Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов

Забережный, Алексей Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов"

'¿ООН 16070

На правах рукописи

Забережный Алексей Дмитриевич

Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов.

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора биологических наук

1Н

Москва, 2003 '

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии Медицинских Наук, в Научно-производственном объединении НАРВЛК, г. Москва и в научно-исследовательской лаборатории 'Муе111-Ьес1ег1с, США.

Научный консультант:

доктор биологических наук

НЕПОКЛОНОВ Евгений Анатольевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

УРЫВАЕВ Леонид Викторович

заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор

АЛЬШТЕИН Анатолий Давидович

доктор биологических наук, профессор

НАРОДИЦКИЙ Борис Савельевич

Ведущее учреждение:

Московский НИИ Вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе РАМН

Защита диссертации состоится 17 ноября 2003 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.20.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С дисйЬртацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им.

Д.И.Ивановского РАМН.

Автореферат разослан 16 октября 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук Н.П.Косякова

6НБЛИО«КА

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Создание инфекционных рскомбинантных геномов представляет собой весьма актуальную задачу для изучения многих РНК-содержащих вирусов, т.к. этот современный подход позволяет выявлять и изменять генетические детерминанты, связанные с биологическими свойствами инфекционных агентов. Это создает теоретические и практические предпосылки для создания новых штаммов РНК-содержащих вирусов с полезными свойствами для диагностики и специфической иммунопрофилактики вирусных инфекций. Конструирование инфекционных вирусных геномов относится к области «обратной генетики». Термин "reverse genetics" появился в вирусологической литературе в последнее десятилетие. В четвертом издании «Fields Virology» этот термин связывают с внесением мутаций в РНК-геномы вирусов, для чего РНК переводится в форму кДНК (созвучно с «обратной транскрипцией»). Появился также термин «создание системы обратной генетики» для того или иного вируса. Подразумевается создание матрицы кДНК, в которую можно вносить изменения и получать полный или дефектный РНК-геном вируса. Таким образом, обратную генетику можно определить как методический прием, посвященный воссозданию, конструированию функционального генетического материала (полный или дефектный вирусный геном) и обеспечению экспериментальных условий для его функционирования. Такая модель позволяет вносить изменения в генетический материал, а также варьировать факторы, влияющие на его функции. Она представляет собой инструмент для прямой экспериментальной проверки рабочих гипотез о молекулярных механизмах наследственности и факторах патогенности. Это особенно важно для исследования РНК-содержащих вирусов. В последнее время продемонстрированы революционные возможности обратной генетики в области молекулярной вирусологии.

В настоящей работе поставлены задачи определения генетических детерминант вирулентности и создания рекомбинантных РНК-содержащих вирусов на примере двух объектов: респираторно-синцитиального (PC) вируса человека и вируса классической чумы свиней (КЧС).

PC вирус вызывет тяжелую инфекцию дыхательных путей (брон\о-легочнмй синдром) в основном у детей раннего возраста. Она особенно опасна для пожилых людей и страдающих иммунодефицитом (Collins P.L. et al., 1996). Заболевание относится к пока нерегулируемым вирусным инфекциям и встречается в развитых и развивающихся странах, а создание эффективной отечественной вакцины и методов диагностики остается важной социальной задачей здравоохранения. PC вирус относится к роду Pneumovirus (Семейство Paramyxoviridae), его геном представлен единственной одноцепочечной (минус-цепь) молекулой РНК.

На сегодняшний день не существует коммерческой вакцины против РС-вирусной инфекции человека. Разработка инактавированных вакцин на основе различных штаммов PC-вируса не принесла ожидаемого результата (Murphy B.R. el al., 1994). П то же время живые вакцины на основе ослабленных штаммов других представителей семейства Paramyxoviridae (кори и паротита) эффективны и безопасны для человека. Поэтому предпринимаются попытки получить аттенуированные штаммы PC-вируса с использованием холодовой адаптации, химического (неспецифического) мутагенеза (Pringle C.R. et al., 1993; Crowe J.E. et al., 1994 a,b, 1996; Hsu K. et al., 1995; Randolph V.D. et at., 1994), а в последнее время - методами обратной генетики.

PC-вирус человека представлен двумя антигенными подгруппами (Л и В), поэтому желательно иметь универсальную вакцину для защиты от обоих типов. При помощи методов обратной генетики были сконструированы рекомбинантные РС-вирусы человека подгруппы Л, несущие гены G и F от PC-вируса человека подгруппы В (Cheng X, et al., 2001; Whitehead S.S. et al., 1999). Целью этих работ являлось получение гибридных вирусов двойной специфичности - кандидатов в вакцинные штаммы. В других исследованиях получен мутантный PC-вирус человека (Teng M.N., Murphy B.R., Collins P.L. et al., 2000), дефектный по генам NS1 и М2-2. Репродукция этого вируса была снижена в 10 раз в сравнении с репродукцией штамма дикого типа, однако .н уровни вирус-нейтрализующнх антител были снижены по сравнению с уровнями антшел, образующимися в результате естественной инфекции. Методами обратной генетики были созданы штаммы PC-вируса человека, которые синтезировали итперфсрон-гамма (mIFN- у) или интерлейкин-2 мыши (mIL-2)

(Bukreyev A. et al„ 1999, 2000). Интересен опыт создания гибридною вируса из компонентов трех родственных вирусов: вирусов парагриппа-3 крупного рогатого скота и человека и PC вируса человека (Schmidt A.C., McAulilTe J.M., Murphy B.R., Collins P.L., 2001). Аттенуация данного рекомбинантного вируса обеспечивалась тем, что в его основу был включен геном вируса парагриппа крупного рогатого скота, который имеет ограничения по репликации в организме приматов. Методами обратной генетики в рекомбинантный PC-вирус крупного рогатого скота на основе инфекционной копии его генома были встроены гены гликопротеинов РС-вируса человека вместо соответствующих генов в родственном вирусе {Buchholz UJ. et al., 2000). По замыслу авторов, новый вирус должен был размножаться в респираторном тракте шимпанзе и обеспечивать защиту от PC-вирусов человека дикого типа. Однако гибридный вирус не размножался в организме шимпанзе лучше, чем исходный РС-вирус крупного рогатого скота, а также не обеспечивал защиту от заболевания при контрольном заражении обезьян PC-вирусом человека.

Несмотря на разнообразие новых кандидатов в вакцинные штаммы РС-вируса, обладающих разной степенью иммуногенности и уровнем аттенуации, остается неясной природа самого явления аттенуации у PC-вирусов. Понимание молекулярных механизмов аттенуации позволило бы более целенаправленно конструировать новые вакцинные штаммы. Ряд исследований аттенуированных штаммов PC-вируса (Connors М. et al.,1995; Tolley K.P. et al., 1996) и вирусов парагриппа-3 (Ray R. et al., 1996) указывают на связь аттенуированных свойств с мутациями в гене РНК-зависимой РНК-полимеразы. Это свидетельствует о том, что нарушения функций !'1!К-полимеразы (транскрипция и репликация вирусного генома) могут быть ответственны за аттснуацито.

культуре клеток при сниженной температуре и претендующих на роль кандидатов в вакцинные штаммы. Для экспериментальной проверки роли найденных мутаций была создана модельная система (обратной генетики) на основе искусственных мини-репликонов PC-вируса, позволяющая вносить изменения в белки репликативного комплекса и в регуляторные элементы генома.

Другим объектом настоящего исследования является вирус КЧС, который распространен в разных регионах мира (включая Россию) и наносит огромный экономический ущерб во время массовых эпизоотий. Геном вируса КЧС (род Pestivirus) представлен единственной одноцепочечной (плюс-цепь) молекулой РНК. Для болезни характерно острое, хроническое или латентное течение, возможность трансплацентарной передачи вируса от матери к плоду, политропное поражение органов (включая систему иммуногенеза и клетки костного мозга, эндотелий сосудов). Вирус КЧС обычно не вызывает цитопатических изменений в культуре клеток, что определяет сложность его выявления и титрования.

Специфическая профилактика КЧС как правило осуществляется живыми вакцинами, приготовленными на основе китайского лапинизированного штамма С или других аналогичных вакцинных штаммов, что защищает животных от заболевания (Terpstra С., Wcnsvoort G., 1988). С целью профилактики КЧС возможно применение инакгивированных, а также рекомбинантных субъединичных вакцин, которые уступают жнвым вакцинам по протективной активности (Terstra С. et al., 1990; Hülst М. М. et al., 1993; Rumenapf Т. et al., 1991; Moormann R.J.M., 1991). Создание полноразмерного инфекционного клона вируса КЧС является важным инструментом для получения ответов на фундаментальные вопросы, касающиеся факторов вирулентности и патогеиности, молекулярных механизмов, вовлечённых в процессы цикла репродукции вируса. Подобный подход был успешно применён к ряду вирусов с РНК геномом положительной полярности, включая вирус КЧС (Moorman R.J.M. et al., 1996; Ruggli, N. et al., 1996; Boyer, J-C., 1994). Для настоящей работы представляет интерес создание инфекционной копии генома вакцинного штамма вируса КЧС, из-за необходимости создания отечественной маркированнной вакцины. Вакцинный штамм КС, взятый за прототип в данной работе, получен на

основе вакцинного штамма ЛК ВПИМВВиМ, который применялся п СССР па протяжении более 30 лет (В.Л.Сергеев, 1993). В 1997-2000 тг. было проведено летальное изучение биолог ических свойств и молекулярных характеристик данного пакпшшого штамма (Е.Л.Нспоклонов, 2000; Л.Д Забережный и др., 1999; Т.В.Гребенникова и др., 1998; Л.Н.Власова и др. 1999; В.В. Цнбезов и лр. 2000): геном штамма КС был полностью секвенирован, разработан молекулярный тест на оспопс ПЦР ( ГУ-9388-082-00008064-99, 18.01.99 ь), а изкже на основе ПЦР и рестриктного анализа для выявления и дифференциации вирулентного и вакцинного штаммов. Поверхностные гликопротенны вируса КЧС были синтезированы в бакуловнрусиой системе, на их основе создан иммуноферментный тест для выявления вирус-специфических антител (ТУ-9388-082-00008064-98, 08.12.98 г.). Таким образом, были созданы все предпосылки для создания новых атгснунровапных штаммов на основе штамма КС, пригодных для разработки маркированной вакцины против КЧС.

Цель и задачи исследований.

Работа посвящена конструированию функциональных вирусных геномов для решения фундаментальных и прикладных задач па примере двух РНК-содержащнх вирусов Цечыо работы бычо выявление генетических детерминант у респираторно-сипцитиальнога вируса чеювека. связанных с аттенуацней, термочувстпнтелыюстыо и адаптацией к сниженной температуре, а также конструирование маркированного рекомбинантного инфекционного генома вакцинно.-о штампа вируса кпассической чумы свиней Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1.Выявит!, в геноме реснираюрно-синцитиального вируса челопека молекулярные детерминанты, связанные с атгенуацей, термочувствительностыо и адаптацией к размножению при сниженной температуры, путем сравнения первичной структуры геномов вирулентного штамма и его атгенуированных производных.

2.11римснить экспериментальную модель, основанную на методах обратной генетики, для выявления функциональной роли обнаруженных генетических детерминант в формировании фснотипичсскнх изменений у РС-пируса, а также для

исследования гипотезы о связи уровней репликации и транскрипции генома с апенуацией РС-вицуса.

2.1 .Сконструирован. дефектные вирусные мини-геномы, содержащие регуляторные области генома РС-вируса, и экспрессирующие векторы, обеспечивающие синтез вирусных белков полимеразного комплекса. Внести мутации, обнаруженные в аттенуированных вариантах, в компоненты данной модельной системы.

2.2. На основе сконструированных мини-геномов получить дефектные варианты РС - вируса человека при одновременном заражении клеюк различными штаммами вируса-помощника, а также при одновременной трансфекции рекомбинантными плазмидами. Исследовать их инфекционность, параметры репликации и транскрипции при различных температурах, относительные количества положительных и отрицательных цепей РНК мини-1 еномов.

3. Разработать стратегию и осуществить сборку полноразмерной копии генома вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней в Е.соП и на его основе получить инфекционный вирус. Исследовать его ростовые и антигенные характеристики, наличие молекулярных маркеров. Подтвердить генно-инженерное происхождение рекомбинантною вируса определением первичной структуры его генома.

4. На основе рекомбинантного инфекционного генома сконструировать химерный вирус классической чумы свиней с замененным гликопротеином Е2 на гликопротеин Е2 из вируса диарреи крупного рогатого скота. Исследовать способность гибридного вируса заражать клетки свиного происхождения, несмотря на гетерологичный

главный оболочечный гликопротеин Е2. Подтвердить генно-инженерное происхождение гибридного вируса определением первичной структуры его генома.

Научная новизна работы.

Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома РС-вируса человека, относящегося к подгруппе В (штамм дикого типа 2В), и проанализированы особенности строения межгенных участков генома в сравнении представителей

подгрупп Л и В. Определены полные последовательности геномов 2 аттснуированпых производных штамма 2В и проведен их сравнительный анализ.

Установлено, что точечная мутация (Л^-Ьув)^! в гене РНК зависимой Р11К-полимеразы РС-вируса человека ответственна за ею термочувствительность

Из 2 мутаций (4С и 7и), обнаруженных в лндернои последовательности аттенуированного штамма 2В ЗЗР, замена 4-го нуклеотида (в-С), ранее известная как усиливающая промоторные функции в генноинженерных опытах, в реально существующем вирусе обнаружена впервые. Другая мутация состоит в дополнительном 7-м нуклеотиде (I)) в промоторной области и также обнаружена впервые. Подтверждено усиливающее действие этих мутаций по отдельности и в комбинации. Установлено, что изменения репродукции РС-вируса, обусловленные комбинацией мутаций в лидерной последовательности и в РНК зависимой РНК-полимеразе, связаны с изменениями уровня репликации, а не транскрипции вирусного генома.

Получена инфекционная копия генома отечественного вакцинного штамма КС вируса КЧС, а на ее основе - инфекционный вирус.

Получена гибридная копия генома, а на ее основе новый гибридный штамм вируса КЧС с замененным геном главного поверхностною гликопротеина Е2 на аналогичный I ен вируса диареи крупного ро! лого скота.

Получены генно-инженерные конструкции, обеспечивающие возможность «кассетных» замен в структуре инфекционной кДНК вируса КЧС, пригодные для конструирования новых гибридных и модифицированных вариантов с полезными свойствами.

Практическая значимость.

Выявлены генетические модификации, связанные с аттенуированными свойствами РС-вирусов и создана экспериментальная модель для проверки роли генетических модификаций при создании новых вакцинных штаммов. На основе результатов диссертационной работы разработаны и внедрены в производство диагностические тест-системы для определения вируса КЧС методом ПЦР и для выявления антител к данному вирусу в конкурентном ИФА. На основе отечественного

вакцинного штамма КС создан маркированный штамм вируса КЧС лля разработки модифицированной вакцины в сочетании с внедренными средствами диат ностики. Созданные гсппоипжспсрнме конструкции на основе генома штамма КС позволяют проводить дальнейшие генетические модификации при рабсис с цслыо изменения свойств вакцинного штамма.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту,

1. Определение и сравнительный анализ полной первичной структуры !еномов вирулешного шгамма 2В респираторно-синцитиального вируса человека и двух ипаммов, производных от пиамма 2В: аттенуированного термочувствительною (Гб) мутанта (2ВЗЗР), а также ревертировавшего по признаку термочувствителыюсти изолята (2В ЗЗГ" ТЯ1)

2. Выявление 2-х усиливающих мутаций (4С и 711), в лидерной последовательности РС-вируса и экспериментальное подтверждение их роли в усилении промоторной функции.

3. Экспериментальное подтверждение связи замены (Л^-ЬуБ) в положении 451 в аминокислотной последовательности РНК-зависимой РНК-полимеразы РС-вируса с потерей Тэ-призиака.

4. Экспериментальное подтверждение того, что компоненты решшкативного комплекса Тя-му танта РС-вируса функционируют при сниженной температуре (32°С) и не функционируют при нормальной температуре (37°С).

5. Подтверждение связи вирулентности РС-вируса с уровнем репликации вирусного генома в результате функционального анализа влияния обнаруженных мутаций на синтез геномной и анти-геномной РНК.

6. Создание полноразмерной копии генома вакцинного штамма КС вируса КЧС, а на его основе -инфекционного вируса.

7. Получение гибридного рекомбинантною генома вируса КЧС, содержащего ген главного поверхностного глнконротеина Е2 из родственного вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), а на его основе - инфекционното гибридного вируса КЧС/ВДКРС.

Апробация результатов исследований. Материалы доложены на мсслапиях Ученою совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановскою, Научно-техническою совета НПО IIAPBAK. на конференциях ВПИИЗЖ, в г. Владимире, 2003 и 1997; II Международной конференции «Биотсхноло! ия в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» в Москве, 2000, па 16-м и 17-м конгрессах международною общества по болезням свиней в "Эймсе, США, 2002 и Мельбурне, Австралия; на 5-м симпозиуме Европейского общества ветеринарной вирусологии п Ксймбридже, Великобритания. 2002; на 82-и и 84-н конференциях по болезням животных (CRWAD) в Сент-Луисе и Чикаю, CUJA, 2001, 2003; на 13-й, 14-й, 16-й, 17-й и 20-й конференциях Американскою общества вирусологии в Мэдисоне, США, 1994, Остине, США, 1995, Боземане, США. 1997, Ванкувере, Канада, 1998, Висконсине, США , 2001; на 2-й международной конференции по вакцинам и диагностике в Оксфорде. Великобритания, 2000; на конференции «Ветеринарная вирусология нового тысячелетия» в Брешин, Италия, 2000; на Симпозиуме OIE по классической чуме свиней в Бнрмшиеме. Великобритания, 1998; на 9-й международной конференции по вирусам с негативным геномом (РНК), Эсторил, Португалия. 1994.

Публикации по диссертационной работе. По теме диссертации опубликовано 32 работы в периодических изданиях, материалах научных конференций, приняты к печати 4. находятся на рецензии 2.

Объем к структура работы. Материалы диссертации изложены на 252 страницах машинописною текста и состоят из следующих разделов: о Г) юр литературы, материалы и методы, ре >ультаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, приложения и список литературы, содержащий источников. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами п 44 рисунками.

Автор приносит глубокую благодарность научному консультанту дб.н. Е.А Непоклонову, д.б.н. Т.И.Алиперу. к.б.м. Т.В.Гребешшковой, А H Власовой, В.В.Грабовецкому. O.I3.Елисеевой, дбн Г.К Воркуновой (ГУ НИИ вирусологии им. Д И.Ивановского), заслуженному деятелю науки РСФСР, профессору В.А. Сергееву, M M Дсмкиной. M.А.Коринкой, к б.н. М.И Мусиенко (НПО НАРВАК), Jean Adamus. Dr.

Joan Crowley (Wyctli-I.cdcrle, Нью-Йорк) m paitmciopoinnom нпушо-мекъшчеекмо и opraunjniiiioiniy 10 помощь n работе.

2.СОВСТПЕНИЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы н методы исследовании

Вирусы и клетки. Штаммы 213 PC-вируса (Bchhc, R.B., Richardson. L.S., el al.. 1977) был получен or д-ра R. Belshe (St. Louis University Medical Center. St. I.ouis. МО). Штамм PC-вируса дикого типа 2В был выделен в 1987 г. в Западной Вирджинии, США от новорожденною ребенка с респираторным заболеванием верхних дыхательных путей. Ослабленные варианты штамма 2В были получены от V. Randolph (Wyeth-Ledcrle, New York). Клеточная линия Vero была получена in коллекции ЛТСС. Шшмм КС вируса КЧС был получен oí проф. В. Л. CepiccBa.

История получения ослабленных штаммов PC-вируса История адаптации штамма 2В к пониженным температурам описана в литературе (Randolph, et. al., 1994). Вкратце, вирус пассировали 7 раз в первичной культуре клеток почки макаки резус при 35°С. Отбирали одну колонию и пассировали б раз (здесь и в дальнейшем в клетках Vero) при 36 °С, отбирали одну колонию и пассировали 12 раз при 36 "С. Вирус пассировали 7 раз при 26 "С, 6 раз при 22 "С, 20 раз при 20 °С. Отбирали одну колонию и пассировали 7 раз при 32 °С. Этот этап биологическою клонирования и наращивания повторяли еще дважды. Полученный вариант (2B33F) адаптирован к росту при пониженной температуре (32°С), а кроме тою приобрел 1смпературную чувствительность, т.е. его рост замедлен более чем в 10 раз при 39°С. Штамм 2B33F оказался аттенуированным для шимпанзе, хлопковых крыс и африканских зеленых мартышек, в частности, оц размножался в 10 - 1000 раз медленнее в верхних и нижних дыхательных путях по сравнению с предшественником- штаммом 2В. Штамм 2B33F вызывал образование вирус-иейтрализующих антител и был способным защитить крыс от контрольного заражения вирулентным штаммом (Randolph et al., 1994). . Методом выращивания штамма 2B33F в клеточной культуре при рестриктнвной температуре (39ПС) получили мутантнмй клон 2B33F(TS+) с восстановленными ростовыми характеристиками. Этот мутант утерял свойство

термочувствительное™, поэтому является ревертантом по данному признаку. Рло нельзя считап, в полном смысле ревертанюм к дикому гипу, т.к. данный шгамм сохраняет признаки адаптации к низким температурам, т.е. способен к нормальному росту при температуре 32°С. Вариант 2B20L. получали параллельно аналогичным способом с меньшим колличеством пассажей на этапе холодовой адаптации (5 пассажей при при 26 "С. 5 при 22 "С, 10 при 20 "С).

Очистка РНК ГС-вируса и синтез кДНК Клетки Vero заражали PC-вирусом с множественностью 0,1 (инфекционных частиц на клетку), затем инкубировали при 32"С, вирус пересевали после развития выражение! о цитопатического эффекта (I (ПЭ). Для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при амплификации внутренних фрагментов 1енома, выделяли тотальную РНК (Sambrook J. et al.. 1989). Для получения вирионной РНК проводили частичную очистку вирнонов PC-вируса и их концентрирование согласно следующей процедуре: инфицированные клетки собирали с 2 матрасов (75 см3) после 48 часов инкубирования, после чего суспензию клеток охлаждали до -70"С. Вирус осветляли с помощью центрифугирования в течение 20 мин при 8000g и осаждали 50% раствором полиэтиленгликоля (4:1) в течение 16 ч. при 4°С. После центрифугирования в течение 1 ч. при lOOOOg, осадок рссуспендировали в 20% растворе сахарозы на буфере NTE (10 шМ Tris-HCI. рН 8 0, 1 mM EDTA, 100 тМ NaCl) и наносили на ступенчатый сахарозный градиент (35-60% на буфере NTE). Вирус дважды очищали в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (вирус концентрировался на границе плотностей 3060%) в следующем режиме центрифугирования. 36 тыс. об/мин (ротор Ti40 Beckman) в течение 2 часов. Вирус переводили в буфер NTE методом диализа. Вирионную РНК экстрагировали фенолом и хлороформом, затем осаждали этанолом. Общую фракцию полиаденилированной РНК выделяли из клеток Vero, зараженых PC-вирусом, с использованием набора Librarian Kit (Invitrogen, США) на основе следующей аффинной цепи: "magnetic beads-streptoavidin-biotin-olido d(T)-poly (A) RNA". Комплементарную ДНК синтезировали при помощи олиготимидиновых праймеров oligo d(T),2.16.

Амплификация генома PC-вирусов методом П11Р. клонирование и секвестрование. Полный геном РС-пируса штамма 2В, за исключением концевых областей, амплнфицировалн в виде перекрывающихся фрагментов. Для клонирования каждого фрагмента смешивали 10 независимо полученных продуктов ПНР- Продукты Г1ЦР очищали препаративно в агарозном геле и клонировали в илазмилном векторе pSK+ (Stratagene, США), в клетках Е. coli DH5a. Фрагменты ссквенировали на обеих цепях в составе очищенной плазмидной ДНК с использованием Т7 Scqucnase или AnipliTaq polymerase (Applied Biosystems). Продукты ПЦР ссквенировали также напрямую, минуя стадию клонирования, также па 2 цепях, используя набор AmpliTaq FS kit (Applied Biosystems, США). Концевые последовательности генома (З'-лидерная и 5'-«трэйлерная» области) сшивали между собой в реакции лигиропания вирионной РНК с использованием РНК-лигазы фага Т4 (Promega, CILIA). Область сшивки концевых последовательностей амплифицировали методом ОТ/ПЦР с использованием олигоиуклеотидиых праймеров, специфичных к генам NS1 и L. Продукт ПЦР клонировали в E.coli, после чего выделяли из 15 независимых клонов и секвенировали. Для секвенирования З'-концевой области генома также применяли метод, описанный у Mink М.А. et al. (1991), по которому вирионная РНК была полиадснилирована, ч кДНК была получена с использованием праймера ojrnro-d(T). Лидерную последовательность амплифицировали с использованием ojiiiro-d(T) и NS-1 ген-специфических праймеров после оптимизации состава буфера для проведения реакции (Invitrogen, CUJA).

Конструирование мини-геномов на основе PC-вируса. Мини-геномы сконструировали при помощи амплификации гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT) с использованием 48-нуклеотидных праймеров с наращиванием длины продукта амплификации после каждого цикла. Праймеры имели перекрывание в 15 нуклеотндов на 3'-конце и их последовательное использование привело к созданию на концах гена CAT необходимых регуляторных областей PC-вируса, а также промотора РПК-полнмеразы Т7. Кроме этого, в конструкцию ввели тем же способом последовательность рибозима вируса гепатита дельта (HDV) и терминатор транскрипции фага Т7. Полученные продукты амплификации клонировали в

плазмидпом векторе pBluescript (Stratagene, США) и определяли их полную нуклеотидную последовательность, выбирая только полноценные клоны. Для внесения дополнительных концевых мутаций в мишысном использовали один раунд амплификации с праймерами, содержащими требуемые мутации, после чего продукт ПЦР непосредственно использовали в качестве матрицы для синтеза РНК.

Анализ экспрессии геиа хлора\<феникол-ацетилтра11сферазы (CAT), Для анализа экспрессии гена CAT определяли ферментативную активность его продукта в модификации хлорамфеникола. Клетки Vero культивировали в 6-луночных плашках, через 16-48 часов собирали вместе с ростовой средой. Образны приводили к одному объему, клетки лизировали замораживанием-оттаиванием 2 раза, тщательно перемешивали, добавляли хлорамфеникол, меченый МС, а также коэнзим A (n-Ruturyl-СоА) согласно методике производителя (Life Technologies, USA). После инкубации в течение 2 часов при 37"С, образцы экстрагировали ксиленом. Органическую фазу отбирали и анализировали при помощи хроматографии в тонком слое и авторадиографии на рентгеновской пленке. Активность фермента вычисляли по формуле: (N i+ N2)/ (N |+ N2+ N0), где N0 - радиоактивность фракции хлорамфеникола (имп/мин); N i+ N2 - радиоактивность 2-х фракций модифицированного хлорамфеникола (имп/мин). Проводили не менее 10 независимых экспериментов (в двух параллелях) для каждого мини-генома. Активность CAT измеряли количественно, пересчитывали на 1 mg белка и усредняли с использованием общепринятых статистических расчетов.

Выделение РНК вируса КЧС. ОТ-ПЦР. Общую РНК выделяли из зараженного клеточного монослоя с использованием тризола (Life Technologies, США), кДНК была синтезирована при помощи cDNA Cycle Kit (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. К 10 д! суммарной PIIK добавляли 15 /il реакционной смеси для ревертазной реакции, содержащей 10 тМ Трис-HCl рН8.3, 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 10 mM DTT, 0,2 мМ каждого dNTPs, по 10 рМ внешних праймеров, 25 ед M-MLV ревертазы. Инкубировали 1 час при 37°С для синтеза кДНК, и 5 мин при 95 °С для остановки ревертазной реакции. К 5 кДНК добавляли 20 fil реакционной смеси для ПЦР, содержащей 67 мМ Трис-HCl рП8.8, 16,6 мМ (NH„)2S04, 0,01% твин-20, 1,5

мМ MgCI2, 0,2 мМ каждого dNTPs, 10 рМ каждого праймера, 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы. Была применена методика "Hot start" с использованием ашител к ДНК-полимеразс TaqI. После этого, проводили 30 циклов реамплификации, используя в качестве матрицы 3-5 ¡Л смеси после первой амплификации. Каждый цикл ПЦР состоял из трех стадий: денатурация - 30 сек при 95°С (для первого цикла 2 мин, для последнего цикла 1 мин 30 сек), отжиг праймеров -30 сек при 62°С (для первого и последнего цикла 1 мин), полимеризации - 30 сек при 72°С (для первою цикла 3 мин, для последнего цикла 5 мин). Реакцию амплификации и реамплификации проводили но одной про1рамме. Результант ПЦР регистрировали после проведения электрофореза ДНК в 2% агарозном геле.

Определение первичной структуры продуктов амплификации. Продукты ПЦР очищали методом препаративного электрофореза в геле из легкоплавкой агарозы с использованием набора "Clean-up" (Promega, США). Секвенировали с использованием набора ABI PRISM"" (Perkin Elmer, США) и последующим анализом на автоматическом приборе ABl 377 (США). Праймеры для секвенирования располагались на расстоянии 200 нуклеотидов по каждой цепи, так что расстояние между соседними праймерами на противоположных цепях было 100 нуклеотидов

Компьютерный анализ первичной структуры нуклеиновых кислот проводили с помощью программ MacVector и AssemblyLIGN (Eastman Kodak, США). Для сравнительною анализа вирусных 1еномов использовали пакет программного обеспечения GCG (University of Wisconsin, США). Филогенетическое родство определяли с помощью пакета компьютерных программ PHYLIP версия 3.5с (Felcnstcin, J., 1993).

Синтез геномной РНК вируса КЧС для введения в восприимчивые клетки. Плазмидную ДНК, содержащую полную ДНК-копию вирусного генома, переводили в линейную форму . 1 ри помощи обработки эндонуклеазой рестрикции Srfl (Stratagene, США) точно в месте окончания последовательности, подлежащей транскрипции. Реакцию транскрипции проводили с помощью набора -Megascript™ High Yield Transcription Kit (Promega, США) в соответствии с инструкцией производителя. Реакция транскрипции останавливалась добавлением 8М раствора LiCI до

концентрации ЗМ. После перемешивания и инкубации при -20°С в течение 1 часа центрифугировали при +4 С (14 тыс об/мин) в течение 15 минут. Осадок промывали 0% этанолом и растпорялн в безпуклеазной воде (15-20 gl). Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически.

Трансфекиия клеток геномной РНК вируса КЧС. Использовали перевиваемые клеточные линии почки свиньи SK-6 (swine kidney), PK -15 (porcine kidney) и первичную культуру клеток ТЯ (тестикулы ягнят). Реакцию проводили в б-луночных плашках по следующей схеме: (1)2 мкг очищенной РНК смешивали со 100 gl DMEM; (2) смешивали 7-12 ц\ CellFECTFN® Reagent (Life Technologies, США) со 100 ц\ DMEM; (3) оба раствора смешивали между собой и инкубировали при комнатной температуре в течение 30-45 минут; (4) промывали клетки бессыворточной средой DMEM; (5) к смеси, содержащей комплекс CellFECTIN®Reagent-PHK, добавляли 1.8 ml бессывороточной среды DMEM и наслаивали на промытый PBS клеточный монослой; (6) инкубировали в СО^-инкубаторе при 37°С 10-24 часа; (7) заменяли РНК-содержащую среду на 4-5 ml среды DMEM, содержащей глутамин (0.3 mg/ml), антибиотики (пенициллин и стрептомицин в стандартных концентрациях) и 5-7% феталыюй сыворотки (Life Technologies, США).

Эчектропораиия клеток геномной РНК вируса КЧС. После 24 ч. культивирования клетки собирали при помощи трипсина и осаждали центрифугированием. Клеточный осадок с культурального матраса 75 см2 дважды промывали PBS и ресуспендировали в 1.5 ml PBS (или Hypoosmolar Electroporation buffer, Eppendorf, США). Параметры электропорании: напряжение - 500V, емкость -100 fiF, сопротивление - 720 Ohm, длина пульса/разряда - 0.7 msec. Для проведения электропорации помешали' 400-450 мкл клеточной суспензии в кювету для электропорации эукариот (Multiporator, Eppendorf, США) (расстояние между электродами 2-4 мм) и добавляли 13-15 ц1 очищенной РНК. После электропорации добавляли 0.5-1 ml DMEM. В культуральный матрас (25 см2) с клетками добавляли 5 ml DMEM и смесь из кюветы.

Выявление инфекиионного вируса КЧС в клеточных культурах методом иммунофлуоресценции. Клетки, зараженные вирусом (2-й и 3-й пассаж), переводили в

суспензию трипсином, адсорбировали на предметном стекле при 37°С в течение 2 часов в С02-иикубаторс, фиксировали в ацетоне (15 минут при 20°С), высушивали в течение ночи, добавляли 30 мкл вирус-специфических моноклинальных антител (MAB 303, Weybridge, Великобритания, разведение 1:1000 в PBS). Инкубировали 1 час при 37°С, промывали водой и высушивали. Добавляли антивидовой коныогат (anli mouse IgG FITC-labellcd, Sigma, США, разведение 1:64). Проводили контрастирующее окрашивание с реатентом Evans Blue, промывали один раз водой и высушивали в темном месте. Рсзульташ учитывали под иммунофлуоресцентным микроскопом под водной или PBS-глицсриновой иммерсией.

Выявление инфекционного вируса КЧС в клеточных культурах при помощи иммунофермеитного метода (PLA). Клетки РК-15, ТЯ, свободные от контаминации вирусом диареи КРС, высевали на 24 -луночные плашки (1.5х106 кл/мл) или на 96-луночные плашки (3xlOf' кл./ml) (Nunc, Denmark). После внесения и адсорбции вируса на клетках в течение 1.5-2 часов при 37°С клетки промывали средой Eagle's MEM, инкубировали в этой среде при +37°С в 5% С02 -атмосфере в течение 3-4 дней. Монослой клеток фиксировали 70% ацетоном в PBS в течении 30 мин при 4°С. После удаления фиксирующего раствора монослой клеток высушивали при 60°С и использовали для постановки реакции. В лунки планшетов вносили по 50 ß\ рабочего разведения гипериммунной сыворотки кролика, иммунизированного вирусом КЧС (Dr. Per Have, Дания) и инкубировали 1 час при 36°С. Промывали буфером PBST и вносили по 50 fi\ антивидового пероксидазного конъюгата в рабочем разведении, инкубировали при 36°С в течение 30-60 минут. Промывали буфером PBST и вносили раствор хромогена диэтилкарбазола, инкубировали при 25-30°С, 15-30 минут. Когда цвет проявлялся достаточно интенсивно, удаляли субстратсолержащий раствор и добавляли Н20 (по 100 мкл). Результаты реакции учитывали под микроскопом.

2.2 Результаты исследований

Определение первичной структуры генома штамма 2В РС-внруса человека и анализ генетической вариабельности представителей подгрупп А и В.

После определения первичной структуры генома штамма 2В появилась возможность сравнить полные геномы представителей подгрупп А и В. Геном штамма

2В (рис. 1) состоит из 15218 нуклеотидов, из которых 33,6% приходится на гуанидиновые и цитозиновые остатки (ГЦ). Подобно другим нпаммам РС-вируса, геном штамма 2В содержит 10 генов, выраженные участки, определяющие начало и конец каждого гена, а также межгенные последовательности (за исключением перекрывающихся генов М2 и Ь) и концевые некодирующис области (лидерную (Ьс) на 3'-конце и «трэйлернуто» (Тг) на 5'-конце). Характерные последовательности начала и окончания генов в штамме 2В консервативны в сравнении со штаммом Л2 (подгруппа Л) и с РС-вирусом крупного рогатого скота.

I. Тг

1-е N.41 N42 N Р М ЯН С! И М2|-г~1

...... II I I -

Рис. 1 Генетическая организация РС-вируса

Размеры межгенных областей в геноме штамма 2В варьируют в диапазоне от 3 до 56 нуклеотидов, причем все оканчиваются аденозиновым остатком за исключением межГенной области Ы-Р. Межгенные последовательности отличаются и по длине и по составу при сравнении РС вирусов, принадлежащих к подгруппам А и В и еще более отличаются от межгенных пространств у РС-вируса крупного рогатого скота. Между представителями подгруппы В (штаммы 2В и 18537) гомология последовательностей межгенных областей составляет 93-100% Лидерная последовательность на З'-конце генома штамма 2В содержит 44 нуклеотида подобно штамму А2. При этом первые 18 нуклеотидов совпадают, оставшаяся часть лидерной последовательности содержит 5 несовпадений (рис.3). Некодирующая область Тг на 5'-коице генома штамма 2В и его производных содержит 145 нуклеотидов, на 10 меньше, чем соответствующая область штамма А2. Последние 27 нуклеотидов области Тг полностью совпадают, а остальная часть имеет низкую гомологию между представителями подгрупп А и В (рис.2).

На основании сравнительного анализа каждого гена у представителей подгрупп А и В видно, что консерватизм нуклеотидных последовательностей генов в геноме РС-внруса уменьшается в следующем порядке: М-М2-Ь-М-Р-Р-Ы82-Ы5 1 -8Н-0. Гомология аминокислотных последовательностей между представителями подгрупп

Л и В варьирует от 53.2% до 96.2%, а между представителями подгруппы В (штаммы 2В и 18537) - от 88.6% до 99.7%.

Конец гена И штамм

ТДТДОТЩ1ТЛМЛЛ-ТТДААДДТСДТЛТДДТТТТТТДААТДАСТТТТЛСТСАЛСТЛ А2

1ЛТЛр£ТЛТТДЛЛЛЛЛТ-ЛТЛ---СЛЛАС—ТТТТС—ЛЛТАЛ—Т ТТАССЛТАТТ С, 2В

ДТССТАДАСТТЛТСДТТТТДАТСТТССАССААТАААТТТАДДСССТДАТСТДДТТСС А2

АТТССАДААТТАТСАТТТТДСТСТТДЛССССТТАДАТААААСТСТДАДАСТААСАДТ 2В

ТТТДТЛТЙТСТЛТТЛДСТЛЛДТТАССДСЛТДТТДСТТТТТСАСАСТТТТТТТСТСПТ Л2

ТЛТЛСЛТСТССАТТСЛСЛЛСЛСЛЛССДбАСЛТТДСТТТТТСЛСЛСТТТТТТТСТССТ 2В

Конец генома РС-вируса1

Рис. 2 Сравнение 5'-концевой «трэйлерной» (Тг) области I енома у 2 штаммов РС-вируса.

Любопытно отметить, что для двух наименее консервативных генов (811 и О) гомология аминокислотных последовательностей между штаммами 2В и Л2 меньше, чем гомология нуклеотидных последовательностей.

При сравнении гена в из штамма 2В и других штаммов РС-вируса была выявлена уникальная для штамма 2В и его производных деления в 6 иуклеотидов в позициях 486-491. Эта деления не привела к сдвигу рамки трансляции, а привела к потере 2 кодонов АЛА-АСС и соответственно аминокислот Ьуя-ТЬг. Обнаружена также вставка из 3 иуклеотидов АЛС в позиции 642-644. Эта вставка привела к включению дополнительной аминокислоты А.чп. Анализ вторичной структуры гликопротеина в показал, что делецня приходится на гидрофильную часть белка, которая выступает из клеточной мембраны.

Сравнительный анализ первичной структуры генома штамма 2В РС-вируса человека и его аттенуированных вариантов 2ВЗЗР и 2ВЗЗР(Т8+).

При сравнении полных геномов вирулентного штамма 2В РС-вируса и его аттенуированного и рспертнровавшего вариантов 2ВЗЗГ и 2ВЗЗР(Т8+) выявилось 23 нуклеотидных различия, которые суммированы в таблице 1.

Таблица 1.

Нуклеотидпые и аминокислотные различия, обнаруженные при сравнении геномов шлтаммов 2В, 2B33F и 2B33F(TS+) I'C-вируса.

Ген положени е нуклеоти да Нуклеотидные и аминокислотные замены

Нуклеотидпые замены Аминокислоты

2 В 2B33F 2B33FÍTS+)

3'- NCR 4 G С С неколирующий

3'- NCR 6 _ Дополнит, и Дополнит, и некодирующий

М 4175 А G G некодирутоший

М 4199 А G G некодирующий

SH 4329 А G G Phe-Leu (10)

SH 4409 А G G молчащая

SH 4420 А G G Ile-Thr (40)

SH 4442 А G G молчащая

SH 4454 А G G молчащая

SH 4484 А G G молчащая

SH 4497 А G G Stop-Gin (66)

SH 4505 А G G молчащая

SH 4525 А G G Ile-Thr (75)

SH 4526 А G G Ile-Thr (75)

SH 4542 А G G Stop-Gin (81)

SH 4561 А G G Leo-Pro (87)

SH 4 57 5 А G G Trp-Arg (92)

SH 4598 А G G молчащая

L 9559 с и и Arg-Lys (353)

L 9853 и; С и Lys-Arg-Lys (451)

L 12186 С и и Asp-Asn (1229)

L 14587 G А А Thr-Ile (2029)

L 15071 и С С не кодирующий

В самом начале генома, в З'-концевой нетранслируемой лилерной области в позициях 4 и 6 у штаммов 2ВЗЗР и 2ВЗЗР(Т8+) обнаружены -замена О/С и вставка и (рис. 3). Аналогичные мутации обнаружены в штаммах 2В20Ь и 2В20ЦТ8+).

Таким образом, мутации в лидерной последовательности привели к ее удлинению до 45 нуклеотидов и к замене в функционально важной регуляторной области.

Как видно из таблицы 1, все 14 мутаций в гене 8Н имеют одинаковый вид: это транзиции А-в. Две «молчащие» мутации, обнаруженые в гене М по соседству с

геном 8Н, имеют ту же природу А-О и являются частью кластера мутаций этого типа, расположенного между нуклеотидами 4175 и 4598.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1В 19 20 21 2? 23 24 25

з и G С G С - и и и и и и А С G С А и G и и G и и и

3 и G С G С - и и и и и и А С G С А и G А и G и и и

3 и G С С С и и и и и и и А С G с А и G А и G и и и

з и G С С С и и и и и и и А С G с А и G А и G и и и

- .

26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

G А А С G и А и и и G G и и и и и и и А С С С С 5"

G А А С G и G и А А G С и и и и и и и А С С С С 5'

G А А С G и G и А А G С и и и и и и и А с С С С 5'

А2 2В

2B33F

2ВЗЗПТ

S+)

А2 2В

2B33F

2B33FIT

S+)

Начало гена 1С

Рис. 3 Сравнительный анализ 3'-концевой нетранслируемой области генома штаммов А2, 2В, 2B33F, 2B33F(TS+) PC-вируса.

Скопление однотипных мутаций A-G представляет собой описанный феномен т.наз. «преднамеренных гипермутаций» (biased hypermutations). Он вызван клеточным механизмом модификации РНК, который основан на действии фермента аденозиндеаминазы (Bass et al., 1989). Из 14 мутаций в гене SH, 6 не приводят к изменению в составе аминокислот, б влекут аминокислотные замены, а 2 мутации (в 66 и 81 триплетах) приводят к исчезновению стоп-кодонов и увеличению размера зрелого полипептида с 65 аминокислот у штамма 2В до 103 у штамма 2B33F. Путем сравнения генов SH из PC-вирусов человека и животных установлено, что после первого стоп- кодона (триплет 66) степень консервации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей весьма низкая, данная область гена в процессе эволюции подвергалась случайным мутациям и являлась «молчащей» генетической информацией. Интересно отметить, что в гене SH штамма 391-2 PC-вируса овец активный стоп-кодон расположен в положении 82, т.е. рядом с «молчащим» стоп-кодоном в гене SH PC-вируса человека. Это свидетельствует о возможной активности данного стоп-кодона у PC-вирусов человека на ранних стадиях эволюционного процесса. Необходимо отметить, что ревертант 2B33F (TS+) и 3 других дополни гельпо исследованных параллельно полученных ревертировавших варианта

сохраняют те же мутации в гене 8Н, что и Тэ- мутант 2ВЗЗР. При этом Тб- мутант 2В20Ц полученный параллельно с 2ВЗЗР, вообще не содержит в гене БН отличий от исходного штамма 2В. Полученные данные свидетельствуют о том, что изменения в области БН у Тб- мутанта 2ВЗЗР не являются результатом селекционного отбора при холодовой адаптации, а скорее случайным мутационным событием, закрепившимся в линии 2ВЗЗР при культивировании и клонировании.

В гене РНК-полимеразы (Ь) обнаружено 5 мутаций. Одна из них расположена в некодирующей области этого гена. Остальные 4 мутации приводят к аминокислотным заменам. Главной находкой здесь является замена в позиции 451 в гене полимеразы: выявлена единственная мутация, различающая геномы Те- мутанта 2ВЗЗР и ревертанта 2ВЗЗР(ТЯ+). Эта мутация в свою очередь является реверсией: Ьуэ-А^-ЬуБ, И она ответственна за потерю термочуствительности.

Для экспериментальной проверки роли найденных мутаций в формировании аттенуированных свойств штамма 2ВЗЗР была сконструирована экспериментальная .модель (обратной генетики) с использованием дефектных мини-геномов РС-вирусов. Конструирование дефектных вирусных мнни-гсномов, содежащих репортерый ген хлорамфениколацетилтрансферазы и регуляторные области

из вирулентного и аттенуированого штаммов РС-вируса человека. Рабочая гипотеза заключалась в том, что аттенуированные свойства Тя-мутантов РС - вируса связаны с задержкой вирусной репродукции, которая может быть вызвана мутациями в концевых регуляторных областях вирусного генома (промоторах транскрипции и репликации), а также в белках полимеразного комплекса. Поскольку мутации такого рода были обнаружены, возникла необходимость

экспериментального подтверждения их роли в формировании свойств РС-вируса. На основе генома РС-вируса был создан мини-репликон КБУ-САТ (рис. 4), содержащий концевые регуляторные последовательности РС-вируса и единственный ген-репортер хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ), имеющий сигналы начала и окончания гена, взятые соответственно из первого (N8-1) и последнего (Ь) генов РС вируса. Для обеспечивания инициации и терминации синтеза РНК были использованы регуляторные области бактериофага Т7 и последовательность рибозима вируса

гепатита дельта (Kuo MYP, Sharmeen L, Dinter-Gottlieb G, Taylor J., 1988, Wu IiN, Lai MM., 1989), которая обеспечивала эффективное разрезание вновь синтезированной цепи РНК точно на последнем нукпеотиде мини-генома.

начало гена NS-I конец гена L

Терминатор рнбознм Лндсрна* лосл слт Тройпсриая поел П

Рис. 4 Генетическая схема мини-репликона РС-вируса с

Для проверки роли мутаций в З'-концевом промоторе РС-вируса, в лидернуто последовательность мини-репликона были введены мутации (Табл. 2), соответствующие штаммам 2В, 2ВЗЗР, Л2. Все 44 нуклеотида, составляющих лидерную область, взяты в точности как у штаммов-прототипов. В таблице 2 показана только консервативная промоторная область из первых 11 нуклеотидов. Как видно из табл. 2, в репликонах 2В/4С, 2В/7и, А2/4С мутации 4С или 711 введены в промоторы поодиночке для проверки их индивидуального действия.

Таблица 2.

Мини-геномы РС-вируса, использованные в работе.

Название Начало лидерной последовательности

2В UG CGC UUUUUU.....

2В/4С UG ССС UUUUUU.....

2B/7U UG CGC UUUUUUU.....

2B33F UG ССС UUUUUUU.....

А2 UG CGC UUUUUU.....

А2/4С UG ССС UUUUUU.....

Получение дефектных рекомбинаитных РС-вирусов и исследование их инфекцнонности, репликации и транскрипции при одновременном заражении различными штаммами вируса-помощника.

Для' поддержания функционирования мини-геномов рекомбинантные РНК-геномы вводили в клетки методом трансфекции при одновременном заражении РС-вирусом-помощником. Через 72 ч. после трансфекции клетки переводили в суспензию

и использовали для заражения свежего монослоя, чтобы проверить, передается ли активность гена CAT при пассировании. Экспрессию гена CAT определяли через 48'ч. после трансфекции или пересева. Установлено, что активность CAT сохраняется по меньшей мере в 10 пассажах. Это свидетельствует об инфскпионности мини-геномов, которые упаковываются в инфекционные дефектные вирусные частицы при посредстве вируса-помощника. Представленные на рис. 5 данные показывают активность мини-геномов «2В», 2B33F», «А2» и «А2/4С» при поддержке штаммов-помощников 2В, 2B33F и А2 при 2 температурах: 32°С и 37°С.

Таким образом, получена возможность сравнить между собой активность 3 промоторов PC-вируса при участии репликативных комплексов из гомологичных и гетерологичных штаммов.

Уровень экспрессии гена CAT сильно варьировал в зависимости от мини-генома, что следует рассмотреть подробнее (рис. 5). Так, при использовании штамма-помощника 2B33F при 32°С, отмечена 8-ми кратная разница в экспрессии для мини-геномов «2В» и «2B33F»; а также почти 3-х кратная разница в экспрессии для мини-геномов «А2» и «А2/4С». Таким образом, мутации «4С» и «7U» в лидерной последовательности увеличивали уровень экспрессии. При использовании штаммов дикого типа 2В и А2 в качестве помощников при 32"С, не было столь больших различий в уровнях экспрессии между мини-геномами «2В» и «2B33F»; «А2» и «А2/4С». Однако, при 37 °С происходит (рис. 5) существенное увеличение уровней экспрессии гена CAT в мини-геномах с мутациями «4С» и «7U» («2B33F» и «А2/4С») в опытах как с гомологичными, так и с гетерологичными штаммами вируса-помощника. Как и ожидалось, Ts-мутант 2B33F не сработал в качестве помощника при температуре 37°С.

Таким образом, замена "4С" и (или) дополнительный нуклеотид (7U) в лидерной последовательности 2B33F приводит к усилению промоторных функций.

£ <

Г-1/С

Мини-

геном

■ "2В"

■ "2В ЗЗР' □ "А2/4С"

■ "А2"

штамм помощник 2В

штзмм помошинк 2В ЗЗИ

штамм помощник Л2

т=зт"с

Мини-геном

итмм-помошнмк штамм-помощник иггамм-помошимк

Рис. 5 Анализ уровня экспрессии репортёрного гена СЛТ в опытах с мини-геномами.

Получение дефектных рекомбинантных РС-вирусов и исследование их ннфскционности, репликации и транскрипции при одновременной трансфекции рекомбииантными комплементирующими плазмидами..

Для того чтобы выявить результаты действия отдельных белковых компонентов репликативного комплекса на функционирование мини-геномов РС-вируса, данные компоненты (белки N. Р, М2 (ОШЧ), Ь) были введены вместо вируса-помощника при помощи экспрессионных плазмид (таблица 3).

Таблица 3.

Комплементирующие плазмиды для мини-геномов РС-вируса

N' Название Описание плазмиды

1 PRSV2B.N Содержит ген N из штамма 2В

2 pRSV2B.M2(ORF1) Содержит ген М2 (ОРИ) из штамма 2В

3 PRSV2B.P Содержит ген Р из штамма 2В

4 PRSV2B.L Содержит ген Ь из штамма 2В

5 PRSV2B33F.L Содержит ген Ь из штамма 2ВЗЗГ

6 pRSV2B33F TS(+)ih Содержит ген Ь из штамма 2ВЗЗГ ТЭ(+)

Гены были встроены (рис. 6) в плазмидный вектор под контролем промотора РНК полимеразы Т7. Для повышения эффективности экспресси генов, перед ними сразу после промотора был встроен сайт связывания рибосом (RBS). Клетки Нер-2, зараженные модифицированным вирусом осповакцины (MPV, штамм Анкара), который конститутивно синтезирует РНК-полимеразу фага Т7, подвергали трансфекции набором из 4 плазмид. Использовали гены N, Р, M2(ORFl) из штамма 2В (Табл. 3), а ген РНК полимеразы L был взят попеременно из различных штаммов PC-вируса в разных опытах.

Результаты экспрессии гена CAT учитывали через 24 ч. после трансфекции так же, как и в предыдущей серии экспериментов (при 32°С и 37"С). Активности CAT не зарегистрировано в контрольных клетках, зараженных MPV, а также в этих клетках после трансфекции набором из трех плазмид, но в отсутствие одной, кодирующей РНК-полимеразу (Рис. 7, А и В). Таким образом, без РНК-полимеразы РС-вируса, экспрессия гена CAT не обнаружена. Активность фермента проявляется при введении

в клетки всех четырех экспрессирутощих плазмид, что является необходимым и достаточным условием экспрессии гена CAT.

I.e NSI NS2 N Г М SII С F 142

I I I II I *-г

Ген РС-вируса

Промотор Т7 ' RBS Сайт пол нлдеи ил пропан мя

Рис. 6 Конструкции комплементирующих плазмид, созданных для поддержания репликации и транскрипции мини-генома в отсутствие инфекционного вируса-помощника

Для различных мини-геномов, различных РНК-иолимераз и при двух разных .значениях температур (32"С и 37°С) уровни экспрессии существенно различаются. Экспрессия мини-генома «2B33F» поддерживается всеми тремя РНК-полимеразами при температуре 32°С в равной степени. При этом экспрессия мини-репликона «2B33F» несколько выше, чем «2В». Уровни экспрессии мини-репликонов «2В/4С» и «2B/7U» оказались еще выше. Особенно это проявляется при температуре 37°С.

Таким образом, каждая из мутаций, найденных в лидерной последовательности штамма 2B33F (замена 4С и дополнительный урацил 7U, существенно повышает уровни экспрессии гена CAT, при этом, взятые вместе, они также повышают уровень экспрессии в сравнен-ш с мини-геномом «2В».

Уровни экспрессии мини-репликонов «2В/4С» и «2B/7U» оказались еще выше. Особенно это проявляется при температуре 37°С. Таким образом, каждая из мутаций, найденных в лидерной последовательности штамма 2B33F (замена 4С и дополнительный урацил 7U, существенно повышает уровни экспрессии гена CAT, при этом, взятые вместе, они также повышают уровень экспрессии в сравнении с мини-геномом «2В».

6 5

S 4

«О 4

o> a

g 3

E 2

Jul

□ мини-геном "2B"

■ мини-геном "2B33F"

■ мини-геном "28/40"

■ мини-геном "2Bf7Un

* 5

sc С

«о 4 о»

О.

I 3 i 2 Е а. ° 1

3?С

Л-

Пмини-геном "2В"

■ мини-геном "2B33F"

Омини-геном "2ВМС"

■ мини-геном "2B/7U"

Рис. 7 Влияние различных РНК полимераз на экспрессию репортёрного гена САТ в мини-геномах РС-вируса

А - клетки + MVA (отрицательный контроль) В - нет РНК полимеразы (отрицательный контроль) С - РНК полимераза из штамма 2В D - РНК полимераза из штамма 2В 33F F - РНК полимераза из штамма 2В 33F (TS+)

Сравним воздействие различных РНК-полимераз (из различных штаммов РС-вируса) на экспрессию гена CAT в мини-репликонах (Рис. 7). При температуре 32°С, РНК-полимераза из штамма 2B33F обеспечивает заметную экспрессию гена CAT на всех репликонах с мутантной лидерной последовательностью («2B33F», «2В/4С» и «2B/7U»), отказывая при этом в поддержке репликона «2В». Однако, при температуре

37°С РНК-полимераза из штамма 2B33F не работает ни с одним мини-репликоном. Это означает, что именно РНК-полимераза штамма 2B33F ответствена за его термочувствительные характеристики, и что именно мутации в лидерной последовательности позволяют термочувствительной РНК-полимеразе осуществлять заметную экспрессию гена CAT при пермиссивной температуре (32°С). Наиболее важным является наблюдение, что РНК-полимераза из-штамма-ревертанта 2B33F(TS+), отличающаяся на 1 аминокислоту от термочувствительной РНК-иолимсразы, обеспечивала стабильную и высокую экспрессию гена CAT на всех 4 мини-геномах при обеих температурах (Рис. 7, Е). Это служит прямым подтверждением того, что единственная реверсия в аминокислотной последовательности (Arg 451 Lys) ответственна за температурно-чувствительный фенотип, наблюдаемый у Ts-мутанта 2B33F.

Анализ транскрипции и репликации мини-геномов PC-вируса в опытах по гибридизации РНК.

В предыдущих разделах основным параметром, характеризующим функционирование мини-репликонов под воздействием переменных факторов, был уровень ферментативной активности CAT, свидетельствующий об уровне экспрессии гена. Экспрессия гена CAT в составе мини-репликонов в свою очередь зависит от степени репликации мини-генома: чем больше копий мини-генома, тем больше и генных продуктов. С другой стороны, количество белковых продуктов также зависит от количества мРНК, т.е. от уровня транскрипции гена. Представляет интерес определить, на какой из этих двух процессов {репликации и транскрипции) влияют . мутации,' найденные в регуляторных областях генома PC-вируса. Для ответа на поставленный вопрос использовали РНК-РНК гибридизацию с радиоактивным зондом в растворе с последующей РНК-азной обработкой с целью гидролиза однонитевых молекул РНК и «спасения» дуплексов.

Гибридизационный РНК-зонд, состоящий из 347 нуклеотидов (Рис. 8), представлял собой минус-цепь РНК и был способен гибридизоваться как с антигеномной РНК, так с мРНК, т.е. выявлять те мишени, которых изначально.в

клетки не вводили, а которые образуются в процессе репликации и транскрипции мини-геномов РС-вируса.

347 нуклеотндов

310 нуклеотидов

265 нуклеотидов

--—гргтт—гг—I-;-

Терминатор T7 рибозим Лндернйл tiocrt 1 CAT + концевые

Рис. 8 Гибридизационные зонды для анализа геномной и информационной РНК. ЬГибриднзационный зонд на основе РНК • 2 Защищаемая от РНК-аз часть антигеномной (+иепн) РНК З.Защищаемая от РНК-аз часть м РНК

Последовательность мини-генома показана в составе плазмидного репликона и закрашена серым цветом. Положение гибридизационного зонда не совпадает с началом мини-геномома, образуя при отжиге участок одноиитевой РНК длиною в 37 нуклеотидов. После РНК-азиой обработки данный участок зонда, а также однонитевая часть на З'-конце плюс-цепи антигеномной РНК разрушались, что приводило к образованию РНК-РНК дуплекса длиною в 310 пар нуклеотидов. При гибридизации данного зонда с мРНК, начинающейся с транскрипционного старта в гене CAT, неспарившийся одноиитевой участок зонда был длинес -82 нуклеотида, а после РНК-азной обработки образовывался РНК-РНК дуплекс из 265 пар нуклеотидов.

После введения мини-репликонов (таблица 4) с комплементирующими плазмидами, клетки собирали через 24 часа инкубации при 37°С. Тотальную РНК из клеток выделяли и подвергали гибридизации с меченым 32[Р] РНК-зондом. Проводили анализ радиоактивных дуплексов методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим подсчетом радиоактивности в разделяемых фракциях РНК.

Основным результатом данных опытов является наблюдение о соответствии количества антигеномной РНК и мРНК для каждого мини-репликона. Это означает, что возрастание уровня экспрессии гена CAT связано с одновременным и

пропорциональным увеличением количества антшеномной и матричной РНК. Таким образом, следует предположить, что возрастание уровня экспрессии lena СЛТ связано именно с ростом числа копий гена, т.е. с усилением репликации. Рост транскрипции является вторичным фактором, вызванный ростом репликации. Опыты по гибридизации также подтверждают усиливающее действие мутаций 4С и 7U.

Таблица 4

Относительные количества антигеномной РНК и мР1 1К при репродукции мини-

геномов РС-вируса.

Мини-геном

«2B33F» «2В» «2В/1С» «2B/7U» «2B33F"

Набор плазмид RSV2B.N RSV2B.P RSV2B.M2 RSV2B.L RSV2B.N RSV2B.P RSV2B.M2 RSV2B.L RSV2B.N RSV2B.P RSV2B.M2 RSV2B.L RSV2B.N RSV2B.P RSV2B.M2 RSV2B.L RSV2B.N RSV2B.Р RSV2B.H2

Антигеномная РНК (дуплекс СЮ п.н.) ++ + ++ ++ -

мРНК (дуплекс 2 65 п.н.) ++ + ++ ++ -

Молекулярный анализ вакцинного штамма КС вируса КЧС как прототипа для создания маркированного штамма на основе полноразмерной инфекционной копии его генома.

Была определена первичная структура полного генома штамма КС. Последовательность депонирована в базе данных ОепВапк под номерами АИ 132116, АР099102. Оболочечные гликопротеины данного штамма могли бы служить кандидатами для введения антигенных маркеров. Для настоящей работы представляет интерес более детально проанализировать структуру генов трех оболочечных гликопротеинов.

Фрагмент генома штамма КС, кодирующий оболочечные гликопротеины Ете, П1,

Е2, (Рис. 9) состоит из 2379 нуклеотидов (позиции 1148—3526 по карте генома) и имеет следующее процентное содержание каждого нуклеотида: 29.6% Л, 21,5% С, 26,7% С, 22,2% и.

5" N"" С Е"" Е1

-ШШМ1Ш

Е2 Р7 NS2 NS3 NS4NS4B NS5A

NS5B

Рис. 9 Положение генов оболочечных гликопротеипов (затемнены) в составе генома вируса КЧС

Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности (Таблица 5) подтвердил, что- наиболее вариабельным является гликопротеин Е2, менее вариабельны два других гликопротеина.

Таблица 5.

Гомология (в %) нуклеотидных и аминокислотных последовательностей штамма КС с референтными штамма вируса КЧС

Штамм вируса КЧС Erns - E2 Erns El E2

нукл. а. к. нукл. a. к. нукл. a. к. нукл. а. к.

ALD 93, 9 93, 6 9, 4 95,0 96,2 95, 6 92, 5 91,6

САР 93, 6 93,2 93, 3 95, 0 95, 6 94,0 92,7 91, 6

Riems 92,2 91, 9 92,8 92, 9 93, 6 92, 9 91,2 90, 3

GPE 93,7 93,4 93,8 94,2 95,8 95,6 92,7 91, 9

Brescia 94, 6 94,3 93,3 94,2 96, 9 95, 1 94, 3 94, 1

Glentorf 93, 6 93, 3 93, 3 95, 0 95, 4 94, 0 92, 9 91, 9

Р97 85, 6 90, 9 87, 2 92, 9 85,0 92, 3 84,9 88, 9

Alfort87 94, 2 93, 6 94, 6 95, 0 96, 2 95, 6 92, 9 91, 6

AlEort Tub. 84,9 91, 3 87, 6 94,2 84, 6 92, 3 83, 3 88,9

C-strain 92, 2 91, 9 92, 9 94, 9 93, 4 92, 3 91,2 90, 3

Результаты филогенетического анализа (рис. 10) показывают, что штамм КС находится в подгруппе 1.1 по европейской классификации (P. Lowings и др., 1996) вместе с референтным штаммом Brescia. На основе филогенетического анализа российских полевых изолятов вируса КЧС и сравнения первичной структуры генов штамма КС с референтными штаммами был разработан тест для идентификации вакцинного штамма на основе ПЦР и рестриктного анализа.

I ¡-ОС. национальная"} БИБЛИОТЕКА I j С. Петербург I

' 09 J00 «г I

ALIУ

Рис. 10 Результаты филогенетического анализа на основании первичной структуры I енов оболочечных белков вируса КЧС.

При оценке потенциальных антшенных свойств гликопротеинов Пт\ El и Е2 учитывались: наличие остатков цистеииа, сайты потенциального гликозилироваиия и взаимное расположение кислых, основных и гидрофобных аминокислот. Аминокислотная последовательность гликопротеинов ЕГЛ5, El и Е2 в сумме имеет 30 цистеиновых остатков, 13 консервативных сайтов потенциального гликозилироваиия, которые не являются уникальными для штамма КС, она содержит 17 специфичных для этого штамма аминокислот, из них 2, 5 и 10 приходятся на белки Ems, El и Е2 соответственно. Из 3 антигенных доменов — А, В и С (van Rijn, Р.А., и др. 1996), выделяемых на гликопротеине Е2 вируса КЧС, антигенная единица «В — С» расположена в N-концевой части белка и является менее консервативной и интересной с точки зрения дифференциальной серологической диагностики. У штамма КС наблюдаются две уникальные аминокислоты в положениях 706 (Glu -» Lys) и 734 (Lys -» - Arg) (участок «В —■ С»), что потенциально может повлиять на изменение антигенной специфичности. С помощью компьютерного анализа было проведено сравнение величины "индекса антигенности" поверхностных гликопротеинов вакцинного штамма КС, под которым подразумевается величина, • - 34

учитывающая гидрофобность, вероятность поверхностного расположения, гибкость и расчетную вторичную структуру аминокислотной цепи (Jameson В. Д., Wolf 11.1988). Выявлено 4 участка, в которых по величине "индекса антигенности" штамм КС отличается от остальных референтных штаммов. Один участок обнаружен в аминокислотной последовательности гликопротеина Е"" (аминокислоты 479-487), три остальных (881-883, 972-982, 991-992) содержатся в гликоиротеине Е2. В ходе исследований гликопротеин Е2 был синтезирован в бакуловирурной системе и использован для разработки иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу КЧС. Разработанная тест-система не выявляет антитела к родственному вирусу диареи КРС. С учетом представленных данных гликопротеин Е2 можно рассматривать как потенциальный антигенный маркер при разработке маркированного штамма вируса КЧС.

Сборка полпоразмерной копии генома вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней в E.coli.

Стратегия сборки полпоразмерной копии генома вируса КЧС была разработана благодаря полной информации о первичной структуре генома штамма КС. Во-первых, результаты анализа первичной структуры генома позволили построить его рестриктную карту и определить уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, по которым велась сборка генома. Во-вторых, все фрагменты кДНК генома, использованные для его сборки в бактериальной плазмиде, были также подвергнуты секвенированшо, после чего их нуклеотидные последовательности сравнивались с последовательностью генома штамма КС. Эта мера необходима для того, чтобы не внести случайные мутации, образующиеся на стадии Г1ЦР, в конечный рекомбинантный вирусный геном. Геном штамма КС вируса КЧС имеет 12,3 тыс.оснований. Удобно расположенными оказались сайты рестриктаз BglH и Sfil. Они отстояли от 5'-конца на 2964 и 8101 нуклеотидов. Полный геном был амплифицирован в полимеразной цепной реакции в виде 3 перекрывающихся фрагментов (Рис. И). Для амплификации использовались олигонуклеотидные праймеры, комплементарные геномной последовательности, а также специально разработанные концевые олигонуклеотиды.

пил w.'ai.yiwffWMww у;

3 тыс. нукл. Sali Bglll (2964)

7 тыс. нукл.

ЦЩШ'У г у «Т.1-"' И'Г

»3

Sfil (8101)

5 тыс. нукл.

Sfrl-Xhol

Рис. 11 Фрагменты генома вируса КЧС, использованные для сборки его копии

Концевые фрагменты кДНК в копии вирусного генома играют ключевую роль для получения инфекционного вируса. С одной стороны, на 5'-конце, должегг присутствовать промотор ДНК-зависимой PIIK полимеразы, обеспечивающий синтез РНК, начиная с первого тгуклеотида вирусного генома. С другой стороны, на 3'-конце, вновь синтезированная цепь РНК должна оканчиваться точно на последнем нуклеотиде вирусного генома. Для достижения этого результата использовали сайт эндонуклеазы рестрикции для точного разрезания матричной молекулы ДНК непосредственно перед синтезом РНК. Для клонирования копии генома вируса КЧС пол контролем промотора фага Т7 и для обеспечения синтеза полноценного РНК-генома in vitro, были сконструированы следующие последовательггости концевых фрагментов ДНК. Ниже приведегго начало (5'-концевая часть) генома:

5'- TGACGTCGACAGATC TTAATACGACTCACTATA GTATACGAGGTTAGTT... Одиночным подчеркиванием выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Sali. Двойньгм подчеркиванием выделена последовательность промотора фага Т7. Сразу после промотора начинается транскрипционная область. На следующей схеме приведен конец генома (З'-концепая его часть):

...ААТТТССТ AACGGCCC*GGGCTCGAGCATT-3' Одиночным подчеркиванием выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Xhol. Звездочкой показагго место разрезания ДНК при помощи эндонуклеазы рестрикции Sfrl. В этом месте заканчивается транскрипционная область, поэтому применение данной рестриктазы позволяет точно отрезать вирусный геггом на его 3'"-конце. Приведенная стратегия позволяет собрать (по сайтам Sali- Xhol) полный геном вируса КЧС в плазмиде Ecoli, обеспечивает возможность его точного вырезания гга З'-конце (при помощи Sfrl) и синтеза полной копии РНК точно с начала транскрипционной области.

Для сборки генома был использован известный плазмилный вектор рЛСУС177, состоящий из 3941 нуклеотидных пар, из которого был удален фрагмент, ограниченный сайтами ЛаШ, ХЬо1. При обработке плазмиды данными рсстриктазами образовывались фрагменты ДНК, содержащие 2329 и 1612 нуклеотидных пар. Фрагмент из 2329 нуклеотидных пар был использован для дальнейшей работы в качестве основы для бактериального вектора. Для встраивания полилинкера, специально предназначенного для сборки кДНК-копии генома штамма КС, были синтезированы комплементарные олигонуклсотиды, образовавшие после отжига нолилипкср (МСЙ), содержащий следующие сайты рсстрикки: Лп1П-8а11-1^111-8П1-БМ-ХЬо!. После встраивания данного фрагмента в плазмиду был получен вектор, содержащий 2366 нуклеотидных пар, специально для сборки вирусного генома. Три описанных выше фрагмента генома были встроены в вектор по отдельности. Всего было получено 244 плазмиды. После проверки правильности клонирования при помощи рестриктного анализа было отобрано 42 плазмиды. Полученные клоны были секвенированы по одному до тех пор, пока один из клонов, не совпадал по первичной структуре с исходными последовательностями генома штамма КС. Отобранные 3 клона, не содержащие мутаций, были использованы для сборки полного генома.

Получение маркированного генома вакцинного штамма путем замены гена Е2 в геноме вируса КЧС (штамм КС) на ген Е2 вируса диареи крупного рогатого скота.

Была разработана и использована стратегия, проиллюстрированная на рис. 12.

Этап 1. Из исходной конструкции, содержащей полноразмерную ДНК-копию генома штамма КС были вырезаны гены Е2, р7, N82 - полностью и часть гена N83 по уникальным сайтам рестрикционных эндонуклеаз N861 и АссШ. Размер оставшейся части генома - 11632 п.н. Одновременно был получен ПЦР-продукт с праймерами: 5'С8 (содержащим вводимые рестриктные сайты N861 и ВббНН) и 3'С8 (содержащим рестриктный сайт АссШ). Матрицей для наработки данного продукта служила исходная полноразмерная копия генома штамма КС. Размер продукта - 1971 п.н. В нем содержались гены р7, N82 и частично - ген N83.

Этап 2. После обработки данного продукта ПЦР рсстриктазами NacI и ЛссШ, он был лигирован с оставшейся частью генома. Между рсстриктазами Nael и ЛссШ в данной конструкции содержался дополнительный (введенный) рсстриктный сайт BssIIII. Размер конструкции - 13603 п.н. Она представляет собой восстановленный геном штамма КС без гена Е2 и с сайтами Nael BssHII, расположенными по краям этого отсутствующего гена. Данная конструкция, таким образом, представляет собой универсальную «кассету» для встраивания чужеродных генов по месту гена Е2 по сайтам рестриктаз Nael и BssHII.

Этап 3. Был получен ПЦР-продукт с праймерами: 5'NADI, (содержащим рестриктный сайт Nael) и 3'NADL (содержащим рестриктный сайт BssHII). Матрицей служила РНК вируса диарреи КРС (цитопатогенный штамм NADL, полученный из Национального центра болезней животных: NADC, Iowa). Размер продукта - 1112 п.н.

Конструкция, полученная на втором этапе, и ПЦР- продукт, содержащий ген Е2 из вируса диарреи КРС были обработаны рестриктазами Nael и BssHII и лигированы. После трансформации E.coli, клоны были проверены рестриктным анализом, и отобраны для дальнейшей работы. Отобраные клоны были проверены в реакциях ПЦР и рестрикции и переданы на хранение в лаборатории Молекулярной диагностики Института вирусологии им. Д.И.Ивановского в виде нлазмид и бактериальных культур. Размер конструкции - 14676 н.н. Она представляет собой химерный геном вируса КЧС (штамм КС) с замененным геном главного оболочечного гликопротеина Е2 на ген Е2 вируса диарреи КРС (штамм NADL), сайты протеолитического расщепления Е1/Е2 и Е2/р7 сохранены как в исходном вирусе КЧС. Инфекционность данного химерного генома проверяли в опытах по трансфекции клеток. Конструкция, полученная на втором этапе, и ПЦР- продукт, содержащий ген Е2 из вируса диареи КРС были обработаны рестриктазами Nael и BssHII и лигированы.

I этяп

V с F."" Fl F2 NS2 NS3 N44 NS4B NS*A NS<H У

Nacl B^IIII AccIII

Nacl AccIII

5' N'~ С E~ El ! NS3 NS4 NS4B NSSA NSiR 3'

E2 NS2

liw?

Nacl BkHTI

5' N»~ С F.~ El , , NS2 N43 NS4 NS4R NS^A NS<B 3'

Nacl , BüHII

5' С F."" El NS2 NS3 NS4 NS4B NS4A NS«B 3'

Nacl B«HII AccIII

V PC" С E~ El EJ NS2 NB3 NS4 NS4B NS4A N44B 3'

►-^¿-i'^^Uâiiti^^'iiii.-ilMMBw-iiii[ ti (tri^

Рис. 12 Получение гибридного вируса классической чумы свиней с геном Е2 из вируса диареи крупного рогатого скота.

I. Методом ПЦР был получен фрагмент (1971 п.н.) с введёнными сайтами: Nael и BssHIII на 5'-конце и AccIII на З'-конце.

II. В исходной конструкции были вырезаны гены Е2, р7, NS2 и часть гена NS3 по уникальным сайтам Nael и АссШ.

III. Ген Е2, полученный из ВД КРС, вводится в геном инфекционной копии вируса КЧС методом последовательного клонирования.

Получение рекомбипантных вирусов: вируса КЧС и гибридного вируса КЧС/ВДКРС на основе инфекционных копий их геномов.

Плазмиды, содержащие полные геномы вируса КЧС (pCSIC-l2F) и химерного вируса КЧС/ВДКРС (pCSIC-20H), переводили в линейную форму при помощи обработки эндонуклеазой рестрикции Sfrl и использовали для синтеза РНК-копии генома при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7. Полученную очищенную РНК использовали для проведения трансфекции и электропорации. Для данных экспериментов использовались перевиваемые клеточные линии почки свиньи SK-6 (swine kidney), РК -15 (porcine kidney) и первичная культура клеток ТЯ (тестикулы ягнят). Через 3 суток после трансфекции клеточный материал использовали для заражения свежего монослоя. Через 48-72 часа после заражения наличие рекомбинантного вируса КЧС и гибридного рекомбинантного вируса КЧС/ВД КРС подтверждалось при помощи прямого иммунофлуоресцентного анализа. Таким образом, инфекционность рекомбинантной РНК была доказана в опытах по трансфекции клеток. Полученный рекомбинантный вирус КЧС не отличался по росговым характеристикам от своего прототипа, штамма КС, накапливаясь в тех же титрах. Гибридный вирус КЧС/ВД КРС выращивался параллельно. Данный вирус заражал клетки свиного происхождения и по накоплению не отличался от вируса КЧС. Данные результаты свидетельствуют, что гибридный вирус способен размножаться в клетках свиного происхождения, взаимодействовать с мембраной клеток и выходить в культуральную жидкость. Несмотря на введение гетерологичной последовательности гена Е2 ВД КРС, вирус не изменил клеточного тропизма. Стабильная репликация обоих вирусов подтверждалась методом прямого иммунофлуоресцентного анализа в течение семи пассажей.

Идентификация рекомбинантных вирусов: вируса КЧС и химерного вируса КЧС/ВД КРС была проведена при помощи метода ОТ-ПЦР и секвенирования. Было установлено, что вирус КЧС, полученный на основе рекомбинантного генома (pCSIC-12F), является штаммом КС и содержит уникальные нуклеотидые маркеры, введенные при сборке инфекционного генома. Аналогичным образом было показано, что

гибридный рекомбинантный вирус КЧС/ВД КРС, получений на основе инфекционной копии генома (рС81С-20Н), является штаммом КС с замененным геном Е2, который точно соответствовал гену Е2 вируса ВД КРС с сохранением уникальных рестриктных сайтов и нуклеотидных замен, введенных п ходе генно-инженерных манипуляций. В дальнейшем при наработке двух рекомбинантных вирусов (КЧС И КЧС/ВД КРС) использовался быстрый метод идентификации на основе ПЦР и рестрикпюго анализа (рис.14). В продукте ПЦР на основе гена Е2 размером 1724 п.н. было подтверждено (в отличие от вируса КЧС) отсутствие сайта ЕсоШ у гибридного штамма вируса КЧС/ВД КРС и наличие искусственно введеиног о сайта ВзбИН.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 14 Проверка клеточных культур, заражённых рекомбинантными вирусами, методами ПЦР и рестриктного анализа фрагментов ДНК.

1,2,7- ПЦР-фрагменты (1724п.н. при анализе рекомбинаитного вируса КЧС (С51С-12Г): исходный (1), обработанный рестриктазой ЕсоШ (2), обработанный рестрикгазой ВйбНН (7); 3,6,8- ПЦР-фрагменты при анализе рекомбинантного вируса КЧС/ВД КРС (С81С-20Н): исходный (6),обработанный рестриктазой ЕсоШ (3), обработанный рестриктазой В«! III (7); 4,5- маркеры молекулярного веса: ?ЛЗМЛ/ЕсоЮ (4), ШЫА/ЕсоШ+НшсШ! (5).

Таким образом, молекулярно-биологическими методами была доказана стабильность репликации гетерологичной последовательности в составе гибридного (химерного) генома в культуре клеток. Отличительной особенностью гибридного рекомбинантного вируса КЧС/ВД КРС от природного вируса КЧС является его способность вызывать цитопатическийй эффект, образовывая характерные вирусные бляшки (рис. 15).

Гибридный вирус КЧС/ВД КРС является новым вирусом с измененными свойствами. Он получен на основе кДНК вакцинного штамма КС вируса КЧС, которая позволяет вносить дальнейшие генетические изменения с целью получения полезных свойств вакцинного штамма.

Рис. 15.Демонстрация цитопатогегшости гибридною рекомбинантного вируса КЧС/ВД КРС в культуре клеток РК-15. Л. Микрофотог рафия участка клеточного лизиса (вирусной бляшки). Б. Лнтиген-содержашие клетки в том же участка после иммунофлуоресцент ного окрашивания.

3. ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ первичной структуры полного генома вирулентного штама 2В респираторно-синцитиального вируса человека и двух его вариантов: аттенуированого термочувствительного (Те) мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2ВЗЗР), и его рсвертанта по Те признаку (2В ЗЗР ТЯ+), обнаружено 23 нуклеотидных различия при сравнении геномов 2В и 2В ЗЗР и 1 различие при сравнении геномов 2В ЗЗР и 2В ЗЗР Т8+.

2. Показано, что в геноме Тэ-мутанта при сравнении с геномом исходного вируса:

- 16 мугаций располагаются в области гена малого гидрофобного белка БН , все они представляют собой транзиции типа (А-О) и приводят к 6 аминокислотным заменам и заменам в 2 последовательных стоп-кодонах в положениях бб^ор-СЛп) и 81(81ор-01п), что увеличивает размер полипептида с 65 до 103 аминокислотных остатков;

- 2 мутации впервые обнаружены в консервативной промоторной области лидерной последовательности: замена 4-го нуклеотида (в-С) и включение дополнительного 7-го нуклеотида (1)). Установлено, что обе мутации вместе и по отдельности приводят к 4-10 кратному усилению промоторных функций.

3. Установлено, что различие геномов аттенуированного штамма 2В ЗЗР и его ревертанта по Т$ -признаку (2В ЗЗИ ТБ+) заключается в одной нуклеотидной замене (11-С) в положении 9853. Эта мутация приводит к замене (А^-Ьуя) в положении 451 в аминокислотной последовательности РНК-зависимой РНК-полимеразы и является главным событием, приводящим к потере Тэ-признака.

4. Получено экспериментальное подтверждение связи мутаций в гене РНК-полимеразы и в лидерной последовательности с термочувствительностыо и адаптацией РС-вируса к сниженной температуре. При помощи модельных

, систем (мини-геномов) установлено, что компоненты репликативного

комплекса'Тз-мутанта 2В ЗЗР функционируют при пониженной температуре (32°С) и не функционируют при нормальной температуре и что за

• термочувствительность и аттенуацию РС-вируса ответствена точечная мутация (Аг£-Ьу5)45| в гене РНК-полимеразы.

5. На основании исследований роли обнаруженных мутаций в лидерной промоторной последовательности и в гене РНК-полимеразы установлена связь вирулентных свойств РС-вируса с функциональной активностью вирусного репликативного комплекса.

6. В опытах с мини-геномами РС-вируса установлено, что количество геномной и антигеномной РНК в зараженых клетках примерно одинаково и это соотношение не изменяется при изменении уровня экспрессии репортерного гена. Сделан вывод, что возрастание экспрессии репортерного гена связано в первую очередь с усилением репликации вирусного генома.

7. На основе полноразмерной ДНК-копии генома вируса КЧС получен

щ .

инфекционный вирус, не отличающийся по ростовым и антигенным свойствам от родительского штамма КС. Генноинженерное происхождение вируса

I • подтверждено молекулярным анализом его генома. Таким образом, создана

базовая модель для экспериментов методами обратной генетики.

8. С целью получения маркированного вакцинного штамма, на основе инфекционного генома вакцинного штамма КС вируса КЧС получен гибридный рекомбинантный геном вируса КЧС, с замененным геном главного

поверхностного глнкопротенна Е2 на аналогичный ген вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) и на этой основе получен инфекционный I ибридный вирус, способный к серийному размножению в культуре клеток свиного происхождения (линии клеток РК.-15 и БК-б). Генноинженерное происхождение гибридного вируса подтверждено молекулярным анализом его генома.

9. Замена главного поверхностного гликопротеина Е2 вируса КЧС на ген Е2 из вируса ВД КРС сопровождалась появлением цитопатогенного действия нового гибридного вируса.

10. Полученный рекомбинантный геном вируса КЧС позволяет проводить его дальнейшие модификации для внесения изменений в маркированный вакцинный штамм. Для данного штамма созданы специфические средства диагностики на основе ИФА и ПЦР, что создает возможность разработки маркированной вакцины против КЧС и концепции ее применения.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основе проведенных исследований разработаны и предложены для практического использования:

Набор реагентов для выявления антител к вирусу классической чумы свиней иммуноферментным методом «КЧС-серотест». Технические условия ТУ-9388-082-00008064-98

Наставление по применению набора реагентов для выявления антител к вирусу классической чумы свиней иммуноферментным методом «КЧС-серотест». Утв. 08.12.98г. №13-7 2/1451. ' •

Тест-система для обнаружения вируса классической чумы свиней (КЧС) в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Технические условия ТУ-9388-082-00008064-99.

- Наставление по применению тест-системы для обнаружения вируса классической чумы свиней (КЧС) в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Утв. 18.01.99г. №13-7 2/1473.

5. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Забережный А. Д. - Применение технологии рекомбинантных инфекционных геномов в изучении РНК-солержащих вирусов.// Принято в печать. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2003.

Vlasova A.N., Т. Grebennikova, A. Zaberezhny, I. Greiser-Wiike, G. Floegel-Niesmann , V. Kurinnov , Т. Aliper, E. Nepoklonov.-

Molecular Epidemiology of Classical Swine Fever in the Russian Federation.// J. Vet. Med., 50: 363-367, 2003.

Куриннов B.B., Цыбанов С.Ж., Забережный А.Д., Гребенникова Т.В., Власова А.Н., Сергеев В.А., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. -

Вопросы клинической и лабораторной диагностики классической чумы свиней.// Принято в печать. Ветеринария 2003.

Гребенникова Т. В., Алексеев К. П., Гибадулин Р. А., Мусиенко М. И., Богданова В. С., Забережный А. Д., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А.- Синтез и антигенные свойства рекомбинантных белков американского и европейского типов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) в бакуловирусной системе.// Принято в печать. Вопросы вирусологии. 2003.

Т. В. Гребенникова, А. Д. Забережный, А. Н. Власова, М. И. Мусиенко, М. А. Соколов, В. В. Грабовецкий, В. С. Богданова, Б. Г. Орлянкин, Т.Н. Алипер, Е.А. Непоклонов.- Генетическая вариабельность белка нуклеокапсида вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС).// Принято в печать. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2003.

Grebennikova, T.V., Musienko, M.I., Mengeling, W.L., Lager, К. M. Zaberezhny, A.D., Aliper, T.I. , Nepoklonov, E.A. - An Infectious Genomic cDNA Clone of the Attenuated PRRSv Strain of North American Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus.// 841"1 Annual Meeting, Conference of Research Workers In Animal Disease, (Crwad).- Chicago, Usa, Novemberl 1-13. 2003.

Алексеев К. П., Грабовецкнй В. В., Гнбядулнн Р. А., Мусненко 1М. И., Гребенникова, Т. В., Алнпср Т. И., Нспоклоноп Е. А., Забережнын А. Д. - Получение рекомбинантных вирусных белков в бакуловирусной системе экспрессии для их дальнейшего использования в качестве специфических компонентов диагностических тест-систем' на основе ИФА.// «Актуальные проблемы патологии животных».- Владимир, октябрь 2003.

Власова А. Н., Грабовецкнй В. В., Корицкая М. А., Демкина М. М., Воркуиопа Г. К., Мусиснко М. И., Гребенникова Т. В., Алнпср Т. И., Нспоклонов Е. Д., Забережный А. Д. - Создание химерного вируса классической чумы свиней, содержащего ген Е2 вируса диареи КРС.// «Актуальные проблемы патологии животных»,- Владимир, октябрь 2003.

Гребснннкова Т. В., Мусненко М. И., Алипер Т, И., Непоклонов Е. А., Забережнын А. Д. - Создание полноразмерной инфекционной копии генома атгенуированного штамма вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) американского типа. И «Актуальные проблемы патоло!ии животных».- Владимир, октябрь 2003.

Власова А. Н., Гребенникова Т. В., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А.,Забережнын А. Д. - Разработка и применение тест-системы на основе ПЦР для детекции и дифференциации Европейского и Американского типов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней.// «Международная научно-практическая конференция по болезням животных». - Покров, сентябрь 2003.

Забережнын А. Д., В. Д. Сергеев, Т. И. Алипер. Е. А. Непоклонов. - Создание вирусных вакцин нового поколения на основе молекулярных технологий. // Материалы 11 -й международной конференции по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных,- Москва, 17-19 апреля, 2003. - С.З

Gr'ebennikova, T.V., Musienko, M.I., Mengcling, W.L., Lager, К. M. Zabcrczhny, A.D., Aliper, T.I. , Nepoklonov/E.A. -An Infectious Genomic cDNA Clone of the Attenuated Strain of North American Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus.// На рецензии. Virology. 2003.

Grebennikova, T.V., Clouser, D.F., Vorwald, A.C., Musienko, M.I., Mengeling, W.L., Lager, К. M. Wesley, R. D., Biketov, S.F., Zaberezhny, A.D., Aliper, T.I. , Nepoklonov, E.A. Genomic Characterization Of Virulent, Attenuated And Revertant Passages Of A North American Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus Strain.// На рецензии. Virology. 2003.

Vlasova A. N., Risatti G., Grebennikova, Т. V., Zaberezhny, A. D., Aliper, Т. I., Nepoklonov, E. A. -Infectious Genomic Copy of The Russian Vaccine Strain of Classical Swine Fever (Hog Cholera) Virus.// 17th Congress of the International Pig Veterinary Society.- Iowa, Ames, USA, June 2-5, 2002 - P. 324

Nepoklonov, E.A., Aliper,T.I., Sergeev, V.A., T.I., Zaberezhny, A.D. Grebennikova, T.V., Gruzdev, K.N., Ulasov, V.I. - Development of tools for diagnostics and prevention of classical swine fever.// 5lh ESVV Pestivitrus Symposiom.- Cambridge, August 2002,- P. 69

Grebennikova, T.V., Zaberezhny, A.D.' Paton, D..J.' Aliper, T.I.-Nepoklonov, E.A. - Complete Nucleotide Sequence of the Vaccine Strain "Cs" of Classical Swine Fever Virus. // Сборник научных работ специалистов НПО НАРВАК. - Москва, 2001. - С. 261-278.

Grebennikova, Т. V., Clouser, D. F., Vorwald, А. С., Zaberezhny, А. D., Biketov, S. F., Aliper, Т. I., Nepoklonov, Е. A., Mengeling, W. L.-

Entire genomic sequencing of the Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain NADC-8 from 3 different passages. // 20lh Annual Meeting of American Society for Virology. - Madison, Wisconsin, July 21-25,2001,- P. 194

Tsybezov, V.V., Vlasova A. N., Grebennikova, Т. V., Drew, T.W., Zaberezhny, A. D., Aliper, Т. I., Nepoklonov, E. A. - Indirect ELISA test for detection of antibodies against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus based on recombinant nucleoprotein from European type of the virus. // 82nd Annual Meeting, Conference of Research Workers in Animal Disease, fCRWAD). - St. Louis, Missouri, USA, Novemberl 1-13, 2001. - P. 179

Непоклонов Е.А., Т.Н. Алипер, В.А. Сергеев, В.К. Сологуб, А.Д. Забережный, СЛ. Калыюв, А.В. Кривонос, JI.A. Дудников, Т.В. Гребенникова, В.В. Цибезов, B.C. Богданова, М.И. Мусиенко, Р.А. Гибадулин. - Применение метода молекулярной биологии для диагностики и профилактики классической чумы свиней.// Сборник научных работ специалистов НПО НАРВАК. - Москва, 2001.- С. 261278.

Орлянкин Б.Г., Е.А. Непоклонов, Т.Н. Алипер, А.Д. Забережный, М.И. Мусиенко. - Диагностика и специфическая профилактика РРСС.// Ветеринария, 10, 2000.- С. 16-19.

Кривонос А.В., А.Д. Забережный, Т.В. Гребенникова, М.И. Мусиенко, Р.А. Гибадулин, В.В. Цибезов, B.C. Богданова, СЛ. Калыюв, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов. - Синтез и иммунохимические свойства рекомбинантного главного поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней.// Вопросы вирусологии, №2, 2000.- С. 29-36.

Nepoklonov, Е.А. Aliper, T.I., V.A.Sergeev, Dudnikov, L.A., Sologub, V.K., Kalnov, S.L., Tsybezov, V.V., Krivonos, A.V., Grebennikova, T.V., Zaberezhny, A.D. - Development of tools for diagnostics and prevention of classical swine fever. // The 16,h International Pig Veterinary Society Congress.- Melbourne, Australia, 17-20 Sept., 2000,-P. 621

Цибезов B.B., B.C. Богданова, А.Д. Забережный, Т.В. Гребенникова, А.В. Кривонос, JI.A. Дудников, C.JI. Калыюв, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов. - Применение рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней для иммунизации животных.// Вопросы вирусологии, №2, 2000.- С. 36-41.

Е. A. Nepoklonov, Т. I. Aliper, V. A. Sergeev, L. A. Dudnikov, V. К. Sologub, V. V. Tsibesov, Т. V. Grebennikova, Zaberezhny A. D. -

Development of tools for eradication of classical swine fever.// Oxford, England, 23-28 July 2000. - P. 61.

Vlasova A., T. Grebennikova, A. Zaberezhny, I. Greiser-Wilke, G. Floegel, V. Kurinnov, S. Tsybanov, T. Aliper, E. Nepoklonov -

Molecular epidemiological study of Classical Swine Fever Virus field isolates from Russian Federation.// Veterinary Virology in the New Millenium. - Brescia, Italy August 27-30, 2000. - P. 431.

Власова А. Н., Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Курников В. В., Вишняков И. Ф., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А. -

Филогенетический анализ российских полевых изолятов вируса классической чумы свиней. // II Международная научная конференция « Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - Москва 18-19 октября 2000. - С.243

Забережный А. Д., Гребенникова Т. В., Власова А. Н., Куриннов

B. В., Вишняков И. Ф., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А. -

Дифференциация вакцинного штамма и вирулентных (полевых) штаммов вируса классической чумы свиней.// II Международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». -Москва 18-19 октября 2000. -

C.214

Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Сергеев В.А., Бикетов С.Ф., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А. - Генетическая характеристика вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней: Сравнительный анализ первичной последовательности генов поверхностных гликопротеинов Ems, El, Е2.// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №2, 1999. - С. 34-40.

Zaberezhny, A. D., Grebennikova, Т. V., Kurinnov, V. V., Tsybanov, S. G., Vishnyakov, I. F., Biketov, S. F., Aliper, Т. I., Nepoklonov, E. A.

- Differentiation between Vaccine Strain and Field Isolates of Classical Swine Fever Virus using Polymerase Chain Reaction and Restriction Test.// Deutsche Tierärztliche Wochenschrift. N.106, 9, 1999. - P. 394397.

Непоклонов E.A., Калънов С.Л., Забережный А.Д. - Проблемы диагностики зоонозов и вирусных инфекций животных.// В сборнике «Новые генетические технологии». - Москва, 1998. - Стр. 62-81

Grebennikova, Т. V., Zaberezhny, A. D., Paton D. J., McGoldrick, А., Aliper, Т. I., Nepoklonov, E. A. - Sequencing analysis of the Classical Swine Fever Virus. // OIE symposium on Classical Swine Fever (Hog Cholera). -Birmingham (United Kindom), 9-10 July, 1998. - P. 53

Yu Q., J. Adamus, D. Buonagorio, A.D.Zaberezhny, Sath Shivaprakash, A. Georgiu, J.Crowley, V. Randolph, S.Udem and M. Sidhu. - Molecular characterization of cold-adapted, temperature-sensitive and attenuateing mutations of respiratory syncytial virys subgroup В strain. // American Society for Virology, 17th Annual Meeteng . - Vancouver, British Columbia 1998.

Кальнов С. Л., Бикетов С.Ф., Дудников JI.A., Гибадулин Р.А.,Забережный А. Д., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А. - Создание рекомбинантного поверхностного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней.// Тезисы докладов конференции «Проблемы инфекционной патологии сельскохзяйственных животных», Владимир, 1997.- С. 121-122.

Nepoklonov, Е.А., T.I.AIiper, S.F. Biketov, L.A. Dudnikov, V.V.Tsibezov, R.A.Gibadulin, S.L.Kalnov, A.D. Zaberezhny. -

Expression of Recombinant Glycoprotein E2 from Hog Cholera Virus" // American Society for Virology, 16th Annual Meeteng . - Bozeman, Montana, 1997.- P. 216

V.B.Randolph, M.Kandis, Y.M.McMullen, A.D.Zaberezhny, J.H.Brougham, J.C.Crowley, J.M.Tatem. - Phenotypic Characterization of an attenuated cold adapted, temperature-sensitive mutant of respiratory syncytial virus. // American Society for Virology, 14th Annual Meeteng , Austin TX 1995,- P 195.

Zaberezhny, A.D., J.E. Adamus, S.W.Harnish, S. Kantesaria, Randolph, V., and Crowley, J.C. - Analysis of Leader Sequences in Parental, Mutant and Revertant Strains of Respiratory Syncytial Virus. // American Society for Virology, 14th Annual Meeteng.- Austin TX 1995.-P170.

Zaberezhny, A.D., S. Tzall, S.W.Harnish, V. Randolph and Crowley, J.C. -Molecular Characterization of Respiratory Syncytial Virus Subgroup В Strain". // American Society for Virology, 13th Annual Meeteng. - Madison WI. 1994. - P. 176

Crowley, J.C., S. Tzall, S.W. Harnish, A.D.Zaberezhny, H. Zheng, V. B. Randolph and C. Weeks. -Levy Characterization of a Respiratory Syncytial Virus Subgroup В Strain". // Ninth International Conference on Negative Strand Viruses. - Estoril, Portugal, abstr. 124 1994. - P. 104

Подп. в печ. 07.10.2003 г. Формат 60x88/16 Бум. Тип.

Объем усл. Печ. л. 3._Тираж 100 экз._Заказ 383

Отпечатано в ООП ФГУЭП «ЭФЕС» 107139, Москва, Орликов пер., д. 3, тел. 207-80-52 Лицензия JIP № 020743 от 2 апреля 1999 г.

(óo^O

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Забережный, Алексей Дмитриевич

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Применение обратной генетики в изучении РНК- 11 содержащих вирусов

1.1.1. Создание полноценных инфекционных геномов РНК- 11 содержащих вирусов

1.1.2. Создание дефектных мини-геномов РНК-содержащих 18 вирусов

1.2. Респираторно-синцитиальный вирус человека (PC- 22 вирус)

1.2.1. Биологическая характеристика вируса и структурно- 22 функциональная характеристика вирусного генома

1.2.2. Применение методов обратной генетики в отношении PC- 35 вирусов для изучения фундаментальных аспектов вирусного морфогенеза

1.2.3. Применение методов обратной генетики в отношении PC- 44 вирусов для решения задач специфической профилактики респираторных заболеваний

1.3. Вирус классической чумы свиней (КЧС)

1.3.1. Биологическая характеристика вируса и структурно- 55 функциональная характеристика вирусного генома

1.3.2. Локализация на геноме вируса КЧС участков, кодирующих 60 поверхностные антигенные детерминанты

1.3.3. Исследования, направленные на изучение вакцинного 62 штамма КС и разработку на его основе средств дифференциальной диагностики и специфической Ф профилактики КЧС

1.3.3.1. Анализ генома штамма КС, филогенетический анализ и 62 разработка теста для идентификации вакцинного штамма методом ПЦР и рестриктного анализа

1.3.3.2. Получение рекомбинантного поверхностного 70 гликопротеина Е2 из вакциного штамма КС, субъединичное вакцинирование и разработка иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу КЧС

1.3.4. Применение методов обратной генетики для изучения 76 вируса КЧС

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов"

Создание инфекционных рекомбинантных геномов представляет собой весьма актуальную задачу для изучения многих РНК-содержащих вирусов, т.к. этот современный подход позволяет выявлять и изменять генетические детерминанты, связанные с биологическими свойствами инфекционных агентов. Это создает теоретические и практические предпосылки для создания новых штаммов РНК-содержащих вирусов с полезными свойствами для диагностики и специфической иммунопрофилактики вирусных инфекций. Конструирование инфекционных вирусных геномов относится к области «обратной генетики». Термин "reverse genetics" появился в вирусологической литературе в последнее десятилетие. В четвертом издании «Fields Virology» этот термин связывают с внесением мутаций в РНК-геномы вирусов, для чего РНК переводится в форму кДНК (созвучно с «обратной транскрипцией»). Появился также термин «создание системы обратной генетики» для того или иного вируса. Подразумевается создание матрицы кДНК, в которую можно вносить изменения и получать полный или дефектный РНК-геном вируса. Таким образом, обратную генетику можно определить как методический прием, посвященный воссозданию, конструированию функционального генетического материала (полный или дефектный вирусный геном) и обеспечению экспериментальных условий для его функционирования. Такая модель позволяет вносить изменения в генетический материал, а также варьировать факторы, влияющие на его функции. Она представляет собой инструмент для прямой экспериментальной проверки рабочих гипотез о молекулярных механизмах наследственности и факторах патогенности. Это особенно важно для исследования РНК-содержащих вирусов. В последнее время продемонстрированы революционные возможности обратной генетики в области молекулярной вирусологии.

PC вирус вызывет тяжелую инфекцию дыхательных путей (бронхо-легочный синдром) в основном у детей раннего возраста. Она особенно опасна для пожилых людей и страдающих иммунодефицитом (68). Заболевание относится к пока нерегулируемым вирусным инфекциям и встречается в развитых и развивающихся странах, а создание эффективной отечественной вакцины и методов диагностики остается важной социальной задачей здравоохранения. PC вирус относится к роду Pneumovirus (Семейство Paramyxoviridae), его геном представлен единственной одноцепочечной (минус-цепь) молекулой РНК.

На сегодняшний день не существует коммерческой вакцины против РС-вирусной инфекции человека. Разработка инактивированных вакцин на основе различных штаммов PC-вируса не принесла ожидаемого результата (153). В то же время живые вакцины на основе ослабленных штаммов других представителей семейства Paramyxoviridae (кори и паротита) эффективны и безопасны для человека. Поэтому предпринимаются попытки получить аттенуированные штаммы PC-вируса с использованием холодовой адаптации, химического (неспецифического) мутагенеза (164, 71-73, 109, 168), а в последнее время - методами обратной генетики.

Несмотря на разнообразие новых кандидатов в вакцинные штаммы РС-вируса, обладающих разной степенью иммуногенности и уровнем аттенуации, остается неясной природа самого явления аттенуации у PC-вирусов. Понимание молекулярных механизмов аттенуации позволило бы более целенаправленно конструировать новые вакцинные штаммы. Ряд исследований аттенуированных штаммов РС-вируса (70, 207) и вирусов парагриппа-3 (169) указывают на связь аттенуированных свойств с мутациями в гене РЖ-зависимой РНК-полимеразы. Это свидетельствует о том, что нарушения функций РНК-полимеразы (транскрипция и репликация вирусного генома) могут быть ответственны за аттенуацию.

Рабочая гипотеза, выдвигаемая в данной работе, состоит в том, что аттенуация PC-вирусов может быть связана со сниженной репродуктивной активностью из-за мутаций в генах РНК-полимеразы и других белков полимеразного комплекса, а также в регуляторных концевых промоторных последовательностях генома. Для проверки этой гипотезы были проанализированы геномные мутации у ослабленных вариантов РС-вируса, полученных адаптацией штамма дикого типа 2В к размножению в культуре клеток при сниженной температуре и претендующих на роль кандидатов в вакцинные штаммы. Для экспериментальной проверки роли найденных мутаций была создана модельная система (обратной генетики) на основе искусственных мини-репликонов PC-вируса, позволяющая вносить изменения в белки репликативного комплекса и в регуляторные элементы генома.

Специфическая профилактика КЧС как правило осуществляется живыми вакцинами, приготовленными на основе китайского лапинизированного штамма

С или других аналогичных вакцинных штаммов, что защищает животных от заболевания (202). С целью профилактики КЧС возможно применение инактивированных, а также рекомбинантных субъединичных вакцин, которые уступают живым вакцинам по протективной активности (206, 110, 178, 147). Создание полноразмерного инфекционного клона вируса КЧС является важным инструментом для получения ответов на фундаментальные вопросы, касающиеся факторов вирулентности и патогенности, молекулярных механизмов, вовлечённых в процессы цикла репродукции вируса. Подобный подход был успешно применён к ряду вирусов с РНК геномом положительной полярности, включая вирус КЧС (150, 177, 36). Для настоящей работы представляет интерес создание инфекционной копии генома вакцинного штамма вируса КЧС, из-за необходимости создания отечественной маркированнной вакцины. Вакцинный штамм КС, взятый за прототип в данной работе, получен на основе вакцинного штамма Ж ВНИИВВиМ, который применялся в СССР на протяжении более 30 лет (В.А.Сергеев, 1993). В 19972000 гг. было проведено детальное изучение биологических свойств и молекулярных характеристик данного вакцинного штамма (Е.А.Непоклонов, 2000; А.Д.Забережный и др., 1999; 5, 3, 18): геном штамма КС был полностью секвенирован, разработан молекулярный тест на основе ПЦР (ТУ-9388-082-00008064-99, 18.01.99 г.), а также на основе ПЦР и рестриктного анализа для выявления и дифференциации вирулентного и вакцинного штаммов. Поверхностные гликопротеины вируса КЧС были синтезированы в бакуловирусной системе, на их основе создан иммуноферментный тест для выявления вирус-специфических антител (ТУ-9388-082-00008064-98, 08.12.98 г.). Таким образом, были созданы все предпосылки для создания новых аттенуированных штаммов на основе штамма КС, пригодных для разработки маркированной вакцины против КЧС.

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии Медицинских Наук, в Научно-производственном объединении НАРВАК, г. Москва и в научно-исследовательской лаборатории Wyeth-Lederle, США. Автор приносит глубокую благодарность научному консультанту д.б.н. Е.А.Непоклонову, д.б.н. Т.И.Алиперу, к.б.н. Т.В.Гребенниковой, А.Н.Власовой, В.В.Грабовецкому, О.В.Елисеевой, д.б.н. Г.К.Воркуновой (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского), заслуженному деятелю науки РСФСР, профессору В.А. Сергееву, М.М.Демкиной, М.А.Корицкой, к.б.н. М.И.Мусиенко (НПО НАРВАК), Jean Adamus, Dr. Joan Crowley (Wyeth-Lederle, Нью-Йорк) за разностороннюю научно-методическую и организационную помощь в работе.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Забережный, Алексей Дмитриевич

4. ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ первичной структуры полного генома вирулентного штама 2В респираторно-синцитиального вируса человека и двух его вариантов: аттенуированого термочувствительного (Ts) мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F), и его ревертанта по Ts признаку (2В 33F TS+), обнаружено 23 нуклеотидных различия при сравнении геномов 2В и 2В 33F и 1 различие при сравнении геномов 2В 33F и 2В 33F TS+.

2. Показано, что в геноме Ts-мутанта при сравнении с геномом исходного вируса:

- 16 мутаций располагаются в области гена малого гидрофобного белка SH , все они представляют собой транзиции типа (A-G) и приводят к 6 аминокислотным заменам и заменам в 2 последовательных стоп-кодонах в положениях 66(Stop-Gln) и 81 (Stop-Gin), что увеличивает размер полипептида с 65 до 103 аминокислотных остатков;

- 2 мутации впервые обнаружены в консервативной промоторной области лидерной последовательности: замена 4-го нуклеотида (G-C) и включение дополнительного 7-го нуклеотида (U). Установлено, что обе мутации вместе и по отдельности приводят к 4-10 кратному усилению промоторных функций.

3. Установлено, что различие геномов аттенуированного штамма 2В 33F и его ревертанта по Ts -признаку (2В 33F TS+) заключается в одной нуклеотидной замене (U-C) в положении 9853. Эта мутация приводит к замене (Arg-Lys) в положении 451 в аминокислотной последовательности РНК-зависимой РНК-полимеразы и является главным событием, приводящим к потере Ts-признака.

4. Получено экспериментальное подтверждение связи мутаций в гене РНК-полимеразы и в лидерной последовательности с термочувствительностью и адаптацией PC-вируса к сниженной температуре. При помощи модельных систем (мини-геномов) установлено, что компоненты репликативного комплекса Ts-мутанта 2В 33F функционируют при пониженной температуре

32°С) и не функционируют при нормальной температуре (37°С), и что за термочувствительность и аттенуацию РС-вируса ответствена точечная мутация (Arg-Lys)45i в гене РНК-полимеразы.

5. На основании исследований роли обнаруженных мутаций в лидерной промоторной последовательности и в гене РНК-полимеразы установлена связь вирулентных свойств PC-вируса с функциональной активностью вирусного репликативного комплекса.

6. В опытах с мини-геномами PC-вируса установлено, что количество геномной и антигеномной РНК в зараженых клетках примерно одинаково и это соотношение не изменяется при изменении уровня экспрессии

Ф репортерного гена. Сделан вывод, что возрастание экспрессии репортерного гена связано в первую очередь с усилением репликации вирусного генома.

7. На основе полноразмерной ДНК-копии генома вируса КЧС получен инфекционный вирус, не отличающийся по ростовым и антигенным свойствам от родительского штамма КС. Генноинженерное происхождение вируса подтверждено молекулярным анализом его генома. Таким образом, создана базовая модель для экспериментов методами обратной генетики.

8. С целью получения маркированного вакцинного штамма, на основе инфекционного генома вакцинного штамма КС вируса КЧС получен

• гибридный рекомбинантный геном вируса КЧС, с замененным геном главного поверхностного гликопротеина Е2 на аналогичный ген вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) и на этой основе получен инфекционный гибридный вирус, способный к серийному размножению в культуре клеток свиного происхождения (линии клеток РК-15 и SK-6). Генноинженерное происхождение гибридного вируса подтверждено молекулярным анализом его генома.

Ю.Полученный рекомбинантный геном вируса КЧС позволяет проводить его дальнейшие модификации для внесения изменений в маркированный вакцинный штамм. Для данного штамма созданы специфические средства диагностики на основе ИФА и ПЦР, что создает возможность разработки маркированной вакцины против КЧС и концепции ее применения.

1.4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Вакцина против PC-вирусной инфекции человека до сих пор не внедрена в медицинскую практику. Создание убитых вакцин на основе различных штаммов PC-вируса не принесло желаемого результата (153). На основании всех накопленных данных при исследовании PC-вируса, определилась тенденция создания живой вакцины на основе аттенуированных штаммов. Поэтому в настоящее время не прекращаются исследования с целью получить ослабленные штаммы PC-вируса с использованием методик неспецифического мутагенеза (164; 71, 72, 73; 109; 168), а также специфического мутагенеза методами обратной генетики. Механизмы атгенуации у PC-вирусов остаются важным предметом для изучения. Понимание данных механизмов позволило бы конструировать новые вакцинные штаммы при помощи новых технологий рекомбинантных инфекционных геномов. Результаты исследований указывают • на связь аттенуированных свойств PC-вируса и вируса парагриппа 3 типа с мутациями в гене РНК-зависимой РНК-полимеразы (70; 207, 169), свидетельствуя о том, что нарушения функций РНК-полимеразы (транскрипция и репликация вирусного генома) могут быть ответственны за аттенуацию. Таким образом, представляет интерес проверка гипотезы о том, что аттенуация PC-вирусов может быть связана со сниженной репродуктивной активностью из-за мутаций в генах РНК-полимеразы и других белков полимеразного комплекса, а также в регуляторных концевых промоторных последовательностях генома. Для проверки этой гипотезы необходимо проанализировать геномные мутации у ослабленных вариантов PC-вируса, полученных адаптацией штамма дикого типа к размножению в культуре клеток при сниженной температуре и претендующих на роль кандидатов в вакцинные штаммы. Для экспериментальной проверки роли найденных мутаций необходимо создать модельную систему на основе искусственных мини-репликонов РС-вируса, позволяющую вносить изменения в белки репликативного комплекса и в регуляторные элементы генома.

Анализ литературы, посвященной исследованиям вируса классической чумы свиней, заставляет задуматься о создании новых вакцинных штаммов с измененными свойствами для целей маркированного вакцинирования против КЧС. В настоящее время вакцинация против КЧС успешно осуществляется живыми вакцинами, приготовленными на основе аттенуированных вакцинных штаммов (205). Установлено, что с целью профилактики КЧС возможно применение инактивированных, а также рекомбинантных субъединичных вакцин, которые менее эффективны в сравнении с живыми вакцинами. (206, 110, 178, 147). Актуальной задачей является создание отечественной маркированнной вакцины. За основу при создании такой вакцины целесообразно взять хорошо изученный вакцинный штамм КС, который получен на основе вакцинного штамма Ж ВНИИВВиМ, и применялся в СССР на протяжении более 30 лет (В.А.Сергеев, 1993). Ранее было проведено подробное изучение биологических свойств и молекулярных характеристик данного вакцинного штамма (Е.А.Непоклонов, 2000 А.Д.Забережный и др., 1999, Т.В.Гребенникова и др., 1998 А.Н.Власова и др. 1999, В.В. Цибезов и др. 2000) геном штамма КС был полностью секвенирован, разработан молекулярный тест на основе ПЦР и рестриктного анализа для выявления и дифференциации вирулентного и вакцинного штаммов. Поверхностные гликопротеины вируса КЧС были синтезированы в бакуловирусной системе, на их основе создан иммуноферментный тест для выявления вирус-специфических антител. Все перечисленные наработки позволяют поставить и решить задачу по созданию маркированного вакцинного штамма КС с замененным или модифицированным геном Е2 при помощи технологии инфекционных рекомбинантных геномов. На основе маркированного штамма возможна разработка маркированной вакцины и сопутствующей специфической тест-системы, что является актуальной задачей.

1.5.ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Выявить в геноме респираторно-синцинтиалъного вируса человека молекулярные детерминанты, связанные со свойствами аттенуации, термочувствительности и адаптации к снижению температуры, при помощи сравнения первичной структуры геномов вирулентного штамма и его аттенуированных производных,

• Определить полную первичную структуру геномов 3 штаммов РС-вируса группы В: вирулентного штамма 2В, его аттенуированого термочувствительного мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F), а также ревертировавшего по признаку термочувствительности изолята (2В 33F TS+).

• Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вирулентного штамма 2В и его аттенуированного термочувствительного мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F) и на основе проведенного анализа определить потенциальные детерминанты аттенуации, термочувствительности и адаптации к сниженной температуре.

Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей его аттенуированного термочувствительного мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F), а также ревертировавшего по признаку термочувствительности изолята (2В 33F TS+) и на этой основе определить потенциальные детерминанты термочувствительности. 2.Применить экспериментальную модель, основанную на методах обратной генетики, для выявления функциональной роли обнаруженных генетических детерминант в формировании фенотипических изменений у PC-вирусов, а также для исследования гипотезы о связи уровней репликации и транскрипции генома с аттенуацией РС-вирусов.

Для изучения функциональной роли нетранслируемых концевых регуляторных (промоторных) областей PC-вируса сконструировать дефектные вирусные мини-геномы, содежащие репортерный ген хлорамфениколацетилтрансферазы и регуляторные области из вирулентного штамма 2В, его аттенуированного термочувствительного мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F), а также ревертировавшего по признаку термочувствительности изолята (2В 33F TS+).

Для моделирования репликазного комплекса каждого из трех изучаемых штаммов PC-вируса сконструировать для каждого из них экспрессирующие векторы, обеспечивающие синтез 4-х вирусспецифических белков: матриксного, нуклеопротеина, фосфопротеина, а также РНК-полимеразы, несущих в себе все особенности, обнаруженные при анализе геномов вирулентного и аттенуированных штаммов РС-вируса. На основе сконструированных мини-геномов получить дефектные РС-вирусы человека при одновременном заражении клеток различными штаммами вируса-помощника, исследовать их инфекционность, параметры репликации и транскрипции при нормальной (37°С) и сниженной (32°С) температурах.

На основе сконструированных мини-геномов, а также экспрессирующих векторов, получить дефектные PC- вирусы человека при одновременной трансфекции рекомбинантными плазмидами, исследовать их инфекционность, параметры репликации и транскрипции при нормальной (37°С) и сниженной (32°С) температурах.

Для выявления относительных уровней репликации и транскрипции мини-геномов при изменении в экспрессии репортерного гена провести анализ положительных и отрицательных цепей РНК мини-геномов. Для проверки гипотезы о связи уровня репликации и транскрипции генома PC-вирусов с атгенуированным фенотипом сравнить уровни экспрессии репортерного гена при использовании промоторных последовательностей и белков репликазного комплекса из вирулентных и аттенуированных штаммов.

З.Получить маркированный вакцинный штамм вируса классической чумы свиней на основе полноразмерной инфекционной копии генома данного вируса.

Разработать стратегию и осуществить сборку полноразмерной копии генома вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней в E.coli под контролем промотора фага Т7 и получить синтезированную in vitro геномную РНК данного штамма.

• Получить инфекционный вирус классической чумы свиней на основе его рекомбинантного генома и исследовать его ростовые и антигенные характеристики, наличие молекулярных маркеров. Подтвердить генно-инженерное происхождение гибридного вируса определением первичной структуры его генома.

• Сконструировать рекомбинантный вирус классической чумы свиней с замененным гликопротеином Е2 на гликопротеин из вируса диарреи крупного рогатого скота. Исследовать способность гибридного вируса заражать клетки свиного происхождения РК-15 и SK-6, несмотря на гетерологичный главный оболочечный гликопротеин Е2. Подтвердить генно-инженерное происхождение гибридного вируса определением первичной структуры его генома.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1.1. Материалы и методы при исследовании РС-вируса

Вирусы и клетки

Штаммы 2В и 18537 РС-вируса (30) были получены от д-ра R. Belshe (St. Louis University Medical Center, St. Louis, МО). Штамм В1 был получен от д-ра В. Murphy (NIH). Штамм 18537 был впервые охарактеризован в 1963 г. (55). Родительский штамм PC-вируса дикого типа 2В был выделен в 1987 г. в Западной Вирджинии от новорожденного ребенка с респираторным заболеванием верхних дыхательных путей. История адаптации штамма 2В к пониженным температурам описана в литературе (168). Вкратце, вирус пассировали 7 раз в первичной культуре клеток почки макаки резус при 35°С. Отбирали одну колонию и пассировали 6 раз (здесь и в дальнейшем в клетках Vero) при 36 °С, отбирали одну колонию и пассировали 12 раз при 36 °С. Вирус пассировали 7 раз при 26 °С, 6 раз при 22 °С, 20 раз при 20 °С. Отбирали одну

83 колонию и пассировали 7 раз при 32 °С. Этот этап биологического клонирования и наращивания повторяли еще дважды. Полученный вариант (2B33F) адаптирован к росту при пониженной температуре (32°С), а кроме того приобрел температурную чувствительность, т.е. его рост замедлен более чем в 10 раз при 39°С. Штамм 2B33F оказался аттенуированным для шимпанзе, хлопковых крыс и африканских зеленых мартышек, в частности, он размножался в 10 - 1000 раз медленнее в верхних и нижних дыхательных путях по сравнению с предшественником- штаммом 2В. Штамм 2B33F вызывал образование вирус-нейтрализующих антител и был способным защитить крыс от контрольного заражения вирулентным штаммом (168). Методом выращивания штамма 2B33F в клеточной культуре при рестриктивной температуре (39°С) получили мутантный клон 2B33F(TS+) с восстановленными ростовыми характеристиками. Этот мутант утерял свойство термочувствительности, поэтому является ревертантом по данному признаку. Его нельзя считать в полном смысле ревертантом к дикому типу, т.к. данный штамм сохраняет признаки адаптации к низким температурам, т.е. способен к нормальному росту при температуре 32°С. Вариант 2B20L получали параллельно аналогичным способом с меньшим колличеством пассажей на этапе холодовой адаптации (5 пассажей при при 26 °С, 5 при 22 °С, 10 при 20 °С).

Штамм PC-вируса дикого типа В1 был получен на основе первоначального изолята, полученного д-ром Belshe в Западной Вирджинии в 1985 г. от грудного ребенка с признаками бронхита и превмонии (bronchiolitis/pneumonia). История культивирования данного штамма описана в литературе (73). Вкратце, вирус был пассирован 3 раза в первичной культуре клеток зеленой африканской мартышки, затем его подвергли 7 пассажам в диплоидных фибробластах человека (MRC-5) и 4 пассажам в клетках Vero. Между 6 и 7 пассажами в клетках MRC-5 вирус трижды подвергся биологическому клонированию (plaque-purification) в тех же клетках.

Клеточная линия Vero была получена из коллекции АТСС. Все клетки выращивали в минимальной среде MEM, с добавлением несущественных аминокислот, фетальной сыворотки теленка, стрептомицина и неомицина.

История получения ослабленных штаммов 2B33F и 2B20L, а также их ревертировавших по признаку термочувствительности мутантов 2B33F(TS+) и 2B20L(TS+). т

Выделение и наращивание штамма 2В в клетках PRMK: 7 пассажей при 35-36°С

Адаптация штамма 2В к клеткам Vero: 2 пассажа при

35°С

Отбор одной колонии и наращивание в клетках Vero: 6 пассажей при 36°С i

Отбор одной колонии и наращивание в клетках Vero: 6 пассажей при 36°С

Отбор одной колонии и наращивание в клетках Vero: 12 пассажей при 36°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 5 пассажей при 26°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 5 пассажей при 22°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 10 пассажей при 20°С

2B20L

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 7 пассажей при 26°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 6 пассажей при 22°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 20 пассажей при 20°С

2B33F

Отбор одной колонии и наращивание в клетках Vero: 7 пассажей при 32°С

То же еще 2 раза

Наращивание в клетках Vero: 3 пассажа при 32°С

Рис.7 Схема получения адаптированных к низкой температуре штаммов-производных от 2В.

Очистка РНК PC-вируса и синтез кДНК

Клетки Vero заражали PC-вирусом с множественностью 0,1 (инфекционных частиц на клетку), затем инкубировали при 32°С, вирус пересевали после развития выраженного цитопатического эффекта (ЦПЭ). Для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ГГЦР) при амплификации внутренних фрагментов генома, выделяли тотальную РНК (181). Для получения вирионной РНК проводили частичную очистку вирионов РС-вируса и их концентрирование согласно следующей процедуре: инфицированные клетки собирали с 2 матрасов (75 см ) после 48 часов инкубирования, после чего суспензию клеток охлаждали до -70°С. Вирус осветляли с помощью центрифугирования в течение 20 мин при 8000g и осаждали 50% раствором полиэтиленгликоля (4:1) в течение 16 ч. при 4°С. После центрифугирования в течение 1 ч. при 10000g, осадок ресуспендировали в 20% растворе сахарозы на буфере NTE (10 mM Tris-HCl, рН 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) и наносили на ступенчатый сахарозный градиент (35-60% на буфере NTE). Вирус дважды очищали в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (вирус W концентрировался на границе плотностей 30-60%) в следующем режиме центрифугирования: 36 тыс. об/мин (ротор Ti40 Beckman) в течение 2 часов. Вирус переводили в буфер NTE методом диализа. Вирионную РНК экстрагировали фенолом и хлороформом, затем осаждали этанолом. Общую фракцию полиаденилированной РНК выделяли из клеток Vero, зараженых РС-вирусом, с использованием набора Librarian Kit (Invitrogen, США) на основе следующей аффинной цепи: "magnetic beads-streptoavidin-biotin-olido d(T)-poly (A) RNA". Комплементарную ДНК синтезировали при помощи олиготимидиновых праймеров oligo d(T)]2.i6.

Выделение и очистка мРНК.

Общая фракция полиаденилированной РНК была выделена из клеток Vero, зараженых PC-вирусом, с использованием набора Invitrogen (США) на основе следующей аффинной цепи: "magnetic beads-streptoavidin-biotin-olido d(T)-poly (A) RNA". Комплементарная ДНК была синтезирована при помощи олиготимидиновых праймеров oligo d(T) в составе набора Librarian Kit (Invitrogen, США).

Амплификация генома PC-вирусов методом ПЦР, клонирование и секвенирование.

Полный геном PC-вируса штамма 2В, за исключением концевых областей, был амплифицирован в виде ряда небольших перекрывающихся (с тем, чтобы праймеры не маскировали собой реальные последовательности) фрагментов. Из-за того, что олигонуклеотидные праймеры были изначально разработаны на основе опубликованных последовательностей геномов PC-вирусов, некоторые не сработали в реакции амплификации со штаммом 2В. Впоследствии, по мере накопления данных, все они были заменены на праймеры, специфичные к 2В. Стратегия амплификации вирусного генома приведена на рис.8.

Для клонирования смешивали 10 независимо полученных продуктов ПЦР для каждого фрагмента. Продукты ПЦР были очищены препаративно в гарозном геле и клонированы в плазмидном векторе pSK+ (Stratagene, США), в клетках Е. coli DH5a. Фрагменты были секвенированы на обеих цепях в составе очищенной плазмидной ДНК с использованием Т7 Sequenase или AmpliTaq polymerase (Applied Biosystems) при помощи универсальных праймеров М13 или специфических праймеров. Все фрагменты (за исключением концевых областей генома) были секвенированы из 5 независимых клонов.

NS-1 NS-2

04 .53 .50 1.20 .91 .96 .41 .92

1.90

M2 .96 Ш

0.3

2.3

1.0

1.5

0.9 1.2

1.0

3.5

3.3

2.0

0.6

1.8

1.7

Рис.8.

Стратегия амплификации генома PC-вирусов

А. Фрагменты, полученные для клонирования и секвенирования генома штамма 2В Б. Фрагменты, использованные для прямого секвенирования геномов штаммов 2В, 2B33F, 2B33F (TS+)

484853235323532353235348535323

Продукты ПЦР секвенировали также напрямую, минуя стадию клонирования, также на 2 цепях, использую набор AmpliTaq FS kit (Applied Biosystems, США). Для получения усредненной (consensus) последовательности, каждый нуклеотид был подтвержден как минимум на основе последовательностей 3 независимых клонов на 2 цепях или на основе 1 клона и прямого сиквенса ПЦР-продукта (также на 2 цепях). Как только была получена полная последовательность генома штамма 2В, была принята новая стратегия секвенирования других штаммов подгруппы В. Все 3 генома РС-вирусов (штаммы 2В, В1 и 18537) были амплифицированы в виде 4 перекрывающихся фрагментов ПЦР с использованием набора GeneAmp" XL RNA PCR Kit (Perkin Elmer, США) и напрямую секвенированы на обеих цепях.

Определение первичной структуры концевых фрагментов генома из различных штаммов РС-вируса.

Детали анализа концевых последовательностей генома будут приведены отдельно. Вкратце, концевые последовательности генома (З'-лидерная и 5-трайлерная области) были сшиты между собой методом циркуляризации вирионной РНК в реакции лигирования с использованием РНК лигазы фага Т4 (Promega, США). Область сшивки концевых последовательностей была амплифицирована методом ОТ/ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных к генам NS1 и L. Продукт ПЦР был клонирован в E.coli, после чего он был выделен из 15 независимых клонов и секвенирован. Для секвенирования 3'-концевой области генома был также применен метод, описанный у Mink et al. (1991), по которому вирионная РНК была полиаденилирована, и кДНК была получена с использованием праймера олиго-d(T). Лидерная последовательность была амплифицирована с использованием олиго^(Т) и NS-1 ген-специфических праймеров после оптимизации состава буфера для проведения реакции (Invitrogen, США).

Очистка вирионов PC-вируса для анализа концевых последовательностей генома.

Клетки Vero заражали PC-вирусом с множественностью 1 вирус на клетку. Инфицированные клетки не собирали, а аккуратно собирали ростовую среду через 72 часов инкубирования, т.к. она содержала достаточное количество высвободившихся вирусных частиц и содержала мало клеток. Вирус осветляли низкоскоростным центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин . (ротор JA10, 8000 об/мин). Надосадочная жидкость смешивалась с 50% раствором ПЭГ (4:1) и выдерживали при +4°С в течение 16 часов с перемешиванием. Осадок собирали центрифугированием в течение 20 мин (ротор JA10, 10000 об/мин). Осадки растворяли в 20% растворе сахарозы на буфере NTE, после чего наносили на градиент плотности сахарозы 35%-60% в пробирках на 12 ml ротора Ti 40. Центрифугирование сахарозных градиентов проводили в течение 2 ч. при 36000 об/мин. Вирус образовывал зону на границе ступеней градента плотности. Препарат вируса собирали, прокалывая пробирку иглой шприца, затем охлаждали и хранили при -20°С.

Амплификация лидерной последовательности с использованием полиаденилирования.

РНК из штаммов 2В, 2B33F, 2B20L, 2B20L(TS+) и 2B33F(TS+) была полиаденилирована при помощи поли (А)-полимеразы в течение 30 мин при 37°С. Затем РНК была экстрагирована насыщеным фенолом (рН 4.7) и переосаждена холодным этанолом.

Комплементарная ДНК была синтезирована на РНК из каждого штамма РС-вируса при помощи праймера oligo d(T) и набора "cDNA-cycle" Kit (Invitrogen, США). Лидерная последовательность генома PC-вирусов была амплифицирована вместе с частью гена 1С с использованием праймера oligo d(T) и праймера, специфичного к гену 1С, что привело к образованию фрагмента ДНК размером 400 нукл. пар. Реакции амплификации проводили в объеме 50 р! с использованием 16 буферных растворов ("PCR Optimizer Kit" Invitrogen, США). Использованные растворы, обозначеные буквами от А до Р, имели характеристики, представленные в таблице 7:

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Забережный, Алексей Дмитриевич, Москва

1. Альберте Б., Д. Брей, Дж. Льюис и др.- Молекулярная биология клетки; М.: Мир. 1987.

2. Беляков И.М. Иммунная система слизистых. Иммунология, 1997, 4, 713.

3. Вишняков И.Ф. Результаты исследований по изучению особо опасных болезней животных и разработке мер борьбы с ними. Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России. М., 1999, 1, 67-74.

4. Кривонос А.В., Мусиенко М.И., Гибадулин Р.А., Забережный А.Д., Гребенникова Т.В., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. (2000). Синтез рекомбинатного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней. Вопросы вирусологии, 1. с. 29-36.

5. Конструирование инфекционной копии генома вакцинного штамма вируса классической чумы свиней. Е.А.Непоклонов, Т.И.Алипер, В.А.Сергеев, А.Д.Забережный, Т.В.Гребенникова, А.Н.Власова, D. Rock, G. Risatti.

6. Орлянкин Б.Г. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных; М.1998.

7. Ю.Понд У. Д., Хауит К.А. Биология свиньи. М., Колос, 1983, 161-170.

8. Притулин П.И.Диагностика свиней на комплексах. М., 1977.

9. Романенко В.Ф. Инфекционные желудочно-кишечные болезни свиней. М., Колос, 1984.

10. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Урожай, Киев, 1993, 292-294 Н.Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г. Структура и биология вирусов животных.1. М., 1983.

11. Сингер М., Берг П.- Гены и геномы; М.: Мир, 1998, 2т.

12. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. М.,1998.

13. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения в норме и патологии. Иммунология, 1997, 5, 4-7.

14. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Медицина, М., 1999, 17-110.

15. Ahmadian G, Chambers Р, Easton AJ. Detection and characterization of proteins encoded by the second ORF of the M2 gene of pneumoviruses. J Gen Virol 1999;80:2011-2016.

16. Ahmadian G, Randhawa JS, Easton AJ, 2000. Expression of the ORF-2 protein of the human respiratory syncytial virus M2 gene is initiated by a ribosomal termination-dependent reinitiation mechanism. EMBO J; 19(11):2681

17. Alansari, H., Potgieter, L.N. (1994). Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of the ovine respiratory syncytial virus non-structural 1С and IB genes and the small hydrophobic protein gene. J. Gen. Virology 75, 401404.

18. Atreya, P., Grosfeld, H., Mink, M., and Collins, P. (1995). Mutational analysis of the 3'-leader RNA sequence of human respiratory syncytial virus (RSV). American Society for Virology 14th meeting, Abstr. W40-8, p. 195.

19. Atreya PL, Peeples ME, Collins PL. The NS1 protein of human respiratory syncytial virus is a potent inhibitor of minigenome transcription and RNA replication. J Virol 1998;72:1452-1461.

20. Barik S. Transcription of human respiratory syncytial virus genome RNA in vitro: Requirement of cellular factor(s). J Virol 1992;66:6813-6818.

21. Barclay, W.S., and Palese, P. 1995. Influenza В viruses with site-specific mutation introduced into the HA gene. J. Virol.69, 1275-1279.

22. Baron, M.D., and Barrett, T.1997. Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J. Virol/l\, 1265-1271.

23. Bass, B.L., Weintraub, H., Cattaneo, R., Billeter, M.A. (1989). Biased hypermutation of viral RNA genomes could be due to unwinding/modification of double-stranded RNA. Cell 56(3), 331.

24. Berthiaume L, Joncas J, Pavilanis V. Comparative structure, morphogenesis and biological characteristics of the respiratory syncytial (RS) virus and the pneumonia virus of mice (PVM). Arch Gesamte Virusforsch 1974; 45:39-51.

25. Bjorklund H., Stadejek Т., Vilcek S., Belak S., 1997. Molecular characterization of the 3' noncoding region of classical swine fever virus vaccine strains. Virus Genes. 16, 307-312.

26. Bolin S. R. 1993. Immunogens of bovine viral diarrhea virus. Vet. Microbiol. Vol. 37. (3-4). P. 236-271.

27. Воуег, J-C., Haenni, A.-L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology, 1994, 198, 415-426.

28. Bridgen, A., and Elliott, R.M.1996. Rescue of a stgmented negative-strand RNA virus entirely from cloned complementary DNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 15400-15404.

29. Brock, К.V., R. Deng, and S. M. Riblet. Nucleotide sequencing of 5' and 3' termini of bovine viral diarrhea virus by RNA ligation and PCR. 1992, Virol. Methods, 38,39-46.

30. Broughan, J.H., Randolph, V.B., Tatem, J.M. (1997). Biochemical characterization of two temperature-sensitive and attenuated strains of respiratory syncytial virus subgroup B. J. Virology, 71 (7), 4962-70.

31. Bukreyev A, Camargo E, Collins PL. Recovery of infectious respiratory syncytial virus expressing an additional, foreign gene. J Virol 1996;70:6634-6641.

32. Bukreyev A, Whitehead SS, Prussin C, Murphy BR, Collins PL. 2000. Effect of coexpression of interleukin-2 by recombinant respiratory syncytial virus onvirus replication, immunogenicity, and production of other cytokines. J Virol; 74(15):7151-7157.

33. Calder LJ, Gonzalez-Reyes L, Garcia-Barreno B, et al. Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies. Virology 2000;271:122-131.

34. Castrucci, M.R., and Kawaoka, Y.1995. Reverse genetics system for generation of an influenza A virus mutant containing a deletion of the carboxyl-terminal residue of M2 protein. J. Virol.69, 2725-2728.

35. Cartee TL, Wertz GW, 2001. Respiratory syncytial virus M2-1 protein requires phosphorylation for efficient function and binds viral RNA during infection. J Virol. 75(24): 12188-12197.

36. Cattaneo, R. Biased (A-I) hypermutation of animal RNA virus genomes. (1994). Current Opinion in Genetics & Development 4, 895-900.

37. Cattaneo, R., Schmid, A., Eschle, D., Baczko, K., ter Meulen, V., Billeter, M.A. (1988). Biased hypermutation and other genetic changes in defective measles viruses in human brain infections. Cell 55,255-265.

38. Chen M.D., Vazquez M., Buonocore L., Kahn J.S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J Infect Dis. 2000 Oct; 182(4): 1228-33.

39. Clarke, D.K., Sidhu, M.S., Johnson, J.E., Udem, S.2000. Rescue of mumps virus from cDNA . J. Virol.74,4831-4838.

40. Coates, H.V., Kendrick, L. and Chanock, R. M. (1963). Antigenic differences between two strains of respiratory syncytial virus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 112, 958-964.

41. Colijn E.O., Bloemraad M., Wensvoort G. (1997), An improved ELISA for the detection of serum antibodies directed against classical swine fever virus. Vet. Microbiol. 59, 15-25.

42. Collett M. S., Larson, R., Gold, C., Strick, D., Anderson, D. and Purchio, A.F. 1988. Molecular cloning and nucleotide sequence of the pestivirus bovine viral diarrhea virus. Virology, 165, 191-199.

43. Collins P.L., Camargo E, Hill M.G. Support plasmids and support proteins required for recovery of recombinant respiratory syncytial virus. Virology 1999;259:251-255.

44. Collins P.L., Hill M.G., Cristina J, et al. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93; 81-85.

45. Collins, P.L., Hill, M.G., Johnson, P.R. (1990a). The two open reading frames of the 22K mRNA of human respiratory syncytial virus: sequence comparisonof antigenic subgroups A and В and expression in vitro. J. Gen. Virology 71, 3015-3020.

46. Collins P.L., Huang Y.T., Wertz G.W. Nucleotide sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus. Proc Natl Acad Sci USA 1984; 81; 7683-7687.

47. Collins P.L., Mottet G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J.Gen.Virol. 1993; 74:1445-1450.

48. Collins, P.,L., Olmsted Д.А., Johnson, P.R. (1990b). The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virology 71, 1571-1576.

49. Collins, P.L. (1991) The molecular biology of human respiratory syncytial virus (RSV) of the genus Pneumovirus. In "The Paramyxoviruses" (D.W. Kingsbury, Ed.), pp. 103-162. Plenum, New York.

50. Collins, P.L., Mcintosh, K., and Chanock, R.M. (1996). Respiratory syncytial virus. In "Virology" (B.N. Fields, D.M. Knipe et al. Eds.), 3rd ed., pp. 13131351. Raven Press, New York.

51. Collins, P.L., Wertz, G.W. (1985). The 1A protein gene of human respiratory syncytial virus: nucleotide sequence of the mRNA and a related polytranscript. Virology 141,283-291.

52. Connors, M., Crowe, J.E.Jr., Firestone, C.-Y., Murphy, B.R., and Collins, P.L. (1995). A cold-passaged, attenuated strain of human respiratory syncytial virus contains mutations in the F and L genes. Virology 208, 000-000.

53. Dahle, J., and Liess, B. Comparative study with cloned classical swine fever virus strains Alfort and Glentorf: clinical, pathological, virological and serological findings in weaner pigs. Wiwn. Tiearaerztl. Monatsschr., 1995, 83, 232-238.

54. Durbin, A.P., Hall, S.L., Siew, J.W., Whiteheard, S.S., Collins, P.L., and Murphy, B.R. 1997. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology 235, 323-332.

55. Enami, M., Luytjes, W., Krystal, M., and Palese, P. 1990. Introduction of site-specific mutations into the genome of influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3802-3805.

56. Ericson G.A. Hog Cholera (Swine fever). In: Vet. Diagn. Virology. Mosby year book. USA, Ed. A.E. Castro, W.P.Heushele, 1992, 228-230.

57. Fearns R, Collins PL. Role of the M2-1 transcription antitermination protein of respiratory syncytial virus in sequential transcription. J Virol 1999(b);73:5852-5864.

58. Fearns R, Collins PL, Peeples ME., 2000. Functional analysis of the genomic and antigenomic promoters of human respiratory syncytial virus. J Virol;74( 13):6006-6014.

59. Fearns R, Peeples ME, Collins PL. Increased expression of the N protein of respiratory syncytial virus stimulates minigenome replication but does not alter the balance between the synthesis of mRNA and antigenome. Virology 1997; 236:188-201.

60. Fearns R, Peeples ME, Collins PL. 2002. Mapping the transcription and replication promoters of respiratory syncytial virus. J Virol., Feb;76(4): 1663-72

61. Feldman SA, Hendry RM, Beeler JA. Identification of a linear heparin binding domain for human respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G. J Virol 1999;73:6610-6617.

62. Felsenstein J. 1978. The number of evolutionary trees, Syst. Zool., Vol. 27. -P. 27-33.

63. Felenstein, J., 1993. PHYLIP Inference Package Version 3.5. Department of Genetics, Univ. of Washington, Seattle, USA.

64. Flick, R., and Pettersson, R.F.2001. Reverse genetics system for Uukuniemi virus (Bunyaviridae): RNA polymerase I-catalyzed expression of chimeric viral RNAs. J. Virol.75, 1643-1655.

65. Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O.G., Palese, P., Brownlee, G.G., and Garcia-Sastre, A. 1999. Resuce of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol.73, 9679-9682.

66. Franki R.I. В., Faquet C.M., Knudson D.L., Brown F. (editors), 1991 . Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Archives of Virology. Supplementum 2, 223-233.

67. Gassen, U., Collins, F. M., Duprex, W. P., and Rima, В. K. 2000. Establishment of a rescue system for canine distemper virus. J.Virol. 14, 1073710744.

68. Hardy RW, Harmon SB, Wertz GW. Diverse gene junctions of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated antitermination. J Virol 1999; 73:170176.

69. Hardy RW, Wertz GW. The product of the respiratory syncytial virus M2 gene ORF1 enhances readthrough of intergenic junctions during viral transcription. J Virol 1998; 72:520-526.

70. Hardy RW, Wertz GW. The Cys (3)-His (1) motif of the respiratory syncytial virus M2-1 protein is essential for protein function. J Virol 2000; 74:58805885.

71. He, В., Paterson, R. G., Ward, C. D., and Lamb, R. A. 1997. Recovery of infectious SV5 from cloned DNA and expression of a foreign gene. Virology 237, 249-260.

72. Heminway, B.R., Yu, Y., Tanaka, Y., Perrine, K.G., Gustafson, E., Bernbstein, J.M., Galinski, M.S. (1994). Analysis of respiratory syncytial virus F, G, and SH proteins in cell fusion. Virology 200, 801-805.

73. Hendricks DA, Mcintosh K, Patterson JL. Further characterization of the soluble form of the G glycoprotein of respiratory syncytial virus. J Virol 1988;62:2228-2233.

74. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y, Hobom, G., and Webster, R. G. 2000. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6108-6113.

75. Hoffmann, E., and Webster, R. G. 2000. Unidirectional RNA polymerase 1-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids. J. Gen. Virol. 81, 2843-2847.

76. Hoffman, M. A., and Banerjee, A K. (1997). An infectious clone of human parainfluenza virus type 3. J. Virol. 71, 4272-4277.

77. Hulst M. M., Westra D.F., Wensvoort G., Moormann R. J.M. Glycoprotein El of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera. J. Virology, 1993, 67, 9, 5435-5442.

78. Jacques, J-P., Hausmann, S., and Kolakofsky, D. (1994). Paramyxovirus mRNA editing leads to G deletions as well as insertions. EMBO J. 13, 54965503.

79. Jameson B. A., Wolf H.The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput Appl Biosci. 1988 Mar;4(l):181-6.

80. Jin, H., Clarke, D., Zhou, H. Z., Cheng, X., Coelingh, K., Bryant, M., and Li, S.1998. Recombinant human respiratory syncytial virus (RSV) from cDNA and construction of subgroup A and В chimeric RSV. Virology 251, 206-214.

81. Jin H, Cheng X, Zhou HZ, et al. Respiratory syncytial virus that lacks open reading frame 2 of the M2 gene (M2-2) has altered growth characteristics and is attenuated in rodents. J Virol 2000; 74:74-82.

82. Johnson, P.R. and Collins,P.L. (1990). Sequence comparison of the phosphoprotein mRNAs of antigenicsubgroups A and В of human respiratory syncytial virus identifies a highly divergent domain in the predicted protein J. Gen. Virol. 71,481-485.

83. Johnson, P.R. and Collins, P.L. (1989). The 1B(NS2), 1C(NS1) and N proteins of human respiratory syncytial virus (RSV) of antigenic subgroups A and B: sequence conservation and divergence within RSV genomic RNA J. Gen. Virol. 70, 1539-1547.

84. Johnson, P.R. and Collins, P.L. (1988a). The fusion glycoproteins of human respiratory syncytial virus of subgroups A and B: Sequence conservation provides a structural basis for antigenic relatedness. J. Gen. Virol. 69, 26232628.

85. Johnson, P.R., and Collins, P.L. (1988b). The A and В subgroups of human respiratory suncytial virus: comparison of intergenic and gene-overlap sequences. J. Gen. Virol. 69, 2901-2906.

86. Johnson PR, Spriggs MK, Olmsted RA, et al. The G glycoprotein of human respiratory syncytial viruses of subgroups A and B: Extensive sequence divergence between antigenically related proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 1987; 84:5625-5629.

87. R. A.Karron, D. A. Buonagurio, A. F. Georgiu, S. S. Whitehead, J. E. Adamus, M. L. Clements-Mann, D. O. Harris, V. B. Randolph, S. A. Udem, B. R. Murphy, and M. S. Sidhu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13,961» 13,966, 1997

88. Kalica AR, Wright PF, Hetrick FM, et al. Electron microscopic studies of respiratory syncytial temperature-sensitive mutants. Arch Gesamte Virusforsch 1973;41:248-258.

89. Koning M., Lengsfeld Т., Pauly Т., Stark R., Thiel H.J. Classical swine fever virus: independent induction induction of protective immunity by two structural glycoproteins. J. Virol. (1995), 69, 6479-6481

90. Kozak, M. The scanning model for translation: an update. 1989, J. Cell Biol., 108, 229-241

91. Kuo L, Fearns R, Collins PL. Analysis of the gene start and gene end signals of human respiratory syncytial virus: Quasi-templated initiation at position 1 of the encoded mRNA. J Virol 1997; 71: 4944-4953

92. Kuo L, Grosfeld H, Cristina J, et al. Effects of mutations in the gene-start and gene-end sequence motifs on transcription of monocistronic and dicistronic minigenomes of respiratory syncytial virus. J Virol 1996; 70: 6892-6901.

93. Kuo MYP, Sharmeen L, Dinter-Gottlieb G, Taylor J. Characterization of self-cleaving RNA sequences on the genome and antigenome of human hepatitus delta virus. J Virol 1988; 62: 4439^1444.

94. Langedijk JP, Schaaper WM, Meloen RH, et al. Proposed three-dimensional model for the attachment protein G of respiratory syncytial virus. J Gen Virol 1996;77:1249-1257.

95. Laude, H. Virus de la peste porcine classique: isolement d'une souche cytolytique a partir de cellules IB-RS2. 1978, Ann. Inst. Psteur Microbiol. 129A: 553-561.

96. Levine S, Klaiber-Franco R, Paradiso PR. Demonstration that glycoprotein G is the attachment protein of respiratory syncytial virus. J Gen Virol 1987;68:2521-2524.

97. Levorban Y., Edwards S., Ibata G., Vannier P. (1990), A blocking ELISA to differentiate hog cholera virus antibodies in pig sera from those due to other pestivirus. Ann. Rech. Vet. 21, 119-129.

98. Liess B. (ed.) 1988. Classical swine fever and related viral infections. Developments in Veterinary Virology, Boston: Martinus Nijhoff Publishing.

99. Lopez J.A., Bustos R., Orvell C., et al. Antigenic structure of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein. J. Virol. 1998; 72:6922-6928.

100. Lowings, P., Ibata, G., Needham, J., Paton, D. (1996): Classical Swine Fever Virus Diversity And Evolution. J. Gen. Virology 77, 1311-1321.

101. Martinez I, Dopazo J, Melero JA. Antigenic structure of the human respiratory syncytial virus G glycoprotein and relevance of hypermutationevents for the generation of antigenic variants. J Gen Virol 1997;78:2419-2429.

102. Marriott AC, Smith JM, Easton AJ. 2001, Fidelity of leader and trailer sequence usage by the respiratory syncytial virus and avian pneumovirus replication complexes. J Virol; 75(14): 6265-6272.

103. Mebatsion T, Verstegen S, De Vaan LT, Romer-Oberdorfer A, Schrier CC A recombinant newcastle disease virus with low-level V protein expression is immunogenic and lacks pathogenicity for chicken embryos. J Virol 2001 Jan; 75(l):420-428.

104. Melero JA, Garcia-Barreno B, Martinez I, et al. Antigenic structure, evolution and immunobiology of human respiratory syncytial virus attachment (G) protein. J Gen Virol 1997;78: 2411-2418.

105. Mena, I., Vivo, A, Perez, E., and Portela, A. 1996. Rescue of a synthetic chloramphenicol acetyltransferase RNA into influenza virus-like particles obtained from recombinant plasmids. J. Virol. 70, 5016-5024.

106. Meyers G., Rumenarf Т., Thiel H.J. (1989): Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171, 555567.

107. Mink, M.A., Stec, D.S., and Collins, P.L. (1991). Nucleotide sequences of the 3' leader and 5' trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA. Urology 185, 615-624.

108. Moenning V. Characteristics of the virus. (1988), In: Liess B. (Ed.) Classical swine fever and related infections. Martinus Nijhoff Publishing, Djston Dordrecht Lancaster, h. 55-80.

109. Moening V., Schageman G., Dahle J., Greiser-Wilke I., Leder L. (1990), A new approach for the diagnosis of hog cholera. Dtsch. Tieratztl, Wsch. 97, 9193.

110. Moormann, R. Live attenuated pseudorabies virus expressing envelope glycoprotein El of hog cholera virus protects swine both against pseudorabies and hog cholera. J. Virol. 1991, 65, 2761-2765.

111. Moorman R. J. M., Warmerrdam P. A. M., van der Meer В., Hulst M. M. 1990 Nucleotide sequence of hog cholera virus RNA: properties of the polyprotein encoded by the open reading frame spanning the viral genomic RNA. Vet. Microbiol. Vol. 23. P. 185-191.

112. Moormann R. J. M., Van Gennip H. G. P., Miedema G. K. W., Hulst M. M., Van Rijn P. A. (1996): Infection RNA transcribed from an engineered full-length cDNA template of the genome of a pestivirus. J. Virol. 70, 763-770.

113. Muller A., Depner K.P., Liess B. (1996), Evaluation of a gp55 (E2) recombinant-based ELISA for the detection of antibodies induced by classical swine fever virus. Dtsch. Tieratztl, Wsch. 103, 451-453.

114. Nepoklonov, E.A., Aliper, T.I., Sergeev, V. A., Dudnikov, L. A., Sologub, V.K., Tsibesov, V.V., Grebennikova, T.V., Zaberezhny, A. D. (2000).

115. Development of tools for eradication of classical swine fever. Oxford, England, 23-28 July, p. 61.

116. Neumann, G., Watanabe, T, Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P.A Hughes, M., Perez, D., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., and I Kawaoka, Y. 1999. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 9345-9350.

117. Pastey, M.K., Samal, S.K. (1995). Nucleotide sequence analysis of the nonstructural NS-1 (1С) and NS-2 (IB) protein genes of bovine respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 76, 193-197.

118. Peeples ME, Collins PL. 2000. Mutations in the 5' trailer region of a respiratory syncytial virus minigenome which limit RNA replication to one step. J Virol; 74(1): 146-55.

119. Peeters BP, de Leeuw OS, Verstegen I, Koch G, Gielkens AL Generation of a recombinant chimeric Newcastle disease virus vaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals. Vaccine 2001 Feb 8; 19(13-14): 1616-1627.

120. Pekosz, A, He, В., and Lamb, R. A. 1999. Reverse genetic of negative-strand RNA viruses: Closing the circle. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 8804-8806.

121. Pleschka S, Jaskunas R, Engelhardt OG, et al. A plasmid-based reverse genetics system for influenza A virus. J Virol 1996;70:4188-4192.

122. Poch, О., Souvaget, I., Delarue, M., and Tordo, N. (1989). Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements. EMBO J. 8, 3867-3874.

123. Pringle, C.R., Filipiuk, A.H., Robinson, B.S., Watt, P.J., Higgins, P., and Tyrrell, D.A.J. (1993). Immunogenecity and pathogenecity of a triple temperature-sensitive modified respiratory syncytial virus in adult volonteers. Vaccine 11,473-478.

124. Purchio A. F., Larson R., Collet M. 1984. Characterization of bovine viral diarrhea viral proteins J. Virol. Vol. 189. P. 666-669.

125. Qi F., Ridpath J. F., Lewis T. et al. 1992. Analysis of the bovine viral diarrhea virus genome for possible cellular insertion. Virology. Vol.189. P. 285-292.

126. Radecke, F, Spielhofer, P., Schneider, H., Kaelin, K., Huber, M., Dotsch, C., Christiansen, G., and Billeter, M. A. 1995. Rescue

127. Randolph, V.B., Kandis, M., Stemler-Higgins, P., Kennelly, M.S., McMullen, Y.M., Speelman, D.J., and Weeks-Levy, C. (1994). Attenuated temperature-sensitive respiratory syncytial virus mutants generated by cold adaptation. Virus Res. 33,241-259.

128. Rixon HW, Brown C, Brown G, Sugrue RJ. 2002. Multiple glycosylated forms of the respiratory syncytial virus fusion protein are expressed in virus-infected cells. J Gen Virol; 83:61-6

129. Roberts SR, Compans RW, Wertz GW. Respiratory syncytial virus matures at the apical surfaces of polarized epithelial cells. J Virol 1995;69:2667-2673.

130. Roberts SR, Lichtenstein D, Ball LA, et al. The membrane-associated and secreted forms of the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G are synthesized from alternative initiation codons. J Virol 1994;68:4538-4546

131. Roberts, A, and Rose, J. K. 1998. Recovery of negative-strand RNA viruses from plasmid DNAs: A positive approach revatilizes a nega-tive field. Virology 247, 1-6.

132. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, Т., Buchholz, U. J., and Mettenleiter, Т. C. 1999. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80, 2987-2995.

133. Ruggli N., Tratschin J.-D., Mittelholzer C., Hofmann M. A. (1996): Nucleotide sequence of classical swine fever virus strain Alfort/187 and transcription of infectious RNA from stably cloned full-length cDNA. J. Virol. 70, 3478-3487.

134. Rumenapf Т., Stark R., Meyers G., Thiel H.-J. Structural proteins of hog cholera virus expressed by vaccinia virus: futher characterization and induction of protective immunity. Journal of Virology, 1991, 65, 589-597.

135. Rumenapf, Т., Unger, G., Strauss, J.H., Theil, H.-J. Processing of the envelope glycoproteins of pestiviruses. 1993, J.Virol., 67, 3288-3294.

136. Saitou N., Nei, M. (1987): The Neighbos-Joining Method: A New Model For Reconstructing Phylogenetic Trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406-425.

137. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

138. Schnell, M. J., Mebatsion, Т., and Conzelmann, К. K.1994. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203.

139. Schroder A, van Loon AA, Goovaerts D, Teifke JP, Mundt E VP5 and the N terminus of VP2 are not responsible for the different pathotype of serotype I and II infectious bursal disease virus. J Gen Virol 2001 Jan; 82(Pt 1):1 p. 5969

140. V. Sergeev, L. Dudnikov, K. Gruzdev, T. Grebennikova and E. Nepoklonov. Some Aspects of Hog Cholera Virus Cultivaton. Proceedings of the Third ESW Symposium on Pestivirus Infections, ID-DLO, Lelystad, The Netherlands, 1996, p. 132.

141. V.A. Sergeev, K. N. Gruzdev, E. A. Nepoklonov, Т. I. Aliper New Efficacious Live Vaccine Against Classical Swine Fever and its Application Strategy to Fight the Disease without Depopulation of Swine. Тезисы на

142. Международное координационное совещание ФАО по проблемам классической чумы свиней, Birmingham,июль 1998 г.

143. Stark R., Rumenapf Т., Meyers G., Thiel H.-J. 1990 Cenomic localization of hog cholera virus glycoproteins. Virology. Vol. 174. P. 286-289.

144. Stec, D.A., Hill, M.G. Ill, and Collins, P.L. (1991). Sequence analysis of the polymerase L gene of human respiratory syncytial virus and predicted phylogeny of nonsegmented negative strand viruses. Virology 183, 273-297.

145. Subbarao, E. K., Kawaoka, Y, and Murphy, B. R.1993. Rescue of influenza A virus wild-type PB2 gene and a mutant derivative bearing a site-specific temperature-sensitive and attenuating mutation. J. Virol. 67, 7223-7228.

146. Sullender WM., 2000. Respiratory syncytial virus genetic and antigenic diversity. Clin Microbiol Rev.: 13(1), 1-15.

147. Sutherland KA, Collins PL, Peeples ME, 2001. Synergistic effects of gene-end signal mutations and the M2-1 protein on transcription termination by respiratory syncytial virus. Virology, 288(2): 295-307.

148. Techaarpornkul S, Barretto N, Peeples ME. (2001). Functional analysis of recombinant respiratory syncytial virus deletion mutants lacking the small hydrophobic and/or attachment glycoprotein gene. J Virol. 75(15):6825-6834.

149. Teng MN, Collins PL. Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles. J Virol 1998; 72:5707-5716.

150. Teng M.N., Collins P.L. Altered growth characteristics of recombinant respiratory syncytial viruses which do not produce NS2 protein. J Virol 1999; 73:466-473.

151. Teng M.N., Whitehead S.S., Collins P.L. 2001. Contribution of the respiratory syncytial virus G glycoprotein and its secretedand membrane-bound forms to virus replication in vitro and in vivo. Virology; 289(2): 283296.

152. Terpstra C., Wensvoort G. (1988), The protective value of vaccine-induced neutralising antibody titers in swine fever. Vet. Microbiol. 16, 123-128

153. Thiel H.J., Stark R., Weiland E., Rumenapf Т., Meyer G. Hog Cholera Virus: Molecular Composition of virions from a pestivirus. 1991, J. Of Virology, 65, 9, 4705-4712.

154. Terpstra С. 1991. Hog cholera: an update of present knowlege. Br. Vet. J., 147, 397-406

155. Terpstra, C., and G. Wensvoort. 1988. The protective value of vaccine-induced neutralizing antibody titers in swine fever. Vet. Microbiol., 16: 123128.

156. Terpstra C., Woortmeyer R., Barteling S.J. Development and properties of a cell culture produced vaccine for cholera based on the Chinese strain. Dt. Tierarottl. Woch., 1990, 97, 2, 77-79.

157. Yount B, Curtis KM, Baric RS Strategy for systematic assembly of large RNA and DNA genomes: transmissible gastroenteritis virus model. J.Virol 2000 Nov; 74(22): 10600-11

158. Yuan S, Mickelson D, Murtaugh MP, Faaberg KS. Complete genome comparison of porcine reproductive and respiratory syndrome virus parental and attenuated strains. Virus Res 2001 Apr;74(l-2):99-l 10 : Virus Res 2001 Apr;74( 1 -2):99-110

159. Van Oirschot J.T., Terpstra C. Hog cholera virus Virus infections of porcines. Amsterdam, 1989. -P.l 13-130.

160. Van Oirschot, J.T. Description of the virus infection, in: B. Liess (ed.), Classical Swine fever and related virus infections, Martinus Nijhoff Publishing, Boston, 1988, p. 1-25.

161. Van Rijn, P.A., Miedema, G.K.W., Wensvoort, G., vanGennip, H.G.P., Moormann, R.J.M. Antigenic structure of envelope glycoprotein El of hog cholera virus. 1994, Journal of Virology, 68, 3934-3942.

162. Van Rijn, P.A., Bossers, A., Wenswoort, G., Moormann, R.J.M. Classical swine fever virus (CSFV) envelope protein E2 containing one structural antigenic unit protects pigs fromlethal CSFV infection. 1996, Virology, 77, 2737-2746.

163. Vilcek S., Belak S. 1998. Classical Swine Fever Virus: Discrimination Between Vaccine Strains and European Field Viruses by Restriction Endonuclease Cleavage of PCR Amplicons. Acta Vet. Scand., 39, 395-400.

164. Vilcek S., Stadejek Т., Ballagi-Pordany A., Lowings J.P., Paton D.J., Belak S. 1996. Genetic variability of classical swine fever virus. Virus Research, 43, 137-147.

165. Walsh EE, Falsey AR, Sullender WM. Monoclonal antibody neutralization escapes mutants of respiratory syncytial virus with unique alterations in the attachment (G) protein. J Gen Virol 1998; 79: 479-487

166. Walsh EE, Hruska J. Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins: Identification of the fusion protein. J Virol 1983;47: 171-177

167. Weber E, Humbert B, Streckert HJ, et al. Nonstructural protein 2 (NS2) of respiratory syncytial virus (RSV) detected by an antipeptide serum. Respiration 1995; 62:27-33.

168. Weiland E., Ahl R., Stark R., Weiland F., Thiel H.J. (1992), A second envelope glycoprotein mediates neutralization of a pestivirus, hog cholera virus. J. Virol. 66, 3677-3682

169. Wengler G. Flaviviridae. Arch, of Virology, 1991 (Suppl. 2), 223-233.

170. Wensvoort G., Bloemraad M., Terpstra C. (1988), An enzyme immunoassay employing monoclonal antibodies and detecting specifically antibodies in classical swine fever virus. Vet. Microbiol. 17, 129-140

171. Wensvoort, G., Terpstra, C., deKluijver, E.P., Kragten, C., Warnaar, J.C. Antigenic differentiation of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus. Vet. Microbiol., 1989, 21, 9-20.

172. Whelan, S. P., Ball, L. A, Barr, J. N., and Wertz, G. T. 1995. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8388-8392.

173. Whitehead S.S., Bukreyev A., Teng M.N., et al. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J Virol 1999;73:3438-3442

174. Wu HN, Lai MM. Reversible cleavage and ligation of hepatitis delta virus RNA. Science 1989;243:652-654.

175. Zaberezhny, A.D., P. S. Paul and Young S. Lyoo (1994) Prevalence of P Types among Porcine Rotaviruses using Polymerase Chain Reaction generated Subgenomic VP4 Gene Probes. Vet. Microbiology. 39. 1-2. p. 97110

176. Zaberezhny, A.D., S. Tzall, S.W.Harnish, V. Randolph and Crowley, J.C. (1994) Molecular Characterization of Respiratory Syncytial Virus Subgroup В Strain, American Society for Virology, 13th Annual Meeteng , Madison WI, p. 176 (English) .

177. Zamora, M., Samal, S.K. (1992). Gene junction sequences of bovine respiratory syncytial virus. Virus Res. 24, 115-121.

178. Zheng, H.Q., Randolph, V.B., and Anderson, L.J. Genetic variability in envelope-associated protein genes of closely related group A strains of respiratory syncytial virus. Virus Res. 1999 Jan;59(l):89-99.

Информация о работе

Забережный, Алексей Дмитриевич
доктора биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.06

Диссертация

Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы