Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические параметры стресс-редуцирующей реакции гидробионтов при интоксикации
ВАК РФ 03.00.16, Экология
Автореферат диссертации по теме "Биохимические параметры стресс-редуцирующей реакции гидробионтов при интоксикации"
На правах рукописи
Цветков Илья Леонидович
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ СТРЕСС-РЕДУЦИРУЮЩЕЙ РЕАКЦИИ ГИДРОБИОНТОВ ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ
03.00.16 — экология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
----
Москва 2009
003481368
Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Ярославского государственного университета, кафедре органической и биологической химии Московского государственного педагогического университета и в лаборатории экологической биохимии Естественно-экологического института Московского государственного областного университета.
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Коничев Александр Сергеевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Микодина Екатерина Викторе] доктор биологических наук, с.н.с. Топунов Алексей Фёдорович доктор химических наук Мартынов Борис Иванович
Ведущая организация: Институт биологии Карельского научного центра РАН
Защита состоится 12 ноября 2009 г. в 15:00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.155.13 при Московском государственном областном университете по адресу: 141014, Московская обл., г.Мытищи, ул. Веры Волошиной, д. 24
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного областного университета по адресу: 105005, Москва, ул. Радио, д. 10а
Автореферат разослан "......"_2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук
Т.А. Снисаренко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Техногенное загрязнение водной среды — одна из глобальных экологических проблем современного общества и в ряду с климатическими изменениями температуры, освещенности, газового, солевого состава и др. параметров, едва ли не главный по значимости средовой фактор, воздействию которого нередко подвергаются водные животные. Сила воздействия этого фактора на гидробионтов определяется его качественными и количественными признаками. Первые обусловлены вероятностью попадания в гидросферу какого-либо не встречавшегося ранее токсического вещества (некоторые тяжелые металлы, ксенобиотики и пр.), вторые — концентрацией в воде и продолжительностью воздействия на биоту. Если по силе воздействия какой-либо фактор среды выходит за привычные рамки, освоенные животными в результате естественного отбора (популяционно-генетическая адаптация) или онтогенеза (индивидуальная адаптация), организм переходит в состояние стресса — органического или физиологического расстройства, сопровождаемого нарушением обмена веществ.
Впервые понятие стресса (неспецифического адаптационного синдрома) было разработано канадским патологом Гансом Селье. Он рассматривал стресс как механизм сохранения гомеостаза, универсальный для живых организмов (Селье, 1961, 1972, 1979), однако впоследствии выяснилось, что существующее многообразие жизненных форм и уровней организации в живой природе не позволяет одинаково интерпретировать стресс у теплокровных животных и беспозвоночных организмов, таких, как насекомые или моллюски. Фундаментальные отличия в строении и функциях нервных систем, степени их вовлеченности в регуляцию гомеостаза, а также в уровнях развития и преобладании значимости клеточной и организменной регуляции метаболизма в данных примерах столь существенны, что для диагностики стресса невозможно использовать одни и те же симптомы (маркеры).
Более того, понятие стресса по-разному интерпретируется экологами, генетиками, физиологами и биохимиками в связи с существованием разных фор^
проявления "органических и физиологических расстройств" у животных на метаболическом, клеточном, морфо-функциональном, популяционном и бйоценотическом уровнях организации.
В этой связи важно отметить, что для универсальной диагностики стресса оказываются наиболее важными не столько какие-либо физиологические или биохимические маркеры, сколько определенный сценарий развития событий, индуктором которых в организме послужил стресс. Несмотря на различную природу стресс-индуцирующего воздействия (в нашем случае это химическая структура токсических веществ, степень их токсичности для определенных видов гидробионтов и вероятность попадания в водную среду) организм реагирует, отвечая стереотипным набором биохимических и физиологических реакций, направленных на преодоление нарушений его жизнедеятельности. Этот набор в совокупности именуемый стресс-реакцией (он же — неспецифический адаптационный синдром), обеспечивает так называемую неспецифическую или срочную адаптацию.
Срочная адаптация не является окончательной для организма, а представляет собой первую фазу индивидуальной адаптации, из которой развивается вторая фаза — устойчивая или специфическая адаптация. Ее важная особенность состоит в способности, во-первых, повышать устойчивость организма к какому-либо определенному или ряду близких по своей природе раздражителей, а во-вторых, формировать так называемый структурный след, который позволяет полностью устранить нарушения гомеостаза и сохранять эту способность в постадаптационный период.
В литературе имеются многочисленные экспериментальные свидетельства того, что вследствие интоксикации у гидробионтов происходит изменение активности и состава множественных форм целого ряда ферментов, непосредственно не связанных с детоксикацией (Немова, 1996, 2008; Немова и др., 1990). Аналогичная реакция наблюдается в ответ и на другие раздражители, например, радиоактивное, рентгеновское и ультрафиолетовое облучение, повышение температуры воды. В частности, на такие факторы реагируют многие
оксидоредуктазы (глюкозо-6-фосфат-, лактат-, малат-, сукцинат- и алкогольдегирогеназы) и трансферазы (аспартатаминотрансфераза, гексокиназа), но в гораздо большей степени это относится к ферментам с широкими метаболическими функциями — неспецифичным к субстрату гидролазам (нуклеазы, кислые протеиназы, щелочная и кислая фосфатазы, неспецифические эстеразы и др.)
По ряду признаков, это и есть "изменения обмена веществ" как указывал Г. Селье, которые составляют суть неспецифического адаптационного синдрома. Однако в силу чрезвычайной разрозненности и часто противоречивости литературных данных охарактеризовать неспецифическую адаптацию на биохимическом уровне как единый и универсальный механизм сохранения гомеостаза у гвдробионтов пока не представляется возможным.
В тоже время, известны и некоторые устойчивые стресс-редуцирующие факторы специфической адаптации. Установлено, например, что большинство токсических веществ подвергается детоксикации путем их постепенной деградации системой цитохромов Р450 (органические вещества) или специфического связывания в неактивные комплексы с металлотионеинами (тяжелые металлы) или иммуноглобулинами (токсины белковой природы и другие антигены). Известны также белки теплового шока или в общем смысле — стресс-белки с невыясненными до конца функциями. Предполагают, что большинство из них играют роль специфических протекторов (например, криопротекторов), некоторые являются сигнальными в генерации стресс-редуцирующих механизмов. Кроме того, описаны белки и другие молекулярные факторы (пептиды, углеводы ц их производные), участвующие в изменении проницаемости клеточных мембран, вязкости и плотности жидкостей организма и других физико-химических параметров клеток и тканей.
Очевидно, что, например, повышенное содержание в организме определенных металлотионеинов или иммуноглобулинов, накопление криопротекторов, индукция активности "адаптационных" форм ферментов и др. параметры, выходящие за рамки нормы реакции, являются вполне убедительными
признаками структурного следа специфической адаптации. Тем не менее, механизмы координации срочных и возникающих позднее устойчивых стресс-редуцирующих факторов, собственно процесс индукции специфической адаптации как результат стресс-реакции на токсическое воздействие остаются пока не известными.
По нашему убеждению, для разрешения проблем экологической биохимии в области теории адаптации необходим систематический подход к исследованию, а именно, анализ динамики изменений широкого круга метаболических параметров (прежде всего, активности ферментов) у ряда гидробионтов разных систематических групп в ответ на токсическое воздействие различной природы, и интерпретация полученных результатов в концепции неспецифической адаптации. Одновременно детальное изучение физико-химических свойств ферментов позволит определить их участие в адаптации как специфических стресс-редуцирующих факторов и таким образом расшифровать механизмы стресс-реакции и адаптации.
Цель и задачи исследования. Основная цель нашей работы — выявление биохимических механизмов стресс-редуцирующей реакции на сублетальную интоксикацию у пресноводных моллюсков и других гидробионтов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Установить основные параметры гидролитических ферментов (активность, тканевую локализацию, состав множественных форм) у пресноводных гидробионтов в норме и выявить их динамику в ответ на слабое токсическое воздействие (на уровне ПДК) в остром опыте.
2. Охарактеризовать универсальные и специфичные аспекты биохимической адаптации в ответ на токсическую нагрузку у разных видов гидробионтов.
3. Выявить механизм стресс-редуцирующей реакции на сублетальное токсическое воздействие и охарактеризовать взаимосвязь биохимических механизмов срочной и устойчивой адаптации у пресноводного моллюска живородка речная (Утрагш \трагш Ь.).
4. Оценить и обосновать возможность биотестирования и биоиндикации с использованием активности гидролитических ферментов гидробионтов как маркеров токсического загрязнения воды и водоемов.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые охарактеризован механизм метаболической адаптации к токсическому воздействию у живородки речной, включая фазы неспецифической (срочной) и специфической (устойчивой) адаптации, а также процесс их координации с участием комплекса кислых фосфатаз, обладающих различной специфичностью в отношении природных субстратов.
Проанализированы и обобщены изменения ряда физико-химических параметров гидролитических ферментов (общая активность фермента, состав и активность множественных форм) у широкого круга видов пресноводных гидробионтов в ответ на слабое токсическое воздействие. Впервые получены систематические данные о динамике биохимической адаптации у разных видов исследованных животных, которые углубляют классическое представление о неспецифическом адаптационном синдроме (НАС). Эти данные позволяют выявить как индивидуальные особенности разных видов по их стресс-реакции, так и общие (универсальные) закономерности адаптивной динамики метаболизма.
Впервые выявлены и охарактеризованы кислые фосфатазы из пищеварительной железы моллюска живородка речная (Утрагш у'Ырагш Ь.). Определены их физико-химические и функциональные параметры (И в 5,7% ПААГ, р1, субстратная специфичность), установлена субклеточная локализация и тканеспецифичность этих ферментов. Кроме того, выделена и подробно изучена индуцибельная (адаптационная) кислая фосфатаза, появляющаяся в ответ на острую интоксикацию хлоридом кадмия.
На основании данных о субстратной специфичности и изменении активности кислых фосфатаз при интоксикации предложена схема участия этих ферментов в адаптивной регуляции гликолиза и накоплении побочных метаболитов (глюкоза, фруктоза, сорбит, глицерин) у пресноводных гидробионтов.
Установлена роль сорбита в метаболизме живородки речной как криопротектора и фактора устойчивости к токсическому воздействию. Предполагается участие сорбита в индукции апоптоза при исчерпании адаптивного потенциала отдельных клеток. Выявлена динамика содержания сорбита и активности ряда ферментов углеводного обмена в пищеварительной железе моллюска. Показано, что сорбит накапливается в пищеварительной железе моллюска, как при понижении температуры воды, так и острой интоксикации, однако происходит это разными путями, поскольку изменения активности сопутствующих накоплению сорбита ферментов (кислая фосфатаза, сорбитолдегидрогеназа, альдозоредуктаза) зависят от характера стресс-индуцирующего воздействия. Это связано с вынужденной оптимизацией регуляторных механизмов в процессе адаптации к определенным неблагоприятным факторам внешней среды и/или необходимостью изменения баланса свободных углеводов (прежде всего, глюкозы и фруктозы) как предшественников сорбита для реализации стресс-редуцирующих реакций организма.
На примере трех видов моллюсков Viviparus vivparus L., Anodonte stagnalis Gmelin, Unió longirostris Rossmaessler показана изменчивость активности кислой фосфатазы в популяциях живородки речной, обитающих в зонах с различной антропогенной нагрузкой (р. Которосль, г. Ярославль и Ярославская обл.). Исследованы активность и состав множественных форм кислой фосфатазы. Установлены достоверные и очень значительные популяционные различия исследованных биохимических параметров, сохраняющиеся в условиях кратковременного изменения условий обитания (при искусственном переселении).
На основании анализа результатов лабораторных исследований даны обоснованные рекомендации для выбора тест-функции (фермент), тест-объекта (вид животного) и параметров токсикологического эксперимента (продолжительность, концентрация токсиканта). Наглядно продемонстрирован способ биохимического тестирования качества воды в остром опыте с
использованием живородки речной (тест-объект) и гидролитических ферментов (тест-функция).
Практическая значимость. Запатентованный нами способ биохимического тестирования качества воды (патент РФ №2308719) состоит в регистрации изменений суммарной активности кислой фосфатазы и дезоксирибонуклеазы в экстракте пищеварительной железы живородки речной по истечении ряда кратковременных экспозиций моллюсков в тестируемой воде. Этот способ имеет универсальное применение в отношении химической природы токсических веществ и их качественного состава в многокомпонентных смесях, т.к. базируется на концепции о неспецифическом адаптационном синдроме, являющейся частью нашего исследования.
Предложен способ биохимической индикации токсического загрязнения природных водоемов по сравнительным данным о суммарной активности кислой фосфатазы в экстракте пищеварительной железы трех видов пресноводных моллюсков (V. vivparus, A. stagnaiïs, U. longirostris). По сравнению с традиционными методами биологической индикации, данный способ значительно проще для реализации, т.к. не требует глубоких знаний в области морфологии и систематике водных животных. В тоже время он позволяет оценить суммарное токсическое загрязнение водоема или его определенных зон, и, по сути, не ограничен в применении ареалами изученных видов моллюсков, т.к. может быть отработан и для других видов гидробионтов.
Обоснованность научных положений, выводов, рекомендаций. Научные положения диссертационной работы, выводы и рекомендации являются результатом натурных и лабораторных исследований, проведенных с применением современных биологических, биохимических и физико-химических методов анализа с использованием калиброванной, юстированной и поверенной аппаратуры. Для получения экспериментальных результатов в основном использованы стандартные методы исследований. Корректность полученных результатов подтверждена статистической оценкой сходства и различия выборок
при повторных экспериментах и проведении независимых контрольных исследований.
Положения, выносимые на защиту:
1. В ответ на сублетальное токсическое воздействие (на уровне ПДК) активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов у. водных животных меняется циклически, характеризуясь закономерно повторяющимися фазами частичной инактивации и последующей активации через определенные промежутки времени. Эта зависимость представляет собой отражение срочной биохимической адаптации организма к токсическому воздействию, которая, реализуясь на физиологическом уровне, формирует неспецифический адаптационный синдром.
2. У водных животных, разных по уровню биологической организации,, существуют универсальные факторы метаболической адаптации к токсическим веществам, которые не зависят от природы токсиканта. Эти факторы обусловлены активностью ферментных систем, напрямую не связанных с детоксикацией, но участвующих в стресс-редуцирующей регуляции обмена веществ и индукции специфических факторов токсикорезистентности. Эти процессы реализуются с помощью множественных форм ферментов, метаболические функции которых могут принципиально отличаться друг от друга, что позволяет производить устойчивые сдвиги обмена веществ (на примере комплекса кислых фосфатаз и их влияния на интенсивность гликолиза и накопление побочных метаболитов).
3. Представления о динамике активности ферментов, участвующих в неспецифической адаптации к токсическому воздействию, могут быть использованы для разработки методов биохимического тестирования и биохимической индикации качества природных и сточных вод.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались, I Международной и IV Всероссийской научно-практической конференции "Экология и охрана окружающей среды" (Рязань, 15-16 сентября 1994 г.), VII Съезду Гидробиологического общества РАН (Казань, 14-15 октября 1996 г.), научной конференции "Вузовская наука в решении экологических проблем
Верхне-Волжского региона" (Ярославль, 18-19 апреля 1996 г.), научной конференции "Биологические исследования в Ярославском государственном университете" (Ярославль, 29 ноября 1997 г.), X Международной научной конференции "Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря и водоемов внутреннего стока Евразии" (Астрахань, 25-30 апреля 2008 г.), Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биоэкологи" (Московский областной государственный университет, 21-24 октября 2008 г.), III Всероссийской конференции по водной токсикологии, посвященной памяти Б.А. Флерова, "Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы" (Борок, 11-16 ноября 2008 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ, из них 10 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 монография, 1 патент на изобретение, 1 рукопись, депонированная в ВИНИТИ, 11 статей в материалах международных, всероссийских и др. конференций, 3 статьи в сборниках трудов вузов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о биохимических механизмах адаптации к токсическому воздействию in vivo у гидробионтов, участии различных белков, ферментов и метаболитов в разнообразных молекулярных процессах формирования токсикорезистентности на уровне организма (глава 1); описания биологических объектов, материалов и методов исследования (глава 2); изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных (главы 3-7); заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 401 странице, содержит 27 таблиц и 31 рисунок, включая диаграммы, графики и фотографии.
Личный вклад автора. Автором сформулированы цель и задачи исследований, теоретически обоснованы пути их решения, подобраны наиболее оптимальные методы анализа. Результаты исследований получены автором лично, за исключением случаев специально оговоренных в диссертации и автореферате, когда результаты были получены в соавторстве с другими исследователями, о чем
имеются ссылки на совместные публикации. Работа написана автором единолично.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы исследования. В работе использовано 13 видов пресноводных гидробионтов разных систематических групп: моллюски — катушка роговидная (Planorbarius corneus L.: Bulinidae, Hygrophila, Gastropoda, Mollusca), битиния Трошеля (Bithynia troscheli Paasch: Bithyniidae, Discopoda, Gastropoda, Mollusca), живородка речная (Viviparus viviparus L.: Viviparidae, Architaenioglossa, Gastropoda, Mollusca), беззубка обыкновенная (Anodonta stagnalis Gmelin, Unionidae, Actinodontida, Bivalvia, Mollusca), перловица (Unió ¡ongirostris Rossraaessler, по последним источникам — Unió rostratus Lam.: Unionidae, Actinodontida, Bivalvia, Mollusca), дрейссена речная или мидия-зебра (Dreissena polymorpha Pallas: Dreissenidae, Veneridita, Bivalvia, Mollusca), членистоногие — дафния "водяная блоха" (Daphnia magna Straus: Daphniidae, Anomopoda, Branchiopoda, Arthropoda), кольчатые черви — улитковая пиявка (Glossiphonia complanata L.: Glossiphoniidae, Rhynchobdellida, Clitellata, Annelida), лимнодрил Гоффмейстера (Limnodrilus hoffmeisteri Claparede: Tubificidae, Haplotaxida, Clitellata, Annelida) и трубочник (Tubifex newaensis Michaelsen: Tubificidae, Haplotaxida, Clitellata, Annelida), рыбы — белый толстолобик (Hypophthalmichthys molitrix Valenciennes: Cyprinidae, Cypriniformes, Osteichthyes, Chordata), плотва обыкновенная (Rutilus rutilus L.: Cyprinidae, Cypriniformes, Osteichthyes, Chordata) и ротан-головешка (Percottus glehni Dybowski: Odontobutidae, Perciformes, Osteichthyes, Chordata).
Некоторых животных содержали в лаборатории в виде постоянной самовоспроизводящейся культуры (дафния, катушка роговидная; возраст дифференцировали по размеру особей) или получали на опытной биологической станции (белый толстолобик, сеголетки одного помета, 12-15 см длины), остальных самостоятельно собирали в природных водоемах (г. Ярославль, Ярославская обл., Московская обл.), а затем акклимировали к лабораторным условиям от 2 недель до 2 месяцев в специально созданных микрокосмах
(аквариумах, которые заселяли высшие растения, бентос и планктон, характерные для мест обитания подопытных животных) при температуре 15-17°С, освещении естественным светом и с круглосуточной аэрацией воды. В отдельных случаях, при проведении натурных испытаний (биохимическая индикация загрязнений,, сезонная динамика показателей), животных препарировали немедленно после доставки в лабораторию.
Лабораторные токсикологические эксперименты производили на группах животных (от 5 до нескольких десятков особей в зависимости от размера), содержавшихся в растворе токсического вещества (хлориды кадмия (И), меди (II), цинка (П), бис-{трибутилолово)оксид, никлосамид (4-нитро-2-хлоранилид-5-хлорсалицилат этаноламина), приготовленном на аквариумной воде в конечной концентрации 0,1-10 величин предельно допустимой концентрации для водоемов рыбохозяйственного назначения (ПДКЕ0ДН). В особых случаях (пример биохимического тестирования качества воды) использовали серию разбавлений сточной воды химического производства (отобрана из ливневой канализации предприятия "Лакокраска", г. Ярославль). Контрольной группой служили животные, содержавшиеся в чистой аквариумной воде и прочих равных условиях. Экспозиция (продолжительность) эксперимента в разных случаях составляла от 12 часов до нескольких суток. В эксперименте с пониженной температурой воды опытную группу животных помещали в холодильную камеру с постоянной температурой 4-6°С, контрольную группу содержали при нормальной температуре (15-17°С). В экспериментах с искусственным переселением подопытных животных (живородка речная) помещали в придонные садки со свободным обменом воды, доступом к планктону и мелкому бентосу. С помощью таких садков группы особей, собранных на относительно чистом участке, экспонировали на загрязненном участке того же водоема (р. Которосль, г.Ярославль) и наоборот. Экспозиция составляла 7 суток, контролем служили группы особей, помещенные в садки, но собранные на том же участке водоема, где они были экспонированы.
Основные методы исследования. Для биохимического анализа из тел исследуемых животных (дафнии, черви, мелкие моллюски — битиния и катушка) или их отдельных органов (крупные моллюски, рыбы) готовили экстракты водорастворимых белков путем гомогенизации в фарфоровых ступках на холоду с пятикратным объемом 0,15 М ЫаС1 (в некоторых случаях с добавлением 0,5% тритона Х-100) и последующего центрифугирования при 10000 % и 4°С в течение 10-20 мин. Хранили экстракты в замороженном виде или при -18°С в присутствии 50% глицерина (для выявления дегидрогеназ). В полученных экстрактах определяли содержание белка по методу Лоури или Бредфорд и активность ферментов: глюкозо-6-фосфат-, глицеральдегид-3-фосфат-, алкоголь-, лактат-, малат-, сукцинат- сорбитолдегидрогеназы, альдозоредуктазы, кислой и щелочной фосфатазы, неспецифической эстеразы, рибо- и дезоксирибонуклеазы, кислой протеиназы. Суммарную активность ферментов выявляли спектрофотометрически и выражали в единицах удельной активности — Е/мг белка. Изменение ферментативной активности у опытных животных оценивали по отношению к контрольным и выражали в процентах. Качественный состав множественных форм ферментов (гидролазы) определяли методом электрофореза в 7,2-5,7% ПААГ по Девису с окрашиванием продукта или субстрата ферментативной реакции (негативное окрашивание, применялось для ДНКазы и кислой протеиназы). Индивидуальную активность множественных форм определяли путем денситометрии полученных энзимограмм и выражали в процентах от суммарной активности фермента.
