Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение природных очагов буньявирусных инфекций с использованием иммуноферментного анализа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение природных очагов буньявирусных инфекций с использованием иммуноферментного анализа"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. Ивановского

Из правах рукописи

ЕРОФЕЕВА Елена Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ЕУНЪЯВИРУСКЫХ ИНФЕКЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАШЕМ ММЮФЕШНТНОГО АНАЛИЗА

(специальность - ОЗ. 00.06. - вирусология)

Авторефэрат диссертации ка соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1992 г.

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Академик РАМН, профессор Д К. Львов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕГТЫ;

доктор медицинских наук, профессор М. С. Воробьева доктор биологических наук С. С.Ямникова

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - НШ эпидемиологии и микробиологии

..... часов на заседании Специализированного Ученого Совета

Д. ООГ. 20. 02. при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН ( 1230Э8, т. Москва, ух Гамалеи, 16 )

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

ии. Е Ф. Гамалеи РАМН

Защита диссертация состоится "¿5"" -Я . 199.3 г. в

Автореферат разослан

-2.5« д&свЗря. из2

г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

введение

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕШ В последние годы большое внимание уделяется исследования«, иап-равлеккым на изучение так называемых малоизученных арбовнруснах инфекций, вызываемых главным образом вирусами, относящимися к семейству Ь'укьявириле, и прежде всего представителями серогруппи Калифорнийского энцефалита (СКЭ).

Буньязируси СКЭ и Буньякзера внроко распространены но мюгнх странах мира - Северной и Южной Америке, Европе, Азии п Африке. В сил наиболее распространенной инфекцией является энцефалит Ла Кросс, также имеются сообщения о заболеваниях лвлеГс, сиззашшх вирусами' ззйца беляка и Джеймстаун Каньон. О странах Центрально!! Епропц ¡шрохо распространены лихорадочные заболевания, этнологически связанные с вирусом Тяпни.

Результаты исследований Псесопзиого центра по изучению экологии, эпидемиологии и клннихк малоизученных арбоеируских иифгкцнй (п той числе буньявнрусных), проведенных в 1985 - 1991 гг. «а базе Института вирусологии ии. Д.И.Ивановского Рлмн,' свидетельствуют об активной циркуляции иа территории Европейской части России вирусов СКЭ и вируса Батан - представителя серогруппи буиьямвера. Значительная часть пие-\е::ных па территории России штаммов вирусов СКЭ (калимы вирусов тяги-ня, Инко, зайца беляка) патогенна для человека.

дальнейшее изучение ирнродннх территории, .жлемичиых в отношении вирусов СКЭ и Буиьямвера. предполагает использование, наряду с тряди-мошшми вирусологическими и еерологическини методами, современных ме-годов зкспресс-иидикацни, идентификации п дня гностики ошенвзпашшх

- г -

инфекций, в том числе метода твердйфаового иинунафермевтиого анализа (Ы>А). Учитывая отсутствие конкретных рекомендаций по тактике использования ИН для диагностических и эпидемиологических исследований в природных очагах буньявирусиых инфекций, возникла необходимость проведения исследоиашп) в отом направлении.

Таким образом, актуальность настоящей диссертации опрглеляется яолныл отсутствие« сведений по тактике применения методов зкспресс-ик-Аикацли, идентификации и диагностики инфекций, вызываемых вируса«« СКЭ и Буньяизера, (в тем числе метода Ш>А), с цьлью обследования природных очагов буньявируских инфекций.

ЦЕЛИ и ЗАДАЧИ РАГСЯЫ. Цель настоящей работы заключалась в разработке эффективной тактики применения различных модификации 1>А для обследования природных очагов буаьивнруслых инфекций (на неделях вирусов комплексов Калифорнийского энцефалита к Бунъяквсра). Основным критерием выбора тактики ИФА яалялось возможность ее внедрения в практическое здравоохранение.

для достижения поставленной цели необходимо било решить следующие задачи.- изучить чувствительность и специфичность иммуноферментиых тест-систем, приготовленных на основе антител к вирусам тягиня (штамм '92ч), Инко (КЫ-3641), зайца беляка (оригинальный итамм), ла Кросс (прототишшй штаим), Батан (МЫ 2:22);

- адаптировать к применить прямой вариант ИФА - метод 'двойных антител* для индихецки автигеиов вирусов СКЭ и вируса Еатаи в суспензиях членистоногих перяносчшсов;

- адаптировать кодификацию пряного варианта ИФА, основанную на принципа"конкурентного анализа, а также две кодификации непрямого варианта ИФа (с антигенам и иммуноглобулином. содержащим антитела к ви-

р;усу, ла твердой фазе) с целью выявления специфических антител к вирусам С'/.Э и Батан в ся-воротках крови экспериментально ккфнцироиггших жи~ ьотнчх, практически здоровых людей и больных сеяошичн лихорадочными заболсазииячи неясной этиолог»;!;

- пронести оразиитгльную опенку эффективности использования з условиях работы практических вирусологических лабораторий непрямого я пряного 1.с!.!-«ар;!пнтоп к'}а лая проведения лабораторно-л:1аг.-гссти-;аского обследования больных сезонники лпкорадочтяш згЦолевзтгокл ляясной

этнологии;

- в эх'щерчиенталь'шх исследованиях оценить эффективность использования нчучешшх нмнунофермектпы* тест-снстси п адаптиропгшшх иодк-фтсаиий постановки им для индикации идентификации вирусов СК2 я паруся Натан, а также диагностики внзаваемых кии заболеваний, в сравнении с традиционными вирусологическнии я серологическими тестами;

- оценить возможность и эффективность использования .-¡пробированных в лабораторном эксперименте модификаций !№А /ля темплекских сбсле-лоаакнй природных очагов буньявнрусных инфекций «а но мл а Тульской области РОССИИ.

научная новизна исследований.

На основании изучения эффективности кепельзотмнда различит- мода-фнкаиц» ифа для выявления анткгеноз вирусов ста к вируса клтак, и антител х нки, разработана рациональная тактика применения 1»а как самостоятельного теста для обследования природных очагоз бу.чьязирусяых

о

икфекцнй,

Епервое показана возкоаность применения пряного варианта ифа для киайкш.ши вирусов скэ в отдельных экземплярах конароз.

Впервые проведена срашителькач сиенха эф^схтьпиасти «ольоолвиня эазлнчиих модификации ифа для шкяления специфических ¡«и^коглобулиноч

классов ЧГ и "О* к вирусам СКЭ и вирусу Батан.

Впервые И4А примечен г.ри экспериментальной химиотерапии инфекций, визвпииия змрусгми СКЭ, Показана его высохая чувствительность, специфичность и гффехтшшость использования в исследованиях подобного рода.

Бгхершг 1« территории Тульской области России установлена активная цнрхуляшя вируса Ияко. Выделено два ш гамма вируса Инхо -1Х1У~1230! Тл в ЬРЛУ~12304 Тл. Установлен достаточно высокий уровень нкыукной прослойки населения к вирусам СКЭ к показано нарастание гуморального иммунитета к вирусам СКЭ с возрастом, характерное для эндемичной территории. Доказана роль вируса Тягиня в инфекционной патологии человека.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Результаты проведенной работы легли в основу разработок иммуно-ферментиых тест-систем для выявления вирусов Тягиня и Батаи, внедренных в практику Едравоохране»ш!>.

