Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция ДНК-белковых взаимодействий слабыми комбинированными постоянным и низкочастотным полями в модельных и биологических системах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Швецов, Юрий Петрович, Пущино

,У¿у

ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ РАН ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

БИОФИЗИКИ РАН.

На правах рукописи.

ШВЕЦОВ ЮРИЙ ПЕТРОВИЧ.

РЕГУЛЯЦИЯ ДНК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ СЛАБЫМИ КОМБИНИРОВАННЫМИ ПОСТОЯННЫМ И НИЗКОЧАСТОТНЫМ ПЕРЕМЕННЫМ МАГНИТНЫМИ ПОЛЯМИ В МОДЕЛЬНЫХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ.

(03.00.04,- БИОХИМИЯ).

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Е. Е. Фесенко; кандидат медицинских наук В. В. Новиков;

кандидат биологических наук Т. М.Третьяк.

г.Пущино 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

1. Введение 4.

2. Цели исследования. 5.

3. Задачи исследования. 5.

4. Обзор литературы. 6.

4.1. Действие слабых комбинированных магнитных полей

на биологические системы. 6.

4.2. Структура геномного аппарата клетки. 13.

4.2.1. Ферменты синтеза ДНК. 13.

4.2.2. Гистоны. 20.

4.2.3. Взаимодействие молекул в структуре хроматина. 26.

4.2.4. Негистоновые белки хроматина. 26.

5. Материалы и методы. 36

5.1. Методика формирования и параметры слабых комбинированных магнитных полей (МП). 36.

5.2. Воздействие слабыми МП на рост культуры клеток

E.coli и на ДНК-полимеразу I. 37

5.3. Воздействие слабыми МП на рекомбинантную ОТ

вируса HIV-I, выделенную из Е. coli. 39.

5.4. Воздействие слабыми МП на рекомбинантную ОТ вируса

саркомы Рауса, выделенную из Е. coli. 46.

5.5 . Воздействие слабыми МП на животных. 47.

5.6. Выделение суммарных гистоновых белков, и негистонового

белка хроматина мозга крыс, ингибирующего ДНКазу I. 49

5.7. Воздействие слабыми МП на водные растворы ДНК

и белков-ингибиторов ДНКазы I. 53.

6. Результаты работы и их обсуждение. 53.

6.1. Действие слабых МП на рост культуры клеток E.coli и

на ДНК - полимеразу I. 53.

6.2. Действие слабых МП на рекомбинантную ОТ вируса иммунодефицита человека HIV-I,выделенную из E.coli. 55.

6.3. Действие слабых МП на рекомбинантную ОТ вируса

саркомы Рауса, выделенную из E.coli. 56.

6.4. Действие слабых МП на клетки карциномы Эр лиха

у мышей и на клетки головного мозга мышей. 58.

6.5. Действие слабых МП на растворы ДНК и

белков - ингибиторов ДНКазы I. 60.

7. Заключение. 62.

8. Выводы. 65.

9. Литература. 66.

10. Список сокращений. 90

1 ВВЕДЕНИЕ

Живые организмы на планете постоянно находятся под воздействием повсеместно присутствующего геомагнитного и искусственных магнитных полей, созданных в результате производственной деятельности человека. Диапазон этих полей очень широк, велико разнообразие вызываемых ими биологических эффектов.

Вплоть до последнего времени, молекулярные механизмы биологического действия слабых магнитных полей (МП) остаются крайне слабо изученными. По-видимому, это является следствием отсутствия адекватных подходов и модельных систем, в которых мог бы быть проведен их достаточно строгий экспериментальный анализ. Один из возможных подходов к решению этой проблемы обозначен в работах, показавших возможность регистрации выраженных биологических эффектов очень слабых ( порядка сотых долей мкТл ) переменных компонентов магнитного поля на фоне более сильного (десятки мкТл) постоянного магнитного поля (Новиков и др. 1996,1997; Фесенко идр.,1997; 1\кшкоу, КагпаиМюу,1997).

Разработанные в этих работах подходы впервые достаточно ясно демонстрируют взаимосвязь слабых электромагнитных полей и молекулярных процессов (Новиков и др., 1997). Механизм обнаруженных эффектов может быть обусловлен изменением свойств жидкой фазы( воды), при действии слабых ЭМП, (РеБепко, Ок^ет, 1995; Безепко е1 а1.,1995; Новоселова, Фесенко 1998; Новиков и др.,1999).

Ранее также сообщалось о том, что данное комбинированное воздействие слабыми постоянным и низкочастотным переменным магнитными полями, формально настроенными на циклотронный резонанс ионов заряженных аминокислот (аспарагиновой, глутаминовой, аргинина и лизина ), оказывает выраженный ингибирующий эффект на ранних стадиях развития асцитной карциномы Эрлиха у мышей (Новиков и др., 1996), а также, как показано в данной работе, существенно снижают скорость роста Е.соН. В этой связи, особенно

актуальными становятся поиск и исследование возможных молекулярных мишеней, чувствительных к действию слабых МП на уровне геномных систем клетки.

С учетом выше приведенных данных, воздействие МП может быть ориентировано на структуру хроматина, на белки хроматина, и на ферменты, связанные с синтезом и гидролизом ДНК в пролиферирующих клетках E.coli, асцитной карциномы Эрлиха и в непролиферирующих клетках головного мозга.

2.ЦЕЛБ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы является исследование возможности регуляции ДНК - белковых взаимодействий действием слабых комбинированных магнитных полей и поиск возможных молекулярных мишеней, чувствительных к действию этих полей :

1- в биологических системах, при действии полей на живые организмы;

2- в модельных системах, содержащих водные растворы ДНК, различные белки- ингибиторы ДНКаз ( кислые негистоновые белки и гистоны), ДНК-полимеразы и обратные транскриптазы;

З.ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие

задачи:

1. Провести выбор объектов исследования.

В качестве объектов исследования были выбраны животные(мыши) и Pix органы (головной мозг, как непролиферирующая или слабо пролиферирующая ткань), культуры активно пролиферирующих клеток животных (карцинома Эрлиха) и микроорганизмов (E.coli), а также водные растворы хроматина, растворы гистоновых и негистоновых бежов хроматина, растворы ДНК, растворы ДНК -полимеразы I E.coli, растворы рекомбинантных обратных транскриптаз (ОТ) вирусов саркомы Рауса (RSV) и иммунодефицита человека (HIV-I).

2.Выделить из ранее сконструированных штаммов продуцентов E.coli рекомбинантные ОТ вирусов саркомы Рауса и иммунодефицита человека HIV-I, для исследования действия на них слабых комбинированных магнитных полей.

4. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

4.1.ДЕЙСТВИЕ СЛАБЫХ МП НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ.

Слабые постоянные и низкочастотные переменные магнитные поля являются одним из основных физических факторов окружающей среды, постоянно оказывающих воздействие на биологические объекты. Под термином "слабые магнитные поля" принято обозначать поля с величиной магнитной индукции, сравнимой с постоянной составляющей магнитного поля Земли, равной 30-50 мкТл.

Поскольку, микропульсации геомагнитного поля составляют величину порядка долей процента, либо нескольких процентов от этого значения в частотном диапазоне преимущественно от 0 до нескольких десятков герц, ясно, что основной частотно-амплитудный диапазон возможных биотропных параметров переменной компоненты геомагнитного поля лежит в пределах 0,001-1 мкТл по амплитуде и от 0 до нескольких десятков герц по частоте.

Вопрос о возможности биологического действия слабых МП имеет давнюю историю, на протяжении которой накоплен обширный фактический материал, подтверждающий высокую биологическую активность этого физического фактора окружающей среды. Особенно широко исследовались различные статистические характеристики, показывающие высокую степень корреляции возмущений естественного геомагнитного фона (геомагнитные бури) с динамикой широкого спектра заболеваний человека, в первую очередь нервно- психического, сердечно -сосудистого профиля. Данные такого рода систематизированы в ряде статей и монографий ( ПресманД968;ДубровД974; ЧижевскийД976; Казначеев, Михайлова, 1981; Темурьянц и др.,1992; ПлехановД990; Владимировский и др., 1996; Backer, Marino, 1982 и других). В значительном числе экспериментальных работ показано, что геомагнитные бури, а также полученные в лабораторных

условиях слабые МП, имитирующие геомагнитные возмущения, оказывают действие на различные клеточные популяции, органы и системы организма, включая миокард, нервную и эндокринную системы и систему крови (Осипов, Десятов, 1971; Павлова, 1975, Павлова и др.,1978; Темурьянц и др.,1996)/

Анализируя собственные и литературные данные Р.О.Беккер и А.А.Марино ( Becker, Marino, 1982; Becker, 1984) пришли к выводу о существенном отличии в характере реакций биологических объектов на МП с различными частотно-амплитудными характеристиками. Слабые поля с частотами, соответствующими периодике физиологических процессов и ритмов геомагнитной активности, по мнению этих авторов, оказывают более избирательное управляющее биологическое действие, прямо взаимодействуя с системой внутренних электрических токов в тканях и клетках организма, в то время, как более сильные поля вызывают эффекты по типу неспецифических адаптационных реакций. Эти данные коррелируют с многичисленными экспериментальными наблюдениями Л.Х.Гаркави (Гаркави и др., 1996) и других показывающими, что достаточно сильные магнитные поля от единиц до десятков мТл как постоянные, так и переменные с сетевой частотой (50 Гц) на уровне организма вызывают развитие неспецифических адаптационных реакций: стресса и антистрессовых реакций, что может вызвать самые различные типы ответа биосистемы на воздействие, в зависимости от предыдущего состояния объекта.

Существенный скачок в понимании процессов, лежащих в основе механизма биологического действия слабых МП, произошел в середине 80-х годов, когда Либовым и Блекманом с сотрудниками было обнаружено интересное явление, заключающееся в том, что слабое переменное низкочастотное МП становится биологически активным в присутствии параллельного ему постоянного МП. В роли такого поля может выступать повсеместное геомагнитное поле. Сочетание этих полей оказалось способным менять внутриклеточную концентрацию ионов кальция (Liboff, 1985,а,б; Blackmaxi, 1985,а,б), влиять на подвижность диатомовых

водорослей (Smith et al., 1987), воздействовать на условно - рефлекторную деятельность млекопитающих (Thomas et al., 1986),вызывать стимуляцию или подавление различных репарационных процессов (Blackman et al.,1994). Особенный интерес вызывает то, что эффект проявляется только на определенных частотах переменного МП, прямо пропорциональных величине постоянного поля и связанных с ним формулой циклотронной частоты для того или иного биологически активного иона ( Liboff, 1985,а,б; Blackman, 1985,а,б).

Существуют различные попытки понять механизм этого

flBneH№i(Liboff,1987; Lednev,1992; Zhadin,Fesenko,1991). Вероятно, именно этот механизм, названный "циклотронным резонансом" в биосистемах срабатывает при реализации некоторых биологических эффектов слабого поля. Появились десятки работ, в которых были обнаружены биоэффекты комбинированного действия слабых магнитных полей на различные системы при настройке воздействия на циклотронные частоты ионов кальция, калия, магния и других (см.обзор Леднев, 1996). В своих теоретических работах В.В.Леднев (Леднев, 1991 ) предположил, что биоэффекты, полученные в экспериментах Либова и других, могут быть объяснены, исходя из представлений о действии таких полей на связанные ионы (прежде всего кальция), регулирующие скорость ключевых для клетки Са -кальмодулин и протеинкиназа С - зависимых биохимических реакций ( Lednev, 1991, 1993, 1995; Леднев, 1996). Эта модель получила известность как гипотеза магнитного параметрического резонанса, в рамках которой МП вызывают прецессию оси вибрации иона Са - осциллятора в структуре белка относительно направления МП, и при определенном соотношении между временами жизни Са-осциллятора и параметрами МП, можно ожидать изменения сродства иона кальция и кальций-связывающего центра фермента. Модель В.В.Леднева дает детальные прогнозы величин и их соотношений для переменных и постоянных компонент МП, причем предсказания этой модели совпадают с рядом экспериментальных результатов автора

и его сотрудников, полученных в опытах с регенерирующими планариями ( Леднев и др., 1996; Тирас и др., 1996).

В теоретической модели М.Н. Жадина (Жадин, 1996) развивается несколько иная гипотеза, рассматривающая тепловое движение как важный компонент механизма действия слабого поля на связанный в макромолекуле ион, при этом делается попытка связать эффекты действия слабого МП с прецессией траектории теплового движения иона в макромолекуле. МП в этой модели вызывают перераспределение тепловой энергии между различными частями макромолекулы. К сожалению, эта концепция пока не дает количественный прогноз соотношения величин МП для реализации оптимального ответа системы на воздействие слабого МП, что затрудняет ее экспериментальную проверку. Следует отметить, что все перечисленные выше концепции и гипотезы указывают на необходимость настройки переменной компоненты действующего МП прежде всего на частоту, совпадающую с циклотронной частотой вращательного компонента движения иона в МП в вакууме, что хорошо согласуется с целым рядом экспериментальных данных.

Траектория заряженной частицы, движущейся в плоскости, перпендикулярной силовым линиям однородного МП, представляет собой окружность (или дугу окружности, если частица покидает поле). При направлении МП от наблюдателя, отрицательно заряженные частицы (электроны) движутся по часовой стрелке, а положительно заряженные частицы движутся против часовой стрелки. Частота обращения частицы по круговой траектории называется "циклотронной частотой", поскольку именно с такой частотой происходит круговое движение заряженных частиц в вакууме в МП циклотрона.

Формула расчета "циклотронной частоты" для заряженных частиц: -------------

2 71Ш

где: £ - частота в герцах;

q - заряд частицы в кулонах; В - индукция магнитного поля в теслах; ш - масса частицы в килограммах;

ту г =-------

ав

где: г - радиус окружности в метрах; у - скорость частицы в м/сек;

Формула для иона:

q Во уц =-------------

2 жт

Уц - циклотронная частота ( Гц ); q - заряд иона; т - мол.масса иона;

Во - величина постоянного магнитного поля (мкТл); Формула для ионов аминокислот: q - заряд иона;

т - мол.масса аминокислоты;

Формула для кластера ионов (Новиков, 1994):

О Во уц =------

2%М

С) - общий заряд кластера (0 = N q); N - число ионов в кластере; q - заряд одного иона;

Во - интенсивность постоянного магнитного поля (мкТл); М - общая масса кластера (М = N т); т - масса одного иона; N - общее число ионов в кластере;

Основными ограничениями этих теоретических работ является

рассмотрение специальных условий, игнорирующих роль водной фазы в биологических эффектах слабых МП. Вследствие этого не раскрываются потенциальные возможности избирательного действия слабых полей на огромное число органических молекулярных ионов в водных средах организмов, не учитывается возможность реализация кооперативных эффектов взаимодействия ионных систем

Несмотря на это, важно отметить, что направление исследований, заданное пионерскими работами А.Либова и К.Блекмана, и связанные с поиском особых резонансных условий в биосистемах, сделало принципиально возможным строгий теоретический анализ и прогноз возможных эффектов действия слабых МП. В то же время, экспериментальные результаты, полученные в этих лабораториях, касаются в основном действия относительно больших переменных компонент МП, которые составляют десятки мкТл, и в реальных условиях окружающей среды встречаются крайне редко. Присутствие подобных полей можно ожидать прежде всего в зоне высоковольтных линий и в зонах техногенных источников магнитного поля. Слабые геомагнитные и техногенные возмущения амплитудой от нескольких нТл до десятых долей мкТл, постоянно присутствующие в окружающей среде, в теоретических и экспериментальных работах этого направления не рассматривались.

В этой связи особое значение приобретают разработки, показывающие потенциальные возможности выраженного избирательного биологического действия очень слабых (порядка сотых долей мкТл) переменных компонент МП, обусловленного прежде всего эффектами на циклотронных частотах ряда органических ионов в водных растворах ( Новиков, 1994, 1996; Новиков, Жадин, 1994; Новиков, Лисицин, 1996; Карнаухов, Новиков, 1996). Сравнительно недавно этими авторами была обнаружена физико-химическая система воспроизводимо реагирующая на комбинированное воздействие слабых МП

содержащих коллинеарные постоянную (десятки мкТл) и очень слабую (сотые доли мкТл) переменную составляющие. В водных растворах аминокислот при наложении резонансных условий отмечены выраженные эффекты действия слабых магнитных полей: кратковременное увеличение тока, пропускавшегося через раствор, при действии переменной компоненты поля на циклотронной частоте ионной формы растворенной аминокислоты; конденсация аминокислот - образование в этих условиях устойчивых молекулярных продуктов олигомеров аминокислот -биологически активных пептидов. Авторами было высказано предположение, что обнаруженные эффекты являются важной частью механизма биологического действия очень слабых повсеместных геомагнитных полей, а также слабых искусственных полей низкочастотного диапазона. Последующие опыты на биологических объектах подтвердили такую возможность. Так, в частности , бы