Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кислая фосфатаза гидробионтов как маркерный фермент токсического воздействия на организм

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кислая фосфатаза гидробионтов как маркерный фермент токсического воздействия на организм"

РГБ ОД 2 1 ДЕК

На правах рукописи

ЦВЕТКОВ Илья Леонидович

КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА ГИДРОБИОНТОВ КАК МАРКЕРНЫЙ ФЕРМЕНТ ТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ

Специальность 03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва 1998

Работа выполнена в Московском педагогическом государственном университете на кафедре органической и биологической химии.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Коничев A.C.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Васильев A.B., кандидат биологических наук, доцент Кузнецова Л.В.

Ведущая организация - ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ДЕЗИНСЕКТОЛОГИИ.

Защита состоится « » /"^¿•r^/ij? 1998 г. в ^ir..."часов на заседании Диссертационного Совета К 053.01.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском педагогическом государствешюм университете по адресу: Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корпус 5, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Mill У по адресу. 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1.

Автореферат разослан « » ¿^¿pzj? 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ХОЛМОГОРОВА Н.В.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема адаптации организма к изменяющимся условиям среды на уровне биохимических реакций приобрела в последние годы фундаментальный характер. Особым вниманием в настоящее время пользуется феномен неспецифической адаптации, включающий биохимические процессы, которые происходят в клетке вне зависимости от того, какой стрессовый фактор их вызвал (неспецифический адаптационный синдром), и вместе с тем, позволяют живому организму сохранять гомеостаз.

Интерес, который проявляют исследователи к проблеме биохимической адаптации, является вполне оправданным. С одной стороны - это новое перспективное направление в области экологии (биохимическая экология), которое включает исследование молекулярных механизмов, позволяющих живому организму существовать в постоянно меняющихся условиях окружающей среды. С другой стороны, в связи с мощной техногенной нагрузкой на биосферу, изучение биохимических процессов адаптации, в особенности неспецифической, позволяет более детально рассмотреть роль антропогенного фактора среды в молекулярной изменчивости и эвотоциошюм процессе. Данный аспект проблемы актуален в практическом отношении, поскольку большинство существующих методов оценки качества водной среды к настоящему времени существенно устарели, и не могут уже отвечать современным требованиям биомониторинга.

Наиболее перспективными в этом отношении сейчас общепризнано считать методы биохимического тестирования или индикации, где в качестве критерия жизнедеятельности организмов в тех или иных условиях среды рассматривают такие показатели, как активность ферментов, качественный состав белковых спектров и пр.

Такой подход объясняется тем, что любому физиологическому, а тем более морфологическому нарушению нормы предшествуют определенные биохимические процессы. Именно последние являются причиной изменения физиологического состояния живого организма, ухудшения качества его потомства или гибели самого организма.

Определение биохимических показателей открывает возможность регистрировать отклонения от нормы в живом организме еще до момента проявления у него морфологических и физиологических сдвигов, т.е. позволяет проводить ратгсе биохимическое тестирование качества среды обитания.

Цель н задачи исследовапия. Основной целью нашего исследования стала детальная характеристика изменений функциональных параметров

комплекса кислых фосфатаз, развившихся у ряда в результате токсического воздействия на организм.

Для достижения этой цели были поставлены следующие главные задачи:

1. Исследовать физико-химические и функциональные свойства комплекса кислых фосфатаз в норме у различных гидробионгов.

2. Проследить динамику адаптивных изменений кислых фосфатаз гидробиоптов под воздействием хлорида кадмия. Оценить, насколько характер адаптивных изменений универсален для разных видов животных и насколько выявленные изменения существенны для функционирования исследуемых ферментов.

3. Изучить возможность использования комплекса кислых фосфатаз в качестве маркерного биохимического показателя для определения токсического воздействия на организм. Исследовать на практике чувствительность, воспроизводимость и целесообразность такого рода определений в сравнении с уже существующими методами оценки качества водной среды.

Научная новизна работы. Впервые исследованы и описаны различные свойства комплекса кислых фосфатаз у ряда видов из разных систематических групп водных животных.

Подробно изучена зависимость ферментативной активности кислых фосфатаз гидробионтов от концентрации токсиканта (хлорид кадмия) в воде и продолжительности его воздействия на организм. Показано, что воздействие хлорида кадмия у изученных гидробионтов вызывает однотипную (универсальную) ответную реакцию, которую можно рассматривать в качестве показателя интоксикации, и но его величине у тест-объекта определять степень токсичности водной среды.

Впервые выделены и охарактеризованы кислые фосфатазы из печени моллюска живородка речная (Viviparus viviparus), исследованы их субклеточная локализация и тканеспецифичность. Кроме того, выделена и подробно изучена индуцибельная (адаптационная) кислая фосфатаза, появляющаяся в ответ на интоксикацию организма хлоридом кадмия.

На примере кислой фосфатазы как тест-фермента показана возможность точного определения степени загрязнения воды в условиях естественного гидробиоценоза.

Практическое значепие работы. Результаты работы обосновывают целесообразность проведения массовых анализов по биотестированию и биоиндикации вод различного происхождения с использованием в качестве тест-ферментов или ферментов-индикаторов комплекса кислых фосфатаз из печени живородки речной (Viviparus viviparus L.). С этой целью разработаны рекомендации по выделению кислых фосфатаз, оптимизации условий выявления их активности различными методами, а