Для субклеточного фракционирования экстракты тканей готовили по специальному протоколу в растворе сахарозы с помощью гомогенизатора Поттера-Эльвейгейма, фракционирование производили путем дифференциального центрифугирования с очисткой легких фракций в ступенчатом градиенте сахарозы. Чистоту полученных фракций оценивали с помощью анализа ферментов-маркеров субклеточных структур. Последующую очистку ферментов производили методом препаративного изоэлектрофокусирования.
Качественный состав полиолов в экстрактах тканей выявляли методом ВЭЖХ в ион-эксклюзионном варианте с рефрактометрическим детектированием. Содержание сорбита определяли ферментативным методом с очищенным препаратом сорбитолдегидрогеназы из печени овцы.
Все измерения производили в 3-6 повторностях, статистическую достоверность результатов оценивали с вероятностью 0,95.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На первом этапе работы мы систематически исследовали реакцию ферментных систем разных видов гидробионтов на острое токсическое воздействие разной интенсивности и продолжительности. Для этого использовали все разнообразие подопытных животных и токсических веществ, которым располагали. У дегидрогеназ исследовали суммарную активность, у гидролаз — суммарную активность и состав множественных форм. Обобщив полученные результаты, теоретически обосновали возможность маркировать токсическое загрязнение воды с помощью ферментов и сформулировали основные рекомендации по планированию токсикологических экспериментов. На следующем этапе разработали и произвели апробацию по одному из возможных примеров биохимического теста и биохимической индикации качества воды (с использованием кислой фосфатазы трех видов пресноводных моллюсков). Параллельно мы подробно, на уровне изолированных препаратов исследовали комплекс кислых фосфатаз живородки речной с целью установить взаимосвязь изменений их активности со стрессовым состоянием и адаптацией, индуцированными токсическим воздействием. Наконец, в заключении работы проанализировали динамику побочных метаболитов (глюкоза, фруктоза, сорбит) и активности сопутствующих их накоплению ферментов живородки речной (некоторые кислые фосфатазы, сорбитолдегидрогеназа и альдозоредуктаза) для более глубокого изучения биохимических механизмов адаптации у гидробионтов.
Суммарная активность ферментов в остром токсикологическом эксперименте. Динамика ферментов, наблюдавшаяся нами при интоксикации гидробионтов, представлена на рис. 1-4.
-КФ --ЩФ .......НЭ -Г-б-ФДГ--ЛДГ .......Г-З-ФДГ
-РНКаза---ДНКаза----КП -МДГ ---СДГ ----АДГ
Рис. 1. Динамика активности ферментов у разных гидробионтов при токсическом воздействии хлорида кадмия (0,005 мг Cd27n — ПДК,0ш,.). По оси абсцисс — экспозиция опыта, ч; по оси ординат — отклонение активности от контроля, %. Условные обозначения: А — трубочник, Б — катушка роговидная, В — белый толстолобик; КФ — кислая фосфатаза, ЩФ — щелочная фосфатаза, НЭ — неспецифическая эстераза, РНКаза — рибонуклеаза, ДНКаза — дезоксирибонуклеаза, КП — кислая протеиназа, Г-б-ФДГ — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, Г-З-ФДГ — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ЛДГ — лактатдегидрогеназа, МДГ — малатдегидрогеназа, СДГ — сукцикатдегидрогеназа, АДГ — алкогольдегидрогеназа.
-Са, 0,005 мг/л
---Си, 0,001 мг/л
----Тп, 0,01 мг/л
-са, 0,05 мг/л -Си, 0,01 мг/л •Ъп, 0,1 мг/л
-100
-Са, 0,0005 мг/л
---Си, 0,0001 мг/л
.....гп, 0,001 мг/л
—са, 0,005 мг/л -Си, 0,001 мг/л —гп, 0,01 мг/л
-Са, 0,0005 мг/л
---Си, 0,0001 мг/л
----гп, 0,001 мг/л
60 80 100
—Са, 0,005 мг/л -Си, 0,001 мг/л —гп, 0,01 мг/л
-Са, 0,005 мг/л
---Си, 0,001 мг/л
—са, 0,05 мг/л -Си, 0,01 мг/л
-С(1,0,005 мг/л
---Си, 0,001 мг/л
-- - гп, 0,01 мг/л
•а, 0,05 мг/л -Си, 0,01 мг/л -гп, 0,1 мг/л
-са, 0,005 мг/л
---Си, 0,001 мг/л
----гп, 0,01 мг/л
— са, 0,05 мг/л
- -Си, 0,01 мг/л —гп, 0,1 мг/л
Рис. 2. Динамика суммарной активности кислой фосфатазы беспозвоночных гидробионтов при интоксикации тяжелыми металлами (хлориды, концентрация указана для катиона металла). По оси абсцисс — экспозиция опыта, ч; по оси ординат — отклонение активности от контроля, %. Условные обозначения: А — улитковая пиявка, Б — трубочник, В — лимнодрилл Гоффмейстера, Г — перловица, Д — беззубка обыкновенная, Е — живородка речная.
-Cd, 0,005 мг/л -Си, 0,001 мг/л ■ Zn, 0,01 мг/л
—Cd, 0,05 мг/л - Си, 0,01 мг/л .....Zn, 0,1 мг/л
20
40
60
80
100
-Cd, 0,005 мг/л
---Си, 0,001 мг/л
----Zn, 0,01 мг/л
-—Cd, 0,05 мг/л - Си, 0,01 мг/л .....Zn, 0,1 мг/л
Рис. 3. Динамика суммарной активности кислой фосфатазы рыб при интоксикации тяжелыми металлами (хлориды, концентрация указана для катиона металла). По оси абсцисс — экспозиция опыта, ч; по оси ординат — отклонение активности от контроля, %. Условные обозначения: А — плотва обыкновенная, Б — ротан-головешка.
■апл ^
200 •
100 -
-100 ->
-100
•Т. nev/anensis •D. polymorpha
— V.viviparus .....Н. molitrix
•Т. newanensis — •D. polymorpha •••
— Vvivipartis ••••#. molitrix
Рис. 4. Динамика активности кислой фосфатазы при интоксикации гидробионтов пестицидами. По оси абсцисс — экспозиция опыта, ч; по оси ординат — отклонение активности от контроля, %. Условные обозначения: А — бис-(трибутилолово)оксид (0,0001 мг/л), Б — никлосамид (0,005 мг/л).
Проанализировав и обобщив полученные данные мы пришли к выводу, что циклические изменения ферментативной активности, наблюдаемые в ответ на слабое (сублетальное) токсическое воздействие, не зависят от химической природы токсиканта, метаболической роли исследуемых ферментов и в целом от уровня организации гидробионтов, причем, временная динамика этих изменений имеет строго определенную форму фазной кривой (в координатах: экспозиция опыта — отклонение активности ферментов от контроля), которая, подобно классической кривой адаптации Г. Селье, образована несколькими последовательными стадиями (реакция тревоги, стадия сопротивляемости и стадия истощения), однако, принципиально отличается от нее своей цикличностью. В частности, "стадия истощения" по Селье необратима и является предвестником гибели животного вследствие повреждений, несовместимых с жизнью, или исчерпания необходимых для адаптации ресурсов, а на уровне метаболизма, по нашим данным, ее сменяет повторная активация ферментов и новая фаза биохимической адаптации. Стадия второй индукции активности ферментов более продолжительна, чем первая и наблюдается у кольчатых червей и моллюсков вплоть до окончания острого опыта (96 ч). У рыб цикличность биохимической адаптации выражена еще более отчетливо: за время эксперимента у них насчитывается до трех фаз угнетения и индукции активности ферментов, последовательно сменяющих друг друга.
Таким образом, выявленная нами кривая биохимической адаптации отражает процесс стресс-индуцированной оптимизации метаболизма, состоящей в колебательной динамике биохимических функций за пределами нормы реакции (об этом свидетельствуют существенные отличия от контрольных значений, которые в течение экспозиции также претерпевали некоторые колебания) и, по ряду признаков, соответствует фазе срочной (неспецифической) адаптации гидробионтов к токсическому воздействию.
Следует отметить, что колебательные изменения активности ферментов несколько отличаются по продолжительности отдельных фаз у гидробионтов разных систематических групп. У моллюсков первое снижение активности
ферментов ("реакцию тревоги") мы наблюдали, как правило, через 4 часа экспозиции, увеличение активности до максимума — через 12 часов, повторное снижение — через 24-48 часов. У кольчатых червей те же фазы отмечены в более ранние сроки — через 2, 8-9 и 18-24 часа, а у рыб — через 2, 6, 12-18 часов, соответственно. Вероятно, частота адаптивных колебаний активности ферментов определяется динамическими процессами в организме, различными в зависимости от биологической организации видов животных, и этот фактор обязательно следует учитывать при постановке токсикологических экспериментов, а точнее, выборе экспозиции острых опытов. Наша практика показала, что если продолжительность биохимического теста не является обязательным его условием, следует остановиться на 96 часах, когда прирост активности ферментов довольно сильно развернут во времени и наблюдается у всех исследованных видов. В тоже время для экспресс-теста больше подойдет ряд экспозиций в пределах 1-6 часов, когда в ответ на интоксикацию следует "реакция тревоги" и единообразное снижение активности ферментов.
Наконец, анализ кривых ферментативной активности у разных видов животных позволил выделить два способа биохимической адаптации, которые симптоматически отличаются максимальной величиной наблюдаемых изменений активности ферментов. Первый способ (токсикодинамичность) свойственен кольчатым червям и моллюскам и характеризуется очень высокими значениями прироста и снижения активности ферментов относительно контроля (особенно гидролаз — до 300%), второй способ (гомеостатичность). характерный для рыб, напротив, отличается слабо выраженной динамикой ферментных систем, хотя достоверные колебания активности, тем не менее, имеют место. "Предпочтение" того или иного способа обусловлено уровнем организации исследованных видов гидробионтов, а именно, степенью развития у них систем детоксикации тканей и органов (например, кровь, печень, почки у рыб), и как следствие — возможностью поддержания гомеостаза на уровне не только отдельных клеток, но и целого организма, а также возможным преобладанием поведенческой формы адаптации у животных, которые способны активно избегать локальных
загрязнений водоема (рыбы). В последнем случае биохимические факторы адаптации становятся невостребованными и, как следствие, слаборазвитыми.
В этой связи необходимо подчеркнуть, что рыбы не могут служить тест-объектами для прикладных токсикологических экспериментов, поскольку кроме неудобств их содержания в лаборатории могут возникнуть трудности с выявлением динамики активности тест-ферментов, в отличие от малоподвижных или неподвижных беспозвоночных гидробионтов.
Изменение состава множественных форм ферментов при интоксикации гидробионтов. Близкие по своей биохимической функции, но отличающиеся по физико-химическим параметрам ферменты, так называемые "множественные формы", как принято считать, обуславливают метаболическую дифференцировку субклеточных органелл, клеток тканей и органов (Мецлер, 1980; Райдер, Тейлор, 1983). Но в тоже время такие ферменты являются важными элементами регуляции клеточного гомеостаза и биохимической адаптации к воздействию внешних факторов. В частности, в литературе имеется ряд сообщений об изменении качественного состава множественных форм ферментов в ответ на воздействие токсических веществ и других стресс-индуцирующих факторов. Изменения эти, как правило, состоят в трудно предсказуемой реакции отдельных форм, некоторые из них частично или полностью инактивируются, другие — активируются, или индуцируются вновь, активность третьих практически не меняется. Мы в свою очередь также исследовали этот феномен на примере ряда гидролитических ферментов (здесь иллюстрации приводятся частично, полные сведения содержаться в рукописи диссертации) при интоксикации гидробионтов солями тяжелых металлов с экспозицией 96 часов (рис. 5).
Полученные данные свидетельствуют о существенном изменении состава множественных форм некоторых ферментов под влиянием токсикантов. Особого внимания заслуживает появление новых форм ферментов, которые можно назвать "адаптоферментами", поскольку их появление индуцировано токсическим воздействием.
Р.согпеиз А Б В
вЛгозсИеИ А Б В
A.stagnalis А Б В
1234123123 12341234123 12341234123
£ V;. Н
■
|§
••••-.•- ••
■ • • • •• • ' :
• ; •V . •
D.magna А Б В
Т.пем1ает1$ А Б В
Н.тоШпх Б В
12341234123 1234 123 123 123412341234
ИГ 0,00,20,40,60,81,01«" 0,00,2 0,4 0,6 0,8 1,0'
Рис. 5. Электрофореграммы множественных форм ферментов гидробионтов в норме и при интоксикации тяжелыми металлами (хлориды) с экспозицией 96 ч. Условные обозначения: А — кислая фосфатаза, Б — дезоксирибонуклеаза, В — кислая протеиназа; 1 — контроль, 2 — воздействие 0,05 мг Сс12+/л (для Т. печюеюгз — 0,005 мг С<32+/л), 3 — воздействие 0,01 мг Си2+/л (для Т. иетоеида — 0,001 мг Си2+/л), 4 — воздействие 0,01 мг (для
Т. пемает^з — 0,01 мг гп2+/л); стрелка — направление электрофореза (от катода к аноду).
Следует также отметить, что суммарная активность множественных форм у всех исследованных ферментов значительно повышалась у всех представленных здесь гидробионтов (через 96 ч в условиях произведенного острого опыта — см. предыдущий раздел "Суммарная активность ферментов в остром токсикологическом эксперименте"), в тоже время индивидуальная активность множественных форм меняется разнонаправлено. Особенно хорошо это заметно у
щрвй ¿'ЯК*
II
Э % ■
дезоксирибонуклеаз и кислых протеаз, которые к тому же отличаются наибольшим числом выявленных множественных форм (см. рис. 5).
Уточним кстати, что обнаруженные на электрофореграммах зоны активности ферментов далеко не во всех случаях являются их "множественными формами" и вообще родственными ферментами — компонентами одного функционального комплекса. В частности, существует целый ряд ферментов, разрушающих белок (например, БСА), это и неспецифические экзопептидазы, специфические и неспецифические эндопептидазы (протеиназы), наконец, вполне определенные пищеварительные ферменты, такие как пепсин и трипсин. Эти ферменты могут быть выявлены на электрофореграмме с одним и тем же субстратом (также как при определении их суммарной активности), но в этом случае использование термина "множественные формы фермента" скорее всего, будет не вполне корректно, а значит и стресс-редуцирующую реакцию отдельных протеаз следует рассматривать как настройку целого ряда метаболических превращений, охватывающих субклеточное "пищеварение", защиту от патогенных белков, реализацию механизма автолиза клеток, распад эндогенных белков, влияние на проницаемость субклеточных мембран и т.д.
Все вышесказанное определенным образом касается и дезоксирибонуклеаз, среди которых у живородки речной нам удалось выявить ферменты, близкие по описанию с эндонуклеазой, фрагментирующей геномную ДНК при апоптозе, а также ДНКазы, обладающие большим сродством к экзогенной ДНК и являющиеся, скорее всего, пищеварительными ферментами (данные получены и опубликованы совместно с А.П. Поповым и A.C. Коничевым).
По этим причинам столь разноплановая реакция протеаз и ДНКаз, приведенных здесь для примера, не может подлежать строгому анализу в свете биохимической адаптации. Для этого необходима информация о метаболической функции каждой из выявленных "множественных форм", или точнее ферментов с гидролитической активностью в отношении сходных субстратов, что позволит систематизировать и группировать выявленные ферменты и уже тогда только
строить обоснованные предположения об участии в неспецифической или специфической адаптации.
В этом отношении кислые фосфатазы — значительно более удобный объект исследования. Во-первых, характерным признаком кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2) является гидролитическая активность в отношении синтетического субстрата (не имеющего природных аналогов), такого как р-нитрофенилфосфат или а-нафтилфосфат в среде с кислым рН, и по этому признаку кислые фосфатазы легко дифференцировать от других ферментов. Во-вторых, кислые фосфатазы у большинства гидробионтов представлены значительно меньшим числом множественных форм, что упрощает процедуру их очистки до гомогенного состояния. И в третьих, по нашим многочисленным наблюдениям, реакции кислых фосфатаз на интоксикацию не менее разнообразны, чем у протеаз и ДНКаз (см. рис. 5), что позволяет предположить их активное участие в биохимической адаптации гидробионтов к токсическому воздействию.
Комплекс кислых фосфатаз живородки речной. В пищеварительной железе живородки речной в норме нами выявлено пять белков с активностью кислой фосфатазы, обозначенных нами КФ1-КФ5 в соответствии с их анодной подвижностью. Интоксикация хлоридом кадмия (0,01 мг Сс12+/л, 72 ч.) приводит к индукции активности еще одной формы фермента с наименьшей электрофоретической подвижностью — КФ6 (рис. 6).
Анализ субклеточной локализации кислых фосфатаз, проведенный нами методом дифференциального ультрацентрифугирования, позволил установить, что значительная ферментативная активность присутствует только в экстрактах лизосом и в цитозоле, причем ферменты этих фракций представлены формами КФ4-КФ6 и КФ1-КФЗ, соответственно, значительно отличающимися величиной ферментативной активности.
1 2
«еЗй»
15
_,КФ6 -КФ5
— КФ4 -КФЗ
— КФ2 -КФ1
М 0,0-1
0,20,40,60,8 1,0-
Рнс. 6. Электрофреграмма комплекса кислых фосфатаз пищеварительной железы живородки речной в норме и при интоксикации. Условные обозначения: 1 — контроль, 2 — воздействие хлорида кадмия (0,01 мг Сс12+/л, 72 ч); КФ1-КФ6 — зоны активности исследуемого фермента; стрелка — направление электрофореза (от катода к аноду).
Дальнейшая очистка ферментов путем препаративного изоэлектрофокусирования сначала в широком, а затем в узких диапазонах рН позволила получить препараты индивидуальных кислых фосфатаз, которые характеризовались единственной зоной активности на электрофореграмме с постоянной величиной Ш", и другими индивидуальными физико-химическими характеристиками (табл. 1).
Таблица 1. Физико-химические характеристики кислых фосфатаз из пищеварительной железы
живородки речной
Активность
Форма фермента Субклеточная локализация М в 5,7% ПААГ Р1 по р-нитрофенилфосфату, Е*10/мг белка
в исходном после очистки
гомогенате
КФ1 Цитозоль 0,67 4,9 0,205 22,40
КФ2 Цитозоль 0,53 5,8 0,269 22,30
КФЗ Цитозоль 0,41 7,1 0,105 8,48
КФ4 Лизосомы 0,32 6,3 0,053 4,98
КФ5 Лизосомы 0,23 6,6 0,050 5,08
КФ6 Лизосомы 0,21 7,1 0,047 5,06
Субстратную специфичность кислых фосфатаз определяли с различными синтетическими и природными эфирами ортофосфорной кислоты (табл. 2).
Таблица 2. Субстратная специфичность кислых фосфатаз из пищеварительной железы
живородки речной
Субстрат Активность, %*
КФ1 КФ2 КФЗ КФ4 КФ5 КФ6
р-Нитрофенилфосфат 100 100 100 100 100 100
а-Нафтилфосфат 75,4 — — 63,8 48,6 36,4
а-Глицерофосфат 55,7 16,7 0,0 32,8 18,6 19,3
(^-Глицерофосфат 73,8 16,7 0,0 14,8 13,2 0,0
Глюкозо-1-фосфат 19,8 — 0,0 — 0,0 0,0
Глюкозо-6-фосфат 73,8 — 0,0 — 0,0 0,0
Фруктозо-6-фосфат 57,4 27,8 0,0 53,4 — 71,1
Фруктозо-1,6-дифосфат 103 55,6 0,0 0,0 0,0 0,0
Рибозо-5-фосфат 31,1 — 0,0 — — 0,0
АТР 52,5 — 0,0 23,8 14,3 0,0
ADP 10,0 15,2 360 15,6 0,0 0,0
AMP 0,0 12,3 0,0 12,6 — 0,0
'Примечание: прочерк — нет данных.
Анализ физико-химических параметров представленных кислых фосфатаз
позволил выявить ряд их особенностей. Так, в частности КФЗ, локализованная в
цитозоле, проявляет гидролитическую активность в отношении только одного из
природных субстратов — аденозиндифосфата. При этом скорость гидролиза
АДФ в 3,6 раза выше, чем р-нитрофенилфосфата, тогда как АТФ и АМФ не
гидролизуются вообще. Таким образом, КФЗ — специфический фермент, и
притом довольно необычный. В литературе часто рассматривают свойства и
функции гидролаз, расщепляющих нуклеозиддифосфаты, однако, хорошо
известны пока только две из них. Нуклеозиддифосфатаза (КФ 3.6.1.6),
выделенная из печени и почек позвоночных животных, кроме АДФ расщепляет
инозиндифосфат, гуанозиндифосфат, уридиндифосфат и Е)-рибозо-5-фосфат;
другой фермент, так называемая апираза (КФ 3.6.1.5), найденная у растений, но
распространенная и у млекопитающих, гидролизует АТФ и АДФ. Оба фермента
используют в качестве кофактора двухвалентные ионы щелочноземельных
металлов (М§2+ и Са2+ соответственно). В то же время полное отсутствие
гидролитической активности КФЗ в отношении Е)-рибозо-5-фосфата и АТФ
(см. табл. 2), а также установленная нами независимость от присутствия М§2+ и 26
Са2+ в реакционной среде (обработка 1 мМ 3flTAxNa2), свойственная большинству кислых фосфатаз, не дают оснований считать этот фермент нуклеозиддифосфатазой или апиразой. Судя по экспериметальным даным, кислая АДФаза из пищеварительной железы живородки речной — новая, впервые обнаруженная нуклеозиддифосфат-фосфогидролаза.
Другая особенность касается двух цитозольных фосфатаз: КФ1 и КФ2, способных гидролизовать диэфир ортофосфорной кислоты — фруктозо-1,6-дифосфат (см. табл. 2), тогда как "классическая" КФ является гидролазой моноэфиров. Более того, наши данные показывают, что КФ1 и КФ2 расщепляют фруктозо-1,6-дифосфат быстрее других природных субстратов.