На оскооднпн полученных данных опубликован« негодкческне рекоиек-

>

дацни по использованию 1№А для выявления вирусок С?;э в суспензиях членистоногих переносчиков.

В результате проведенной работы впервые на территория Тульской области устансалена активная циркуляция вируса инко (ХЕ1\'-12301 Тл; 1£1У-1230* га), изучены иммуноструктура и гуморальный иммунитет населения к буньявирусаи, доказана роль вируса Тягиня в инфекционной патологии человека. Эти исследования икеот теоретическое значение с точки зрения обум о ра^дьтия науки о прнродноочагошх инфекциях.

Разработана эффективная тактика специфической диагностики инфекции, вызванных енрусаин СКЭ, основанная на применении 1£М-варианта НФА с использован не у. ингредиентов из отечественных нмиуноферменткых тест-систем. Результаты апробации этого теста позволяют рекомендовать

его для внедрения в практические лаборатории страны.

в результате проведенных исследований и1>а впервые бнл применен при экспериментальной химиотерапии ннфехцин, вызванных вирусами СКЗ, с целью изучения противозируской активности хнмкопрег.аратой (в системах in viiro, in vivo) и контроля процесса антителообразпвакия у контрольных н леченных препаратом уивотных. Полученные результаты позволяют рекомендовать 1WA для широкого использования п экспериментальной химиотерапии буньявкрусных инфекций.

НФА внедреа о практику работы вирусологической лаборатории Тульской 05л СЭС.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫКОСШНЕ ИА ЗАЩИТУ. !. Нмиуноферментные тест-системы, приготовленные на основе антител х вирусам Тягиня (атамн '92'), Икко (KK-JG41), зайца О.еляка (оригинальный итами), Ла Кросс (протстипнай штамп) н Батан (ММ 2222),обладая групповой активность», позволяет диФференцииропать кпруси внутри серогрупиы.

2. Прямой вариант НФА ("сэндвич" модификация) может йкть использован для экснре.сс-янднкашм антигенов вирусов СКЭ и вируса Батан как

*

в пулах членистоногих переносчиков, так к в отдельных экземплярах инфицированных комаров. 'г

2. lgK-вариант И4>А, основанный на использовании ингредиентов из отечественных иммуиоферментных тест-систем, является эффективный тес-

'Iом для экспресс-диагностики инфекций, вызываемых вирусами СКЭ, в ус-

ft

ловипх практических вирусологических лабораторий.

4. ифа может бить применен в качестве самостоятельного теста для обследования природных очагов букьявирусных инфекций (показано на примере Тульской области России). На территории Тульской области установлена активная циркуляция вируса Кико, изучена иммуноструктура н гумо-

ралышй иммунитет населения х буньявкрусам, доказана роль- вируса Тяги-I'.» в инфекционной г.атслогня человека.

ПУБЛИКАЦИИ. Результаты исследований опубликованы в 13 печатных работа* в отечественных к зарубежных журналах и сборникахг

ОБЬЕ.« И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИЯ, диссертационная работа изложена на 228 страницах машинописного текста и состоит из ¡введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, инзодоп и указателя литературы (54 отечественных и Юб зарубежных источника). Работа иллюстрирован?, 52 таблицами 3¡ 13 рисунками.

СОБСТВЕННЕЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

Материал для вирусологических и серологических исследований был собран в 19ÍS - 1У88 годах. Основная работа по сбору материала была выполнена в веемш ад^шшстратнБннх районах г.Тулы и Тульской области.

Всего было собрано н исследовано ¡325 экземпляров иксодовмх клещей я 377643 экземпляров комаров р.Aedes, Anophslcs. íio.s wo членистоногих переносчиков (комары, хлеия) в хачестае материала для вирусологического обследования использовали кровь и органы (мозг, легкие, печень, селезенка, почки) экспериментально зараженных нелинейных белых мышей н сирийских хоиячкоа, всего было обследовано 200 суспензий.

В серологических реакциях было обследовано Ю60 сывороток крови людей . Нз них - 392 сыворотки крови практически здоровых жителей г.Тулы а Тульсхой области ; 644 сыворотхи крови от 329 больных сезонными лихорадочными заболеваниями неясной этиологии из г.Тули и тульской области, 11 сывороток - от больных нз г.Москвы и московской области, 4 сыворотки - от больных из Мурманской области н 9 сыьороток -от больных из Вологодской области. Также была обследована 191 сыворот-

ка крапа экспериментально зараженных животных ( ¡80 скнороток беспородных белых нишей и 11 сывороток зсленах иартаиек )-

В работе использовались следующие буньявирусм, адаитнрпййнные к мозгу новорожденных белих пыша»: : Батон ■( мы гггх ), Ккко ( ).

Тягння ( итамм "92" ), зайца беляка ( оригинальней ¡итак* ), калифорнийского энцефалита < вго-2$з ), кенстон ( в-«4-55-(?7.05 ), ла Кросс ( прототапный атаик ) ; стаимы буньявирусов из коллекции лаборатории экологии вирусов института вирусологии им. Л.И.Ивановского ?АМН : ЬЕ1У-91 Ирк., ЬЫУ-П301 Гл., 1£ГУ~12304 Тл., 1п1\'-5545 Кар.. 1.Е1У-11483 Сах. И 1X^-11554 Тайм. "

Выделение внрусоп проводил): на новорожденных белых чыезх по методу , описанному д.к.Львовым с соавт. г 1970 году.

Лабораторную лини» комаров - ле. aegypti икфиикровкли гирус-содерм.цен мозговой суспензией кби (б1<^ Т-р50) через биочеьбрзну (гакурка белой мыши) по методу И.У.кЬи^г^вкауа е1 »1.(1985).

Прямой вариант И<5а в 'сэндвич* моднфгасашш использовали д.-я зке-пресс-инднкаими антч'чнсд вирусов СКЭ и Буньямвера б пулах хровососу-инх членистоногих переносчиков и в отдельных экземплярах экспериментально инфицированных комаров. Пслкстироловае ллзчисг« (Сс.ч1аг, ПК) сенскбцлкзироаали вирусспецифическими иьвншыми 7 "С-. Сорбции белка проводили в течение но"н при + 4* с. Затем вкоенли а .¡нхуСкровали а течение ночи при + С нсследуеыие и контрольные ¡0% суспензии членистоногих в разаедении 1:2 к 1:10. Затем в тест-систему вносили специфические ;£0, иеченнне персксидаэсй. раствор саехеприготояченного энзим- субстрата, г Н серную кислоту. Разведения 10 % суспензий членистоногих готовили на ФСБ рН 7. 4 с 5% ИФС К ГС и 0,2% Т»еег.-20. Ксшьюга-т разводили ФСК~Т»ееп20 с 50% К4-С К?С. Не злу этапами реакции проголнлпгь 5 - краткая проыьгака раствором ФСК-ТУеяп-го. а качестве знл>«еу6сгрота использовали офд , 1'5а) - 4 «г на 1 о мл о, 1 м цфб рн .•>,« в при-

- $ -

гутсгвки О.ПОб'й nepexncir водорода. Б качества положительного контроля испольэселли пс/зит»шкум контрольную суспензйл) членистоногих \ (пул из десяти сугпенхнч, полохительиых по результатам биологического выделе-ил* вгрусон на нбм и результатам НФА) и гомологичный сакарозо-ацетоновый антиген из имчуно^ериенткой тестсистемы. В качестве отрицательного контроля использовали негативную контрольную суспензию членистоногих (пул ii'j лесят.: суспензий ненифицисюдоннмх комаров или клещей), а также гегерологичкый и нормальный (приготовленной нз неикфицнровантего вару-сои шгернала) антигены. Учет результатов реакции проводился на муль-ткскане (Labsysi eas Multistat; PLUS, Flos' i_ab., Ьеликобрнтання) при дли we роль.'j 4 92 !ш.

ИКЛ.НХПЦИ» вирусных, антигенов в крови и органах экспериментально зарякекнгих вирусами СКЭ и Букьачяера животных проводи/чи, используя осху A.voHer, 197S с небольшим изменениями.

Прямой варнак г ИФА, оскоякнни'й на принципе конкурентного анализа, применяли для. г.ерьичиого ихрчнинга сывороток крови экспериментально aapaaerfhux животных, больных людей и доноров. Реакций ставили по схеме, описанной л. п. Ива новым с соавт. (1981), с небольшим изменениями (си. Глава 2).

Для серологической диагностики заболевании, вызванных вирусами СКЗ, использовалась реакция киаралязацик (Р!1), реакции биологической нейтрализации (?Eli), реакция торможения гемаггл:отинацни (РТГА), реакция связывания комплемента (РОС), непрямой и IgM- варианта ИФА.

РН выполнили микроиетодэм ъ перевиваемой культуре клеток почек эмбриона ctauw (Uidb). Первоначальный скрининг сывороток (в разведенки 1:'.0) просолили против Юс, 1000 и 10000 цпд 50 вирусов. Титр специфических антител определяли по наибольшему разведении сыворотки, обладающему нейтрализующей активностью против 100 цпл 50 вируса.

РБН ставили я9 ослих мыиах по методике А.К.Шу&лалзе и с.Я.Гапла-

Ü0BH4 (1954) с постоянной дозой вируса 100LD.

РТГА выполняли иихроквтодом по общепринятой методике с 8 АЕ антигена .

РОС ставили кикрометолом по общепринятой методике., с тремя разными ,( 2,0; 1,5; 1,0 ) дозами хомплеиеита.

Постановку непрямого варианта ИФА осуиестоляли по схеме U.KofiBann et al. (1979) и схеме I.j.Smart et aL.(l9S5) я авторской модификации. В первой елучое, полнстаролосые планшета (Costar, IK) сеясибилнгнрова-лн вирусными антигенэип, приготовленными одним из трех нижеописанных способов. Затем п лунки пл.ютетов гюследовртслъко гаоенлн соответствующие разведения исследуемых п контрольных сывороток., аитиги/опой хонь-агат и раствор знзта-субстрата (Oía, Signa usa). Череа 30 нииут реакции останавливали добавлением а луихи панели по О,05 мл 1 Я рзстзора серной кислоти. Учет результатов реакция проводили спсхтрофотожтри-чески при длине волны 492 км.

При постановке непрямого варианта ИФА по второй с-деие полистиро-ловме планяетн (Costar, UK) сенсибилизировали вирусспецифичесхиии кы-виншш IgO нз кмкукофериенткого диагйостнкуаа, После удаления неадсор-бированкого :ч!муноглобул![нл я гяательпой прошвхя лунах панели последовательно вносили специфический и контрольный сахэрозо-ацетонашй антиген в рабочем разведении, нсследускис сиворогки »"в соответствуй гугх разделениях к аитняиловой коньюгат в рабочем разведенки. При постановке реакции использовплн контрольные положительную и отрпцательку» си-

Еоротки (пул из десяти сыаороток, отрицательных по результатам РН). За

»

RtTp сыворотки принимали ее наибольшее разведенке, ОП которого ь 2,1 заэл превышала ОП двух отрицательных коитролей. В качестве дополнительного контроля все выявленные положительные сыворотки тестировали с гариалыши антигеном, приготовленный та иеинфиинрованного материала.

Выявление с пожгаья Н$А впрусспецифических иммуноглобулинов клас-

са 'М* и "О" в сы.йоро гкау. крови ссуцгствлялц по схеме -Н. Schn.i tz et. al.,¡98i - при исследовании сывороток крови ¡экспериментально' зарахек-íiux нелинейных Седых ыыией к по схеиаи H.Schaitz et .al. ,1984 и M.Roggendorf et al., 1981 - в случае сывороток крови экспериментально зараженных зеленых мартышек к больных лил"«, с небольшими излксснияии.

Аля постановки ИФА использовали иозговой антиген, очищенный прота-иии сульфаток (ПС) и концентрированный полиэтиленглнколем (ПЭГ), куль-туральный антиген, приготовленный по истоду Пер-Оке Альбергсона ( 1974), инфицированную культуру клеток Vero ( А.С.Новохатсхий с cor авт.,1985 ) мозговой антиген, приготовленный методом сахарозо-ацетоко-вой экстракции ( D.H.Clarke, J.Casals , 1958 ).

В работе ипюльзозали диагностические иммуноферментные тест-системы. приготовленные на основе антител ( мшшные igO) х зирусам Тягиая ( штамм "92* )*, Инки ( КК - 3641), зайца беляка ( оригинальный итаии), ла Кросс ( прототипный втаыи ), Батаи (ММ 2222)', был» получе-кы из лаборатории экспериментального производства института Еирусоло-гии им. Д.И.Ивановского РАМП.

* - автор является соавтором данных тест-систек.

Иныукныг асцитаые жидкости получали по методу, описанному С.Я.Гайдгмович с соавторами (1969 ).

Электрофорез вирусных белков проводили по методике Laeoinli U.K. н Maizel J Л'. ( 1970) в 10% ПАЛГ с додгцилсульфатом натрия (SI)S) с использование«: трис-глицнновой системы.

Концентраций и очистку вируса для биохимических и имкуннохниичес-ких исследований проводили путе.и заражения клеточной кулыуры Bi:<-21 вирусом, взятый на уровне 6 пассахя с титром 8 -9 цпд 50/0,115 йл с последующем осветлением культуральной аидкости путей центрифугирования и дальнейшей ere концентрацией путем ультрацеитрифугирования на центрифуге X.-5-J0 'Вескиап' в роторе Ту-45 при 25.000 об/мнн в течение 1,3

- 1Л -

- i чдсов. Концентрированный вирус чистили в линейном градиенте концентраций сахароза 20-60% (Ч/У) путем улътрацеитрпфугировапия при 24.00!) об/иин в течение и часов. '

Кониектраии» белка в препарате определяли по метолу, о'ипсшшоку С.Я.Гакдамович с соазт., 1975 .

