Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вариабельность переносимых иксодовыми клещами бактерий семейства Anaplasmataceae на территории азиатской части России

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Вариабельность переносимых иксодовыми клещами бактерий семейства Anaplasmataceae на территории азиатской части России"

005006150

V

РАР ВЕРА АЛЕКСАНДРОВНА

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПЕРЕНОСИМЫХ ИКСОДОВЫМИ КЛЕЩАМИ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА ДГЧАРЬА8МАТАСЕАЕ НА ТЕРРИТОРИИ АЗИАТСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 5 ДЕК 2011

Новосибирск - 2011

005006150

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Научный руководитель:

Д.Х.Н., профессор, академик РАН Власов Валентин Викторович

Официальные оппоненты:

д.б.н., доцент Карпенко Лариса Ивановна

Защита состоится «28» декабря 2011 г. в II30 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ri]

Автореферат разослан «22» ноября 2011 г.

к.б.н. Филипенко Максим Леонидович

Ведущая организация:

Омский научно-исследовательский институт природноочаговых инфекций» Роспотребнадзора

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иксодовые клещи являются переносчиками не только возбудителей клещевого энцефалита (КЭ) и иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ), но и возбудителей так называемых вновь возникших инфекций (emergence infections), типичными представителями которых являются эрлихиозы, вызываемые бактериями семейства Anaplasmataceae. Широкий интерес к изучению данных заболеваний возник после обнаружения среди представителей семейства Anaplasmataceae патогенных для людей видов. В настоящее время известно 5 видов семейства Anaplasmataceae, вызывающих эрлихиоз человека - Neorickettsia sennetsu, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii и Ehrlichia canis. Кроме того, инфекцию у людей могут вызвать бактерии кандидатного вида "Candidatus Neoehrlichia mikurensis". За исключением бактерий N. sennetsu, остальные возбудители эрлихиозов человека передаются в результате присасывания инфицированных иксодовых клещей (Rikihisa, 1991).

Подавляющее большинство случаев эрлихиозов (несколько тысяч) зарегистрировано в США, при этом летальность составляла 1-3%. В Европе отмечены десятки случаев заболеваний, вызванных А. phagocytophilum и единичные случаи заболеваний, вызванных "Candidatus N. mikurensis" (Thomas et al., 2009; von Loewenich et al., 2010). В России серологически подтвержденные случаи эрлихиозов были отмечены в различных областях (Афанасьева и др., 2006; Борисов и др., 2010).

Жизненный цикл эрлихий и анаплазм включает стадии размножения в служащих специфичными переносчиками иксодовых клещах и в являющихся резервуарными хозяевами позвоночных животных (Parola et al, 2005). К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных изучению распространения, видовой и внутривидовой вариабельности эрлихий и анаплазм, циркулирующих на территории США, Европы, Китая, Кореи и Японии, а также установлению их резервуарных хозяев. На территории России в таежных клещах Ixodes persulcatus молекулярными методами были выявлены три вида из семейства Anaplasmataceae - A. phagocytophilum, Ehrlichia muris и, в единичных случаях, "Candidatus N. mikurensis" (Шпынов и др., 2004; Eremeeva et al., 2006; Нефедова и др., 2008). Однако распространение бактерий семейства Anaplasmataceae в различных видах позвоночных хозяев и в различных видах клещей, а также генетическая гетерогенность A. phagocytophilum и других представителей семейства Anaplasmataceae, распространенных на территории России, практически не изучена.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось проведение молекулярно-генетического анализа представителей семейства

Anaplasmataceae, выявленных в клещах и мелких млекопитающих на территории азиатской части России.

Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить распространение и видовое разнообразие бактерий из семейстЁа Anaplasmataceae в иксодовых клещах и мелких млекопитающих на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока.

2. Провести молекулярно-генетический анализ выявленных бактерий из семейства Anaplasmataceae на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и groESL оперона.

3. Изучить возможность участия возбудителей гранулоцитарного анаплазмоза и моноцитарного эрлихиоза человека в патогенезе переносимых клещами инфекций на территории Новосибирской области.

Научная новизна и практическая значимость работы. Было впервые проведено комплексное исследование распространения и генетического разнообразия бактерий семейства Anaplasmataceae в иксодовых клещах и мелких млекопитающих на территории азиатской части России. Показано, что возбудитель гранулоцитарного анаплазмоза человека (ГАЧ) A. phagocytophilum, предполагаемый возбудитель моноцитарного эрлихиоза человека (МЭЧ) Е. mûris и, в единичных случаях, патогенные для людей бактерии "Candidates N. mikurensis" распространены в различных частях ареала таежного клеща, что свидетельствует о возможном участии данных возбудителей в патогенезе перекосимых клещами инфекций на территории исследуемых областей. Показано, что выявленные образцы Е. mûris и "Candidates N. mikurensis" строго консервативны по гену 16S рРНК и groESL оперону, а выявленные образцы A. phagocytophilum на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и groESL оперона подразделяются на три группы, которые различаются также по тропизму к позвоночным хозяевам. На территории Хабаровского края в клещах Haemaphysalis spp. и в мелких млекопитающих были обнаружены два новых генетических варианта Ehrlichia spp., которые не могут быть отнесены ни к одному из известных видов. Кроме того, в клещах Ixodes spp., Haemaphysalis concinna и Dermacentor silvarum была обнаружена ДНК 11 новых генетических вариантов бактерий из семейства Anaplasmataceae, которые на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК не могут быть отнесены ни к одному из родов семейства.

Показано, что на территории Новосибирской области около 2% случаев острых лихорадочных состояний у пациентов, возникающих после присасывания клеща, могут быть верифицированы как случаи гранулоцитарного анаплазмоза и/или моноцитарного эрлихиоза.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 статей. Результаты работы были представлены на трех

российских и двух международных конференциях: «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке», Томск, 2006; 3rd International Conference "Basic Science for Medicine", Новосибирск, 2007; Научная конференция с международным участием «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии», Иркутск, 2007; 4-я Межрегиональная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы неврологии и инфекционных болезней», Новосибирск, 2008; X International Jena Symposium on Tick-borne Diseases, Weimar (Germany), 19-21 марта 2009 г.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 10 рисунков и 15 таблиц. Библиография включает 190 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в

иксодовых клещах

На наличие ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae методом двухраундовой ПЦР в присутствии родоспецифичных праймеров из области гена 16S рРНК были исследованы образцы от 4559 голодных имаго иксодовых клещей, собранных в лесных биотопах на территории Свердловской, Челябинской, Новосибирской, Иркутской областей и Хабаровского края в 2003-2010 годах. На территории всех исследованных областей были собраны таежные клещи I. persulcatus. Кроме того, на территории Новосибирской области были собраны клещи близкородственного вида I. pavlovskyi, а на территории Хабаровского края - клещи Dermacentor silvarum, Haemaphysalis concinna и H. japónica.

ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae была обнаружена в 371 из 3867 исследованных образцов от клещей рода Ixodes. При последующем проведении 2-ого раунда ПЦР в присутствии видоспецифичных праймеров, а также посредством определения нуклеотидных последовательностей в 114 образцах была обнаружена ДНК А. phagocytophilum, в 234 образцах - ДНК Е. mûris, в 11 образцах - ДНК как А. phagocytophilum, так и Е. mûris и в 9 образцах - ДНК "Candidatos Neoehrlichia mikurensis" (Табл. 1). В трех клещах была выявлена ДНК бактерий, которые на основании анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК не могли быть отнесены ни к одному из известных родов семейства Anaplasmataceae.

В ходе проведения данной работы ДНК A. phagocytophilum и Е. mûris была обнаружена в клещах, собранных на всех исследованных

территориях, при этом доля клещей, содержащих ДНК A. phagocytophilum, варьировала от 0,2% до 6,3%, а доля клещей, содержащих ДНК Е. mûris -от 2,0% до 14,1% (Табл. 1), что соответствует литературным данным о распространении данных возбудителей в других частях ареала таежного клеща (Alekseev et al., 2001; Cao et al., 2003; Шпынов и др., 2004). Полученные результаты подтверждают предположение о повсеместном распространении A. phagocytophilum и Е. mûris в ареале I. persulcatus.

