Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вирусов москитных лихорадок и создание тест-систем для диагностики этих инфекций

Клименко, Ирина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вирусов москитных лихорадок и создание тест-систем для диагностики этих инфекций
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вирусов москитных лихорадок и создание тест-систем для диагностики этих инфекций"

На правах рукописи

КЛИМЕНКО ИРИНА СЕРГЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ МОСКИТНЫХ ЛИХОРАДОК И СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭТИХ ИНФЕКЦИЙ

03.00.06 - вирусология 03.00.03. - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 о ДЕК 2009

Москва, 2009

003488824

Работа выполнена в ГУНИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Бутенко Александр Михайлович доктор биологических наук Гребенникова Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Погодина Ванда Вацлавовна доктор медицинских наук, профессор Баринский Игорь Феликсович

Ведущая организация:

ФГУН стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича

Защита состоится «_» декабря 2009 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного

Совета Д.001.020.01 при ГУНИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУНИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Автореферат разослан «_» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

Е.И.Бурцева

ВВЕДЕНИЕ

Группа вирусов москитных лихорадок (MJ1) (род Phlebovirus семейство Bunyaviridaé) в настоящее время насчитывает 52 вируса, 27 из которых объединены в 9 антигенных комплексов: Bujaru, Candiru, Chilibre, Frijoles, неаполитанской москитной лихорадки, Punta Того, лихорадки долины Рифт, Salehabad и сицилийской москитной лихорадки. Имеющиеся данные по антигенной классификации остальных 25 флебовирусов недостаточно полно характеризуют их таксономическое положение в пределах группы. Сведения по генотипированию многих флебовирусов также весьма ограничены.

Прототипные штаммы флебовирусов были выделены в разные годы в Бразилии, Панаме, Колумбии, США, Италии, Греции, Иране, Кении, Судане, и Центрально-Африканской республике. Информация об истории выделения пяти вирусов (Armero, Ditrania, Ixacanal, Mariquita, Odrinisrou), включая данные об источниках выделения, в доступной литературе отсутствует. Источниками выделения оригинальных штаммов других флебовирусов были москиты, больные острыми лихорадочными заболеваниями, грызуны, другие млекопитающие и комары.

Значение флебовирусов в патологии человека установлено для 14 из 52 представителей этой группы: 8 из них распространены в Бразилии, 2 - в Панаме, 3 - в странах Средиземноморья, Средней Азии и, возможно, в Закавказье, на юге Европейской части России, на Украине и Молдавии (Гайдамович, 1989). В 1986 и 1987гг. сотрудниками НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН из крови больных советских военнослужащих, дислоцированных в Афганистане, были выделены три штамма вируса неаполитанской москитной лихорадки (НМЛ) и два штамма вируса сицилийской москитной лихорадки (СМЛ).

Наибольшее медицинское значение имеют неаполитанская МЛ, сицилийская МЛ, лихорадка Тоскана, а также южно-американские МЛ - Аленквер, Кандиру, Пунта Topo, Чагрес и другие, встречающиеся в Бразилии и Панаме.

Ареал СМЛ и НМЛ охватывает регион Средиземноморья (европейские и африканские страны), республики Средней Азии, Иран и Афганистан.

Заболевания лихорадкой Тоскана регистрируются в Италии, Испании, Португалии, на юге Франции, Словении, Греции, на Кипре и в Турции.

В публикациях отечественных и зарубежных авторов при описании географического распространения вспышек и эпидемий МЛ на территории бывшего СССР упоминаются республики Закавказья, Средней Азии (Туркмения, Таджикистан, юг Киргизии), Украина (Крым) и Молдавия [С.Я.Гайдамович, 1989; R.B.Tesh et al., 1976]. Между тем, проведенный нами анализ более ранней информации позволил восстановить и прояснить ситуацию с заболеваемостью москитными лихорадками в южном регионе Европейской части бывшего СССР в первой половине XX века. В 1923 г. крупная эпидемическая вспышка МЛ наблюдалась в Севастополе и Бахчисарае, в 1928 и 1929 г.г. случаи заболевания регистрировались в Армавире, в 1933г. - в Феодосии. В 1934 г большая вспышка имела место в Новороссийске. В 1935 г. в г. Георгиевске и близлежащих населенных пунктах было зарегистрировано 1375 больных. В 1935 г. в районе г.Новороссийска эпидемия МЛ охватила более 5000 человек. Помимо приведенной информации, имеются сведения об эпидемических вспышках «лихорадки паппатачи» в послевоенные годы в Дагестане и других административных территориях Северного Кавказа. В настоящее время какие-либо данные об этих инфекциях в южном регионе отсутствуют, что объясняется, возможно, резким снижением активности природных очагов, а также недоступностью тест-систем для специфической диагностики МЛ в практических региональных лабораториях.

Актуальность настоящих исследований определяется: широким географическим распространением и высокой активностью циркуляции вирусов москитных лихорадок на эндемичных территориях; выраженной патогенностью для человека; отсутствием

диагностических тест-систем, доступных для использования в практических лабораториях и этиотропных средств лечения москитных лихорадок; отсутствием достаточной информации по молекулярно-генетической идентификации "афганских" штаммов вирусов МЛ и близкородственных вирусов, которая имеет прямое отношение к пониманию процессов эволюции рода Phlebovinis.

Цель и задачи исследования

Цель исследования:

Проведение филогенетического анализа малоизученных штаммов вирусов МЛ, выделенных на территории Афганистана, и создание лабораторных вариантов ОТ-ПЦР и иммуноферментных тест-систем для мониторинга циркуляции вирусов МЛ и диагностики вызываемых ими инфекций.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи: S разработать лабораторный вариант ОТ-ПЦР для выявления геномной РНК вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана, отработать условия проведения реакции, определить чувствительность и специфичность метода; S секвенировать фрагменты генома афганских штаммов вирусов МЛ и провести

филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей; S создать и охарактеризовать компоненты ИФА-тест-систем, предназначенных для выявления антител класса М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также их антигенов;

провести обследование сывороток здоровых жителей южных областей России и больных острыми лихорадочными заболеваниями неясной этиологии с целью апробации ИФА-тест-систем для определения антител класса М и G, выявления циркуляции вирусов МЛ в этих регионах и изучения их возможной роли в краевой патологии;

исследовать противовирусную активность коммерческого препарата "рибавирин" и ряда экспериментальных химических соединений (452, 467, dRSata, R sata, Ci-Ara-А, dR-SK-452, Det-Ага-А, OH-Ara-A, Ome-Ara-A) в отношении вирусов МЛ на модели вируса Тоскана в опытах in vitro.

Научная новизна работы

Впервые определено систематическое положение внутри рода трех афганских штаммов (Аф-1008, Аф-83 и Аф-1028) вирусов москитных лихорадок на основе анализа нуклеотидной последовательности участков двух сегментов (S и М) вирусного генома.

Впервые за последние 20 лет проведено серологическое обследование жителей южного региона России. Всего исследовано 1140 сывороток практически здоровых доноров и больных неясными лихорадочными заболеваниями. Согласно полученным результатам, на территории Астраханской области и Краснодарского края установлена циркуляция вирусов НМЛ и СМЛ. В Астраханской области выявлен серологически подтвержденный случай заболевания сицилийской москитной лихорадкой. У жителя Краснодарского края обнаружены IgG антитела к вирусу НМЛ.

В опытах in vitro было проведено изучение противовирусной активности препарата «рибавирин» на модели вируса Тоскана. Показано, что исследуемый препарат оказывает выраженное противовирусное действие в отношении этого вируса.

Практическая ценность работы

Создан лабораторный вариант группоспецифичной ОТ-ПЦР тест-системы для выявления РНК малого сегмента S генома вирусов МЛ. Чувствительность тест-системы составила 0,4 БОЕ/мл.

Созданы и охарактеризованы специфичные компоненты ИФА-тест-систем для выявления специфических антител М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также их

антигенов. Техническая документация на эти системы утверждена Учёным Советом НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 11 мая 2009г.

Исследована противовирусная активность зарубежного (производство Швейцария) и отечественного препарата «рибавирин» на модели вируса Тоскана. Показано, что исследуемый препарат подавляет цитопатическое действие этого вируса в культуре клеток Vero Е6. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 2,75 ^ЦПД.ад при максимальной концентрации препарата (500 мкг/мл). В то же время испытанные производиые рибавирина (dRsata, Rsata) и другие экспериментальные химические соединения (452, 467) в отношении вируса Тоскана подобным действием не обладали. Большая часть их оказалась цитотоксичной для клеток Vero Е6.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Сравнительный анализ первичных нуклеотидных последовательностей участков генов, кодирующих белки N и Gn показал, что штамм Аф-1008 принадлежит к серокомплексу НМЛ, а наиболее близким к нему является индийский штамм вируса НМЛ Р-7101795.

2. Выделенные в Афганистане штаммы Аф-1028 и Аф-83 являются представителями серокомплекса СМЛ. Наиболее близким им оказался штамм вируса СМЛ Р-701735, выделенный в Индии.

3. Создан н охарактеризован лабораторный вариант ОТ-ПЦР-тест-системы для детекции РНК вирусов МЛ.

4. Разработаны и охарактеризованы специфические компоненты ИФА тест-систем для обнаружения антител класса М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также антигенов этих вирусов.

5. Данные обследования сывороток крови здоровых доноров и лихорадящих больных южного региона России на антитела IgM и IgG к вирусам москитных лихорадок указывают на низкий уровень активности очагов этих инфекций на юге Краснодарского края и Астраханской области. Однако обнаружение положительных находок позволяет констатировать факт циркуляции вирусов НМЛ и СМЛ на данных территориях, что определяет целесообразность проведения дальнейших исследований.

6. Показано, что рибавирин эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса Тоскана в культуре клеток Vero Е6. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 2,75 lgljnflso при максимальной концентрации препарата 500 мкг/мл.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании Ученого Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН 30 сентября 2009 г., и представлены на Международной конференции молодых ученых и специалистов «Биотехнология: разработка и контроль препаратов - 2009», Киев, 23 - 26 сентября 2009 г., на IX международном конгрессе « Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 27 - 30 ноября 2008г. и на Международной конференции EUROMEDLAB Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, Innsbruck, 7-11 июня 2009.

Публикации

По результатам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и тезисы 3 докладов в сборниках международных конференций.

Объем и структура диссертация

Материалы диссертации изложены на 103 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (120 источников), содержит 14 таблиц и 13 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы. В качестве исследуемого материала были использованы штаммы, выделенные от больных в Афганистане (Аф-1008, Аф-1028, Аф-83), и прототипные штаммы вирусов НМЛ, СМЛ, Тоскана. Для контроля специфичности созданных при выполнении диссертации ОТ-ПЦР и ИФА-тест-систем использовали также вирусы: Тягиня, Инко (Bunyaviridae, Orthobunyavirus), ККГЛ (Bunyaviridae, Nairovims), Бужару, Каримабад, Чагрес, Тегеран (Bunyaviridae, Phlebovirus), Исфаган (Rhabdoviridae, Vesiculovirus), Гета, Синдбис (Togaviridae, Alphavirus), Кемерово (Reoviridae, Orbivirus), желтой лихорадки, Денге, Западного Нила, клещевого энцефалита (Flaviviridae, Flavivirus).

Сахарозо-ацетоновые антигены, полученных из мозга инфицированных новорожденных белых мышей, иммунные асцитические жидкости к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также нормальные иммунные асцитические жидкости получали с использованием общепринятых методов.

В процессе работы были приготовлены и использованы иммуноглобулины IgG к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, и пероксидазные конъюгаты на основе поликлональных антител.

В ИФА-IgM и ИФА-IgO на антитела к вирусам НМЛ и СМЛ были обследованы 134 сыворотки крови практически здоровых доноров и 1140 сывороток больных острыми лихорадочными заболеваниями из Южного региона России.

Препарат "рибавирин" и экспериментальные химические соединения (452, 467, dRSata, R sata, Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A) были синтезированы в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН [И.Д.Константинова и др.] и любезно предоставлены профессором Г.А.Галеговым (лаборатория противовирусных препаратов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН).

Культуры клеток. В исследовании использовали перевиваемые клеточные культуры почек африканских зеленых мартышек (Vera Е6), почек сирийского хомяка (ВНК-21), почек обезьян макак резусов (LLC-МКг), а также культуры клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ).

Непрямой метод флуоресцирующих антител (Методические рекомендации. Под ред. Д.К.Львова, 1995). Зараженную культуру клеток Vero Е6, выращенную на предметных стеклах, фиксировали в охлажденном ацетоне. На фиксированные клетки наносили ИАЖ или сыворотки, содержащие исследуемые антитела, и инкубировали при 37°С во влажной камере в течение 30 мин. После отмывки на препараты наносили меченные ФИТЦ антивидовые (против глобулинов мыши или человека) антитела IgM или IgG. Спустя 30 мин. оценивали интенсивность флюоресценции, просматривая препараты в микроскопе "Axioskop" в водно-иммерсионном объективе. Для доказательства специфичности флюоресценции выполняли следующие контрольные исследования: 1) обработку специфической ИАЖ неинфицированных клеток; 2) обработку гетерологичной ИАЖ клеток, инфицированных вирусом.

Метод бляшкообраздвания. Реакцию проводили в 6-луночных планшетах (фирма "Costar"). Для заражения монослоя клеток Vero Е6 использовали вируссодержащую суспензию на среде Игла. Клетки инкубировали с вирусом в течение часа при 37°С и 5% содержании СОг, периодически покачивая планшеты. Затем в каждую лунку добавляли среды следующего состава: среда Игла с 1% бычьей сывороткой, 2% дрожжевой экстракт, 1,5% агар и 0,03% нейтрального красного. В качестве контроля использовали

незараженные клеточные культуры. Число бляшек подсчитывали, начиная с пятого дня после заражения в течение 4 дней.