Постановку имыуисблота осуществляли по суеме, описанной H.Tovbin с соавторами в 1979 году с небольшим изменениями.

Лля статистической обработки результатов использовали биометрические нетоды (Г.В.Лаккн, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ НССЛЕДОЗА1ШН

1. Оптимизация условий постановки различных модификаций И-М при работе с вирусами скэ и Буньямвера г с использованием отечественных иммуноферментаых тсст-систем).

Как уже отмечалось автором, комплексное обследование прнродиих очагов буньявнруашх инфекций с использованием ПФА предполагает, я первую очередь, проведение лабораторных исследований по изучения» и испытана» отечественных имиуно^ерменпшх тест-систем, а также адаптации различных модификаций постановки ифа для работы с вирусами скэ и Еунь-янвера.

данные исследования были проведены на первом этане настоящей диссертационной работы.

результата оценки чувствительности и специфичности отечественных

*

диагностических ш.;иуно}>ериентаых тест-систем, прнготог,ленных на основе кгпггел к вирусам Ткпшя ( итаым '92"), Шко ( КЯ - 3641 ), зийпа беляка ( оригинальный отамн ), ла Кросс ( прототнпнын итаым ) я Натан ( НН Z121 ) показали, что все изученные тест-системы явллясь вндоспе-дпфичниаи, обладав? групповой активность».

Второй раздел рабспъГсостокл в разработке оптниалыгой схемы постановки прямого варианта ИФЛ для индикация вирусов СКЭ и Буньямверз в суспензиях членистоногих при использовании иимуноферментиых тест-снс-теи, приготовленных на основе антител к Еирусаи Тягкня И Батан. Ярове-декные исследования по испытании различии^ времекчах и теь-.пературких режимов инкубации вирусных антигенов показали, что оптимальным является рогам инкубации антигена в течений 18 часов при +4°С. В целом, в ходе исследований, проявлялась теиденцля к увеличении сроков инкубации от 1 до 18 часов и снижению температурь; - от +37°С до +4° с.

Испитание при постановки ИФА ряда блокууэуюялх факто;юз (желатин, ЕСА. НАЖ иеннфицировакних нашей, няактивнрованная Детальная сыворотка КРС) показало, что использование в качестве добавки к раствору для разведения кокьюгата 5 0% инактквироваькой Детальной сыворотки КРС значительно снижает (от 0,44.1 до о,031 - для вируса Тяпшя и от 0,792 до 0,032 - для вируса Натай) неспецкфический фэк при постановке ИФЛ.

Проведенное изучение кеспецийичесхого фока яри. постановке пряного варианта И94 на материале 162 негативных хомариных пулов, объединенных по 150. ¿Oü, 250, зоо, 35« и .ico экземпляров в пул, позволило установить шшнкальное значение поглощения (CD) для толктквнах комариных пулов, которое составило - 0,09. Образцы, имеющие 00>0,09 , были классифицировании как позитив.

Tásese бйло установлено, что неспецкфическш! (¿он (при постановке ШК) с увеличением числа неимфнцировашшх хойароа в пределах пула увеличивается незначительно (t<2,01; Р>0,05). Полученные наии данные были подтеерхдека при кни в ЯФА пулов комаров, содержащих различное число (от о до 5 экземпляров) экспериментально инфицированных вирусами ткга-ня ( итамй "92" ) и Ннко ( КВ - 3641 ) комаров. Значительные (0,0:<рс0,05) различия в средних значениях логловеннй (OD), полученных при исс\едоЕа::(Ш кокаринях пулов, наблюдались только в случае уасличе-

!иш числа нп^ицнровашшх кенаров а пределах пула. Так, о:ш поменялись «т 0,5!?. + 0,007 до 1,831 ± 0,0Н - в случае Еируса тяпгпя и от 0,373 + 0,006 до 1,352 + 0^012 - в случае вируса иико. Значительных различий между ервдшшн значениями поглощений образцов, содержащих различное .число иеинфшшропаиинх комаров н одинаковое число инфицированных кенаров, отмечено не Сило (Р>0,05).

Пропедсшше исследования позволили выявить антигены вирусов Тяги;;;) п инко в единичных экземплярах инфицированных кенаров. ' При этой средние значения титров антигенов вирусов тягиня н Инко ь суспензиях

о

комаров с гомологичными тест-систекамн составили - 2,3 + 0,032 и 1,5 + 0,045 1£, соответственно. инфекциошше же титры вирусоч тягчня и Инка, опрелеленнме по их иитопатогег.поиу лейеттш в культуре клеток спэа, били низкие а состапнли 2,5 цпд 50/0,115 мл. Полугенныа результата не были неожиданными, так как, проводя.подобные исследования с шягленнем в ИМ антигенов вируса ла Кросс в экспериментально гшу»!-цираээшшх комарах , ili.lciret.ti с соавтора«« в ряде работ показали глз-ипхиость о помопь» иол выявлять антигены вируса п елшшчних экземплярах инфицированных хс.чзроп. при зтои чувствительность истода иоа составила 1- 3 1й.

Третий раздел данного ятепа исследовательской работ*» сключал исследования по адаптации прямого и непрямого вариантой н^Л .для шяалеяяя адрусспсцифическнх антител п сыворотках крови экспериментально нифицч-р.онакиих вирусами СКЭ и Батан животных, практически эдорзвих людей к Йолышх с подозрением на ьрбовнрусные ин$екшт.

3 качестве модификации прямого варианта постановхн 5!ФЛ для выявления антител к вирусам СКЭ и Батаи (суммарная фракция антител) в сц-гороткдх крови доноров и экспериментально зараженных вирусами СКЭ белых ишией и зеленых ааргипек была апробирована реакция, осноеаннг.н на принципе конкурентного анализа (ИФА-К) с использованием •днгрелчеитоо

из отечественных икмуиоферментних тест-снстеи на основе, антител х вирусам Тягння и Батаи. Показан.-} эффективность применения данной модификации прямого варианта И4>А для проведения первичного скрининга сывороток крови больных и доноров.

Исследование двадцати иммунных сывороток белых иыисй с поцоньи непрямого варианта ИФЛ с вкруссяешкрическнии и двумя различно приготовленными антигенами на твердой -фазе показало значительное преимущество использования культурального концентрированного очищенного антигена. Так, среднее значения уровня вирусспецифических антител в сыворотках при использовании для сенсибилизации твердой фази при постановке непрямого ИФА специфических 150, мозгового и культурального антигенов, соответственно, составили - 3,16 + 0,19; 7,96 + 0,35 и 11,63 + 0,41 (в случае знруса Тягиня); 3,12 ± 0,14; 7,16 + 0,31 И 9, 53 ± 0,37 (в случае вируса Батан)

Однако, мекду результатами, полученными при использовании различных тверды* фаз ври постановке ИФЛ бала выявлена высокая положительная корреляции, что свидетельствует о возможности использования ингредиентов из отечественных итунорерхеитиих тест-систем на основе антител к вирусам Тягиня и Батаи при постановке непрямого гараанта ш>а. По нашему кненяв, это особенно важно в условиях работы практических вирусологических лабораторий СЭС, так как. возмохность использования иммунофер-мгктаых тест-систсы при постановке непрямого варианта ИФА значительно упроаает применение дайной модификации метода в условиях СЭС.