Таблица 1. Выявление ДНК бактерий семейства АпаркэпШасеае в клещах I. репикаПи /1. рт1о\^куч методом двухраундовой ПЦР

Мест и время сбора Клещей Число исследованных клещей Число (%) клещей, содержащих ДНК

A. phagocytophilum Е. mûris A. phagocytophilum и Е. mûris Candidates N. mikurensis Апар-lasma-taceae

Свердловская область (Северный Урал), 2004-2010 496 1 (0,2) 30 (6,0) 0 0 0

Свердловская область (Средний Урал), 2007-2008 145 5 (3,4) 11 (7,6) 1 (0,7) 0 0

Челябинская область, 2004 79 1(1.3) 5 (6.3) 0 0 0

Новосибирская область, 2003-2010 1688 38 (2,3) 29 (1,7) 1 (0,06) 6 (0,4) 2(0,1)

Иркутская область, 2006-2009 928 27 (2,9) 126(13,6) 5 (0,5) 1 (0.1) 0

Хабаровский край, 2006-2009 730 42 (5,8) 46 (6,3) 4 (0,5) 2 (0,3) 1 (0,1)

Всего 3867 114(2,9) 234 (6,1) 11(0,3) 9 (0.2) 3 (0,1)

В отличие от A. phagocytophilum и Е. mûris, данных о распространении "Candidates N. mikurensis" в клещах рода Ixodes очень мало. В ходе проведения данной работы ДНК "Candidates N. mikurensis" была обнаружена в девяти клещах, собранных на территории Новосибирской, Иркутской областей и Хабаровского края, однако частота выявляемости "Candidates N. mikurensis" ни в одной из областей не превышала 0,4% (Табл. 1). Можно предположить, что подобно A. phagocytophilum и Е. mûris, бактерии "Candidates N. mikurensis" распространены в различных частях ареала 1. persulcatus. Показано, что бактерии "Candidates N. mikurensis" способны вызывать возвратные лихорадки в Тяжелых формах (von Loewenich et al., 2010), поэтому выявление данного вида бактерий свидетельствует о возможном участии "Candidates N. mikurensis" в патогенезе инфекций, переносимых иксодовыми клещами, на территории

азиатской части России.

На наличие ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae были проанализированы образцы от 91 клеща Я. concinna, 380 Н. japónica и 221 D. silvarum, собранных на территории Хабаровского края на тех же участках, что и I. persulcatus. ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae были обнаружены в 2 (2,2%) Я. concinna, 37 (9,7%) Н. japónica и в 9 (4,1%) D. silvarum. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК показал, что выявленные в Я. japónica бактерии относятся к роду Ehrlichia, но не могут быть отнесены ни к одному из известных видов, а бактерии, выявленные в Я concinna и D. silvarum, не могут быть отнесены ни к одному из известных родов семейства Anaplasmataceae.

Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в мелких млекопитающих

На наличие ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae были также проанализированы образцы тканей и/или крови от 1698 мелких млекопитающих, отловленных в лесных биотопах на территории Свердловской, Новосибирской областей и Хабаровского края. ДНК как А. phagocytophilum, так и Е. muris была обнаружена в образцах от млекопитающих на территории всех исследованных областей (Табл. 2). На Северном Урале (Свердловская область) у 16,6% мелких млекопитающих была обнаружена ДНК A, phagocytophilum и у 7,0% - ДНК Е. muris. На территории остальных исследованных областей частота выявляемое™ А. phagocytophilum и Е. muris не превышала 3,9%. В пяти образцах от грызунов из Новосибирской области и Хабаровского края была выявлена ДНК "Candidatus Neoehrlichia mikurensis", а в ряде образцов от грызунов из Хабаровского края - ДНК нового генетического варианта эрлихий, названного Ehrlichia sp. Khabarovsk (Табл. 2). Проведение ПЦР в присутствии праймеров, специфичных для данного варианта, позволило выявить ДНК Ehrlichia sp. Khabarovsk в 171 (15%) образце от мелких млекопитающих в Хабаровском крае. Следует подчеркнуть, что, несмотря на высокий уровень инфицирования мелких млекопитающих бактериями Ehrlichia sp. Khabarovsk, данный генетический вариант бактерий не был обнаружен ни в одном из четырех видов иксодовых клещей, распространенных на исследуемой территории Хабаровского края.

Как A. phagocytophilum, так и Е. muris были выявлены среди представителей большинства исследованных видов, а именно в образцах от полевок рода Myodes и Microtus, обыкновенных бурозубок {Sorex araneus), восточноазиатских мышей (Apodemus peninsulae) и бурундуков (Tamias sibiricus) (Табл. 2). В отличие от A. phagocytophilum и Е. muris, для бактерий Ehrlichia sp. Khabarovsk характерна специфичность к определенным видам хозяев. Так, ДНК Ehrlichia sp. Khabarovsk была обнаружена в образцах тканей у 18-22% полевок и бурозубок, но лишь в 1

из 359 проанализированных образцов от восточно-азиатских мышей и не была обнаружена ни в одном из 18 образцов от бурундуков.

Таблица 2. Выявление ДНК бактерий семейства Апар1а5гпа1асеае методом двухраундовой ПЦР в образцах крови/тканей мелких млекопитающих

Область, вид животных Общее число особей Число (%) мелких млекопитающих, у которых была выявлена ДНК

A. phagocy-tophilum Е. muris Candidatus N.mikurensis Ehrlichia sp. Khabarovsk

Северный Урал (Свердловская область), всего 199 33 (16,6) 14(7,0)

Муос1е5 гиШия 99 23 (23,2) 9(9,1) - -

М. ги/осаню 7 1 (14,3) - -

М. я1агео1ш 37 4(10,1) , 2(5,4) - -

Богех агапеиз 48 5 (10,4) 2(4,2) - -

Богех зрр. 5 - - - -

МкгоЫя зрр. 3 - 1 (33,3) - -

Средний Урал (Свердловская область), всего 50 1 (2.0)

М. гиН1га 23 - - - -

М. ги/осапия 8. - - - -

Б. агапеж 16 1 (6,3).

Аройетиз а^апия 3 - - -

Новосибирская область, всего 307 10 (3,3) 12 (3,9) 1 (0,3) -

М. гиШив 53 4(7,5) 3 (5,7) - -

М. ги/осапш 66 4(6,1) ,. 5 (7,6) - -

М. %1агео1и$ 24 - - -

Б. агапеиБ 73 - 4(5,5) - -

М1сго1ш зрр. 38 .1 (2,6) - 1(2,6) . -

Ар. а^агш 11 - -

Лсг^Ля ЬеШИпа 36 - - - -

Тат1сн я&1гк:и$ 6 1(16,7) - - -

Хабаровский край, всего 1142 44(3,9) 43 (3,8) 4(0,4) 171 (15,0)

М. гиШш 14 1 (7,1) , - - 3 (21,4)

М. ги/осапия 695 36 (5,2) 31(4,5) 1 (0,1) 157(22,6)

Б. агамия 56 - - - 10(17,9),

Арос1ети5 репШиЬе 359 2 (0,6) 10 (2,8) 3 (0,8) 1 (0,3)

Т. ¡Шпсиз 18 5(27,8) 2(11,1) - -

Изучение сезонной динамики частоты встречаемости инфицированных эрлихиями и анаплазмами мелких млекопитающих на территории Хабаровского края

В Хабаровском крае отлов мелких млекопитающих проводили в течение 4 лет в период с февраля по ноябрь. За одним исключением, ДНК A. phagocytophilum, Е. muris и "Candidates N. mikurensis" была обнаружена только в образцах тканей животных, отловленных после начала периода активности иксодовых клещей - с апреля по ноябрь. Среди обнаруженных на Дальнем Востоке бактерий семейства Anaplasmataceae Ehrlichia sp. Khabarovsk является единственным видом, для которого не был установлен вероятный переносчик, и только ДНК Ehrlichia sp. Khabarovsk выявлялась в мелких млекопитающих в течение всего периода сбора материала - с февраля по ноябрь Эти результаты могут свидетельствовать о возможном участии других членистоногих, помимо иксодовых клещей, в переносе Ehrlichia sp. Khabarovsk позвоночным хозяевам.

Молекулярно-генетический анализ бактерий из семейства Anaplasmataceae

Выявленные в ходе выполнения данной работы бактерии из семейства Anaplasmataceae были охарактеризованы посредством анализа нуклеотидных последовательностей двух генетических локусов - гена 16S рРНК и groESL оперона белков теплового шока. Определенные нуклеотидные последовательности были зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами GU358686-GU358692, FJ966349-FJ966366, JN581367- JN581373, НМ366567-НМ366590 и HQ630614-HQ630620.

Изучение генетической вариабельности Е. muris и новых генетических вариантов Ehrlichia spp.

В ходе выполнения данной работы нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона Е. muris длиной соответственно 1299 и 1315 н.о. были определены для образцов от 16 клещей и 8 мелких млекопитающих, отловленных на территории различных областей. Все определенные последовательности фрагмента гена 16S рРНК были идентичны друг другу (Рис. 1) и совпадали либо отличались 1-2 нуклеотидными заменами от других известных последовательностей гена 16S рРНК Е. muris (Wen et al., 1995). Определенные нуклеотидные последовательности groESL оперона Е. muris различались между собой одной нуклеотидной заменой и отличались 1 -2 нуклеотидными заменами от единственной доступной в базе данных GenBank последовательности groESL оперона Е. muris (Kawahara et al., 1999) (Рис. 2).

Как было написано выше, в 37 клещах Я japonica была обнаружена ДНК нового генетического варианта эрлихий, названного Ehrlichia sp. Kh-Hj27. Из числа этих положительных образцов у 16 были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК и groESL

—,

riMkhh sp„ Tibet - A mkropmlt (AF414399) : EMkMa sp. EB»J2. Я. micrepJi (AF4?7J8I) г FMkhkt ip. Fcjbn - A mkrvfoh (DQ324547) j EMkkia jp.Elli224-Jt inW (AF3 119Я) Ehtlkhh jp. Tibet - Л trvnmm (AF311967) - Ehrlichia »p. IILAH17S (GU075695) _r £ ft«!« - еебмо, США (M7J221)

- £ amgii - cc&xa, США (Ш4М) - Ehrlichia ip. Q1727 (AY309970)

ts|J-fl'bia^ EH1M7(AY#»}!)

sail Е1ШТ (AYM»«)

■ CcraMew E vYeWBttms (AB0744SS) щ £ сЬфетЬ. чоовс*. США (U6CW76) Hjp—Ehrlichia ip. XS10I -okhv(AB454074) L£.<>xrfrtmu ■ Н)т*1.КхПЬ (AFI47752)

- ЕМШз sp. IIFJ« -1 oiunrt (АВ0Ш1) Ekrtkkha qJ. Амя. £ ewta (AB82IJt9) Dtrtkkh sp. Hl-2000 - /, <тлг (АШ60591) £WM4j ф. FN 147 . возс»п (AB196J03) I— Ehrlichiasp. UF-/.rkittts(DQ647}l$)

Ehrlichia ф, 360. /. pmttfom (АБЩ$64) p £ irarfj. Я./bmj, Японии (AB1J0009) £ иго • гршукы, Яяокк* (АВ19Ш2) £ mtrb (Xer-lptto) - Л ртяквш £ Mrii (Юк 155®) . ntitio, Xi6ipotac I— £ rmdmmhm • жормв, Afoxn (X624J2) иЧИЫИ sp. P-Ma. «ом, США (DQJ24J67) —EAHkkk jp. Kfab»nmkM2,1931 СЫШт N. bccfii (EF6M744) -CWidtod N. пмкипаи (ABI96J02) '—Л. тщШе (AF414S72)

■Л. Кли(ЯМШ21$)

/АзуоолуАЛш (M7J224)

Рис.1. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей (длиной 1297 н.о.) фрагмента гена 16S рРНК Anaplasmataceae, построенная с использованием метода NJ. Шкала представляет 1% дивергенции. Жирным шрифтом выделены последовательности образцов Е. muris от I. persulcatus (Nov-Ip205) и от полевки (Kh-1550), а также новых генетических вариантов эрлихий (Ehrlichia sp. Kh-Hj27 и Ehrlichiasp. Khabarovsk 362,1931).

Condidaiui E ovata (DQÓ72553)

1M

Si

1M

1M

104

Ehrlichia sp. IIF56S (AB0327I2) Ehrlichia sp. Aran (АБ032711) £ muris (Nov-IpI05) • l.pmulcatus E. muris (AF210459) e<'£muríí (KhISSO) - полевка —Ш/cAíesp.NSIOÍ (АВ4Я077) —E.chaff«mis(l№l7)

-Е.смй (V96731)

ww¿í/(AF195273) - Ehrlichia sp. Kh-llJ27

-Candidatos E shimnensii (AB074462) Ehrlichia sp. Kfaibanmk 1931

tPhrllrhb tn. I

^Ehrlichia »p. Khibirovik 362

-E, ruminanlium {U13638)

—CowMdotus N, mikwcnsis (ЛВ074461)

-Candidates N. lotoris (EF633745)

-А. marginóle(AFI6J8I2)

■Amplaima^, NS104 (AI3454078)

- A. phogocylophilum (AP172163) —A. plat)"? (AY0441 б I) -Anaplmma sp, NS1Q8 (AB454079)

ta

Рис.2. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей (длиной 1236 н.п.) фрагмента groESL оперона Anaplasmataceac, построенная с использованием метода NJ. Шкала представляет 5% дивергенции. Жирным шрифтом выделены последовательности образцов E.muris от I. persulcatus (Nov-Ip205) и от полевки (Kh-1550), а также новых генетических вариантов эрлихий (Ehrlichia sp. Kh-Hj27, Ehrlichiasp. Khabarovsk 362 и Ehrlichia.sp. Khabarovsk 1931).

оперона длиной соответственно 1295 и 1293 н.о. Все определенные последовательности гена 16S рРНК были идентичны друг другу и наиболее схожи с нуклеотидными последовательностями гена 16S рРНК генетических вариантов эрлихий (Ehrlichia sp. EHÍ669 и Ehrlichia sp. EH727), обнаруженных в клещах Haemaphysalis spp. в Японии (Inokuma et al., 2004), отличаясь от них соответственно двумя и семью нуклеотидными заменами (99,8% и 99,5% гомологии) (Рис. 1). Определенные в образцах от Н. japónica нуклеотидные последовательности groESL оперона также были идентичны друг другу, но существенно отличались от известных последовательностей Ehrlichia spp. Наибольшее сходство (93,8%

гомологии) было отмечено с последовательностью groESL оперона Е. ewingii, уровень гомологии с другими известными последовательностями Ehrlichia spp. не превышал 91,4% (Рис. 2). Таким образом, проведенный анализ нуклеотидных последовательностей по двум локусам показал, что выявленные в Н. japónica бактерии не могут быть отнесены ни к одному из известных видов и представляют собой новый генетический вариант эрлихий, филогенетически схожий с генетическими вариантами, обнаруженными в клещах Haemaphysalis spp. в Японии.

Для восьми образцов, представляющих еще один новый генетический вариант эрлихий, Ehrlichia sp. Khabarovsk, были также определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК и groESL оперона длиной 1300 н.о. и 1296 и.о., соответственно. Все определенные последовательности фрагмента гена 16S рРНК были идентичны друг другу и наиболее схожи (97,1% гомологии) с соответствующей последовательностью "Candidatus Ehrlichia shimanensis" (Рис. 1). Для семи образцов Ehrlichia sp. Khabarovsk последовательности groESL оперона также были идентичны друг другу (типичная последовательность Ehrlichia sp. Khabarovsk 362), а последовательность восьмого образца Ehrlichia sp. Khabarovsk 1931 отличалась от них инсерцией одного нуклеотида в межгеНной области оперона (Рис. 2). Нуклеотидные последовательности groESL оперона Ehrlichia sp. Khabarovsk также существенно отличались от известных последовательностей и были наиболее схожи (89,5% гомологии) с нуклеотидными последовательностями "Candidatus Ehrlichia ovata" и "Candidatus Е. shimanensis ". Таким образом, проведенный анализ последовательностей гена 16S рРНК и groESL оперона показал, что бактерии Ehrlichia sp. Khabarovsk не могут быть отнесены ни к одному из известных видов эрлихий (Рис. 1,2).

Филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей гена 16S рРНК, показывает, что большинство видов и гекетических вариантов эрлихий могут быть отнесены к одной общей группе внутри кластера, образованного бактериями рода Ehrlichia (Рис. 1). Из общепризнанных видов эрлихий только бактерии Е. ruminañtium не относятся к данному кластеру, образуя вместе с близкородственными бактериями Ehrlichia sp. P-Mtn отдельную ветвь на Дендрограмме. Вторая отдельная ветвь на филогенетическом дереве образована бактериями Ehrlichia sp. Khabarovsk.

Изучение генетической вариабельности "Candidatus Neoéhrlichia mikurensis"

Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона "Candidatus N. mikurensis" были определены для образцов от двух восточноазиатских мышей, отловленных на территории Хабаровского края и от четырех I. persulcatus, собранных на территории различных областей.

Все Определенные последовательности фрагмента гена 16S рРНК (1294 н.о.) и groESL оперона (1297 н.о.) были идентичны друг другу (Рис. 3).

д Nov-!p82 (А persulcatus, Новосибирск)

Kh-564 (грызуны, Хабаровск) ii^ КЬ-1р81 (/. persulcatus, Хабаровск) Япония, грызуны (АВ213021) Япоши, грызуны (ЛВ196305) Irk-Ip659 (А persulcatus, Иркутск) Германия, I. ricinus (EU810405)

_Германия, человек (Е1Г810404)

9»-Нидерланды, А ricinus (AFI046S0)

Швейцария, человек (GQ5Q1090)

Япоикя, грызуны (ЛВ084582)

«9

si|_tЯпония, грызуны (ABl96304)

Япония, 1. ovatia(ЛВ074460)

--Candidatitг N. lotoris (EF633744)

КитаЯ, rpuiyiiu (AY135531) Китай, грызуны (JIM439431) Китай, насекомоядные (GU227699)

«002

В

4t

Kb-Ip$l (1. persulcatus, Хабаровск) Jrk-Ip659 (/. persulcatus, Иркутск) Kh-564 (грызуны, Хабаровск) fiov-lp82 (/. pemtkalus, Новосибирск) —Шасндлрня, человек (HM045S24)

10«

аз

Германия, человек (EU810406) Германия, I. ricinus (HU810407) Германия, собака (EU432375) • Япония, Л ovotus (AU07446I)

-Япоши, грызуны (АВ0Ш83)

---——CamiUtatus N. lotoris (EF633745)

АО!