Выделение и коиъюгирование специфических IgG с пероксидазой хрена. Из типоспецифических мышиных ИАЖ методом аффинной хроматографии на колонке 7x1 см с протеин-А-сефарозой Ch-4B (Pharmacia) выделяли фракцию иммуноглобулинов G (Chenais F. et al., 1977). Полученный глобулин использовался в качестве подложки для адсорбции антигена на твердой фазе в реакции ИФА, а также для конъюгирования с ферментом пероксидазой (Sigma тип VI-A, активность 25000 ед.) методом периодатного окисления по P.Nakane (1974). Готовили раствор, содержащий пероксидазу хрена RZ=3,0 в концентрации 4 мг/мл и 0,02М NaIC>4. Полученный раствор диализовали против 0,001М натрий-ацетатного буфера рН=4,4 в течение 12-14 часов, после чего добавляли натрий-карбонатный буфер рН=9,5 до конечной концентрации 0,004М и IgG в концентрации 2 мг/мл. Реакционную смесь инкубировали 2 часа при комнатной температуре, непрерывно перемешивая. После этого в реакционную смесь добавляли свежеприготовленный раствор NaBH4 до концентрации 0,4 мг/мл, инкубировали 2 часа при 4°С, непрерывно перемешивая. Полученный конъюгат очищали на колонке 1,6x35 см с сефадексом G-200, собирая фракции, относящиеся к первому пику. Для стабилизации конъюгата добавляли бычий сывороточный альбумин до концентрации 1%, а для предотвращения бактериального загрязнения мертиолят (0,02%) или глицерин (50%).

Иммуноферментный анализ. Оценку активности и специфичности полученных антигенов, глобулинов и конъюгатов, а также выявление вирусных антигенов и антител к ним в исследуемом материале проводили иммуноферментным анализом (ИФА). Состав буферных, рабочих и промывающих растворов был общепринятым (Н.А.Лаврова, О.В.Наволокин, 1986). В случае выявления вирусных антигенов в лунки 96-луночных панелей сорбировали мышиные поликлональные иммуноглобулины G против вирусов МЛ (НМЛ, СМЛ и Тоскана), разведенные в 0,05М карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) с рН 9,6 (в выбранном рабочем разведении). Затем вносили мозговые антигены, разведенные в фосфатном буфере (1:200), а после инкубации - мышиные поликлональные антитела против указанных выше вирусов, меченные пероксидазой хрена.

Определение IgG непрямым ИФА (Meegan and LeDuc, 1989) проводили в лунках полистироловых планшетов с сорбированными поликлональными мышиными антителами IgG к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана (в рабочем разведении) в КББ. Остальные реагенты вносили в следующей последовательности: блокирующий раствор 1% бычьего сывороточного альбумина, специфичные вирусные (НМЛ, СМЛ или Тоскана) антигены в разведении 1:200, обследуемые сыворотки (начальное разведение 1:50) и мышиные антитела против иммуноглобулинов IgG человека, меченные пероксидазой хрена (НИИ иммунологии РАН, г.Москва) в рабочем разведении.

Определение IgM антител проводили методом MAC-ELISA (Calisher, 1986). В лунках планшета сорбировали козьи антитела IgG (производство фирмы Sigma, США), против ц-цепи иммуноглобулина человека в рабочем разведении 1:600. Обследуемые сыворотки (начальное разведение 1:50), антигены вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана (в разведении 1:100) и мышиные поликлональные антитела против этих вирусов, меченные пероксидазой хрена, вносили последовательно.

На каждом из этапов постановки ИФА реакционная смесь инкубировалась 1 час при температуре 37°С, а после тщательно промывалась 0,01 М фосфатно-буферным раствором (ФБР) рН 7,4 с добавлением 0,15 М NaCl и 0,05% твина-20.

Субстрат-индикаторной системой служил раствор тетраметилбензидина с 0,006% перекиси водорода Н2О2. Реакцию останавливали 2N раствором серной кислоты. Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП) при длине волны 450нм. В каждом опыте использовали гетерологичные или нормальные контрольные антигены. Реакцию считали положительной, если отношение экстинкции опытных и контрольных образцов составляло не менее 3,0 (при ОП450 не ниже 0,3 для опытных

образцов и не выше 0,1 в отрицательном контроле).

Реакция связывания комплемента. РСК ставили микрометодом на холоду по общепринятой методике (Методические рекомендации. Под ред. Д.К.Львова, 1995).. Тестируемые ИАЖ в разведении 1:10 прогревали при 56°С в течение 30 минут. Рабочее разведение антигена определяли по предварительному шахматному титрованию с ИАЖ к вирусам МЛ. Ингредиенты разливали в лунки в следующих объемах и последовательности: 0,025 мл ИАЖ, 0,025мл антигена в рабочем разведении, содержащим 4-8 антигенных единиц, 0,05мл комплемента (2 ед.). Панели встряхивали для перемешивания компонентов и оставляли при 4°С на 18 часов. Затем во все лунки добавляли по 0,05 мл гемолитической системы. После встряхивания панели инкубировали при 37°С. Учет реакции проводили после полного гемолиза в контрольных лунках с 2 единицами комплемента по 4-х крестовой системе.

Проведение ОТ-ПЦР и секвенирование. Выделение вирусной РНК проводили из 10% мозговых суспензий новорожденных белых беспородных мышей с использованием «Тризола» (Trizol Reagent, Gibco BRL, Life Technologies, США) по методике производителя, а также неорганическим сорбентом (силика, "Sigma", США) в присутствии раствора гуанидинтиоционата. Мозговые суспензии получали из мозга инфицированных двухдневных мышей-сосунков.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности S- и М-сегментов генома вирусов МЛ, представленные в базе данных NCB1 GenBank, были выровнены с помощью алгоритма CLUSTAL W программы MegAline из пакета программ Lasergene v.6 ("Lasergen Inc.", США). Праймеры конструировали в соответствии с требованиями к специфическим олигонуклеотидам. С помощью программы Amplify 1.0 ("Accelrys Inc.", США) праймеры тестировали на отсутствие внутри- и межпраймерной гомологии. (Табл. 1).

Таблица 1

Праймеры, использованные для проведения ОТ-ПЦР фрагментов S-сегмента генома вирусов москитных лихорадок

Праймер Нуклеотидная последовательность (5' - 3') Длина амплифицируемого участка(н.о.) Тт

Праймеры к участку S сегмента вирусов москитных лихорадок

Unique F S GCGAAGCTAGGGTGCATCAT 379 57

Unique R_S TTTGCTTACCAGGGGTTTGA

Праймеры к участку М сегмента вирусов сицилийской серогруппы

MS 196 F ATGAAGAGATTGGATGGAG 359 65

MS 555 R GTATTGAGTGGTCCAGTAAGATTG

Праймеры к участку М сегмента вирусов неаполитанской серогруппы

SFN MF 351 ATTGGATGGACTGAGCGTGAA 202 57

SFN MR 553 TAGACAAGCCTCTGATCCTAT

ОТ-ПЦР на матрице РНК вирусов MJI проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл нуклеиновых кислот, по 10 пмоль каждого праймера, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 25 ед. MMLV-ревертазы, 20 ед. ингибитора РНКаз, 10 мМ Tris-HCl (рН=9,0), 50 мМ KCl, 0,1% Triton Х-100, 1,5 мМ MgCI2.

Условия амплификации были следующими: 50° - 30 мин, 94° - 5 мин и 35 циклов

амплификации: 94° - 30 сек, температура отжига лраймера - 30 сек, 72° - 30 сек.

Реакцию проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия).

Анализ фрагментов ДНК после ПЦР проводили методом электрофореза в агарозном геле (2%). Гели фотографировали и анализировали, используя трансиллюминатор, в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.

Праймеры для секвенирования были те же, что и для ОТ-ПЦР. Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера с использованием набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Великобритания) согласно инструкции производителя. Электрофорез ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе ABl PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Япония).

Филогенетический анализ. Полученные после секвенирования последовательности участков малого и среднего сегментов генома малоизученных штаммов МЛ использовались в модуле BLAST программы MegAline из пакета программ Lasergene v.6 (Lasergene, США) для поиска гомологичных последовательностей в базе данных GenBank. Построение филогенетической дендрограммы осуществляли на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М.Кимуры в программе MEGA 3.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Культивирование и серологическая идентификация штаммов вирусов МЛ

Для исследований использованы штаммы вирусов МЛ (НМЛ: штаммы Sabin, Аф-1008; СМЛ: штаммы Аф-83, Аф-1028; Тоскана (штамм ISS PHL 3), Каримабад (R-12928)), хранившихся в коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов в течение 15 лет. Пассирование вирусов проводили на н.б.м. Мозг заболевших животных с ясно выраженной типичной клинической картиной, использовали в качестве вируссодержащего материала.

Антигенную идентификацию штаммов проводили методом флюоресцирующих антител (МФА) с использованием гомологичных ИАЖ и гетерологичной ИАЖ к вирусу клещевого энцефалита в качестве контроля. Культуру клеток Vero Е6, выращенную на покровных стеклах, заражали мозговой суспензией. Специфическая флюоресценция выявлялась в препаратах, содержащих антиген штамма Аф-1008 и обработанных гомологичной ИАЖ. В препаратах, обработанных гетерологичной ИАЖ к вирусу КЭ, свечение отсутствовало (Рис.1). Аналогичные результаты были получены также со всеми другими использованными штаммами вирусов МЛ.

1а. Специфическая флюоресценция в культуре клеток Vero Е6, зараженной вирусом НМЛ (штамм Аф-1008) после обработки гомологичной ИАЖ.

Рис. 1. Идентификация штамма Аф-1008 вируса

16. Контроль. Культура клеток Vero Е6, зараженной вирусом НМЛ (штамм Аф-1008) после обработки ИАЖ к вирусу КЭ.

непрямым методом флюоресцирующих антител

Выбор чувствительной клеточной культуры

Для выбора оптимальной клеточной системы проводили заражение ряда перевиваемых культур (Vero Е6, ВНК-21, LLC-МКг и СПЭВ) прототипными штаммами вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана. О наличии репликации вирусной РНК судили по наличию ЦПД и флуоресцентному сигналу.

Результаты исследований показали, что наиболее чувствительной является клеточная культура Vero Е6. Репродукция вирусов СМЛ и Тоскана в этой культуре сопровождается выраженным цитопатическим действием (Рис.2).

МшжяФШ»

Рис.2. Цитопатогенное действие вируса Тоскана в культуре клеток Vero Е6. А -клеточный монослой, зараженный вируссодержащей мозговой суспензией в разведении 103, Б - отрицательный контроль (незараженный клеточный монослой).

Вирус НМЛ в культуре Vero Е6 размножался, что подтверждалось свечением цитоплазмы зараженных клеток во флуоресцентном анализе, но ЦПД не вызывал.

Клеточные линии LLC-МКг и СПЭВ для работы оказались не пригодны. Ни репликации, ни ЦПД мы не наблюдали в случае заражения указанными вирусами этих клеточных линий. Выраженное ЦПД (4+) в культуре клеток ВНК-21 наблюдали при заражении вирусом СМЛ. Титр вируса при этом достигал 6,5 ^ЦПД5о в мл.

Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК малого сегмента S вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана.

При подборе праймеров использовали нуклеотидные последовательности малого сегмента генома штаммов вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана, размещенные в банке данных GenBank. После проведения сравнительного компьютерного анализа последовательностей между собой были выбраны наиболее консервативные участки гена нуклеопротеина N. К ним были подобраны специфические олигонуклеотиды для проведения ОТ-ПЦР, фланкирующие участок длиной 379 н.о. (Рис.3).

NSs N 3'

Unique F S Utiique R S

379H.O.

Рис.3. Схематичное изображение посадки праймеров, подобранных для детекции и секвенирования фрагмента малого сегмента генома вирусов МЛ методом ОТ-ПЦР. Стрелками обозначены направления олигонуклеотидных праймеров, использованных в работе.

Для оценки специфичности реакции был использован прототиппый штамм вируса НМЛ (Sabin), а также вируссодержащие суспензии, полученные из мозга новорожденных белых мышей, инфицированных вирусами семейства Bunyaviridae: Тягиня, Инко

(Bunyaviridae, Orthobunyavirus), Бужару, Чагрес, Тегеран (Bunyaviridae, Phlebovirus), так и других семейств: Исфаган (Rhabdoviridae, Vesiculovirus), Гета, Синдбис (Togaviridae, Alphavirus), Кемерово (Reoviridae, Orbivirus), вирус желтой лихорадки (штамм Дакар), Деиге II, Западного Нила (Flaviviridae, Flavivirus). Положительные результаты были получены с вирусами НМЛ, Бужару и Чагрес, что свидетельствует о группоспецифичности системы.

Чувствительность ОТ-ПЦР со специфическими праймерами определяли с использованием разведений культуральной жидкости культуры клеток Vero Е6, зараженной вирусом Тоскана, от 10" до 10"8. Специфический сигнал регистрировался до разведения вируса 10"4, что соответствовало 0,4 БОЕ/мл.

Филогенетический анализ «афганских» штаммов вирусов МЛ

С целью проведения филогенетического анализа штаммов вирусов МЛ (Аф-1008, Аф-83 и Аф-1028), выделенных на территории Афганистана, применялся однораундовый вариант созданной лабораторной ОТ-ПЦР тест-системы. Последующее секвенирование позволило определить первичную структуру фрагментов гена, кодирующего нуклеокапсндный белок N изучаемых вирусов. Далее был проведен филогенетический анализ этих фрагментов в сравнении с ранее опубликованными последовательностями штаммов вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана.

Штаммы вирусов разделились на две группы. В состав первой вошли вирусы неаполитанского серокомплекса: штаммы вируса НМЛ и подобные ему штаммы, вирус Тоскана и Тоскана-подобные штаммы. Вторую группу сформировали прототипный штамм вируса СМЛ и другие штаммы этого вируса.

Афганский штамм Аф-1008 вошел в состав неаполитанского серокомплекса. Гомология нуклеотидных последовательностей участка гена белка N этого штамма и штамма POONA-7101795 вируса НМЛ, изолированного в Индии в 1970 г., составила 92,9%. Афганские штаммы Аф-83 и Аф-1028, согласно полученным данным, относятся к сицилийскому серокомплексу. Причем наиболее близким им филогенетически оказался штамм 1-701735 вируса СМЛ (изолирован в Индии в 1970-1971) - 87,5% для штамма Аф-1028 и 95,5% для штамма Аф-83. Процент гомологии между этими афганскими изолятами составил 89,5% (Рис.4).

I-SFN_NAMRU 840 055 Египет

j—| 1- SFN_R-3 Кипр

' SFN_ Sabin Италия • SFN_P-7101795 ИНДИЯ

SFN1008 коллекция |

' TOS_ GR40 Испания '

" TOS~GR41HcnaHKfl ■ TOS ELB Португалия

■Ei

TOS_SI-1812 Италия — TOS iss PHL3 Италия

SFN_YU-8-76 Югославия SFS 83 коллекция SFS 1028 коллекция SFSJ-701735 Индия

_r SFS_R-1 8 Кипр

1 SFS_RM-09 Кипр — SFS_Sabin Италия _j- SFS_91025B Иран SFS 910451 Иран

Г II

32.5 .