Проведенные исследования по выявлению ранних диагностических антител - иммуноглобулинов класса "И* к вирусам скэ в сыворотках крови экспериментально инфицированных зеленых мартышек и больных людей с использованием двух модификаций МАОЕГЛБА показали, с одной стороны, больаую -чувствительность непрямой модификации МАС - ЕМвА , с другой -возможность и эффективность использования обеих этих модификаций пос-

- и -

тановкн ИФА. Так, иммуноглобулины, класса 'и", были выявлены обеими кодификациями МАС-БЫвА в сыворотках крови экспериментально зараженных зеленых картишек н больных людей в 90,0 + 9,5 и 7',8+ 13,ё% случаев, соответственно. При этом средние значения уровня антител х вирусам СКЭ как в сыворотках крови болышх людей, так и сыворотках крови экспериментально эаркхекшх зеленых мартышек, были значительно (1>4,32; Р<0,001) выше в модификации НАС-ЕЫЭЛ с использованием хоньюгата антивидового иммуноглобулина и фермента. Так, в случае прямой и непрямой модификации МАС-Е1Л5А средние значения урония ^М ' антител к вирусам СКЭ, соответственно, составили 3,38 + 0,11 и 5,42 + о,08 р/к - дли сывороток крови больных людей; 5,02 £ 0,07 и 7,16+0,0« р/н - для сывороток крови зеленых мартышек.

2. Результата применения ИФА в зксперинецгалышх исследованиях с вирусами СКЭ и Буньямвсра.

Второй этап работа по использование ИФА для хсмплексного обследования природных очагов буньявируснызс инфекций включал проведение предварительных испытаний з экспериментальных исследованиях изученных ик-мунофериентных тест-систем и модификации постановки прямого к непрямого вариантов ИФА, предпарительно адаптированных автором для работы с вирусами СКЭ и Букьяивера. Параллельно был проведен сравнительный анализ эффективности использования данных модификаций ИФА в сравнении с традиционными вирусологическими н серологичесхямк методами исследования.

С целью сравнения эффективности использования методов - ИФА и биологической изоляции вирусов на нб.ч для индикации вирусов СКЭ и Бунь-ямвера в суспензиях членистоногих переносчиков, параллельно двумя методами было исследовано .177643 экземпляров комаров и 49202 экземпляра

- te -

кледей, собранных a i6 областях Россия, Коки АССР, на полуостровах Таймыр н Камчатка. Е результате проведенных исследований обоими методами из клещей вирусы СКЭ и Буиьямгерз выделены не были. Исследование 377648 экземпляров xouapun, ооьедкиенных и 1903 пула, методом биологической изоляции вирусов ка нби позволило выявить вирусы СКЭ и 27 пулах (24,10 ± 0.9SS), Еатаи-полсбнь'е вируса - н П пулах (16,21 ± 0,84%). Из 27 выделении вирусов СКЭ в биопробе п 19 случаях (70,37 ± 1.03S) с поксцью прямого варианта ИФА были обнаружена антигены вирусов СКЭ, а.

из 17 выделений биогробы Катаи-нодобних сиругов метод ифа позволил вы-

í»

делить вирусные антигены в первичном материале в 4 с\учаях (23.53 + 0,97%). Проведенный статистический анализ результатов, полученных обоими игтодани, выявил высокую ассоциативную связь ыехду результатами иод. и биепробы. Коэффициент ассоциации (rQ) достигал 0,994 + 0,0007 ( fc>3,2 9 ; Р<0,001) - 2 Случае вирусоз СКЭ И 0,993 + 0,0064 (t>î,2S; P<0,üül) - в случае Наган -подобиях вирусов.

Проведенная иаки сравнительная сценка 1Ы>А и РСК для идентификации выделенных ц йиопробе нз пулов кома pois иекрэтрошшх агентов показала, что прииененке и»л позволило ухе в процессе пассивировать провести ндентиф.чхашно инрусов ссрогрупп Калифоршшехсх-а энцефалита и Гупьангс-ра в 95,4 5% случаев, тогда как в РСК илецти^нзеами» проводили только после 3-го naccasa и обработки вкруссодерхайсй «оэговоа суспензии методой сахарозо-ацетоковой экстракции.

Чувствительность всех модификаций ИФА оцеицвкла относительна традиционных серологических иатодор опредсладшя «мтитол» FT ГА, VCK, S'il, 1>бн. при атом оценку 9$$скгнвностн мспользовання uïtgaou üvak н Fiai проиодялк иа материале И-ч евдоретох. хршш аелских иарггьшок акскорл-мектальш ш-'фш'.иршшчшх округами оказалось, что процент налога-

тслышх рааулугвтаа з иза-к. бил достоверно m, пек в TOi (t>a,0í; P<û,0i)j te состсвяа ~ ioo» и 72,73 + î3.4S, «ea'îawrcwsjss». срана-

тельную оценку чувствительности над-Г. с пироко применяемым! методами серодиагностики буньямвирусных инфекций - РТ1'Л и РН, проводили при исследовании 105 сывороток хров« дскороа, полученных из пунктов переливания кровн мурманской, вологодской и тульской областей, н результате проведенных и^следонашм во выявления в еызоротках крови доноров антител к вирусам тягиня и Батан методами ИФЛ-К, РН и РТГА, антитела к вирусу Тяпшя были выявлены методами 1!ФА -К к РН, соответственно, в '/4,27 ; 4,2% и 2J.6C ± 4,5% случаев-, акппела к вирусу Батаи были обнаружены методами И1>А-К и РТГА h рн — h 7,77 £ 2,6% ; 9,52+2,*% и

да

2,*25 + 1,6% случаев, соответственно. Проведенный статистический анализ полученных результатов выявил наличие тесной ассоциативной счй-зи «еж/.у результатами, полученными тремя использованными методами. Чувствительность непрямого варианта ИФА при использовании специфических IgG, мозгового и культурального антигенов для сенсибилизации тзгрдой фазы была оценена относительно результатов ГЩ, путем исследования 10 сывороток крови зеленых мартьжех, экспериментально инфицированных гирусамк С?.Э. Результаты исследований показали, что средние значения титров зирусс-нецифнческих антител в сыворотках крови зеленых мартышек были значительно выше при их обследовании в непрямом варианте Н$л (с различной твердой фазой). Так, в случае непрямого нариаата ИФА-со специфическими IgG, мозговым и культурьльным антигецаан на твердой фаза средние значения титров антител к вирусам СКЭ составили - 2,73 + 0,16 lg; 3,üs + 0,OS lg и 3,24 + 0,10 lg, соответственно, а з случае РБН - 1,23 ¿ 0,07 lg. Проведенный статистический анализ полученных результатов выявил высохум положительную корреляцию между результатами ?ЪК я непрямого ИФА с использованием различных твердых фсэ.

