Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические и антигенные свойства штаммов вирусов сицилийской и неаполитанской москитных лихорадок, выделенных в Афганистане в 1986-87 гг.

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биологические и антигенные свойства штаммов вирусов сицилийской и неаполитанской москитных лихорадок, выделенных в Афганистане в 1986-87 гг."

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НИИ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

Р Г 6 О Д На правах рукописи

Б Е Л А Н Элеонора Борисовна

ИОЛОГИЧЕСКИЕ И АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ ВИРУСОВ СИЦИЛИЙСКОЙ И НЕАПОЛИТАНСКОЙ МОСКИТНЫХ ЛИХОРАДОК, ВЫДЕЛЕННЫХ В АФГАНИСТАНЕ В 1986—87 гг.

03.00.06 — вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1994

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Научный руководитель

почетный академик АЕН РФ, засл. деят. науки РФ, докт. мед. наук, профессор С. Я. Гайдамович.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Л. Л. Фадеева; доктор медицинских наук Е. А. Ткаченко.

Ведущая организация — Государственный институт стандартизации и контроля биологических и медицинских препаратов им. Тарасевпча МЗ РФ.

Защита состоится « /Р. » . ¿■^Я'-У...... 1994 г.

в « . . . » час. на заседании специализированного совета (Д.001.20.02) при НИИ вирусологи!; им. Д. И. Ивановского РАМН (Москва, 123098, ул. Гамалеи, д. 16).

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан « /</. » . . 1994 г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета, канд. мед. наук, ст. науч. сотр.

А. М. Жуковский

Актуальность проблемы. Проблема острых лихорадочных заболеваний остается одной из вашшх для здравоохранения ию ня стран мира. Ее актуальность обусловлена многообразием видового состава возбудителей:, тяжестью клинической картины многих ваболеваний,недостатком или отсутствием для них средств диаг ностики,профилактики и лечения.

Одну.из частих причин возникновения острых лихорадочных заболеваний человека представляют ербовирусы,среди гаэторых наиболее многочисленны представители семейства Bunyavirídae. К ньстоядему времени на территории бывпего СССР выделен 21 ви-' рус,относя1цийся к этому семейству,в том числе восемь - патогенных для человека. Несмотря на то,что последний случай виде ленкл вирусов москитных лихорадок на территории СССР относится к 1948 г. ,в настоящее время в средне.-азиатской регионе а пределах ареала Phlebotonius papatasi у грызунов - прокормителей москитов обнаруотваются антитела" к вирусу неаполитанской мое китчой лихорадки (12.1.1). Это свидетельствует о продолжающейся циркуляции вируса в природе и возможности возникновения новых вспышек.

Наличке сегментированного генома,одновременная активность в эндемичном районе двух или нескольких близких буньяаиру<-..'н. обя'лооаь видового состава их естественных переносчиков и резервуаров создам ре&?т>ные предпосылки для появления ген^тн чески измененных вариантов, в том числе обладавдих Oontr

выраженными патогенными свойствами,чем исходные вирусы. Реаль

ными, хотя и нэмнргочисленкыш, примерами могут едшь данные об изменении патогенных свойств вирусов ли::орадкм долины Рифт и Пунта Topo (Anderson G. ,1988: bfeegar; J. ,1977),принадлежащими наряду с вирусами сицилийской (CHI) и неаполитшю-кой ( HMji, москитных лихорадок к роду Phlebovirus.

Для выявления закономерностей эволюта флебовирусов необходимо накопление фундаментальных даг/ннх о патогенных, биологических и антигенных свойствах новых (чюгргфачеокик изолятса.

В 1986. и 1987 гг. из проб крови, вгитых ■/ больных со время вспышек москитной лихорадки в Афганистане были выделены три штамма вируса НМЛ {Аф-130, Аф-1008 и Аф-1038) и два чягамма СШ1 (Аф-83 и Аф-1028). Особый интерес к згим вспышкам был обусловлен тремя причинами: заболевание наблюдалось ер®дп советских военнослужащих,прибывших из неэндёмичиых районов; фяебовирусы в Афганистане, были обнаружены впервые; выде.геннпэ втащу вируса неаполитанской москитной лихорадки отличались от прототип-ных.