Рис. 3. Дендрограммы сходства нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 165 рРНК длиной 1299 н.о. (А) и groEL гена длиной 941 н.о. (В) "СатИйаШз N. гткигегшэ", построенные с использованием метода №. Жирным шрифтом выделены последовательности образцов, выявленные в I. рекикаШх (Коу-1р82, КЬ-1р81, 1гк-1р659) и в восточноазиатской мыши (КИ-564). В качестве внешней последовательности использована последовательность СапсИсЬ¡ш N. 1о1опз.

Проведенный филогенетический анализ по обоим локусам показывает территориальную кластеризацию последовательностей "СапШсЬш N.

mikurensis", которая, вероятно, ассоциирована с различными видами клещей переносчиков. Действительно, определенные в данной работе нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК "Candidatus N. mikurensis" из различных частей ареала I. persulcatus были идентичны друг другу и соответствующие последовательности изолятов "Candidatus N. mikurensis" из ареала I. ricinus (страны Европы) также были высококонсервативны (Рис. ЗА). Аналогично, нуклеотидные последовательности groESL оперона изолятов "Candidatus N. mikurensis" из России и Германии были высококонсервативны и образовывали отдельные кластеры на дендрограмме (Рис. ЗВ). Напротив, для изолятов "Candidatus N. mikurensis" из Японии и Китая была показана высокая вариабельность по обоим локусам, что, вероятно, связано с участием разных видов иксодовых клещей в переносе данного инфекционного агента мелким млекопитающим.

Изучение генетической вариабельности нетипичных бактерий семейства Anaplasmataceae

В 14 образцах от иксодовых клещей разных видов - двух I. persulcatus /1, pavlovskyi из Новосибирской области, а также от одного I. persulcatus, двух Я. concinna и девяти D. silvarum из Хабаровского края была обнаружена ДНК нетипичных бактерий из семейства Anaplasmataceae. Ни для одного из этих 14 образцов не удалось амплифицировать фрагмент groESL оперона. И только для двух образцов из D. silvarum (Kh-Ds37, Kh-Dsl95) и для одного образца из клеща Ixodes sp. из Новосибирской области (Nov-Ipl9) удалось определить последовательность гена 16S рРНК длиной 1270-1301 н.о. У остальных образцов были определены только нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК длиной 456-553 н.о.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК образцов Kh-Ds37, Kh-Dsl95 и Nov-Ipl9 показал, что эти последовательности наиболее схожи (92,4-93,8% гомологии) с соответствующей последовательностью бактерии из семейства Anaplasmataceae IS 136 (GenBank AB 190771) из Японии; уровень гомологии с другими известными последовательностями гена 16S рРНК не превышал 92%. Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК длиной 456 н.о. от всех выявленных нетипичных бактерий показал, что все эти образцы принадлежат к семейству Anaplasmataceae, но не могут быть отнесены к родам Ehrlichia, Anaplasma, или к кластеру "Candidatus Neoehrlichia". Всего в 14 образцах было выявлено 11 различных вариантов нуклеотидных последовательностей, которые образуют гетерогенную группу (с уровнем гомологии внутри группы 92,9 - 100%) и не формируют отдельный кластер на дендрограмме (Рис. 4).

Изучение генетической вариабельности A. phagocytophilum

В ходе проведения данной работы нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона А. phagocytophilum были определены в

образцах от 65 клещей /. persulcatus /1. pavlovskyi, а также от 25 мелких млекопитающих, относящихся к Myodes spp., S. araneus и Tamias sibiricus, собранных на территории различных областей.

fEF

A. piatys (ЛВ0Ш7) -Л. bovis (?) 169957) vi. phagocytophdum (М 73224) A. ovil (AY262124)

marginale (AF414872) centrate (EF5206S9)

rA. oví) ~7>{j—А. п »«lí. сеп

i—С а lirCc

J?—

Candidatos N. loioris (EF633744) Candidatos N. mikurcmis (EU801405)

Candidatos N. mikurenjis (ЛВ084582) F.. nminantlim (X62432) г-Е, ewingii (U96436)

-£ maris (ABl 96302)

«¡|r£ chaffetnslt (U60476)

-E. cants (M73221)

-Kh-Dil9S (Л silvarum, Хаб»ровск)

im

rNov-lp!9 {Ixodes ipp., Новосибирск) »^-Nov-Ipl94 {Ixodes »pp., Новосибирск) ——Kh-D*57 (Л slUurum, Хабаровск)

Kh-!pS9 {/, prrsukatut, Хабаровск)

,Kh-D»97 {D. silvarum, Хабаровск)

ii»>Kb-Di98 (D. silvarum, Хабаровск) ■ Kh«Hc68 {iL canclnm, Хабаровск)

-Anaplasmitaccac IS 13 б (AB 190771)

i?jKb-Hc85 (#. cominna, Хабаровск)

Kh«D»l (D. silvarum, Хабаровск) i,Kh-Di37 (O. silvarum, Хабаровск) 'КЫМ8 (A silvarum, Хабаровск) % |, Kh-DiI82 {D, silvarum, Хабаровск) u'Kh-DiU8 (Л silvarum, Хабаровск) НЫЫкЫаpiplentls (AFI79630) --Rickettsia rickettsil (Uli 021)

Рис. 4. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей (длиной 456 и.о.) фрагмента гена 16S рРНК бактерий Anaplasmataceae, построенная с использованием метода NJ. Жирным шрифтом выделены последовательности образцов, выявленные в I. persulcatus (Nov-Ipl9, Nov-Ipl94, Kh-Ip89), H. concitma (Kh-Hc68, Kh-Hc85) и D. silvarum (Kh-Dsl, Kh-Ds37, Kh-Ds38, Kh-Ds57, Kh-Ds97, Kh-Ds98, Kh-Dsl 18, Kh-Dsl82, Kh-Dsl95). В качестве внешней последовательности использована последовательность Rickettsia rickettsil

Всего было выявлено 6 различных вариантов последовательности гена 16Б рРНК, различающихся между собой 1-5 нуклеотидными заменами (Табл. 3), но только вариант 1 соответствовал последовательности, доступной в базе данных ОепВапк(номер доступа АР093788) и выявленной в крови больных людей (СЬае & а1., 2000). Этот вариант был обнаружен в 17 образцах А. phagocytophilum от клещей из различных областей и в 11 образцах от Муос1ез эрр. из Новосибирской области и Хабаровского края. В 43 образцах А. phagocytophilum от клещей из всех исследованных областей и в 4 образцах от бурундуков из Новосибирской области и Хабаровского края (вариант 4) нуклеотидные последовательности гена 168 рРНК были наиболее схожи с последовательностью генетического варианта А. phagocytophilum (СепВапк 00342324), выявленного ранее только на территории Китая в 1. регяикаШ и мелких млекопитающих (Сао еЛ а1., 2006). Варианты 2 и 3 отличались единичными заменами в консервативной области гена от соответствующих последовательностей варианта 1, а варианты 5 и 6 -от соответствующих последовательностей варианта 4.

Таблица 3. Конденсированное выравнивание нуклеотидных последовательностей гена 16Б рРНК А. phagocytophilum

Генетичес- Типичные для каждого Вариабельные позиции нуклеотидов* кие вариан- варианта образцы,

ты по гену 16Б рРНК последовательности из базы данных ОепВапк 32 33 36 178 395 1013 1039 1172

ОепВапк АР093788 А А А А С Т о С

1 вариант Ыоу-1р456а №^-уо1е144ь А А А А С Т й С

2 вариант 1гк-1р 625 а А А А А Т т о С

3 вариант 8У-У01е8ь А А А А С с о С

ОепВапк 0(3342324 в в в А С т А С

4 вариант КЫр 801 КЬ-сЫртипк177с в в О А С т О С

5 вариант 1гк-1р 662а в в в О С т О С

6 вариант 854 а в в в А С т о Т

* по последовательности гена 168 рРНК А. р^осуЮрЫЫт (ОепВапк АР093788) а - образцы от клещей,ь- образцы от полевок,с- образцы от бурундуков

Определенные в ходе выполнения данной работы последовательности $гоЕБЬ оперона А. phagocytophilum отличались более высоким разнообразием по сравнению с последовательностями гена 168 рРНК. Всего было выявлено десять различных вариантов последовательностей groESL оперона, которые с высоким уровнем поддержки могут быть отнесены к трем различным группам (Рис. 5). Уровень гомологии между

последовательностями groESL оперона из разных групп составил 94,898,3%, а внутри групп - 99,7-100%. Образцы из разных групп различались также по последовательностям гена 16S рРНК (Табл. 4).

А. phagocytophilum из группы I были обнаружены в образцах от 19 клещей из всех исследованных областей и от 11 полевок из Новосибирской области и Хабаровского края. Все определенные последовательности были идентичны друг другу и наиболее схожи (98,2% гомологии) с соответствующей последовательностью^, phagocytophilum из рыжей полевки из Швейцарии (GenBank AF192796), уровень гомологии с другими известными последовательностями groESL оперона не превышал 95,5%.