Третий раздел работы по испытанию адаптированных модификаций постановки ИФА включал исследования по применение данных модификаций VÚA' в опытах по экспериментальной химиотерапии нкфгкциЬ", вызванных вируса-

мн СКЭ, с цель» изучения противовирусной активности отечественного препарата рибамндил^ в системах in vitro и xa vivo. Эффективность действия рибакклнла методом ИФЛ оценивали по снижению татра вирусного антигена в ку.-ЬтурзлыюЛ жидкости и органах лабораторных животных, инфицированных вирусами СКЭ и леченных рибамидклои.

Представленные результаты дают основаьне считать, что отсчеетиен-нии препарат рибамаднл, синтезированный з латвийском Институте органической хииуи, проявляет дпсгатсчцо васокук активность в отноиенки. буцьявирусных инфекций схэ в системах ia vitro ц in vivo. Так, проведенные исследования по изучению иротявовирусиой активности риоакидкла в системе in vitro иегодами релукцни бляшек, прямого варианта НФА и электронной микроскопии показали, что рибамидил а концентрации 100 икс/ил снижал инфекционный титр вируса Тягиня (штамм LEIV-S545 Кар.) ка 3,2 ]g LO 50/0,03 ил. находясь в среде поддержи в течение 48-72 часоа; при гтои о 32 раза снижался титр вирусного антигена в КЖ.

В системе in vivo риоа.чидил й концентрация 100 мг/кг, применяемый подкожно по лечебно-профилактической схеме, обеспечивал 5оа защиту животных от ннргхиии вируса oas¡ца беляка, втакм LEiv-i:55? Таймыр ()()-Ю0 LO 50). для опенки эффективности применения рпбамидила в ске-тенр. in vivo нами был такке использоинн метод НОА. который ранее не применялся в подобных исследованиях. С яокоиь» этого метода было показано снижение титрзв вирусного антигена в органах животных опытной группа (лечошх рибамнянлем по лечебно-профилактической схеме) по сравнении с яяаотаымн контрольной группы. Так, титр вирусного антигена на IQ день шфевдоз снижался в мозгу - в 8 раз, в селезенке н легких -а 4 раза, в RS'itíiH - в 2 р&за.

Такни образом, аряюн вариант ыохет быть успесшо использован для ¡¡зучеькя про»квсгнрусноа акткаиости хчяяолрепаратов в системах in vitro и in vivo, a vajcse для npci-здения контроле эффективности лечения

- 19 -

химиопрепаратакн в системе in vivo.

Различные модификации ИФЛ были также применены для изучения процесса ангителообразования у экспериментально зараженных вирусом зайца беляка (атаим LEIV-11552 Танми-р) н леченных ркбамидклом 6-7 г белых мшаей. С поисдаьи lgM - варианта ИФА удалось обнаружить в ctmopancax крови белых мышеи шрусспецнфнчесхпе IgM антитела в титре 1/ЮО на 4 и 3 4 дни после инфицирования; в тигре 1/ЮОО - на 7 и 10 днн инфицирования. IgG - вариант И<?А позволял выявлять аирусспецчфическче Igo антитела в тигре i/too на 7 и Ю днн инфицирования; и титре 1/1 ООО - на 34 t»

'день после инфицирования. Использование прямого Hí-A-rC и непрямого га-риантов НФА позволило изучить дннаикку накопления вирусспецифических IgG-антител в сыворотках крови животных опытной и контрольной групп. Наблюдалось незначительное преобладание титроа антител у хивотних контрольной группы, по сравнению с опытной группой.

3. Изучение природных очагов Буньявирусных инфекций на территории Тульской области ( с использованием ИФА).

Заключительный основной этап настоящей диссертационной работа включал проведение комплексного обследования территории Тульской области России, выбранной в качестве модельного региона, с целью выявления циркуляции на ней арбпвирусов. Ключевым звеном данных исследовании явилось использование в них различиях модификаций ИФА, предварительно адаптированных и испытанных в уелевнях лабораторного эксперимента при работе с вирусами СКЭ и Еуньямоерз.

а эпкдеезок i9íé--i9S7rr в восьми районах Тульской области (иг, запад, северо-запад, восток, северо-восток и центр области) был проведен сбор членистоногих переноечккоп и сывороток крови доноров и больных сезонными лихорадочными заболеваниями с цель» выявления распространения арбовирусов на территории области. Ранее на территории Ту ль-

cKOi's области были обнаружены очаги хлсщевого энцефалита и ГЛТ1С (Мчсин-

t л

КОВ И др., 190СГ) >

Обследование 2685 экз. клещей ( 2671 экз. D. pictus; 14 экз. ix. risinus) и 1SZ48 экз. комаров (17309 эха. р. Aedes; 1879 зкз. р. Anopheles) методами биологической изоляции вирусов На кбм и с помощью пряного варианта И1>а { сэндвич-мольфнкашм ) поззолило выявить в суспензиях комаров два вирусных агента. В результате проведенных исследований обоими методами из клещей вирус выделен не был.

Результаты идентификации выделенных на территория тульской области вирусных стайное (LElv—12301 Тл и LF.IV—12304 Тл), проведенной методами РСК, Pi: Ii с по.чеиы» прямого варианта ИМ, позволили идентифицировать ютаммы LEIV-12I01 Тл и I.EIV-12304 Тл как итаммы вируса Кнко, представителя СКЗ. Полученные результата согласуются с данными ряда авторов (А.А.Кузнецов, к.с.Нелялкова, 1991 ), показавшими активную циркуляцию вируса Иико в Центральной районе Европейской части России.

Следующий раздел работа состоял в изучении биологических свойств птаамЕ L.EW-12.3Q1 Тл. Изучение динамики шрусемни нр» зарааетш нелинейных белых тхвзя и сирийских хомячков crraxuou LEIV-123C1 Тл, проведенное с пояоиьо прямого вао'ттнта НФА и традиционного метода титрования вируса на белых иыиах 2-ксдель:юго возраста, показало, в целой схсдиут» картину. так, при здутримээговои заражении 6-7 г белых мышей, у животных наблюдалось клкннчссхи выраженное заболевание с сшштрмамн иейроинфокция и последующей их гибель» через 96 часов. При этом, наибольшее накопление вируса и его антигенов, начиная ст 1 часа с момента инфицирования, иаблюдолосъ (по результата« обоих методов) в кропи и иозгв инфицированных хнвэтнмх. Прямой вариант ИФЛ позволил дополнительно выявить антигены вируса в селезенке через 48 к 72 часа после инфицирования: в ие«ени (),Д lg; 1,0 lg; i,o lg) - через 48, 72 и 96 часов инфекции; а почках (1.0 ig) - через. 72 и 96 часов инфицирования.

.1 полкой«« заражении бе ли у: мкиен з течение развития инЛекцин вирус его рггнгеки были выявлены обоими методами во все* органах инйициро-животных. По кере развития ян^гкции титры вируса и его аитиге-з нарастали, достигая своего наивысыего значения к 71- 96 часам нн-шни.

Результаты изучения динамики вирусемии при экспериментальмой ин-:цни сирийских хомячков показали, что у та мм LErvi7.ini Гл ке патоге-| для сирийских хомячков кьк при впутр!мозговом, так и при подкожном •ях их инфицирования.