" 1-58 Каримабад Иран

30 25 20 15 10 5 0

Nucleotide Substituions 0(100)

Рис.4. Девдрограмма, построенная на основе сравнения участка гена, кодирующего нуклеопротеин N штаммов вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана. Словом "коллекция" обозначены малоизученные афганские штаммы, изолированные сотрудниками НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского. Цифры I и II объединяют вирусы серокомплекса НМЛ и СМЛ, соответственно.

Определение первичной нуклеотидной последовательности фрагмента гена, кодирующего гликопротеин Gn штаммов Аф-1008 и Аф-1028

Значительный интерес для изучения эволюции афганских штаммов вирусов MJ1 представляет средний сегмент М генома, кодирующий поверхностные гликопротеины, так как его нуклеотидная последовательность наиболее подвержена мутационным процессам. Ввиду генетической вариабельности сегмента М, специфические олигонуклеотиды разрабатывались для каждой серогруппы отдельно (Рис.5). Кроме того, при конструировании праймеров ориентировались на последовательность среднего сегмента штамма вируса НМЛ POONA-7101795 и штамма вируса СМЛ 1-701735, изолированных в Индии и оказавшихся наиболее близкими штаммам Аф-1008, Аф-83 и Аф-1028 из Афганистана по S-сегменту. Места посадки праймеров были приблизительно одинаковы. Методом ОТ-ПЦР получили фрагменты гена гликопротеина Gn длиной 202 н.о. (для вирусов НМЛ (штаммы Sabin, Аф-1008) и Тоскана) и 359 н.о. (для вируса СМЛ (штаммы Sabin, Аф-83, Аф-1028) с целью определения их первичной нуклеотидной последовательности.

Рис.5. Схематичное изображение посадки праймеров, подобранных для секвенирования фрагмента среднего сегмента генома вирусов МЛ методом ОТ-ПЦР. Стрелками обозначены направления олигонуклеотидных праймеров, использованных в работе.

Филогенетические взаимоотношения штаммов Аф-1008 и Аф-1028 и других представителей рода ¡'ЫеЬтчгт

В результате филогенетического анализа по участку гена Оп показано, что штамм Аф-1008 принадлежит к антигенному комплексу вируса неаполитанской москитной лихорадки, а штамм Аф-1028 - к комплексу вируса сицилийской москитной лихорадки (Рис.6). Афганский изолят Аф-1008 оказался наиболее близок штамму РООЫА-7101795 вируса НМЛ индийского происхождения (гомология 78,1%), а первичная нуклеотидная последовательность участка М сегмента штамма Аф-1028 на 98% соответствовала таковой у штамма 1-701735 СМЛ.

■d

448.9

SFN R-3 Кипр SFN_ YU-8-76 Югославия SFN_NAMRU 840055 Египет SFhLSabin Италия

_r TOS-ELB Португалия

LTOS ISS PHL3 Италия SFN~POONA7101795 Индия SFN 1008 коллекция SFS 1-701735 Индия SFS 1028 коллекция SFSR-18 Кипр SFSRM-09 Кипр SFS Sabin Италия SFS 910451 Иран SFS 1-91025В Иран

У I

Г II

400 350 300 250 200 150 100 50 Nucleotde Substitutions (xi00)

Рис.6. Дендрограмма, построенная на основе сравнения участка гена, кодирующего гликопротеин вп штаммов вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана. Словом "коллекция" обозначены малоизученные штаммы, изолированные в Афганистане. Цифры 1 и II объединяют вирусы серокомплекса НМЛ и СМЛ, соответственно.

Таким образом, нами были впервые секвснированы участки сегментов 8 и М малоизученных афганских штаммов вирусов неаполитанской и сицилийской москитных лихорадок. Полученные данные о систематическом положении этих изолятов внутри антигенных групп вирусов МЛ согласуются с результатами их серологической идентификации, проведенной Э.Б.Белан (1994). На основании наших данных можно сказать, что по малому Б и среднему М-сегментам исследуемые штаммы не являются реассортантами, поскольку наибольшая гомология их со штаммами, выделенными на территории Индии, прослеживается по обоим сегментам (Б и М). Кроме того, можно предположить, что изоляты из Афганистана произошли от индийских штаммов, либо они имеют общего прародителя.

Определение различий в аминокислотной последовательности фрагментов нуклеопротеина и гликопротеина Сп у штаммов вирусов МЛ

Сравнение аминокислотной последовательности секвенированного нами участка гена нуклеокапсидного белка штамма Аф-1008 с последовательностями участков сегмента Б близкородственных штаммов позволило выявить замену аланина (А) в позиции 46 на треонин (Т). Подобная мутация характерна и для штамма вируса НМЛ индийского происхождения Р-7101795. Участок нуклеокапсидного белка штаммов вируса СМЛ оказался более вариабельным. Замены аминокислот у исследованных нами штаммов Аф-83, Аф-1028 и штамма вируса СМЛ 1-701735 (из базы данных ОепВапк) оказались сходными: в положении 16 валин (V) заменен изолейцином (I), аланин (А) в положении 64 - серином (Б), а на протяжении участка 100 - 120 в их аминокислотной последовательности преобладает серии (Б). Помимо этого, у штамма Аф-83 в позициях 24 и 67 лизин (К) замещен аргинином (К) (Рис.7). Данные замены не существенны, так как замещающие аминокислоты равноценны, и изменения нуклеотидного состава первичной последовательности малого сегмента Б не оказывают влияние на пространственную организацию нуклеопротеина.

КР^КРуКММ1УЬЫЪУКСЫКРЕАНМ1ЖМЗЕК6АО1УА0Ь15УУОККЕСМР6КРТ1

30 40 50 60 70

ЮНКИ)УКММ1УЬ№УКСЫКРЕДММККМЗЕКСАО1УА0ЫЗУУ0ЬКЕСКРСКВТ1

RDWKKDVKMMIVLNLVRGNKP^J^^MKKMSEKGAGIVAQLISVYQLKEGNPGRDTI RDWKKDVKMMIVLNLVRG^IKPEAMMKKMSEKGAGIVAQLISVYQLREGNPGRDTI RDWKKDVKMMIVLNLVRGNKPEAMMKKMSEKGAAIVAQLISVYQLKEGNPGRDTI RDWKKDVKMMIVLШJVRGNKPEAMMKKMSEKGAGIVAQL^S^rYQLKEGl^lPGRDTI RDWKKDVKMMIVLNLVRGNKPEAMMKKMSEKGASIVANLISVУQLKEGNPGRDTI RDWKKDVKMMIVLNLVRGNKPEAИMKKMSEKGASIVANЫSVYQLKEGNPGRDTI НПНККОУКММ1УЪНЪУРСМКРЕАММККМЗЕКСА31УА^ЗУУ0ЬКЕСЫРОКВТ1 ШШЖОУКММ1У1ЖЬиРОЫГОЕАШКХМЗЕКСАБ1УАЖЛ;ЗУУ01ЖЕО№СК1)Т1

НМЛ(ЫАМНи)840055)ЕГИПЕТ

НМЛ(Р-7101795ШНДИЯ

НМЛ(АФ1008)АФГАНИСТАН

НМЛ^-3)КИПР

НМЛ(Уи-8-76)ЮГОСЛАВИЯ

нмл(заЫп)

ТОСКАНА(ЕЬВ)

ТОСКАНА(СН40)

ТОСКАНАДО41)

ТОСКАНАрББ РНЬЗ)

01Ш/01/5---СКСУЗЕЕРАКК

_20_30

QNLVQLGXXXGKGWEEDAKK 0И1Л/С)ЬСХХХСКСИЕЕОАКК ОЫЫОЬСХХХСКСИЕЕОАКК ОЫЫОЪСХХХСРСИЕЕОАКК ОЫЫОЬСХХХСКСНЕЕРАКК <Э№У(31Х;ХХХСКЗЮЕЕПАКК <2ЩЛ7<21,СХХХСКЗИЕЕОАКК

СМЛ(910451)ИРАН

СМЛ(91025Б)ИРАН

СМЛ(1-701735)ИНДИЯ

СМЛ(АФ-83)АФГАНИСТАН

СМЛ(АФ-1028)АФГАНИСТАН

СМЛ(1Ш-18)КИПР

СМЛ^аМп)

САИЕУКЗЪУАКУУТУЕ

-1-т~

60_70

САЕПУК31,УАКУК1УЕ САКОУКЗЬУАКУИУЕ САКЕУКЗЬУЗКУКГУЕ САКЕУКЗЬУЗКУН1УЕ САКЕУКЕЬУЕКУКГУЕ САНЕУКЗЬУАКУКЕУЕ САИЕУКЗЬУАКУКТУЕ

СМЛ(910451)ИРАН

СМЛ(91025В)ИРАН

СМЛ(1-701735)ИНДИЯ

СМЛ(АФ-83)АФГАНИСТАН

СМЛ{АФ-1028) АФГАНИСТАН

СМЛ(11М-18)КИПР

СМЛ(5аЬл.п)

Е1Я55БКЕНЖ53НУИ:ШУ 100 110

ELPASPWECNGQDVRASL ЕЬРЗ^РИЕСЫСООУИКЬ Е^г^ЕШЖШУИТЫУ

ЕС^ЗЗ^МЕНГК^рХШТЫУ ЕШЙИШШСРУУЮАЮ: ELLASPREHNGPУVWANI

СМЛ(910451)ИРАН

СМЛ(91025В)ИРАН

СМЛ(1-701735)ИНДИЯ

СМЛ(АФ-83)АФГАНИСТАН

СМ Л(АФ-1028) АФГАНИСТАН

СМЛ(ЯИ-18)КИПР

СМЛ^аМп)

Рис.7. Аминокислотные последовательности участка нуклеокапсидного белка вирусов МЛ. А -аминокислотные последовательности малого Б-сегмента генома вирусов серокомплекса НМЛ; Б, В, Г - аминокислотные последовательности малого в-сегмента генома вирусов серокомплекса СМЛ.

В аминокислотной последовательности участка сегмента М изолята Аф-1008 были обнаружены следующие мктации: замены, вставки (пролин в положении 49, фенилаланин в позиции 50, тирозин в положении 60) и делении (отсутствие в положениях 54-55

аминокислот серина и лизина), отсутствующие в последовательностях среднего сегмента близкородственных штаммов (Рис.8).

IGWTEREERWAERPGGRNTroYGAKYSFYGVVILAILESAFGCSESPFIAESKVMQCYNIA

_10_20_30_40_50_60

1GWRENRRHAQDIERAQYTGGAPGAKYSFYGVMILGLLSSAQSCSES—IADSKIMQC-RP 1

IGWTEREERWAERPGGRNTVRY---SFYGVVILAILESAFGCSES—IAESKVMQC-NIA 2

IGWTEREERWAERPGGRNTIRY--SFYGVVILAMLESAFGCSES—IAESKVMQC-NIA 3

IGWTEREERWAERPGGRNTIRY---SFYGVVILAMLESAFGCSES—IAESKVMQC-NIA *

IGWTEREERVIAERPGGRNTIRY--SFYGVVILAILESAFGCSES—IAESKIMQC-NIA g

IGWTEREERVIAERPGGRNTIRY---SFYGVVILAILESAFGCSE3PFÇ —VLKl^FG 7

IGWTEREERIVAERPRSRNTVRY--SFYGVVILAMLESAFGCSES—IAESKVMQC-NIA 8

IGWRDNRRYGRDVERAQYTGGAPGAKYSFYGVMILGLLGNVHSCSES—IADSKVMQC-QL 9

Рис.8. Аминокислотные последовательности поверхностного гликопротеина Gn вирусов серокомплекса НМЛ: 1 - вируса Тоскана (штамм ELB); 2 - вируса НМЛ (штамм NAMRU 840055); 3 - вируса НМЛ (штамм R-3); 4 - вируса НМЛ (штамм YU-8-76); 5 - вируса НМЛ (штамм POONA7101795); 6 - вируса НМЛ (штамм Аф-1008); 7 - вируса НМЛ (штамм Sabin); 8 - вируса Тоскана (штамм ISS Phi 3).

Анализ фрагментов аминокислотных последовательностей белка Gn позволил выявить у штамма вируса СМЛ Аф-1028 делению двух аминокислот метионина и аргинина, а также несколько замен. Эти же изменения в последовательности аминокислотных остатков характерны и для индийского штамма 1-701735, что указывает на родство этих изолятов. Кроме того, в последовательности штамма Аф-1028 выявлены замены, характерные только для него (Рис.9).

VHRMRDRDRRPIPRSAIYLAVLFLISVTSACSDHTIASSKIVKCVAKGSKS

_10_20_30_40_50

VYRARDRDRRPIPRSAIYLAVLFTLSVASACSDHTIASSRIVKCITRDSKD 1 VYRARDRDRRPIPRSAIYLAVLFTLSVASACSDHTIASSRIVKCITRDSKD 2 THRMRDRDRRPIPRSAVYLAVLFLISVTSACSDHTIASSKIVKCVAKGSKS 3 THRMRDRDRRPIPRSAVYLAVLFLISVTSACSDHTIASSKIVKCVAKGSKS 4 VHS^^RDRRPIPRSAIYLAVLBÎvH0jTSACSDHTIASSKIVKCVAKGSKS 5 VHR^^RDRRPIPRSAIYLAVL^VS^TNACSDHTIASSKIVKCVAKGSKS 6 AHRMRDRDRRPIPRSAVYLAILLLISVTSACSDHTIASSKIVKCVAKGSKS 7 д

GSKSVCTISGLVNVKAGPIGSETCVTLRGPDSADKKFLTIKTIASELICSEGQ

50_60_70_80_90_100

DSKDICTISGVVNVKAGPIGSETCVTLRGPDSTDKKFLTIKTVASELTCSEGQ 1

DSKDICTISGVVNVKAGPIGSETCVTLRGPDSTDKKFLTIKTVASELTCSEGQ 2

GSKSVCTISGLVNVKAGPIGSETCVTLKGPDSADKKFLTIKTIASELICSEGQ 3

GSKSVCTISGLVNVKAGPIGSETCVTLKGPDSADKKFLTIKTIASELICSEGQ 4

GSKSVCTISGLINVKAGPIGSET<fiVLRGPDSADKKFLTIKTIASELICSEGQ 5

GSKSVCTISGLINVKAGPIGSETiOTLRGPDSADKKFLTIKTIASELICSKGQ 6

GSKSVCTISGLINVKAGPIGSETCVTLKGPDSADKKFLTIKTIASELICSEGQ 7 ß

Рис.9. Аминокислотные последовательности поверхностного гликопротеина Gn вирусов серокомплекса СМЛ (А - первые 50 а.м.к. секвенированного фрагмента, Б -последние 50 а.м.к. секвенированного фрагмента): 1 - вируса СМЛ (штамм 91045 I); 2 -вируса СМЛ (штамм 1-91025В); 3 - вируса СМЛ (штамм R-18); 4 - вируса СМЛ (штамм RM-09); 5 - вируса СМЛ (штамм 1-701735); 6 - вируса СМЛ (штамм Аф-1028); 7 - вируса СМЛ (штамм Sabin).

