Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распространение и генетическая вариабельность бактерий семейства Anaplasmataceae в сочетанных природных очагах клещевых инфекций Иркутской области

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Распространение и генетическая вариабельность бактерий семейства Anaplasmataceae в сочетанных природных очагах клещевых инфекций Иркутской области"

На правах рукописи

ДОРОЩЕНКО Елена Константиновна

РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА АМАРЬАБМАТАСЕАЕ В СОЧЕТАННЫХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ КЛЕЩЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ ИРКУТСКОЙ

ОБЛАСТИ

03.02.03 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 У Д1К 2013

Иркутск —2013

005544307

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Козлова Ирина Валерьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Инокентьева Тамара Ивановна

(Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН, старший научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций)

доктор биологических наук, профессор Анганова Елена Витальевна

(Государственное бюджетное образовательное учреждение ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения РФ, кафедра эпидемиологии и микробиологии)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Омский НИИ нри-родно-очаговых инфекций» Роснотребнадзора РФ

Защита состоится «_»_2013 г. в «_» часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.038.01 при ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН по адресу: г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16. Почтовый адрес: 664003, г.Иркутск, ул.Тимирязева, 16, а/я 221.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинский наук.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Л

Астафьев Виктор Александрович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) и моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ) - это острые трансмиссивные инфекционные заболевания, переносимые клещами. Возбудители данных инфекций Anaplasma phagocytophilum (для ГАЧ), Ehrlichia chajfeensis и Ehrlichia mûris (для МЭЧ) в течение последних 15-20 лет обнаружены в разных видах иксодовых клещей во многих странах Европы и Азии, в России, Корее, Китае, Японии, США и Африке (Коренберг, 1999; Сидельников, 2003; Aguero-Rosenfeld, 1996; Alekseev, 2001; Anderson, 1991; Arnez, 2001; Bakken, 1996; Bjoersdorff, 2002; Brouqui, 1999; Buller, 1999; Cao, 2000, 2003; Dawson, 1991; Dumler, 1991; Inokuma, 2004; Karlsson, 2001; Kim, 2003; Liz, 2000; Ogden, 1998; Parola, 2001; Petrovec, 2002; Raoult, 1996; Rar, 2005; Wen, 1995; Tylewska-Wierzbanowska, 2001).

В России эти заболевания выявлены относительно недавно (Ravyn, 1999; Рудаков, 2001, 2002; Сидельников, 2003), изучены недостаточно и до сих пор не зарегистрированы как нозологические формы. Диагностика ГАЧ и МЭЧ проводится лишь в некоторых субъектах РФ. В то же время там, где осуществляется комплексная лабораторная диагностика заболеваний, переносимых клещами, эти инфекции выявляются достаточно часто (Афанасьева, 2006, 2007; Оберт, 2009; Рудаков, 2006; Tkachev, 2008; Фоменко, 2007; Щучинова, 2009).

На территории Иркутской области сложились все биоценотические предпосылки для существования очагов ГАЧ и МЭЧ. Известно, что эти заболевания могут протекать под маской «лихорадок неясной этиологии». В Иркутской городской инфекционной больнице ежегодно доля таких сезонных лихорадок, возникших у больных после присасывания клещей, достигает 15 %. В связи с этим, актуальным является проведение поисковых исследований по изучению распространения очагов МЭЧ и ГАЧ на территории Иркутской области, установлению спектра переносчиков и резервуарных хозяев возбудителей этих заболеваний и выявлению их роли в региональной инфекционной патологии.

В научной литературе большое внимание уделяется генетической вариабельности эрлихий и анаплазм. С помощью молекулярно-генетических методов были обнаружены новые генетические варианты эрлихий, филогенетически сходные с Е. chaffeensis (Cao, 2006; Inokuma, 2004; Wen, 2002). В Японии и на территории Евразии были обнаружены ранее неизвестные бактерии «Сап-didatus Neoehrlichia mikurensis», образующие отдельный филогенетический кластер в семействе Anaplasmataceae и играющие роль в патологии человека (Kawahara, 2004). К этому кластеру относятся также бактерии, выявленные в клещах и грызунах, данные о патогенности которых для теплокровных на сегодняшний день отсутствуют (Шпынов, 2004; Pan, 2003; Schouls, 1999; Shpynov, 2006). В связи с этим необходимо проведение исследований по установлению потенциальной опасности заражения людей новыми бактериями семейства Anaplasmataceae на территории Иркутской области.

Чрезвычайно важным является то, что очаги разных клещевых инфекций накладываются друг на друга. Возможность одновременного присутствия в организме клеща нескольких патогенов может приводить к возникновению микстформ заболевания. Вместе с тем, на сегодняшний день нет четких представлений о степени сочетанности природных очагов клещевых инфекций на территории Иркутской области, спектре возбудителей, разнообразии сочетаний патогенов при коинфицировании ими переносчика. Методы детекции одновременно нескольких патогенов в одной особи переносчика практически отсутствуют.

Цель работы. Установить широту распространения и генетическое разнообразие представителей семейства Anaplasmataceae в природных очагах Иркутской области, разработать предложения по совершенствованию системы микробиологического мониторинга за возбудителями трансмиссивных клещевых инфекций в сочетанных природных очагах.

Задачи исследования:

1. Оценить зараженность иксодовых клещей и мелких млекопитающих, собранных на территории различных районов Иркутской области, Е. mûris и A. phagocytophilum, а также недавно обнаруженными бактериями семейства Anaplasmataceae.

2. Провести ретроспективное тестирование образцов крови, полученных от людей с лихорадкой неясной этиологии или укусом клеща в анамнезе на наличие IgM и IgG к возбудителям МЭЧ и ГАЧ.

3. Изучить генетическое разнообразие эрлихий и анаплазм, инфицирующих популяции иксодовых клещей и мелких млекопитающих на территории Иркутской области.

4. С помощью комплекса методов провести исследование переносчиков и резервуарных хозяев одновременно на несколько патогенов и выявить возможные сочетания возбудителей в микстинфицированных клещах.

5. Разработать предложения по совершенствованию системы микробиологического мониторинга за возбудителями трансмиссивных клещевых инфекций в сочетанных природных очагах Иркутской области.

Научная новизна. Установлено широкое распространение на территории Иркутской области очагов МЭЧ и ГАЧ с циркуляцией в них Е. mûris и A. phagocytophilum. Выявлена циркуляция нового представителя семейства Anaplasmataceae - «Candidatus Neoehrlichia mikurensis». Показано, что очаги МЭЧ и ГАЧ приурочены ко всем типам ландшафта - от горно-таежных до степных.

Получена новая информация об инфицированности разных видов иксодовых клещей возбудителями МЭЧ и ГАЧ и о степени их участия в циркуляции бактерий семейства Anaplasmataceae в природных очагах Иркутской области.

Впервые установлены потенциальные резервуарные хозяева Е. mûris и A. phagocytophilum на территории Иркутской области, к которым могут быть отнесены: M. oeconomus, M. rutilus, M. gregalis и Sorex spp.

Ретроспективное исследование сывороток крови людей с укусом клеща в анамнезе позволило выявить случаи инфицирования возбудителями МЭЧ и 4

ГАЧ, а также возможность микстинфицирования эрлихиями и анаплазмами в сочетании с боррелиями и/или вирусом КЭ.

Определены различия по генетической вариабельности представителей семейства Anaplasmataceae, циркулирующих на территории Иркутской области. Установлено, что нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона у образцов Е. mûris, выявленных в таежных клещах, строго консервативны, а у A. phagocytophilum — высоковариабельны. На основании анализа последовательности гена 16S рРНК выявлено четыре варианта A. phagocytophilum, объединенные на основе анализа groESL оперона в две генетические группы.

Получены новые данные о спектре возбудителей клещевых инфекций и их возможных сочетаниях при микстинфицировании иксодовых клещей. Доказана возможность инфицирования переносчиков двумя и более видами возбудителей одновременно, что свидетельствует о высокой степени сочетанно-сти очагов разных клещевых инфекций в Иркутской области.

Разработаны предложения по совершенствованию микробиологического мониторинга за циркуляцией возбудителей клещевых инфекций в сочетанных природных очагах за счет внедрения современных молекулярно-генетических методов.

Практическая значимость. Обосновано введение в систему эпизоото-лого-эпидемиологического надзора микробиологического мониторинга за всем спектром клещевых патогенов, обнаруженных на территории Иркутской области. Апробирована мультиплексная ПЦР в режиме реального времени для одновременной детекции в переносчиках четырех возбудителей (вирус клещевого энцефалита, боррелии, анаплазмы, эрлихии). Определена ее диагностическая и экономическая ценность для микробиологического мониторинга за возбудителями клещевых инфекций.

Данные, полученные в ходе микробиологического мониторинга, могут быть использованы при составлении прогноза развития эпидемиологической ситуации в отношении клещевых инфекций на территории Иркутской области и для разработки эффективных предупредительных мероприятий в сочетанных природных очагах.

В международную электронную базу данных GenBank депонировано 35 нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК и groESL оперона A. phagocytophilum, 5 нуклеотидных последовательностей Е. mûris и 8 нуклеотидных последовательностей «Candidatus Neoehrlichia mikurensis».

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены: на Всероссийской конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита» (Москва, 2007), международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зооноз-ных инфекций» (Улан-Батар, 2008), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых инфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), международной научной конференции "Zoonotic infectious diseases and tourism" (Ulaanbaatar, 2009), научно-

5

практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней» (Иркутск, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней» (Омск, 2009), Пленуме научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития Российской Федерации (Москва, 2009), X International Jena Symposium on Tick-borne Diseases (Иена, Германия, 2009), II Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции. Современные аспекты клещевых инфекций» (Екатеринбург, 2010), региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Иркутск, 2010), IX Республиканском съезде эпидемиологов, гигиенистов, санитарных врачей и инфекционистов Узбекистана (Ташкент, 2010), XI International Jena Symposium on Tick-borne Diseases, (Иена, Германия, 2011), итоговой научно-практической конференции с международным участием «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2011), Всероссийской конференции с международным участием «Современные аспекты природной очаговости болезней» (Омск, 2011), X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012), международной научной конференции «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами» (Листвянка-Иркутск, 2012), XII International Jena Symposium on Tick-borne Diseases (Weimar, Германия, 2013), Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевого энцефалита» (Москва, 2013).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На территории Иркутской области широко распространены очаги мо-ноцитарного эрлихиоза и гранулоцитарного анаплазмоза человека с циркуляцией в них Е. mûris, A. phagocytophilum и «Candidatus Neoehrlichia mikurensis».

2. Основным видом переносчика бактерий семейства Anaplasmataceae на территории Иркутской области является клещ I. persulcatus, а клещи H. concinna и D. nuttalli играют дополнительную роль. Потенциальными резерву-арными хозяевами эрлихий и анаплазм на территории Иркутской области являются мелкие млекопитающие M. oeconomus, M. gregalis, M. rutilus и Sorex spp.

3. Представители семейства Anaplasmataceae, циркулирующие a природных очагах Иркутской области, значительно различаются по степени генетической вариабельности. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона у Е. mûris и «Candidatus Neoehrlichia mikurensis» строго консервативны, ay A. phagocytophilum - высоко вариабельны.

4. Совершенствование микробиологического мониторинга за циркуляцией возбудителей клещевых инфекций в сочетанных природных очагах возможно за счет комплексного подхода к исследованию и использования современных молекулярно-генетических методов.

Публикации результатов. По теме диссертации опубликовано 24 научных работы, в том числе: 10 работ в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ и 1 методическое пособие.

Личный вклад автора. Автором проведена информационная проработка темы исследования, выполнен сбор, анализ и обобщение материалов, сделаны выводы. Доли личного участия автора составляют: в получении и накоплении научной информации - 70 %, в обобщении, анализе, интерпретации материалов - 100 %.

Структура и объем диссертационной работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 140 страницах, иллюстрирована 7 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель содержит 211 источников, из которых 92 работы отечественных и 119 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, методы и объем исследований. На наличие ДНК эрлихий и анаплазм было проанализировано 2332 экземпляра клещей, собранных с растительности на флаг в 2006-2012 гг. на территории двенадцати районов Иркутской области, 49 образцов печени мелких млекопитающих, отловленных с использованием стандартных зоологических методов в Эхирит-Булагатском районе.

909 образцов крови были получены от больных с лихорадкой неясной этиологии или укусом клеща в анамнезе, находящихся на лечении в инфекционных стационарах г. Иркутска и п. Усть-Орда в период с 2003 по 2012 г.

Общее количество проведенных лабораторных исследований приведено в таблице 1.

Методы исследования. Для достижения цели и решения поставленных задач был использован комплекс микробиологических, серологических, моле-кулярно-генетических и статистических методов.

Молекулярно-генетические методы исследования. Суммарные нуклеиновые кислоты экстрагировали из клещей, образцов тканей животных и крови людей с помощью комплекта реагентов «РИБО - преп» («АмплиСенс» ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва) по инструкции производителя. Для обнаружения вируса КЭ предварительно применялась реакция обратной транскрипции с помощью комплекта реагентов для получения кДНК на матрице РНК «РЕВЕРТА-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва).

Для детекции нуклеиновых кислот возбудителей клещевых инфекций: вируса КЭ, В. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum, Е. muris, В. miyamotoi использовали двухраундовую ПЦР с тест-системами производства «Биосан» (г. Новосибирск).

На первом этапе ДНК эрлихий/анаплазм выявляли методом двухраундо-вой ПЦР в присутствии родоспецифичных праймеров из области гена 16S рРНК. В первом раунде ПЦР были использованы праймеры Ehrl и Ehr2, во втором раунде - Ehr3 и Ehr4 (Pap, 2007).

Таблица 1

Общее количество проведенных лабораторных исследований

Вид исследования (метод) Кол-во исследований

Определение зараженности клещей боррелиями (микроскопия) 1500

Выявление антигена вируса КЭ в клещах и крови (ИФА) 1012

Выявление ^М- и ^в-антител к возбудителю МЭЧ (ИФА) 820

Выявление ^М- и ^й-антител к возбудителю ГАЧ (ИФА) 710

Выявление ^М- и ^в-антител к вирусу КЭ (ИФА) 276

Выявление ^М- и ^в-антител к возбудителю ИКБ (ИФА) 802

Получение проб суммарных ДНК/РНК из крови (экстракция) 909

Получение проб суммарных ДНК/РНК из клещей (экстракция) 2332

Получение проб суммарных ДНК/РНК из тканей грызунов (экстракция) 49

Выявление ДНК возбудителей ИКБ в клещах (двухраундовая ПЦР) 2000

Выявление ДНК возбудителей ГАЧ/ МЭЧ в клещах (двухраундовая ПЦР) 2332

Выявление ДНК возбудителей В. тгуатоМ в клещах (двухраундовая ПЦР) 280

Выявление ДНК возбудителей ГАЧ/ МЭЧ в печени грызунов (двухраундовая ПЦР) 49

Выявление ДНК возбудителей ИКБ в печени грызунов (двухраундовая ПЦР) 49

Выявление ДНК возбудителей ГАЧ и МЭЧ в крови (двухраундовая ПЦР) 909

Выявление РНК вируса КЭ в клещах (ОТ-ПЦР, двухраундовая ПЦР) 1260

Выявление РНК вируса КЭ в печени грызунов (ОТ-ПЦР, двухраундовая ПЦР) 49

Выявление РНК вируса КЭ в крови (ОТ-ПЦР, двухраундовая ПЦР) 590

Выявление и дифференциация возбудителей КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ в клещах (ПЦР в режиме реального времени) 132

Амплификацию проводили в термоцикл ере 2720 (Applied Biosystems, Сингапур). Данные праймеры обеспечивали амплификацию фрагмента гена 16S рРНК эрлихий и анаплазм длиной 524 и.о.

Видовую принадлежность эрлихий и анаплазм устанавливали на втором этапе. Для этого отбирали положительные образцы первого раунда, полученные на первом этапе, и использовали их во втором раунде ПЦР с праймерами, специфичными для A. phagocytophilum (HGE1 и HGE2) и Е. mûris (Eml и Em2) (Pap, 2007).

В результате проведения второго раунда ПЦР получали специфические фрагменты длиной 494 п.о. для А. phagocytophilum и 539 п.о. для Е. mûris, которые выявлялись с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле при облучении ультрафиолетом на трансиллюминаторе в присутствии бромистого этидия.

Для последующего секвенирования нуклеотидных последовательностей были амплифицированы фрагменты гена 16S рРНК длиной 1299 н.о. с использованием в первом раунде ПЦР праймеров Ehrl и Ehr6, а во втором раунде праймеров Ehr7 и Ehr8. Фрагменты groESL оперона длиной 1315 н.о. были амплифицированы с использованием в первом раунде ПЦР праймеров HSl-f и HS6-r, а во втором раунде - праймеров HS6-f и HSVR (Pap В.А., 2007; 2011). 8

Полученные ампликоны очищали с помощью GFX-колонок (Amercham Biosciences, USA). Определение нуклеотидных последовательностей проводили с помощью генетического анализатора ABI PRISM 3100 («Applied Biosystems», USA) в Центре секвенирования ДНК СО РАМН, г. Новосибирск. Сравнение нуклеотидных последовательностей с последовательностями, опубликованными в GenBank, проведено с использованием программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). полученные последовательности анализировали методом ClustalW (http://www.ebi.ас.uk/clustalw/index.html). Выполнение данного раздела работы осуществлялось совместно с сотрудником Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) к.б.н. В.А. Рар.

Топологию филогенетических деревьев создавали с помощью метода объединения ближайших соседей (Neighbor-joining).

Для одновременной детекции нуклеиновых кислот вируса КЭ, боррелий, анаплазм и эрлихий использовали коммерческую тест-систему «Amplisens® TBEV, В. burgdorferi si., A. phagocytophilum, Е. muris/E. chaffeensis - Fl» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва), любезно предоставленную для исследования Л.С. Карань. Амплификацию проводили в термоциклере RotorGene 6000 (Австралия).

Серологические методы исследования. Для обнаружения иммуноглобулинов класса M и G к возбудителям МЭЧ и ГАЧ использовали ИФА с диагностическими тест-системами производства ООО «Омникс» (г. Санкт-Петербург). Исследования выполняли в соответствии с инструкцией производителя. Учет результатов проводили с помощью автоматического ридера ELx800 при длине волны 492 нм. Для каждой сыворотки рассчитывали коэффициент серопозитивности (КС). Положительными считали сыворотки с КС > 1,1.

Для выявления IgM и IgG к вирусу КЭ использовали тест-системы «Век-тоВКЭ-IgM», «ВектоВКЭ-IgG», к боррелиям В. burgdorferi s.I. - «ЛаймБест-IgM», «ЛаймБест-IgG» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).

Светлопольная микроскопия фиксированных препаратов. Часть клещей была исследована на наличие боррелий методом прямой светлопольной микроскопии фиксированных мазков из содержимого кишечника клеща (Ко-ренберг, 1991). Полученные препараты окрашивали по Романовскому-Гимза и дополнительно докрашивали кристаллическим фиолетовым. Просмотр осуществляли посредством иммерсионной микроскопии с применением микроскопов МИКМЕД-2 и OLYMPUS СХ21.

Методы статистической обработки материала. Статистический анализ данных с вычислением общепринятых показателей осуществляли с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA» и системы электронных таблиц Microsoft Excel 2000 (Реброва, 2002, Савилов, 2011). Оценку достоверности полученных филогенетических схем осуществляли с использованием бутстреп-анализа на основе 1000 повторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика эпидемиологической обстановки в отношении МЭЧ и ГАЧ на территории Иркутской области

Для обнаружения очагов МЭЧ и ГАЧ на территории Иркутской области, установления основных переносчиков Е. mûris и A. phagocytophilum за период с 2006 по 2012 гг. было исследовано 2332 имаго иксодовых клещей, из которых 1924 экземпляра были представлены клещами I, persulcatus, 221 -Haemaphysalis concinna и 187 экземпляров клещей рода Dermacentor, собранных с растительности на флаг в 12 районах Иркутской области (табл. 2).

В результате проведенных исследований ДНК Е. mûris была выявлена в иксодовых клещах на территории всех обследованных нами районов. ДНК А. phagocytophilum обнаружена в клещах, отловленных на территории девяти районов. Клещи, инфицированные двумя этими видами возбудителей, выявлены в иксодидах на территории восьми районов Иркутской области. С учетом данных результатов, циркуляция A. phagocytophilum не зафиксирована нами только на территории трех районов - Киренского, Усть-Илимского и Братского.

Таблица 2

Результаты исследование иксодовых клещей, собранных в различных районах Иркутской области, с помощью ПЦР

Район сбора кле- Вид клеща Кол-во Число образцов, в которых обнаружена

щей исслед. ДНК ( %)

экз. Е. mûris А. Е. mûris /

phagocytophilm A. phagocyt.

Эхирит-Булагатский I. persulcatus 374 32 (8,6) 15 (4,0) 12 (3,2)

H. concinna 221 3 (1,4) 5 (2,3) -

Dermacentor 7 - - -

Ольхонский I. persulcatus 3 - - 1

D. mittalli 180 5 (2,8) - -

Киренский I. persulcatus 189 43 (22,8) - -

Бодайбинский I. persulcatus 164 26 (15,9) - 3 (1,8)

Усть-Илимский I. persulcatus 122 7 (5,7) - -

Братский I. persulcatus 52 4 (7,7) - -

Казачинско-Ленский I. persulcatus 85 7 (8,2) 1 (1,2) -

Шелеховский I. persulcatus 34 - 2 (5,9) 1 (2,9)

Качугский I. persulcatus 124 32 (25,8) 1 (0,8) 2 (1,6)

Нижне-Илимский I. persulcatus 31 14 (45,1) - 1 (2,9)

Иркутский I. persulcatus 627* 47 (7,5) 30 (4,8) 7 (1,1)

Слюдянский I. persulcatus 119 10 (8,4) 2 (1,7) 2 (1,7)

I. persulcatus 1924 222(11,5) 51 (2,7) 29(1,5)

H. concinna 221 3 (1,4) 5 (2,3) -

ВСЕГО Dermacentor 187 5 (2,7) - -

ИТОГО: 2332 230 56 29

( %±m) (9,9±0,6) (2,4±0,3) (1,2±0,2)

* - в двух образцах обнаружена ДНК бактерии «Candidatus Neoehrlichia mikurensis»

Общая зараженность иксодовых клещей, собранных на всех обследованных территориях, составила для A. phagocytophilum 2,4±0,3 %, для Е. mûris -9,9±0,6%. ДНК обоих патогенов одновременно обнаружена в 1,2±0,2% клещей. В 2 экземплярах клещей I. persulcatus, отловленных на территории Иркутского района, была выявлена ДНК «Candidatus N. mikurensis» (0,1 %). Это соответствует данным литературы о распространении этих возбудителей в других частях ареала иксодовых клещей (Pap, 2011).

В среднем инфицированность клещей I. persulcatus Е. mûris составила 11,5 %, A. phagocytophilum - 2,7 %, одновременно двумя микроорганизмами -1,5 %.

В клещах H. concinna ДНК эрлихий была обнаружена в 1,4 %, ДНК ана-плазм выявлена у 2,3 % особей. Микстинфекция Е. muris+A. phagocytophilum в клещах этого вида не обнаружена. В клещах рода Dermacentor выявлена только ДНК Е. mûris, инфицированность этих видов клещей составила 2,7 %.

Процент клещей, в которых была выявлена ДНК Е. mûris, на территории разных районов Иркутской области варьировал в широких пределах (от 2,8 % до 45,1 %).

Установлены статистически значимые различия в зараженности разных видов иксодовых клещей в Иркутской области возбудителями МЭЧ и ГАЧ. В клещах I. persulcatus бактерии семейства Anaplasmataceae выявляются достоверно чаще, чем в клещах H. concinna и Dermacentor spp. (t = 8,3 и t = 9,4 при р<0,05 и К>500). Таким образом, основным переносчиком Е. mûris и A. phagocytophilum на территории Иркутской области является таежный клещ I. persulcatus. Клещи H. concinna и Dermacentor spp. играют дополнительную роль. На сегодняшний день нами получена информация об инфицированности клещей Dermacentor spp. только Е. mûris. В ходе рекогносцировочных исследований нами установлено широкое распространение на территории Иркутской области природных очагов с циркуляцией в них Е. mûris, А. phagocytophilum и «Candidatus Neoehrlichia mikurensis» и отмечена высокая степень зараженности клещей I. persulcatus Е. mûris и A. phagocytophilum, а также возможность микстинфицирования клещей двумя этими возбудителями.

Нами была получена ландшафтная характеристика районов, в которых выявлена циркуляция Е. mûris, A. phagocytophilum и «Candidatus Neoehrlichia mikurensis». Было показано, что очаги МЭЧ и ГАЧ приурочены к различным типам ландшафтов — от горно-таежных до лесостепных и степных.

Для выявления ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae с помощью двухраундовой ПЦР проанализировано 49 образцов печени мелких млекопитающих, отловленных в различных биотопах Эхирит-Булагатского района Иркутской области. Доля животных, в печени которых обнаружена ДНК Е. mûris, составила 6,1 %, ДНК A. phagocytophilum выявлена у 8,2 %, мелких млекопитающих, нуклеиновых кислот двух патогенов одновременно - у 6,1 % (табл. 3).

С учетом данных по микстинфицированности грызунов, к числу потенциальных резервуарных хозяев Е. mûris на территории Иркутской области могут быть отнесены: M. oeconomus, M. gregalis, M. rutilus и Sorex spp. Возможными резервуарными хозяевами A. phagocytophilum являются M. oeconomus и M rutilus. M. rutilus и Sorex spp. относятся к таежному эколого-фаунистическому комплексу, M. oeconomus и M. gregalis — к агрозооценозам.

11

Таблица 3

Результаты исследования грызунов, отловленных на территории Иркутской области, на присутствие ДНК Е. mûris и A. phagocytophilum

№ Кол-во Число образцов, в которых обнаружена ДНК

Вид животного исслед. А. Е. mûris +

особей Е. mûris phagocytophilum А. phagocytophilum

1 Microtus oeconomus 17 - 2* 2

2 Microtus gregalis 4 1 - -

3 Sorex spp. 21 2 - -

4 Myodes rutilus 5 - 2* 1

5 Myodes rufocanus 1 - - -

6 Rattus norvegicus 1 - - -

Всего ( %) 49 3 (6,1) 4 (8,2) 3 (6,1)

* - в одном из образцов одновременно обнаружена РНК вируса КЭ

Результаты ретроспективного тестирования крови людей на наличие антител к возбудителям МЭЧ и ГАЧ

С целью выяснения возможной роли возбудителей ГАЧ и МЭЧ в региональной инфекционной патологии нами проведено ретроспективное исследование 909 проб сывороток крови от больных людей, имеющих укус клеща в анамнезе. Проведено определение наличия ^М и к возбудителям МЭЧ и ГАЧ. Кроме того, большая часть проб крови людей с лихорадкой неясной этиологии тестировалась нами одновременно и на наличие маркеров других инфекций. С помощью ПЦР выявлялись нуклеиновые кислоты возбудителей КЭ и ИКБ, методом ИФА определялись антитела к возбудителям ИКБ и КЭ или антиген вируса КЭ. Результаты выполненных исследований приведены в таблице 4.

Антитела только к возбудителю МЭЧ обнаружены в 21 пробе (2,9 %). Антитела к возбудителю ГАЧ в виде моноинфекции обнаружены в 16 случаях (2,3 %). Особую группу составили пробы сывороток крови, в которых наличие антител к анаплазмам и эрлихиям сочеталось с присутствием антител к возбудителям ИКБ и КЭ (либо антигена ВКЭ в зависимости от метода исследования). Из 802 образцов в двух пробах одновременно выявлены 1§М к возбудителям МЭЧ и ИКБ (0,3 %). Микстинфекция ГАЧ и ИКБ выявлена в четырех случаях (0,7 %), микстинфекция ГАЧ и КЭ зафиксирована в трех случаях (0,5 %). Таким образом, при исследовании 909 сывороток больных людей с укусом клеща в анамнезе ретроспективно выявлено в общей сложности 23 случая контакта с возбудителем МЭЧ (3,1 %) и 23 - с возбудителем ГАЧ (3,5 %). Обнаружить ДНК возбудителей МЭЧ и ГАЧ в крови обследуемых пациентов методом ПЦР не удалось.

У больных, в крови которых были обнаружены антитела к возбудителям ГАЧ и МЭЧ, отмечались следующие симптомы: высокая температура (39-40°С), общее недомогание (слабость, разбитость, головная боль), региональный лимфаденит. 12

Таблица 4

Результаты ретроспективного исследования сывороток крови больных (за период с 2003 по 2012 гг.)

Наличие антител к возбудителям МЭЧ и ГАЧ Число обследованных проб сыворотки Количество подтвержденных случаев

Абс. %

МЭЧ (IgM) МЭЧ (IgG) МЭЧ (IgM) + ИКБ 820 736 802 3 18 ... . 2- 0,4 2,5 0,3

ГАЧ (IgM) 710 13 1,8

ГАЧ (IgG) 552 3 0,5

ГАЧ (IgM) + ИКБ 665 2 0,3

ГАЧ (IgG) + ИКБ 552 1 0,2

ГАЧ (IgM + IgG) + ИКБ 580 1 0,2

ГАЧ (IgM) + вирус КЭ 690 2 0,3

ГАЧ (IgG) + вирус КЭ 552 1 0,2

Путем сбора анамнеза у пациентов с положительными результатами анализа на наличие антител к возбудителям ГАЧ и МЭЧ были выявлены места нападения клещей, зараженных данными возбудителями. Так люди, имеющие антитела к эрлихиям, были укушены клещами на территории Иркутского, Ше-леховского, Слюдянского, Усольского, Эхирит-Булагатского, Ольхонского, Осинского и Баяндаевского районов Иркутской области. Наличие антител к возбудителю ГАЧ выявлено у людей, подвергшихся нападению клещей в Ше-леховском, Иркутском, Баяндаевском, Осинском и Куйтунском районах. Эти данные могут свидетельствовать в пользу достаточно широкого распространения очагов ГАЧ и МЭЧ на территории Иркутской области.

Наличие в крови лиц с лихорадкой неясной этиологии антител к этим возбудителям свидетельствует о контакте населения с клещами, инфицированными данными патогенами. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что возбудители МЭЧ и ГАЧ могут являться причиной сезонных лихорадок неустановленной этиологии (6,6 % случаев) и принимать участие в региональной инфекционной патологии. Верифицированы случаи микстинфецирования людей одновременно возбудителями ГАЧ и ИКБ, МЭЧ и ИКБ, ГАЧ и КЭ.

На основании данных молекулярно-генетических и серологических исследований нами установлено распространение очагов МЭЧ и ГАЧ на территории 16 районов Иркутской области (рис. 1).

Изучение генетического разнообразия эрлихий и анаплазм, инфицирующих нопуляции иксодовых клещей в Иркутской области

В ходе выполнения данной работы были расшифрованы нуклеотидные последовательности двух генетических локусов (гена 16Б рРНК и groESL опе-рона) двадцати изолятов ДНК бактерий семейства АпарШтШасеае.

Нуклсотидныс последовательное™ groESL оперона и гена I6S рРНК Е. mûris ранее были определены в образцах из клешей и млекопитающих, отловленных на территории азиатской части России (Pap, 2011). Все они были идентичны друг другу и нуклеотидной последовательности Е. mûris (GenBank AB 196302), выявленной у грызунов в Японии и отличались двумя нуклеотид-ными заменами от последовательности Е. mûris (GenBank ABO 13009), которая впервые была генотипирована в Японии в 1999 г. в клещах и грызунах (рис. 2).

Анализ нуклеотидных последовательностей groESL оперона трех образцов ДНК Е. mûris из Иркугской обласги (Irk-Ip615, Irk-Ip635, Irk-Hc313) показал, что они идентичны последовательностям groESL оперона образов Е. mûris, выявленных в Новосибирской области (GU358686) и Хабаровском крас (GU358689) и отличаются двумя заменами от единственной доступной в базе данных GenBank последовательности groESL оперона (AF210459) из других стран (Kawahara, 1999; Sumner, 2000) (рис. 3).

ДНК «Candidatus Neoehrlichia mikurensis» была детектирована в двух образцах таежных клещей, отловленных на территории Иркутского района (Irk-Ip659, Irk-Ip661). Сравнение первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК образца Irk-Ip659 с нуклеотидными структурами микроорганизмов семейства Anaplasmalaceae, имеющимися в GenBank. показало его схожесть с соответствующим участком ДНК образца «Candidatus Ncochrlichia mikurensis», впервые

■ t. mûris ф - A. phagocytophUum A - «Candidatus Seoehrlichia mikurensis»

Рисунок I. Карта-схсма районов Иркутской области с указанием очагов ГЛЧ и МЭЧ, установленных на основании серологических и молскулирио-гсистичсских исследований.

обнаруженного в Японии в клещах Ixodes ovatus и грызунах (Kawahara, 2004), а также с нуклеотидными последовательностями образцов, ранее описанных как «Ehrlichia-like» sp. Schotti variant, выявленных в клещах I. ricinus из Голландии, в клещах I. persulcatus из Омской области и серой крысе (Rattus norvégiens) (Шпынов, 2004; Cimmino, 1998; Pan, 2003) (см. рис.2).

Candldatus N.m.Kh-lp81 (FJ966364)

Candldatus N.m. (AB196305) клещи, грызуны, Япония

{Candldatus N.m Irk-Ip661 Candldatus N.m. Irk-!p659 (FJ966360) Candidatus N.m. (EU810405) l.rlclnus, Германия Candldatus N.m. (EU810404) человек, Германия Candidatus N.m. (AF104680) l.rlclnus, Нидерланды Candldatus N.m. (GQ501090) человек, Швейцария ü: j Candidatus N.m. (AB196304) клещи, грызуны, Япония 8 Candldatus N.m. (AB074460) l.ovatus, Япония ■ Candldatus N.m. (AB084582) l.ovatus, Япония lÖSCandldatus N.m. (AY135531) грызуны, Китай

-Candldatus N.lotoris (EF633744)

E.rumlnantium корова,Африка (X62432) E.canls (M73221) E.ewingil (U96436) E.chaffeensls (U60476)

E.muris (AB013009) клещи, грызуны, Япония .E.muris Nov-Ip 205 (GU358691) 10I E.muris) Irk-Ip615 5* E.muris (AB196302) грызуны, Япония Anaplasma centrale (AF283007) Anaplasma bovis (FJ169957) — Anaplasma platys (AF303467)

A.phagocytophilum Irk-Ip625 (HM366583) A. phagocytophilum Nov-lp456 (HM366582) A.phagocytophilum (AF093788) человек, Германия ^ A.phagocytophilum Sv-Ip854 (HM366579) A.phagocytophilum Kh-Ip7 (HM366580) A.phagocytophilum Irk-Ip820 (HM366586) ■A.phagocytophilum Irk-Ip662 (HM366584) A.phagocytophilum Irk-Ip776 (HM366585) A.phagocytophilum Nov-lp365 (HM366580) 'A.phagocytophilum (DQ342324) грызуны, Китай A.phagocytophllum Kh-ip144 (HM366589) Wolbachia piplentis (AF179630)

Рис. 2. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК (1299 н.о.) представителей семейства Anaplasmataceae, построенная с использованием метода NJ. Шкала представляет 1 % дивергенции. Красным цветом выделены последовательности из Иркутской области и последовательности Е. mûris Nov-Ip205, A. phagocytophilum Nov-Ip456 и Kh-Ip7 из Новосибирской области и Хабаровского края, идентичные последовательностям из Иркутской области.

Нуклеотидные последовательности фрагмента гена groESL оперона образцов Irk-Ip659 и Irk-Ip661 оказались идентичны друг другу и генетически близкими соответствующей нуклеотидной структуре образца «Candidatus Neoehrlichia mikurensis» (EU810406), которая была генотипирована недавно в образце крови пациента из Германии (Von Loewenich, 2010), что может служить свидетельством в пользу возможного участия этого вида в инфекционной патологии человека (см. рис. 3).

А.рИ. ЫоУ-сЫртипк 1322 (Н0630618)

А.рИ.№У-1р364 (НМ366569)

А.рН. 1гк-1р10

А.рИ. КМр7 (НМ366575)

А.рН. 1гк-1р662 (НМ366572)

А.рИ. 1гк-1р320 (НМ366574)

А.рИ. (АР383227) косуля, Швейцария

А.рН. (АЯ172163) человек, США

А.рИ. (АЯ548386) овца, Норвегия А.рИ. (АР478563) человек, Словения

\

1001

100 |

90

7 47

90

А.рН. (AF192796) полевка, Швейцария А.рИ. Nov-lp456 (НМ366570) А.рИ. Irk-lp853 А.рИ. Irk-lp625 (НМ366571)

Anaplasma marginale (AF165812)

-Anaplasma platys (AY044161)

E.ruminantium (U13638) E.ewingii (AF195273) E. canis (U96731) E.cHaffeensis (L10917) E.muris Nov-Ip 205 (GU358686) E.muris Ip662

E.muris (AF210459) клещи, Япония E.muris-KH1550- (6U358689) - Candidatus N.m. (AB084583) грызуны, Япония > Candidatus N.m. (AB074461) l.ovatus, грызуны, Япония Candidatus N.m. Nov-lp82 (FJ966361) Candidatus N.m. Irk-lp661 Candidatus N.m.lrk-Ip659 (FJ966359) Candidatus N.m. (HM045824) человек, Швейцария Candidatus N.m. (EU810406) человек, Германия Candidatus N.m. (EU810407) l.ricinus, Германия Candidatus N.m. (EU432375) собака, Германия -Neorickettsia ristlcü (U24396)

Рис. 3. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей фрагментов groESL опе-рона представителей семейства Anaplasmataceae (1245 и.о.), построенная с использованием метода NJ. Шкала представляет 20 % дивергенции. Красным цветом выделены последовательности из Иркутской области и последовательности А. phagocytophilum Nov-Ip456 и E.muris Nov-Ip 205 из Новосибирска, идентичные не зарегистрированным в базе данных GenBank последовательностям из Иркутской области.

В ходе выполнения данной работы были определены нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона А. phagocytophilum в 15 образцах, выявленных в клещах I. persulcatus.

При анализе нуклеотидных последовательностей ДНК данных образцов мы применяли схему деления А. phagocytophilum на генетические варианты, которая была использована при изучении генетической вариабельности образцов А. phagocytophilum из других регионов России (Pap, 2011). Согласно этой 16

схеме при анализе нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК на территории Иркутской области выявлено четыре генетических варианта А. phagocytophilum (табл. 5), но только вариант 1 соответствовал последовательности гена 16Б рРНК Л. phagocytophilum (ОепВапк АР093788), обнаруженной в крови больных людей (СЬае е1 а1., 2000).

Таблица 5

Варианты А. phagocytophilum, обнаруженные на территории Иркутской области

Образец Генетический вариант Количество проб с данным вариантом A. phagocytophilum

groESL 16S pPHK

Irk-Ip853 I 1 5

Irk-Ip625 I 2 2

Irk-IplO III-a 4 1

Irk-Ip776 Ill-b 4 2

Irk-Ip820 III-c 4 3

Irk-Ip662 III-h 5 1

Нуклеотидные последовательности groESL оперона A. phagocytophilum из Иркутской области принадлежали к двум генетическим группам (I, III) и были идентичны последовательностям, обнаруженным ранее в образцах клещей и грызунов, собранных в азиатской части России (Pap, 2011). Что касается других стран, то наибольшее сходство (98,2 % гомологии) было отмечено с нук-леотидной последовательностью groESL оперона А. phagocytophilum из рыжей полевки из Швейцарии (AFI92796), уровень гомологии с другими известными последовательностями А. phagocytophilum не превышал 95,5 % (рис. 3).

Таким образом, в ходе проведенных исследований установлены различия по генетической вариабельности представителей семейства Anaplasmataceae, циркулирующих на территории Иркутской области. Установлено, что нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона у образцов Е. mûris, выделенных из таежных клещей строго консервативны, а у A. phagocytophilum - высоковариабельны. На основании анализа последовательности гена 16S рРНК выявлено четыре варианта A. phagocytophilum, объединенных на основе анализа groESL оперона в две генетические группы. Последовательности обоих генетических маркеров «Candidatus Neoehrlichia mikurensis», обнаруженных в клещах I. persulcatus азиатской части России также оказались высококонсервативными, но отличались от последовательностей гена 16S рРНК и groESL оперона европейских изолятов из ареала I. ricinus.

Результаты одновременного скрининга переносчиков и их прокоми-телей на наличие нескольких клещевых патогенов и вопросы совершенствования микробиологического мониторинга в условиях сочетанности природных очагов Иркутской области

Наиболее значимый поток информации для осуществления эпидемиологического надзора за клещевыми природно-очаговыми инфекциями формируется в результате проведения микробиологического мониторинга. Данные, полученные в ходе его выполнения, являются одной из важных составляющих

информационной подсистемы эпидемиологического надзора. От уровня и надежности используемых лабораторных методов зависит эффективность скри-нинговых и клинико-диагностических исследований, что влияет на адекватность постановки эпидемиологического диагноза и реализацию эпидемиологического надзора в целом. При необходимости детекции широкого спектра возбудителей клещевых инфекций в сочетанных природных очагах, актуальным становится выбор методов, отличающихся относительной простотой постановки, доступностью, точностью (высокая специфичность и чувствительность) и экономичностью.

Для одновременного обнаружения в переносчиках и прокормителях вируса КЭ, В. burgdorferi s.l., В. myiamotoi, эрлихий и анаплазм, циркулирующих в природных очагах Иркутской области, нами использован комплекс диагностических тестов (микроскопия содержимого кишечника клеща для выявления боррелий, ИФА для индикации антигена КЭ, двухраундовая ПЦР). Для обнаружения нуклеиновых кислот был использован метод двухраундовая ПЦР с тест-системами производства «Биосан». Результаты скрининга клещей и мелких млекопитающих приведены в таблице 7.

ДНК Е. muris выявлена в 5,7 %, A. phagocytophilum - в 2,1 % исследованных образцов. Микстинфицирование Е. muris + A. phagocytophilum обнаружено в 1,5 %, Е. muris в сочетании с В. burgdorferi s.l. - в 2,7 % случаев. Частота встречаемости сочетаний эрлихий и вируса КЭ, анаплазм и вируса КЭ, анаплазм и боррелий не превышала 1 %. Проведенные исследования показали, что в одном клеще одновременно могут быть детектированы от одного до четырех различных патогенов, что свидетельствует о высокой степени сочетан-ности очагов трансмиссивных клещевых инфекций на территории Иркутской области.

Таблица 7

Сочетания патогенов, обнаруженные в микстинфицированных клещах и мелких млекопитающих на территории Иркутской области

Кол-во выявленных Процент от об-

Обнаруженные сочетания возбудителей образцов с данным щего числа ис-

сочетанием возбуди- следованных об-

телей разцов

Е. muris 135 5,7 %

A. phagocytophilum 51 2,1 %

Е. muris + A. phagocytophilum 35 1,5%

Е. muris + В. burgdorferi s.l. 63 2,7 %

Е. muris + В. miyamotoi + В. garinii 1 0,04 %

Е. muris + В. miyamotoi 3 0,1 %

Е. muris + вирус КЭ 14 0,6 %

A. phagocytophilum + В. burgdorferi s.l. 2 0,1 %

A. phagocytophilum + вирус КЭ 11 0,5 %

Е. muris + A. phagocytophilum + В. burgdorferi s.l. 2 0,1 %

Е. muris + A. phagocytophilum + вирус КЭ 6 0,3 %

Е. muris + A. phagocytophilum + В. burgdorferi s.l. 2 0,1 %

+ вирус КЭ

Проведена также апробация коммерческой тсст-снстемы «Amplisens® TBEV, В. burgdorferi si, A. phagocytophilum. Е. chqffeensis/E. mûris - FL» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребпадзора РФ, г. Москва) для мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Этим методом проведено исследование 132 экземпляров иксодовых клещей, собранных в разных районах Иркутской области. Аналитическая чувствительность данной тест-системы для всех вышеперечисленных возбудителей составляет 5-103 копий/мл. Специфичность при анализе гстерологичных штаммов вирусов и бактерий - 100 %.

Генетические маркеры вируса КЭ выявлены в 4,5% проб, боррелий - у 2,7 % клещей, Е. mûris / Е. chaffeensis - у 11,4 %, A. phagocytophillum - в 6,8 % случаев (рис. 4). В 3,8 % клещей зафиксирована микстинфекция -Е. mûris / Е. chaffeensis + A. phagocytophillum, в 0,8 % случаев одновременно обнаружена РНК вируса КЭ и ДНК Е. mûris /Е. chaffeensis (рис. 4).

□ вирус КЭ Иборрелии

□ эрлихии Оаиаллазмы

■ эрлихии ♦ аналлазмы ■ вирус КЭ ♦ эрлихии

■ нсзараженные клещи

Рис 4. Результаты исследования иксодовых клещей с помощью мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

Мультиплексная ПЦР позволяет проводить несколько реакций для индикации нуклеиновых кислот разных микроорганизмов одномоментно, результаты учитываются в режиме реального времени, что приводит к снижению затрат на реакгивы и увеличение скорости получения результата. По нашему мнению, подобная технология оптимальна для проведения массовых скринин-говых исследований инфицированности клещей и мелких млекопитающих возбудителями клещевых инфекций в сочстанных природных очагах.

Одним из важных условий для осуществления иммунологического (серологического) мониторинга как составляющей информационной подсистемы эпидемиологического надзора за природно-очаговыми инфекциями является информация о широте контакта населения с очагами, получение которого базируется на серологических методах исследования. Для ретроспективных скрининговых серологических исследований нами использован метод имму-ноферментного анализа, результаты которого изложены выше.

Для дифференциальной диагностики клещевых инфекций, возникших у людей, находящихся в инфекционных стационарах г. Иркутска и п. Усть-Орды

после присасывания клеща, нами была использована двухраундовая ПЦР. При исследовании 155 сывороток крови в двух (1,3 %) была выявлена РНК вируса КЭ, в шести (3,9 %) - ДНК боррелий группы ИКБ. Генетические маркеры возбудителей МЭЧ, ГАЧ, КР, а также боррелий из группы клещевых возвратных лихорадок не выявлены. По нашему мнению, молекулярно-генетические методы надо рассматривать не как альтернативу классическим методам лабораторной диагностики, а как взаимодополняющие тесты.

Правильно организованный микробиологический мониторинг за новыми и возвращающимися инфекциями, передаваемыми через укус клеща, актуальными для Восточной Сибири, позволит минимизировать социальный и экономический ущерб, наносимый региону данной группой инфекций, поможет предотвратить их неожиданное появление и позволит вовремя принять меры по их эффективному предупреждению с помощью средств и методов специфической диагностики, профилактики и рационального лечения.

ВЫВОДЫ

1. Установлено широкое распространение на территории Иркутской области очагов МЭЧ и ГАЧ с циркуляцией в них Е. mûris, A. phagocyîophilum и нового представителя семейства Anaplasmataceae - «Candidatus Neoehrlichia mikurensis». Показано, что очаги МЭЧ и ГАЧ приурочены к различным типам ландшафтов - от горно-таежных до лесостепных и степных.

2. Основным переносчиком бактерий семейства Anaplasmataceae на территории Иркутской области является таежный клещ I. persulcatus. Клещи H. concinna и Dermocentor spp. выполняют роль дополнительных переносчиков. К потенциальным резервуарным хозяевам эрлихий и анаплазм на территории Иркутской области могут быть отнесены: M. oeconomus, M. gregalis, M. rutilus и Sorex spp.

3. Ретроспективное тестирование образцов крови людей с укусом клеща в анамнезе на наличие антител к возбудителям МЭЧ и ГАЧ выявило присутствие у 6,6 % из них антител к этим возбудителям, что может свидетельствовать о возможном участии эрлихий и анаплазм в региональной инфекционной патологии. Верифицированы случаи микстинфицирования людей одновременно возбудителями ГАЧ и ИКБ, МЭЧ и ИКБ, ГАЧ и КЭ.

4. Показано, что нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона у образцов Е, mûris и «Candidatus Neoehrlichia mikurensis» идентичны выявленным в различных местах ареала клещей I. persulcatus и являются строго консервативными, а у A. phagocytophilum - высоко вариабельны. На основе анализа гена 16S рРНК выявлено четыре варианта нуклеотид-ных последовательностей A. phagocytophilum. При изучении groESL оперона выявлено две генетические группы.

5. Установлена высокая степень сочетанности очагов трансмиссивных клещевых инфекций на территории Иркутской области. Выявлен спектр возбудителей и их возможных сочетаний при коинфицировании ими иксодовых клещей и мелких млекопитающих.

6. Для совершенствования микробиологического мониторинга за циркуляцией возбудителей клещевых инфекций в сочетанных природных очагах предложено использование комплекса методов, включая молекулярно-генетические. Оптимальным является применение технологии мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, позволяющей проводить индикацию сразу четырех патогенов одномоментно, снизить затраты на реактивы и увеличить скорость получения результата.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

В изданиях, рекомендованных ВАК

1. Результаты рекогносцировочных исследований по моноцитарному эр-лихиозу и гранулоцитарному анаплазмозу человека в Прибайкалье / И. В. Козлова, В. И. Злобин, М. М. Верхозина, В. А. Pap, О. В. Лисак, Е. К. Дорощенко, С. С. Шулунов, О. Л. Богомазова, А. М. Антонова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2007. - № 3 (55). - С. 112-116.

2. Совершенствование методов экстренной лабораторной диагностики трансмиссивных клещевых инфекций в условиях сочетанных природных очагов Прибайкалья / О. В. Лисак, И. В. Козлова, М. М. Верхозина, Е. К. Дорощенко, О. В. Сунцова, Л. Б. Бадуева, М. О. Горина, Т. В. Демина, М. А. Хасна-тинов, С. С. Шулунов, С. Э. Дигас, В. И. Злобин // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2007. -№3 (55). - С. 131-135.

3. Эпидемиологическая ситуация в отношении моноцитарного эрлихиоза и гранулоцитарного анаплазмоза в Прибайкалье (результаты рекогносцировочных исследований за 2003-2007 гг.) / Е. К. Дорощенко, И. В. Козлова, М. М. Верхозина, О. В. Лисак, В. А. Pap, Ю. П. Джиоев, Т. В. Демина, В. И. Злобин И Вестн. Российской военно-медицинской академии. - 2008. -Приложение 2(22) (ч. II). - С. 604-605.

4. Сочетанные очаги трансмиссивных клещевых инфекций на территории Прибайкалья / И. В. Козлова, М. М. Верхозина, Т. В. Демина, Ю. П. Джиоев, Е. К. Дорощенко, О. В. Лисак, Л. С. Карань, Н. М. Коляснико-ва, В. А. Pap, Н. В. Фоменко, С. Е. Ткачев, О. Л. Богомазова, В. А. Борисов, М. К. Туваков, В. И. Злобин // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2010. -№4(53).-С. 40-46.

5. Изучение гетерогенности гена 16S рРНК и groESL оперона у представителей семейства Anaplasmataceae, выявленных в таежных клещах на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока / В. А. Pap, Т. И. Епихина, Н. Н. Ливанова, В. В. Панов, Е. К. Дорощенко, Н. М. Пуховская, Н. П. Высочина, Л. И. Иванов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2011.-Т. 26, №2.-С. 17-24.

6. Genetic variability of Anaplasma phagocyíophilum in Ixodes persulcatus ticks and small mammals in the Asian part of Russia / V. A. Rar, Т. I. Epikhina, N. N. Livanova, V. V. Panov, E. K. Doroschenko, N. M. Pukhovskaya, N. P. Vyso-china, L. I. Ivanov // Vector-Borne and Zoonotic Diseases. - 2011. - Vol. 11, N 8. -P. 1013-1021.

7. Видовое и генетическое разнообразие возбудителей клещевых инфекций на территории Восточной Сибири / И. В. Козлова, Е. К. Дорощенко, О. В. Лисак, Ю. П. Джиоев, М. М. Верхозина, Т. В. Демина, В. А. Pap, С. Е. Ткачев, Н. В. Фоменко, О. В. Сунцова, О. О. Черноиванова, А. И. Парамонов, А. О. Ревизор, В. И. Злобин // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 2(84), ч. 2. - С. 75-82.

8. Выявление очагов моноцитарного эрлихиоза и гранулоцитарного анаплазмоза человека на территории Красноярского края / Е. К. Дорощенко, О. В. Лисак, Т. Г. Хазова, В. А. Pap, И. В. Козлова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2013. - № 2, ч. 2. - С. 106-110.

В других изданиях

9. Генетическая вариабельность возбудителей трансмиссивных клещевых инфекций, циркулирующих в сочетанных природных очагах Иркутской области / И. В. Козлова, М. М. Верхозина, Т. В. Демина, Ю. П. Джиоев, О. В. Лисак, Е. К. Дорощенко, В. А. Pap, М. А. Хаснатинов, С. С. Шулунов, Г. А. Данчинова, С. Э. Дигас, В. И. Злобин // Эрдэм шинжилгээний бутээл. -2008.-№16.-С. 283-291.

10. Моноцитарный эрлихиоз и гранулоцитарный анаплазмоз человека -новые для Прибайкалья инфекции / И. В. Козлова, М. М. Верхозина, Е. К. Дорощенко, О. В. Лисак, В. А. Pap, Ю. П. Джиоев, Т.В. Демина // Журн. инфекционной патологии. - 2009. - Т.16, №3 . - С. 129-130.

11. Диагностика и профилактика клещевых инфекций в сочетанных природных очагах Восточной Сибири : пособие для врачей / И.В. Козлова, М. М. Верхозина, Т. В. Демина, О. В. Лисак, Е. К. Дорощенко, А. В. Хабаров, Е. Д. Савилов. - Иркутск, 2009. - 31 с.

12. Genetic diversity of Anaplasma and Ehrlichia in the Asian part of Russia / V. A. Rar, N. N. Livanova, V. V. Panov, E. K. Doroschenko, N. M. Pukhovskaya, N. P. Vysochina, L. I. Ivanov // Ticks and Tick-borne Diseases. - 2010. - Vol. 1. -P. 57-65.

13. Современная эпидемиологическая ситуация и вопросы молекулярной эпидемиологии, диагностики и профилактики трансмиссивных клещевых инфекций на территории Сибири / И. В. Козлова, М. М. Верхозина, Е. К. Дорощенко, О. В. Лисак, Т. В. Демина, Ю. П. Джиоев // Экологические аспекты краевой инфекционной патологии. - Новосибирск : Наука, 2012. - С. 168-228.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВКЭ - вирус клещевого энцефалита

ГАЧ-гранулоцитарный анаплазмоз человека

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИКБ - иксодовый клещевой боррелиоз

ИФА — иммуноферментный анализ

МЭЧ-моноцитарный эрлихиоз человека

кДНК - комплементарная ДНК

КС - коэффициент серопозитивности

КЭ — клещевой энцефалит

н.о. — нуклеотидный остаток

ПЦР -полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная РНК

gro£SX-oпepoн — оперон гена теплового шока

- иммуноглобулины класса О ^М - иммуноглобулины класса М

168 - коэффициент седиментации макромолекул (РНК, ДНК)

Подписано в печать 25.11.2013. Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 764

Отпечатано с готового оригинал-макета

в типографии Издательства ИГУ 664003, г. Иркутск, бульвар Гагарина, 36 тел. (3952) 24-14-36, e-mail: ¡zdat@lawinstitut.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дорощенко, Елена Константиновна, Иркутск

ФГБУ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРОБЛЕМ ЗДОРОВЬЯ СЕМЬИ И РЕПРОДУКЦИИ ЧЕЛОВЕКА» СО РАМН

РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА А МАРЕАБМА ТА СЕЛЕ В СОЧЕТАННЫХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ КЛЕЩЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ

03.02.03 - микробиология

На правах рукописи

04201455476

ДОРОЩЕНКО

Елена Константиновна

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Козлова Ирина Валерьевна

Иркутск -2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................ 4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................ 5

ГЛАВА 1. МОНОЦИТ АРНЫЙ ЭРЛИХИОЗ И ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ АНАПЛАЗМОЗ ЧЕЛОВЕКА - НОВЫЕ ДЛЯ РФ ИНФЕКЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).............................. 12

1.1. История изучения эрлихиозов: классификация представителей семейства АпарЬятШасеае и обнаружение возбудителей ГАЧ

и МЭЧ в разных странах мира .............................................. 12

1.2. Этиология, патогенез, клинические проявления и методы диагностики ГАЧ и МЭЧ.................................................... 19

1.3. Выявление возбудителей ГАЧ и МЭЧ в природных очагах на территории России............................................................ 24

1.4. Изучение генетического разнообразия анаплазм и

эрлихий в природных очагах азиатской части России................ 28

1.5. Микстинфекция иксодовых клещей: актуальные аспекты изучения, диагностики, лечения и профилактики................................... 35

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................43

2.1. Материалы..........................................................................................................................................43

2.2. Методы..................................................................................................................................................45

2.2.1. Светлопольная микроскопия фиксированных препаратов ... 46

2.2.2. Иммуноферментный анализ ................................................................................46

2.2.3. Молекулярно-генетические методы исследования........................47

2.2.4. Методы статистической обработки материала....................................50

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ОБСТАНОВКИ В ОТНОШЕНИИ МЭЧ И ГАЧ НА ТЕРРИТОРИИ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ......................... 51

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕТРОСПЕКТИВНОГО ТЕСТИРОВАНИЯ КРОВИ ЛЮДЕЙ НА НАЛИЧИЕ АНТИТЕЛ К ВОЗБУДИТЕЛЯМ МЭЧ И ГАЧ................... 63

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЭРЛИХИЙ И АНАПЛАЗМ, ИНФИЦИРУЮЩИХ ПОПУЛЯЦИИ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ В ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ................................................................... 74

ГЛАВА 6. РЕЗУЛЬТАТЫ ОДНОВРЕМЕННОГО СКРИНИНГА

ПЕРЕНОСЧИКОВ И МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА

НАЛИЧИЕ НЕСКОЛЬКИХ КЛЕЩЕВЫХ ПАТОГЕНОВ И ВОПРОСЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СИСТЕМЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА В СОЧЕТАННЫХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ................................................................... 88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................... 101

ВЫВОДЫ.................................................................................. 113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................ 115

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВКЭ - вирус клещевого энцефалита

ГАЧ - гранулоцитарный анаплазмоз человека

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИКБ - иксодовый клещевой боррелиоз

ИФА - иммуноферментный анализ

МЭЧ - моноцитарный эрлихиоз человека

кДНК - комплементарная ДНК

КР - клещевой риккетсиоз

КС - коэффициент серопозитивности

КЭ - клещевой энцефалит

н.о. — нуклеотидный остаток

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция полимеразной цепной реакции

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РВ-ПЦР - метод ПЦР в режиме реального времени

РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная РНК

УОБО - Усть-Ордынский Бурятский округ

groESL-оперон - оперон гена теплового шока

- иммуноглобулины класса в ^М - иммуноглобулины класса М

168 - коэффициент седиментации макромолекул (РНК, ДНК)

ВВЕДЕНИЕ

Гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) и моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ) - это острые трансмиссивные инфекционные заболевения, переносимые клещами. Возбудители данных инфекций Anaplasma phagocytophilum (для ГАЧ), Ehrlichia chaffeensis и Ehrlichia mûris (для МЭЧ) в течение последних 15-20 лет обнаружены в разных видах иксодовых клещей во многих странах Европы и Азии (России, Корее, Китае, Японии), США и Африке [56, 75, 95, 99, 102, 109, 111, 117, 118, 121, 128, 132, 139, 147, 152, 153, 154, 155, 157, 160, 177, 180, 183, 184, 195, 201].

В России эти заболевания выявлены относительно недавно [71, 72, 75, 170], изучены недостаточно и до сих пор не зарегистрированы как нозологические формы. Диагностика ГАЧ и МЭЧ проводится лишь в некоторых субъектах РФ. В то же время там, где осуществляется комплексная лабораторная диагностика заболеваний, переносимых клещами, эти инфекции выявляются достаточно часто [12, 26, 47, 73, 75, 82, 84, 89, 175].

На территории Иркутской области сложились все биоценотические предпосылки для существования очагов ГАЧ и МЭЧ. Известно, что эти заболевания могут протекать под маской «лихорадок неясной этиологии». В Иркутской городской инфекционной больнице ежегодно доля таких сезонных лихорадок, возникших у больных после присасывания клещей, достигает 15%. В связи с этим, актуальным является проведение поисковых исследований по распространению очагов МЭЧ и ГАЧ на территории Иркутской области, установлению спектра переносчиков и резервуарных хозяев возбудителей этих заболеваний и выявлению их роли в региональной инфекционной патологии.

В научной литературе последних лет большое внимание уделяется генетической вариабельности эрлихий и анаплазм. С помощью молекулярно-генетических методов были обнаружены новые генетические варианты эрлихий, филогенетически схожих с Е. chaffeensis [111, 171, 211]. В Японии и на территории Евразии были также обнаружены бактерии «Candidatus Neoehrlichia mikurensis», образующие отдельный филогенетический кластер в

Neoehrlichia mikurensis», образующие отдельный филогенетический кластер в семействе Anaplasmataceae и играющие роль в патологии человека [207]. К этому кластеру относятся также бактерии, ранее выявленные в клещах и грызунах и известные как Ehrlichia-like бактерии «Shcotti variant» и Ehrlichia sp. «Rattus strain» [21, 108, 113, 120]. Данные о патогенности этих вариантов эрлихий для теплокровных на сегодняшний день отсутствуют. В связи с этим необходимо проведение исследований по установлению потенциальной опасности заражения людей новыми бактериями семейства Anaplasmataceae на территории Иркутской области.

Чрезвычайно важным аспектом эпидобстановки является то, что очаги разных клещевых инфекций накладываются друг на друга, т.е. речь идет о совмещенных очагах вирусных, бактериальных и риккетсиозных инфекций. Возможность одновременного присутствия в организме клеща нескольких патогенов может приводить к возникновению микстформ заболевания. Вместе с тем, на сегодняшний день нет четких представлений о степени сочетанности природных очагов клещевых инфекций на территории Иркутской области, спектре возбудителей, разнообразии сочетаний патогенов при коинфицировании ими переносчиков. Методы детекции одновременно нескольких патогенов в одной особи клеща практически отсутствуют.

Цель работы:

Установить широту распространения и генетическое разнообразие представителей семейства Anaplasmataceae в природных очагах Иркутской области, разработать предложения по совершенствованию системы микробиологического мониторинга за возбудителями трансмиссивных клещевых инфекций в сочетанных природных очагах.

Задачи исследования:

1. Оценить зараженность иксодовых клещей и мелких млекопитающих, собранных на территории различных районов Иркутской области Е. muris, и А. phagocytophilum, а также вновь обнаруженными бактериями семейства A napiasmataceae.

2. Провести ретроспективное тестирование образцов крови, полученных от людей с лихорадкой неясной этиологии или укусом клеща в анамнезе, на наличие IgM и IgG к возбудителям МЭЧ и ГАЧ.

3. Изучить генетическое разнообразие эрлихий и анаплазм, инфицирующих популяции иксодовых клещей и мелких млекопитающих на территории Иркутской области.

4. С помощью комплекса методов провести исследование переносчиков и резервуарных хозяев одновременно на несколько патогенов и выявить возможные сочетания возбудителей в микстинфицированных клещах.

5. Разработать предложения по совершенствованию системы микробиологического мониторинга за возбудителями трансмиссивных клещевых инфекций в сочетанных природных очагах Иркутской области.

Научная новизна работы:

Установлено широкое распространение на территории Иркутской области очагов МЭЧ и ГАЧ с циркуляцией в них Е. mûris и A. phagocytophilum. Выявлена циркуляция нового представителя семейства Anaplasmataceae -«Candidatus Neoehrlichia mikurensis». Показано, что очаги МЭЧ и ГАЧ приурочены ко всем типам ландшафта - от горно-таежных до степных.

Получена новая информация об инфицированности разных видов иксодовых клещей возбудителями МЭЧ и ГАЧ и о степени их участия в циркуляции бактерий семейства Anaplasmataceae в природных очагах Иркутской области.

Впервые установлены потенциальные резерву арные хозяева Е. mûris и А. phagocytophilum на территории Иркутской области, к которым могут быть отнесены: Microtus oeconomus, Myodes rutilus, Microtus gregalis и Sorex spp.

Ретроспективное исследование сывороток крови людей с укусом клеща в анамнезе позволило выявить случаи инфицирования возбудителями МЭЧ и ГАЧ, а также возможность микстинфицирования эрлихиями и анаплазмами в сочетании с боррелиями и/или вирусом КЭ.

ГАЧ, а также возможность микстинфицирования эрлихиями и анаплазмами в сочетании с боррелиями и/или вирусом КЭ.

Определены различия по генетической вариабельности представителей семейства Anaplasmataceae, циркулирующих на территории Иркутской области. Установлено, что нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона у образцов Е. mûris, выявленных в таежных клещах, строго консервативны, а у A. phagocytophilum - высоковариабельны. На основании анализа последовательности гена 16S рРНК выявлено четыре варианта А. phagocytophilum, объединенные на основе анализа groESL оперона в две генетические группы.

Получены новые данные о спектре возбудителей клещевых инфекций и их возможных сочетаниях при микстинфицировании иксодовых клещей. Доказана возможность инфицирования переносчиков двумя и более видами возбудителей одновременно, что свидетельствует о высокой степени сочетанности очагов разных клещевых инфекций в Иркутской области.

Разработаны предложения по совершенствованию микробиологического мониторинга за циркуляцией возбудителей клещевых инфекций в сочетанных природных очагах за счет комплексного подхода и внедрения современных молекулярно-генетических методов.

Практическая значимость работы: Обосновано введение в систему эпизоотолого-эпидемиологического надзора микробиологического мониторинга за всем спектром клещевых патогенов, обнаруженных на территории Иркутской области. Апробирована мультиплексная ПЦР в режиме реального времени для одновременной детекции в переносчиках четырех возбудителей (вирус клещевого энцефалита, боррелии, анаплазмы, эрлихии). Определена ее диагностическая и экономическая ценность для микробиологического мониторинга за возбудителями клещевых инфекций.

Данные, полученные в ходе микробиологического мониторинга, могут быть использованы для составления прогноза развития эпидемиологической

ситуации в отношении клещевых инфекций на территории Иркутской области и для разработки эффективных предупредительных мероприятий в сочетанных природных очагах.

В международную электронную базу данных GenBank депонировано 35 нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК и groESL оперона A. phagocytophilum, 5 нуклеотидных последовательностей Е. mûris и 8 нуклеотидных последовательностей «Candidatus Neoehrlichia mikurensis».

Апробация работы: Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены: на Всероссийской конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита», посвященной 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита (Москва, 2007), международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоонозных инфекций» (Улан-Батар, 2008), Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых инфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), международной научной конференции "Zoonotic infectious diseases and tourism" (Ulaanbaatar, 2009), научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней», посвященной 75-летнему юбилею ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» (Иркутск, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней», посвященной 70-летию теории академика E.H. Павловского (Омск, 2009), Пленуме научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития Российской Федерации, посвященному 65-летию РАМН и 130-летию со дня рождения А.Н. Сысина (Москва, 2009), X International Jena Symposium on Tick-borne Diseases (Иена, Германия, 2009), II Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции.

региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Иркутск, 2010), IX Республиканском съезде эпидемиологов, гигиенистов, санитарных врачей и инфекционистов Узбекистана (Ташкент, 2010), XI International Jena Symposium on Tick-borne Diseases, (Иена, Германия, 2011), итоговой научно-практической конференции с международным участием, посвященной 35-летию НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2011), Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 90-летию ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора «Современные аспекты природной очаговости болезней» (Омск, 2011), X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012), международной научной конференции «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами», посвященной 75-летию открытия вируса клещевого энцефалита (Листвянка-Иркутск, 2012), XII International Jena Symposium on Tick-borne Diseases (Weimar, Германия, 2013), Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевого энцефалита» (Москва, 2013).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На территории Иркутской области широко распространены очаги моноцитарного эрлихиоза и гранулоцитарного анаплазмоза человека с циркуляцией в них Е. mûris, A. phagocytophilum и «Candidatus Neoehrlichia mikurensis».

2. Основным переносчиком бактерий семейства Anaplasmataceae на территории Иркутской области является таежный клещ I. persulcatus, а клещи H. concinna и D. nuttalli играют дополнительную роль. Потенциальными резервуарными хозяевами эрлихий и анаплазм на территории региона являются мелкие млекопитающие M. oeconomus, M. gregalis, M. rutilus и Sorex spp.

мелкие млекопитающие M. oeconomus, M. gregalis, M. rutilus и Sorex spp.

3. Представители семейства Anaplasmataceae, циркулирующие a природных очагах Иркутской области, значительно различаются по степени генетической вариабельности. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона у Е. mûris и «Candidatus Neoehrlichia mikurensis» строго консервативны, а у A. phagocytophilum - высоко вариабельны.

4. Совершенствование микробиологического мониторинга за циркуляцией возбудителей клещевых инфекций в сочетанных природных очагах возможно за счет комплексного подхода и использования современных молекулярно-генетических методов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 24 научных работы, в том числе: 10 работ в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ и одно методическое пособие.

Материалы диссертации вошли в отчеты по научным темам, выполненным в отделе природно-очаговых инфекций Института эпидемиологии и микробиологии ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН.

Личный вклад автора: Автором проведена информационная проработка темы исследования, выполнен сбор, анализ и обобщение материалов, сделаны выводы. Доли личного участия автора составляют: в получении и накоплении научной информации - 70%, в обобщении, анализе, интерпритации материалов - 100%.

Структура и объем диссертационной работы: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 140 страницах, иллюстрирована 7 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель содержит 211 источников, из которых 92 работы отечественных и 119 зарубежных авторов.

ГЛАВА 1.

МОНОЦИТ АРНЫЙ ЭРЛИХИОЗ И ГРАНУЛОЦИТ АРНЫЙ АНАПЛАЗМОЗ ЧЕЛОВЕКА - НОВЫЕ ДЛЯ РФ ИНФЕКЦИИ

1.1. История изучения эрлихиозов: классификация представителей семейства Anaplasmataceae и обнаружение возбудителей ГАЧ и МЭЧ в разных странах мира

К эрлихиозам относят природно-очаговые инфекции чел