Проведенное серологическое исследование сывороток крови зеленьх 'Тошсх, экспериментально инфицированных подкожно и ийутр"ве1ШО гатам-Г.Е)У-:?301 тл, с использопанчем методов РПН и дьух модификаций рямого варианта кфа, показало наличие в сыворотках кропи икфнцнро-ных животных (через зо дней после заражения) антител к исследуемому мму. Так, средний уровень тигров вирусс-пешфнчесмх антител состав случае РГ-Н, 1- ой л 2-ой модификации непрямого ЯФА - С ,¿75 + 4 Зg Ц> 50(0,03 мл; 1,95 £ 0,9"? и 2,275 + 1,14 соотвмствен-

Третий раздел исследований природного очага буньяпирусни'.: инфек-на территории Тульской области включал изучение -имму но структуры и зрального иммунитета населения тудьелой области к шруелн СКЭ и г.п-/ Батан, представителю ссрогруппы ¡.умьямлера. с цель« установления зня популяцаокного иммунитета нэееленда Тульской области в 1986 го-)ыла взята 121 сыворотка крови домвр«в (29-п.Первомайский; 42-г.Ту-50 -г.аекино). Серологические исследования шророг.-.к грови доноров 1ллелыю проводили методами ?ТГА, ен я с номонью П'М-к модиСшхации гаго варианта НФА.

Ь результате провгленннх исследовании был установлен достаточно кии ( 25,хз + 2,6 % ) уровень иммунной прослойки населения 'Гуль-

схой области к вирусам СКЭ н было показано нарастание гуморального иммунитета к злрус.ам СКЭ с возрастом, характерное для эндемичных территорий .

Анализ результатов исследований 271 сыаороткн крови доноров пс розргстным категориям, дополнительно проведении^ на территории Тульской сбластл в 1987 году, выявил наиболее высокий уровень иммунно* прослойки к ш!ру:ни СКЭ у наиболее ахтивкоя части населения в всзрасп от 10 #лО ;о \ет, при сакон высокой частоте выявления антител л детей 1 группе 15-14 лег (е 47,S3 10,4% случаев); у взрослых в группе 25-з; лет (в 40,54 + S.1S случаен). Нгзначительная тенденция к снижение этого уроин.я каблодглась у возрастной категории старше 50 лет (в 20 н C.JCS глучаеп). В nt-лом, низкий процент выявления антител в группе детей 4.0 треу лет (в 7,15 ± 3,4% случаея) и дальнейшее увеличение серо-поиитнвкых лкц в более старших возрастнах категориях свидетельствует об ■зндеыичнсстк Центрального района Ьвропсйсхой части Госсин в отношении вирусов СО.

Последний раздел исследований состоял в обследованик больных сезонными лихерадочныхк заболеваниями неясной этиологии, прохивалимх н< территории тульской области России, с цель» выяснения роли вирусов Ж в и.ифехциоикот каталогам человека.

С отай целью в 198S году било взято 45 сывороток крови от 3! больних сеаспкумИ лихорадочными заболеваниями неясной этнологии, в об-слслосаннук: группу входил.: болмые с клиническими диагнозами о^вн, «е-инкгозицефалкт, лимфаденит, янеи'юьня, гршшалолэбнис заболенььия, энцефалопатия н ляхорадка неясного геиеза. Сыворотки крови больных параллельно были обследовании в ГСП, №, а также с помощью различных модификаций И^л. В результате предварительного скрининга 46 емьорото кропи от 30 СЬльыях »семи три/я метслайя п них били выявлены антител к вирусу Тйгиня. Дальнейшее иссл&дссаиис отобраниях 14 сывороток от

больных n PCS, FH и методой непрямого варианта ИФА (со спенифичесимн IgO и х^льтуралышм очищенным антигеном на твердой фазе) выявило у 5 больных наличие антител к вирусу Тягиня без их диагностического прироста в парных сыворотках (71,43 + 12,1% случаев); у 1 больных (2R.57 ± 12,1%) бала установлена сероконзерсия антител. Наибольпий процент серохонверскй (28,S7 i 12,1 %) наблюдался з случае использования непрямого варианта ИФА н в РСК. В случае ?!! процент сероксноерсиЛ составил - !4,2$>+9,3%.

С целью выявления в сыворотках хроЕИ больных ранних диагностических антител - кмиуиоглобуликов класса "М* к вирусам СКЭ в опилсезон IУ87 года на территории Тульской области было собрано 59о сывороток •.ровк от 295 болышх сезонными лихорадочными заболеваниями неясной (тиолопги. Первичный скрининг исследуемых сывороток, проведенный него-,ом ИФА-К выявил в 86 скшротках {14,55 + 1,5%) антитела к вирусу Тя-иня. Повторное исследование тюлохителышх я Hi А парных сывороток крои Сольных с помадыа ИФл-К, непрямого к igM - вариантов !№А позволило ыявить в них антитела к вирусу Тягиня всем« тремя методами, соответс-венно, в 13,91 + 1,б; 13,04 ± 1.6 и з,48 + 0,8% случаев, у зосыш элышх была установлена сероконперскя igG и XgH вирусспсцифн-геских ктател. Однако, только в трех случаях (1,3 ± 0,5%) наблюдалось диаг-пстически значимое (4-х и более краткое) изменение тнтрои антител к ipycy тяптя в парных сиворотках хрови болышх . При этом кратность зироста ила падения тнтрез антител по результатам двух реакций в »еднем составила 4,7+0,16 и ll,0fl,3 раз, соответственно.

Таким образом, проведенные исследования с поаояь» непрямого и IgM вариантов ИФА позволили у трех больных сезонный« лихорадочными забо-ванняыи (г.Тула и Тульская область, 1987г.) диагностировать заболе-ние, этнологически связанное с вирусом Тягиня - представителен СКЭ. •.; '

- 24 -ВЫВОДЫ :

5, Инмуноферкентные тест-системы, приготовленные на основе антител к вирусам Тягичя (гатамм "91"), Ичко (¡СК-3641), зайца беляка (оригинальный штэмм), ла Кросс (прототипный штамм) и Батан (ММ 2222), являются видоснеци^ичиыми и когут быть рекомендованы для экспресс-инли-кации данных вирусов.

2. Установлено, что прямой варнзкт ИФА ("сэндвич' модификация) -высоко чувствительный тест, позволяющий выявлять антигены вирусов Тя-гин? и Ннко в единичных экземплярах кн$ицнрова71ных комаров. При этом, средние значения титров антигенов вирусов Тягння н Инко в исследуемых образцах соответственно составили - 2,£ + 0,032 ^ и 2,5 + 0,045

3. Впервые с цель» выявления специфических антител к вирусам СО и Батан в сыворотках крови экспериментально инфицированных киеотнух, практически здоровых людей н бальных сезонными лихорадочными заболеваниями исйсной этиологии была адаптирована модификация прямого варианта ИФА, осноззккзя на принципе конкурентного анализа, а также две модификации непрямого варианта ИФА (с антигеном и иммуноглобулином, содержания антитела к вирусу, на твердой фазе). Применение атнх модификаций ИФА п лабсраторьо-лкагкостчческих исследованиях показало их высокую чувствительность, специфичность и преимущество перед такими серологическими тестЕМч, как РТГа, рск и ГЕН.