Возможно, что конформзция гликопрогеина вп «афганских» штаммов вирусов МЛ несколько отличается от таковой близкородственных штаммов, поскольку замещающие аминокислоты не всегда равноценны и приводят к изменению общего заряда белка. Полученные нами данные коррелируют с данными других авторов о большей вариабельности первичной и аминокислотной последовательностей среднего сегмента генома.

Разработка и характеристика ИФА тест-систем, предназначенных для выявления антител класса М и в к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также их антигенов

Антигены прототипных штаммов вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана получали методом сахарозо-ацетоновой экстракции из мозговой ткани инфицированных новорожденных белых мышей. Инактивацию полученных антигенов проводили 0,01% раствором р-пропиолактона.

Иммуноглобулины класса ^О к вирусам МЛ (НМЛ, СМЛ, Тоскана) получали из иммунной асцитной жидкости взрослых, белых мышей методом аффинной хроматографии на протеин-А сефарозе. Специфическая активность используемых ИАЖ в РСК составляла не менее 1:320. Очищенные иммуноглобулины конъюгировали с пероксидазой хрена.

Специфичность и активность компонентов тест-систем оценивали с помощью РСК и ИФА. В качестве отрицательного контроля использовали нормальные антигены, полученные из мозговой ткани незараженных мышей-сосунков, и нормальные глобулины, полученные из асцитных жидкостей неиммунизированных мышей. Для оценки специфичности применяли антигены и глобулины гетерологичных вирусов (клещевого энцефалита, крымской геморрагической лихорадки), для выявления перекрестных взаимодействий использовали антигены и глобулины к вирусам МЛ (НМЛ, СМЛ, Тоскана). Положительными считали такие пробы, значение оптической плотности (ОП450) которых было ниже 0,300, при ОП450 в контрольных лунках не выше 0,1.

Проверка специфичности полученных нами иммуноглобулинов к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана показала отсутствие выраженной реакции с нормальным и гетерологичным антигенами (значение ОП < 0.09) и высокую специфическую активность (ОП > 1.1) в лунках с гомологичным антигеном. Перекрестные взаимодействия зарегистрированы между вирусами НМЛ и Тоскана. Иммуноглобулин к вирусу СМЛ не реагировал с антигенами других использованных вирусов комплекса МЛ.

Для определения активности иммуноглобулинов использовали их двукратные разведения от 8 мкг/0,1 мл до 0,0625 мкг/0,1 мл. Отмечено, что реакция активно протекает при концентрации от 0,5 до 0,0625 мкг/0,1 мл. В дальнейшем для сорбирования на планшеты использовали иммуноглобулины в рабочем разведении 0,0625 мкг/0,1 мл.

Полученные сахарозо-ацетоновые антигены обладали высокой специфической активностью как в РСК (Табл.2), так и в ИФА (Рис. 10).

Таблица 2

Активность сахарозо-ацетоновых антигенов вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана в РСК с гомологичными ИАЖ

Антиген вируса Гомологичный титр в РСК

НМЛ 1:640

СМЛ 1:1280

ТОС 1:2560

В результате титрования антигенов трех вирусов МЛ в ИФА было установлено, что они

имеют одинаковую специфическую активность, которая составила 1:512000 (Рис.10). Положительные сигналы в лунках с нормальным антигеном и гетерологичным антигеном вируса КГЛ зарегистрированы не были. В дальнейших исследованиях для антигенов вирусов МЛ в качестве рабочего использовали разведение 1:200.

•М-ГМи.М. И .И .И .и .М.И .и ■»•••■• # ^ # #

обратные велечины титра антигенов

Рис. 10. Кривая титрования антигенов вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана методом ИФА с гомологичными иммуноглобулинами.

Для определения активности иммуноглобулинов к вирусам МЛ, меченных пероксидазой хрена (конъюгатов), их титровали в разведениях от 1:25 до 1:3200 (Рис.11). Специфичность каждого коньюгата оценивали в параллельном его титровании с нормальным и гомологичным антигенами вирусов МЛ (НМЛ, СМЛ, Тоскана).

н п

и л

е О т

о О

п с

т т

и и

3200 1600 800 400 200 100 50

обратный титр конъюгата

Рис. 11. Кривая титрования конъюгатов вирусов МЛ с гомологичными антигенами методом ИФА.

Активность полученных конъюгатов оказалась достаточно высокой: 1:200 - для вируса Тоскана, 1:3200 - для вирусов СМЛ и НМЛ. Неспецифической реакции их с нормальным антигеном не было выявлено. В последующих исследованиях были выбраны рабочие разведения конъюгатов антител к вирусам Тоскана, НМЛ и СМЛ, соответственно, 1:200, 1:800 и 1:200.

Определение специфичности и чувствительности метода ИФА для выявления антигенов вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана

Специфичность метода ИФА для выявления вирусных антигенов определяли с использованием антигенов вирусов рода Phlebovirus (НМЛ, СМЛ, Тоскана, Каримабад), клещевого энцефалита (Flaviviridae, род Flavivirus) и ККГЛ (Bunyaviridae, род Nairovirus), полученных методом сахарозо-ацетоновой экстракции. В качестве отрицательного контроля использовали нормальный антиген из мозга незараженных мышей. Начальное разведение всех антигенов составило 1:100.

Иммуноглобулины к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана не взаимодействовали с антигенами вирусов клещевого энцефалита и ККГЛ, а также с нормальным антигеном. Положительный сигнал регистрировался в лунках с гомологичным антигеном. В опытах с иммуноглобулинами к вирусам НМЛ и Тоскана отмечена перекрестная реактивность.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности данного метода ИФА и составляющих компонентов.

Чувствительность метода ИФА для выявления антигенов вирусов МЛ определяли на модели вируса Тоскана. Культуральную жидкость инфицированных клеток Vero Е6 титровали, начиная с разведения 1:50 и заканчивая разведением 1:6400. Положительным контролем служил сахарозо-ацетоновый антиген вируса Тоскана, отрицательным -нормальный антиген, приготовленный из мозга незараженных мышей. Вирусный антиген выявлялся до разведения 1:400 (4x10"2). Положительный сигнал не был зарегистрирован также в планшете с сорбированным контрольным глобулином и в лунках с нормальным антигеном.

Для сравнения чувствительности ИФА и ОТ-ПЦР методов эта же клеточная суспензия была использована и при титровании вируса Тоскана методом бляшек. Титр вируса по реакции бляшкообразования составил 4х10"3. Таким образом, чувствительность ИФА в данном случае составила ЮБОЕ вируса Тоскана.

Определение специфичности и чувствительности метода ИФА для выявления антител IgM и IgG к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана

Специфичность и чувствительность методов ИФА для определения антител оценивали тестированием 1274 образцов сывороток жителей Астраханской, Ростовской областей и Краснодарского края на присутствие вирус-специфических иммуноглобулинов IgG и IgM.

С использованием созданной ИФА-IgM системы к вирусу СМЛ нам удалось обнаружить антитела класса М в титре 1:800 в сыворотке лихорадящего больного из Астраханской области. Система ИФА-IgG к вирусу НМЛ позволила обнаружить антитела класса G в титре 1:12800 в сыворотке жителя Новороссийского района Краснодарского края. Отрицательные результаты обследования в ИФА-IgM и ИФА-IgG на антитела к вирусам НМЛ и СМЛ остальных 1272 сывороток лихорадочных больных и здоровых жителей Ростовской, Астраханской областей и Краснодарского края с компонентами систем косвенно указывает на специфичность созданных тест-систем.

С помощью ИФА-IgG системы нам удалось обнаружить также специфические иммуноглобулины IgG к вирусу НМЛ в титре 1:3200 в сыворотке крови сотрудницы лаборатории биологии и индикации арбовирусов (Н.В.Х.), перенесшей неясное лихорадочное заболевание в Узбекистане в 1959 г.. Обследованная сыворотка была взята в апреле 2009г. Обнаружение антител IgG у реконвалесцента спустя 40 лет после заболевания свидетельствует о длительности персистенции их в организме и о пригодности метода ИФА-IgG для проведения ретроспективных сероэпидемиологических исследований.

Более полная характеристика чувствительности созданных нами ИФА-IgM и ИФА-IgG тест-систем для диагностики москитных лихорадкок может быть получена в дальнейшей работе с использованием достаточного количества IgM- и IgG-позитивных сывороток.

Специфические компоненты, использованные в апробированных ИФА-IgM тест-

системах на антитела к вирусу СМЛ, ИФА-IgG тест-системе на антитела к вирусу НМЛ и Тоскана, а также тест-системах для выявления антигенов вирусов СМЛ, НМЛ и Тоскана, являются основой создания тест-систем для детекции IgG антител к вирусу СМЛ и IgM антител к вирусам НМЛ и Тоскана. Их практическое использование окажется возможным в случае обнаружения соответствующих позитивных сывороток, для использования в качестве контролен.

Серологическое обследование больных лихорадочными заболеваниями неясной этиологии и здоровых жителей южного региона России

Сыворотки людей, больных острыми сезонными лихорадочными заболеваниями неясной этиологии, и здоровых жителей Астраханской, Ростовской областей и Краснодарского края были собраны в 2005 - 2008 гг. и любезно предоставлены Астраханским Центром гигиены и эпидемиологии, Астраханской областной инфекционной клинической больницей, Астраханской противочумной станцией, Причерноморской противочумной станцией и Ростовским Центром гигиены и эпидемиологии, за что выражаем глубокую благодарность.

В тест-системах ИФА-IgM и ИФА-IgG на антитела к вирусам НМЛ и СМЛ были обследованы сыворотки крови 134 здоровых жителей (доноров) и 1140 сывороток, взятых у 1133 больных острыми лихорадочными заболеваниями (сыворотки нескольких больных были парными).

Обследование сывороток проводили с использованием двух модификаций иммуноферментного анализа: ИФА-IgM для выявления специфических антител класса М и ИФА-IgG для выявления G антител (Rossi et al., 1999).

Результаты обследования сывороток крови больных (61) и здоровых людей (15) из Ростовской области оказались отрицательными. В Астраханской области при обследовании собранных в 2007г. сывороток крови 234 больных неясными лихорадочными заболеваниями IgM антитела к вирусу СМЛ в титре I: 800 были обнаружены у одного пациента (жителя Володарского района) с неподтвержденным диагнозом «лихорадка Ку» (Т.Е.Аршба, личное сообщение). Пациент заболел 15 сентября 2007 г., а 27 сентября был госпитализирован в Областную инфекционную клиническую больницу г.Астрахань. В течение трех дней после госпитализации у него наблюдалась лихорадка. В анализе крови при поступлении лейкоцитов - 6,5*105/л, тромбоцитов -214* 109/л.

Все обследованные сыворотки крови доноров (119) и сыворотки больных людей (333) из Краснодарского края оказались отрицательными. Среди 119 сывороток доноров из Новороссийского района Краснодарского края одна содержала IgG антитела к вирусу НМЛ в титре 1: 12800. Эта же проба реагировала с антигеном вируса Тоскана в титре 1: 1600. В этой связи нужно отметить, что в Причерноморской ПЧС О. М. Пиликовой (личное сообщение), при обследовании в 2004г. 92 доноров-жителей г.Новороссийска было выявлено две положительные пробы: одна содержала IgG к вирусу НМЛ, другая -IgG к вирусу СМЛ .

Полученные нами предварительные данные указывают на отсутствие циркуляции вирусов НМЛ и СМЛ в Ростовской области и очень низкий уровень активности очагов этих инфекций на юге Краснодарского края и Астраханской области. Однако обнаружение находок специфических антител позволяет констатировать факт циркуляции вирусов НМЛ и СМЛ на данных территориях, что определяет целесообразность проведения дальнейших исследований.

Изучение действия рибавирина, его производных и других экспериментальных химических соединений в отношении вирусов MJI на модели вируса Тоскана в опытах in vitro.

Противовирусную активность рибавирина (ICN Switzerland AG Birsfelden, Switzerland)

оценивали в концентрациях 500, 250, 125, 62,5 мкт/мл. Разведения препарата готовили на поддерживающей среде Игла. Для заражения культуры клеток Vero Е6 использовали десятикратные разведения вируссодержащей суспензии мозговой ткани инфицированных вирусом Тоскана н.б.м., приготовленной на среде Игла MEM с 1% эмбриональной телячьей сывороткой («High Clone», США). Параллельно проводили контроль токсичности препарата, контрольное титрование и Титрование вируса в присутствии специфической иммунной сыворотоки (ИАЖ). Разведения рибавирина, других исследованных соединений и ИАЖ (в разведении 1:50) вносили через 1 час контакта вирусов с клетками в СОз-инкубаторе при 37°С и 5% содержании С02.

Индекс противовирусной активности рибавирина при испытанных концентрациях препарата 500, 250 и 125 мкг/мл составил, соответственно 2,75; 1,75 и 1,75 lg ЦПД5о/0,1 мл. Выбранные нами разведения препарата не оказывали цитотоксического действия на клетки Vero Е6.

При исследовании противовирусной активности рибавирина в зависимости от времени его внесения в поддерживающую питательную среду было установлено, что препарат оказывает ярко выраженный противовирусный эффект спустя 2, 4 и 6 часов после инфицирования клеточного монослоя (Табл.3). Внесение за час до контакта клеток с вирусом Тоскана и спустя 18 часов после заражения не вызывало значительного защитного действия.

Таблица 3

Определение активности рибавирина в опытах in vitro на модели вируса Тоскана при разных сроках внесения препарата

Вирус Время внесения препарата после заражения монослоя Титр вируса (в lg ЦПД5о/0,1 мл) в присутствии рибавирина Титр вируса (lg ЦПД50/0,1 мл) в контроле

Тоскана За час 6,5 7,5

Через 1 час 4,0

Через 2 часа 4,5

Через 4 часа 4,5

Через 6 часов 4,5

Через 18 часов 6,5

Полученные результаты указывают на перспективность использования рибавирина для лечебных целей.