Цель и задачи работа

1. Совершенствование специфической диагностики москитных лихорадок; выбор чувствительной клеточной системы для выделения и культивирования вирусов.

2. Определение нейротропноеги афганских изолятов в опытах па лабораторных животных.

3. Классификация новых штаммов. Сравнительное определение молекулярной массы структурных и неструктурных протеинов афганских и прототипного штаммов вируса НМЛ.

4. Изучение антигенных связей и серологическая идентификация

- о -

выделенных штаммов методами кммунофлюоресценции (Иф), реак ции связывания комплемент« (РСК), лантанидной иммунофлюорее ценцни (ЛИФА) и иммуноблота (ИБ).

Научная новизна работы.

Впервые проведано изучение биологических свойств и серологическая идентификация пяти штаммов (Аф-83, Аф-130; Аф-1008, Аф-1С28 и Аф-1038), выделенных из крови людей, заболевших москитной лихорадкой в Афганистане. Впервые 'клеточная культура БНК-21 рекомендована ¡сак оптимальная и универсальная модель in vitro для выделения и изучения флебовируеов. Впервые на осно--валки результатов серологической идентификации в РСК в составе серокошлекса вируса НМЛ Еыделени три антигенные группы (1-вирусы НМЛ, Тоскана и Тегеран, 2 - включахдая афганские штаммы (Аф-130, Аф-1008 и Аф-1038) и 3- вирус Каримабад). Впервые определена молекулярная масса структурных и неструктурных протеинов для афганских и прототипиого штаммов вируса НМЛ. Впервые показала связь вируса Каримабад с другими представителями се рокомплекса НМЛ по нуклеокапеидному белку.

Практическая ценность работы.

11а основании полученных результатов сформулирован ряд но ло.^нкй, способствующих усовершенствованию тактики специфичен кой вирусологической и серологической диагностики москитные лихорадок.

Основные положения, выносише на защиту. 1. Выделенные в Афганистане в 1986-6? гг. штаммы лф''<

- б -

Аф-1028 идентичны вирусу сицилийской москитной лихорадки (штамм Sabin).

2. Шоляты Аф-130. Аф-1008 и Аф-1036 представляют ооОой атаммы вируса неаполитанской москитной михсрадки, .отличающиеся друг от друга и от прототипного штамма.

3. ОптимальньЫи биологическими системами для реяродуг-ции вирусов СШ1 и НМЛ (в эксперименте) являются мозг новорожденных белых мышей и клеточная культура ВНК-21.

4. Антигенные свойства вирусов серокомплекиа НМЛ отражают общую тенденцию буньявирусов к пестроте антигенных связей, которые неодинаково проявляются в различных серологических тестах.

5. Для индикации вирусспецифических антигенов серокомплекса НМЛ наиболее чувствительным является метод лантанидной имму-нофлуоресценции.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 2 работы. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обаора литературы, шести глав собственных исследований, , обсуждения, выводов и списка литературы,включающего 239 работ,из которых 69 - отечественных

авторов,170 - зарубежных. Экспериментальные данные иллюстрированы 10 рисунками и 19 таб.аицами.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на Международном симпозиум по арбовнрусам в Москве,октябрь 1989 г.,на Всесоюзной конференции по арбОЕкрусиьм инфекциям в Москве,апрель 1991 г. . на конференции молодых ученых в Институте вирусология им. Д. И. Ивановского,январь 1991,на научных конференциях, в Волгоградской; мэдицинскои институте в 1992-93 гг.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы штаммы, выделенные от больных в Афганистане (Аф-33, Аф-1028, Аф-130, Аф-1008, Аф-1038) и прото-типные штаммы зирусов СШ1 и НМЛ. а таюке вирусы серокомплекса НШ!( Тоскана, Тегеран, Кари.мабад); сахарозо-ацетоновые антигены перечисленных вирусов и штаммов; иммунные асцитические лидкос тн (КАЯ) я IgG к перечисленным вирусам и штаммам; ксиъюгати на основе лоликлонадьных а.чтмтел и лантанидной метки( И. Г. Харнто-ненкоз,1990); перезиваемые клеточные культуры СПЭВ, ВНН;.!1, Vero £5.

Реакции- ишунофлюоресцекцта выполняли по стандартной «етодике (IL L Свешникова,1986). С помощь» этого теста изучена чувствительность неточных культур (СПЭВ, ВНК-21, Vero F.6) к указанным вирусам.

РСК ставили на 9б-лукочных панелях по стандартной методик*-

Лантанидная иммунофдюоресЦенция ( ЛИФА) выполнена ло методике, описанной И. Г. Харитоненковым (1990). Реакцию ставили в варианте двойного антитедьного сэндвича. Использовали 3 типа тест-системы. В первом случае для сЬнскбилиэации подложи использовали поликлональные антитела к вирусу НМЛ, а для проявления результатов реакции - к вирусам Каримабэд, Тегеран и штаммам Аф-130 и Аф-1038; во втором сиг/чае антитела (АТ) к вирусу НМЛ использовались как индикаторные, а к вирусам Кзрима-бад, Тегеран и штаммам Аф-130 и Aí>-1038 - как первичные; в третьем варианте были созданы теот-системы из гомологичных антител ко всем перечисленным вирусам. Во всех указанных системах тестировали антигены вирусов ШТ.. Тоскана, Тегеран, Карима-бад,Аф-130 и Аф-1038. Регистрация результатов осуществлялась с помошыо флюориметра "Arcus-1230" (",LKB-Vallak") с временным разрешением. Результат считали положительным в случае двукратного превышения величины сигнала над. уровнем люминесценции контрольного буферного раствора.

Для постановки реакции иммуноблотинга вирус накапливали в клеточной культуре ВНК-21. При появлении в контрольных препаратах 70% клеток,светящихся в ИФ на 4+ при отсутствии признаков ЦЦЦ,культуральную жидкость удаляли ,а антигенсодеркавдй материал готовили по методу,описанному L. Zoller (1989). Электрофорез. в пластинчатом полиакриламидном геле (ПААГ) проводили по методу A.Laemmli (1970) при 20 V. Белки,разделенные в геле, переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью аппарата "Biorad" (Италия) в течении 50-55 мин при 0,76 А,после чего препарат выдерживали в блокирующем растворе,высушивали и нарезали на стрилы. Иммуноферментное проявление комплексов "ан

тиген-антитело" проводили н соответствии с описанием Е. А. Вла-дишрцеЕой (1989).

При изучении антигенных связей между вирусами в ГСК, ИФ и ЛИФА были построены антительные и/или антигенные профили вирусов, а по результатам ИФ и РСК - дендрограммы, полученные при обработке данных с помоиью метода кластерного анализа ( Б. Дюран и П. Оде ал. 1977).

Результаты и их обсуадение.

С. Я. Гайдамович с соавторами в мае-августе 1S86 и 1987 гг. из проб крови,взятых у больных во время вспышки острого лихорадочного заболевания,наблюдавшейся среди советских военнослужащих в Афганистане,были выделены пять изолятов.три из которых оказались родственными вирусу НМЛ, а два - вирусу О МЛ. Первые при этом имели некоторые различия-как между собой,так и с про-тотипньи штаммом вируса НШ1

Настоящая работа была начата с выбора чувствительной биологической системы, наиболее пригодной для репродукции вирусов - возбудителей москитных лихорадок.

Оптимальными в этом отношении моделями оказались новоре,*. денные белые мыши (в случае ?аракения й мозг) и клеточная культура ИЖ-21 - наиболее чувствительная по сравнению с куль гурами СПЭВ и Vero Еб ко всем исследованным вирусам группы мо с'ситных лихорадок. Полученные результаты позволили впервые рекомендовать культуру клеток ВНК-21 в качестве универсальной для выделения и изучения этих вирусов.

По данным перекрестных опытов ИФ и РСК, пгг.здмы Аф-1028, А?-83 оказались идентичными прототипн'ому штамму вируса сицилийской-москитной лихорадки.

При изучении антигенных связей внутри серокошлекса НМЛ вирусы НМЛ, Тоскана и Тегеран в РСК 6ы.л; идентичными друг другу,что согласуется с выводом ТеэЬ Й. В. с соавт. <1982,1983), однако штаммы'Аф^ЗО, Аф-1008 и Аф-1038 одкссначко дифференцировались от вирусов Тоскана и Тегеран, штаммы Аф-1008 и Аф-1038 также отличались от вируса НМЛ, а в перекрестных опытах РСК выявлялись различия меиду штаммами ¿(¡г 130 и Аф-1008

На основании полученных в РСК данных среди изученных вирусов комплекса НМЛ было выделено три группы. В первую вошли вирусы Тоскана,Тегеран и НШГ, во вторую - афганские штаммы Аф-130, Аф-1008 и Аф-1038, £ третью - вирус Каримабад.

Штамм Аф-130 оказался наиболее близким к вирусам первой группы,а Аф-1008 - наиболее отличающимся (табл.1).

В опытах ИФ были подтверждены сведения о выраженной группоспецифичности этого геста для флзбовирусов: с его помощью практически не удавалось дифференцировать исследуемые вирусы и штаммы серокомплекса НМЛ (табл. 2). Очевидно, это связано с тем,что присутствие консервативного И-протеина в мажорных количествам маскирует различия, обеспечиваете другими белками. С другой стороны,различия по нуклеокапеидному белку "сглаживаются" близкородственными белками 61 и 02,как это имело место у вирусов Тоскана и штамма Аф-130 (табл. 1 и 2).

Метод иммуноблота для изучения вирусов комплекса НМЛ ранее не применялся. В результате его использования удалось до-

Таблица 1

' ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СВЯЗЕЙ ВНУТРИ СЕРОКОМПЛЕКСА НМЛ В РСК

НМЛ

тос

ГЕГ

АФ-1038 АФ-130 АФ-1008 НА»

НМЛ 160/20 040/20 160/20 20/20

Тоскана 80/1280 540/12») 160/640 О

Тегеран 40/80 160/160 640/80. 20/40

Аф-1030 320/40 320/80 320/4

Аф-130 80/80 320/40 80/80

Аф-1008 320/40 320/40 160/40 40/80 Кариыабад 0 0 0 О

80/160 20/80

О О

20/20 20/20

160/160 160/80 160/160

80/80 320/80 40/40

160/320 320/640

. О -

О

О

о о о

II

320. >'■ I

Прим. Б числителе указаны обратные значения титров антигенов, е знаменателе - МАИ.

Таблица 2

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СВЯЗЕЯ ВНУТРИ СЕРОКОМПЛЕКСА НМЛ В ИФ

НМЛ Аф-1008 Аф-1038 ТЕГ 1 ТОС Аф-130 КАР

НМЛ 320 320 20 2560 640 80 Н:

Аф-1008 320 640 160 1280 1280 80 , <i

Аф-1038 320 320 160 1280 2560 80 I'-

Тегеран 640 640 0 1280 1280 :J20

Тискана 1280 320 80 1280 1280 640

Заримабад 0 0 0 0 а 0 "Ч

Прим. Данные приведены з виде обратных значений титров ПАЯ.

полнить сведения об антигенных взаимосвязях, полученные с помощью РСК и ИФ, а также определить молекулярную массу белков вирусов НМЛ, Каримабад и афганских изолятов Аф-130. Аф-1008 и Аф-1038 (табл.3).

Показано,что эти агенты имеют рааличную.молекулярную массу структурных и неструктурных поотоипов,а при перекрестных опытах не реагируют с гетерологичными. ттакмаг.и по всему спектру белков.

Вирус Каримабад методов иммуноблота ранее тага» не изу- ^ чали, однако известны данные электрофоретического разделения его белков с целью определения их молекулярной массы (Smith J. F., Pifat D. .1982; Rice, 1980; Str uthers J. K., etc. , 1980«И др.). Данные, полученные нами о белка!. N (25 кД) и NS (80 кД), совпадали с таковыми всех авторов. Информация о гликопротеи-нах Gl и G2 во всех случаях, в том числе и в нашем исследовании, была различной, однако значения их молекулярной массы были типичными Для флебовирусов. По мнению Smith J. . et Pifat 0.(1982), отличающиеся результаты могли'были получены в результате работы с разными штаммами вируса Каримабад или вследствие неодинаковых технических условий проведения исследования. Совпадение данных о молекулярной массе наиболее консервативного (N) и неструктурного (вОкД) белков свидетельствуют, вероятно, в пользу первого предположения.

При изучении антигенных связей вируса Каримабад методом иммуноблота нами установлено, что антитела к нему реагируют с гликопротеинами(и/или их предшественниками) тех вирусоЕ.с которыми взаимодействуют в опытах иммунофлюоресцекции( табл. 2). Однако при использовании антител к вирусам НМЛ,Тоскана и штам-

- Ш5-

Таблица 3

ИЗУЧЕНИЕ ВИРУСОВ СЕИЖОМПЛЕКСА НМЛ МЕТОДОМ ИММУНОБЛОТА

Антитела (ИА1) --—<-

. ¿шхшены Г&ДКИ

.вирусов НМЛ Аф-130 Аф-1008 Аф-1038 КАР ТОС ТЕГ

106 + +

97 + + +

80 + + +

. НУЛ 80

74 + н. и. н. и.

58 + +

28 + +

100

95 . + +

ео

. Аф-130 63 н. Й. слабо +

+ 57 + + + .+

+ 20 + + + ' +

+ 106

. Аф-1008 + • 95 + н. и.

+ 58 + +

+ + 20 +' +

+ 110

+ 94 +

+ 75

; Аф-1038 + Н. и. 65 + н. и.

+ 50 +

46

+ ■+ 22 +

+ 106 +

• + 80

Каримабад + 58

46

+ 34

+ +■ 25 +

ТриЕедены значения м. м. /кД/ протеинов изученных вирусов. Белки, фореагировасшие с гетерологичными антителами, отмечены "+".

му Аф-130 была установлена связь между этими вирусами и вирусом Каримабад по нуклеокапсидному белку. Отсутствие аналогичных перекрестных реакций в РСК свидетельствует,очевидно,о том, что в процессе разделения вирусных протеинов в полиакриламид-ном геле и переносе на $штроцеллюлозную мембрану белковые молекулы претерпевали некоторые конформационнь® изменения. Это привело к тому, что эпитопы, способные связываться с антителами, но недоступные им в цельном вирионе, приобрели такую возможность. Таким образом, применение метода иммунобдота позволило получить сведения об антигенном родстве вируса Каримабад с другими членами серокомплекса КАЯ, хотя и выраяеннои в ыалой степени.

Для дальнейшего анализа антигенной структуры исследуемых вирусов москитных лихорадок-нами был использован метод ланта-нидной иммунофлюоресценции,который хорошо зарекомендовал себя при изучении вирусов клещевого энцефалита и венесуэльского энцефаломиелита лошадей (Гайдамович С. Л. ссозт. ,1991; Шмелева В. Г. с соавт. ,1991;ларитоненков И. Г.' с соавт. ,1990').

Анализ полученных с помощью ЛИФА результатов (табл. 4) показал, что по характеру поверхностных структур вирионов -изученные вирусы серокомплекса НМЛ можно разделить на четыро группы 1 - вирусы НМЛ и Тоскана,2 - штаммы Аф-130 и 103)3,3 ■• вирус Тегеран, 4 - вирус Каримабад. Со штаммом Аф-1008 исследовании ЛИГА не проводили.

Наличие широких перекрестных связей медцу представителями первых трех групп указывает на генетическое родство вирусов НМЛ, Тоскана и афганских штаммов (Аф-130, Аф-1038) вируса НМЛ Овязь вируса Тегеран о серокомплексом ь одностороннем порядке

-

Таблица 4

РЕАКТИВНОСТЬ АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ КОМПЛЕКСА НМЛ, ВЫЯВЛЯ-. ЕУЫХ МЕТОДОМ ЛАНГАНИДНОЙ ИММУГОФЛЮОРЕСЦЕШЩ 1/тест-системы на основе первичных антител НШГ

антиген индикаторные антитела

НМЛ КАР : Аф-130 Аф-1038 ТЕГ

НШ! 10 ООО 100 1 ООО 1 ООО 1 ООО

Карш.-:абад 100 100 100 100 100

АФ-130 40 ООО 100 20 ООО 20 ООО 40 ООО

Аф-1038 40 ООО 100 20 ООО 20 ООО 80 ООО

Тоскана 160 ООО 100 20 ООО 80 ООО 160 ООО

Тегеран 100 100 100 1'00 100

2/тест-скстемы на основе индикаторных антител к вирусу' НМЛ

антиген первичные антитела

дал КАР ■ф-130 Аф-1038 ТЕГ

НМЛ 1С ООО 100 20 ООО 1 ООО 10 ООО

Каримабад 100 100 100 100 100

Аф-130 40 ООО 100 20 ООО 80 ООО 40 ООО

Аф-1038 40 ООО 100 20 ООО 40 ООО 40 ООО

Тоскана 160 ООО 100 160 ООО 20 ООО 160 ООО

Тегеран 1Ьо 100 100 100 100

3/тест- системы из гомологичных первичных и индикаторных антител

антиген антитела

. НМЛ КАР Аф-130 Аф-1038 ТЕГ

НМЛ 10 ООО 100 1 ООО 100 1 ООО

каримабад 100 160 ООО 100 100 100

МНЗО 40 ООО 100 20 ООО 10 ООО 20 ООО

\ф-1038 40 ООО 100 20 ООО 20 ООО 20 ООО

Тоскана 160 ООО 100 1 ООО 100 10 ООО

Тегеран 100 100 100 100 20 ООО

Трим. .В таблицах указаны обратные значения титров антигенов в тест-системах.

в лантанидной иммунофлюоресцении при " идентичности его вирусам НМЛ и Тоскан^ в РСК объясняется, очевидно, тем, что в процессе эволюции поверхностные структуры вируса ТЕГ практически-утратили эпитопы, родственные этим агентам.

Таким образом,результаты настоящей работы показали,что для антигенной дифференциации вирусов группы неаполитанской москитной лихорадки наиболее информативной является лантанид-ная иммунофлуоресценция.в, которой участвуют антигены поверхностных структур,а также метод иммуноблота, позволяющий выявить каздую конкретную пару " антиген-антитело"

На основании анализа перекрестных■реакций в ЛИФА в составе серокомплекса была выделена группа "итальянских" вирусов (Тоскана и НМЛ),"афганская" группа,' объединяющая штаммы Аф-130 и Аф-1038, и группы "Тегеран" и "Каримабад", кавдая из которых представлена единственным одноименным вирусом, причем последний не имел выраженных перекрестных связей с другими членами серокомплекса.

В ходе нашего исследования было установлено,, что наиболее •широкими антигенными-связями обладает вирус ШЛ, в то время как остальные члены серокомплекса НМЛ реагирует между-собой в серологических реакциях ь меньшей степени. Например, -дал» в РСК вирус Тоскана и афганские штаммы вируса НМЛ имел^ только 'одностороннюю связь. Наряду с этим широкое распространение вируса НМЛ (в отличие от территориальной ограниченности ареалов остальных представителя серокомплекса) свидетельствует в пользу версии о его эволюционном значении качестве прародителя других, позднее сформировавшихся вирусов, таких как Тоскана, Тегеран и афганские варианты вируса НМЛ.

1№амм Аф-130 о'згндиняется с кластером вирусои НМЛ-Тоскана

:Тегеран по результатам ИФ, а тест-система для лантанидной им-мунофльоресценции Аф-130-Аф-130 обладает меньшей дифференцирующей способностью, чем тест-система Аф-1038-1038. Это позволяет предположить, что штамм Аф-130 эволюционно более близок к вирусу НМЛ, чем остальные афганские штаммы. Интересно в этой связи, что в лантанидной иммунофлюоресценции титр антигена штамма Аф-130 в тест-системе Аф-1038-НМЛ в 2 раза превышает титр антигена штамма Аф-1038 и в 80 раз - титр антигена вируса НМЛ.

• йгаш Аф-1038 в опытах лантанидной иммунофлюорёсценции вел ;ебя Праш'кчески идентично штамму Аф-130, что свидетельнствует э большом сходстве поверхностных структур вирнионов. Однако при изучении методом иммуноблота этот изолят проявил большее сходство с Аф-100'8, чем с Аф-130. Кроме того, во всех тестах сред-шв показатели связи штамма Аф-1038 с другими афганскими штампами вируса НШ1 были одинаково высокими, а между штаммами Аф-130 I Аф-1008 значительно ниже. Эти факты приводят к мысли, что аташ Аф-1038 является связующим звеном между двумя другими 1фганскими изолятами.

У<есто вируса Тегеран в структуре серокомплекса оконча-■ельно не определено. Антигенное родство по нуклеокапсидному ¡елку с вирусами Тоскана и НМЛ свидетельствует об их 'эволюци-1ННой близости. Аналогичной вирусу Тоскана является и степень вязи вируса Тегеран с афганскими штаммами, а в опытах ИФ редний показатель связи между вирусами Тегеран и НМЛ превыша-т гомологичный.

Вместе с тем, по структуре поверхностных антигенов вирус егеран значительно отличается от вирусов Тоскана и НМЛ. Он не

в/

0/

Рпс. Возможные пута эволюции вируса НМЛ.

реагирует с ними в реакции нейтрализации (ТевЬ Я. В. ,1982), а в опытах лантанкдной иммунофлюоресценции (по нашим данным) связан с другими представителями серокомплекса только в одностороннем порядке. В последнем случае он оказался ближе к штамму Аф-130, чем к вирусу НМЛ.

Кг основании полученных нами данных мокно предположить, что наиболее древним среди изученных вирусов является вирус НМЛ. Его эволюция привела к образованию новых видов, составляющих в настоящее время одноименный серокомплекс.

' Модно предположить, что этот процесс шел в трех или четырех направлениях.

Одно из них могло привести к появлению вируса Каримабад.

Вторую ветвь эволюции представляют афганские штаммы вируса НЫЛ. Характер их реактивности в серологических тестах, в частности большая близость, выявляемая в опытах ЛИФА, свидетельствуют о выраженном их генетическом родстве. Количественные характеристики этой связи дают возможность предположить, что временная последовательность появления антигенных вариантов была следующей: Аф-130, Аф-1038 и Аф-1008. Не исключено, тао эволюция в данном случае имела место в результате измене-*ий в нарезании полипептидной цепи, содержащей последователь-тости белков 01 и 02. Пэ нашим данным, суммарная молекулярная иасса гликопротеинов афганских штаммов вируса НМЛ практически зовпадает.

Возникновение вирусов Тоскана и Тегеран, возможно, яви-гось результатом третьего и четвертого путей эволюции вируса Ш

Таким образом, в работе показано, что антигенные взаимо-

отношения внутри серокомплекса НМЛ характеризуются близкими перекрестными реакциями. Сложность классификации этой группы отличается возможным возникновением в природных условиях генетических рекомбинантов.

Анализ литературных и собственных данных показал, что уникальность вируса НИЛ определяется характером его поверхностных структур. Они представлены гликопротеипами с находящимися на них гемагглютинирующими зпитопами и эпитопом, ответственным за нейтрализующий антителогенез. Ш мнении к. М.К1ппеу (1982), именно эти структуры претерпели наибольшие изменения в ответ на селективное давление внешних факторов. Е сочетании с высокой способностью буньявирусов к реассортации генных сегмзятов это привело к появлению новых вирусов, сходных по строению консервативного нуклеокапсидного белка и различаются по структуре гликопротеннов.

Вместе с тем, эта тенденция не носит абсолютного характера. Особенности взаимоотношений вируса Тоскана к штамма Аф-130 свидетельствуют о том, что эти . четко .дифференцирующиеся по нуклеокапсидному белку вирусы на каком-то этапе получили близкородственные гликопротеины. Не исключено, что -действительный процесс эволюции этих вирусов выходит за рамки наших представлений, а в цепи вирусов Тоскана - Аф-130 и^екггся другие, неизвестные пока варианты.

Не нашел объяснения факт большей лабильности структуры вируса НМЛ по сравнению с вирусом СМЛ. Если первый имеет выраженную тенденцию к ноьому видообразованию, то последний до сих пор остается единственным антигенным типом в пределах рода.

ВЫВОДЫ:

1. Проведено изучение биологических свойств и серологическая идентификация пяти штаммов (Аф-83, Аф-130, Аф-1008, Аф-10й8, Аф-1038), выделенных из крови людей, заболевших москитной лихорадкой в Афганистане.

. 2. Все изученные вирусы и штамш серокомплекса НМЛ и ви-Г'Ус сицилийской москитной лихорадки обладают цитопатогенным действием, п культуре ¡слеток БНК-21. На этом основании клеточная' ку.к>тура ВКК-21 рекомендуется как универсальная и оптимальная модель :п vitro для выделения и изучения флебовирусов.

3. По данник серологической идентификации, штамш Аф-83 и. Аф-1028 оказались идентичными вирусу сицилийской москитной ли- ' корадки. Штаммы Аф-130, Аф-1008 и Аф-1038 являются антигенными вариантами, относящимися к комплексу вируса неаполитанской москитной лихорад/ш. В составе серокомплекса вируса НМЛ выделяются три антигенные группы: а) вирусы НМЛ, Тоскана и Тегеран; б) афганские штаммы Аф-130, Аф-1008 и Аф-1038; в) вирус Каримабад,

4. Установлено, что реакция связывания комплемента и метод непрямой иммунофлюоресценции выявляют группоспецифические связи мекду флебовирусами, а метод лантанидной иммунофлюоресценции - типоспецифические.

5. Впервые для изучения антигенных связей и молекулярной структуры вирусов серокомплекса НМЛ применен метод иммунобло-та. Определена молекулярная масса структурных (61, G2 и N)

протеинов для п^ютотипного и афганских штаммов вируса НМЛ (соответственно, 74, 68 и 28 кД для штампа Сэбин, 63, 5? к 20 кД - для штамма Аф-130, 58, 58 и 20 кД - для штамма Аф-1008, 65, 50 и 22 кД - для штамма Аф-1038) и некоторых неструктурных белков.

6. Впервые показана связь по нуклеокапсидному Селку вируса Каримабад с вирусами НМЛ, Тоскана и штаммом Аф-130, что подтвер вдает правомерность его включения в серокомплэте вируса 1Ш.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Белан Э. Б. , Хуторецкая На Чувствительность клеточных культур к прстотипным и афганским штаммам вирусов сицилийской и неаполитанской москитных лихорадок/ дрбовирусы и арбовирус-ные инфекции// Теа. докл. меад. симп. - М. , 1269 - С. 54-55.

2. Белан Э. Б. Хуторецкая Е Е Изучение антигенных сь:зей между вирусами группы неаполитанской москитной лихорадки и штаммами, выделенными в Афганистане в 1986-87 г. г. / ВИНИТИ, т. 28 "Вирусология", М-. 1992, с. 103.