4. Впервые показано, что модификация варианта ИФЛ - метода "захвата' ^М антител (МАС-ЕЫйА). основанная на использовании ингредиентов из отечестпаошх иныунпферчентиых тест -систем, является эффективным тестом для экспресс-диагностики заболеваний, вызываемых вирусами СКЭ, в условиях практических вирусологических лаборатории.

5. .Установлено, что твердофазный ИФА ("сэндвич" модификация ) является высоко чувствительным, специфичным и экономичным тестом для

ч1

проведения нодехэшш вирусов СКЭ и Батан в пулах членистоноги* пере-

носчиков с последующей идентификацией выделенных в биопробе ненротрип-шх агентов. Применение ИФА позволило уже в процессе пассироЕапчя провести идентнфнкзщтвкрусов СКЭ и Батан в 95, 4 5% случаев.

5. Впервые показано, что твердофазный ИФА является эффективным и удобным тестом для изучения противовирусной зктиености химнопреиаратов в системе in vitro, для проведения контроля эффективности лечения хи-миопрспаратамц п системе in vivo и для изучения процесса антшелообра-зования у инфицированных и лечении* препаратом животных.

7. Твердофазный ИФА может быть з^крехтьпчо использован в качества

ta

самостоятельного теста для обследования природных очагов буньяиируски* инфекции. Показано на примере Тульской облает России.

8. Впервые показано,, с использованием нфа, что территория Тульской области России эндемична в отношении вирусов СКЭ - Тягиня и Инко. Зыделсно два штамма вируса Инко - LE1V-12301 тл и I.eiv-123G4 Тл. Уста-ювлеп достаточно высокий (25,83+2,6S) уровень иммунной прослойки на-:еления к вирусам СКЭ и показана нарастание гуморального иммунитета к трусам СКЭ с возрастом, характерное для эндемичной территории, доха-ян з роль вируса Тягиня в инфекционной патологии человека. Уделький ее этой иифекшт среди сезонных лихорадочных заболеваний составил ,3± 0,05».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Керезнна Л.К., Kopueesa С.Л., лобкопскин О.Г., Быстрова Е.А. и з. Арбовирусные инфекции на территории Тульской области. //Тезисы ¡кладов научно-медицинской конференции 'Научно-технический прогресс и >орозье населения." - Калуга, 19S7. -С. 35 - 36.

2. Быстрова Е.А., Березина л.К., львов д.К. использование метода срдо$азного иимуноферментного анализа при экспресс-диагностике и х«~ отерапии арбовирусных инфекций. //Тезисы докладов Y съезда гигиенис-

tob, санитарных врачей, зпидеииолотоз, михробиологоп и инфекционистов ¡Узбекистана. - Ташкент îçs ; . Т. 2. - С. 287.

3. Бистров? Е.А., Гроиамевсхш! В.Л., Львов С.Л., Селиванов Я.М. п Ар. Пспользсьание чму.уиофе.р1.еитного анализа для выявления вирусов группы Калифорнийского энцефалита в суспензиях членистоногих переносчиков. II Б сборнике чстодических рекомендаций: "Методы исследования в молекулярной, общей к медицинской вирусологии *. - М.. 196? - С. 2S4 -

4. Березина Л.П. , Быстрозя Е.А., Кориесва С.Л., Либковскш. О.Г и др. Изучение природных очагов арбопирусиых инфекций на территории Тульской области. /Тезисы докладов ХП Всесоюзной конференции по нри-pûAiioi! очаговости болезной. - Ь!,, 1989. - С. 23 - 24.

5. Влчлнмнрцева Е.А., ьакулкка Е.А., Быстропа Е.Л. Выявление сяе~ цифическск антител к пкрусяи комплекса Калифорнийского энцефалита при естественной к экспериментальной инфекции. //В сборнике 'Экология вирусов i4 диагностика арйомрусных ннд-екцил". - M., 1989. - С. 172 -17S.

С. Влддкнирцсза il.к,, львов С.А., Емстрова 2.А., Бакулнна Е.А., Бутеяхо Л. M. Применение метода иммуноблота для идентификации вирусов комплекса калифорнийского энцефалита. IIB сборнике: 'Экология вирусов н диагностика арботрусиих ккфекц.чй•. - и., 1989. - С. 178 - 182.

7. Березина Л.К., Бь;стропа Е.Л., Абрамова л.Н., Колобухиш» л.В. к др. Изучение очагов арСсвнрусных инфекций с яспольэооакием метода твердофазного шмупоферменткого анализа (ифа) (на примере Тульской об-ласта РСФСР). //3 cöopKiisce: "Зкологкя вирусов и дяагиостаха арбоанрус-JÎH-.Î ПНфСКЦЯЙ". - Ы., 1934Î. , - С. 194 - 201.

8. льсоз с.д., Гроьаиепский 6.Л., Скворцопа Т..Ч., Соколова Н.Г., дилренова D.H., Бытрова S.A. и др. Циркуляции вирусов комплекса Кали-фарннкского энцефалита иа севоро-аападе Руссзсой равнины. // Мелкшшс-

- Z7 -

кая паразитология и ааразипше болеани. - Ы., 1989.,- N г. - С. 74 -77-.

9. львов С.Д., Гроипвевокий 5.Л., Еоропаноп Ю.В., АидреевВ.П., сквоцова т.м., шстро«а Е.А. и др. Изоляция вирусов аитигениах комплексов калифорнийского энцефалита к Йуньякаера (Uunyaviridae, EtnyaviruS; из комаров на северо-восток« Азиатского континента. //Вопроси вирусологии. - М. , 1989.,- Hi,- С. .433 - 333.

10. Березина Л.К., ЕисТроиа Е.А., ииянхевнч A.M., Абрамова л.Н. н др. Противовирусная активность рибамнлнла ъри экспериментальных инфекциях вирусами комплекса Калифорнийского энцефалита. // Вопросы вирусологии. - М., 1989., - N 4. -- С. 454 - 436.

11. Бистрова В,А., Громашевскни В.А., Селипанов Я.»»., Львов С.Д. н др. Выявление с помощью нммунофернеитаого анализа антигенов вирусов комплекса Калифорнийского энцефалита п Буиьяивера (Bunyavirus, aunyaviridae) в пулах комаров. IIЕопроса вирусологии. - М., 1989., - К 5. - С. 744 - 746.

12. vladimirtseva П.A., Eakulina Е.А., Bystrova Е.А., Lvov S.D., Jutenko A.M. Iniaune blotting studies of California «¿cephalitis mtifcenic conplex viruses recently isolated in the USSR //Arch Mrology. - 1990..- Suppl.l., - Г. 347,

13. Berezina L.K., oushehina P..A., »yatrcva E.A., Lvov D.K. The mtiviral activity of the soviet ribavirin - ribaaidil - tested on lodels of some arbovirus infections. // 3ov. Med. Rev. E: virology eviews. - 1991., - Vol. 4.--P. 103 - u5.