также упрощенная схема надежного определения ряда свойств фосфатаз именно для целей биотестирования и биоиндикации. Показано, что чувствительность и достоверность проведенных анализов сопоставимы, а чаще, существенно выше в сравнении с используемыми методами определения качества вод (гидрохимический анализ, дафниевый тест, биологическая индикация).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на I Международной и IV Всероссийской научно-практической конференции «Экология и охрана окружающей среды» (Рязань, 15-16 сентября 1994 г.), VII Съезду Гидробиологического общества РАН (Казань, 14-15 октября 1996 г.), научной конференции «Вузовская наука в решении экологических проблем Верхне-Волжского региона» (Ярославль, 18-19 апреля 1996 г.), научной конференции «Биологические исследования в Ярославском государственном университете» (Ярославль, 29 ноября 1997 г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит го введения, обзора литературы (глава 1), отражающего современные представления о кислой фосфатазе и роли этого фермента в процессах молекулярной и клеточной адаптации; характеристики материалов и описания методов исследования (глава 2); изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных (главы 3-6); заключения, выводов и списка цитированной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили водные животные (отдельные органы или тела целиком) разных систематических групп: брюхоногие моллюски - катушка роговидная двух внутривидовых форм (Planorbarius corneus L.), битшшя (Bithynia troscheli Paasch), живородка речная (Vivíparas vivíparas L.); двустворчатые моллюски - уния (Unió longirostris Rossmaessler) и беззубка обыкновенная (Anodontha stagnalis Gmelin); ракообразные - дафния (Daphnia magna Straus), и рыбы - толстолобик (Hypophtalmichtis molytrix).

В разных вариантах лабораторного токсикологического эксперимента исследовали воздействие водных растворов хлорида кадмия в концентрациях от 0.001 до 10 мг-ион кадмия на 1 л. (продолжительность опытов - от 12 до 120 часов), а также, на примере живородки речной -воздействие разных концентраций сточной воды химического предприятия (з-д «Лакокраска», г. Ярославль).

Экстракты из целых животных и их отдельных органов получали в процессе гомогенизации образцов с 8-и кратным объемом экстрагирующей

жидкости (вода, 0.25М раствор сахарозы, 0.15М раствор NaCl) и последующем центрифугировании при Ю'000 g. Для полного извлечения растворимых белков из гомогената тканей применяли детергент Тритон X-100. Содержание общего белка в экстрактах определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976).

Ферментативную активность кислых фосфатаз (КФ) определяли спектрофотометрически с р-нитрофенилфосфатом в качестве субстрата и выражали в микромолях р-нитрофенола (р-НФ), образующегося за 1 мин на 1 мг белка. Фракционирование кислых фосфатаз вели методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по Дэвису (Davis, 1964) с последующим окрашиванием гелевых блоков по Лойда (Лойда и др., 1982) (с а-нафтилфосфатом путем последовательного азосочетания с прочным синим Б). Относительную активность кислых фосфатаз в процентах к суммарной определяли путем сканирования окрашенных гелевых блоков на денситометре Ultroscan XL (LKB, Швеция).

Субклеточную локализацию кислых фосфатаз определяли методом дифференциального центрифугирования с последующей очисткой «легких» субклеточных фракций через сахарозный градиент по Саванту (Sawant et al., 1964). Экстракцию белков из полученных субклеточных фракций (ядра, тяжелые и легкие митохондрии, лизосомы, цитозоль) проводили 0.5%-ным раствором тритона Х-100 в воде при многократном замораживании-оттаивании. Затем экстракты центрифугировали при 20'000 g.

Выделение и очистку индивидуальных кислых фосфатаз проводили методом препаративного изоэлектрофокусирования в слое ультрадекса с амфолинами в градиенте pH 3.5-9.5 на приборе электрофореза Multiphor (LKB, Швеция). Полученные препараты фосфатаз использовали для анализа субстратной специфичности в отношении различных сшггетических и природных субстратов методом Фиске-Суббароу в модификации Хейнонена-Лати (Heinonen, Lahti, 1981)

Результаты и обсуждение

Первым этапом работы стало исследование изменений активности комплекса КФ при воздействии хлорида кадмия на организм ряда гидробионтов (табл. 1).

Комплекс КФ в норме у отдельных особей исследованных видов гидробионтов (активность и число зон в ПААГ), проявил исключительную видоспецифичность внутри всех экспериментальных выборок животных (от одной особи до нескольких десятков в пробе). Отклонения от средних значений суммарной ферментативной активности, электрофоретической подвижности (RI) и активности отдельных фосфатаз не превышают статистически достоверных величин. Исключение составил лишь один вид

моллюсков - катушка роговидная (Р1апогЬаиш согнет Ь.). Данный вид характеризуется выраженным внутривидовым полиморфизмом, который описан во многих классических источниках, указывающих на то, что отдельные формы (морфы) вида легко различимы по цвету раковины (в нашем случае, это «красная» и «коричневая» формы) или другим морфологическим признакам. Нами впервые выявлен молекулярный полиморфизм кислых фосфатаз по крайней мере у двух изученных форм данного вида моллюсков. Внутри «красной» и «коричневой» форм катушки роговидной вариаций активности и спектра КФ не обнаружено.

Таблица 1.

Активность комплекса кислых фосфатаз у различных гидробионтов в условиях токсического воздействия хлорида кадмия in vivo

Концентарация Удельная активность фермента,

иона кадмия

и экспозиция мкМ р-НФ Отклонения от Достоверность

опыта мг белка*мин контроля, % отклонений*, р>0.999

Planorbarius corneus, "красная" форма

Контроль 3.5Ш.12

0.5мг/л, 96 ч 3.86±0.12 + 10.0 +

Planorbarius corneus "коричневая" форма

Контроль 4.25±0.13

0.5мг/л, 96 ч 5.29±0.18 +24.5 +

Bithynia troscheli

Контроль 1.69±0.07

0.05мг/л, 24 ч 1.71±0.13 +1.1 -

0.05мг/л, 48 ч 1.90+0.11 +12.6 +

0.05мг/л, 96 ч 2.26+0.12 +33.9 +

Viviparus viviparus, печень

Контроль 5.92±0.08

0.001мг/л, 96 ч 4.44±0.08 -25.0 +

0.01мг/л, 96 ч 6.82±0.09 +15.2 +

0.1мг/л, 96 ч 8.52±0.12 +43.9 +

1.0 мг/л, 96 ч 9.36±0.13 +58.1 +

10.0 мг/л, 96 ч 6.56+0.14 +10.8 +

Daphnia magna

Контроль 3.64+0.11

0.5 мг/л, 96 ч 3.93+0.12 +8.0 +

Продолжение табл.1

Концентрация иона кадмия и экспозиция опыта Удельная активность фермента,

мкМ р-НФ mi- белка*мин ±Д,%* Достоверность отклонений**

Hypophtalmichtis molytrix, печень

Контроль 2.18±0.10

0.05мг/л, 96 ч 5.52±0.12 +153.6 +

0.5мг/л, 96 ч 7.47±0.15 +242.7 +

5мг/л, 96 ч 6.44+0.14 +195.5 +

Hypophtalmichtis molytrix, жабры

Контроль 1.89Ю.07

0.05мг/л, 96 ч. 4.35±0.12 +130.5 +

0.5мг/л, 96 ч. 7.58±0.18 +301.2 +

5мг/л, 96 ч. 3.52±0.10 +86.3 +

Нуро jhtalmichtis molytrix, белые скелетные мышцы

Контроль 0.81+0.08

0.05мг/л, 96 ч. 2.0610.13 +154.8 +

0.5мг/л, 96 ч. 1.50±0.11 +84.4 +

5мг/л, 96 ч. 1.03+0.07 +27.7 +

Примечание к табл. 1:

*Плюс - отклонения от контроля в опыте статистически достоверны с вероятностью р>0.999, минус - отклонения от контроля статистически не достоверны.

Обобщая результаты наших экспериментов и данные, имеющиеся в литературе, следует отметить два важных момента, касающиеся реакции кислых фосфатаз гидробионтов на токсическое воздействие Cd2+ in vivo.

Первое - у всех изученных гидробионтов в ответ на интоксикацию происходит увеличение суммарной активности комплекса КФ, в большинстве случаев прямо пропорциональное дозе токсического воздействия (концентрация токсиканта, экспозиция опыта).

Опыты с толстолобиком и живородкой речной показали, что активирование КФ при интоксикации имеет некоторый предел. Если доза. токсического воздействия в опыте продолжает расти, активность КФ, после достижения определенного максимального значения, начинает снижаться (см. табл. 1.). Воздействие более широкого диапазона концентраций токсиканта на организм моллюска живородка речная обнаружило

существование еще одной фазы адаптивной реакции, сводящейся к снижению активности комплекса КФ в ответ на воздействие очень низких (подпороговых) концентраций кадмия, не превышающих величину ПДК для вод питьевого и хозяйственно-бытового назначения (0.01 мг Сс127л).

Таким образом, адаптивный ответ комплекса КФ («эффект») на интоксикацию кадмием представляет собой синусоидальную кривую, на которой можно выделить три фазы (рис.1), очень характерные для динамики биологического эффекта неблагоприятного воздействия, имеющие строгое теоретическое обоснование с точки зрения термодинамики процессов адаптации и признанные в качестве стандартных в практике токсикологии.

Эффект

Рис. 1. Кривая "доза-эффект", отражающая зависимость величин биохимических или физиологических показателей жизнедеятельности животных ("эффект") от интенсивности токсического воздействия ("доза"); норма - ось абсцисс.

Условные обозначения:

I - фаза затаивания,

II - фаза стимуляции,

III - фаза угнетения.

Первая фаза - затаивание, при этом, по данным литературы, физиологические показатели жизнедеятельности организма приобретают меньшие значения в сравнении с нормой. Организм существует при сниженном обмене и ферментативная активность КФ, по нашим данным, снижается относительно контроля.

Следующая фаза - фаза стимуляции физиологических процессов. Происходит репарация повреждений, включающая ускоренный и, возможно, избирательный синтез белков, синтез нуклеиновых кислот,

ускоренный рост численности клеточных популяций. Суммарная активность комплекса КФ в опыте на этой фазе увеличивается, и именно в эту фазу происходит индукция активности «адаптационных» форм КФ.

Заключительная - фаза угнетения, в течение которой происходит инактивация КФ и, но данным литературы, снижение активности большинства других ферментов. В результате дальнейшее нарастание деструктивных процессов будет идти без ограничений, что приведет к гибели экспериментального животного.

Второй важный момент касается изменений выявляемого числа кислых фосфатаз и их активности у экспериментальных животных при токсическом воздействии in vivo. Эта реакция специфична для определенных условий токсического воздействия, но в целом для всех изученных видов животных выражается в постепенном увеличении доли активности высокоподвижных к аноду кислых фосфатаз.

Наиболее детально комплекс КФ был изучен нами на примере моллюска живородка речная (Viviparus viviparus L.) как самого перспективного тест-объекта из исследованных (данные по всем изученным видам гидробионтов полностью приведены в диссертации -И.Ц.). Все кислые фосфатазы, обнаруженные в печени этого вида моллюсков, были выделены нами в индивидуальном состоянии методом препаративного изоэлектрофокусирования. Степень очистки полученных препаратов КФ составила 80-100 раз. Субклеточное фракционирование клеток печени живородки речной позволило установить субклеточную локализацию выделенных кислых фосфатаз. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Свойства кислых фосфатаз печени живородки речной

Название фермента Субклеточная локализация Rf в 5.7% ПААГ Pi Активность фермента, % к суммарной

КФ1 цитозоль 0.6710.03 4.9 24.1

КФ2 цитозоль 0.53±0.02 5.8 32.5

КФЗ цитозоль 0.41±0.02 7.1 16.4

КФ4 лизосомы 0.32+0.02 6.3 13.8

КФ5 лизосомы 0.23±0.01 6.6 13.3

Cd2f при воздействии in vitro на комплекс КФ живородки речной в большей или меньшей степени ингибирует все обнаруженные кислые фосфатазы. Чувствительность к действию кадмия у разных кислых фосфатаз находится в определенной зависимости от молекулярных свойств

этих ферментов: чем ниже его pl и выше Rf, тем фермент менее чувствителен к Cd2+. Воздействие Cd2+ in vivo приводит к перераспределению активности фосфатаз вплоть до полного ингибирования КФЗ и индукции активности новой «адаптационной» КФ6 (pl=7.1, Rf0.21). Дшпше приведены на рисунке 1.

Rf

2

: :

К-+-6 K<=f=S

К1*?!

0.0

0.25

0.5

0.75

1.0

К 24

48

72 120

Рис. 1. Схемы энзимограмм комплекса КФ печени живородки речной при воздействии кадмия in vivo в концентрации 0.01 мг/л разной продолжительности.

Условные обозначения:

К - контроль; 24,48,72,120 - продолжительность опыта, часы.

Биохимическая адаптация к токсическому воздействию на организм животного проявляется прежде всего на молекулярном уровне. Ионы кадмия, проникающие в клетку, неизбежно становятся одним из ведущих, а, в случае высокой концентрации, и преобладающим фактором микроокружения молекул фермента. Их ингибирующее воздействие на отдельные компоненты комплекса КФ может компенсироваться in vivo индукцией активности новых «адаптационных» форм КФ, имеющих особую роль в обмене веществ или обладающих повышенной резистентностью к кадмию.

Связывая функциональную роль КФ4, КФ5 и КФ6 с деятельностью лизосомального аппарата клетки, можно предположить, что при воздействии токсического вещества рост активности кислых фосфатаз обусловлен повышением роли лизосом в экстремальной ситуации, связанной с автолизом поврежденных субклеточных структур, автофагией

целых клеток и вовлечением в обмен резервного пластического материала, отчасти, с детоксикацией, клеточной дефекацией и пр.

По всей вероятности, в подобных условиях активность лизосомальных гидролаз, их качественный состав, а, возможно, и количество активных молекул ферментов должны возрастать, представлявляя собой один из механизмов, которые позволяют клетке и целому организму поддерживать гомеостаз в экстремальных условиях.

Активность и качественный состав цитозольных фосфатаз (КФ1, КФ2 и КФЗ) при интоксикации животного также изменяются, что в целом приводит к возрастающему преобладанию активности кислых фосфатаз, отличающихся наибольшей подвижностью к аноду. Не исключено, что это происходит из-за большей устойчивости таких ферментов к кадмию, однако, не менее вероятно и то, что КФ1 и КФ2, активирующиеся при воздействии кадмия in vivo, обладают определенными свойствами, которые становятся полезны животному организму для адаптации к токсическому воздействию.

Для более детальной характеристики роли кислых фосфатаз печени живородки речной в обмене веществ мы исследовали субстратную специфичность этих ферментов в норме (табл. 3).

Таблица 3.

Субстратная специфичность кислых фосфатаз печени живородки речной

Субстрат Активность фермента, % к р-нитрофенилфосфату

КФ1 КФ2 КФЗ КФ4 КФ5

р-Нитрофенилфосфат 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

а-Нафтилфосфат 75.4 - - 63.8 48.6

сс-Глицерофосфат 55.7 16.7 0.0 32.8 18.6

Р-Глицерофосфат 73.8 16.7 0.0 14.8 13.2

Глюкозо-1 -фосфат 19.8 - 0.0 - 0.0

Глюкозо-6-фосфат 73.8 - - - 0.0

Фруктозо-6-фосфат 57.4 27.8 0.0 53.4 -

Фруктозо-1,6-дифосфат 103.2 55.6 0.0 0.0 0.0

Рибозо-5-фосфат 31.1 - 0.0 - -

АТФ 52.5 - 0.0 23.8 14.3

АДФ 10.0 15.2 360.0 15.6 0.0

АМФ 0.0 12.3 0.0 12.6 -

Особый интерес представляет фермент, специфичный к АДФ (КФЗ) и фосфатазы, расщепляющие преимущественно фрукгозо-1,6-дифосфат (КФ1 и КФ2). Эти ферменты, локализованные в цитозолс (см. табл. 2), по нашему

мнению, принимают участие в регуляции углеводного обмена, а следовательно, энергетического обмена в целом, что особенно важно для адаптации организма к экстремальным условиям существования.

В силу того, что при интоксикации кадмием происходит изменение активности цитозольных КФ, их субстратная специфичность в целом изменяется разнонаправленно. КФЗ в опыте ингибируется и, как следствие, пропадает возможность расщеплять АДФ, накапливать АМФ и таким образом стимулировать гликолиз. КФ2 и, особенно, КФ1, напротив, активируются при воздействии кадмия. В результате торможение гликолиза и накопление свободной фруктозы должно происходить с большей интенсивностью, чем в норме.

Лизосомалыше кислые фосфатазы (КФ4 и КФ5) неспецифичны к субстрату. Их гидролитическая активность полностью зависит от состояния лизосомальиого аппарата клетки, и факт активирования КФ4 и КФ5 при воздействии кадмия in vivo может считаться, по нашему мнению, показателем состояния лизосомальиого аппарата в целом в условиях повреждающего воздействия токсиканта.

Важно отметить в связи с этим индукцию активности лизосоматьной КФ6, которая происходит в определенных условиях токсикологического опыта. Ее участие в обмене веществ клетки, также как и других лизосомальных фосфатаз, может проявиться только после активирования лизосом, однако, в отличие от КФ4 и КФ5, этот фермент специфичен к определенному субстрату (фруктозо-б-фосфат) и, по всей видимости, способен, наряду с цитозольными КФ, участвовать в регуляции углеводного обмена, дублируя или замещая специфические фосфатазы в условиях токсического воздействия на организм животного.

Таким образом, комплекс КФ печени живородки речной представляет собой систему, тонко регулирующую процессы обмена в организме и адаптирующую их к определенным условиям существования животного, а следовательно, может являться маркером токсического воздействия in vivo. Последнее утверждение мы проверили на заключительном этане нашей работы в опытах со сточной водой химического производства, качественный состав, которой нам известен не был.

Пробы сточной воды отбирали из коллектора ливневой канализации завода «Победа рабочих» («Лакокраска», г. Ярославль), которые для опытов разбавляли водой питьевого качества в разных пропорциях. Ориентировочную степень токсичности полученных проб сточной воды определяли с помощью дафниевого теста. У живородки речной по истечении экспозиции токсического воздействия (96 ч) определяли суммарную активность КФ из печени, а затем рассчитывали величину отклонения единиц активности КФ в опыте в процентах к контролю (табл.4).

Таблица 4.

Данные биологического и биохимического тестирования качества сточной воды разной концентрации

Концентрация Дафнисвый тест Активность кислой фосфатазы

сточной воды

в пробе Процент Достоверность Отклонения от Достоверность

гибели отклонении от контроля в отклонении от

контроля* опыте, % контроля*

0 (контроль) 0.0 - 0.0 -

2 0.0 - +6.1 +

4 0.0 - +42.2 +

10 1.2 - +75.6 +

20 7.7 + +111.8 +

50 69.2 + +146.5 +

100 100 + +59.9 +

Примечание к табл. 3:

*Плюс - отклонения от контроля в опыте статистически достоверны с вероятностью р>0.999; минус - отклонения от контроля не достоверны.

Достоверные отклонения активности КФ моллюска, свидетельствующие об интоксикации его организма, обнаружены во всех вариантах опыта. Чувствительность дафниевого теста оказалась на порядок ниже, что говорит о безусловном превосходстве биохимического тестирования как способа оценки качества сточной воды над общепринятыми в настоящее время методами и, следовательно, его целесообразности и перспективности его использования наряду или вместо существующих.

С целью изучить возможность определения степени токсичности природных вод, мы провели анализ динамики суммарной активности комплекса КФ печени у особей живородки речной, отловленных на разных участках реки (р.Которосль, гЛрославль). Это позволило нам оценить степень интоксикации моллюсков, а следовательно, качество воды в зависимости от расположения наиболее вероятных источников загрязнения природного водоема (рис 3).

Материал собирали в июле 1996 года на 33 станциях, расположенных по обоим берегам реки Которосль и привязанных к местам сброса в реку загрязненных вод.

Поскольку наиболее вероятные источники загрязненной воды (ливневые стоки с территории промышленных предприятий, сельскохозяйственных угодий, хоз.-бытовые стоки), располагаются вдоль

русла всей городской части реки, степень загрязнения воды в русле реки должна возрастать вниз по течению. Это и было установлено нами при анализе активности комплекса КФ живородки речной (см. рис.3).

Станция, № п/п 1-6 7-14 15-21 22-26 3>-ка 27-33

Средняя Активность КФ, единицы 4.97 6.92 8.68 9.29 13.63

Рис. 3. Динамика суммарной активности комплекса кислых фосфатаз печени живородки речной в природном водоеме (р.Которосль)

Условные обозначения. -► - течение реки;

V - вероятные источники загрязнения.

Прогрессирующее увеличение активности комплекса КФ живородки речной, обнаруженное нами, может определенно свидетельствовать об ухудшающемся качестве природной воды вниз по течению реки, и являться чувствительным показателем состояния среды обитания водных животных.

Выводы

1. Воздействие хлорида кадмия in vitro и in vivo индуцирует в различной степени выраженные изменения общей активности и активности отдельных компонентов комплекса кислых фосфатаз у изученных видов пресноводных гидробионтов: катушка роговидная, битиния, живородка речная, уния, беззубка обыкновенная (моллюски), дафния (ракообразные), толстолобик (рыбы). Достоверность изменений удельной активности и специфических наборов кислых фосфатаз в норме и при токсическом воздействии in vivo у разных видов пресноводных гидробионтов является

главным критерием выбора оптимальных для биохимического тестирования качества водной среды тсст-объектов - моллюсков.

2. Реакция комплекса кислых фосфатаз (моллюсков и других видов гидробионтов) на интоксикацию in vivo имеет трехфазный характер, совпадающий с биологическими фазами адаптации. Эта реакция универсальна в отношении токсического вещества, его концентрации и продолжительности воздействия на организм.

3. Кислые фосфатазы печени живородки речной (Viviparus viviparus L.), полученные в индивидуальном состоянии, представляют собой комплекс различных по физико-химическим свойствам и функциональной роли ферментов, включающий в себя неспецифические к субстрату (лизосомапьные) кислые фосфатазы и специфические (цитозольные) ферменты: фруктозо-1,б-дифосфатазу и АДФ-азу.

4. Изменения в активности кислых фосфатаз in vivo при воздействии хлорида кадмия специфичны вплоть до полной инактивации одних и индукции активности других - «адаптационных» форм фермента.

5. При воздействии хлорида кадмия в определенной концентрации in vivo субстратная специфичность комплекса кислых фосфатаз печени живородки речной (Viviparus viviparus L.) меняется разнонаправленно, что обеспечивает адаптацию метаболических процессов в организме моллюска, выражающуюся в угнетении распада углеводов. Эта реакция комплекса кислых фосфатаз живородки речной соответствует фазе затаивания моллюска при адаптации к среде обитания.

6. Кислая фосфатаза живородки речной (Viviparus viviparus L.) может быть использована в качестве универсального маркера для определения пороговых и подпороговых концентраций токсических веществ в сточных и природных водах.

Основное содержание работы достаточно полно отражено в следующих публикациях:

1. Цветков И.Л., Урванцева Г.А. Влияние хлорида кадмия на активность кислой фосфатазы катушки роговой // Экология и охрана окружающей среды. Тез.докл. 1 Международной IV Всероссийской научно-практической конференции (Рязань, 15-16 сентября 1994 г.). - Рязань, 1994. -С. 115.

2. Цветков И.Л., Зарубин С.Л., Урванцева Г.А. Кислая фосфатаза разных внутривидовых форм катушки роговой как индикатор загрязнения вод тяжелыми металлами. - Деп. в ВИНИТИ от 15.03.95., №709-В95. - 11 с.

3. Цветков И. Л., Урванцева Г.А., Зарубин С. Л., Коничев A.C. О возможности биохимического тестирования качества воды с помощью кислой фосфатазы некоторых гидробионтов // Материалы VII съезда

Гидробиологического общества РАН (Казань, 14-20 октября 1996 г.). Т. 3.

- Казань: Полиграф, 1996. - С. 93-94.

4. Зарубин C.JL, Цветков И.Л., Урванцева Г.А. Изменение характеристик фермента кислая фосфатаза моллюсков Viviparus viviparus при воздействии сточных и природных вод // Материалы VII съезда Гидробиологического общества РАН (Казань, 14-20 октября 1996 г.). Т. 3. -Казань: Полиграф, 1996. - С. 28-30.

5. Цветков И.Л., Зарубин С.Л., Урванцева Г.А. Изменение активности кислой фосфатазы и белкового спектра экстракта тел моллюсков Viviparus viviparus как биохимические показатели степени токсичности природных вод // Вузовская наука в решении экологических проблем ВерхнеВолжского региона. - Тез. докл. научной конференции (Ярославль, 18-19 апреля 1995 г.). - Ярославль, 1995. - С. 23.

6. Зарубин С.Л., Цветков И.Л. Принципы выбора тест-объекта и тест-показателя для биоиндикации и биотестирования сточных и природных вод // Биологические исследования в Ярославском государственном университете. - Тез. докл. конф. (Ярославль, 29 ноября 1996 г.).

- Ярославль, 1997. - С. 62-65.

7. Зарубин С.Л., Цветков И.Л., Урванцева Г.А., Шляпникова H.A. Исследование индуцированной резистентности Daphnia magna Straus к длительному воздействию хлорида хрома // Биологические исследования в Ярославском государственном университете. - Тез. докл. конф. (Ярославль, 29 ноября 1996 г.). - Ярославль, 1997. - С. 70-71.

8. Цветков И.Л. Изменчивость активности комплекса кислых фосфатаз моллюсков в адаптации организма к среде обитания // Научные труды МПГУ им. В.И. Ленина. Серия: естественные науки. - М.: Прометей, 1997.

- С. 71-72.

9. Цветков И.Л., Зарубин С.Л., Урванцева Г.А., Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. Кислая фосфатаза гидробионтов как фермент-индикатор биохимической адаптации к воздействию токсических веществ // Известия АН. Серия биологическая. - 1997. - №5. - С. 539-545.

10. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев A.C., Урванцева Г.А. Влияние хлорида кадмия на активность фосфатазного комплекса ферментов // Научные труды МПГУ им. В.И. Ленина. Серия: естественные науки. -М.: Прометей, 1997.- С. 242-243.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цветков, Илья Леонидович, Москва

МОСКОВСКИЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЦВЕТКОВ Илья Леонидович

КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА ГИДРОБИОНТОВ КАК МАРКЕРНЫЙ ФЕРМЕНТ ТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ

Специальность 03.00.04 - биологическая химия Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

У , *

^ " /

1 • ! "А

( ' '' ¡/¿У У

/у •• Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Коничев А. С.

Москва, 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы..............................................................................10

1.1. Структура и функции кислых фосфатаз различных видов животных и растений......................................................................................................10

1.1.1. Общая характеристика и функции.....................................................10

1.1.2. Механизм катализа.............................................................................12

1.1.3. Влияние микроокружения.................................................................13

1.1.4. Молекулярная гетерогенность кислых фосфатаз............................16

1.2. Биосинтез и локализация зрелой кислой фосфатазы в клетках и тканях. Связь с мембранными структурами..............................................18

1.2.1. Общие представления о биосинтезе.................................................18

1.2.2. Организация лизосомального аппарата клетки...............................21

1.3. Динамика активности кислых фосфатаз как критерий адаптации организма к среде обитания........................................................................22

1.3.1. Изученность вопроса..........................................................................23

1.3.2. Проблема нормы и патологии...........................................................26

1.3.3. Проблема существования инверсий.................................................28

1.3.4. Энзимоиндикация качества природных вод на примере кислых фосфатаз гидробионтов................................................................................31

Глава 2. Материалы и методы.........................................................................34

2.1. Материалы..............................................................................................34

2.1.1. Особенности биологии экспериментальных животных................34

2.1.1.1. Моллюски.........................................................................................34

2.1.1.2. Ракообразные...................................................................................38

2.1.1.3. Рыбы...................................................................................................39

2.1.2. Условия содержания лабораторных культур и схемы токсикологических экспериментов............................................................40

2.1.3. Сбор материала в природных условиях...........................................44

2.2. Методы....................................................................................................44

2.2.1. Подготовка биологического материала и экстракция белков.......45

2.2.2. Определение общего белка................................................................45

2.2.3. Спектрофотометрическое определение активности кислых фосфатах........................................................................................................47

2.2.3.1. Реакция с р-нитрофенилфосфатом................................................47

2.2.3.2. Реакция Фиске-Суббароу................................................................48

2.2.4. Энзим-электрофоретическое определение активности кислых фосфатаз.........................................................................................................50

2.2.4.1. Диск-электрофорез..........................................................................50

2.2.4.2. Аналитическое изоэлектрофокусирование...................................52

2.2.4.3. Обнаружение зон активности кислых фосфатаз..........................53

2.2.5. Субклеточное фракционирование....................................................54

2.2.6. Препаративное изоэлектрофокусирование......................................56

Глава 3. Комплекс кислых фосфатаз гидробионтов. Норма и следствия токсического воздействия на организм..........................................................58

3.1. Кислые фосфатазы гидробионтов разных систематических

групп...............................................................................................................58

3.2. Кислые фосфатазы как возможные тест-ферменты для оценки токсического воздействия на организм......................................................68

3.2.1. Общий характер ответной реакции на токсическое воздействие.....................................................................................................81

3.2.2. Выбор тест-объекта............................................................................86

Глава 4. Комплекс кислых фосфатаз печени живородки речной. Молекулярная гетерогенность и субклеточная локализация кислых фосфатаз.............................................................................................................90

4.1. Оптимизация условий обнаружения активности кислых фосфатаз..91

4.2. «Свободная» и «связанная» активность фермента............................94

4.3. Субклеточная локализация кислых фосфатаз.....................................99

4.4. Субстратная специфичность кислых фосфатаз................................104

Глава 5. Комплекс кислых фосфатаз печени живородки речной. Реакция на токсическое воздействие................................................................................111

5.1. Опыты in vitro........................................................................................Ill

5.2. Опыты in vivo........................................................................................115

5.2.1. Зависимость токсического эффекта от концентрации кадмия в воде.........................................................................................................116

5.2.2. Зависимость токсического эффекта от продолжительности воздействия кадмия на организм...............................................................123

5.2.3. Изменения в комплексе фосфатаз под воздействием кадмия. Индуцибельная кадмием кислая фосфатаза............................................129

Глава 6. Кислые фосфатазы печени живородки речной как ферменты-маркеры токсического воздействия на организм.......................................143

6.1. Пример биохимического тестирования качества сточных

вод.................................................................................................................144

6.2. Пример энзимоиндикации качества природных вод.......................148

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................160

ВЫВОДЫ........................................................................................................163

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................165

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..........................................................................182

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Проблема адаптации организма к изменяющимся условиям среды на уровне биохимических реакций чрезвычайно мало изучена. Имеющиеся экспериментальные данные крайне скудны, разрознены и не раскрывают молекулярных механизмов адаптации. Особым вниманием в настоящее время пользуется феномен неспецифической адаптации, включающий биохимические процессы, которые происходят в клетке вне зависимости от того, какой стрессовый фактор их вызвал (неспецифический адаптационный синдром), и вместе с тем, позволяют живому организму сохранять гомеостатические свойства.

Интерес, который проявляют исследователи к проблеме биохимической адаптации, является вполне оправданным. С одной стороны - это новое фундаментальное направление в области экологии (биохимическая экология), которое включает исследование молекулярных механизмов, позволяющих живому организму существовать в постоянно меняющихся условиях окружающей среды. С другой стороны, в связи с мощной техногенной нагрузкой на биосферу, изучение биохимических процессов адаптации, в особенности неспецифической, позволяет более детально рассмотреть роль антропогенного фактора среды в молекулярной изменчивости и эволюционном процессе. Данный аспект проблемы по-прежнему остается наиболее актуальным, поскольку большинство существующих методов оценки качества водной среды к настоящему времени существенно устарели, и не могут уже отвечать современным требованиям биомониторинга.

Наиболее перспективными в этом отношении сейчас общепризнанно считаются методы биохимического тестирования или индикации, где в качестве критерия жизнедеятельности организмов в тех или иных условиях

среды рассматривают такие биохимические показатели, как активность ферментов, качественный состав белковых спектров и пр.

Такой подход объясняется тем, что любому физиологическому, а тем более морфологическому нарушению нормы предшествуют определенные биохимические процессы. Именно последние являются причиной изменения физиологического состояния живого организма, ухудшения качества его потомства или гибели самого организма.

Исследование биохимических показателей в качестве тестов может позволить регистрировать отклонения от нормы в живом организме еще до момента появления у него морфологических и физиологических сдвигов, а следовательно, осуществить раннее биохимическое тестирование качества среды обитания животного.

Цель и задачи исследования. Основной целью нашего исследования стала детальная характеристика изменений функциональных параметров комплекса кислых фосфатаз различных гидробионтов, произошедших в результате токсического воздействия на организм.

Для достижения этой цели были поставлены следующие главные задачи:

1. Исследовать физико-химические и функциональные свойства комплекса кислых фосфатаз в норме у различных гидробионтов.

2. Проследить динамику адаптивных изменений кислых фосфатаз гидробионтов под воздействием хлорида кадмия. Оценить, насколько характер адаптивных изменений универсален для разных видов животных и насколько обнаруживаемые изменения глубоки для исследуемых ферментов.

3. Изучить возможность использования комплекса кислых фосфатаз в качестве маркерного биохимического показателя для определения

токсического воздействия на организм. Исследовать на практике чувствительность, воспроизводимость и целесообразность такого рода определений в сравнении с уже существующими методами оценки качества водной среды.

Научная новизна работы. Впервые исследованы и описаны различные свойства комплекса кислых фосфатаз у широкого спектра видов и систематических групп водных животных.

Подробно изучена зависимость ферментативной активности кислых фосфатаз гидробионтов от концентрации токсиканта (хлорид кадмия) в воде и продолжительности его воздействия на организм. Показано, что воздействие кадмия у всех изученных организмов вызывает однотипную (универсальную) ответную реакцию, которую можно рассматривать в качестве диагностической при интоксикации, и по ее обнаружению у тест-объекта определять степень токсичности водной среды.

Впервые выделены и охарактеризованы формы кислых фосфатаз из печени моллюска живородка речная (Viviparus viviparus), исследованы их субклеточная локализация и тканеспецифичность. Кроме того, выделена и подробно изучена индуцибельная (адаптационная) форма кислой фосфатазы, появляющаяся в ответ на интоксикацию организма хлоридом кадмия.

На примере кислой фосфатазы как тест-фермента трех видов моллюсков (Viviparus viviparus, Unió longirostris, Anodonta stagnalis) показана возможность точного определения степени загрязнения воды в условиях естественного гидробиоценоза.

Практическое значение работы. Результаты работы позволяют организовать проведение массовых анализов в плане биотестирования и

биоиндикации вод различного происхождения с использованием в качестве тест-ферментов или ферментов-индикаторов комплекса кислых фосфатаз из печени живородки речной (V. утрап^).

В работе приведены рекомендации по выделению кислых фосфатаз, данные оптимизации условий обнаружения их активности различными методами, а также упрощенная схема надежного определения ряда свойств фосфатаз для целей биотестирования и биоиндикации. Показано, что чувствительность и достоверность проведенных анализов сопоставимы, а чаще, существенно выше в сравнении с распространенными методами определения качества вод (гидрохимический анализ, дафниевый тест, биологическая индикация).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались: I Международной IV Всероссийской научно-практической конференции «Экология и охрана окружающей среды» (Рязань, 15-16 сентября 1994 г.), VII Съезду Гидробиологического общества РАН (Казань, 14-15 октября 1996 г.), научной конференции «Вузовская наука в решении экологических проблем Верхне-Волжского региона» (Ярославль, 18-19 апреля 1996 г.), научной конференции «Биологические исследования в Ярославском государственном университете» (Ярославль, 29 ноября 1997 г.).

Публикации. По матриалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 4 статьи (одна - в центральной печати) и 6 кратких сообщений в сборниках трудов научных конференций различного ранга.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), отражающего современные представления о кислой фосфатазе живых организмов и роли этого фермента в процессах

молекулярной и клеточной адаптации, характеристики материалов и описания методов исследования (глава 2), изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных (главы 3-6), заключения, выводов и библиографического списка.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность и благодарность своей первой учительнице по биохимии Урванцевой Галине Александровне, своему научному руководителю профессору Коничеву Александру Сергеевичу за искреннее внимание, интерес и заботу, проявленные к настоящей работе, помощь в организации эксперимента, интерпретации полученных результатов, формулировке основных положений работы и подготовке публикаций по теме диссертации; генеральному директору ООО «Компания Биоком» Комарову Андрею Борисовичу за моральную и материальную поддержку, оказанную мне, а также любезное предоставление компьютера для набора и распечатки рукописи диссертации, и наконец, но не в последнюю очередь своей жене Цветковой Марии Александровне за терпеливое внимание и снисходительный интерес к моей научной деятельности, а также неоценимую помощь в корректировке всех черновых вариантов рукописи диссертации.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Структура и функции кислых фосфатаз различных видов живых

организмов

Кислая фосфатаза (КФ) - один из наиболее распространенных гидролитических ферментов среди представителей по крайней мере четырех из пяти известных царств живого: растения, животные, грибы и дробянки (микроорганизмы). В клетках большинства живых организмов фермент представлен совокупностью множественных молекулярных форм, которые отличаются молекулярной массой, суммарным зарядом молекулы (р1), величиной рН-оптимума активности, субстратной специфичностью, благодаря чему, в целом, комплекс молекулярных форм КФ обладает очень широкими каталитическими возможностями, для выполнения своей метаболической функции - отщепление фосфата от широкого спектра органических соединений. Комплекс кислых фосфатаз принимает участие в деструктивных, анаболических и регуляторных процессах, а гибкие функциональные характеристики позволяют адаптироваться к изменяющимся условиям среды обитания живого организма. Все это привлекает давний и заслуженный интерес многих исследователей к изучению КФ в работах как сугубо теоретического, так и прикладного характера.

1.1.1. Общая характеристика и функции

Кислая фосфатаза, фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты с кислым оптимумом (КФ 3.1.3.2.) катализирует химические

реакции по схеме:

моноэфирортофосфат+Н20=спирт или фенол+НзР04 ;

из-за постоянного преобладания мольной доли воды в реакционной среде, реакция является практически не обратимой [23].

В отличие от прочих фосфатаз, имеющих строго ограниченную субстратную специфичность (нуклеотидазы, гексозомонофосфатазы, глицерофосфатазы, фосфосеринфосфатазы), КФ в целом - широко специфичный фермент, а потому в большом числе случаев может дублировать специфические фосфатазы [70], или замещать таковые, если они отсутствуют в клетке [109]. Имеются, например, указания на пирофосфатазную [108, 120, 153] и нуклиотидазную [108, 118, 120] активности КФ.

В связи с тем значением, которое имеют фосфоорганические соединения в метаболизме клетки, особенно для процессов синтеза, роль КФ становится очевидной; активно участвуя в процессах клеточного питания и гидролизуя широкий спектр моноэфиров ортофосфорной кислоты экзогенного происхождения, КФ является одним из основных поставщиков неорганического фосфата в клетку [32, 38].

Помимо основной функции - ускорение гидролитических реакций, КФ обладает трансферазной активностью, особенно при наличии свободного акцептора [23, 48]. Последняя заключается в переносе остатка ортофосфорной кислоты [34], а в качестве акцепторов выступают чаще всего свободные спирты (например, глицерин), либо спиртовые группы сложных полифункциональных соединений (например, гликозидов, нуклеозидов etc), в связи с чем фосфатазы могут иметь косвенное значение

как доноры фосфорильных групп при синтезе нуклеотидов [32], а следовательно, играть определенную роль в образовании субклеточных структур.

Не исключается возможность, которая в некоторых случаях доказана, участия КФ в самых различных клеточных функциях, в том числе уникальных и еще не идентифицированных, например, синтезе пиридоксинов, стероидов etc, а также процессах, связанных с самообновлением, репарацией и смертью [125, 130]. Отмечается также возможная роль КФ в регуляции клеточного метаболизма.

Интересно отметить существование КФ, обладающей фосфопротеинфосфатазной активностью [157]. Так КФ предстательной железы человека гидролизует фосфопрот