Одна из задач нашей работы заключалась в сравнительном изучении эффективности препаратов «рибавирин» швейцарского и отечественного производства. «Рибавирин», полученный группой исследователей в НИИ биоорганической химии РАН с использованием нового биотехнологического метода, был любезно предоставлен д.б.н., проф. Г.А. Галеговым (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН). Оба препарата исследовались в двух концентрациях (500 и 250 мкг/мл) с параллельным титрованием вируса и определением их возможного цитотоксического действия на клетки. Внесение препаратов проводили спустя час после заражения монослоя. Индексы противовирусной активности отечественного рибавирина составили 2,5 и 3,5 lg ЦПД5о/0,1, а рибавирина швейцарского производства - 2,75 и 1,75 lg ЦПД5о/0,1.

Помимо двух вариантов рибавирина была исследована противовирусная активность нескольких соединений (452, 467, dRSata, R sata, Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A), синтезированных в Институте биоорганической химии РАН. Соединения

сЖ5а1а, Я5а1а являлись производными рибавирина. Параллельно проводил» титрование вируса, контроль токсичности препаратов и реакцию нейтрализации вируса с гомологичной ИАЖ. Исследуемые соединения (467, 452, <Ж5а(а, К$а(а) в выбранных концентрациях (500, 250, 125 и 62,5 мкг/мл) не оказывали токсического действия на клетки. Ни одно из них не оказывало противовирусного действия: индекс противовирусной активности не превышал 0,75 ЦПД50. Более того, в концентрации 500 мкг/мл препараты сШба1а, И^а и 452 (также и в концентрации 62,5), возможно, несколько усиливали активность вируса, так как титр его превышал результаты контрольного титрования (Табл.4).

Таблица 4

Определение активности химических соединений 467,452, dRsata, Rsata в опытах __in vitro 11а модели вируса Тоскана__

Вирус Препарат Титр вируса (в ЦПД5о/0,1 мл) в присутствии препаратов в соответствующих концентрациях (в мкг/мл) Контрольное титрование вируса Индекс нейтрализации вируса с гомологичной ИАЖ

1.:? ЦЩЬо/0,1 мл

Тоскана 467 500/8,0* 250/8.0 125/8.5 62.5/8.0 8,25 1,75

dRsata 500/8.5 250/7.5 125/7,5 62.5/8,0

Rsata 500/8,5 250/8.0 125/7,5 62,5/8,0

452 500/8.5 250/7.5 125/8,0 62.5/8.5

Cl-Ara-A токсичен

dR-SK-452 токсичен

Det-Ara-A токсичен

OH-Ara-A токсичен

Ome-Ara-A токсичен

Примечание. * • в числителе - концентрация препарата, в знаменателе - титр вируса при данной концентрации.

Синтезированные химические соединения Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ага-А, OH-Ara-A, Ome-Ara-A во всех выбранных концентрациях обладали цитотоксическим действием, поэтому оценить их возможную противовирусную активность в отношении вируса Тоскана в культуре клеток Vero Е6 не представилось возможным.

ВЫВОДЫ

1. Разработан лабораторный вариант тест-системы ОТ-ПЦР для детекции РНК вирусов MJ1 в экспериментальных материалах. Чувствительность системы составляет 0,4 БОЕ/мл.

2. Филогенетический анализ участков генов, кодирующих белки N и Gn штамма Аф-1008 и других представителей рода Phlebovirus выявил, что штамм Аф-1008 принадлежит к серокомплексу НМЛ, а наиболее близким ему как по М (94%), так и по S (93%) сегментам является индийский штамм вируса НМЛ Р-7101795.

3. Афганские штаммы Аф-1028 и Аф-83 являются представителями серокомплекса СМЛ, наиболее близкими к штамму Р-701735 из Индии. Гомологичность нуклеотидной последовательности фрагмента сегмента S между штаммами Аф-1028 и Р-701735 составила 87,5%, а между штаммами Аф-83 и Р-701735 - 95,5%. Нуклеотидные последовательности сегмента М штаммов Аф-1028 и Р-701735 гомологичны на 94%.

4. Обнаружены значимые различия в аминокислотных последовательностях участка гликопротеина Gn афганских штаммов вирусов МЛ и близкородственных им

штаммов.

5. Созданы и охарактеризованы ИФА тест-системы для обнаружения специфических антител класса М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана в сыворотках крови людей, а также антигенов этих вирусов.

6. На юге Краснодарского края и в Астраханской области по данным серологических исследований установлена низкая активность вирусов неаполитанской (в Краснодарском крае) и сицилийской (в Астраханской области) москитных лихорадок. Случай СМЛ диагностирован в Астраханской области впервые. У здорового жителя Краснодарского края обнаружены IgG антитела к вирусу НМЛ.

7. Показано, что рибавирин эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса Тоскана в культуре клеток Vero Е6. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 2,75 ^ЦПДзо при максимальной концентрации препарата 500 мкг/мл. Испытанные серии производных рибавирина (dRsata, Rsata) и других химических соединений не обладали противовирусной активностью в отношении вируса Тоскана.

Список публикаций по теме диссертации

1. И.С.Клименко, Н.В.Хуторецкая, Т.В.Гребенникова Филогенетический анализ штаммов вирусов москитных лихорадок, выделенных на территории Афганистана//Вестник Российского Университета Дружбы Народов. - Серия Медицина. - 2008. - №6. - С.289 - 293.

2. И.С.Клименко, А.М.Бутенко, В.Ф.Ларичев, С.А.Терехин, А.С.Азарян, Т.Е.Аршба Результаты обследования здоровых жителей южного региона России и лихорадящих больных на антитела к вирусам москитных лихорадок//Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2009. - декабрь №4. - С. И - 14. - в печати.

3. И.С.Клименко, Н.В.Хуторецкая, Т.В.Гребенникова Филогенетический анализ вирусов москитных лихорадок, выделенных на территории Афганистана/ЛХ международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке»:Тез.докл. - 27 — 30 ноября 2008 г. - Москва, 2008. - С. 268.

4. С.А.Терехин, И.С.Клименко А.М.Бутенко, Г.А.Галегов, В.Ф.Ларичев Определение активности рибавирина в опытах in vitro на моделях вирусов Батаи и Тоскана (семейство Bunyaviridae)// Материалы первой Международной конференции молодых учёных и специалистов "Биотехнология: разработка и контроль препаратов - 2009", Киев, 23-26 сентября 2009.

5. I.S. Klimenko, A.M. Butenko, T.V. Grebennikova, N.V.,Khutoreckaya The phylogenetic analysis of sandfly fever viruses isolated in Afganistan// EUROMEDLAB, 2009 -Innsbruck-Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, June 2009, Vol. 47,No.S 1 ,p.S304-S310.

Заказ № 100-а/11/09 Подписано в печать 17.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

СгООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 у*)) www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Клименко, Ирина Сергеевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Часть 1. Обзор литературы.

1.1. Классификация и таксономия вирусов группы москитных лихорадок.

1.2. Морфология, молекулярная организация и репликация флебовирусов.

1.3.Молекулярные аспекты эволюции флебовирусов.

1.4. Биологические свойства флебовирусов.

1.4.1. Цитопатогенная активность.

1.4.2. Эксперименты на лабораторных животных.

1.5. Эпидемиология москитных лихорадок. Экология вирусов-возбудителей

1.5.1. История.

1.5.2. Распространение, заболеваемость, сезонность.

1.5.3. Экология вирусов MJI.

1.6. Клиника и патогенез MJT.

1.7. Лечение.

1.8. Профилактика.

1.9. Специфическая диагностика москитных лихорадок.

1.9.1. Вирусологическая диагностика москитных лихорадок.

1.9.2. Серологическая диагностика москитных лихорадок.

1.9.3. Молекулярная диагностика.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вирусов москитных лихорадок и создание тест-систем для диагностики этих инфекций"

Группа вирусов москитных лихорадок (МЛ) (род Phlebovirus семейство Bunyaviridae) в настоящее время насчитывает 52 вируса, 27 из которых объединены в 9 антигенных комплексов: Bujaru, Candiru, Chilibre, Frijoles, неаполитанской москитной лихорадки, Punta Того, лихорадки долины Рифт, Salehabad и сицилийской москитной лихорадки. Имеющиеся данные по антигенной классификации остальных 25 флебовирусов недостаточно полно характеризуют их таксономическое положение в пределах группы. Сведения по генотипированию многих флебовирусов также весьма ограничены.

Прототипные штаммы флебовирусов были выделены в разные годы в Бразилии, Панаме, Колумбии, США, Италии, Греции, Иране, Кении, Судане, и Центрально-Африканской республике. Информация об истории выделения пяти вирусов (Armero, Durania, Ixacanal, Mariquita, Odrinisrou), включая данные об источниках выделения, в доступной литературе отсутствует. Источниками выделения оригинальных штаммов других флебовирусов были москиты, больные острыми лихорадочными заболеваниями, грызуны, другие млекопитающие и комары [45,59,65,73].

Значение флебовирусов в патологии человека установлено для 14 из 52 представителей этой группы: 8 из них распространены в Бразилии, 2 — в Панаме, 3 — в странах Средиземноморья, Средней Азии и, возможно, в Закавказье, на юге Европейской части России, на Украине и Молдавии [2,16,36,42]. В 1986 и 1987гг. сотрудниками НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН из крови больных советских военнослужащих, дислоцированных в Афганистане, были выделены три штамма вируса неаполитанской москитной лихорадки (НМЛ) и два штамма вируса сицилийской москитной лихорадки (СМЛ) [3]. Наибольшее медицинское значение имеют неаполитанская МЛ, сицилийская МЛ, лихорадка Тоскана, а также южно-американские МЛ - Аленквер, Кандиру, Пунта Торо, Чагрес и другие, встречающиеся в Бразилии и Панаме [29,41,42,61,75].

Ареал СМЛ и НМЛ охватывает регион Средиземноморья (европейские и африканские страны), республики Средней Азии, Иран и Афганистан [104].

Заболевания лихорадкой Тоскана регистрируются в Италии, Испании, Португалии, на юге Франции, Словении, Греции, на Кипре и в Турции [64,74,85].

В публикациях отечественных и зарубежных авторов при описании географического распространения вспышек и эпидемий МЛ на территории бывшего СССР упоминаются республики Закавказья, Средней Азии (Туркмения, Таджикистан, юг Киргизии), Украина (Крым) и Молдавия [2,13,16]. Между тем, проведенный нами анализ более ранней информации позволил восстановить и прояснить ситуацию с заболеваемостью москитными лихорадками в южном регионе Европейской части бывшего СССР в первой половине XX века. В 1923 г. крупная эпидемическая вспышка МЛ наблюдалась в Севастополе и Бахчисарае, в 1928 и 1929 г.г. случаи заболевания регистрировались в Армавире, в 1933г. - в Феодосии. В 1934 г. большая вспышка имела место в Новороссийске. В 1935 г. в г. Георгиевске и близлежащих населенных пунктах было зарегистрировано 1375 больных. В 1935 г. в районе г. Новороссийска эпидемия МЛ охватила более 5000 человек. Помимо приведенной информации, имеются сведения об эпидемических вспышках «лихорадки паппатачи» в послевоенные годы в Дагестане и других административных территориях Северного Кавказа. В настоящее время какие-либо данные об этих инфекциях в южном регионе отсутствуют, что объясняется, возможно, резким снижением активности природных очагов, а также недоступностью тест-систем для специфической диагностики МЛ в практических региональных лабораториях.

Актуальность настоящих исследований определяется широким географическим распространением и высокой активностью циркуляции вирусов москитных лихорадок на эндемичных территориях, выраженной патогенностью для человека; отсутствием диагностических тест-систем, доступных для использования в практических лабораториях и этиотропных средств лечения москитных лихорадок; отсутствием достаточной информации по молекулярно-генетической идентификации "афганских" штаммов вирусов МЛ и близкородственных вирусов, которая имеет прямое отношение к пониманию процессов эволюции рода Phlebovirus.

Цель и задачи исследования

Цель исследования:

Проведение филогенетического анализа малоизученных штаммов вирусов МЛ, выделенных на территории Афганистана, и создание лабораторного варианта оригинальных ОТ-ПЦР и иммуноферментных тест-систем для мониторинга циркуляции вирусов MJI и диагностики вызываемых ими инфекций.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи: ^ разработать лабораторный вариант ОТ-ПЦР для избирательного выявления геномной РНК вирусов НМЛ, СМЛ и Тоскана, отработать условия проведения реакции, определить чувствительность и специфичность метода; S секвенировать фрагменты генома афганских штаммов вирусов МЛ и провести филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей; ^ создать и охарактеризовать компоненты ИФА-тест-систем, предназначенных для выявления антител класса М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также их антигенов; ^ провести обследование сывороток здоровых жителей южных областей России и больных острыми лихорадочными заболеваниями неясной этиологии с целью апробации ИФА-тест-систем для определения антител класса М и Q выявления циркуляции вирусов MJI в этих регионах и изучения их возможной роли в краевой патологии; S исследовать противовирусную активность коммерческого препарата рибавирин" и ряда экспериментальных химических соединений (452, 467, dRSata, R sata, Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ага-А, ОН-Ага-А, Ome-Ara-A) на модели вируса Тоскана в опытах in vitro.

Научная новизна работы

В опытах in vitro было впервые проведено изучение противовирусной активности препарата «рибавирин» на модели вируса Тоскана. Показано, что исследуемый препарат оказывает выраженное противовирусное действие в отношении этого вируса.

Практическая ценность работы

Созданы и охарактеризованы специфичные компоненты ИФА-тест-систем для выявления специфических антител М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также их антигенов. Техническая документация на эти системы утверждена Учёным Советом НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 11 мая 2009г.

Исследована противовирусная активность зарубежного (производство

Швейцария) и отечественного препарата «рибавирин» на модели вируса Тоскана. Показано, что исследуемый препарат подавляет цитопатическое действие этого вируса в культуре клеток Vero Е6. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 2,75 lgljn^o при концентрации препарата (500 мкг/мл). В то же время испытанные производные рибавирина и другие экспериментальные химические соединения (452, 467, dRSata, R sata) в отношении вируса Тоскана подобным действием не обладали.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Сравнительный анализ первичных нуклеотидных последовательностей участков генов, кодирующих белки N и Gn показал, что штамм Аф-1008 принадлежит к серокомплексу ИМЯ. Наиболее близким к нему является индийский штамм вируса НМЛ Р-7101795.

3. Создан и охарактеризован лабораторный вариант ОТ-ПЦР-тест-системы для детекции РНК вирусов МЛ.

4. Созданы и охарактеризованы ИФА тест-системы для обнаружения антител класса М и G к вирусам НМЛ, СМЛ и Тоскана, а также антигенов этих вирусов.