А. phagocytophilum из группы II были обнаружены только в образцах от полевок и бурозубок из Свердловской области. Все определенные последовательности groESL оперона также были идентичны друг другу и наиболее схожи с соответствующей последовательностью А. phagocytophilum из рыжей полевки (GenBank AFI 92796), отличаясь от нее 3 из 1246 нуклеотидных остатков (99,8% гомологии); уровень гомологии с другими последовательностями Л. phagocytophilum не превышал 95,4%.

А. phagocytophilum из группы III были обнаружены в образцах от 46 клещей из всех исследованных областей и 4 бурундуков из Новосибирской области и Хабаровского края. В отличие от первых двух групп, третья группа последовательностей groESL оперона была гетерогенной и объединяла 8 вариантов последовательностей. Эти последовательности различались между собой 1-4 нуклеотидными заменами и были схожи (99,2-99,4% гомологии) с нуклеотидными последовательностями groESL оперона ряда изолятов А. phagocytophilum, выявленных в Европе в образцах от клещей 1. ricinus и косуль. (Petrovec et al., 2002; von Loewenich et al., 2003).

В ряде работ было показано, что подавляющее большинство последовательностей groESL оперона А. phagocytophilum подразделяются на два кластера, при этом к первому кластеру относятся последовательности от различных видов клещей и позвоночных хозяев, а также от больных людей, а ко второму - только от косуль и I. ricinus (Alberti et al., 20Ö5; Rymaszewska, 2008). Среди определенных в ходе выполнения данной работы последовательностей groESL оперона не было обнаружено последовательностей, относящихся к первому кластеру. В то же время последовательности groESL оперона из группы III, выявленные у большинства Образцов А. phagocytophilum от клещей и у всех образцов от бурундуков, относились ко второму кластеру, образуя в нем отдельную ветвь (Рис. 5). Последовательности groESL оперона А. phagocytophilum из групп I и И, выявленные во всех исследованных образцах от полевок и бурозубок и в ряде образцов от клещей, не могут быть отнесены ни к одному из ранее описанных кластеров и с высоким уровнем поддержки

образуют вместе с единственной известной последовательностью groESL оперона A. phagocytophilum от мелких грызунов в Европе (Liz et al., 2000) новый кластер на филогенетическом дереве (Рис. 5).

Nov-lp364 (I. pcrsulcatus, Новосибирск) 1 -Nov-Ip355(/. persulcatm, Новосибирск) Nov4hipmunkl322(6) рундук, Новосибирск) Irk-Jp662 (/. pcrsulcatus, Иркутск) -Kh-Ipl60 ('• pcrsulcatus, Хабаровск) Irk-Ip820 (/. pcrsulcatus, Иркутск) Irk-Ip776(/. ptrsulcaius, Иркутск)

Л

Хабаровск) абаровск)

Косул»; Австрия (\Y220469) ./. ricinus, Германия (AY2S1820) i г Косуля, Чехия (AY22CM68) М—Косуля, Швейцарка (AF383225) «Косуля, Словения (AF478560)

-Косуля, Швейцария (AF383227)

•и—Овца, Норвегия (AF54S386) "ПОлень, Словения (AF478563) гЧ '—Человек, Словения (AF033101) Ч. ricinus, Германия (AY281828) Человек, США (AF172I63) Человек, США (U9672S) /. pacißais, США (AFI73989) -Лошадь, США (AFI72158) -Кои. Албания (AY279095)

J

3 •3

г-Sv-voteS (полевиц Новосибирск)}Группа П Ч1олезм, Швейцария (AF192796) jNov-Ip456 (/. pcrsulcatus, Новосибирск)) j *ло\-ло1е144 (полевка, Новосибирск) '

Рис.5. Дендрограмма сходства нуклеотидных последовательностей (длиной 1245 н.о.) фрагмента groESL оперона А. phagocytophilum, построенная с использованием метода N1. Шкала представляет 0,5% дивергенции. Жирным шрифтом выделены последовательности образцов А. phagocytophilum от I. ретйсашх (>1оу-1р456, Иоу-1р355, №уу-1р364, 1гк-1р662, 1гк-1р776, 1гк-1р820, КМр7, КМр144, КЫр160), полевок (!Чоу-уо1е144, 8у-уо1е8) и бурундуков (№у-сЫртипк1322 и К1> сЫртипк177), представляющие различные генетические варианты.

В данной работе ДНК А. phagocytophilum была обнаружена в 33 из 199 (16,6%) исследованных мелких млекопитающих и только в одном из 496 имаго I. рекиЫсЛт, собранных в одном и том же районе Северного Урала. Представляется вероятным, что клещи I. регзи1са1т не являются эффективными переносчиками для генетического варианта

А. phagocytophilum, типичного для мелких млекопитающих на Северном Урале, и что другие виды иксодовых клещей могут участвовать в переносе данного генетического варианта мелким млекопитающим.

Таблица 4. Встречаемость различных вариантов А. рка^осуЮрЫЫт в клещах и мелких млекопитающих на территории различных областей

Группы Вари- Типичные Число образцов с различными вариаитами А.

по анты образцы для 01га£0су10рЫ1ит

по каждого клещи полевки, полевки, бурун-

оперо- гену варианта Сверд Ново- Ир- Хаба- бурозуб- Новоси- дуки

ну 168 ловск си- кутск ровск ки, бирск,

рРНК бирск Сверд- Хаба-

ловск ровск

I 1 Моу-Гр45б 2 7 5 3 - 11 -

Моу-уо1е144

I 2 1гк-1р 625 - - 2 - - - -

II 3 8у-уо1е8 - - - - 10 -

III 4 1\[о\'-1р364 - 12 6 25 - - 4

КЬ-сЫр-

типк177

III 5 1гк-1р662 - - 1 - - - -

III 6 Эу-1р854 2 - - - - - -

Таким образом, на территории азиатской части России были выявлены три генетические группы А. phagocytophilum, одна из которых ассоциирована с полевками из Сибири и Дальнего Востока, другая с полевками и бурозубками с Урала и третья с бурундуками. Специфичный переносчик для генетического варианта А. phagocytophilum, выявленного в мелких млекопитающих на Урале, к настоящему времени не установлен.

Выявление антител к возбудителям ГАЧ и МЭЧ в крови пациентов на территории Новосибирской области.

Выявление на территории азиатской части России и, в частности, на территории Новосибирской области в клещах и мелких млекопитающих возбудителя ГАЧ А. phagocytophilum и других представителей семейства Апар^эпШасеае свидетельствует о потенциальной опасности развития эрлихИозов у людей вследствии присасывания инфицированных клещей.

На наличие антител к возбудителям ГАЧ и МЭЧ были исследованы методом ИФА парные сыворотки крови 205 пациентов с лихорадочным состоянием и присасыванием клещей в анамнезе, госпитализированных в 2007 г. с подозрением на КЭ, а также сыворотки 92 клинически здоровых людей контрольной группы, отрицающих присасывание клещей за последние три года. Работа проводилась с одобрения этического комитета института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

(протокол № 3). В группе лихорадящих больных антитела к возбудителям ГАЧ и МЭЧ были обнаружены у 12 пациентов, а в контрольной группе -только у одного пациента. У трех из двенадцати серопозитивных пациентов наблюдалась сероконверсия антител к возбудителю ГАЧ, у одного пациента - возрастающий в восемь раз титр антител в парных сыворотках, а у остальных восьми пациентов титры антител были постоянными или различались в 2 раза. В соответствии с принятыми критериями (Brouqui et al., 2004) лишь у первых четырех пациентов диагноз ГАЧ являлся серологически подтвержденным.

Во всех рассмотренных случаях у пациентов с серологически подтвержденным ГАЧ в острой фазе болезни наблюдались изменения в гематограмме (лейкопения, тромбоцитопения), характерные для данного заболевания. При этом показатели крови в течение 8 дней приходили в норму. У трех из четырех пациентов наблюдалась острая лихорадка с температурой выше 39,0°С, у одного пациента была отмечена сыпь и повышенный уровень аминотрансфераз. Титры антител класса IgG достигали показателей 1:800 - 1:1600, а титры антител класса IgM были существенно ниже (1:200). Во всех рассмотренных случаях ГАЧ протекал в виде смешанной инфекции: у одного пациента наблюдалась сероконверсия антител к возбудителям ГАЧ и МЭЧ, у одного пациента был диагностирован КЭ и обнаружены антитела к боррелиям, и у двух пациентов были обнаружены антитела к боррелиям.

В отличие от пациентов с серологически подтвержденным ГАЧ, лишь у 2 из 8 пациентов с постоянными титрами антител наблюдалась лейкопения; незначительная тромбоцитопения наблюдалась у 4 из 8 пациентов. Полученные результаты подтверждают данные из различных регионов о высоком уровне серопозитивности (Afanasieva et al., 2006; Борисов и др., 2010). Можно предположить, что наличие постоянного титра антител обусловлено более ранним контактом с возбудителем ГАЧ либо с непатогенным для людей генетическим вариантом А. phagocytophilum.