Только КФ4 и КФ5 — ферменты, неспецифичные к субстрату, хотя некоторые природные ортофосфаты не расщепляют. КФ4, например, не активна в отношении фруктозо-1,6-дифосфата, КФ5 — в отношении глюкозо-1-фосфата, глюкозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-дифосфата. Другие природные субстраты КФ4 и КФ5 гидролизуют заметно медленнее, чем р-нитрофенилфосфат (см. табл. 2).
Индуцируемая хлоридом кадмия in vivo КФ6 специфична к фруктозо-6-фосфату, медленно расщепляет a-глицерофосфат и не действует ни на один из других природных субстратов.
Таким образом, при интоксикации организма живородки активность индуцибельной КФ6, а также КФ1 и КФ2, активность которых при этом резко возрастает, должна привести к торможению гликолитического распада углеводов и накоплению побочных метаболитов — свободной фруктозы, глюкозы и глицерина. В тоже время другая специфическая фосфатаза КФЗ, способная активировать гликолиз через посредство гликогенфосфорилазы, при токсическом воздействии полностью инактивируется.
Обмен побочных метаболитов в состоянии стресса. Судя по литературным данным, накопление побочных метаболитов, в частности ряда свободных углеводов (фруктоза, глюкоза и др.) и многоатомных спиртов (глицерин, сорбит) в крови, лимфе и других тканях и органах у водных животных
является одним из способов приспособления к понижению температуры воды. В частности, это явление хорошо изучено у лососевых рыб и личинок некоторых видов насекомых, которые склонны к миграциям, далеко выходящим за пределы одной климатической зоны. Исследованные нами виды животных, и в том числе речная живородка, также постоянно испытывают изменения температуры воды, происходящие как в течение года, так и в более сжатые сроки — в периоды межсезонья, поэтому вполне вероятно, что механизм регуляции гликолиза и возможность накопления побочных метаболитов в качестве криопротекторов существуют и у этого объекта.
Для проверки этой гипотезы мы изучили качественный состав и количественную динамику содержания полиолов в пищеварительной железе живородки речной, в норме и в остром опыте со стресс-индуцирующими факторами — воздействием холода (до 4°С) и хлорида кадмия (0,005 мг Сс127л) продолжительностью 1,4 и 11 суток.
Методом ВЭЖХ нами показано, что в экстракте пищеварительной железы живородки речной действительно присутствует сорбит (хроматограмма, построенная по данным рефрактометрических замеров, содержала один пик, по времени удержания соответствующий сорбиту, глицерин выявлен не был). С целью охарактеризовать адаптивную динамику его содержания в ткани пищеварительной железы мы исследовали изменения концентрации сорбита и активность сопутствующих ферментов — сорбитолдегидрогеназы (КФ 1.1.1.14) и альдозоредуктазы (КФ 1.1.1.21), непосредственно связанных с превращением сорбита из фруктозы и глюкозы, соответственно, а поскольку эти реакции обратимы, то и вовлечением сорбита в метаболизм углеводов.
Результаты экспериментов показывают, что при понижении температуры среды обитания у моллюсков уже через сутки наблюдается увеличение активности дегидрогеназ и, соответственно, содержание сорбита в пищеварительной железе, образующегося приблизительно из равных долей глюкозы и фруктозы. Однако затем активность сорбитолдегидрогеназы резко
снижается и последующее накопление сорбита возможно только путем восстановления из глюкозы (рис. 7, А).
А
0 1 2 3 4 5 6 7
в
9 10 11
I
0 1 2 3 4 5 6 7
9 10 И
в сорбитолдегидрогеназа ¡ив* альдозоредуктаза
• кислая фосфатаза сорбит
Рис. 7. Динамика содержания сорбита и активности сопутствующих ферментов пищеварительной железы живородки речной при понижении температуры и интоксикации. По оси абсцисс — экспозиция опыта, сут.; по оси ординат — отклонение активности ферментов и содержания сорбита от контроля, %. Условные обозначения: А — понижение температуры, Б — интоксикация хлоридом кадмия.
Кислые фосфатазы при понижении температуры практически не активны, однако известно, что глюкоза и фруктоза могут накапливаться в свободном виде заранее или в первый момент понижения температуры, неустановленный нами, как бы формируя резервный пул предшественников сорбита, предназначенный для адаптации к периодическому понижению температуры воды.
При токсическом воздействии сорбит образуется преимущественно из фруктозы, чему способствует существенное увеличение активности сорбитолдегидрогеназы, преобладающей над альдозоредуктазой, и кислых фосфатаз, превращающих фруктозо-6-фосфат во фруктозу (рис. 7, Б). В тоже время, накопление сорбита в пищеварительной железе моллюска происходит лишь в начале опыта, уже через одиннадцать суток экспозиции его содержание резко падает, но при этом сорбит превращается преимущественно в глюкозу, т.к. активность сорбитолдегидрогеназы приближается к контрольному значению, тогда как у альдозоредуктазы возрастает почти вдвое.
Вероятно, сорбит у моллюсков служит не только криопротектором, точнее, он является защитным фактором в более широком смысле, который позволяет снизить повреждающее воздействие, в том числе и токсических веществ, подобно свободным углеводам (глюкоза, мальтоза), выполняющим роль неспецифических защитных метаболитов у дрожжей, уменьшая текучесть клеточных мембран. Снижение содержание сорбита у подопытных моллюсков через 11 суток после внесения токсиканта в среду их обитания можно объяснить фактическим снижением токсической нагрузки из-за частичной сорбции кадмия живыми организмами и стеклянными стенками сосуда, а также вследствие специфической адаптации моллюсков к кадмию путем связывания его металлотионеинами.
Исследование сезонной динамики сорбита в пищеварительной железе живородки речной, показало, что, во-первых, сорбит действительно накапливается к наступлению зимы и вновь вовлекается в обмен к лету (мкмоль/г ткани: 1,31 — осенью, 156 — зимой, 1,37 — весной, 0,68 — летом) и во-вторых, ответная реакция на острое воздействие холода (4°С) и токсиканта (0,005 мг Сс12+/л) однообразна во все сезоны (несколько более сглаженна зимой из-за
высокого содержания сорбита в норме), т.е. "медленная" сезонная адаптация не исключает "быстрой" адаптации в стресс-индуцирующему воздействию в остром опыте.
Резюмируя данные экспериментов по динамике сорбита и активности сопутствующих ферментов (фосфатазы, оксидоредуктазы) можно предложить следующую схему их участия в формировании устойчивости к понижению температуры и токсической нагрузке (рис. 8).
(^Гпикогеш^)
(^Пнокозо-1 -фосфат^У-
КФ1
-К^^юкозгГ^у Ал ьдозорсдуктаза
--- ---КФ1.КФ2 ___
£Тщокозо-6-фосфат_}---Глюкоза у /V
--—г^----------НАДФН НАДФ'
Сорбит
,---------
(__Фруктозо-6-фосфат__>
КФ1, КФ2, КФб
*■( Сорбитолдегидрогеназа
----- —к
СФруктозо-1,6-дифосфат) >Г Фруктоза у /ц ^-------—^ --НАДН НАД*
Рис. 8. Схема превращения углеводов и образования сорбита в пищеварительной железе живородки речной. Условные обозначения: эллипсы — промежуточные продукты обмена; прямоугольники — конечные продукты обмена; сплошные стрелки — реакции распада углеводов; штриховые стрелки — реакции, тормозящие распад углеводов и способствующие накоплению побочных метаболитов
Таким образом, выявленные нами стресс-редуцирующие биохимические факторы у живородки речной, возникающие в ответ на воздействие холода и токсического вещества, принципиально не отличаются по результату — накоплению сорбита (по крайней мере, в течение четырех суток экспозиции), однако варьируют по своему механизму, а именно: 1) участию фосфатаз, которое
весьма значительно при интоксикации и ничтожно мало при адаптации к холоду, 2) источнику углеводов — предшественников сорбита, при интоксикации таковым является преимущественно фруктоза как промежуточный продукт распада углеводов, в состоянии адаптации к холоду, вероятнее всего, — глюкоза и фруктоза, как продукты гидролиза полисахаридов, 3) продукту восстановления сорбита, которым является преимущественно фруктоза после токсического воздействия и глюкоза — при понижении температуры.
Биохимическое тестирование стоков и индикация природной воды. В качестве тест-функции или тест-показателя при биологическом тестировании чаще всего принимают выживаемость тест-организма (например, "дафниевый тест") или скорость размножения (например, тест на одноклеточных водорослях рода сценедесмус и др.), реже — потребление кислорода, интенсивность питания или двигательную активность животных в тестируемой воде. Мы использовали суммарную активность хорошо изученного нами комплекса кислых фосфатаз живородки речной. В результате было показано, что достоверное увеличение активности кислых фосфатаз находится в прямой зависимости от концентрации примеси практически во всей серии разбавлений и наблюдается уже в 2%-ной сточной воде (табл. 3).
Таблица 3. Активность комплекса кислых фосфатаз живородки речной и некоторые характеристики качества сточной воды, использованной в эксперименте
Концентрация сточной воды в пробе, % Суммарная активность кислых фосфатаз* через 96 ч., Е*10~3/мг белка Характеристики качества воды*
Конц. 02, мг/л ХПК, мг Сул бпк5, мг 02/л Выживаемость £>. та^а за 96 ч„ %
100 8,07±0,18 (+) 2,62 2100 65,5 0,0 (+)
50 11,64±0,22 (+) 4,96 1238 77,4 30,8 (+)
20 10,34±0,21 (+) 6,36 720 82,8 92,3 (+)
10 8,65±0,19 (+) 7,09 548 85,1 98,8 (-)
4 7,33+0,18 (+) 7,46 444 86,4 100,0 (-)
2 6,38±0,16 (+) 7,65 410 86,8 100,0 (-)
1 6,03±0,12 (-) 7,71 393 87,3 100,0 (-)
Контроль 5,92+0,12 7,79 375 87,2 100,0
'Примечание: (+) — отклонение от контроля статистически достоверно с вероятностью 0,95; (-) — отклонение от контроля недостоверно.
Испытание качества сточной воды с помощью традиционных методов убедительно подтверждают ее выраженные токсические свойства. Судя по высокому значению бихроматной окисляемости (ХПК) и крайне низкому содержанию кислорода, сточная вода содержит большое количество недоокисленных компонентов, а небольшое биологическое потребление кислорода (БПК5) в этой воде указывает на то, что эти компоненты, скорее всего, имеют небиотическую природу. Кроме того, неразбавленная сточная вода вызывает 100%-ную гибель дафний, причем токсические свойства воды по отношению к дафниям сохраняются до разбавления ее в 5 раз (20% сточной воды в пробе). Большая кратность разбавления сточной воды полностью нивелирует летальное действие на дафний и отклонения от контроля по другим характеристикам качества (содержание 02, показатели ХПК, БПКз).
Для биохимической индикации природной воды мы использовали комплекс кислых фосфатаз из пищеварительной железы трех видов моллюсков: живородки, беззубки и перловицы. Оптимизация рН инкубационной среды выявила, что у кислых фосфатаз перловицы наблюдается два четких пика активности — при рН 3,4 и 4,8. В соответствии с этим фосфатазы перловицы обозначили как КФ1 и КФ2 и определяли раздельно. Район сбора биологического материала охватывал приустьевой участок реки Которосль (г. Ярославль), станции сбора привязывали к наиболее вероятным источникам техногенного загрязнения, контролем считали станцию №4, расположенную рядом с установкой водоотбора питьевой воды (рис. 9).
Рис, 9. Схема приустьевого участка р. Которосль, в кружках — номера станций сбора биологического материала
Для сравнения производили биологическую индикацию качества воды по ряду традиционных показателей состава макрозообентоса (данные получены и опубликованы совместно с сотрудниками биологического факультета Ярославского государственного университета В.П. Семерным и С.Л. Зарубиным). Результаты исследований однозначно свидетельствуют о монотонном нарастании загрязненности русла реки вниз по течению. Динамика активности кислых фосфатаз у исследованных моллюсков имеет аналогичную тенденцию — постепенно увеличивается, коррелируя с расстоянием от контрольной станции сбора материала (рис. 10).
150,00 130,00 110,00 90,00 70,00 50,00 30,00 10,00 -10,00 -30,00 -50,00
А
т-!-!-1-1-!-1-1-1-1
■3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
♦ V. утраггш ■ А. stagnalis
к КФ1 Ь. X КФ2 и. 1ощргойЬгЬ
-—— V. утратил ....."А.
----КФ] У. ¡0П^1Г05Ш.Ч — — КФ2 и.
• ИС (слева) + ИРШУ (слева) Д ЧВЗ (слева) О ЧО/ЧЗ (справа)
-ИВ (слева)
----ЧГЗ (слева)
г 1500,00
|- 1400,00
- 1300,00 1200,00 1100,00 1000,00
- 900,00 800,00
- 700,00
- 600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00
- 0,00 -100,00
■ ИВ (слева) ▲ ЧГЗ (слева) □ 40 (справа) ИС (слева)
.......ИРШУ (слева)
----ЧВЗ (слева)
Рис. 10. Данные биохимической и биологической индикации качества воды в приустьевом участке реки Которосль. По оси абсцисс — расстояние от контрольной станции №4 по руслу реки, км; по осям ординат — отклонение результатов от контроля, %. Условные обозначения: А — активность кислой фосфатазы моллюсков, Б — критерии биологической индикации на примере макрозообентоса, ИС — индекс сапробности Пантле и Букк, ИВ — биотический индекс Вудивисса, ИРШУ — индекс разнообразия Шеннона-Уивера, ЧГЗ — численность групп зообентоса, ЧВЗ — численность видов зообентоса, ЧО — численность олигохет, ЧО/ЧЗ — отношение численности олигохет к общей численности видов зообентоса.
Искусственное переселение экспериментальных групп особей живородки речной на 7 суток, собранных на относительно чистых и загрязненных участках реки, подтвердило закономерность выявленных в ходе биохимической индикации наблюдений. Переселение на загрязненный участок водоема приводит к достоверному увеличению активности комплекса кислых фосфатаз, на относительно чистый — к снижению (табл. 4).
Таблица 4. Активность кислой фосфатазы живородки речной в опыте с искусственным
переселением на 7 суток
Станция сбора 9 28 32
Станция переселения 9 28 32 9 28 32 9 28 32
Активность, Е*10"3/мг белка 4,81* 7,11 8,98 6,54 8,24* 11,31 9,51 12,31 14,36*
Отклонение активности от контроля, % 0,0 +47,8 +86,7 -20,6 0,0 +37,3 -33,8 -14,3 0,0
Отклонение активности от исходного значения, % 0,0 -13,7 -37,5 +36,0 0,0 -21,2 +97,7 +49,4 0,0
Примечание: *контрольные значения активности кислой фосфатазы, определённые у аборигенных животных
Интересно отметить, что уровень активности фермента у переселённых особей живородки за время эксперимента не достигал величин, характерных для аборигенов (см. табл. 4). Наиболее вероятной причиной тому является возникновение генетически обусловленной изменчивости между популяциями живородки, изолированными значительньм расстоянием, практически непреодолимым для вида, привязанного к субстрату на всех стадиях своего развития.
Таким образом, примеры биохимического тестирования и индикации позволяют утверждать, что исследование динамики активности ферментов при интоксикации имеет очевидное практическое применение в качестве если не альтернативы, то существенного дополнения традиционным методам оценки качества природных и сточных вод.
Заключение. Существование стресса и неспецифической адаптации у
животных, значительно отличающихся по уровню организации от
млекопитающих (насекомые, моллюски, кольчатые черви), доказать весьма
проблематично a priori, поскольку к большинству из них не применима
диагностика этого явления по комплексу функциональных маркеров,
практикуемая в клинической патологии. Еще сложнее создать условия для
возникновения стресса, такие, чтобы интенсивность воздействия на организм, с
одной стороны, превосходила привычную (к которой организм уже адаптирован)
и тем самым индуцировала у него закономерную и адекватную ответную
реакцию (эустресс), с другой стороны, не была чрезмерной и не вызывала 36
коллапс защитных систем организма с необратимым нарушением гомеостаза (дистресс).
Судя по нашему опыту, наиболее существенным параметром для проведения токсикологических экспериментов является величина ПДК — концентрация вредных веществ, которая по результатам биологического тестирования не вызывает патологий у ряда тестовых организмов (Методические указания по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение. М.: ВНЙРО, 1998). Ориентируясь на эту величину, нам удалось создать сопоставимые условия токсикологических экспериментов с разными по степени токсичности веществами, а также пронаблюдать ответную реакцию на достаточно большом отрезке времени (до 4 суток) и при этом избежать дистресса и слишком интенсивного стресса у подопытных животных, когда стадия сопротивляемости быстро сменяется стадией истощения.
Важнейшим признаком стресс-реакции, а, следовательно, и стресса у различных по уровню организации водных животных при интоксикации на биохимическом уровне является колебательная динамика активности ферментов, достоверно превышающая по амплитуде естественную, наблюдаемую в контроле. Эта динамика универсальна в отношении воздействия разных токсических веществ и стереотипна для множества ферментных систем, не связанных с детоксикацией, и разных видов пресноводных гидробионтов, что позволяет рассматривать ее как метаболический фактор неспецифической (срочной) адаптации и использовать для эколого-биохимического мониторинга загрязнений пресных вод. Однако при ближайшем рассмотрении проясняется, что изменения качественного состава множественных форм ферментов, наблюдаемые, как правило, значительно позднее их суммарной ответной реакции, сугубо специфичны и представляют собой механизм адаптивной настройки метаболизма.
В частности, для комплекса кислых фосфатаз нами определена роль регуляторов интенсивности гликолиза и факторов накопления свободных
углеводов глюкозы и фруктозы у моллюска живородка речная. Этот стресс-редуцирующий фактор также можно считать неспецифическим, поскольку аналогичная реакция наблюдается в ответ на холодовой стресс, совершенно не схожий с интоксикацией. В тоже время активность сорбитолдегидрогеназы и альдозоредуктазы, сопутствующих превращению свободных углеводов в сорбит и обратно, а также динамика содержания самого сорбита в органах и тканях моллюска специфичны в отношении стресс-индуцирующего воздействия (переохлаждение или интоксикация), а, следовательно, являются факторами устойчивой адаптации. Если же принять за истину предположение, что сорбит у моллюсков действительно может служить защитным метаболитом в условиях токсической нагрузки (косвенные подтверждения тому мы получили в эксперименте с живородкой речной), его повышенное содержание в пищеварительной железе представляет собой структурный след устойчивой адаптации, позволяющий легче переносить повторную интоксикацию.
Таким образом, биохимический механизм стресс-реакции моллюсков на токсическое воздействие состоит в индукции генерализованной колебательной динамики активности ферментов как фактора срочной адаптации, закономерное перераспределение активности между фосфатазами с разной субстратной специфичностью или формировании базы для устойчивой адаптации и, как следствие, генерации устойчивого адаптивного ответа, а именно накопления побочных метаболитов — глюкозы, фруктозы и сорбита и их взаимопревращения с участием соответствующих ферментов. Участие других специфических стресс-редуцирующих факторов в формировании структурного следа, таких как металлотионеины или комплекс цитохромов Р450, также возможно, но их координация с динамикой активности ферментов остается не выясненной. Вероятнее всего их индукция связана не с метаболическим, а мембранным или другим биохимическим уровнем адаптации, исследование которых в рамки настоящего исследования не входило. В тоже время именно метаболический уровень адаптации, в отличие от молекулярного, клеточного, морфо-функционального и тем более популяционно-генетического может позволить с
наименьшими техническими трудностями произвести диагностику интоксикации и определить интегральный уровень загрязнения водной среды. Активность ферментов, определённая суммарно или дифференцированно для отдельных множественных форм, — легко выявляемый и весьма информативный симптоматический признак нормального состояния организма, стресса и патологических процессов. Это продемонстрировано нами не только в модельных токсикологических экспериментах с тяжёлыми металлами, но и в опытах со сточной водой неизвестного состава, а также исследованиях в природном водоёме.
Данные примеры послужили нам основой для подготовки патента, который стал логическим итогом развития прикладного аспекта нашего исследования.
Выводы:
1. Охарактеризована стресс-редуцирующая реакция на сублетальное токсическое воздействие, установлены механизмы и выявлена взаимосвязь срочной и устойчивой адаптации с участием комплекса кислых фосфатаз у пресноводного моллюска живородка речная (Утрагш \iviparus Ь.).
2. Биохимические механизмы адаптации к токсическому воздействию имеют общебиологическую природу, однообразно определяются у различных по организации видов гидробионтов и проявляются в закономерных колебаниях активности гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов относительно контроля (нормы), которые имеют вид циклической фазной зависимости от экспозиции токсического воздействия. Среди исследованных видов гидробионтов можно выделить токсикодинамичные (беспозвоночные), отличающиеся большими колебаниями активности ферментов (в 2 и более раз относительно контроля), и гомеостатичные (рыбы), у которых амплитуда колебаний ферментативной активности не высока (в 1,5 раза и менее).
3. Химическая природа токсического вещества (тяжелые металлы, органические вещества) и его концентрация не отражается на форме зависимости активности ферментов от продолжительности опыта, а влияет только на величину изменения активности ферментов.
4. Закономерные однообразные колебания активности гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов, индуцированные острым токсическим воздействием, являются биохимическим компонентом неспецифического адаптационного синдрома у гидробионтов и служат срочными стресс-редуцирующими факторами, позволяющими корректировать метаболизм при интоксикации.
5. Адаптивная динамика биохимических параметров при интоксикации у рыб может быть выражена слабо из-за частичного замещения (предупреждения) более высокими уровнями адаптации и, прежде всего, поведенческим, сопряженным со способностью свободно передвигаться на значительные расстояния и таким образом избегать локальных загрязнений водоема.
6. Состав множественных форм ферментов при интоксикации гидробионтов меняется разнообразно, и зависит от типа токсиканта, его концентрации и продолжительности воздействия. Форму кривой биохимической адаптации в целом определяют суммарные ферментативные реакции, тогда как функции каждого из ферментов состоят в специфической коррекции метаболизма посредством активности отдельных множественных форм.
7. Молекулярные формы кислой фосфатазы речной живородки впервые охарактеризованы по электрофоретической подвижности, изоэлектрической точке и субстратной специфичности. Установлено, что в зависимости от большего или меньшего сродства к органическим фосфатам, изученные ферменты могут тормозить или интенсифицировать гликолиз, и, следовательно, обмен углеводов в пищеварительной железе моллюска.
8. В пищеварительной железе речной живородки при интоксикации in vivo происходит индукция одной из форм кислой фосфатазы — КФ6. Фермент специфичен к фруктозо-б-фосфату (71% активности по отношению к р-нитрофенилфосфату), медленно расщепляет а-глицерофосфат (19% по отношению к р-нитрофенилфосфату) и не действуют ни на один из других природных субстратов, а потому способствует торможению гликолиза и накоплению побочных продуктов метаболизма углеводов (фруктозы, сорбита,
глюкозы). Относительная электрофоретическая подвижность КФ 6 в 5,7%-ном ПААГ составляет 0,21, изоэлектрическая точка равна 7,1.
9. Впервые определено содержание сорбита в пищеварительной железе живородки речной в разные сезоны (осенью — 1,31±0,08, зимой — 155,95±3,85, весной — 1,37±0,07, летом — 0,68±0,06 мкмоль/г ткани) и в острых лабораторных опытах. При содержании моллюсков в холодной воде происходит накопление сорбита (до 508% по отношению к контролю). При интоксикации организма моллюска содержание сорбита увеличивается в разной степени в зависимости от экспозиции (от 117 до 283% по отношению к контролю).
10. Динамика содержания сорбита в пищеварительной железе живородки речной вызвана изменением активности кислых фосфатаз, сорбитолдегидрогеназы и альдозоредуктазы, которые в зависимости от характера внешнего воздействия, способствуют накоплению сорбита в организме моллюска или его обратному вовлечению в метаболизм углеводов. Реакция этих ферментов на интоксикацию организма и воздействие холода различна, в соответствии с чем изменение содержания сорбита в течение острого опыта происходит по-разному: при понижении температуры монотонно нарастает, при интоксикации колеблется, повышаясь относительно контроля и вновь возвращаясь в первоначальному уровню.
11.Кислые фосфатазы пищеварительной железы речной живородки служат эффекторами для срочной стресс-редуцирующей (адаптивной) регуляции углеводного обмена. Ее сущность состоит в модуляции гликолиза (изъятии промежуточных продуктов углеводного обмена) и индукции накопления сорбита как устойчивого стресс-редуцирующего фактора (криопротектора, модулятора текучести и проницаемости клеточных мембран), а при исчерпании адаптивного потенциала—вероятного индуктора апоптоза.
12.Изменения активности ферментов, наблюдаемые при интоксикации организма водных животных в остром опыте, могут служить биохимическим показателем загрязнения воды. Этот показатель в отличие от физико-химических является синергическим, т.е. отражает комплексное воздействие всей
взаимозависимой совокупности загрязнения воды и, одновременно характеризуется высокой чувствительностью (на уровне ПДКводн. и ниже) и динамичностью, поскольку первые изменения обнаруживаются уже через несколько часов экспозиции подопытных животных в исследуемой воде.
13.На примере трех видов молюсков Viviparus vivparus L., Anodonta stagnalis Gmelin, Unio longirostris Rossmaessler показано, что многолетняя изоляция на экологически чистых и в разной степени загрязненных участках водоема приводит к возникновению межпопуляционных различий в суммарной активности кислой фосфатазы, которые сохраняются после вынужденного (искусственного) переселения, а значит, являются следствием генетической изменчивости. Эта изменчивость может количественно характеризовать степень техногенного загрязнения природных вод.
Содержание работы в основном отражено в следующих публикациях: Монография:
Цветков И.Л., Коничев A.C. Экологическая биохимия гидробионтов. М.: Изд-во МГОУ, 2006.104 с. (6,5 п.л., авторский вклад — 85%). Патент на изобретение:
Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев A.C. Способ определения токсического загрязнения сточных и природных пресных вод. / Патент РФ №2308719. // Опубликовано 20.10.2007. Бюлл. № 29 (1,38 пл., авторский вклад — 50%). Статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ:
1. Цветков И.Л., Зарубин С.Л., Урванцева Г.А., Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. Кислая фосфатаза гидробионтов как фермент-индикатор биохимической адаптации к воздействию токсических веществ. // Известия АН. Серия биологическая. 1997. №5. С. 539-545 (0,44 п.л., авторский вклад — 60%).
2. Попов А.П., Коничев A.C., Цветков И.Л. Влияние токсичных соединений техногенного происхождения на активность и множественные формы кислой ДНКазы живородки речной (Viviparus viviparus L.). // Прикладная
биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. №5. С. 518-523 (0,38 пл., авторский вклад — 25%).
3. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев A.C. Комплекс кислых фосфатаз живородки речной в норме и при интоксикации ионами кадмия. // Биохимия. 2003. Т. 68. Вып. 12. С. 1648-1656 (0,56 пл., авторский вклад — 70%).
4. Цветкова М.А., Цветков И.Л., Коничев A.C. Содержание гликоалкалоидов и состав белков в листьях картофеля при повреждении колорадским жуком. // С.-х. биология. Серия: Биология растений. 2004. №1. С. 97-104 (0,50 пл., авторский вклад — 35%).
5. Сеитова А.М., Игнатов А.Н., Супрунова Т.П., Цветков И.Л., Дейнеко Е.В., Дорохов Д.Б., Шумный В.К., Скрябин К.Г. Оценка генетического разнообразия дикорастущей сои (Glycine soja Siebold et Zucc.) в Дальневосточном регионе России. // Генетика. 2004. Т. 40, №2. С. 224-231 (0,50 пл., авторский вклад — 20%).
6. Коничев A.C., Попов А.П., Цветков И.Л., Филков П.В. Ферменты как биохимические маркеры загрязнения воды. // Приложение к Вестнику МГОУ. Серия «Естественные науки». География, экология, экономика: актуальные проблемы науки и образования. М.: Изд-во МГОУ, 2005. С. 151-153 (0,19 пл., авторский вклад —20%).
7. Цветков И.Л., Цветкова М.А., Зарубин С.Л., Семерной В.П., Коничев A.C. Оценка качества сточных и природных вод с помощью биохимического показателя — активности кислой фосфатазы пресноводных моллюсков. // Водные ресурсы. 2006. Т. 33. №1. С. 62-70 (0,56 пл., авторский вклад — 65%).
8. Попов А.П., Цветков И.Л., Коничев A.C. Биохимическое тестирование токсического загрязнения вод: планирование эксперимента и выбор тест-объекта. // Вестник МГОУ. Серия Естественные науки. 2006. № 4. С. 87-92 (0,3 8 пл., авторский вклад — 20%).
9. Попов А.П., Цветков И.Л., Коничев A.C. Разделение и характеристика дезоксирибонуклеаз гепатопанкреаса живородки речной в норме и при модельной интоксикации in vivo. II Биохимия. 2008. T. 73. Вып. 8. С. 11611167 (0,44 п.л., авторский вклад — 25%).
10. Цветков И.Л., Коничев A.C. Стресс-индуцированная динамика сорбита и активности сопутствующих ферментов в пищеварительной железе живородки речной. // Биохимия. 2009. Т. 74. Вып. 11. С. 1548-1554 (0,37 п.л., авторский вклад — 90%).
Депонированная рукопись:
Цветков И.Л., Зарубин С.Л., Урванцева Г.А. Кислая фосфатаза разных внутривидовых форм катушки роговой как индикатор загрязнения вод тяжелыми металлами. Деп. в ВИНИТИ от 15.03.95., №709-В95. 11с. (0,69 п.л., авторский вклад — 75%).
Материалы Международных. Всероссийских и др. научных конференций:
1. Цветков И.Л., Урванцева Г.А. Влияние хлорида кадмия на активность кислой фосфатазы катушки роговой. // Тез. докл. I Международной IV Всероссийской научно-практической конференции "Экология и охрана окружающей среды" (Рязань, 15-16 сентября 1994 г.). Рязань, 1994. С. 115 (0,06 п.л., авторский вклад — 90%).
2. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев A.C. Уровень активности кислой фосфатазы у моллюсков на различных по степени загрязнения участках реки. // Мат. X Международ, науч. конф. "Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря и водоемов внутреннего стока Евразии" (Астрахань, 25-30 апреля 2008 г.). Астрахань, 2008. С. 125-127 (0,13 п.л., авторский вклад — 75%).
3. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев A.C. Стресс-индуцированная динамика сорбита и активности сопутствующих ферментов в пищеварительной железе живородки речной. // Сб. мат. Международ, научно-практич. конференции "Актуальные проблемы биоэкологи" (Москва, 21-24 октября
2008 г.). М.: Изд-во МГОУ, 2008. С. 70-72 (0,13 пл., авторский вклад — 75%).
4. Попов А.П., Цветков И.Л., Коничев A.C. Комплекс дезоксирибонуклеаз живородки речной и его реакция на токсическое воздействие in vivo. II Материалы Ш Всероссийской конференции по водной токсикологии, посвященной памяти Б.А. Флерова (Борок, 11-16 ноября 2008 г.). Борок, 2008. Ч. 2. С. 123-127 (0,31 п.л., авторский вклад —20%).
5. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев A.C. Влияние стресса на метаболизм сорбита в пищеварительной железе живородки речной. II Материалы III Всероссийской конференции по водной токсикологии, посвященной памяти Б .А. Флерова (Борок, 11-16 ноября 2008 г.). Борок, 2008. Ч. 2. С. 182-186 (0,31 п.л., авторский вклад — 75%).
6. Цветков И.Л., Урванцева Г.А., Зарубин С.Л., Коничев A.C. О возможности биохимического тестирования качества воды с помощью кислой фосфатазы некоторых гидробионтов // Материалы VII съезда Гидробиологического общества РАН (Казань, 14—20 октября 1996 г.). Казань: Полиграф, 1996. Т.З. С.93-94 (0,13 пл., авторский вклад — 65%).
7. Зарубин С.Л., Цветков И.Л., Урванцева Г.А. Изменение характеристик фермента кислая фосфатаза моллюсков Vivíparas viviparus при воздействии сточных и природных вод. // Материалы VII съезда Гидробиологического общества РАН (Казань, 14-20 октября 1996 г.). Казань: Полиграф, 1996. Т. 3. С. 28-30 (0,19 пл., авторский вклад —45%).
8. Цветков И.Л., Зарубин С.Л., Урванцева Г.А. Изменение активности кислой фосфатазы и белкового спектра экстракта тел моллюсков Viviparus viviparus как биохимические показатели степени токсичности природных вод. // Тез. докл. науч. конф. "Вузовская наука в решении экологических проблем Верхне-Волжского региона" (Ярославль, 18-19 апреля 1995 г.). Ярославль, 1995. С. 23 (0,06 пл., авторский вклад — 75%).
9. Зарубин С.Л., Цветков И.Л. Принципы выбора тест-объекта и тест-показателя для биоиндикации и биотестирования сточных и природных
вод. //. Тез. докл. конф. "Биологические исследования в Ярославском государственном университете" (Ярославль, 29 ноября 1996 г.). Ярославль, 1997. С. 62-65 (0,25 п.л., авторский вклад — 45%)
Ю.Зарубин С.Л., Цветков И.Л., Урванцева Г.А., Шляпникова H.A. Исследование индуцированной резистентности Daphnia magna Straus к длительному воздействию хлорида хрома. // Тез. докл. конф. "Биологические исследования в Ярославском государственном университете" (Ярославль, 29 ноября 1996 г.). Ярославль, 1997. С. 70-71 (0,13 п.л., авторский вклад — 20%).
11.Цветков И.Л., Попов А.П. Энзимодиагностика загрязнений пресных вод с использованием кислой фосфатазы и дезоксирибонуклеазы живородки речной. И. Сборник статей Российской школы молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии" (Пущино, 28 октября — 3 ноября 2006 г.,). Пущино — Тула, 2006. С. 146-148 (0,19 п.л., авторский вклад — 50%).
Статьи в сборниках научных трудов:
1. Цветков И.Л. Изменчивость активности комплекса кислых фосфатаз моллюсков в адаптации организма к среде обитания. // Научные труды МПГУ им. В.И. Ленина. Серия: естественные науки. М.: Прометей, 1997. С. 71-72 (0,13 п.л., авторский вклад — 100%).
2. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев A.C., Урванцева Г.А. Влияние хлорида кадмия на активность фосфатазного комплекса ферментов. // Научные труды МПГУ. Серия: Естественные науки. М.: Прометей, 1998. С. 242-243 (0,13 п.л., авторский вклад — 70%).
3. Коничев A.C., Попов А.П., Цветков И.Л. Влияние катионов металлов на активность и множественные формы ДНКазы живородки речной (Viviparus viviparus L.). // Труды Центра фундаментальных научных исследований МГОУ. М.: Изд-во МГОУ, 2005. №1. С. 75-78 (0,25 п.л., авторский вклад — 20%).
Подписано в печать: 24.09.2009
Заказ № 2583 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Цветков, Илья Леонидович
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Биохимическая адаптация гидробионтов к токсическому воздействию и другим факторам среды (обзор литературы)
1.1. Молекулярные факторы адаптации. Металлотионеины и другие стресс-белки
1.2. Метаболические факторы адаптации
1.2.1. Реакции свободного окисления
1.2.1.1. Ферментативная детоксикация ксенобиотиков
1.2.1.2. Антиоксидантная защита
1.2.1.3. Биомаркеры окислительно-восстановительных процессов в экологическом мониторинге природных водоемов
1.2.2. Адаптивная динамика основных путей метаболизма
1.2.3. Биогенные вещества и специализированные защитные белки в качестве факторов метаболической адаптации
1.3. Клеточная адаптация и её биохимические маркеры
1.3.1. Апоптоз — запрограммированная гибель клеток
1.3.2. Аутолиз и некроз
1.4. Стресс и его общебиологическая природа 108 1.4.1. Основные биохимические маркеры стресса
1.4.2. Развитие стресс-реакции. Неспецифическая и специфическая адаптация
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Особенности биологии подопытных животных
2.1.2. Сбор и содержание животных в лаборатории. Постановка токсикологических экспериментов
2.2. Методы
2.2.1. Количественное определение активности ферментов
2.2.2. Энзимэлектрофорез множественных форм ферментов в полиакриламидном геле
2.2.3. Изоэлектрическое фокусирование множественных форм ферментов
2.2.4. Определение субклеточной локализации множественных форм ферментов 1^
2.2.5. Качественное и количественное определение сорбита
ГЛАВА 3. Суммарная активность ферментов в остром токсикологическом эксперименте 145 3.1. Методическая основа и проблемы постановки токсикологических экспериментов
3.1.1. Верификация результатов, полученных с объединённой пробой
3.1.2. Групповая изменчивость и репрезентативные группы
3.2. Изучение динамики суммарной активности ферментов в остром токсикологическом эксперименте
3.2.1. Изменение активности ферментов как следствие интоксикации организма
3.2.2. Колебательная динамика активности ферментов в процессе адаптации
ГЛАВА 4. Изменение состава множественных форм гидролитических ферментов при интоксикации гидробионтов
4.1. Молекулярная гетерогенность ферментов в норме
4.1.1. Процедура разделения и характеристики множественных форм исследованных ферментов
4.1.2. Ферменты или множественные формы?
4.2. Функциональные и патологические изменения состава множественных форм ферментов
4.2.1. Множественные формы ферментов как инструменты метаболической адаптации и маркеры загрязнённости природных
4.2.2. Множественные формы ферментов как факторы специализации тканей, органов и межвидовой дифференциации
ГЛАВА 5. Комплекс кислых фосфатаз живородки речной 214 5.1. Молекулярная гетерогенность и субклеточная локализация
5.1.1. Суммарная активность и состав множественных форм
5.1.2. Тканевая специфичность и субклеточная локализация
5.2. Физико-химические свойства и функции кислых фосфатаз
5.2.1. Очистка ферментов, их зависимость от катионов металлов
5.2.2. Субстратная специфичность и метаболические функции
5.3. Реакция комплекса кислых фосфатаз на токсическое воздействие
5.3.1. Опыты in vitro
5.3.2. Опыты in vivo
5.3.2.1. Динамика суммарной активности комплекса кислых фосфатаз
5.3.2.2. Изменения состава множественных форм кислых фосфатаз
ГЛАВА 6. Обмен побочных метаболитов в состоянии стресса
6.1. Побочные метаболиты живородки речной
6.1.1. Сезонная динамика накопления сорбита
6.1.2. Стресс-индуцированная динамика накопления сорбита
6.2. Динамика активности сопутствующих ферментов
6.2.1. Превращение побочных метаболитов в состоянии холодового и токсического воздействия
6.2.2. Координация факторов срочной и устойчивой адаптации. Структурный след
ГЛАВА 7. Биохимическое тестирование стоков и индикация качества природной воды
7.1. Лабораторный токсикологический эксперимент
7.2. Исследования в природном водоёме
7.2.1. Биологическая индикация качества воды ЗС
7.2.2. Эксперимент в природных условиях (биотестирование путём переселения) 320 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 329 ВЫВОДЫ 333 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 338 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические параметры стресс-редуцирующей реакции гидробионтов при интоксикации"
Актуальность темы. Техногенное загрязнение водной среды — одна из глобальных экологических проблем современного общества и в ряду с климатическими изменениями температуры, освещенности, газового, солевого состава и др. параметров, едва ли не главный по значимости средовой фактор, воздействию которого нередко подвергаются водные животные. Сила воздействия этого фактора на гидробионтов определяется его качественными и количественными признаками. Первые обусловлены вероятностью попадания в гидросферу какого-либо не встречавшегося ранее токсического вещества (некоторые тяжелые металлы, ксенобиотики и пр.), вторые — концентрацией в воде и продолжительностью воздействия на биоту. Если по силе воздействия какой-либо фактор среды выходит за привычные рамки, освоенные животными в результате естественного отбора (популяционно-генетическая адаптация) или онтогенеза (индивидуальная адаптация), организм переходит в состояние стресса — органического или физиологического расстройства, сопровождаемого нарушением обмена веществ.
Впервые понятие стресса (неспецифического адаптационного синдрома) было разработано канадским патологом Гансом Селье. Он рассматривал стресс как механизм сохранения гомеостаза, универсальный для живых организмов [Селье, 1961, 1972, 1979], однако впоследствии выяснилось, что существующее многообразие жизненных форм и уровней организации в живой природе не позволяет одинаково интерпретировать стресс у теплокровных животных и беспозвоночных организмов, таких, как насекомые или моллюски. Фундаментальные отличия в строении и функциях нервных систем, степени их вовлечённости в регуляцию гомеостаза, а также в уровнях развития и преобладании значимости клеточной и организменной регуляции метаболизма в данных примерах столь существенны, что для диагностики стресса невозможно использовать одни и те же симптомы (маркеры).
Более того, понятие стресса по-разному интерпретируется экологами, генетиками, физиологами и биохимиками в связи с существованием разных форм проявления «органических и физиологических расстройств» у животных на метаболическом, клеточном, морфо-функциональном, популяционном и биоценотическом уровнях организации.
В этой связи важно отметить, что для универсальной диагностики стресса оказываются наиболее важными не столько какие-либо физиологические или биохимические маркеры, сколько определённый сценарий развития событий, индуктором которых в организме послужил стресс. Несмотря на различную природу стресс-индуцирующего воздействия (в нашем случае это химическая структура токсических веществ, степень их токсичности для определённых видов гидробионтов и 8 вероятность попадания в водную среду) организм реагирует, отвечая стереотипным набором биохимических и физиологических реакций, направленных на преодоление нарушений его жизнедеятельности. Этот набор в совокупности именуемый стресс-реакцией (он же — неспецифический адаптационный синдром), обеспечивает так называемую неспецифическую или срочную адаптацию.
Срочная адаптация не является окончательной для организма, а представляет собой первую фазу индивидуальной адаптации, из которой развивается вторая фаза — устойчивая или специфическая адаптация. Её важная особенность состоит в способности, во-первых, повышать устойчивость организма к какому-либо определённому или ряду близких по своей природе раздражителей, а во-вторых, формировать так называемый структурный след, который позволяет полностью устранить нарушения гомеостаза и сохранять эту способность в постадаптационный период.
В литературе имеются многочисленные экспериментальные свидетельства того, что вследствие интоксикации у гидробионтов происходит изменение активности и состава множественных форм целого ряда ферментов, непосредственно не связанных с детоксикацией [Немова,
1996, 2008; Немова и др., 1990]. Аналогичная реакция наблюдается в ответ и на другие раздражители, например, радиоактивное, рентгеновское и ультрафиолетовое облучение, повышение температуры воды. В частности, на такие факторы реагируют многие оксидоредуктазы (глюкозо-6фосфат-, лактат—, малат—, сукцинат- и алкогольдегирогеназы) и трансферазы (аспартатаминотрансфераза, гексокиназа), но в гораздо большей степени это относится к ферментам с широкими метаболическими функциями — неспецифичным к субстрату гидролазам (нуклеазы, кислые протеиназы, щелочная и кислая фосфатазы, неспецифические эстеразы и др.).
По ряду признаков, это и есть «изменения обмена веществ» как указывал Селье, которые составляют суть неспецифического адаптационного синдрома. Однако в силу чрезвычайной разрозненности и часто противоречивости литературных данных охарактеризовать неспецифическую адаптацию на биохимическом уровне как единый и универсальный механизм сохранения гомеостаза у гидробионтов пока не представляется возможным.
В тоже время, известны и некоторые устойчивые стрессредуцирующие факторы специфической адаптации. Установлено, например, что большинство токсических веществ подвергается детоксикации путем их постепенной деградации системой цитохромов Р45о органические вещества) или специфического связывания в неактивные комплексы с металлотионеинами (тяжелые металлы) или иммуноглобулинами (токсины белковой природы и другие антигены).
Известны также белки теплового шока или в общем смысле — стрессбелки с невыясненными до конца функциями. Предполагают, что большинство из них играют роль специфических протекторов (например, криопротекторов), некоторые являются сигнальными в генерации стресс-редуцирующих механизмов. Кроме того, описаны белки и другие молекулярные факторы (пептиды, углеводы и их производные), участвующие в изменении проницаемости клеточных мембран, вязкости и плотности жидкостей организма и других физико-химических параметров клеток и тканей.
Очевидно, что, например, повышенное содержание в организме определённых металлотионеинов или иммуноглобулинов, накопление криопротекторов, индукция активности «адаптационных» форм ферментов и др. параметры, выходящие за рамки нормы реакции, являются вполне убедительными признаками структурного следа специфической адаптации. Тем не менее, механизмы координации срочных и возникающих позднее устойчивых стресс-редуцирующих факторов, собственно процесс индукции специфической адаптации как результат стресс-реакции на токсическое воздействие остаются пока не известными.
По нашему убеждению, для разрешения проблем экологической биохимии в области теории адаптации необходим систематический подход к исследованию, а именно, анализ динамики изменений широкого круга метаболических параметров (прежде всего, активности ферментов) у ряда гидробионтов разных систематических групп в ответ на токсическое воздействие различной природы, и интерпретация полученных результатов в концепции неспецифической адаптации. Одновременно детальное изучение физико-химических свойств ферментов позволит определить их участие в адаптации как специфических стресс-редуцирующих факторов и таким образом расшифровать механизмы стресс-реакции и адаптации.
Цель и задачи исследования. Основная цель нашей работы — выявление биохимических механизмов стресс-редуцирующей реакции на сублетальную интоксикацию у пресноводных моллюсков и других гидробионтов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Установить основные параметры гидролитических ферментов (активность, тканевую локализацию, состав множественных форм) у пресноводных гидробионтов в норме и выявить их динамику в ответ на слабое токсическое воздействие (на уровне ПДК) в остром опыте.
2. Охарактеризовать универсальные и специфичные аспекты биохимической адаптации в ответ на токсическую нагрузку у разных видов гидробионтов.
3. Выявить механизм стресс-редуцирующей реакции на сублетальное токсическое воздействие и охарактеризовать взаимосвязь биохимических механизмов срочной и устойчивой адаптации у пресноводного моллюска живородка речная (Viviparus viviparus L.).
4. Оценить и обосновать возможность биотестирования и биоиндикации' с использованием активности гидролитических ферментов гидробионтов как маркеров токсического загрязнения воды и водоёмов.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые охарактеризован механизм метаболической адаптации к токсическому воздействию у живородки речной, включая фазы неспецифической (срочной) и специфической (устойчивой) адаптации, а также процесс их координации с участием комплекса кислых фосфатаз, обладающих различной специфичностью в отношении природных субстратов.
Проанализированы и обобщены изменения ряда физико-химических параметров гидролитических ферментов (общая активность фермента, состав и активность множественных форм) у широкого круга видов пресноводных гидробионтов в ответ на слабое токсическое воздействие. Впервые получены систематические данные о динамике биохимической адаптации у разных видов исследованных животных, которые углубляют классическое представление о неспецифическом адаптационном синдроме (НАС). Эти данные позволяют выявить как индивидуальные особенности разных видов по их стресс-реакции, так и общие (универсальные) закономерности адаптивной динамики метаболизма.
Впервые выделены и охарактеризованы кислые фосфатазы из пищеварительной железы моллюска живородка речная (Viviparus viviparus L.). Определены их физико-химические и функциональные параметры (Rf в 5,7% ПААГ, pi, субстратная специфичность), установлена субклеточная локализация и тканеспецифичность этих ферментов. Кроме того, выявлена и подробно изучена индуцибельная (адаптационная) кислая фосфатаза, появляющаяся в ответ на острую интоксикацию хлоридом кадмия.
На основании данных о субстратной специфичности и изменении активности кислых фосфатаз при интоксикации предложена схема участия этих ферментов в адаптивной регуляции гликолиза и накоплении побочных метаболитов (глюкоза, фруктоза, сорбит, глицерин) у пресноводных гидробионтов.
Установлена роль сорбита в метаболизме живородки речной как криопротектора и фактора устойчивости к токсическому воздействию. Предполагается участие сорбита в индукции апоптоза при исчерпании адаптивного потенциала отдельных клеток. Выявлена динамика содержания сорбита и активности ряда ферментов углеводного обмена в пищеварительной железе моллюска. Показано, что сорбит накапливается в пищеварительной железе моллюска как при понижении температуры воды, так и при острой интоксикации, однако происходит это разными путями, поскольку изменения активности сопутствующих накоплению сорбита ферментов (кислая фосфатаза, сорбитолдегидрогеназа, альдозоредуктаза) зависят от характера стресс-индуцирующего воздействия. Это связано с вынужденной оптимизацией регуляторных механизмов в процессе адаптации к определённым неблагоприятным факторам внешней среды и/или необходимостью изменения баланса свободных углеводов (прежде всего, глюкозы и фруктозы) как предшественников сорбита для реализации стресс-редуцирующих реакций организма.
На примере трёх видов моллюсков Viviparus vivparus L., Anodonta stagnalis Gmelin, Unio longirostris Rossmaessler показана изменчивость активности кислой фосфатазы в популяциях живородки речной, обитающих в зонах с различной антропогенной нагрузкой (р. Которосль, г. Ярославль и Ярославская обл.). Исследованы активность и состав множественных форм кислой фосфатазы. Установлены достоверные и очень значительные популяционные различия исследованных биохимических параметров, сохраняющиеся в условиях кратковременного изменения условий обитания (при искусственном переселении).
На основании анализа результатов лабораторных исследований даны обоснованные рекомендации для выбора тест-функции (фермент), тест-объекта (вид животного) и параметров токсикологического эксперимента (продолжительность, концентрация токсиканта). Наглядно продемонстрирован способ биохимического тестирования качества воды в остром опыте с использованием живородки речной (тест-объект) и гидролитических ферментов (тест-функция).
Практическая значимость. Запатентованный нами способ биохимического тестирования качества воды (патент РФ №2308719) состоит в регистрации изменений суммарной активности кислой фосфатазы и дезоксирибонуклеазы в экстракте пищеварительной железы живородки речной по истечении ряда кратковременных экспозиций моллюсков в тестируемой воде. Этот способ имеет универсальное применение в отношении химической природы токсических веществ и их качественного состава в многокомпонентных смесях, т.к. базируется на концепции о неспецифическом адаптационном синдроме, являющейся частью нашего исследования.
Предложен способ биохимической индикации токсического загрязнения природных водоёмов по сравнительным данным о суммарной активности кислой фосфатазы в экстракте пищеварительной железы трёх видов пресноводных моллюсков (V. vivparus, A. stagnalis, U. longirostris). По сравнению с традиционными методами биологической индикации, данный способ значительно проще для реализации, т.к. не требует глубоких знаний в области морфологии и систематике водных животных. В тоже время он позволяет оценить суммарное токсическое загрязнение водоёма или его определённых зон, и, по сути, не ограничен в применении ареалами изученных видов моллюсков, т.к. может быть отработан, и для других видов гидробионтов.
Обоснованность научных положений, выводов, рекомендаций. Научные положения диссертационной работы, выводы и рекомендации являются результатом натурных и лабораторных исследований, проведённых с применением современных биологических, биохимических и физико-химических методов анализа с использованием калиброванной, юстированной и поверенной аппаратуры. Для получения экспериментальных результатов в основном использованы стандартные методы исследований. Корректность полученных результатов подтверждена статистической оценкой сходства и различия выборок при повторных экспериментах и проведении независимых контрольных исследований.
Положения, выносимые на защиту:
1. В ответ на сублетальное токсическое воздействие (на уровне ПДК) активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов у водных животных меняется циклически, характеризуясь закономерно повторяющимися фазами частичной инактивации и последующей активации через определенные промежутки времени. Эта зависимость представляет собой отражение срочной биохимической адаптации организма к токсическому воздействию, которая, реализуясь на физиологическом уровне, формирует неспецифический адаптационный синдром.
2. У водных животных, разных по уровню биологической организации, существуют универсальные факторы метаболической адаптации к токсическим веществам, которые не зависят от природы токсиканта. Эти факторы обусловлены активностью ферментных систем, напрямую не связанных с детоксикацией, но участвующих в стресс-редуцирующей регуляции обмена веществ и индукции специфических факторов токсикорезистентности. Эти процессы реализуются с помощью множественных форм ферментов, метаболические функции которых могут принципиально отличаться друг от друга, что позволяет производить устойчивые сдвиги обмена веществ (на примере комплекса кислых фосфатаз и их влияния на интенсивность гликолиза и накопление побочных метаболитов).
3. Представления о динамике активности ферментов, участвующих в неспецифической адаптации к токсическому воздействию, могут быть использованы для разработки методов биохимического тестирования и биохимической индикации качества природных и сточных вод.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались I Международной и IV Всероссийской научно-практической конференции «Экология и охрана окружающей среды» (Рязань, 15-16 сентября 1994 г.), VII Съезду Гидробиологического общества РАН (Казань, 14-15 октября
1996 г.), научной конференции «Вузовская наука в решении экологических i проблем Верхне-Волжского региона» (Ярославль, 18-19 апреля 1996 г.), научной конференции «Биологические исследования в Ярославском государственном университете» (Ярославль, 29 ноября 1997 г.), X Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря и водоемов внутреннего стока Евразии» (Астрахань, 25-30 апреля 2008 г.), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологи» (Московский областной государственный университет, 21-24 октября 2008 г.), III Всероссийской конференции по водной токсикологии, посвященной памяти Б.А. Флерова, «Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы» (Борок, 11-16 ноября 2008 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ, из них 10 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ (1 — в печати), 1 монография, 1 патент на изобретение, 1 рукопись, депонированная в ВИНИТИ, 11 статей в материалах международных, всероссийских и др. конференций, 3 статьи в сборниках трудов вузов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о биохимических механизмах адаптации к токсическому воздействию in vivo у гидробионтов, участии различных белков, ферментов и метаболитов в разнообразных молекулярных процессах формирования
Заключение Диссертация по теме "Экология", Цветков, Илья Леонидович
выводы
1. Охарактеризована стресс-редуцирующая реакция на сублетальное токсическое воздействие, установлены механизмы и выявлена взаимосвязь срочной и устойчивой адаптации с участием комплекса кислых фосфатаз у пресноводного моллюска живородка речная {Viviparus viviparus L.).
2. Биохимические механизмы адаптации к токсическому воздействию имеют общебиологическую природу, однообразно определяются у различных по организации видов гидробионтов и проявляются в закономерных колебаниях активности гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов относительно контроля (нормы), которые имеют вид циклической фазной зависимости от экспозиции токсического воздействия. Среди исследованных видов гидробионтов можно выделить токсикодинамичные (беспозвоночные), отличающиеся большими колебаниями активности ферментов (в 2 и более раз относительно контроля), и гомеостатичные (рыбы), у которых амплитуда колебаний ферментативной активности не высока (в 1,5 раза и менее).
3. Химическая природа токсического вещества (тяжелые металлы, органические вещества) и его концентрация не отражается на форме зависимости активности ферментов от продолжительности опыта, а влияет только на величину изменения активности ферментов.
4. Закономерные однообразные колебания активности гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов, индуцированные острым токсическим воздействием, являются биохимическим компонентом неспецифического адаптационного синдрома у гидробионтов и служат срочными стресс-редуцирующими факторами, позволяющими корректировать метаболизм при интоксикации.
5. Адаптивная динамика биохимических параметров при интоксикации у рыб может быть выражена слабо из-за частичного замещения (предупреждения) более высокими уровнями адаптации и, прежде всего, поведенческим, сопряженным со способностью свободно передвигаться на значительные расстояния и таким образом избегать локальных загрязнений водоёма.
6. Состав множественных форм ферментов при интоксикации гидробионтов меняется разнообразно, и зависит от типа токсиканта, его концентрации и продолжительности воздействия. Форму кривой биохимической адаптации в целом определяют суммарные ферментативные реакции, тогда как функции каждого из ферментов состоят в специфической коррекции метаболизма посредством активности отдельных множественных форм.
7. Молекулярные формы кислой фосфатазы речной живородки впервые охарактеризованы по электрофоретической подвижности,
334 изоэлектрической точке и субстратной специфичности. Установлено, что в зависимости от большего или меньшего сродства к органическим фосфатам, изученные ферменты могут тормозить или интенсифицировать гликолиз, и, следовательно, обмен углеводов в пищеварительной железе моллюска.
8. В пищеварительной железе речной живородки при интоксикации in vivo происходит индукция одной из форм кислой фосфатазы — КФ 6. Фермент специфичен к фруктозо-6-фосфату (71% активности по отношению к р-нитрофенилфосфату), медленно расщепляет а-глицерофосфат (19% по отношению к р-нитрофенилфосфату) и не действуют ни на один из других природных субстратов, а потому способствует торможению гликолиза и накоплению побочных продуктов метаболизма углеводов (фруктозы, сорбита, глюкозы). Относительная электрофоретическая подвижность КФ б в 5,7%-ном ПААГ составляет 0,21, изоэлектрическая точка равна 7,1.
9. Впервые определено содержание сорбита в пищеварительной железе живородки речной в разные сезоны (осенью — 1,31±0,08, зимой — 155,95±3,85, весной — 1,37±0,07, летом — 0,68±0,06 мкмоль/г ткани) и в острых лабораторных опытах. При содержании моллюсков в холодной воде происходит накопление сорбита (до 508% по отношению к контролю). При интоксикации организма моллюска содержание сорбита увеличивается в разной степени в зависимости от экспозиции (от 117 до 283% по отношению к контролю).
10. Динамика содержания сорбита: в пищеварительной железе живородки речной вызвана изменением активности кислых фосфатаз, сорбитолдегидрогеназы и альдозоредуктазы, которые в зависимости от характера внешнего воздействия, способствуют накоплению сорбита в организме моллюска или его обратному вовлечению- в метаболизм углеводов. Реакция этих ферментов на интоксикацию- организма и воздействие холода различна, в соответствии с чем изменение содержания сорбита в течение острого опыта происходит по-разному: при понижении температуры монотонно нарастает, при интоксикации колеблется, повышаясь относительно контроля и вновь возвращаясь в первоначальному уровню.
11. Кислые фосфатазы пищеварительной железы, речной живородки служат эффекторами для срочной стресс-редуцирующей (адаптивной) регуляции углеводного обмена. Её сущность состоит в модуляции гликолиза (изъятии; промежуточных продуктов углеводного обмена) и индукции, накопления сорбита как устойчивого стресс-редуцирующего фактора (криопротектора, модулятора текучести и проницаемости клеточных мембран), а при исчерпании адаптивного потенциала — вероятного индуктора апоптоза.
12. Изменения активности ферментов, наблюдаемые при интоксикации организма водных животных в остром опыте, могут служить биохимическим показателем загрязнения воды. Этот показатель в отлитие от физико-химических является синергическим, т.е. отражает комплексное
336 воздействие всей взаимозависимой совокупности загрязнения воды и, одновременно характеризуется высокой чувствительностью (на уровне ПДКводн. и ниже) и динамичностью, поскольку первые изменения обнаруживаются уже через несколько часов экспозиции подопытных животных в исследуемой воде.
13. На примере трёх видов молюсков Viviparus vivparus L., Anodonta stagnalis Gmelin, Unio longirostris Rossmaessler показано, что многолетняя изоляция на экологически чистых и в разной степени загрязненных участках водоема приводит к возникновению межпопуляционных различий в суммарной активности кислой фосфатазы, которые сохраняются после вынужденного (искусственного) переселения, а значит, являются следствием генетической изменчивости. Эта изменчивость может количественно характеризовать степень техногенного загрязнения природных вод.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Существование стресса и неспецифической адаптации у животных, значительно отличающихся по уровню организации от млекопитающих (насекомые, моллюски, кольчатые черви), доказать весьма проблематично a priori, поскольку к большинству из них не применима диагностика этого явления по комплексу функциональных маркеров, практикуемая в клинической патологии. Ещё сложнее создать условия для возникновения стресса, такие, чтобы интенсивность воздействия на организм, с одной стороны, превосходила привычную (к которой организм уже адаптирован) и тем самым индуцировала у него закономерную и адекватную ответную реакцию (эустресс), с другой стороны, не была чрезмерной и не вызывала коллапс защитных систем организма с необратимым нарушением гомеостаза (дистресс).
Судя по нашему опыту, наиболее существенным параметром для проведения токсикологических экспериментов является величина ПДК — I концентрация вредных веществ, которая по результатам биологического тестирования не вызывает патологий у ряда тестовых организмов [Методические указания., 1998]. Ориентируясь на эту величину, нам удалось создать сопоставимые условия токсикологических экспериментов с разными по степени токсичности веществами, а также пронаблюдать ответную реакцию на достаточно большом отрезке времени (до 4 суток) и при этом избежать дистресса и слишком интенсивного стресса у подопытных животных, когда стадия сопротивляемости быстро сменяется стадией истощения:
Важнейшим признаком стресс-реакции, а, следовательно, и стресса у различных по уровню организации водных животных при интоксикации на биохимическом уровне является колебательная динамика активности ферментов, достоверно превышающая по амплитуде естественную, наблюдаемую в контроле. Эта динамика универсальна в отношении воздействия разных токсических веществ и стереотипна для множества ферментных систем, не связанных с детоксикацией, и разных видов пресноводных гидробионтов, что позволяет рассматривать её как метаболический фактор неспецифической (срочной) адаптации и использовать для эколого-биохимического мониторинга загрязнений пресных вод. Однако при ближайшем рассмотрении проясняется, что изменения качественного состава множественных форм ферментов, наблюдаемые, как правило, значительно позднее их суммарной ответной реакции, сугубо специфичны и представляют'собой механизм адаптивной настройки метаболизма.
В-частности, для комплекса-кислых фосфатаз нами определена роль регуляторов интенсивности гликолиза и факторов накопления свободных углеводов глюкозы и фруктозы у моллюска живородка речная. Этот стресс-редуцирующий фактор также можно считать неспецифическим, поскольку аналогичная реакция наблюдается в ответ на холодовой стресс,
330 совершенно не схожий с интоксикацией. В тоже время активность сорбитолдегидрогеназы и альдозоредуктазы, сопутствующих превращению свободных углеводов в сорбит и обратно, а также динамика содержания самого сорбита в органах и тканях моллюска специфичны в отношении стресс-индуцирующего воздействия (переохлаждение или интоксикация), а, следовательно, являются факторами устойчивой адаптации. Если же принять за истину предположение, что сорбит у моллюсков действительно может служить защитным метаболитом в условиях токсической нагрузки (косвенные подтверждения тому мы получили в эксперименте с живородкой речной), его повышенное содержание в пищеварительной железе представляет собой структурный след устойчивой адаптации, позволяющий легче переносить повторную интоксикацию.
Таким образом, биохимический механизм стресс-реакции моллюсков на токсическое воздействие состоит в индукции генерализованной колебательной динамики активности ферментов как фактора срочной адаптации, закономерное перераспределение активности между фосфатазами с разной субстратной специфичностью или формировании базы для устойчивой адаптации и, как следствие, генерации устойчивого адаптивного ответа, а именно накопления побочных метаболитов — глюкозы, фруктозы и сорбита и их взаимопревращения с участием соответствующих ферментов. Участие других специфических стресс-редуцирующих факторов в формировании структурного следа,
331 таких как металлотионеины или комплекс цитохромов Р450, также возможно, но их координация с динамикой активности ферментов остаётся не выясненной. Вероятнее всего их индукция связана не с метаболическим, а мембранным или другим биохимическим уровнем адаптации, исследование которых в рамки настоящего исследования не входило.
В тоже время именно метаболический уровень адаптации, в отличие от молекулярного, клеточного, морфо-функционального и тем более популяционно-генетического может позволить с наименьшими техническими трудностями произвести диагностику интоксикации и определить интегральный уровень загрязнения водной среды. Активность ферментов, определённая суммарно или дифференцированно для отдельных множественных форм, — легко выявляемый и весьма информативный симптоматический признак нормального состояния организма, стресса и патологических процессов. Это продемонстрировано нами не только в модельных токсикологических экспериментах с тяжёлыми металлами, но и в опытах со сточной водой неизвестного состава, а также исследованиях в природном водоёме.
Данные примеры послужили нам основой для подготовки патента, который стал логическим итогом развития прикладного аспекта нашего исследования.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Цветков, Илья Леонидович, Москва
1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. В 3-х т. / Пер. с англ. М.: Мир, 1994. Т. 2. 498 с.
2. Алексеев В.А. Основа биоиндикации качества поверхностных вод на уровне организмов. // Водные ресурсы. 1984. Т. 11. №2. С. 107-121.
3. Андреев Н.А., Андерсоне Д.П. Количественные сдвиги изоферментов кислой фосфатазы в крови больных инфарктом миокарда. // Кардиология. 1978. Т. 18. №11. С. 122-124.
4. Березина Н.А. Оценка качества вод р. Которосли и её притоков по составу зообентоса. // Водные ресурсы. 2000. Т. 27. №6. С. 718-727.
5. Биргер П.И. Метаболизм водных беспозвоночных в токсической среде. Киев: Наукова думка, 1979. 190 с.
6. Бочкова А.П., Филиппович Ю.Б., Коничев А.С. Выделение, очистка и свойства кислой дезоксирибонуклеазы грены тутового шелкопряда. // Биохимия. 1982. Т. 47. Вып. 3. С. 489-496.
7. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. JL: Наука, Ленинградское отделение, 1987. 232 с.
8. Введенский Н.Е. Возбуждение, торможение и наркоз (1901). // Избранные произведения. М.: Просвещение, 1951. С. 509-679.
9. Высоцкая Р.У. О влиянии смоляных кислот на активность лизосомальных ферментов в опытах in vivo и in vitro. // В кн.: Экологическая физиология и биохимия рыб. Тез. докл. IV Всесоюз. конфер. Астрахань, 1979. Т. 1. С. 71-72.
10. Высоцкая Р.У., Руоколайнен Т.Р., Сидоров B.C. Изменение активности кислых гидролаз при действии на изолированные лизосомы рыб сульфатного щелока // В кн.: Гидробиология Выгозерского водохранилища. Петрозаводск, 1978. С. 156-165.
11. Высоцкая Р.У., Руоколайнен Т.Р., Чеченков А.В. Изучение активности кислой фосфатазы у молоди лосося при разных условиях выращивания. // В кн.: Биохимия пресноводных рыб Карелии. Петрозаводск, 1980. С. 41-47.
12. Гарбуз Д.Г., Зацепина О.Г., Пржиборо А.А. и др., Исследование механизмов термоустойчивости: эволюция генетических локусов и мутагенез. // Динамика генофондов. Материалы отчетной конференции памяти Ю.П. Алтухова. М.: 2007. С. 118-121.
13. Гаузе Г.Ф. Экологическая приспособляемость. // Успехи соврем, биол. 1941. Т. 14. №2. С. 227-242.
14. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции. М.: Наука, 1997. 624 с.
15. Голиков А.Н., Голиков Н.В. Угнетение и стимуляция как фазы процесса адаптации. // В кн.: Вопросы теории адаптации. Тр. ЗИН АН СССР. 1987. Т. 160. С. 4-12.
16. Горизонтов П.Д. Резистентность и поражение. Вопросы общей патологии. // В кн.: Патологическая физиология экстремальных состояний. М. Медицина, 1973. С. 7-35.
17. Горомосова С.А., Миловидова Н.Ю., Таможняя В.А., Шапиро А.З. Некоторые эколого-биохимические показатели устойчивости моллюсков к загрязнению. //Гидробиол. журн. 1987. Т. 21. №1. С. 61-66.
18. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология: В 3-х т. / Пер. с англ. М.: Мир. 1990. Т. 1. 368 с.
19. Груздев А.И., Сидоров B.C. Регуляция гликолиза изоферментами лактатдегидрогеназы в тканях радужной форели при влиянии абиетиновой кислоты. // В кн.: Физиология и биохимия гидробионтов. Ярославль: Изд-воЯрГУ, 1987. С. 12-18.
20. Довженко Н.В. Роль антиоксидантной системы в выживании моллюска Anadara broughtoni в условиях аноксии. // Scientific Articles. Ecology 2006. Part 1. Bulgaria: A Company of Union of Scientists in Bulgaria, 2006. P. 11-18.
21. Дубинин Н.П. Общая генетика. М.: Наука, 1976. 572 с. Жизнь животных: В 7-и томах / Под ред. В.Е. Соколова. М.: Просвещение, 1983. Т. 2. С. 14-61, 305-312. Т. 4. С. 271.
22. Жукинский В. Н., Оксиюк О. П., Олейник Г. Н., Кошелева С. Н. Критерии комплексной оценки качества поверхностных пресных вод. // ВIкн.: Самоочищение и биоиндикация загрязненных вод. М.: Наука, 1980. С. 57-63.
23. Завадский К.М. Вид и видообразование. Л.: Наука, Ленинградское отделение, 1968. 404 с.
24. Зарубин С.Л., Цветков И.Л., Урванцева Г.А., Шляпникова Н.А. Исследование индуцированной резистентности Daphnia magna Straus к длительному воздействию хлорида хрома. // Тез. докл. конф.
25. Биологические исследования в Ярославском государственна университете» (Ярославль, 29 ноября 1996 г.). Ярославль, 1997. С. 70-71.
26. Зилов Е.А., Стом Д.И. Модельный эксперимент в водной токсикологии. //Гидробиол. журн. 1990. Т. 26. №1. С. 67-71.
27. Зиновьев В. П. Экспресс методы определения качества вод по зообентосу в реках восточной Сибири. // В кн.: Методы биоиндикацик и биотестирования природных вод. Выпуск 1. Л.: Гидрометиздат, 1987. С. 127-135
28. Зуева Н.Н., Далев П.Г., Лазорева Д.Л. Свойства, получение и практическое применение щелочной фофатазы. // Биохимия. 1993. Т. 58. Вып. 7. С. 1009-1023.
29. Каранова М.В. Антифризные свойства низкомолекулярных гликопротеинов из крови полярных рыб. // Биофизика живой клетки. 1994. Т. 6. №1.С. 68-73.
30. Каранова М.В., Байкова Э.Э., Долгачёва Л.П. Молекулярная природа антифризной активности гемолимфы гаммаруса Gammarus lacusris. // Биофизика живой клетки. 1994. Т. 6. №1. С. 74-76.
31. Каранова М.В., Гахова Э.Н. Биохимическая стратегия выживания пресноводного моллюска Limnaea stagnalis при околонулевых температурах. // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2007. Т. 43. №3. С. 258264.
32. Карр Я. Механизмы биологической защиты. М.: Медицина, 1976.108 с.
33. Классификация и номенклатура ферментов. М.: Изд-во иностр. литры, 1962. 198 с.
34. Козловская В.И., Чуйко Г.М., Мензикова О.В., Подгорная В.А. Энзиматический метод определения в воде фосфорорганических пестицидов и их метаболитов. // Биология внутренних вод. Информ. бюлл. СПб.: Наука, Ленинградское отделение. 1996. №100. С. 65-72.
35. Колупаев Е.И. Чувствительность тест-функций как основа для выбора биотестов на токсичность водной среды. // Гидробиол. журн. 1989. Т. 25. №5. С. 52-54.
36. Конарев А.В. Анализ ингибиторов протеиназ из зерна пшеницы методом желатиновых реплик. //Биохимия. 1986. Т. 51. Вып. 2. С. 195-198.
37. Коничев А.С., Попов А.П., Цветков И.Л. Влияние катионов металлов на активность и множественные формы ДНКазы живородки речной {Viviparus viviparus L.). // Труды Центра фундаментальных научных исследований МГОУ. М.: Изд-во МГОУ, 2005. №1. С. 75-78.
38. Коничев А.С., Попов А.П., Цветков И.Л., Филков П.В. Ферменты какбиохимические маркеры загрязнения воды. // Приложение к Вестнику
39. МГОУ. Серия «Естественные науки». География, экология, экономика:344актуальные проблемы науки и образования. М.: Изд-во МГОУ, 2005. С.151-153.
40. Коничев А.С. Физико-химическая и функциональная характеристика множественных форм ферментов насекомых. // Автореф. дисс. . д-ра. биол. наук. М., 1991. 48 с.
41. Конькова А.Ф., Магай И.А., Шехаева О.М. Энергетический гомеостаз и адаптационные возможности человека в экстремальных условиях. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1987. № 4. С. 506-515.
42. Короленко Т.А. Биохимические аспекты лизосомотропизма. Новосибирск: Наука, 1983. 118 с.
43. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа. 1971. 352 с.
44. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа. 1980. 272 с.
45. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.
46. Лизенко Е.И. Липидный состав и липолитические ферменты лизосом. // Успехи совр. биол. 1982. Т. 94. №1. С. 94-110.
47. Линник П.Н., Набиванец Б.И. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. М.: Гидрометеоиздат, 1986. 270 с.
48. Лобашев М.Е., Инге-Вечтомов С.Г. Физиологическая генетика. Л.: Медицина, 1976. 472 с.
49. Лозина-Лозинский Л.К. Адаптации и устойчивость организмов и клеток к низким и сверхнизким температурам. // Очерки по криобиологии. Л.: Наука. Ленинградское отделение, 1972. С. 288.
50. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. / Пер. с англ. М.: Мир, 1982. 272 с.
51. Лукьяненко В.И. Биохимические тесты в ихтиотоксикологии. // В кн.: Теоретические вопросы биотестирования. Волгоград, 1983а. С. 38-45.
52. Лукьяненко В.И. Энзимодиагностика токсикозов рыб. // В кн.: Теоретические вопросы биотестирования. Волгоград, 19836. С. 46-52.
53. Маляревская А.Я. Биохимические механизмы адаптации гидробионтов к токсическим веществам. // Гидробиол. журн. 1985. Т. 21. №3. С. 70-82.
54. Маляревская А.Я., Карасина Ф.М. Влияние азотнокислого свинца на физиолого-биохимические показатели некоторых водных беспозвоночных. //Гидробиол. журн. 1987. Т. 23. №1. С. 79-84.
55. Маляревская А.Я. Обмен веществ у рыб в условиях антропогенного эвтрофирования водоёмов. Киев: Наукова думка, 1979. 254 с.
56. Манихин В.И., Коновалов Г.С. Изучение обмена химическими компонентами между донными отложениями и водой. // В кн.: Опыт иметоды экологического мониторинга. Пущино: Б.И., 1978. С. 277-290.
57. Меерсон Ф.З. Защитные эффекты адаптации и некоторые перспективы развития адаптационной медицины. // Успехи физиол. наук. 1991. Т. 22. №2. С. 52-89.
58. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М.: Медицина, 1984. 272 с.
59. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зообентос и его продукция. Л.: ЗИН АН СССР, 1983. 52 с.
60. Методические указания по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение / Под. ред. О.Ф. Филенко и С.А. Соколовой. М.: Изд-во ВНИРО. 1998. 145 с.
61. Методическое руководство по биотестированию воды РД-118-02-90. М., 1991. С. 5-11.
62. Мецлер Д. Биохимия: Химические реакции в живой клетке. В 3-х томах. / Пер. с англ. М.: Мир, 1980. Т. 2. 606 с.
63. Митин А.В. Спектры изоформ ферментов гемолимфы нимф подёнок при воздействии на них промышленных стоков. // Гидробиол. журн. 1985. Т. 21. №5. С. 84-89.
64. Нахшина Е.П. Тяжёлые металлы в системе «вода-донные отложения» водоёмов (обзор). // Гидробиол. журн. 1985. Т. 21. №2. С. 8090.
65. Немова Н.Н. Внутриклеточные протеиназы в эколого-биохимических адаптациях у рыб. // Автореф. дисс. . д-ра биол. наук. М., 1992. 43 с.
66. Немова Н.Н. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. Петрозаводск: Карел, науч. центр РАН, 1996. 104 с.
67. Немова Н.Н, Крупнова М.Ю., Кяйвяряйнен Е.И., Волков И.В. Влияние токсических факторов на протеолитическую активность в икре и ранних личинках рыб. // Изв. АН. Сер. биол. 1994. Т. 4. С. 528-534.
68. Немова Н.Н., Кяйвяряйнен Е.И., Крупнова М.Ю. Влияние промышленных стоков на активность внутримышечных кальций-зависимых протеиназ ряда пресноводных рыб. // Вопр. ихтиол. 1996. Т. 26. №3. С. 420-422.
69. Немова Н.Н., Сидоров B.C. Влияние некоторых токсических факторов на лизосомальные протеиназы пресноводных рыб. // Гидробиол. журн. 1990. Т. 26. №4. С. 69-73.
70. Неорганическая биохимия: В 2-х томах / Пер. с англ. М.: Мир, 1978. Т. 1.711 с.
71. Оксиюк О. П., Жукинский В. Н. Комплексная экологическая классификация качества поверхностных вод суши. // Гидробиол. журн. 1993. Т. 29. №4. С. 62-76.
72. Оно С. Генетические механизмы прогрессивной эволюции. М.: Наука, 1973. 227 с.
73. Определитель пресноводных беспозвоночных Европейской части СССР. Д.: Гидрометеоиздат, 1977. 512 с.
74. Основы общей промышленной токсикологии (руководство) / Под ред. Н.А. Толоконцева, В.А. Филова. JL: Медицина. Ленинградское отделение, 1976. 303 с.
75. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. Структура и свойства малых белков теплового шока. // Успехи биологической химии. 2003. Т. 43. №1. С. 59-98.
76. Панин Л.Е., Маянская Н.Н. Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1987. 198 с.
77. Пахомова В.М. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений // Цитология. 1995. Т. 37. №1/2. С. 66-91.
78. Покровский А.А., Коровников К.А. К вопросу о функциональном значении изоферментов дегидрогеназ. // В кн.: Проблемы медицинской химии. М.: Медицина, 1973. С. 5-36.
79. Покровский А.А., Крыстев Л.П. Печень, лизосомы и питание. София: Изд-во Болгарской академии наук, 1977. 207 с.
80. Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. М.: Наука, 1976. 382 с.
81. Полевой В.В., Саламатова Т.С. Живое состояние клетки и биология старения. СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2004. 136 с.
82. Попов А.П., Коничев А.С., Цветков И.Л. Влияние токсичныхсоединений техногенного происхождения на активность и множественные349формы кислой ДНКазы живородки речной (Viviparus viviparus L.). // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39. №5. С. 518-523.
83. Попов А.П., Цветков И.Л., Коничев А.С. Биохимическое тестирование токсического загрязнения вод: планирование эксперимента и выбор тест-объекта. // Вестник МГОУ. Серия Естественные науки. 2006. № 4. С. 87-92.
84. Попов А.П., Цветков И. Л., Коничев А.С. Разделение и характеристика дезоксирибонуклеаз гепатопанкреаса живородки речной в норме и при модельной интоксикации in vivo. II Биохимия. 20086. Т. 73. Вып. 8. С. 1161-1167.
85. Райдер К., Тейлор К. Изоферменты. / Пер. с англ. М.: Мир, 1983.106 с.
86. Рублёва И.М., Ромадина Е.С. Методы очистки и анализ сточных вод. Ярославль: Изд-воЯрГУ, 1984. 84 с.
87. Руоколайнен Т.Р., Высоцкая Р.У. Активность лизосомальных ферментов в печени окуня из разных зон Онежского озера. // В кн.: Сравнительная биохимия водных животных. Петрозаводск: Изд-во Карел, науч. центра РАН, 1983. С. 85-95.
88. Руоколайнен Т.Р., Высоцкая Р.У., Крупнова М.Ю. Влияние абиетиновой кислоты на изолированные лизосомы рыб. // В кн.: Экспериментальные исследования влияния загрязнений на водные организмы. Аппатиты, 1979. С. 122-127.
89. Руоколайнен Т.Р., Высоцкая Р.У. Лизосомальные ферменты различных органов радужной форели при хроническом токсикозе, вызванном смоляными кислотами // Тез. докл. II Всесоюзного симп. «Структура и функции лизосом». Новосибирск, 1980. С. 157-158.
90. Руоколайнен Т.Р., Высоцкая Р.У., Сидоров B.C. Влияние смоляных кислот на молекулярную гетерогенность кислой фосфатазы печени форели. // В кн.: Теоретические вопросы биотестирования. Волгоград, 1983. С. 60-64.
91. Руоколайнен Т.Р., Сидоров B.C. Модификация спектра молекулярных форм кислой фосфатазы печени рыб при интоксикации смоляными кислотами. // В кн.: Методы ихтиотоксикологических исследований. Л.: Наука. Ленинградское отделение, 1987. С. 114-116.
92. Рязанов Е.М. Действие противоопухолевых препаратов на лизосомальный аппарат нормальных и опухолевых клеток. // Автореф. дисс. . канд. наук. Л., 1978. 29 с.
93. Селье Г. Неспецифическая резистентность. // Физиологический журнал СССР. 1961. № 3. С. 3-15.
94. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука, 1972. 121 с.
95. Селье Г. Концепция стресса как мы ее представляем в 1976 г. // В кн.: Новое о гормонах и механизме их действия. Киев: Наукова думха, 1977. С. 27-51.
96. Селье Г. Стресс без дистресса. М.: Прогресс, 1979. 122 с.
97. Сёмин В.А., Иголкина Е.Д. Энзимоиндикация загрязнения водных экосистем. // В кн.: Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Л.: Гидрометеоизат, 1983. Т. 6. С. 137-145.
98. Сергиевский С.О. Полиморфизм как универсальная адаптивная стратегия популяций. // Вопросы теории адаптации. Л.: Зоол. Ин-т АН СССР. 1987. С. 41-58.
99. Сидоров B.C. Возможная роль лизосом и пероксисом в механизмах реализации патологического воздействия. // Тезисы докл. научн. конф. биол. Карелии, поев. 250-лет. АН СССР. Петрозаводск, 1974. С. 87-88.
100. Сидоров B.C., Высоцкая Р.У. Природоохранительные аспекты экологической биохимии рыб. // В кн.: Природные ресурсы Карелии, их использование и охрана. Петрозаводск: Карел, филиал АН СССР, 1988. С.132-144.
101. Сидоров B.C. Значение биохимического изучения нормы ипатологии органелл для водной токсикологии. // В кн.: Теоретическиепроблемы водной токсикологии. М.: Наука, 1983. С. 110-120.
102. Сидоров B.C. Эволюционные и экологические аспекты биохимиирыб. Автореф. дисс. . д-ра биол. наук. М., 1986. 56 с.
103. Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. М.: Медицина, 1968. 372 с.
104. Спиро Т.Г. Неорганическая биохимия / Под ред. Эпхгорна Г.М. М.:
105. Мир, 1978. Т. 1. С. 633-644; 656.
106. Таиров М.Т. Рыбоводство и рыболовство. Алма-Ата: Кайнар, 1985.342 с.
107. Тимофеева А.И. Влияние сублетальных концентраций CuS04 на показатели роста радужной форели. // С. науч. трудов ГосНИОРХ. СПб., 2000. Вып. 326. С. 257-265.
108. Тимофеев-Ресовский Н.В., Воронцов Н.Н., Яблоков А.В. Краткий очерк теории эволюции. М. Наука, 1977. 297 с.
109. Тодоров И.Н., Тодоров Т.Н. Стресс, старение и их биохимическая коррекция. М.: Наука, 2003. 479 с.
110. Токин И.Б., Зензеров B.C. К проблеме изучения механизма действия загрязнителей на клеточном и субклеточном уровнях. // В кн.: Проблема изучения действия загрязнителей. Аппатиты, 1977. С. 22-43.
111. Финогенова Н.П., Алимов А.Ф. Оценка степени загрязнения вод по составу донных животных. // В кн.: Методы биологического анализа пресных вод. Л.: Изд-во Зоол. ин-та АН СССР, 1976. С. 95-106.
112. Флеров Б.А. Биотестирование: терминология, задачи, перспективы. // В кн.: Теоретические вопросы биотестирования. Волгоград, 1983. С. 13-20.
113. Флеров Б.А. Экспериментальные исследования фенольного отравления рыб. // В кн.: Влияние фенола на гидробионтов. Л.: Изд-во ЛГУ, 1973. С. 5-18.
114. Хейсин Е.М. Краткий определитель пресноводной фауны. М.: Учпедгиз РСФСР, 1962. 148 с.
115. Хоружая Т.А. Перспективы использования биохимических тест-функций в биомониторинге пресных вод. // Гидробил. журн. 1989. Т. 25. №5. С. 47-52.
116. Хочачка П., Сомеро Д. Стратегия биохимической адаптации. / Пер. с англ. М.: Мир, 1977. 398 с.
117. Цветкова М.А., Цветков И.Л., Коничев А.С. Содержание гликоалкалоидов и состав белков в листьях картофеля при повреждении колорадским жуком. // С.-х. биология. Серия: Биология растений. 2004. №1. С. 97-104.
118. Цветков И.Л., Зарубин С.Л., Урванцева Г.А. Кислая фосфатаза разных внутривидовых форм катушки роговой как индикатор загрязнения вод тяжелыми металлами. / Деп. в ВИНИТИ. 19956. №709-В95 от 15.03.95. 11 с.
119. Цветков И.Л., Зарубин С.Л., Урванцева Г.А., Коничев А.С., Филиппович Ю.Б. Кислая фосфатаза гидробионтов как фермент-индикатор биохимической адаптации к воздействию токсических веществ. //Изв. АН. Сер. биол. 1997. №5. С. 539-545.
120. Цветков И.Л. Изменчивость активности комплекса кислых фосфатаз моллюсков в адаптации организма к среде обитания. // Науч. труды МПГУ им. В.И. Ленина. Серия: естественные науки. М.: Прометей, 1997. С. 7172.
121. Цветков И.Л., Коничев А.С. Стресс-индуцированная динамика сорбита и активности сопутствующих ферментов в пищеварительной железе живородки речной. // Биохимия. 2009. Т. 74. Вып. 11. С. 1548-1554.
122. Цветков И.Л., Коничев А.С. Экологическая биохимия гидробионтов. М.: Изд-во МГОУ, 2006. 104 с.
123. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев А.С. Комплекс кислых фосфатаз живородки речной в норме и при интоксикации ионами кадмия. // Биохимия. 2003. Т. 68. Вып. 12. С. 1648-1656.
124. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев А.С. Способ определения токсического загрязнения сточных и природных пресных вод. / Патент РФ №2308719. // Бюлл. № 29 от 20.10.2007.
125. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев А.С., Урванцева Г.А. Влияние хлорида кадмия на активность фосфатазного комплекса ферментов. // Науч. труды МПГУ. Серия: Естественные науки. М.: Прометей, 1998. С.242-243.
126. Цветков И.Л., Цветкова М.А., Зарубин С.Л., Семерной В.П., Коничев А.С. Оценка качества сточных и природных вод с помощью биохимического показателя — активности кислой фосфатазы пресноводных моллюсков. // Водн. рес. 2006. Т. 33. №1. С. 62-70.
127. Цветков И.Л., Зарубин СЛ., Урванцева Г.А., Коничев А.С., Филиппович Ю.Б. Кислая фосфатаза гидробионтов как фермент-индикатор биохимической адаптации к воздействию токсических веществ. //Изв. АН. Сер. биол. 1997. №5. С. 539-545.
128. Шапиро А.З., Бобкова А.Н. Влияние ядов противообрастающих покрытий на ферменты углеводного обмена некоторых организмов обрастания. // Гидробиол. журн. 1986. Т. 22. №6. С. 79-82.
129. Шапиро А.З., Бобкова А.Н. Изменение активности ферментов гликолиза в тканях балянусов под влиянием некоторых ядов. // Биология моря. Киев, 1979. Вып. 48. С. 75-80.
130. Шилов И.А. Стресс как экологическое явление. // Зоол. журн. 1984. Т. LXIII. №6. С. 805-812.
131. Шнырева М.Г., Цунрун В.Л., Стемалыцук В.Я., Егоров С.Н. Анализ четвертичной структуры секретируемой репрессибельной кислой фосфатазы "дрожжей Saccharomyces cerevisia. II Биохимия. 1992. Т. 57. Вып. 7. С. 1100-1108.
132. Юровицкий Ю.Г., Сидоров B.C. Эколого-биохимический мониторинг и эколого-биохимическое тестирование в районах экологического неблагополучия. //Изв. АН. Сер. биол. 1993. №1. С. 74-82.
133. Allen S.L., Adams J., Rushford C.L. Interspecies relationships in the Paramecium aurelia complez: acid phosphatase variation. // J. Protozool. 1983. Vol. 30.Nol.P. 143-147.
134. Allen S.L., Nerad T.A., Rushford C.L. Comparison of the esterases and acid phosphatases in Paramecium, multimicronucleatum, syngens 1—5, P. jenningsi, P. caudatum, and the P. aurelia complex. // J. Protozool. 1983 a. Vol. 30.Nol.P. 148-154.
135. Allen S.L., Nerad T.A., Rushford C.L. Intraspecies variability in the Paramecium aurelia complex. // J. Protozool. 1983b. V. 30. Nol. P. 131-143.
136. Alnemri E.S., Livingston D.J., Nicholson D.W., Salvesen G., Thornberry N.A., Wong W.W., Yuan J.Y. Human ICE/Ced-3 protease nomenclature. // Cell. 1996. Vol. 87. No2. P. 171.
137. Alves-Araujo C., Pacheco A., Almeida M.J., Spencer-Martins I., Leao C., Sousa M.J. Sugar utilization patterns and respiro-fermentative metabolism in the baker's yeast Torulaspora delbrueckii // Microbiology. 2007. Vol. 153. Iss. 3. P. 898-904.
138. Amaral A.F., Anselmo H., da Cunha R.M., Rodrigues A.S. The connective tissue index of Helix aspersa as a metal biomarker. // Biometals. 2004. Vol. 17. No6. P. 625-629.
139. Amiard J.C., Amiard-Triquet C., Barka S., Pellerin J., Rainbow P.S. Metallothioneins in aquatic invertebrates: Their role in metal detoxification and their use as biomarkers. // Aquat. Toxicol. 2006. Vol. 76. No2. P. 160-202.
140. Au D.W. The application of histo-cytopathological biomarkers in marine pollution monitoring: a review. // Mar. Pollut. Bull. 2004. Vol.48. No 9-10. P. 817-834.
141. Au D.W., Wu R.S.S. A field study on EROD activity and quantitative hepatocytological changes in an immature demersal fish. // Environ. Pollut. 2001. Vol. 115.Nol.P. 23-32.
142. Au D.W., Wu R.S.S., Zhou B.S., Lam P.K.S. Relationship between ultrastructural changes and EROD activities in liver of fish exposed to benzo(a)pyrene. // Environ. Pollut. 1999. Vol. 104. N08. P. 235-247.
143. Avila J.L. The influence of the type of sulphate bond and degree of sulphation of glycosaminoglicans on their interaction with lysosomal enzimes // Biochem. J. 1989. Vol. 171. Nol9. P. 9789-9792.
144. Bard S.M. Multixenobiotic resistance as a cellular defense mechanism in aquatic organisms. // Aquat. Toxicol. 2000. Vol. 48. No4. P. 357-389.
145. Baron D.N. Isoenzymes and their clinical application. // Ann. R. Coll. Surg. Engl. 1965. Vol. 37. No5. P. 263-271.
146. Beattie J.H., Black D.J., Wood A.M., Trayhurn P. Coldinduced expression of the metallothionein-1 gene in brown adipose tissue of rats. // Am. J. Phys." 1996. Vol. 270. P. R971-R977.
147. Bebianno M.J., Cravo A., Miguel C., Morais S., Metallothionein concentrations in a population of Patella aspera: variation with size. // Sci. Total Environ. 2003. Vol. 301. Nol-3. P. 151-161.
148. Bebianno M.J., Geret F., Hoarau P., Serafim M.A., Coelho M.R., Gnassia-Barelli M., Romeo M. Biomarkers in Ruditapes decussatus: a potential bioindicator species. // Biomarkers. 2004. Vol. 9. No4-5. P. 305-330.
149. Bennett V.V., Lee R. Modeling seasonal changes in intracellular freeze-tolerance of fat body cells of the gall fly Eurosta solidaginis (Diptera, Tephritidae). //J. Exp. Biol. 1997. Vol. 200. Part 1. P. 185-192.
150. Bessey O.A., Lowry O.H., Broock M.J. A method for the rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic millimeters of serum. // J. Biol. Chem. 1946. Vol. 164, No4. P. 321-329.
151. Binelli A, Ricciardi F, Riva C, Provini A. Integrated use of biomarkers and bioaccumulation data in Zebra mussel (Dreissena polymorpha) for site-specific quality assessment. // Biomarkers. 2006. Vol. 11. No5. P. 428-448.
152. Blaise C., Gagne F., Pellerin J., Hansen P.D., Trottier S. Molluscan shellfish biomarker study of the Quebec, Canada, Saguenay Fjord with the soft-shell clam, Mya arenaria. // Environ. Toxicol. 2002. Vol. 17. No3. P. 170-186.
153. Block W. Water or ice? — the challenge for invertebrate cold survival // Sci. Prog. 2003. Vol. 86. Part 1-2. P. 77-101.
154. Bocchetti R, Regoli F. Seasonal variability of oxidative biomarkers, lysosomal parameters, metallothioneins and peroxisomal enzymes in the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis from Adriatic Sea. // Chemosphere. 2006. Vol. 65. No6. P. 913-921.
155. Boyd J.B. Characterization of acid deoxyribonuclease from the larval salivary glad of Drosophila Pujdei. II Biochim. Biophys. Acta. 1970. Vol. 209. No2. P. 349-356.
156. Bonacci S., Browne M.A., Dissanayake A., Hagger J.A., Corsi I., Focardi
157. S., Galloway T.S. Esterase activities in the bivalve mollusc Adamussium361colbecki as a biomarker for pollution monitoring in the Antarctic marine environment. // Mar. Pollut. Bull. 2004. Vol. 49. No5-6. P. 445-455.
158. Borner C., Monney L. Apoptosis without caspases: an inefficient molecular guillotine? // Cell Death and Differentiation. 1999. Vol. 6. P. 497507.
159. Bozzola J.J., Russell L.D. Electron Microscopy. London: Jones and Bartlett Publishers, 1992. 256 p.
160. Bradford M. Rapid and sensitive method for quantitation the principle of protein-dye binding/ // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. No2. P. 248-254.
161. Braunbeck Т., Storch V., Bresch H. Species-specific reaction of liver ultrastructure in zebrafish {Brachydanio rerio) and trout (Salmo gairdneri) after prolonged exposure to 4-chloroaniline. // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1990. Vol. 19. P. 405-418.
162. Broeg K., Kohler A., Westernhagen H.V. Disorder and recovery of environmental health monitored by means of lysosomal stability in liver of European flounder Platichthys flesus L. // Mar. Environ. Res. 2002. Vol. 54. P. 569-573.
163. Brown H.D., Patel A.B., Chattopadhyay S.K., Pennington S.N. Support matrices for apyrase. // Enzymologia. 1968. Vol. 35. No4. P. 233-238.
164. Brown R.J., Galloway T.S., Lowe D., Browne M.A., Dissanayake A., Jones M.B., Depledge M.H. Differential sensitivity of three marine invertebrates to copper assessed using multiple biomarkers. // Aquat. Toxicol. 2004. Vol. 66. No3. P. 267-278.
165. Buckland-Nicks J., Tompkins G. Paraspermatogenesis in Ceratostoma foliatum (Neogastropoda): confirmation of programmed nuclear death. // J. Exp.
166. Zoolog. А Сотр. Exp. Biol. 2005. Vol. 303. No9. P. 723-741.
167. Cajaraville M.P., Orbea A., Marigomez I., Cancio I. Peroxisomeproliferation in the digestive epithelium of mussels exposed to the wateraccommodated fraction of three oils. // Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol.
168. Pharmacol. 1997. Vol. 117. No4. P. 233-242.
169. Cajaraville M.P., Uranga J.A., Angulo E. Light microscopic catalase histochemistry in mussel digestive gland tissue. // Histol. Histopathol. 1993. Vol. 8. P. 537-546.
170. Calderon S., Holmstrup M., Westh P., Overgaard J. Dual roles of glucose in the freeze-tolerant earthworm Dendrobaena octaedra: cryoprotection and fuel for metabolism. // J. Exp. Biol. 2009. Vol. 212. Part 6. P. 859-866.
171. Cashikar A.G., Kumaresan R., Rao N.M. Biochemical characterization and subcellular localization of the red kidney bean purple acid phosphatase. // Plant Physiol. 1997. Vol. 114. No3. P. 907-915.
172. Chaimovich H., Nome F. The acid phosphatase from bovine cerebrum: purification and characterization. // Arch. Biochem. Biophys. 1970. Vol. 139. Nol.P. 9-13.
173. Cheeseman M.T. Characterization of apyrase activity from the salivary glands of the cat flea Ctenocephalides felis. // Insect. Biochem. Mol. Biol. 1998. Vol. 28. Nol2. P. 1025-1030.
174. Cheung V.V., Wedderburn R.J., Depledge M.H. Molluscan lysosomal responses as a diagnostic tool for the detection of a pollution gradient in Tolo Harbour, Hong Kong. // Mar. Environ. Res. 1998. Vol. 46. No2. P. 237-241.
175. Chinnaiyan A.M., Dixit V.M. The cell death machine. // Curr. Biol. 1996. Vol. 6. No5. P. 555-562.
176. Churchill T.A., Storey K.B. Freezing survival of the garter snake Thamnoplus sirtalisparietalis. II Can. J. Zool. 1992. Vol. 70. Nol. P. 99-105.
177. Churchill T.A., Storey K.B. Metabolic responses to freezing and anoxia by the periwinkle Littorina littorea. // J. Therm. Biol. 1996. Vol. 21. Nol. P. 5763.
178. Ciocan C.M., Rotchell J.M. Cadmium induction of metallothionein isoforms in juvenile and adult mussel (Mytilus edulis). // Environ. Sci. Technol. 2004. Vol. 38. No4. P. 1073-1078.
179. Clark M.S., Worland M.R. How insects survive the cold: molecular mechanisms-a review. // J. Сотр. Physiol. B. 2008. Vol. 178. No8. P. 917-933.
180. Collins C.A., Wells W.W. Identification of phosphatidylinositolkinase in rat liver lysosomal membranes // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 288. No4. P. 827831.
181. Collins C.A., Wells W.W. Characterisation of endogenous protein phosphorilatin in isolated rat liver lysosomes // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257. No2. P. 2130-2143.
182. Contardo-Jara V., Krueger A., Exner H.J., Wiegand C. Biotransformation and antioxidant enzymes of Dreissena polymorpha for detection of site impact in watercourses of Berlin. // J. Environ. Monit. 2009. Vol. 11. No6. P. 1147— 1156.
183. Cook G. Lysosomes and adaptation // Lysosomes in Biology and Patology / In ed. J. Dungle, H. Fell. Amsterdam, North Holland, 1973. Vol. 111. P. 7389.
184. Cziko P.A., Evans C.W., Cheng C.H., De Vries A.L. Freezing resistance of antifreeze-deficient larval Antarctic fish. // J. Exp. Biol. 2006. Vol. 209. Part 3. P. 407-420.
185. Dallinger R., Chabicovsky M., Berger B. Isoform-specific quantification of metallothionein in the terrestrial gastropod Helix pomatia. I. Molecular, biochemical, and methodical background. // Environ. Toxicol. Chem. 2004. Vol. 23. No4. P. 890-901.
186. Damiens G, Gnassia-Barelli M, Loques F, Romeo M, Salbert V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. // Chemosphere. 2007. Vol. 66. No3. P. 574-583.
187. Damiens G., His E., Gnassia-Barelli M., Quiniou F., Romeo M. Evaluation of biomarkers in oyster larvae in natural and polluted conditions. // Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2004. Vol. 138. No2. P. 121128.
188. Davis B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1964. Vol. 121. No3. P. 404-408.
189. Davis J.C., Averill B.A. Evidence for a spin-coupled binuclear iron unit at the active site of the purple acid phosphatase from beef spleen. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA Biol. Sci. 1982. Vol. 79. Nol5. P. 4623-4627.
190. De Duve C. Lysosomal revisited // Eur. J. Biochem. 1983. Vol. 137. No4. P. 391-397.
191. De Jonceere J.F., Dierickx PJ. Determination of acid phosphatase and leucine amino peptidase activity as an identification method for pathogenic Naegleria fowleri. II Trans. Roy. Soc. Trop. Med. and Hyd. 1982. Vol. 76. No6. P. 773-775.
192. Desoize В., Veiler V., Pourny С., Сотое L., Jardillier J.C. Isoenzymes of alkaline and acid phosphatases as bones metastasis marker in breast cancer patients. // Anticancer. Res. 1989. Vol. 9. No4. P. 1105-1109.
193. De Wolf M., Hilderson H.J., Lagrou A., Dierich W. Phospholipase A from bovine thireoid lisosomes // Arch. Intern. Physiol. Biochem. 1977. Vol. 35. No5. P. 969-971.
194. Dolcetti L., Zuanna L.D., Venier P. DNA adducts in mussels and fish exposed to bulky genotoxic compounds. // Mar. Environ. Res. 2002. Vol. 54. No3-5. P. 481-486.
195. Domenech C.E. Lisa T.A., Salmano M.A., Garrido M.N. Pseudomonas aeruginosa acid phosphatase. Activation by divalent cations and inhibition by aluminium ion. // FEBS Lett. 1992. Vol. 299. Nol. P. 96-98.
196. Dondero F., Piacentini L., Banni M., Rebelo M., Burlando В., Viarengo A. Quantitative PCR analysis of two molluscan metallothionein genes unveils differential expression and regulation. // Gene. 2005. Vol. 345. No2. P. 259270.
197. Driedzic W.R., Ewart K.V. Control of glycerol production by rainbow smelt (Osmerus mordax) to provide freeze resistance and allow foraging at low winter temperatures // Сотр. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 2004. V. 139. No3. P. 347-357.
198. Ellis R.E., Yuan J., Horvitz H.R. Mechanisms and functions of cell death. // Ann. Rev. Cell. Biol. 1991. Vol. 7. P. 663-698.
199. English Т.Е., Storey K.B. Freezing and anoxia stresses induce expressionof metallothionein in the foot muscle and hepatopancreas of the marine369gastropod Littorina littorea 11 J. Exp. Biol. 2003. Vol. 206. Part. 14. P. 2517— 2524.
200. Ericson G., Skarphedinsdottir H., Zuanna L.D., Svavarsson J. DNA adducts as indicators of genotoxic exposure in indigenous and transplanted mussels, Mytilus edulis L. from Icelandic coastal sites. // Mutat. Res. 2002. Vol. 516. No 1-2. P. 91-99.
201. Francis J.M., Moss D.W., Collinet E., Calam D.H., Bullock D.J. A reference preparation of human prostatic acid phosphatase: purification, characterisation and field trials. // Ann. Clin. Biochem. 1992. Vol. 29. No2. P. 176-183.
202. Frenette G., Thabet M., Sullivan R. Polyol pathway in human epididymis and semen // J. Androl. 2006. Vol. 27. No 2. P. 233-239.
203. Galka M., Dziembor-Gruszlciewicz E., Kos S., Ostrowski W. Properties of low-moleculair-weight acid phosphatases isolated from cytosol and chromatin of rat liver. // Acta Biochem. Pol. 1980. Vol. 27. No3-4. P. 281-293.
204. Galloway T.S., Brown R.J., Browne M.A., Dissanayake A., Lowe D., Jones M.B., Depledge M.H. A multibiomarker approach to environmental assessment. //Environ. Sci. Technol. 2004. Vol. 38. No6. P. 1723-1731.
205. Geffard A., Amiard J.C., Amiard-Triquet C. Use of metallothionein in gills from oysters (Crassostrea gigas) as a biomarker: seasonal and intersite fluctuations. //Biomarkers. 2002. Vol. 7. No2. P. 123-137.
206. Gellatly K.S., Moorhead G., Duff S., Lefebvre D.D., Plaxton W.C. Purification and Characterization of a Potato Tuber Acid Phosphatase Having Significant Phosphotyrosine Phosphatase Activity. // Plant. Physiol. 1994. Vol. IO6.N0I.P. 223-232.
207. Geret F., Cosson R.P. Induction of specific isoforms of metallothionein in mussel tissues after exposure to cadmium or mercury. // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2002. Vol. 42. Nol. P. 36-42.
208. Gibson G., Lake B. Peroxisomes: Biology and Importance in Toxicology and Medicine. London: Taylor & Francis, 1993. 238 p.
209. Goldberg A.F., Takakura K., Rosenthal R.L. Electrophoretic separation of serum acid phosphatase isoenzymes in Gaucher's disease, prostatic carcinoma and multiple myeloma. //Nature. 1966. Vol. 211. No5044. P. 41-43.
210. Gorbi S., Regoli F. Total oxyradical scavenging capacity as an index of susceptibility to oxidative stress in marine organisms. // Comments Toxicol. 2003. Vol. 9. P. 303-322.
211. Ghosh R., Sen P.C., Biswas S. Mimosa pudica apyrase requires polysaccharide and Ca for the activity. // Mol. Cell. Biochem. 1998. Vol. 187. No 1-2. P. 47-55.
212. Gravato C., Oliveira M., Santos M.A. Oxidative stress and genotoxic responses to resin acids in Mediterranean mussels. // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2005. Vol. 61. No2. P. 221-229.
213. Hamer В., Hamer D.P., Muller W.E., Batel R. Stress-70 proteins in marine mussel Mytilus galloprovincialis as biomarkers of environmental pollution: a field study. // Environ. Int. 2004. Vol. 30. No7. P. 873-882.
214. Handa M., Guidotti G. Purification and cloning of a soluble ATP-diphosphohydrolase (apyrase) from potato tubers {Solarium tuberosum). II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 218. No3. P. 916-923.
215. Heinonen J.K., Lahti R.A. A new and convenient colorimetric determination to the assay of inorganic pyrophosphatase. // Anal. Biochem. 1981. Vol. 113. No2. P. 313-317.
216. Heinrikson R.L. The acid phosphatase from bovine liver // J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244. No3. P. 299-310.
217. Hermes-Lima M., Storey K.B. Antioxidant defenses and metabolic depression in a pulmonate land snail. // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 268. No6. Part 2. P. R1386-R1393.
218. Hofmann G., Somero G. Evidence for protein damage at environmental temperatures: seasonal changes in levels of ubiquitin conjugates and hsp70 in the intertidal mussel Mytilus trossulus. II J. Exp. Biol. 1995. Vol. 198. Part. 7. P. 1509-1518.
219. Holmstrup M., Costanzo J.P., Lee Jr.R.E. Crioprotective and osmotic responses to cold acclimation and freezing in freeze-tolerant earthworms. // J. Сотр. Physiol. 1999. Vol. 169B. No2. P. 207-214.
220. Holmstrup M., S0rensen L.I., Bindesb0l A.M., Hedlund K. Cold acclimation and lipid composition in the earthworm Dendrobaena octaedra. 11
221. Сотр. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 2007. Vol. 147. No4. P. 911919.
222. Jing G., Xie L.-P., Li L.Y., Zhang R.-Q. Purification and partial characterization of two acid phosphatase forms from pearl oyster {Pinctada fucatd). II Сотр. Biochem. and Physiol. 1996. Vol. 32. No6. P. 10134-10146.
223. Kelly B.M., Waheed A., Van Etten R., Chang P.L. Heterogeneity of lysosomes in human fibroblasts. // Mol. Cell. Biochem. 1989. Vol. 87. No2. P. 171-183.
224. Keough D.T., Beck J.L., Jersey J., Zerner B. Iron-containing acid phosphatases: interaction of phosphate with the enzyme from allantoic fluid. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1982. Vol. 108. No4. P. 1643-1648.
225. Kerr J.F.R. Shrinkage necrosis: a distinct mode of cellular death. // J. Pathol. 1971. Vol. 105. Nol. P. 13-20.
226. Kim E.Y., Hahn M.E. cDNA cloning and characterization of an aryl hydrocarbon receptor from the harbor seal (Phoca vitulina): a biomarker of dioxin susceptibility? //Aquat. Toxicol. 2002. Vol. 58. Nol-2. P. 57-73.
227. Kohler A., Wahl E., Soffker K. Functional and Morphological changes of lysosomes as prognostic biomarkers of toxic liver injury in a marine flatfishсPlatichthys flesus (L.)). // Environ. Toxicol. Chem. 2002. Vol.21. Noll. P. 2434-2444.
228. Komoszynski M., Wojtczak A. Apyrases (ATP diphosphohydrolases, EC 3.6.1.5): function and relationship to ATPases. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1310. No2. P. 233-241.
229. Krishnakumar P.K., Casillas E., Varanasi U. Cytochemical responses in the digestive tissue of Mytilus edulis complex exposed to microencapsulated PAHs or PCBs. // Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 1997. Vol. II8.N0I.P. 11-18.
230. Kroemer G., Zamzami N., Susin S. Mitochondrial control of apoptosis. // Immunol. Today. 1997. Vol. 18. No 1. P. 44-51.
231. Kunitz M. Cristalline soybean tripsin inhibitor. General properties. // J. Gen. Physiol. 1947. Vol. 30. P. 318-326.
232. C.J., Jam L.T., Lam K.W. Acid phosphatase isoenzymes in human leukocytes in normal and pathologic conditions. // J. Histochem. Cytochem. 1970. Vol. 18. No7. P. 437-481.
233. Mans B.J., Gaspar A.R., Louw A.I., Neitz A.W. Apyrase activity and platelet aggregation inhibitors in the tick Ornithodoros savignyi (Acari: Argasidae). 11 Exp. Appl. Acarol. 1998. Vol. 22. No6. P. 353-366.
234. Marigomez I., Orbea A., Olabarrieta I., Etxeberria M., Cajaraville M.P.
235. Structural changes in the digestive lysosomal system of sentinel mussels asbiomarkers of environmental stress in musselwatch programmes. // Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 1996. Vol. 113. No3. P. 291-297.
236. Marshall CB, Fletcher GL, Davies PL. Hyperactive antifreeze protein in a fish. //Nature. 2004. Vol. 429. No6988. P. 153.
237. Martin-Diaz M.L., Blasco J., Sales D., Delvalls T.A. Biomarkers study for sediment quality assessment in spanish ports using the crab Carcinus maenas and the clam Ruditapesphilippinarum. II Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2007. Vol. 53. Nol. P. 66-76.
238. Matsumoto Т., Sugiyama Y., Deguchi К., Okano K. An ADPase-like substance in placental extracts. // Asia Oceania J. Obstet. Gynaecol. 1990. Vol. 16. No3. P. 267-274.
239. Maunsbach A. Lysosomes and adaptation // Lysosomes in Biology and Patology / In ed. J. Dangle, H.B. Fell. Amsterdam. North Holland, 1966. Vol. 1. P. 115-127.
240. Methoden der Enzymatischen Analyse / Herausgegeben von H.U. (Bergmeyer). Berlin: Academie-Verlag, 1970. Bd 2. P. 1292-1299.
241. Micic M., Bihari N., Jaksic Z., Muller W.E., Batel R. DNA damage and apoptosis in the mussel Mytilus galloprovincialis. // Mar. Environ. Res. 2002. Vol. 53. No3. P. 243-262.
242. Minn A.J., Velez P., Schendel S.L., Liang H., Muchmore S.W., Fesik S.W., Fill M., Thompson C.B. Bcl-XL forms an ion channel in synthetic lipid membranes. //Nature. 1997. Vol. 385. No6614. P. 353-357.
243. Mitchelmore C.L., Birmelin C., Livingstone D.R., Chipman J.K. Detection of DNA strand breaks in isolated mussel (Mytilus edulis L.) digestive gland cells using the "Comet" assay. // Ecotoxicol. Environ. Saf. 1998. Vol. 41. Nol.P. 51-58.
244. Moalem S., Storey K.B., Percy M.E., Peros M.C., Perl D.P. The sweet thing about Type 1 diabetes: a cryoprotective evolutionary adaptation // Med. Hypotheses. 2005. Vol. 65. No 1. P. 8-16.
245. Moody D.E. Peroxisome proliferation: an overview. // In: Moody, D.E. (Ed.), Peroxisome Proliferator: Unique Inducers of Drug-Metabolizing Enzyme. CRC Press, Boca Raton, FL. 1994. P. 1-15.
246. Moore M.N. Biomarkers of contaminant exposure and effect: a way forward in marine environmental toxicology. // Sci. Total Environ. 1993 (Suppl.)P. 1335-1343.
247. Moore M.N., Icarus Allen I.J., McVeigh A. Environmental prognostics: An integrated model supporting lysosomal stress responses as predictive biomarkers of animal health status. // Mar. Environ. Res. 2006. Vol. 61. No3. P. 278-304.
248. Moore M.N. Lysosomal cytochemistry in marine environmental monitoring. //Histochem. J. 1990. Vol. 22. No2. P. 187-191.
249. Mortimore G.E., Poso A.R. Lysosomal pathways in hepatic protein degradation: regulatory role of amino acid // Fed. Proc. 1980. Vol.43. No5. P. 1289-1295.
250. Mrsa V., Barbaric S., Ries В., Mildner P. Comparative studies of natural and carbohydratedeplet yeast acid phosphatase. // Biochem. Soc. Trans. 1981. Vol. 9. No2. P. 144-152.
251. Murphy D.J. Freezing resistance in intertidal invertebrates. // Annu. Rev. Physiol. 1983. Vol. 45. P. 289-299.
252. Niyogi S., Biswas S., Sarker S., Datta A.G. Seasonal variation of antioxidant and biotransformation enzymes in barnacle, Balanus balanoides, and their relation with polyaromatic hydrocarbons. // Mar. Environ. Res. 2001b. Vol. 52. Nol.P. 13-26.
253. Nasci C., Da Ros L., Campesan G., Van Vleet E.S., Salizzato M., Sperni L., Pavoni B. Clam transplantation and stressrelated biomarkers as useful tools for assessing water quality in coastal environments.,// Mar. Pollut. Bull. 1999. Vol. 39. P. 255-260.
254. Nicholson S. Cytological and physiological biomarker responses from green mussels, Perna viridis transplanted to contaminated sites in Hong Kong coastal waters. // Mar. Pollut. Bull. 1999a. Vol. 39. P. 261-268.
255. Nicholson S. Cardiac and lysosomal responses to periodic copper in the mussel Perna viridis. // Mar. Pollut. Bull. 1999b. Vol. 38. P. 1157-1162.
256. Nishimoto M., Varanasi U. Benzoa.pyrene metabolism and DNA adduct formation mediated by English sole liver enzymes. // Biochem. Pharmacol. 1985. Vol. 34. No2. P. 263-268.
257. Niyogi S., Biswas S., Sarker S., Datta A.G. Seasonal variation ofantioxidant and biotransformation enzymes in barnacle, Balanus balanoides, andtheir relation with polyaromatic hydrocarbons. I I Mar. Environ. Res. 2001b.1. Vol. 52. Nol. P. 13-26.
258. O'Brien M.M., Schofield P.J., Edwards M.R. Polyol-pathway enzymes ofhuman brain. Partial purification and properties of sorbitol dehydrogenase. //
259. Biochem. J. 1983. Vol. 211. Nol. P. 81-90.
260. Ohkubo I., Kondo Т., Taniguchi N. Purification ofnucleosidediphosphatase of rat liver by metal-chelate affinity chromatography.
261. Biochim. Biophys. Acta. 1980. Vol. 616. Nol. P. 89-93.
262. Olive P.L. DNA precipitation assay: a rapid and simple method fordetecting DNA damage in mammalian cells. // Environ Molec. Mutagen. 1988.1. Vol. 11. No3. P. 487-495.
263. Orbea A., Cajaraville M.P. Field validation of peroxisome proliferation inmussels as biomarker of organic pollution: a transplant experiment. // In: 11th
264. Annual Meeting of SETACEurope, 6-10 May 2001, Madrid, Spain. 2001. P. 73.
265. Orbea A., Marigomez I., Fernandez C., Tarazona J.V., Cancio 'I.,
266. Cajaraville M.P. Structure of peroxisomes and activity of the marker enzymecatalase in digestive epithelial cells in relation to PAH content of mussels fromtwo basque estuaries (Bay of Biscay): seasonal and site-specific variations. //
267. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1999. Vol. 36. P. 158-166.
268. Overgaard J., Tollarova M., Hedlund K., Petersen S.O., Holmstrup M.
269. Seasonal changes in lipid composition and glycogen storage associated with384freeze-tolerance of the earthworm, Dendrobaena octaedra. II J. Сотр. Physiol.
270. B. 2009 Vol. 179. No5. P. 569-577.
271. Pain S., Parrant M. Response of multixenobiotic defense mechanism in
272. Dreissena polymorpha exposed to environmental stress. // Chemosphere. 2003.
273. Vol. 52. No7. P. 1105-1113.
274. Pampanin D.M., Marangon I., Volpato E., Campesan G., Nasci C. Stressbiomarkers and alkali-labile phosphate level in mussels {Mytilusgalloprovincialis) collected in the urban area of Venice (Venice Lagoon, Italy).
275. Environ. Pollut. 2005. Vol. 136. Nol. P. 103-107.
276. Pan K., Wang W.X. The subcellular fate of cadmium and zinc in thescallop Chlamys nobilis during waterborne and dietary metal exposure. // Aquat.
277. Toxicol. 2008. Vol. 90. No4. P. 253-260.
278. Parant M., Pain S. Potential use of multixenobiotic defense mechanism
279. MXDM) in Dreissena polymorpha as a biomarker for the monitoring offreshwater pollution. // Water Res. 2001. Vol. 35. No 15. P. 3743-3748.
280. Pearson J.D., Carleton J.S., Gordon J.L. Metabolism of adeninenucleotides by ectoenzymes of vascular endothelial and smooth-muscle cells inculture. // Biochem. J. 1980. Vol. 190. No2. P. 421-429.
281. Pena-Llopis S., Ferrando M.D., Pena J.B. Impaired glutathione redoxstatus is associated with decreased survival in two organophosphate-poisonedmarine bivalves. // Chemosphere. 2002. Vol. 47. No5. P. 485-497.
282. Petrovic S., Semencic L., Ozretic В., Ozretic M. Seasonal variations of physiological and cellular biomarkers and their use in the biomonitoring of north Adriatic coastal waters (Croatia). // Mar. Pollut. Bull. 2004. Vol. 49. No9-10. P. 713-720.
283. Pfeifer C.J., Cho C.H., Cheema A., Salman D. Reserpine induced gastric ulcers: petection by lysosomal stabilisation due to zine // Eur. J. Pharmacol. 1980. Vol. 61. No4. P. 347-354.
284. Pieber M., Valenzuela M.A., Kettlun A.M., Mancilla M., Aranda E., Collados L., Traverso-Cori A. ATPase-ADPase activities of rat placental tissue. // Сотр. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 1991. Vol. 100. No2. P. 281-285.
285. Pissing J., Johnsen A.H., Sensalaugh G.f. Human red cell acid phosphatase (ACP 1). The amino acid sequence of the two isosimes Bf and Bs encoded by the ACP 1* В allele. // J. Biol. Chem. 1991. Vol.266. No31. P. 20619-20625.
286. Ploch S.A., King L.C., Kohan M.J., Di Giulio R.T. Comparative in vitro and in vivo benzoa.pyrene-DNA adduct formation and its relationship to CYP1A activity in two species of ictalurid catfish. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1998. Vol. 149. Nol. P. 90-98.
287. Press By M.C., Lee J.A. Acid phosphatase activity in Sphagnum species in relation to phosphate nutrition. // New Phytol. 1983. Vol. 93. No4. P. 567573.
288. Pruski A.M., Dixon D.R. Effects of cadmium on nuclear integrity and DNA repair efficiency in the gill cells of Mytilus edulis L. // Aquat. Toxicol. 2002. Vol. 57. No3. P. 127-137.
289. Puff S.M., Plaxton W.C., Lefebre D.D. Phosphate-starvation response in plant cell: de novo sinphesis and degradation of acid phosphatases. // Proc. Nat. Acad. Sci USA. 1991. Vol. 88. No21. P. 9538-9542.
290. Ramadan A.A., Yousif W.B., Ali A.M. The effect of methotrexate on the small intestine of the mouse IV. The Golgi apparatus, phosphatases and esterases // Funct. and Dev. Morfol. 1992. Vol. 2. No2. P. 111-112.
291. Rassel W., Khorama H. Studies on polynucleotides. X. Enzyme degradation. Some properties and mode of action of spleen phosphodiesterase. // J. Biol. Chem. 1961. Vol. 236. No4. P. 1144.
292. Reddy J.K., Mannaerts G.P. Peroxisomal lipid metabolism. // Ann. Rev. Nutr. 1994. Vol. 14. P. 343-370.
293. Regoli F. Total oxyradical scavenging capacity (TOSC) in polluted and translocated mussels: a predictive biomarker of oxidative stress. // Aquat. Toxicol. 2000. Vol. 50. No4. P. 351-361.
294. Regoli F., Winston G.W. Quantification of total oxidant scavenging capacity (TOSC) of antioxidants for peroxynitrite, peroxyl radicals and hydroxyl radicals. //Toxicol. Appl. Pharmacol. 1999. Vol. 156. No2. P. 96-105.
295. Rocha J.B., Battastini A.M., Sarkis J.J., Dias R.D. Effects of undernutrition during suckling on ATP and ADP hydrolysis by synaptosomes from the cerebral cortex of adult rats. // Braz. J. Med. Biol. Res. 1991. Vol. 24. No5. P. 515-526.
296. Rushmore Т.Н., Kong A.-N.T. Pharmacogenomics, regulation and signaling pathways of phase I and II drug metabolizing enzymes. // Current Drug Metabolism. 2002. Vol. 3. No5. P. 481^89.
297. Sarkis J.J., Salto C. Characterization of a synaptosomal ATP diphosphohydrolase from the electric organ of Torpedo marmorata. II Brain. Res. Bull. 1991. Vol. 26. No6. P. 871-876.
298. Schendel S.L., Xie Z.H., Montal M.O., Matsuyama S., Montal M., Reed J.C. Channel formation by antiapoptotic protein Bcl-2. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. NolO. P. 5113-5118.
299. Schetinger M.R., Vieira V.L., Morsch V.M., Balz D. ATP and ADP hydrolysis in fish, chicken and rat synaptosomes. // Сотр. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 200L Vol. 128. No4. P. 731-741.
300. Scheuhammer A.M., Cherian, M.G. Quantification of metallothioneins by a silver-saturation method. I I Toxicol. Appl. Pharmacol. 1986. Vol. 82. No3. P. 417^25.
301. Schlesinger P.H., Gross A., Yin X.M., Yamamoto K., Saito M., Waksman
302. Gand Korsmeyer SJ. Comparison of the ion channel characteristics ofproapoptotic Bax and antiapoptotic Bcl-2. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997.
303. Vol. 94.No21.P. 11357-11362.
304. Serafim A., Bebianno M.J. Metallothionein role in the kinetic model ofcopper accumulation and elimination in the clam Ruditapes decussatus. II
305. Environ Res. 2009. Vol. 109. No4. P. 390-399.
306. Serafim M.A., Bebianno M.J. Variation of metallothionein • and metalconcentrations in the digestive gland of the clam Ruditapes decussatus: sex andseasonal effects. // Environ. Toxicol. Chem. 2001. Vol. 20. No3. P. 544-552.
307. Shaw J.P., Large A.T., Chipman J.K., Livingstone D.R., Peters L.D.
308. Seasonal variation in mussel Mytiius edulis digestive gland cytochrome P4501Aand 2E-immunoidentified protein levels and DNA strand breaks (Comet assay).
309. Mar. Environ. Res. 2000. Vol. 50. Nol-5. P. 405-409.
310. Shaw J.P., Large A.T., Livingstone D.R., Doyotte A., Renger J., Chipman
311. J.K., Peters L.D. Elevation of cytochrome P450-immunopositive protein and
312. DNA damage in mussels {Mytiius edulis) transplanted to a contaminated site. //
313. Mar. Environ. Res. 2002. Vol. 54. No3-5. P. 505-509.
314. Skarpheinsdottir H., Ericson G., Dalla Zuanna L., Gilek M. Tissuedifferences, dose-response relationship and persistence of DNA adducts in blue390mussels {Mytilus edulis L) exposed to benzoa.pyrene. // Aquat. Toxicol. 2003. Vol. 62. No2. P. 165-177.
315. Slee E.A., Harte M.T., Kluck R.M., Wolf B.B., Casiano C.A., Newmeyer D.D., Wang H.-G., Reed J.C., Nicholson D.W., Alnemri E.S., Green D.R.,
316. Martin S.J. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchicaliactivation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner // J. Cell Biol. 1999. Vol. 144. No2. P. 281-292.
317. Slotsbo S., Maraldo K., Malmendal A., Nielsen N.C., Holmstrup M. Freeze tolerance and accumulation of cryoprotectants in the enchytraeid Enchytraeus albidus (Oligochaeta) from Greenland and Europe. // Cryobiology. 2008. Vol. 57. No3. P. 286-291.
318. Smital Т., Kurelec B. Inhibitors of the multixenobiotic resistance mechanism in natural waters: in vivo demonstration of their effects. // Environ. Toxicol. Chem. 1997. Vol. 16. Issue 10. P. 2164-2170.
319. Srinivasula S.M., Ahmad M., Fernandes-Alnemri Т., Alnemri E.S. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-l-mediated oligomerization. // Mol. Cell. 1998. Vol. 1. No7. P. 949-957.
320. Storey K.B., Churchill T.A. Metabolic responses to anoxia and freezing by the freeze-tolerant marine mussel Geucensia demissus. // J. Exper. Marine Biol. Ecol. 1995. Vol. 188. Nol. P. 99-114.
321. Storey K.B., Storey J.M., Brooks S.P.J., Churchill T.A., Brooks R.J. Hatchling turtles survive freezing during winter hibernation. // Procl. Nat. Acad. Sci. USA. 1987. Vol. 85. No3. P. 8350-8354.
322. Storey K.B., Storey J.M., Churchill T.A. Freezing and anoxia tolerance of slugs: a metabolic perspective. // J. Сотр. Physiol. B. 2007. Vol. 177. N08. P. 833-840.
323. Storey K.B., Storey J.M. Freeze tolerance in animals. // Physiol. Rev. 1988. Vol. 68.N0I.P. 27-84.
324. Sugiura Y., Kavabe H., Tanaka H., Fujimoto S., Ohara A. First evidence for manganese binding to sulfur donor group in metalloprotein Mn(III)-containing acid phosphatase. // J. Amer. Chem. Soc. 1981. Vol. 103. No4. P. 963-964.
325. Sunila I., LaBanca J. Apoptosis in the pathogenesis of infectious diseases of the eastern oyster Crassostrea virginica. II Dis. Aquat. Organ. 2003. Vol. 56. No2. P. 163-170.
326. Szuwart Т., Kierdorf H., Kierdorf U., Clemen G. Histochemical andtultrastructural studies of cartilage resorption and acid phosphatase activity during antler growth in fallow deer (.Dama dama). II Anat. Rec. 2002. Vol. 268. Nol.P. 66-72.
327. Terahara K., Takahashi K.G., Mori K. Pacific oyster hemocytes undergo apoptosis following cell-adhesion mediated by integrin-like molecules. //
328. Сотр. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 2005. Vol. 141. No2. P. 215-222.
329. Thornalley P., Vasak M. Possible role for metallothionein in protection against radiation-induced oxidative stress. Kinetics and mechanism of its reaction with superoxide and hydroxyl radicals. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. Vol. 827. Nol. P. 36-44.
330. Traverso-Cori A., Traverso S., Reyes H. Different molecular forms of potato apyrase. //Arch. Biochem. Biophys. 1970. Vol. 137. Nol. P. 133-142.
331. Twardowski J. Hiver Raman spectroscopy of acid phosphatase from rat liver ander neuraminidase treatment. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 581. Nol. P. 116-120.
332. Valenzuela J.G., Charlab R., Galperin M.Y., Ribeiro J.M. Purification, cloning, and expression of an apyrase from the bed bug Cimex lectularius. A new type of nucleotide-binding enzyme. // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. No46. P. 30583-30590.
333. Vergani L., Grattarola M., Borghi C., Dondero F., Viarengo A. Fish and molluscan metallothioneins. //FEBS J. 2005. Vol. 272. No23. P. 6014-6023.
334. Verlecar X.N., Jena K.B., Chainy G.B. Biochemical markers of oxidative stress in Perna viridis exposed to mercury and temperature. // Chem. Biol. Interact. 2007. Vol. 167. No3. P. 219-226.
335. Viarengo A., Burlando В., Cavaletto M., Marchi В., Ponzano E., Blasco J. Role of metallothionein against oxidative stress in the mussel Mytilusgalloprovincialis. II Am. J. Physiol. 1999. Vol.277. N06. Part 2. P. R1612-R1619.
336. Viarengo A., Burlando В., Ceratto N., Panfoli I. Antioxidant role of metallothioneins: a comparative overview. // Cell Mol. Biol. 2000. Vol. 46. No2. P. 407-417.
337. Viarengo A., Nott J.A. Mechanisms of heavy metal cation homeostasis in marine invertebrates. // Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 1993. Vol. 104. No5.P. 355-372.
338. Voituron Y., Barre H., Ramlov H., J Douady C. Freeze tolerance evolution among anurans: Frequency and timing of appearance. // Cryobiology. 2009 (in press).
339. Waite W., Griffin H.D., Franson R. The phospholypases A of lysosomes // In: Lysosomes in Biol, and Pathol. Amsterdam. North Holland, 1976. Vol. 5. P. 257-305.
340. Wallweler G.J., Lilli W.W, Purification and characterisation of the two constitutively produced acid phosphatase isosymes from Schizophillum commune. И Mycol. Res. 1992. Vol. 96. No9. P. 792-797.
341. Walters K.R.Jr., Sformo Т., Barnes B.M., Duman J.G. Freeze tolerance in an arctic Alaska stonefly. // J. Exp. Biol. 2009. Vol. 212. Part 2. P. 305-312.
342. Weils W. W., Collins C.A., Kurtz J.W. Meyabolic regulation of lysosome activity // In: Lysosomes in Biol, and Pathol. Amsterdam. North Holland, 1975. Vol. 3.P. 200-238.
343. Wells W.W., Collins C.A. Phosphorylation of lysosomal membrane components as a possibly regulatory mechanism // In: Lysosomes in Biol, and Pathol. Amsterdam. North Holland, 1984. Vol. 7. P. 119-141.
344. Wilson C.L., Safe S. Mechanisms of ligand-induced aryl hydrocarbon receptor-mediated biochemical and toxic responses. // Toxicol. Pathol. 1998. Vol. 26. No5. P. 657-671.
345. Wilson M.R. Apoptosis: unmasking the executioner. // Cell Death Differ. 1998. Vol. 5. No8. P. 646-652.
346. Winston G.W., Regoli F., Dugas A.J., Blanchard K.A., Fong J.H. A rapid gas chromatographic assay for determining oxyradical scavenging capacity of antioxidants and biological fluids. // Free Radic. Biol. Med. 1998. Vol. 24. No3. P.480-493.
347. Whyte M. Ice/Ced-3 proteases In apoptosis. // Trends Cell. Biol. 1996. Vol. 6. No7. P. 245-248.
348. Zou H., Henzel W.J., Liu X., Lutschg A., Wang X. Apaf-1, a humanprotein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. // Cell. 1997. Vol. 90. No3. P. 405-413.
349. Yi F.X., Sun P., Huang S.L., Liu W.L., Guo Z.G. Characteristics of apyrase (EC 3.6.1.5) on cultured bovine endocardial endothelial cells. // Sheng Li Xue Bao. 1999. Vol. 51. No4. P. 425-429.
350. Yoshimoto M., Kimura Т., Miamoto Т., Sacamoto J., Hatano S. Purification and properties of acid phosphatase from Japanese radish. // Biosci. Biotechnol. and Biochem. 1992. Vol. 56. Nol. P. 147-148.
351. Yuan J.Y., Shaham S., Ledoux S., Ellis H.M., Horvitz H.R. The C-elegans cell death gene Ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-l-betaconverting enzyme. // Cell. 1993. Vol. 75. P. 641-652.
-
Цветков, Илья Леонидович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2009
-
ВАК 03.00.16
- Стресс-реакции пресноводных амфипод в условиях гипертермии и при интоксикации ксенобиотиками
- Оценка воздействия гетероциклических пестицидов группы диазолов на гидробионтов
- Изучение комплекса протеолитических ферментов при воздействии токсинов различной химической структуры в печени живородки речной
- Сравнительная оценка влияния изменения температуры среды на байкальские и палеарктические организмы по показателям энергетического метаболизма и неспецифического стресс-ответа
- Влияние ионов кадмия и свинца на некоторые показатели липидного обмена и систему антиоксидантной защиты карпа (Cyprinus carpio L.)