6. Установлена выраженная противовирусная активность препарата «рибавирин» с демонстрацией эффективного подавления цитопатогенной активности вируса Тоскана в культуре клеток Vero Е6. Новые отечественные производные рибавирина и другие экспериментальные соединения не обладают противовирусной активностью в отношении вируса Тоскана.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Клименко, Ирина Сергеевна

Выводы

1. Разработан лабораторный вариант тест-системы на основе ОТ-ПЦР для детекции РНК вирусов MJI в экспериментальных материалах. Чувствительность системы составляет 0,4 БОЕ/мл.

3. Афганские штаммы Аф-1028 и Аф-83 являются представителями серокомплекса СМЛ, наиболее близкими к штамму Р-701735 из Индии. Гомологичность нуклеотидной последовательности фрагмента сегмента S между штаммами Аф-1028 и Р-701735 составила 87,5%, а между штаммами Аф-83 и Р-701735 — 95,5%. Нуклеотидные последовательности сегмента М штаммов Аф-1028 и Р-701735 гомологичны на 94%.

4. Обнаружены значимые различия в аминокислотных последовательностях участка гликопротеина Gn афганских штаммов вирусов МЛ и близкородственных им штаммов.

7. Показано, что рибавирин эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса Тоскана в культуре клеток Vero Е6. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 2,75 lg ЦПД50 при максимальной концентрации препарата 500 мкг/мл. Испытанные серии производных рибавирина (dRsata, Rsata) и других химических соединений не обладали противовирусной активностью в отношении вируса Тоскана.

Заключение

Настоящая работа посвящена вопросам генотнпирования и филогенетики малоизученных штаммов вирусов МЛ, выделенных в мае — августе 1986 — 1987 гг. в Афганистане, а также разработке и совершенствованию методов специфической диагностики и средств лечения инфекций, вызываемых этими вирусами, что представляется актуальным для науки и практики, учитывая факт отсутствия отечественных диагностических и лечебных препаратов. В исследовании использовали прототипные штаммы вирусов неаполитанской, сицилийской москитных лихорадок, вируса Тоскана, а также афганские штаммы (Аф-1008, Аф-83, Аф-1028), выделенные сотрудниками НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского (С.Я.Гайдамович и соавт.) из крови советских военнослужащих.

Как известно, геном вирусов МЛ представлен тремя кольцевыми молекулами РНК (сегменты S, М и L), каждая из которых содержит уникальную генетическую информацию и играет различную роль в вирусном патогенезе. Объектом филогенетического исследования изучаемых нами штаммов были малый S и средний М сегменты.

РНК малого сегмента проявляет двойную кодирующую стратегию и содержит две открытые рамки считывания. Одна из них кодирует нуклеокапсидный белок N, а другая - неструктурный белок NSs. Согласно большинству недавних исследований, малый сегмент S флебовирусов наиболее консервативен по сравнению с сегментом М генома [84,96,119]. Генетическая стабильность нуклеотидной последовательности малого сегмента объясняется функциональной значимостью нуклекапсидного белка N. Ранее афганские штаммы вирусов MJT (Аф-1008, Аф-83 и Аф-1028 и еще два) были типированы с использованием серологических методов исследования [1,3]. По результатам идентификации в реакциях непрямой иммунофлюоресценции, связывания комплемента и нейтрализации методом редукции числа бляшек на клетках Vero Е6 и СПЭВ штамм Аф-1008 был отнесен к серокомплексу вируса НМЛ, а штаммы Аф-83 и Аф-1028 — к серокомплексу вируса СМЛ [3]. Известно, что нуклеокапсидный белок N проявляет комплементсвязывающую активность. На основании результатов изучения антигенных связей в РСК, полученных Э.Б.Белан [1], в составе серокомплекса НМЛ были выделены три антигенные группы: 1 - вирусы НМЛ (штамм Sabin), Тоскана и Тегеран, 2 - афганские штаммы Аф-130, Аф-1038, Аф-1008. Вирус Каримабад, по данным этого теста, оказался удаленным от других представителей серокомплекса и вошел в третью группу. Афганские штаммы Аф-83 и Аф-1028, по данным РСК, оказались идентичными друг другу и прототипному штамму СМЛ. В то же время, они не вступали в перекрестные реакции с вирусами серокомплекса НМЛ.

С целью изучения филогенетических взаимоотношений штаммов, выделенных в Афганистане, и дальнейшего сравнения полученных данных с существующей антигенной классификацией была поставлена задача секвенировать участки малого S и среднего М сегментов генома этих вирусов. Анализ существующей литературы показал, что для молекулярно-генетического анализа и детекции РНК вирусов МЛ используют такие методы как ПЦР, ОТ-ПЦР, "гнездовая" ОТ-ПЦР [86,107]. В зависимости от конечной цели исследования специфические олигонуклеотиды подбирают к тому или иному сегменту генома вирусов МЛ. Филогенетическое исследование проводят как по полным последовательностям какого-либо сегмента вирусного генома (большого L, среднего М, малого S), так и по участкам последовательностей вирусных структурных (N, Gn, Gc, L) и неструктурных (NSs, NSm) белков [33,51,85]. Тест-системы, используемые для детекции РНК вирусов МЛ в клинических образцах и пулах насекомых, амплифицируют фрагмент гена РНК-зависимой РНК-полимеразы, кодируемой сегментом L, или гена нуклеокапсидного белка N флебовирусов [40,85,107,109]. В представленной работе на первом этапе была создана ОТ-ПЦР тест-система для выявления и амплификации участка S-сегмента генома вирусов МЛ

НМЛ, СМЛ, Тоскана и близкородственных им штаммов). Их последовательности опубликованы в базе данных GeneBank. Мишенью для специфических олигонуклеотидов была последовательность нуклеокапсидного белка N, поскольку неструктурный белок NSs малого сегмента генома характеризуется большей вариабельностью [84,96]. Места посадки выбранных праймеров соответствовали наиболее консервативным участкам "консенсусной" последовательности сегмента S. В ходе оптимизации условий проведения ПЦР проводили подбор следующих параметров реакции: температуры отжига праймеров и количества циклов амплификации. Созданная ОТ-ПЦР тест-система оказалась группоспецифичной, способной выявлять РНК нуклеокапсидного белка N родственных вирусов москитных лихорадок, по чувствительности эквивалентна 0,4 БОЕ/мл вируса Тоскана.

С использованием созданной лабораторной ОТ-ПЦР тест-системы были амплифицированы участки малого сегмента генома штаммов Аф-1008, Аф-83 и Аф-1028. Далее была определена нуклеотидная последовательность ПЦР-фрагментов. Распределение изучаемых штаммов вирусов МЛ на филогенетической дендрограмме четко соответствовало их антигенной классификации, основанной на данных перекрестных опытов РСК и других серологических реакций. Группу I составили вирусы неаполитанского серокомплекса, который разделился на две ветки: вирус НМЛ (штамм Sabin) и другие НМЛ-подобные штаммы, вирус Тоскана и Тоскана-подобные штаммы. В группу П вошли прототипный штамм Sabin вируса СМЛ и близкие ему штаммы. Вирус Каримабад оказался обособленным от вышеперечисленных групп, что соответствует литературным данным по таксономии этого вируса [1]. Сходные результаты были получены Xu F. и соавт. [119] в результате анализа нуклеотидных последовательностей гена белка N. Согласно данным, полученным Xu F. вирусы серокомплекса НМЛ разделяются на две ветви: вирус Тоскана (ISS Phi 3) и близкородственный ему штамм Тоскана(ЕЬВ), прототипный штамм вируса НМЛ (Sabin) и штаммы POONA 7101795, NAMRU 840055, R-3, YU 8-76,Р-7101795. Прототипный штамм вируса СМЛ (Sabin) и близкородственные ему штаммы 1-701735, 910451, 91025В объединились в серокомплекс вируса СМЛ. Следует отметить, что по данным Xu F. объединение вирусов, участвующих в филогенетическом исследовании, в кластеры по местоположению изоляции не было выявлено. Однако, анализ дендрограммы, построенной на основе участка нуклеокапсидного белка N, настоящего исследования позволяет сделать противоположные выводы. Вирусы, изолированные на соседних территориях, характеризуются большим процентом гомологии нуклеотидной последовательности участка белка N. Согласно данным настоящей работы, афганский штамм Аф-1008 вошел в состав неаполитанского серокомплекса, наиболее близким ему оказался штамм вируса НМЛ индийского происхождения (Р-7101795), изолированный в 1970 г.(92,9 % гомологии). Афганские штаммы Аф-83 и Аф-1028 относятся к сицилийскому серокомплексу. Они наиболее близки индийскому штамму I-701735 вируса СМЛ, выделенному в 1970 -1971 гг. (95,5 и 87,5 процентов гомологии, соответственно).

О достоверности полученных данных свидетельствует 100% совпадение нуклеотидной последовательности участка S сегмента прототипного штамма НМЛ, секвенированного нами, с таковой, опубликованной в базе данных GeneBank. То же можно сказать и про прототипные штаммы вирусов СМЛ и Тоскана (100%).

Известно, что у флебовирусов, как и у многих других буньявирусов, сегмент М, кодирующий экспрессию поверхностного гликопротеина Gn, является наиболее вариабельным, с ним связана нейтрализующая активность гомологичных антител. Поэтому он является важным объектом для филогенетического анализа, представляет значительный интерес для проведения молекулярно-эпидемиологических исследований вирусов МЛ и изучения эволюции возбудителя [65,110].

В связи с генетической вариабельностью первичной последовательности гена Gn нам не удалось выбрать универсальную пару праймеров, амплифицирующую все штаммы (прототипные штаммы вирусов НМЛ, СМЛ, Тоскана и близкородственные им штаммы). Поэтому для каждого серокомплекса были сконструированы индивидуальные специфические олигонуклеотиды. Место посадки праймеров на нуклеотидной последовательности штаммов неаполитанского и сицилийского серокомплексов было одинаковым, что в дальнейшем позволило провести более точный сравнительный анализ.

На филогенетической дендрограмме, построенной на основе нуклеотидной последовательности гена белка Gn, вирусы вновь разделились на два кластера: I - вирусы неаполитанского серокомплекса, II — сицилийского серокомплекса. Изучаемые нами афганские изоляты распределились так же, как и на дендрограмме, построенной на основе малого S сегмента. Афганский изолят Аф-1008 оказался наиболее близок штамму POONA-7101795 вируса НМЛ индийского происхождения (гомология 78,1%), а первичная последовательность участка М сегмента штамма Аф-1028 на 98% соответствовала таковой штамма 1-701735 СМЛ.

Сравнение аминокислотных последовательностей участка малого сегмента S афганских штаммов и близкородственных им штаммов выявило незначительные изменения. Замена аланина в позиции 46 на треонин у штамма Аф-1008 обнаружена и у индийского штамма вируса НМЛ POONA-7101795. Анализ последовательности аминокислот малого S сегмента вирусов серокомплекса СМЛ выявил сходные мутации у штаммов Аф-83, Аф-1028 и I-701735. Замена лизина на аргинин в позициях 24 и 67 аминокислотной последовательности характерна только для штамма Аф-83. Выявленные замены не оказывают влияния на пространственную организацию нуклеокапсидного белка, поскольку не изменяют общего заряда полипротеина. Сравнение аминокислотной последовательности среднего М сегмента штамма Аф-1008 выявило наличие характерных только для него аминокислот пролина (в позиции 49), фенилаланина (50) и тирозина (60) и отсутствие серина (54) и лизина (55). Минимальное число отличий аминокислотного состава участка гена Gn у штамма Аф-1028 от такового у индийского штамма 1-701735 (серен 30 -аспарагин, глютаминовая кислота 99 - лизин) указывает, возможно, на недавнее расхождение этих штаммов в процессе эволюции.

Таким образом, нами были впервые секвенированы малоизученные афганские штаммы вирусов неаполитанской и сицилийской москитных лихорадок. Полученные данные о систематическом положении этих изолятов внутри антигенных групп подтверждают результаты предыдущих серологических исследований. На основании этих наших данных можно сказать, что по малому S и среднему М сегментам исследуемые штаммы не являются реассортантами, поскольку наибольшая гомология их со штаммами, выделенными на территории Индии, прослеживается по обоим сегментам. Кроме того, можно предположить, что изоляты из Афганистана произошли от индийских штаммов, либо они имеют общего прародителя. Высокая чувствительность и универсальность разработанного лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для выявления РНК малого сегмента генома S флебовирусов позволяют использовать его и в диагностических целях. Целесообразность создания диагностических ПЦР тест-систем для быстрой детекции РНК вирусов МЛ в клинических образцах продиктована острым началом инфекции, отсутствием специфических IgM и IgG в первые дни заболевания и наличием вирусемии в конце продромального периода и в течении первых двух - трех дней болезни, а также отсутствием подобных диагностикумов отечественного производства.

Не менее востребованными для диагностики и проведения сероэпидемиологических исследований являются и серологические методы, в первую очередь ИФА-IgM (MAC-ELISA) и ИФА-IgG (ELISA). Они особенно актуальны для диагностики заболевания после окончания короткого периода вирусемии у больных МЛ, когда выявление специфической вирусной РНК с помощью ОТ-ПЦР тест-системы уже не представляется возможным. Однако, начиная с пятого дня заболевания, концентрация специфических IgM достигает определяемых уровней [23]. Поэтому одной из задач нашего исследования было создание ИФА-тест-систем для выявления IgM и IgG антител к вирусам MJI, а также специфических антигенов.

Приготовленные компоненты (антигены, глобулины и конъюгаты) оказались высоко активными. Проверка специфичности диагностикумов показала отсутствие перекрестных реакций (с использованием гомологичных и гетерологичных антител и антигенов), между всеми тестированными родственными флебовирусами, за исключением вирусов НМЛ и Тоскана, что объясняется их близким антигенным родством [1]. Чувствительность созданных ИФА-систем для детекции антигенов вирусов MJI была достаточно высокой, позволяющей выявлять специфические антигены в культуральной жидкости инфицированных клеток Vero Е6 и в мозговой ткани зараженных н.б.м. в титрах, соответственно 1:400 и 1:512000. С помощью тест-системы ИФА-IgG были выявлены антитела к вирусу НМЛ (в титре 1:12800) у здорового жителя Краснодарского края, а специфические IgM антитела к вирусу СМЛ (в титре 1:800) в сыворотке крови больного из Астраханской области. Созданные нами ИФА тест-системы расширяют спектр имеющихся в России препаратов, предназначенных для диагностики эндемичных арбовирусных инфекций.