Таким образом, около 2% случаев острых лихорадочных состояний, возникающих после присасывания клеща, могут быть верифицированы как случаи ГАЧ и/или МЭЧ.

ВЫВОДЫ

1. В результате комплексного изучения распространения бактерий из семейства Anaplasmataceae на территории азиатской части России в иксодовых клещах и мелких млекопитающих была выявлена ДНК Anaplasma phagocytophilum, "Candidates Neoehrlichia mikurensis", Ehrlichia muris, двух новых генетических вариантов Ehrlichia spp., а также нетипичных бактерий, которые не могут быть отнесены ни к одному из

родов семейства Anaplasmataceae.

2. Показано, что возбудитель гранулоцитарного анаплазмоза человека A. phagocytophilum распространен в клещах Ixodes persulcatus /Ixodes pavlovskyi и в различных видах мелких млекопитающих на территории всех исследуемых областей. На основании анализа последовательностей groESL оперона и гена 16S рРНК образцы A. phagocytophilum подразделяются на три генетические группы, которые различаются также по тропизму к позвоночным хозяевам. Бактерии A. phagocytophilum из первой группы выявлялись в клещах Ixodes spp. и в полевках на территории Сибири и Дальнего Востока, A. phagocytophilum из второй группы - только в полевках и бурозубках на территории Урала, а А. phagocytophilum из третьей группы - в клещах Ixodes spp. во всех исследованных областях и в бурундуках на территории Сибири и Дальнего Востока. Показано, что образцы A. phagocytophilum из первой и второй группы образуют новый филогенетический кластер, ассоциированный с мелкими млекопитающими.

3. Показано, что патогенные для людей бактерии "Candidatus Neoehrlichia mikurensis" распространены в клещах Ixodes persulcatus /Ixodes pavlovskyi и в мелких млекопитающих на территории Сибири и Дальнего Востока, однако частота выявляемое™ не превышает 0,5%. Впервые показано, что образцы "Candidatus Neoehrlichia mikurensis", выявленные в ареале Ixodes persulcatus, строго консервативны по гену 16S рРНК и groESL оперону и кластеризуются по groESL оперону отдельно от изолятов "Candidatus Neoehrlichia mikurensis" из других стран Европы и Азии.

4. Показано, что прёдполагаемый возбудитель моноцитарного эрлихиоза человека Ehrlichia mûris распространен в клещах Ixodes persulcatus /Ixodes pavlovskyi и в различных видах мелких млекопитающих на территории всех исследуемых областей и является высококонсервативным на основании анализа последовательностей гена 16S рРНК и groESL оперона.

5. Два новых генетических варианта Ehrlichia spp. обнаружены на территории Хабаровского края - Ehrlichia sp. Kh-Hj27 в клещах Haemaphysalis japónica и Ehrlichia sp. Khabarovsk в образцах печени/селезенки мелких млекопитающих. Бактерии Ehrlichia sp. Kh-Hj27 филогенетически схожи с генетическим вариантом эрлихий, выявленном в клещах Haemaphysalis spp. в Японии, а бактерии Ehrlichia sp. Khabarovsk существенно отличаются от других известных генетических вариантов и видов эрлихий. В отличие of A. phagocytophilum и Е. mûris, бактерии Ehrlichia sp. Khabarovsk выявлялись в образцах от животных, отловленных до начала периода активности клещей.

6. В клещах Ixodes spp., Dermacentor silvarum и Haemaphysalis concinna

на территории Хабаровского края и Новосибирской области обнаружена ДНК нетипичных бактерий из семейства Anaplasmataceae, которые не могут быть отнесены ни к одному из родов данного семейства. Эти бактерии существенно отличаются друг от друга по последовательностям гена 16S рРНК и не образуют отдельную генетическую группу.

-7. Показано, что на территории Новосибирской области около 2% случаев острых лихорадочных состояний у людей, возникающих после присасывания клеща, могут быть верифицированы. -как! случаи гранулоцитарного анаплазмоза и/или моноцитарного эрлихиоза на основании наблюдающейся сероконверсии антител к возбудителям данных инфекций. ,...;:■

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Rar V.A., Fomenko N.V., Dobrotvorsky А.К., Livanova N.N., Rudakova S.A., Fedorov E.G., Astanin V.B., Morozova O.V. Tickborne pathogen detection, Western Siberia, Russia // Emerging Infectious Diseases. -2005,- V.ll.-P. 1708-1715.

2. Ливанова H.H., Pap B.A., Ливанов С.Г., Иголкина Я.П.. Разнообразие паразитарных систем с участием мелких млекопитающих и Ixodes persulcatus Shculze на Северном Урале // Сибирский экологический журнал. - 2005. - №6. - С. 1079-1084.

3. Pap В.А., Ливанова Н.Н., Панов В.В., Астанин В.Б., Ливанов С.Г., Морозова О.В. Изучение генетического разнообразия анаплазм и эрлихий в паразитарных системах юга Западной Сибири и Урала // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Том 5. - Приложение 1. - С. 116-120.

4. Pap В.А., Пуховская Н.М., Высочина Н. П., Зайнулина З.У., Гуляко Л.Ф., Иванов Л.И.. Распространение и генетическое разнообразие эрлихий и анаплазм в таежных клещах и мелких млекопитающих на территории Хабаровского края // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -.2007. - №3 (Приложение). - С. 156-159.

5. Фоменко Н.В., Pap В.А., Епихина Т.И., Мельникова О.В., Черноусова Н.Я.. Выявление антител к Borrelia burgdorferi sensu lato и Anaplasma phagocytophilum у больных госпитализированных с диагнозом клещевой энцефалит // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - №3 (Приложение).-С. 177-180.

6. Rar V.A., Livanova N.N., Panov V.V., Kozlova I.V., Pukhovskaya N.M., Vysochina N.P., Tkachev S.E., Ivanov L.I. Prevalence of Anaplasma and Ehrlichia species in Ixodes persulcatus ticks and small mammals from different regions of Asian part of Russia // International Journal of Medical Microbiology. - 2008. - V. 298 - Supplement 1.- P. 222-230.

7. Tkachev S.E., Fomenko N.V., Rar V.A., Igolkina Y.P., Kazakova Y.V., Chernousova N.Y. Molecular-genetic analysis of tick-transmitted pathogens

revealed in patients of Novosibirsk region, Russia // International Journal of Medical Microbiology.-2008. - V. 298S1. - P. 365-367.

8. Pap B.A., Фоменко H.B., Мельникова O.B., Черноусова Н.Я. Выявление антител к возбудителям гранулоцитарного анаплазмоза и моноцитарного эрлихиоза человека в крови пациентов из Новосибирской области // Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - Том 7. - Приложение 1.-С. 73-77.

9. Ливанова Н.Н., Ливанов С.Г., Pap В.А., Ткачев С.Е. Зоологические предпосылки существования на Северном Урале инфекций человека, передающихся иксодовыми клещами // Национальные приоритеты России! -2009. - Спец. выпуск. №2. - С. 53-55.

10. Rar V.A., Livanova N.N., Panov V.V. , Doroschenko E.K., Pukhovskaia N.M., Vysochina N.P., Ivanov L.I. Genetic diversity of Anaplasma and Ehrlichia in Asian part of Russia // Ticks and Tick-borne Diseases - 2010 -V.l. - P. 57-65.

11. Pap B.A., Епихина Т.И, Ливанова Н.Н., Панов В.В., Дорощенко Е. К, Пуховская Н.М., Высочина Н.П., Иванов Л.И. Изучение гетерогенности гена 16S рРНК и groESL оперона в образцах ДНК Anaplasma phagocytophilит, Ehrlichia muris и "Candidates Neoehrlichia mikurensis", выявленных в таежных клещах на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология - 2011 -№2. - С.17-23.

12. Rar V.A., Epikhina T.I., Livanova N.N., Panov V.V. , Doroschenko E.K., Pukhovskaia N.M., Vysochina N.P., Ivanov L.I. Genetic variability of Anaplasma phagocytophilum in Ixodes persulcatus ticks and small mammals in the Asian part of Russia // Vector-Borne and Zoonotic Diseases - 2011 - V 11.-P. 1013-1021.

Подписано к печати 21 ноября 2011г. Тираж 150 экз. Заказ № 372. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рар, Вера Александровна, Новосибирск

61 12-3/403

Министерство Образования и Науки Учреждение Российской Академии Наук Институт Химической Биологии и Фундаментальной Медицины

На правах рукописи

Pap Вера Александровна

Вариабельность переносимых иксодовыми клещами бактерий семейства Anaplasmataceae на территории азиатской части России

03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель акад. РАН В.В. Власов

Новосибирск 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Общая характеристика эрлихиозов и их инфекционных агентов 9

1.1.1. История изучения эрлихиозов 9

1.1.2. Систематика представителей семейства Anaplasmataceae. 11 1.1.3 Морфология эрлихий и анаплазм 15

1.1.4. Структура генома 16

1.1.5. Клиника, лечение 2 О

1.1.6. Диагностика 22

1.1.7. Эпидемиология 23

1.2. Молекулярно-генетическая характеристика отдельных

представителей семейства Anaplasmataceae 25

1.2.1. Характеристика бактерий рода Anaplasma 25

1.2.1.1. Anaplasmaphagocytophilum 26

1.2.1.1.1. Специфичные переносчики A. phagocytophilum 26

1.2.1.1.2. Резервуарные хозяева A. phagocytophilum на территории США 27

1.2.1.1.3. Резервуарные хозяева A. phagocytophilum на территории Евразии 29

1.2.1.1.4. Генетическая вариабельность A. phagocytophilum 32

1.2.1.2. Внутриэритроцитарные анаплазмы 3 8

1.2.1.3. Anaplasma bovis 40

1.2.1.4. Anaplasmaplatys 41

1.2.2. Характеристика бактерий рода Ehrlichia 41

1.2.2.1. Ehrlichia chaffeensis 41

1.2.2.1.1. Распространение Ehrlichia chaffeensis в природных очагах 41

1.2.2.1.2. Генетическая вариабельность Е. chaffeensis 42

1.2.2.2. Ehrlichia canis 44

1.2.2.3. Ehrlichia ewingii 45 1.2.2Л. Ehrlichia mûris 46

1.2.2.5. Ehrlichia ruminantium 47

1.2.2.6. Новые генетические варианты эрлихий 48 1.2.3. Характеристика бактерий "Candidatus Neoehrlichia spp." 49

1.2.3.1. "Candidatus Neoehrlichia mikurensis" 49

1.2.3.2. "CandidatusNeoehrlichialotoris" 51

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53

2.1. Материалы 53

2.2. Буферы и основные растворы 53

2.3. Медико-биологические образцы 54

2.3.1. Иксодовые клещи 5 4

2.3.2. Образцы крови и тканей мелких млекопитающих 55

2.3.3. Образцы крови больных 55

2.4. Выделение ДНК 56 2.4.1. Выделение ДНК из иксодовых клещей 56

2.4.2. Выделение ДНК из образцов крови 56

2.4.3. Выделение ДНК из образцов ткани 57

2.5. Выявление ДНК бактерий из семейства Anaplasmataceae методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) 57

2.5.1. Синтетические олигонуклеотиды 57

2.5.2. Постановка ПЦР 57

2.5.3. Электрофоретическая детекция продуктов ПЦР 59

2.5.4. Определения нуклеотидных последовательностей 59

2.5.5. Анализ нуклеотидных последовательностей 60

2.5.6. Номера доступа использованных в работе

нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank 60

2.6. Проведение иммуноферментного анализа 61

2.7. Проведение статистического анализа 61 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 62

3.1. Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в иксодовых

клещах 62

3.1.2. Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в клещах рода Ixodes 63 3.1.2. Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в клещах

Haemaphysalis spp. и Dermacentor silvarum на территории Хабаровского края 68

3.2. Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в мелких млекопитающих 69

3.3. Выявление ДНК эрлихий и анаплазм в личинках и нимфах, снятых с

мелких млекопитающих 74

3.4. Изучение сезонной динамики частоты встречаемости инфицированных эрлихиями и анаплазмами мелких млекопитающих на территории Хабаровского края 74

3.5. Молекулярно-генетический анализ бактерий из семейства Anaplasmataceae 77

3.5.1. Изучение генетической вариабельности Е. mûris и новых генетических вариантов Ehrlichia spp. 79

3.5.2. Изучение генетической вариабельности "Candidatus N. mikurensis" 84

3.5.3. Изучение генетической вариабельности нетипичных бакетерий

семейства Anaplasmataceae 86

3.5.4. Изучение генетической вариабельности A. phagocytophilum 90

3.6. Выявление аетител к возбудителям ГАЧ и МЭЧ в крови пациентов

на территории Новосибирской области. 97

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 102

ВЫВОДЫ 105

ЛИТЕРАТУРА 107

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

а.о. - аминокислотный остаток

ед. акт. - единицы активности

ИФА - иммуноферментный анализ

ИКБ - иксодовые клещевые боррелиозы

ГАЧ - гранулоцитарный анаплазмоз человека

кДа - кил о дальтон

КЭ - клещевой энцефалит

МИКБ №1 - муниципальная инфекционная клиническая больница №1

МЭЧ - моноцитарный эрлихиоз человека

н.о. - нуклеотидный остаток

ННЦ - Новосибирский научный центр

н.п. - нуклеотидная пара

ПЦР - полимеразная цепная реакция

рРНК - рибосомальная РНК

РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции

Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан

ЭДТА - этилендиамин N,N,N',N'-TeTpayKcycHafl кислота

ACT - аспартатаминотрансфераза

ALT - аланинаминотрансфераза

Big Dye™ddNTP- флуоресцентно меченые Big Dye™ дидезоксинуклеозид-5'-трифосфаты dNTP - дезоксинуклеозид 5'-трифосфат IgM - иммуноглобулины класса М IgG - иммуноглобулины класса G

ME - метод минимальной эволюции (Minimum Evolution) NJ - метод объединения ближайших соседей (Neighbor-Joining) PLT - тромбоциты (platelet)

Taq ДНК-полимераза - ДНК-полимераза, выделенная из Thermus aquaticus

UPMGA - метод невзвешенного попарного среднего (Unweighted Pair Group Method with

Arithmetic mean)

WBC - лейкоциты (white blood cells)

ВВЕДЕНИЕ

Иксодовые клещи являются переносчиками не только возбудителей клещевого энцефалита (КЭ) и иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ), но и возбудителей так называемых вновь возникших инфекций (emergence infections), наиболее типичными и хорошо изученными представителями которых являются эрлихиозы. К эрлихиозам относят природно-очаговые инфекции, вызываемые бактериями семейства Anaplasmataceae. Эрлихиозы известны с начала 20 века как заболевания различных видов домашних животных, наносящие серьезный вред сельскому хозяйству, однако широкий интерес к изучению данных заболеваний возник после обнаружения среди представителей семейства Anaplasmataceae патогенных для людей видов. В настоящее время известно 5 видов семейства Anaplasmataceae, вызывающих эрлихиоз человека - Neorickettsia sennetsu, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii и Ehrlichia canis. Кроме того, инфекцию у людей способны вызвать бактерии кандидатного вида "Candidatus Neoehrlichia mikurensis". За исключением бактерий N. sennetsu, передаваемых алиментарным путем при употреблении инфицированной трематодами рыбы, остальные возбудители эрлихиозов человека передаются в результате присасывания инфицированных иксодовых клещей.

Подавляющее большинство случаев эрлихиозов (несколько тысяч) зарегистрировано в США, при этом доля летальных исходов составляет 1-3%. В Европе отмечены десятки случаев заболеваний, вызванных A. phagocytophilum и единичные случаи заболеваний, вызванных "Candidatus N. mikurensis" (Strie, 2004; Thomas et al., 2009; von Loewenich et al., 2010). В России первый случай гранулоцитарного анаплазмоза был отмечен в 2000 г. на Дальнем Востоке (Сидельников и др., 2003), позднее серологически подтвержденные случаи заболевания были отмечены в различных областях - на Алтае, в Новосибирской, Иркутской и Пермской областях (Афанасьева и др., 2006; Рудаков и др., 2006; Борисов и др., 2010).

Жизненный цикл эрлихий и анаплазм включает стадии размножения в служащих специфичными переносчиками иксодовых клещах и в являющихся резервуарными хозяевами позвоночных животных (Parola et al, 2005). Таежный клещ Ixodes persulcatus является основным видом иксодовых клещей, обитающим

в таежных, лесных и лесостепных зонах России от Прибалтики до Тихого океана. Ранее на территории различных областей России в таежных клещах молекулярными методами были выявлены три вида из семейства Anaplasmataceae -A. phagocytophilum, Ehrlichia muris и, в единичных случаях, "Candidatus N. mikurensis" (Шпынов и др., 2004; Eremeeva et al., 2006; Нефедова и др., 2008).

К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных изучению распространения, видовой и внутривидовой вариабельности эрлихий и анаплазм, циркулирующих на территории США, Европы, Китая, Кореи и Японии, а также установлению их резерву арных хозяев. Показана высокая генетическая вариабельность A. phagocytophilum и установлено, что различные генетические линии A. phagocytophilum могут существенно различаться по специфичности к различным видам хозяев и по патогенности для человека. Однако, несмотря на ряд исследований, изучающих распространение эрлихий и анаплазм в клещах I. persulcatus на территории России (Телфорд III и др., 2002; Шпынов и др., 2004; Eremeeva et al. 2006), распространение бактерий семейства Anaplasmataceae в различных видах позвоночных хозяев, а также в различных видах клещей не было изучено. Генетическая гетерогенность А. phagocytophilum и других представителей семейства Anaplasmataceae, распространенных на территории России, также практически не изучена.

Цель работы. Целью настоящей работы являлось проведение молекулярно-генетического анализа представителей семейства Anaplasmataceae, выявленных в клещах и мелких млекопитающих на территории азиатской части России.

Задачи исследования

1. Изучить распространение и видовое разнообразие бактерий из семейства Anaplasmataceae в иксодовых клещах и мелких млекопитающих на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока.

2. Провести молекулярно-генетический анализ выявленных бактерий из семейства Anaplasmataceae на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и groESL оперона.

3. Изучить возможность участия возбудителей гранулоцитарного анаплазмоза и моноцитарного эрлихиоза человека в патогенезе переносимых клещами инфекций на территории Новосибирской области.

Научная новизна

Было впервые проведено комплексное исследование распространения и генетического разнообразия бактерий семейства Anaplasmataceae в иксодовых клещах и мелких млекопитающих на территории азиатской части России. Было показано, что возбудитель гранулоцитарного анаплазмоза человека Anaplasma phagocytophilum, моноцитарные эрлихии Ehrlichia mûris и, в единичных случаях, патогенные для людей бактерии "Candidatus Neoehrlichia mikurensis" распространены в различных частях ареала таежного клеща. Было показано, что выявленные в разных регионах образцы Е. mûris и "Candidatus N. mikurensis" строго консервативны по гену 16S рРНК и groESL оперону, при этом образцы "Candidatus N. mikurensis" отличаются по groESL оперону от изолятов "Candidatus N. mikurensis" из других стран Европы и Азии. Было показано, что выявленные образцы A. phagocytophilum вариабельны по гену 16S рРНК и groESL оперону и подразделяются на три генетические группы. Выявленные в бурундуках образцы A. phagocytophilum из третьей группы на основании сравнения нуклеотидных последовательностей groESL оперона филогенетически схожи с европейскими изолятами A. phagocytophilum, а выявленные в полевках и бурозубках образцы A. phagocytophilum из первой и второй группы образуют новый кластер.

На территории Хабаровского края в клещах Haemaphysalis spp. и в мелких млекопитающих были обнаружены два новых генетических варианта Ehrlichia spp., которые на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и groESL оперона не могут быть отнесены ни к одному из известных видов. Кроме того, на территории Хабаровского края и Новосибирской области в клещах Dermacentor silvarum, Haemaphysalis concinna и Ixodes spp. была обнаружена ДНК одиннадцати различных генетических вариантов бактерий из семейства Anaplasmataceae, которые на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК не могут быть отнесены ни к одному из известных родов в семействе.

Практическая значимость

В результате проведения данной работы было показано, что в различных частях ареала таежного клеща на территории азиатской части России в клещах и

мелких млекопитающих распространены два патогенных для людей представителя семейства Anaplasmataceae - A. phagocytophilum и "Candidatus N. mikurensis", что свидетельствует о возможном участии данных возбудителей в патогенезе переносимых клещами инфекций на территории исследуемых областей. Было показано, что на территории Новосибирской области около 2% случаев острых лихорадочных состояний у пациентов, возникающих после присасывания клеща, могут быть верифицированы как случаи гранулоцитарного анаплазмоза и/или моноцитарного эрлихиоза на основании наблюдающейся сероконверсии антител к возбудителям данных инфекций. При этом в большинстве случаев гранулоцитарный анаплазмоз протекал в виде смешанной инфекции с иксодовым клещевым боррелиозом или клещевым энцефалитом.

Апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 12 статей. Результаты работы были представлены на трех российских и двух международных конференциях:

«Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI

j

веке», Томск, 2006; 3 International Conference "Basic Science for Medicine", Новосибирск, 2007; Научная конференция с международным участием «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии», Иркутск, 2007; 4-я Межрегиональная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы неврологии и инфекционных болезней», Новосибирск, 2008; X International Jena Symposium on Tick-borne Diseases, Weimar (Germany), 19-21 марта 2009 г.,

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 10 рисунков и 15 таблиц. Библиография включает 190 литературных источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика эрлихиозов и их инфекционных агентов

1.1.1. История изучения эрлихиозов

К эрлихиозам относят природно-очаговые инфекции, вызываемые бактериями семейства Anaplasmataceae. Эрлихиозы домашних животных известны с начала прошлого века, однако широкий интерес к изучению представителей данного семейства возник после обнаружения в семействе Anaplasmataceae патогенных для человека видов.

История изучения инфекционных агентов эрлихиозов насчитывает более 100 лет. В 1910 г. Тейлером впервые был описан переносимый иксодовыми клещами внутриэритроцитарный возбудитель анаплазмоза крупного рогатого скота -Anaplasma marginale. Впоследствии были установлены другие переносимые клещами размножающиеся в лейкоцитах инфекционные агенты крупного рогатого скота - Cowdria ruminantium (теперь Ehrlichia ruminantium) и Е. phagocytophila. Были также установлены возбудители эрлихиозов лошадей (Е. equi) и собак (Е. ewingii, Е. platys, Е. canis) (Rikihisa et al., 1991; Anderson et al., 1992, Skotarczak, 2003).

В настоящее время известно 5 видов семейства Anaplasmataceae, вызывающих эрлихиоз человека. В 1953 г. из крови больных людей были впервые изолированы эрлихии - Е. sennetsu (теперь Neorickettsia sennetsu). Вызываемый данным возбудителем эндемичный для юго-западной части Японии эрлихиоз известен с конца 19 века и по клиническим симптомам напоминает инфекционный мононуклеоз. Эрлихиоз, обусловленный N. sennetsu, связан с употреблением зараженной моллюсками сырой рыбы (Rikihisa, 1991).

Первый случай переносимого клещами моноцитарного эрлихиоза человека (МЭЧ) был отмечен в 1986 г. в США; диагноз был поставлен по наличию внутрицитоплазматических включений в моноцитах тяжело больного человека (Dawson et al., 1991). Первоначально предполагали, что инфекционным агентом данного заболевания является Е. canis. В 1991 г. был изолирован инфекционный агент этого заболевания, названный Ehrlichia chaffeensis, и на основании анализа гена 16S рРНК было продемонстрировано отличие Е. chaffeensis от известных видов эрлихий (Anderson et al., 1991). Специфичным переносчиком для Е.

chaffeensis являются клещи Amblyomma americanum. До настоящего времени практически все случаи МЭЧ (несколько тысяч), отмечены на территории США (Thomas et al., 2009).

В 1994 г. в США был впервые отмечен случай гранулоцитарного анаплазмоза человека (ГАЧ) (Chen et al., 1994). Инфекционный агент данного заболевания, инфицирующий преимущественно нейтрофилы, был первоначально назван «HGE-agent» (human granulocytic ehrlichia agent). Впоследствии на основании филогенетического анализа патогенный для человека «HGE-agent» был объединен в один вид с возбудителями эрлихиозов крупного рогатого скота и лошадей -Ehrlichia phagocytophila и Ehrlichia equi. Объединенный вид был отнесен к роду Anaplasma и назван Anaplasmaphagocytophilum (Dumler et al., 2001). К настоящему времени в США было установлено более трех тысяч подтвержденных случаев ГАЧ. В Европе первый случай ГАЧ был отмечен в Словении (Petrovec et al., 1997), впоследствии серологически подтвержденные случаи ГАЧ были отмечены в большинстве европейских стран (Lotric-Furlan et al., 1998).

Еще один патогенный для людей вид эрлихий, Ehrlichia ewingii, был впервые описан в 1992 г., как этиологический агент гранулоцитарного эрлихиоза собак (Anderson et al., 1992). В 1999 г. ретроспективно у больных людей в США было установлено четыре случая инфекции, вызванной размножающимися в гранулоцитарных лейкоцитах Е. ewingii (Buller et al., 1999). До настоящего времени известно лишь несколько десятков случаев эрлихиозов у людей, вызванные Е. ewingii, и все они были выявлены на территории США (Thomas et al., 2009).

Моноцитарные эрлихии Е. canis, филогенетически схожие с Е. chaffeensis и Е. ewingii, хорошо известны как возбудители эрлихиоза собак. В 1996 г. впервые был изолирован штамм Е. canis из крови человека с бессимптомной персестирующей инфекцией в Венесуэле. Впоследствии в 2002 г. Е. canis были обнаружены у 6 из 20 пациентов из Венесуэлы, госпитализированых с острой лихорадкой (Perez et al., 1996, Perez et al., 2006).

Кроме того, в 2010 году были получены первые свидетельства патогенности для людей бактерий "Candidatus Neoehrlichia mikurensis", которые образует отдельный филогенетический кластер в семействе Anaplasmataceae (Kawahara et al., 2004). "Candidatus N. mikurensis" распространены в различных частях Евразии и

переносятся клещами рода Ixodes. ДНК этого возбудителя была обнаружена в образцах крови 4 лихорадящих больных из Европы (Fehr et al., 2010; von Loewenich e