вызванных "арбовирусами;

-апробировать различные варианты иммуноферментного анализа для выявления • спектра и активности арборирусов, циркулирующих на территории республики Таджикистан .

-изучить уровень и структуру гуморального иммунитета к эндемичным арбовирусам (К-КГЛ, ТяТ-иня, ^москитные лихорадки) у людей, сельскохозяйственных животно на основе новых методов;

-оценить эффективность использования различных вариантов ИФА для индикации и идентификации вирусов К-КГЛ, Тягиня и москитных лихорадок, а также диагностики вызываемых ими заболеваний, в сравнении с традиционными вирусологическими и серологическими тестами.

НАУЧНАЯ НОВИЗЙА ИССЛЕДОВАНИЯ Впервые в республике-Таджикистан для экспресс-диагностики К-КГЛ, Тягиня и москитных лихорадок были использораны методы ИФА.

Показана высокая специфичность и чувствительность метэда "захвата" ,1вМ антител (МАС-Е1Л5А). позволившая на 4-6 дни выявлять диагностические 1®М антитела в сыворотке крови больных.

- 6 -• •

Метод ИФА позволил впервые выявлять антиген вирусов К-.КГЛ, ТягиЬя и москитных лихорадок в ранние сроки в сыворотках крови больных; сельскохозяйственных животных и в суспензиях переносчиков арбовирусных инфекций.

Впервые в Таджикистане с помощью ИФА в крови больного был обнаружен антиген вируса неаполитанской москитной лихорадки и выделен возбудитель этой инфекции. Обнаружена активная цирку-

•г

ляция Еирусов неаполитанской и сицилийской москитных лихорадок и Каримабад на территории республики. . '

Впервые проведена сравнительная оценка эффективности ис-

• пользования различных модификаций . ИФА для выявления • • *

специфических иммуноглобулинов классов Ы и G к вирусам К-КГЛ и москитных лихорадок.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработана эффективная тактика специфической диагностики арбовирусных инфекций, основанная на применении ИФА и его варианта - MAC ELISA. АпреОЦция этого метода в ряде вирусологу-'

• ческих лабораториях республики Таджикистан (3 акта внедрения) ■ позволила' рекомендовать ИФА для экспресс-диагностики' арбовирусных инфекций во всех вирусологических лабораториях СЭО, а также госпиталей и больниц республики.

Разработаны ,и внедрены в ряде- практических лабораторий республики методические р-жзмендации: "Диагностика крымской-Конго геморрагической лихорадки (К-КГЛ) иммуноферментным методом", "Крымская-Конго геморрагическая лихорадка" ( по 3 ачта внедрения). Методические • рекомендации утверждены минис-

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЭАШТУ.

1. •Иммуноферментннй анализ является высокоспецифичным, чувствительным, экономичным при индикации циркулирующих в различных регионах республики Таджикистан вирусов К-ИЛ, Тягиня, москитных лихорадок, в различных биологических материалах.

2. Вариант И1>А - метод "захвата" 1гМ антител (МАС-ЕЫ5А) характеризуется высокой диагностической ценностью и может использоваться для экспресс-диагностики заболеваний, вызванных бунья- и флебовирусами в Таджикистане.

3. Анализ изучения уровня гуморального иммунитета к вирусам москитных лихорадок у людей с8идете^ьству£т о.б активной циркуляции этих вирусов на территории республики Таджикистан.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. .' '

. ' Материалы диссертации доложены на:

- Конференции общества эпидемиологов и микробиологов в Таджикском научно-исследовательском институте эпидемиологии и гигиены, май, 1994 год. 4 .

- Ученом Совете Таджикского научно-исследовательского института профилактической медицины, ноябрь, 1995 года.

- Конференции отдела экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского, апрель, 1996 год.

ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации отражены в 8 опубликованных научных работах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из

изложена на . страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы ( отечественных и зарубежных источника). Работа иллюстрирована 15 таблицами й 3 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛ К МЕТОДЫ.

Основная работа по сбору материала проводилась в южных районах республики Таджикистан' и г. Душанбе в период с 1991 по 1995 гг.

Сбор сывороток крови от ■ больных неясными лихорадочными заболеваниями проводился в инфекционных отделениях городских и районных больниц. Сыворотки крови от практически здорового населения были получены из областной и республиканской станций по переливанию крови.

•Клещи и сыворотки крсви крупного рогатого скота (КРС) и мелкого рогатого скота (МРС) были собраны в очагах к эндемйч-ных районах по K-KT.IL

Комары и москиты отлавдмгались в различных районах Южного Таджикистана. Общй объём собранного материала представлен в таблице К 1.

Выделение вируса проводили на новорожденных белых мышах по методу, описанному Д. К Львовым с соавт. 1970 г.

Работу 'та идентификации новых вирусных агентов проводили на уровне 4-Г> ! чссажа на 1-3 дневных белых мышах и готовили

ОШИИ ОБЪЕМ СОБРАННОГО МАТЕРИАЛА

Таблица 1

Вид материала ! Количество

1.Сыворотки крови здоровых людей 1032

Парные сньоротки от больных Печеными лихорадочными 'заболеваниями . 749

а) Городская инфекционная больница 184

б) Госпиталь погран. войск 392 а) Больные и контактные с диагнозом

К- КГ Л ■ 173

3. Клещи 5255

4. Комары ■ 22810

6. Москиты 1500 G. Сыворотки крови КРС 1431

7. Сыворотки крови МРО ¡500

.итигеи метолом сахарозо-ацетоновой экстращии (Casais 1958), ■оторкй испольвойали в реакции связывания комплемента (РСЮ с чс- сыворотками к г-ирусам, имеющихся в банке лаборатории .рборирусяьи инфекций Таджикского НИИ профилшстической м*ди:1икы

и НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

' I

Иммунные асцитные жидкости (ИАЖ) получали по описанной ранее методике (С.Я Гайдамович с соавт. , 1074).

Прямой вариант \Ш в "сэндвич" модификации использовали для , экспресс-индикации антигенов вирусов в пулах кровососущих членистоногих переносчиков, в сыворотках крови Сольных и животных. Полистироловые планшеты сенсибилизировали ЕИрусспеци-фичеекими мышиными IgG в течении ночи при +4 С. Исследуемые образцы вносили в лунгл сенсибилизированных планшетов, по 0,05 мл и инкубировали при 37 С в течении 1 часа. Планшеты отмывали триады ФСБ-Т, вносили коньюгат по 0,05 мл в каждую лунку £ рабочем разведении и оставляли на 1 час при 37 С. Непрореагиро-вавший коньюгат удаляли вытряхиванием, после чего планшеты промывали 5 раз ЯСБ-Т и в каждую лунку вносили по 0,1 мл субстрат -индикаторного раствора. Инкубация проходила 15-20 мин. в темном месте при комнатной температуре, реакиш останавливали Z Н серной.кислотой. В качестве лнзимсубстрата использовали ОФД (Sißma.USA) - 4мг на . J мл 0,1 Ы 1№В pH 5,0 в присутствии 0,0(56% перекиси водорода .Результат учитывали фотометрически на приборе' "Мультискан" при длине волны 49П им или аиоуально.

Для специфической диагностики арбовирусных -инфекций и се-роэпидемиологических исследований использовали РСК и М<1А. Поиск специфических It'G проводили методом И1А в варианте непрямого "сэндвича"; специфических иммуноглобулинов класса М -методом "захвата" IgM антител (MAC-ELISA).

Постановку MAOfc'L.'lGA осуществляли ' ' схеме, описанной С. Н. Caliper с соавт. 1986,' с * небольшими изменениями. Лунки

96-луночных планшет сенсибилизировали , козьими антителами против м-цепей ItrM человека (Sit'ma.USA). Затем последовательно вносили сыворотки в разведении 1:200, специфические антигены вирусов К-КГЛ, Тягиня.НШГ. СМЛ в рабочем разведении , нормальный антиген в качеетре контроля и (ганьюгат специфических Ig мьш: с пероксидазой хрена в рабочем разведении. Специфические IgG выявляли по схеме: иммобилигированный на твердой фазе специфический мышиный I? , сахарозе-ацетоновый или культуральный антиген, исследуемая сыворотка крови человека (наименьшее разведение 1:100), пероксидазный коньюгат крольичих антител против IgG человека в рабочем разведении (Signa,USA). Положительными считали ; пробы, оптическая плотность которых в 2,1 превышала оптическую плотность отрицательных контролей. Положительные пробы затем титровали в двухкратных раз ведениях.

Все тест-системы ИФА бани приготовлены научными сотрудниками лаборатории биологии и индикации арбовирусов НШ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН Лавровой Е А. и Хуторецкой Н. Е РОК ставили по общепринятой методике с двумя дозами комплемента. . ,

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

К началу проведения исследований в Таджикистане не была налажена экспресс-диагностика для арбовирусных инфекций. В связи с этим нами проведена работа с применением ускоренных

-

методов диагностики. Учитывая преимущее!во метода ИФА по сравнению с другими серологическими 'реакциями, была изучена воэмож-• нэсть их широкого применения при обследовании очагов арбови-

.русных инфекций и' ранней диагностики заболеваний.

• *

1. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка и ее диагностика.

1.1. Среди арбовирусних инфекций в республике Таджикистан наибольшую практическую значимость имеет КГJI-Конго.

В течении 1991-1995 *гг обследовано 173 сыворотки крови больных и контактных с диагнозом КГЛ-Конго из которых у 39 подтвержден диагноз К-КГЛ. Выявления по годам были распределены следующим образом: в 1991 - 16 больных, в 1993 - 7,в 1994 -!5 п в 1995 - 11 больных. Наибольшее число заболевших отмечено в 1991 и 1995 годах, в эти периоды отмечались вспышки вследствии контакта людей с кровью и мясом инфицированных животных при убое скота. Из 39 Сольных погибло 15, летальность ' составила 38 & если Енализировать по годам, то этот показатель варьирует от 14 до 80%.

1.2. Выделение вируса К-КГЛ от Сольных людей.

Иг 173 собранных проб крови от больные и контаотных с диагнозом К-КГЛ, 160 были исследованы методом ИФА на наличие антигена V: вирусу К-КГЛ. В результате в 17 пробах крови обнаружен антиген к вирусу К-КГЛ * .

■ Вирусологически исследовано 29 проб крови • от больных Я-,КГЛ . В результате было выделено 13 вгаммов вируса К-КГЛ.

Кз 17 положительных проб в ИФА методом биопробы'иссле-довны 9 проб крови, в результате чего удалось выделить 7 штам-_ мов вируса К-КГЛ, что составило 77% от числа обследованных биопробой.

Итак кз 39 больных антиген к вирусу К-КГЛ обнаружен в 17 пробах (44%). Антиген выявлялся в сыворотках крови взятой на 2 -4 день от*начала заболевания. В сыворотках крови взятых в более поздние дни антиген в крови методом ИТА выявить не удавалось.

1.3. Выделение вируса К-КГЛ от клещей.

Исследовано 5255 • клещей. Исследование проводили 2-мя методами - иммуноферментным (прямой "сэндвич") и биопробой. 'При исследовании клещей H. an. anatolicum методом ИФА на наличие антигена , в 3 пулах был обнаружен шгиген к вирусу К-КГ'Л. Б дальнейшем положительные пулы исследовели методом биопробы, что позволило выделить 3 штамма вируса К-КГЛ. Клещей, которые дали ■отрицательный результат в И£А'. исследовали в биопробах, но вирус выделить не удалось.

В данном случче ьирсфорйоеть клешей составила: один эара- ' «чший iui-ш, на 1751 незасаженных,. а по данным Т. П. Пак и '">1 А. Дчкиярова (!&7& г.) зараженность для клещей составила 1: <Ш> MVO ''кз. • .

1. 4. Исол^довгшие сывороток крови крупного и мелкого рогатого скота методом ИЬА на антиген к вирусу К-КГЛ. '

Метолом ИФА (прямой "сэндвич") было исследовано ■ 1431, са-' лорстш КРО и 5ÔC1 сывороток MPC ( таблица 2. )

- M -

Таблица 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВЛККЯ СЫВОРОТОК КРО И MPC ШМУНСЖРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ

Районы . исследования

! Всего | КРС }с-ок КРС| антиген i ! ¿--ИГЛ '

! Всего I MPC |с-ок MFC I антиген I I К-КГЛ

асе 17.(М+т)

абс I %( М+т)

Î. Ленинский 175

2.Турсунаадевский 1£0

3. Шаартузский 117 \. Гиссарский 143

5. Дангаринский 68

6. Советский 125

7. Пархарский 170 В. Куйбышевский 169

9. Кафирнеганский 146

10. Пянджский 127

2,3+1 /09 40 1,6+5.1 5,0+2,2 .2,7+1,3 2.9+2,0 2,3+1,3

1,2+0,8 l,3i0, У

ао

''О

33

1 2,5*2,4

1 1,25+1,2 1 1,4+1,1

Всего

1431

26 2,5+0,4

500

3 1,7+1,5

Как };йдно из таблицы антиген обнажу,м-,. в сыворотках крови KF1 ь 25 случаях (2.5%), а в сыворотках крови MPC в 3 случаях г.1,7%). Вое образцы, оказавшиеся положительными при первичном

4

4

2

скриненге, переставлялись, отмечалось полное совпадение. Наибольший процент приходится на Шаартуэский район,это не случайно, т. к. в этом районе чакр всего регистрируются случаи заболевания людей К-КГЛ при убое и разделки туш скота

При вирусологическом исследовании этих сивороток крови вирус выделить не удалось.

Впервые для обнаружения в крови антигена к вйрусу К-КГЛ применен иммуноферментный метод, который позволил »а ¡«эроткий. период времени иметь представлентс об уровне зараженности сельскохозяйственных животных возбудителем К-КГЛ, и рекомендовать мясокомбинатам таких животных забивать через 2 г:?де.та после обнаружения антигена вируса К-КГЛ |гирусёмия в крови тавотных держится з течения 14 дней Gonzales ]. Р. о созвт. 3992 г.).

1.5. Изучение вспышек заболеваний 1С- IT Л с использовш.-ем

im

Для расшифровки гспышек в Турсунзадевсгам я Илартузсиом районах был успешно применен ^етод ИФА как для вьивлэнля алти-гена, так и специфических *штител в и ьз о ротках крози Эольнш. Проведена сравнительная характер'.стш-са егтецов' лабораторной диагностики и оценка эффективности их кспользовалия яри рйс-шифровке заболеваний, вызванных вирусом К-КГЛ. ¡,

Дня оценки специфичности гктода и$д и его диагностической ценности, как метода ускоренной серодиагностики заболевания, связанного с вирусом К-КГЛ, проведено сраакенпе результатов, полученных при обследовании сывороток. крозк от 27 больных мэ~ ходами биопробы, РОК и ИФА (таблица 3).

Таблица 3.

ДИАГНОСТИКА БОЛЬНЫХ К-КГЛ РАЗНЫМИ ЖГОДАМИ

! кл/п! ФИО N 1............"г 1 Дата | МАС-ЕЫЗА ИФА ! РСК ■ 1 1 ИФА |Био|исход

1 |сыв-взятия! 1кб 1 антиген!про|

• ! ки (крови | | | » 1 1 ' |ба | . 11

Л. Г. К. 1 6 1200 * 100 ■. _ вызд

2 19 24300 1600 40

3 120 400 4000 40

2. Э. И. 1 3 ЙИ **■' * • НИ НИ НИ + вызд

• 2 19 24300 800 40

3 60 800 6400 160

4 120 200 12800 80

3. Б.Х. 1 3 НИ НИ НИ НИ • + вызд.

?. 16 24300 400 ео

3 58. 4000 3200 160

* , 4 120 400 1280? 160

'.4. Б. Ш. 1 4 ' НИ - _ + + вызд

2 17 2700 400 ъо исх зар.

3 120 200 4000 40 нбм

г. с. 1 1 НИ - + •+ вызд

2 12 8000 800 40. исх аар

* , 3 120 ' 200 . 4000 40 нбм

!б. 8.Н. 1 б 1600 - _ - вызд

2 14 3200 400 40

3 120 ,400 12800 40

'.?. Н.Х. .1 3 - - • + + вызд

2 20 16000 4000 80

3 • 90 800 12800 40

1 8. А: С. 1 4 •100 - _ _ вызд '

2 17 2000 800 20

з 120 400 1600 40

1в. т. т. •. 1 4 - - клиники

• контакт 2 11 6400 400 80 не было

3 120 400 1600 40

4 1 год i 1600 40

; ю. т. р 1 4 200 - - клиники

Контакт 2 11 6400 800 40 ке было

3 120 400 2000 40 <

4 1 год 7 1600 40

Продолжение таблицы 3.

Nn/ni ФИО ¡ N i' Дата ¡ MAC-ELISaÍ ИФА i РСК |ИФА' [Ёио[исход I |сыв-взятия| IIgG I антиген Iпро i

. ! |ки ¡крови j III- |ба j

! п. i ......i О. IL контакт i i 3 16 90 1 год 3200 400 • 200 160С 1600 _ 160 80 8 у ... i. клиники це было

'.12. ¡I 0. 3 9 1000 + исх зар. гибель

'. 13. М. А. 3 - + + гибель

! 14. П. А. контакт 3 9 60 800 1600 100 3200 80 • « вызд

! 15. . М.Х о - * + + гибэг

; 16. 0. Э. 3 + + гибель

! 17. н. р. 3 - ' - + + гибель

! 18. Э. С. 2 - + ' НИ гибель

! 19. К. н. 3 15 90 . 24000 3200 200 6400 160 160 • + НИ вызд

К. Д. конт . 3 - НИ гибель

.21. А. Р. 2 - НИ гибель

. 22. У. А. 7 ■ 12800 - вызд '

. 23. К. К. 3 , ни гибель

".24. К. Р. 3 - + НИ высд

! 25. У. Ф. б ' ■ 6400 вызд

Í26; X. 3. конт. 3 4 f ни гибель

.27. У. X. юнт 3 . ни гибель

* не личин; - не обратная титру.* еследовали. •

Методом ИФА' (прямой "сэндвич") антиген вируса К-ИГЛ в крови, ввятой на £-4 день от начала заболевания, выявлен у 17 больных. При обследовании этих больных методом биопроби было выделено 11- атаммов вируса К-КГЛ (пробы 1995 г вирусологически не исследовали). Большой процент совпадения выделения методом

бкопробы и ИФА' свидетельствует о высокой специфичности. и

i!

чувствительности иммуноферментного метода.

Применение MAC-ELiSA позволило в первых сыворотках крови выявить Ig класса М уж на 4-7 день от начала заболевания в титрах 1:100 - 1:8000. При серологическом исследовании вторых сывороток крови реконвалесцентов было обнаружено, что IgM регистрировались в титрах 1:800 - 1:24300, тогда как в РСК титры были 1:20 - 1:160. Появление Ig8 зарегистрировано начиная с 6 дня от начала заболевания в титре 1:100. При исследовании парных сывороток крови на 0-50 день, титры IgG регистрировались 1:800 -1:6-100- Исследование сывороток крови через 3-4 месяца енявило спад IgM антител дс 1:100 - 1: 400 и нарастание Ig3 до 1:12800. При исследогачии сывороток крови через 12 месяцев IgG регистрировались в титрах 1:1600, sk IgM - отсутствовали.

Т, о. идеальным вариантом серс логического подтверждения диагноза является обнаружение специфических IgM с регистрацией положительной динаШки нарастания титров специфических - IgG и компл^мектсвявываших антител в парных сыворотках крови.

2. Uimwn .-и« ИФА для диагностики лихорадки Тягикя.

Многолетние вирусологические и серологические исследования выявили циркуляцию вируса Тягиня на территории Таджикистана (Д. К. Льнов, М. А. Костиков и др.). Случаи заболевания лихорадкой Тягиня регистрируются ежегодно. Клинические проявления заболеваний,вызываемых вирусом'Тягиня разнообразны: от грип-поподобных форм до заболеваний с выраженным лордачшем ЦБС. При отсутствии патогномоничных симптомов при этих заболеваниях, решающее диагностическое значение имеют методы специфической диагностики. С этой целью проведена работа по использованию вариантов PŒA для комплексного обследования природных очагов буньявирусных инфекций.

С целью сравнения эффективности использования методов КМ и биологической изоляции вирусов на новорозденнннх белых мышах для индикации тлгинегюдобных вирусе и в суспензиях членистоногих переносчиков, параллельно двумя методами было исследовано РГ310 комаров О. pipi ens, An. hyrcanus, А. с. сагршз. An. pulche-1ч »лis из разных районов Ktooro Таджикистана. В результате исследовании исходных суспензий комаров в им»'уноферментных тест-системах к вирусу Тягиня антиген был обнаружен в одной пробе. При исследовании этих суспензий методом биопробы было изолировано Г: штамма вируса Тягиня. Исследуя суспензии ткани мол га ми:®?й исходного заражения на 5-6 день инкубации методом M'A, был найден антиген к вирусу Тягиня в пробе, иа которой в дальнейшем выделили штамм вируса. Проведенная сравнительная оценка ИФА и ГГК для идентификации выделенных в Оиопройе из пули?; комдрое кир^сных агентов показана, что пр,„.., мение _ Ш\ поаьолило уже в процессе пассирования провести идентификации

- го -

вируса Тягиня, тогда как в PGR идентификацию проводили только " о после 3-го пассажа и обработки вируссодержащей мозговой суспензии методом сахарозо-ацетоновой экстракции.

Методом ИОД на наличие антигена и специфических антител к . вирусу Тягиня было обследовано 376 сывороток крови от больных .неясными лихорадочными ааболевмшямг,

В результате исследования антиген' был обнаружен в .7 случаях, Антиген определяли в еывороткях крови, взятых на 1-3 день от начала заболевания. Чувствительность метода ИФА для выявления антигена вируса Тягиня в сыворотке крови сравни- , вали с чувствительностью классического метода Сиопробы. В ре-еудьтате методом биопробы было изолировано 5 штаммов вируса Тягиня,что свидетельствует о высокой чувствительности и диагностической ценности ЙФА.

Для серологической диагностики заболеваний, вызванных вирусом Тягиня и оценки дцсоч,' готических возможностей метода ИМ был проведен сравнительный >щидиз данных, полученных при пара--лельном обследовании методами ИФА и РОК.. •

В рсаультат - проведенных кссдодоианий ь 5 сыворотках, в которых ранее был обнаружен антиген к вирусу Тягиня, гюрегииг-рироьшш специфические антитела класса М в 'титрах 1:^00 . 1:12800 , кроме того. Ig М антитела в диагностических титрах (1:800 и более) были выявлены ещь в.Б сыворотках.

Вторые сыворотки крови от сольных, взятые на а-?.?, дни от на-чма заболевания, исследоваяи в ИФЛ с ue^J установления факта нарастания l^G. Во всех случаях определялись антитела класса G в титрах 1:200 - 1:1600. При исследовании этих сывороток ь К-К

были выявлены специфические комплементсвяэывагаие антитела в титрах 1:10 - 1:80. Данные по выявлению антител в РСЧ и Шк совпадали, однако, титры антител, выявляемых в ЙФА, бь-m значительно выше.

При последующем обследовании сывороток крсви, ввятых после 2-3 месяцев от начала заболевания, было отмечено нарзс;-такие igG до 1:1600 ; 1:6400 и выраженное падение IgM с 1 :800 до 1: 100 и с 1:6400 до 1:200.

Таким образом применение, метода ИФА позволило выявить антиген к вирусу Тягин*. а следовательно, установить диагноз

у 7 больных. Изучение динамики титров IrM я IgCI антител

«

подтвердило данное заболевание.* В сыворотках больных, взятых на 4-6 день болезни, уле определись вбсокж титры igM, что позволило поставить диэгкоэ по одаой пробе сыворотки на ранних сроках заболевания.

Полученные данные позволяют сделать обиее заключение о высоких диагностических возможностях метода ИФА и его вариантов перед классическими серологкческжи гестами С PCR). • ' *

3. Москитные лихорадки и их диагностика.

Для выяснения циркуляции вирусов москитных лихорадок была проведена работа в трех направлениях: анализ эабояевзеыости москитной лихорадкой в республпкз в прогике годы, серологическое обследование сывороток крови населения, noterai,больных и попытки выделить вирус от больньй н москитоз с применением экспресс-методов диагностюед. •

По данным Республиканской СЭС москитную лихорадку отмечали в равнинных и среднегорных районах, т. е. там, где распространен переносчик Ph. papatasi. Наиболее высокую заболеваемость регистрировали на равнинах, где численность переносчика выше.

Исчезновение москитных лихорадок после 1950 года было вызвано снижением численности Р. papatasi под действием массовых противомалярийных обработок. В дальнейшем, после практической ликвидации малярии, интенсивность обработки снизилась, численность Р. papatasi стала восстанавливаться, естественно предположить, что выявление лиц с антителами к вирусам москитных лихорадок свидетельствует о циркуляции вируеог, что подтвердило серологическое обследование населения в 1977 году (С. Я. Гайдамович и др. J 978 г.). ! '

Вирусологическое.исследование 1500 москитов Р. papabas i на наличие вирусов москитных лихорадок дали отрицательный результат.

Было исследовано 576 сыворотк крови от больных. В результате от больного (военнослужащий) из Московского района с диагнозом "малярия" был выделен штамм вируса (9БЭ9 Тадж), идентифицированный с помощью -РОК как вирус неаполитанской москитной лихорадки (НМЛ). Г^и первоначальном заражении кровью больного мыши-сосунки заболели н& 14 сутки. При последующих пассалач инкубационный период сократился до 6-7 дней. Штамм 95S9 Тадж оказался высокопатогенным для новорожденных белых мыжй при ;.ятрацеребральном заражении.

При исследовании парных сывороток крови этого больного методом ИМ, в r'VBOñ сыворотке крови, взятой на 2 день от нача-

ла заболевания, .был обнаружен антиген к вирусу НМЛ, во второй сыворотке,взятой'на 6 день, выявлены специфические антитела класса М в титре 1:800, в третьей (16 день) сыворотке крови зарегистрировано 8-ми кратное нарастание специфических в

(1:800-1:6400) и обнаружение 1е0 антител в титре 1:1000, что позволило нам диагносцировать. данное заболевание как НМЛ.

• Для изучения интенсивности циркуляции вирусов москитных' лихорадок и имушюго статуса населения', мы исследовали 1082 ' сыворотки крови населения 8 районов и г. Душанбе. Исследования проводили в РСК с антигенами вирусов СМЛ, НМЛ и Каримабад. •

Наиболее высокой оказалась имунная прослойка к вирусу НМЛ ' (6,7% расел^ния обследованных районов). Наиболее часты полоот-тельные находки в Кумсангирском (25,5%), Колхозобадеком (17,1%) и Яванском (11,4%) районах.

Антитела к вирусу СМЛ найдены у населения из 6 районов республики (3,3%). Наиболее часто они встречались у населения Гапималикского (12,7%) и Пархарского (6,3%) районов.

Реже ьтречапись антитела к вирусу Каримабад (1,74% населения трех районов).

Антитела ко всем трс-м вирусам найдены у населения Газима-дикского, Пархарского и Пянджкого районов.

Приведенные данные указывают на широкое распространение грех флебокирусоп (НМЛ, СМЛ, КаримабЬд;

Методом И'1>А было исследовано 392 больных неясными лихорадочными заболеваниями ие госпиталя пограничных войск и 184 из городской инфекционной больницы

5лн обнаружения антигенов, сыворотки крози были исследова-

ны в иммушфе-рментных тест-системах к вирусам НМЛ и СМ В ре- <

гультате ь 9 еывооотках крови был найден антиген к вирусу НМЛ. У больных, в сыворотках которых был обнаружен антиген к трусу ШИЗ, были в'зяты вторые сьшоротки крови на 6-19 день от начала заболевания, которые иЬследоваля в ИМ для обнаружения ¡е класса М и Б и ь РСН.

класса М к вирусу НМЛ были обнаружены в 8. из 9 сывороток в титрах с 1:800 -1:3200). Антитела класса Э к вирусу НМЛ были обнаружены в ? случаях в титрах (1:100 .-' 1:1000). В РСК комплемектсвязывавде антитела также были обнаружены в 7 случаях В титрах (1:10 - 1:80)

При исследовании сывороток иэ инфекционной больницы г. Душанбе антиген не был обнаружен ни в одной сыворотке. к вирусу НЫЛ были обнаружены у 3-х больных в титрах (1:200 -1:1600). Во вторых сыворотках, взятых на 7-18 день, специфические 1йМ обнаруживались в титрах (1:1600 - 1:4000). в этих сыворотках выявлялись я титрах (1:200 - 1: 400).

Нами были исследованы'' 86 сывороток крови детей из Пянд-жского района о диагнозом дифтерия. В результате ь двух сыворотках были выявлены 1еМ к вирусу СМЛ,

Таким образом находки в крови больных 1дМ'к'вирусам НМЛ и СМЛ, антигена вируса' НМЛ и выделение вируса НМЛ являются прямым доказательством наличия заболеваемости москитными лихорадками в настоящее время ь Таджикистане. '

ВЫВОДЫ

1. Впервые для серологической экспресс-диагностики инфекций, вызываемых буньявирусами КГЛ-Конго, Тягиня и флебовируса-ми москитных лихорадок, циркулирующих на территории Таджикистана, был адаптирован и внедрен метод Шк. Показана высокая чувствительность, специфичность метода, по многим параметрам в значительной степени превосходящего классические вирусологические тесты.

2. Установлено, что прямой вариант Шк ("сэндвич" модифи-

?

кзади) - высокочувствительный тест,'* позволяющий выявить антигены вирусов К-КГЛ, Тягиня и москитных лихорадок в крови больных, взятой на J-3 день от начала заболевания.

3. Установлена высокая специфичность ответа lgM антител, Еыявляемых методм MAC-ELISA у людей, инфицированных вирусами ■ К-КГЛ, Тягиня, москитных лихорадок. Ранние антитела выявлялись на 3-6 день от начала заббльвания.

4. Впервые показана высокая эффективность использования ИФА для выявления антигена вирусов К-КГЛ, Тягиня в крови сельскохозяйственных животных и в суспензиях переносчиков (клещ, комары). Частота обнаружения вирусного агента с помощью ИФА коррелировала с числом последующих положительных выделений вирусов методом биопробы. ■

5. Впервые из крови больного, был выделен вирус неаполи-

танзкой москитной лмхррадки.

6.Впервые при диагностике К-КГЛ, Тягиня, москитных лихорадок, циркулирующих в Таджикистане показана возможность эффективного использования варианта ША для обнаружения антител в сыворотках крови больных.

7. Сравнительный анализ современных и классических серологических методов исследования в республике показал, что по чувствительности варианты ИОД - метод "захвата" 1гМ антител (МАС-ЕЫЗА) , непрямой "сэндвич" на 2-3 превосходят классические серологические методы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

. 1. Вышемирский О. И., Гордеева 3. Е., Тишкова Ф. X. , Булычев . К П. ,• Немова Е Е , Волкова Т. Е и др. Вспышка Крымской-Конго геморрагической лихорадки (К-КГЛ) в Шаартузском районе Таджикистана. //Здравоохранение Таджикистана N 2 -Душанбе, 1992 - с. 54-56.

2. Вышемирский 0. И., Гордеева 3. Е., Тишкова Ф. X , Булычев ЕЕ , Волкова Т. Е Расшифровал вспышки Крымской-Конго геморрагической лихорадки (К-КГЛ) в Гаджикиставне разными методами.// Здравоохранение Таджикистана - Душанбе, 1093, N 5 с. 10-12.

3. Гордеева 3. Е., Тишкова Ф. X., Булычев Е П., Данияров 0. А. , Волкова Т. Е О длительности сохранения антител к вирусу Крымской--Конго геморрагической лихорадки (К-КГЛ) у переболевшие. //Здравоохранение Таджикистана - Душанбе, 1993, N 3 с. 23. 24.

4. Тишкова Ф. X Ранняя диагностика арбовирусных инфекций иммуноферментным методом.//Материалы годичной - 42-fl научной конференции госмедунИверситета. Душанбе. И)94. с. 152

5. Волкова Т. В. , Тишкова Ф. X . ГордееЕа 3. Е. , Булычев В. П. , «Хуфаев А. й , Шарипов А. С. Выделение вируса неаполитанской москитной лихорадки иэ крови больного в.Таджикистане.// Материалы годичной 43-й научной конференции госыедуниверсите-'та, Душанбе. 1995. с. 192-193 ,

6. Волкова Т. В. , Гордеева 3. Е., Тйшковз Ф. X , Хуторецкая К В. / Серологические доказательства циркуляции вирусов москитных лихорадок в Таджикистане. ..//Здравоохранение Таджикистана. 1-994. -N4 - с. 25-26.

7; Тишкова Ф. X • Ранняя диагностика Крымской-Конго геморрагической лихорадки иммуноферментным методом (ИМ).// Методические рекомендации. Душанбе. 1994. - 7 с.'

8. Тишкова Ф. X , Булычев а П., Данияров 0. А. , Гордеева 3. К. Крымскоя-Конго геморрагическая лихорадка (К-КГЛ) // Методические рекомендации. Душанбе. 1995 - 11 с.

9. 0. 1. Vyshemirsky. F. Kh.-Tyshkova,. А. М. Butenko,3. Ya. Gaida-nnvich. / Crimean-Congo haemorrhagic fever in Tadjikistan.// Abstract. N 1044, in press'. Xth International Congress of Virology. Jeiusalem, Israel', 11-16 august., 1996.

Подписано к печати I.04.S6 Тираж ТОО Заказ 40Г Типография Т1ШЖМ