Из литературных источников известно, что на территории южного региона Европейской части бывшего СССР (Крым, Ставропольский, Краснодарский край, Дагестан, Северный Кавказ) в первой половине XX века наблюдалась активная циркуляция вирусов MJI. Эпидемические вспышки заболевания насчитывали тысячи больных. Борьба с москитами-переносчиками позволила радикально сократить массовое инфицирование населения в Севастополе. Какие-либо данные о случаях заболевания MJI на юге России в настоящее время отсутствуют. Подобный факт можно объяснить снижением активности природных очагов вирусов МЛ в этом регионе или отсутствием специфической диагностики.

Для выяснения существующей ситуации было проведено обследование сывороток крови больных лихорадками неясной этиологии и здоровых доноров, проживающих на территории Ростовской и Астраханской областей, а также Краснодарского края на IgM и IgG антитела к вирусам москитных лихорадок с использованием созданных нами ИФА-тест-систем.

Антитела к вирусам НМЛ и СМЛ у жителей Ростовской области не были обнаружены, что объясняется отсутствием москитов Ph.papatasi на этой территории. Как известно, северная граница ареала Ph.papatasi на юге России находится на уровне 45° с.ш. (широта г.г. Армавира и Буденновска) [17].

Среди обследованных сывороток, собранных на территории Астраханской области в 2007 году, у одного пациента (К.М.Н.) — жителя с. Новая Рыча Володарского района (госпитализированного в сентябре 2007 г. в Областную клиническую инфекционную больницу с неподтвержденным диагнозом «лихорадка Ку») на 13 день болезни были обнаружены IgM антитела к вирусу СМЛ в титре 1:800. Володарский район граничит с Атыраусской областью Казахстана (ранее - Гурьевская), где Ю.А.Дубровским [18] на широте примерно 46° с.ш. были обнаружены москиты вида Ph.mongolensis Sint.

Кроме того, нам удалось выявить IgG антитела к вирусу НМЛ в титре 1:12800 у здорового жителя (донора) из Новороссийского района Краснодарского края. Эта же сыворотка за счет перекрестных антигенных связей реагировала в титре 1:6400 с антигеном вируса Тоскана. По данным О.М.Пиликовой (личное сообщение), при обследовании 92 доноров-жителей г. Новороссийска в 2004 г. было выявлено две положительные пробы: одна содержала IgG к вирусу НМЛ, другая - IgG к вирусу СМЛ.

Полученные нами предварительные данные указывают на отсутствие циркуляции вирусов НМЛ и СМЛ в Ростовской области и очень низкий уровень активности очагов этих инфекций на юге Краснодарского края и Астраханской области. Однако обнаружение положительных находок IgM и IgG антител позволяет констатировать факт циркуляции вирусов НМЛ и СМЛ на данных территориях, что определяет целесообразность проведения дальнейших исследований.

При экспериментальном испытании химиопрепаратов в отношении многих вирусных инфекций особое внимание уделяется рибавирину. Его выраженное противовирусное действие, наряду с вирусами разных семейств и родов, было показано в опытах in vitro и in vivo на моделях флебовирусов Пунто Торо [94]. В нашем исследовании была поставлена задача оценить эффективность этого препарата in vitro на модели вируса Тоскана. Препарат использовался в дозах 500, 250, 125 и 62,5 мкг/мл. Выбор данных концентраций препарата обусловлен результатами предшествующих исследований, в которых было показано, что в этих концентрациях рибавирин не токсичен для клеток и активно снижает репликацию ряда вирусов [95]. Наши исследования показали, что рибавирин заметно снижает цитопатогенную активность вируса Тоскана после добавления в поддерживающую среду спустя час после заражения монослоя (индекс противовирусной активности составил 2,75 lg ЦПД5о/0,1 мл), а также через 2, 4 и 6 часов, снижая титр вируса на 3 lg ЦПД50/0,1. Внесение препарата за 1 час до заражения клеточного монослоя и после 18 часов существенно не предотвращало развитие ЦПД вируса.

Действие рибавирина швейцарского производства и аналогичного отечественного препарата оказалось в одинаковой степени эффективным.

Помимо рибавирина были протестированы несколько новых экспериментальных химических соединений (467, 452, dRsata, Rsata, Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A), синтезированных в НИИ биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Их действие оценивали также в четырех концентрациях, параллельно контролируя возможную токсичность для клеток. Было установлено, что соединения 467, 452, dRsata, Rsata в выбранных концентрациях не оказывали противовирусного действия. Другие перечисленные препараты оказались цитотоксическим и для культуры клеток Vero Е6, поэтому оценить их эффективность не оказалось возможным.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Клименко, Ирина Сергеевна, Москва

1. Белан Э.Б. Биологические и антигенные свойства штаммов вирусов Сицилийской и Неаполитанской москитных лихорадок, выделенных в Афганистане в 1986 — 87 гг.//Диссер.канд.мед.наук. Москва. - 1994.

2. Воинов И.И., Семикоз Ф.Ф., Чеботаревич Н.Д. Лихорадка паппатачи на Северном Кавказе//Мед.паразитол. и паразит, бол. 1936. - T.V., вып. 6. - С. 852 - 862.

3. Гайдамович СЛ., Хуторецкая Н.В., Азямов Ю.В. и др. Вирусологическое изучение случаев москитных лихорадок в Афганистане//Вопр. вир. 1990. -N.1.-C. 45-47.

4. Демиховская Е.В. Биологические свойства флебовирусов и разработка иммунохимических методов диагностики москитных лихорадок//Дисс. канд.мед.наук. -М., 1989.

5. Каверин Н.В. Стратегия генома и репродукция вирусов. В кн.: Медицинская вирусология (Под ред.Д.К.Львова). Москва, МИА. - 2008. -С.66.

6. Курахмедова Ш.А. Гемагглютинирующие свойства вирусов группы москитных лихорадок//Дисс.докт.мед.наук. М., 1973.

7. Лаврова Н.А., Краснобаева З.Н. Опыт получения иммунопероксидазных диагностикумов для индикации арбовирусов//Арбовирусы/Под ред. С.Я.Гайдамович, Л.С.Приймяги-Таллин, 1984. С. 144 - 146.

8. Лаврова Н.А., Наволокин О.В. Твердофазный иммуноферментный метод (ТИФМ) для выявления арбовирусов и антител к ним//АрбовирусыЛ1од ред С.Я.Гайдамович. М., 1986. - С. 146 - 153.

9. Лурия С., Дарнелл Дж. Общая вирусология. Под ред. Ю.З.Гендона Перевод Л.Б.Меклера. "Мир", Москва. - 1970. - С. 36 - 41.

10. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции//Москва "Медицина". 1989 г. - С. 168.

11. Львов Д.К., Щелканов М.Ю. Буньявирусы. В кн.: Медицинскаявирусология (под ред. Львова Д.К.). М., 2008. - С. 138 — 164, 546.

12. Мельникова Е.Э. Иммунные сыворотки и асцитные жидкости к арбовирусам//Арбовирусы/Под ред. С.Я.Гайдамович. М., 1986. - С. 104 -106.

13. Москитная лихорадка (болезнь Папатачи). Ананян С.А.//Автореф. дис. д.м.н. Москва. — 1954.

14. Организация эколого-эпидемиологического мониторинга территории Российской Федерации с целью противоэпидемической защиты населения и войск (Методические рекомендации). Под ред. академика РАМН Д.К.Львова. -Москва, 1995.-С. 56-61,83-86.

15. Павловский Е.Н. Лихорадка паппатачи и ее переносчик. Медгиз. - 1947. — С. 7 -13.

16. Пашкин М.Ф., Никитин A.M., Демина С.Н. Материалы по изучению природного очага москитной лихорадки в Севастополе за 1945 1988 гг.//Мед.паразитол. -1990. -N.6. - С.38 - 40.

17. Сергиев П.Г. К вопросу о лихорадке паппатчи на Северном Кавказе//Мед.паразитол. и параз. бол. 1936. - T.V., вып. 6. - С. 863 — 868.

18. Сорокин В.В., Амплеева Э.А., Иванов B.C. О природной очаговости кожного лейщманиоза в низовьях реки Эмбы//Мед.паразитол. 1979. - N.3. -С. 44 - 46.

19. Сошникова М.Н. Изучение вируса москитной лихорадки на мышах-сосунках//ЖМЭИ. — 1954. -N.7. С. 53 — 55.

20. Часовников. Клинические особенности течения лихорадки паппатачи и опыт специфической серотерапии.//Мед.паразитол. и паразит бол. 1936. -T.V., вып. 6. - С. 871 - 878.

21. Accardi L., Gro М.С., Di Bonito P. et al. Toscana virus genomic L segment: molecular cloning, coding strategy and amino acid sequence in comparison with other negative strand RNA viruses//Virus.Res. 1993. - V.27, N. 2. - P. 119 - 131.

22. Amaro F., Ciufolini M.G, Venturi G et al. Phleboviruses laboratory diagnosis

23. Toscana virus)//Acta.Med.Port. 2007. - V.20, N.4. - P. 341 - 346.

24. Bartellioni P.J., Tesh R.B. Clinical and serologic responses of volunteers infected with phlebotomus fever virus (Sicilian type)//Am.J.Trop.Med.Hyg. -1976.- V.25. P. 456 - 462.

25. Billecocq A., Spiegel M., Vialat P. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription//J.Virol. 2004. - V.78, N.18.-P. 9798-9806.

26. Bishop D.H.L. Ambisense RNA genomes of arenaviruses//Adv.Virus.Res. -1986.-V.31.-P. 1-51.

27. Braito A., Corbisiero R., Corradini S. et al. Toscana virus infections of the central nervous system in children: a report of 14 cases//J.Pediatr. 1998. - V.132, N.l.-P. 144-148.

28. Brandt W.E., Buescher E.L., Hetrick F.M. Production and characterization of arbovirus in mouse ascetic fluid//Am.J.Trop.Med.Hyg. — 1967. V.16, N.3. -P.339 - 347.

29. Calisher C.H., Petzman C.I. et al. Serodiagnosis of La Cross Virus infections in humans by detections of immunoglobulin M class antibodies//J.Clin.Microbiol. -1986.-V.23.-P. 667-671.

30. Charrel R.N., Gallian P., Navarro-Mari J.M. et al. Emergence of Toscana virus in Europe./ZEmerg Infect Dis. 2005. - V.ll, N.ll. - P. 1657 - 1665.

31. Charrel RN., Izri A., Temmam S. et al. Cocirculation of 2 genotypes of Toscana virus, southeastern France//Emerg.Infect.Dis. 2007. - V.13, N.3. - P. 465 - 468.

32. Chenais F., Virella G, Patrick C.C. et al. Isolation of immune complex by affinity chromatography using staphylococcal protein-A-Sepharose as substrate//J.Immunol.Method. 1977. - V.l8. - P. 183 - 193.

33. Clarke D.H., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutonation-inhibition with arthropod-born virusis//Am .J.Trop.Med.Hyg- 1958. V.7. - P. 561 -573.

34. Collao X., Palacios G, Sanbonmatsu-Gamez S. et al. Genetic diversity of

35. Toscana virus//Emerg.Infect.Dis. 2009. - V.15, N.4. - P. 574 - 577.

36. Crance J.M., Gratier D., Guimet J., Jouan A. Inhibition of sandfly fever Sicilian virus (Phlebovirus) replication in vitro by antiviral compounds//Res.Virol. 1997. -V.148, N.5. - P. 353 — 365.

37. Cusi M.G, Savellini GG, Terrosi C. et al. Development of a mouse model for the study of Toscana virus pathogenesis//Virology. 2005. - V. 333. - P. 66 - 73.

38. Darwish M.A., Hoogstraal H., Roberts T.J.et al. A sero-epidemiological survey for Bunyaviridae and certain other arboviruses in Pakistan//Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg. 1983. - V.77, N.4. - P. 446 - 450.

39. Di Bonito P., Bosco S., Mochi S. et al. Human antibody response to Toscana virus glycoproteins expressed by recombinant baculovirus//J.Med.Virol. 2002. -N.68. - P.615 -619.

40. Di Bonito P., Mochi S., Gro M.C. et al. Organization of the M genomic segment of Toscana phlebovirus//J.Gen. Virol. 1997. - V.78. - P. 77 - 81.

41. Di Bonito P., Nicoletti L., Mochi S. et al. Immunological characterization of Toscana virus proteins//Arch.Virol. 1999. - V.144, N.10. - P. 1947 - 1960.

42. Di Nicuolo G, Pagliano P., Battisti S. et al. Toscana virus central nervous system infections in southern Italy//J.Clin.Microbiol. 2005. - V.43, N.12. - P. 6186-6188.

43. Dionisio D., Esperti F., Vivarelli A., Valassina M. Epidemiological, clinical and laboratory aspects of sandfly fever//Curr.Opin.Infect.Dis. 2003. - V.16, N.5. - P. 383-388.

44. Duran N., Gowen B.B., Costa F.T. et al. A biotechnological product and its potential as a new immunomodulator for treatment of animal phlebovirus infection: Punto Того virus//Antiviral.Res. 2009. - V.83, N.2. - P. 143 - 147.

45. Echevarria J.M., de Oiy F., Guisasola M.E. et al. Acute meningitis due to Toscana virus infection among patients from the Spanish Mediterranean region and the region of Madrid//J.Clin.Virol. 2003. - N.26. - P. 79 - 84.

46. Ehrnst A., Peters C.J., Niklasson B. et al. Neurovirulent Toscana virus (asandfly fever virus) in Swedish man after visit to Portugal/ZLancet. 1985. - V.25, N.l.-P. 1212-1213.

47. Eight report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses// C.M.Fauquet, M.A.Mayo, J.Maniloff,U.Desselberger and L.A.Ball. 2005.

48. Eitrem R., Niklasson В., Weiland O. Sandfly fever among Swedish tourists//Scand.J.Infect.Dis. 1991. - V.23. - P.451 - 457.

49. Elliott R.M., Dunn E., Simons J.F. et al. Nucleotide sequence and coding strategy of the Uukuniemi virus L RNA segmentZ/J.Gen.Vir. 1992. - V.73. - P. 1745-1752.

50. Ellis S.B., Appenzeller G, Lee H. et al. Outbreak of sandfly fever in central Iraq, September 2007//Mil.Med. 2008 - V.173, N.10. - P. 949 - 53.

51. Espy J.R., Uhl L.M., Sloan L.M. et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing//Clin.Microbiol.Rev. 2006. - V.19. -P. 165-256.

52. George J.E. Isolation of Phlebotomus fever virus from Phlebotomus papatasi and determination of the host ranges of sandflies (Diptera:Psychodidae) in West Pakistan.//J.Med.Entomol. 1970. - N.7. - P. 670 - 676.

53. Giorgi C., Accardi L., Nicoletti L. et al. Sequences and coding strategies of the S RNAs of Toscana and Rift Valley fever compared to those of Punta Того, Sicilian Sandfly fever, and Uukuniemi viruses//Virology. 1991. - V.180. - P. 738 - 753.

54. Gori Savellini G, Di Genova G, Terrosi C. et al. Immunization with Toscana virus N-Gc proteins protects mice against virus challenge//Virology. 2008. -V.375, N.2. — P.521 — 528.

55. Goswami B.B., Borek E., Sharma O.K. et al. The broad-spectrum antiviral agent ribavirin inhibits capping of messenger RNA//Biochem.Biophys.Res.Commun. 1979. - V.89. - P. 830 - 836.

56. Grassi M., Wandele A.I., Peterhaus E. Enzyme-linked immunosorbent assay for determination of antibodies to the envelope glycoprotein in rabies virus//J.Clin.Microbiol. 1989. - V.27. - P. 899 - 902.

57. Hacker D., Rochat S., Kolakofsky D. Anti-mRNA in La Crosse Bunyavirus-infected cells//J.Virology 1990. - V.64, N.10. - P. 5051 - 5057.

58. Hemmersbach-Miller M., Parola P., Charrel RJM. et al. Sandfly fever due to TOSV: an emerging infection in southern France//Eur.J.lntern.Med. 2004. — N.15. - P. 316-317.

59. Hukic M., Salimovic-Besic I. Sandfly Pappataci fever in Bosnia and Herzegovina: the new-old disease/ZBosn.J.Basic.Med.Sci. — 2009. - V.9, N.l. - P. 39 - 43.

60. Ikegami Т., Won S., Peters C.J., Makino S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene//J. Virol. 2006. - V.80. - P. 2933 - 2940.

61. Intern. Catalogue of Arboviruses, 1985, Amer.Soc.Trop.Med.Hyd. (N.Karabatsos, ed.), San Antonio, Texas,USA.

62. Izri A, Depaquit J, Parola P. Phlebotomine sandflies and transmission of disease agents around the Mediterranean basin//Med.Trop. 2006. - V.66, N.5. -P. 429-35.

63. Izri A., Temmam S., Moureau G et al. Sandfly fever Sicilian virus, Algeria//Emer.Inf.Dis. 2008. - V.14, N.5. - P. 795 - 797.

64. Jenkins GM., Rambaut A., Pybus O.G, Holmes E.C. Rates of molecular evolution in RNA viruses: a quantitative phylogenetic analysis//J.Mol.Evol. -2002.-V.54.-P. 156-165.

65. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences//J.Mol.Evol. -1980. —N.16. P. 111-120.

66. Konstantinou GN., Papa A., Antoniadis A. Sandfly fever outbreak in Cyprus: are phlebiviruses still a health problem?//Travel.Med.Infect.Dis. 2007. - V.5, N.4. -P. 239-242.

67. Kumar S., Gadagkar S.R. Efficiency of the neighbor-joining method in reconstructing deep and shallow evolutionary relationships in largephylogenies//J.Moi.Evol. 2000. - V.51, N.6. - P. 544 - 553.

68. Liu D.-Y., Tesh R.B., Travassos Da Rosa A.P.A. et al. Phylogenetic relationships among members of the genus Phlebovirus (Bunyaviridae) based on partial M segment sequence analyses//J.Gen.Virol. V.84. - P. 465 - 473.

69. Magurano F., Nicoletti L. Humoral response in Toscana virus acute neurologic disease investigated by viral-protein-specific immunoassays//Clin.Diagn.Lab.Immunol. — 1999. — V.6, N.l. P. 55 - 60.

70. Marriot A.C., Ward V.K., Nuttall P.A. The S RNA segment of Sandfly Fever Sicilian virus: evidence for an ambisense genome/Aerology. 1989. - V.169, N.2. -P. 341-345.

71. Mendenhall M., Wong M.H., Skirpstunas R. et al. Punta Того virus (Bunyaviridae, Phlebovirus) infection in mice: strain differences in pathogenesis and host interferon response//Virology. 2009. - V.395, N.1. - P. 143 - 151.

72. Morshed M.G, Lee M.K., Jorgensen D., Isaac-Renton J.L. Molecular method used in clinical laboratory: prospects and pitfalls//FEMS Immunol.Med.Microbiol. 2007. - V.49, N.2. — P. 184-191.

73. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation//J.Histochemistry and Cytochemistry. 1974. - V.22, N.l2 - P. 1084 -1091.

74. Overview of Arbovirology in Brazil and neighbouring countries. Belem, Instituto Evandro Chagas (A.P.A.Travassos da Posa, P.F.C.Vasconcelos, J.F.S.Travassos da Rosa, eds.) 1998. - P. 25 - 26, 101 - 105.

75. Papa A., Konstantinou G, Pavlidou V., Antoniadis A. Sandfly fever virus outbreak in Cyprus//Clin.Microbiol.Infect. 2006. - V.12, N.2. - P. 192-194.

76. Peralta P.H., Shevlokov A., Brody J.A. Chagres virus: a new human isolate from Panama//Am.J.Trop.Med.Hyg. 1965. - V.14, N.l. - P. 146 - 151.

77. Perez-Ruiz M., Collao X., Navarro-Mari J.M., Tenorio A. Reverse transcription, real-time PCR assay for detection of Toscana virus//J.Clin.Virol. -2007. V.39, N.4. - P. 276 - 281.

78. Peyrefitte CN., Devetakov I., Pastorino B. et al. Toscana virus and acute meningitis, France//Emerg.Infect.Dis. 2005. - V.ll, N.5. - P. 778 - 779.

79. Pifet D.Y., Osterling M.C., Smith J.F. Antigenic analysis of Punta Того virus and identification of protective determinants with monoclonal antibodies/Aerology. 1988. - N.l67. - P. 442 - 450.

80. Raju R., Kolakofsky D. The ends of La Cross virus genome and antigenome RNAs within nucleocapsids are base paired//J.Virol. 1989. - V.63. - P. 122 -128.

81. Robeson G, Said L.H., Brandt W. et al. Biochemical studies on the Phlebotomus fever group viruses (Bunyaviridae family)//J.Virol. 1979. - V.30, N.l.-P. 339-350.

82. Rossi C., Ksiazek Т.Е. Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA). In: Manual of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome//H.W.Lee, Ch.Calisher, C.Schaljohn (eds). P. 87-91.

83. Sabin A.B. Experimental studies on Phlebotomus (pappataci, sadfly) fever during World War II//Arch.Gesamte Virusforsch. 1951. - V.4, N.4. - P. 367 -410.

84. Sail A.A., Zanotto A., Zeller H.G et al. Variability of the NS(S) protein among Rift Valley fever virus isolates//J.Gen.Virol. 1997. - V.78. - P. 2853 - 2858.

85. Sanbonmatsu-Gamez S., Perez-Ruiz M., Collao X. et al. Toscana virus in

86. Spain//Emer.Inf.Dis. 2005. - V.ll,N.ll. - P. 1701 - 1707.

87. Sanchez-Seco M.P., Echevarria J.M., Hernandez L. et al. Detection and identification of Toscana and other phleboviruses by RT-nested-PCR assays with degenerated primers//J.Med.Yirol. 2003. - V.71, N.l. - P. 140 - 149.

88. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase//J.Mol.Biol. — 1975. — V. 94. — P. 444448.

89. Sanger F., Niclein S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1977. — T. 74. — C. 5463-5467.

90. Schmidt J.R. et al. Phlebotomus fever in Egypt//Am.J.Trop.Med.Hyg. 1971. -N.20. - P. 483 — 490.

91. Schwartz T.F., Gilch S., Pauli C. et al. Immunoblot detection of antibodies to Toscana virus//J.Med.Virol. 1996. - V.49, N.2. - P. 83 - 86.

92. Schwarz T.F., Glich S., Jager G Travel-related Toscana virus infection/ZLancet. 1993. - V.25. - P. 803 - 804.

93. Schwarz TF., Gilch S., Jager G Aseptic meningitis caused by sandfly fever virus, serotype Toscana//Clin.Infect.Dis. 1995. - V.21., N.3. - P. 669 - 671.

94. Schwarz TF., Jager G, Gilch S., Nitschko H. Nested RT-PCR for detection of sandfly fever vims, serotype Toscana, in clinical specimens, with confirmation by nucleotide sequence analysis/ZRes.Virol. 1995. - V.146., N.5. - P. 355 — 362.

95. Sidwell R.W., Huffinan J.H., Barnard D.L. et al. Antiviral and immunomodulating inhibitors of experimentally-induced Punta Того virus infections//Antiviral.Res. 1994. - V.25., N.2. - P. 105 - 122.

96. Sidwell R.W., Huffman J.H., Barnett B.B., Pifat D.Y. In vitro and in vivo Phlebovirus inhibition by ribavirin//Antimicrob.Ag.Chem. 1988. - V.32., N.3. — P.331—336.

97. Simons J.F., Hellman U., Pettersson R.F. Uukuniemi virus S RNA segment: ambisense coding strategy, packaging of complementary strands into virions, and homology to members of the genus Phlebovirus//J. Virol. 1990. - V.64, N.l. - P.247.255.

98. Smith R.A., Sidwell R.W., Robins R.K. Antiviral mechanisms of action//Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 1980. - Vol.20. - P. 259 - 284.

99. Terrosi C., Olivieri R., Bianco C. et al. Age-dependent seroprevalence of Toscana virus in central Italy and correlation with the clinical profile//Clin.Vaccine Immunol.-2009. V.l 6, N.8.-P. 1251 - 1252.

100. Tesh R. et al. Studies on the epidemiology of sandfy fever in Iran. 1. Virus isolated obtained from Phlebotomus//Am.J.Trop.Med. Hyg. 1977. - V.26. - P. 282 -287.

101. Tesh R.B. The genus Phlebovirus and its vectors//Annu.Rev.Entomol. — V.33. -P. 169-181.

102. Tesh R.B., Boshell J., Young D.G et al. Biology of Arboledas virus, a new phlebotomus fever serogroup virus (Bunyaviridae: Phlebovirus) isolated from sandflies in Colombia//Am.J.Trop.Med.Hyg. 1986. - V.35, N.6. - P. 1310 -1316.

103. Tesh R.B., Duboise S.M. Viremia and immune response with sequential phlebovirus infections//Am.J.Trop. Med.Hyg. 1987. - V.36, N.3. - P. 662 - 668.

104. Tesh R.B., Peters C.J., Meegan J.M. Studies on the antigenic relationship among Phleboviruses//Am.J.Trop.Med.Hyg. 1982. - V.31, N.l. -P. 149 - 155.

105. Tesh R.B., Saidi S., Gajdamovich SJa. et al. Serological studies on the epidemiology of sandfly fever in the Old Wold//BULL.Wold Health Organ. 1976. - V.54. - P. 663 - 673.

106. Valassina M., Cuppone A.M., Bianchi S. et al. Evidence of Toscana virus variants circulating in Tuscany, Italy, during the summer of 1995 to 1997//J.Clin.Microbiol. 1998. - V.36, N.7. - P. 2103 - 2104.

107. Valassina M., Cusi M.G, Valensin P.E. A Mediterranean arbovirus: the Toscana virus//J.Neurovirol. 2003. - V.9, N.6. - P. 577 - 583.

108. Valassina M., Cusi M.G, Valensin P.E. Rapid identification of Toscana virus by nested PCR during an outbreak in the Siena area of Italy//J.Clin.Microbiol. 1996.- V.34., N.10. P. 2500 - 2502.

109. Valassina M.,Soldateschi D., Dal Maso GM. et al. Diagnostic potential of Toscana virus N protein expressed in Escherichia coli//J.Clin.Microbiol. 1998. -V.36., N.l 1. - P. 3170 - 3172.

110. Valassina, M., Meacci F., Valensin P.E., Cusi M. G Detection of neurotropic viruses circulating in Tuscany: the incisive role of Toscana virus//J.Med.Virol. -2000.-V.60.-P. 86-90.

111. Valentini M., Valassina M., Savellini GG, Gusi M.G Nucleotide variability of Toscana virus M segment in strains isolated from clinical cases//Virus Res. — 2008.- V.135,N.l. —P. 187-190.

112. Venturi G, Ciccozzi M., Montieri S. et al. Genetic variability of the M genome segment of clinical and environmental Toscana virus strains//J.Gen.Virol. 2007. -V.88. - P. 1288 - 1294.

113. Verani P., Nicoletti L., Ciufolini M.G, Balducci M. Viruses transmitted by sandflies in Italy//Parassitologia. 1991. - V.33. - P. 513 - 518.

114. Voller A., Bidwell D., Bartlett A. Microplate immunoassay for the immunodiagnosis of virus infection//Eds. N.R.Rose, H.H.Friedman. — 1976. -Washington. P. 506 - 512.

115. Watts D.M., MacDonald C., Bailey C.L. et al. Experimental infection of Phlebotomus Papatasi with sandfly fever Sicilian virus//Am.J.Trop.Med.Hyg. -1988. V.39, N.6. - P. 611 - 616.

116. Weidmann M., Sanchez-Seco M.P., Sail A.A. et al. Rapid detection of important human pathogenic Phleboviruses//J.Clin.Virol. 2008. - V. 41, N.2. - P. 138-142.

117. Won S., Ikegami Т., Peters C.J. NSm protein of Rift Valley fever virus suppresses virus-induced apoptosis//J.Virol. — 2007. — V.81, N.24. — P. 1333513345.

118. Won S., Ikegami Т., Peters C.J., Makino S. NSm and 78-kilodalton proteins of Rift Valley fever virus are nonessential for viral replication in cell culture//J.Virol.- 2006. V.80, N.16. — P. 8274 - 8278.

119. Worobey M., Holmes E.C. Evolutionary recombination in RNA viruses//J.Gen.Microbiol. 1999. - V.80. - P. 2535 - 2543.

120. Xu F., Chen H., Travassos da Rosa A.P.A. et al. Phylogenetic relationships among sandfly fever group viruses (Phlebovirus: Bunyaviridae) based on the small genome segment//J.Gen.Virol. 2007. -N.88. - P. 2312 - 2319.

121. Xu F., Liu D., Nunes M.R.T. et al. Antigenic and genetic relationships among Rift Valley fever virus and other selected members of the genus Phlebovirus (Bunyaviridae)//Am.J.Trop.Med.Hyg. 2007. - V.76, N.6. - P.l 194 - 1200.

Информация о работе

Клименко, Ирина Сергеевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вирусов москитных лихорадок и создание тест-систем для диагностики этих инфекций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы