Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ФЕРМЕНТОВ ЖИВОРОДКИ РЕЧНОЙ КАК МАРКЕРЫ ТОКСИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ФЕРМЕНТОВ ЖИВОРОДКИ РЕЧНОЙ КАК МАРКЕРЫ ТОКСИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ"

шт

На правах рукописи

ПОПОВ Алексей Петрович

МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ФЕРМЕНТОВ ЖИВОРОДКИ РЕЧНОЙ КАК МАРКЕРЫ ТОКСИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ

Специальность: 03.00,04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2002

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химки биолого-химического факультета Московского педагогического государственного

университета

Научные руководитель:

доктор биологических наук, профессор КОНИЧЕВ Александр Сергеевич

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор Рославцева Светлана Александровна

доктор химических наук, профессор Дедков Юрий Маркович

Ведущая организация -Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии Государственного Комитета РФ по рыболовству

Защита состоится «_16_» декабг" ?Л02 г. в /6 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д2! ' -™-ом педагогическом

государственном ул. Кибальчича,

С диссертаци ^тиотеке Московского

педагогического rot i-rpecy: 119992, Москва,

Ар- |>ер? _ ^ол-'. '.002 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

ХОЛМОГОРОВА Н.В,

Мое- ; н ; 'Ч

Актуальность темы. Актуальность изучения воздействий, токсических

веществ антропогенного происхождения на биоМшйчёские процессы у

гидробионтов обусловлена как постоянно возрастающим интересом к

проблеме биохимической адаптации в изменяющихся условиях среды, так

и необходимостью поиска чувствительных тест-объектов и тест-функций

для оценки степени загрязненности природных и сточных вод.

В настоящее время биохимическому тестированию воздействия различных экотоксикантов на живые организмы уделяется повышенное внимание. Результаты ряда экспериментальных работ позволяют сделать вывод, что биохимическую диагностику можно использовать не только для оценки интенсивности загрязнения, но и для идентификации по крайней мере отдельных групп токсикантов (Козловская и др., 1996; Сидоров и др., 1990; ЮроеицкиЙ, Сидоров, 1993).

Последнее положение было положено в основу нашей работы. Мы исходили из того, что для обнаружения токсикантов особенно полезным быпо бы иметь качественные характеристики биохимических изменений а тест-объекте. Такими качественными показателями могут быть прежде всего множественные формы ферментов, осуществляющие тонкую настройку обменных процессов в условиях адаптации к изменяющимся условиям среды. Естественно, что предпочтение следовало отдать высокоактивным ферментам, контролирующим принципиально важные метаболические процессы, для которых отработаны надежные приемы анализа изоформ. Поэтому наш выбор пал на кислую ДНКазу - один из центральных ферментов обмена нуклеиновых кислот, а также на НАД*-эависшлую мэпатдешдрогенаэу и г л юкозо-6-фосфатдеги дрогеназу, принадлежащим к важнейшим ферментам углеводного обмена.

Объектом наших исследований являлся пресноводный моллюск живородка речная. Отметим, что моллюски еще не стали классическими объектами ни в водной токсиколога«, ни в экологической биохимии, хотя результаты ранее опубликованных работ (Горомосова и др.. 1987; Короленко и др., 1984; Цветков и др., 1997) свидетельствуют о том, что в процессе токсического воздействия в организме моллюсков происходят закономерные перестройки обмена веществ, что отражается на уровне активности и молекулярной гетерогенности их ферментов. Ограниченность

пространственных перемещений и встречаемость речной живородки практически в любых водоемах, вне зависимости от сипы антропогенной нагрузки (Брагинский, 1977), позволяют рассматривать данный вид как обладающий широким адаптивным потенциалом к гидрохимическому режиму. Широкая распространенность живородок в гидробиоценозах любого ранга, простота сбора и содержания в лабораторных условиях обусловливают доступность и легкость искусственного культивирования этих моллюсков. На основании вышеизложенного изучение энзиматических реакций живородки речной на токсическое воздействие представляется вполне обоснованным и перспективным.

Цель и задачи исследования. Основной целью наших исследований стал анализ изменений в наборах множественных форм и функциональной активности ряда ферментов моллюсков, происходящих в результате воздействия различных экотоксикзнтов. Для достижения этой цепи были поставлены следующие главные задачи:

1. Определить активность и состав множественных форм НАД4-заеискмой мадатдегидрогеназы, глкжозо-б-фосфатд е гадроген азы, кислой ДНКазы, а также активность протеаз и кислых фосфатаз в норме у живородки речной.

2. Проследить динамику изменений а активности и спектрах множественных форм ферментов при воздействии на моллюсков различных концентраций токсических веществ.

3. Оценить степень сходства и различия адаптивных изменений у исследованных ферментов в зависимости от концентрации и времени воздействия различных поллютантов (тяжелые металлы, фенол, бензин, синтетические поверхности о-актиеные вещества, галогенорганические соединения).

4. Сопоставить возможность и целесообразность использования удельной активности и наборов активных форм ферментов в качестве маркерных биохимических показателей загрязнения водной среды исследованными токсикантами.

5. Провести выделение и осуществить физико-химическую и функциональную характеристику множественных форм наиболее

перспективного в плане биохимического тестирования воды фермента моллюсков.

Научная новизну работы. Впервые изучены наборы множественных форм НАД+-зависимой м алатдеги дрогена зы, глкжозо-6-

фосфатдегидрогеназы и комплекс кислых ДНКаэ печени живородки речной в норме и в условиях токсического воздействия.

Впервые изучена динамика адаптивных изменений активности кислых ДНКаз, кислых фосфатаз и протеаз, а также НАД*-зависимой малатдегидрогеназы в печени речных живородок при воздействии различных концентраций широкого спектра поллютантов. Установлено, что токсическое воздействие вызывает закономерные изменения в активности ферментов, которые можно рассматривать в качестве показателя интоксикации. Наиболее достоверные и воспроизводящиеся изменения зафиксированы в отношении наборов кислых ДНКаз; при действии различных загрязнителей в печени моллюсков формируется определенный спектр белков, обладающих ДНКазной активностью.

Впервые исследована знутракпетсчкая локализация кислых ДККзз речной живородки, проведено их препаративное разделение и изучено воздействие на ДНК эндогенного и экзогенного происхождения. На основе полученных данных высказаны суждения о роли отдельных компонентов ДНКаэного комплекса в деструкции ДНК у контрольных и подвергнутых действию токсикантов моллюсков.

Практическое значение работы. Результаты работы обосновывают целесообразность проведения анализов по энзимоди агностике загрязнения еод с использованием в качестве тест-функций множественных форм ферментов. Кислая ДНКаза печени живородки речной может быть рекомендована для обнаружения в воде ряда токсических веществ в концентрациях на уровне ГЩК и ниже.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы МПГУ г 1999-2000 гадах.

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, посвященного современному состоянию биомониторинга и биотестирования качества вод; описания объекта и методов исследования; четырех глав, посвященных изложению и обсуждению полученных экспериментальных данных, заключения и выводов. Работа изложена на 187 страницах машинописного текста, включает 36 рисунков и 34 таблицы. Список цитируемой литературы включает 202 названия, из которых 33 работы на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом для наших исследований служил пресноводный моллюск живородка речная (Viviparus viviparus L). Моллюсков собирали в природном водоеме и содержали до опыта в лабораторных условиях в течение месяца По окончании периода акклиматизации животных подвергали воздействию растворенных в воде токсических веществ. Опытные группы животных (15-20 особей) помещались в стеклянные сосуды с 1 л воды, куда вносился токсикант; контрольная группа помещалась в чистую воду. По истечении экспозиции опыта (3-96 часов) у животных путем вивисекции извлекали печень, гомогенизировали с 0,5%-ным раствором Тритона Х-100 и очищали экстракт центрифугированием.

Определение общего белка е экстрактах проводили методом Лоури (Lowry et, al, 1951), Определение активности кислой ДНКазы проводили по модифицированному методу Бойда (Вочкоеа и др., 1982), кислой фосфатазы - по методу Бессея с модификациями (Безбородова, Морозова, 1972), протеопитической активности - по методу Кунитца (Kunitz, 1947), активности малатдегидрогенаэы - по Кочетову (Кочетов, 1980). Аналитический диск-электрофорез проводили на колонках полиакриламиднога геля (Davis, 1964); обнаружение зон активности кислой ДНКазы в геле осуществляли методом Бойда (Boyd, 1970),

мапатдегидрогеназ ы и глюкозо-6-фосфатдетдрогеназы - тетразолиевым методом (Кочетов, 1380).

Субклеточное фракционирование осуществляли методом дифференциального центрифугирования. Препаративное

изоэлекгрофокусирование проводили в слое ультрадексз с амфолинами е градиенте рН 3-10 и 4-6. Анализ продуктов гидролиза ДНК кислыми ДНКазами моллюсков • осуществляли методом горизонтального электрофореза в 1%-ном агарсзном геле с красителем бромистым этидием; изображение визуализировали в ультрафиолетовом свете при длине волны 302 нм. Статистическую обработку результатов проводили по руководству Плохинского (1961).

Результаты и их обсуждение

Результаты проведенных нами экспериментов свидетельствуют, что при действии загрязняющих веществ активность кислых гидролаз печени живородки речкой (кислая ДНКаза, кислая фосфата за, общая протеолитическая активность) претерпевает закономерные изменения, которые носят волнообразный характер. Фаавость подобных изменений в динамике токсического воздействия наиболее подробно изучена нами на примере сульфата меди (II) и бензина.

Изучение эффекта действия сульфата меди (II) в трех, отличающихся друг от друга на порядок, концентрациях (0.1,0.01 и 0.001 мг Сиг+/л), позволило выявить следующие закономерности. Уже через 3 ч происходят статистически достоверные отклонения активности кислой ДНКазы от контроля под воздействием ионов меди в концентрации 0.1 и 0.01 мг/л, через 6 ч - во всех трех опытных вариантах; на всем протяжении эксперимента активность кислой ДНКазы претерпевает значительные изменения. Обращает на себя внимание однонаправленность изменений энзиматической активности в динамике воздействия разных концентраций токсиканта (рис. 1), что является, видимо, отражением адаптационно-компенсаторных процессов, происходящих в организме моллюсков в ответ на интоксикацию.

При воздействии бензина в концентрациях 0.005, 0.05 и 0.5 мг/л после начального периода угнетения (высокие концентрации) или «безразличия» (0,005 мг/л) к 12 ч экспозиции происходит резкий скачок активности кислой ДНКазы до величин, превышающих контрольные значения в три, три с половиной и более чем в семь раз в трех опытных вариантах. После этого наблюдается не менее резкое угнетение активности и падение ее величин ниже контрольного уровня (16-24 ч), сменяющееся повторным ростом к 48 ч. Изменения активности кислой фосфатазы и общей протеолитической активности при воздействии бензина имеют схожую во времени динамику, но менее ярко выражены (рис. 2). Выделим тот факт, что кривые зависимости активности кислой ДНКазы (рис. 1, 2), КИСЛОЙ фосфатазы и протеаз (рис. 2) от продолжительности токсического воздействия имеют форму синусоиды, признанную в практике токсикологии в качестве стандартной и имеющую строгое теоретическое обоснование с точки зрения термодинамики биологических процессов адаптации (Бергер, 1987; Фипенко, 1990).

Снижение активности изученных ферментов в первые часы интоксикации (рис. 1, 2) соответствует первой фазе адаптивного ответа организма на стрессовое воздействие, известной как «эффект затаивания». В это время в клетках происходит временное подавление взаимосвязанных процессов синтеза ДНК, РНК и белков и падение интенсивности метаболизма (Голиков, Голиков, 1987). Вторая стадия адаптации тест-организма к токсическому воздействию - фаза активации физиологических и биохимических процессов (Голиков, Голиков, 1987) -характеризуется ростом ферментативной активности кислых гидролаз а печени живородок сверх контрольного уровня (рис. 1, 2). Наблюдаемое нами увеличение активности литических ферментов является, видимо, результатом активации лизосомального аппарата в целом, как одного из инструментов механизма репарации клеточных повреждений. Полагают, что эта реакция является составляющей единого неспецифического адаптационного синдрома кпетки, однотипна для всего животного мира и действия разнообразных токсических веществ и других стрессовых факторов (Браун, Моженок, 1987). Если повреждающее воздействие не

Активность,

% к контролю

Активное гь, % к контролю

р •

■£ - ш ё ■ * —*

Jill í

в -3

Z ^

14

i * X r>

s * H

g s

i В

I*

te

о "о

Is

¿J

Is

* I

' i i та

S S

превышает адаптационных возможностей организма, фаза стимуляции сменяется серией волнообразных изменений функциональных показателей или продолжается длительное время, завершаясь стабилизацией процессов жизнедеятельности на новом уровне (Голиков, Голиков, 1987; Хлебович, 1981),

Чувствительность исследованных нами ферментов печени живородки речной к действию поллютантов различна. Наиболее выраженные изменения энзиматической активности в результате интоксикации характерны для кислой ДНКазы моллюсков. Напротив, активность НАД "-зависимой малатдегидрогеназы (МДГ) печени живородок под влиянием тяжелых металлов, бензина, синтетических поверхностно-активных веществ изменяется в небольших пределах, в связи с чем наблюдаемые отклонения во многих опытных вариантах оказываются статистически недостоверными. В целом в динамике токсического воздействия наблюдается тенденция к угнетению активности МДГ подопытных животных, что может указывать на снижение интенсивности аэробного метаболизма в условиях интоксикации

Вышеперечисленные поллютанты во всех использованных концентрациях не оказали влияния на спектр множественных форм МДГ, выявляемых методом энзим-электрофореза в 5,6%-ном ПААГ, но при этом фермент обнаружил высокую чувствительность к сапоге норганическим соединениям. В норме МДГ в печени живородок представлена тремя формами ^ 0.38, 0,23 и 0.11). Действие галогенорганических соединений приводит к перераспределению активности между отдельными формами фермента; в ряде вариантов опыта происходит инактивация форм с М 0.38 (при действии хлорбензола) и 0.11 ( влияние три- и тетрахпорметана. хлор-, бром-, чюдбеизола) и в одном случае (под влиянием тетрахпорметана) индукция активности отсутствующих у контрольных моллюсков форм с ГУ 0.57 и 0.50.

При изучении молекулярной гетерогенности глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы живородки речной мы столкнулись с вариабельностью спектров форм этого фермента в норме. В сериях

опытов, проводимых в 1999 и 2000 годах, на энэимограммах у контрольных моллюсков выявлялись соответственно две 0.40 и 0.30) и одна (1^ 0.40) зоны активности фермента; во втором случае форма с 0,30 являлась «индуцибельной», то есть проявляла активность при действии токсических веществ (хлорпроизводных метана). Под влиянием токсикантов наблюдалась также индукция форм фермента с Rf 0,75 (действие бромбензола) и 0,10 (действие иодбензола).

г*

Исследование состава множественных форм кислой ДНКазы живородок в 7,2%-ном ПААГ показало, что на электрофореграммах ДНКазы в норме выявляются пять зон активности фермента ((У=0.76, 0,71, 0.33, 0,29, 0.08). Следует отметить, что здесь мы используем термин «формы кислой ДНКазы» исключительно для удобства изложения полученных данных, имея в виду белки, обладающие ДНКазной активностью и характеризующиеся различными значениями в ПААГ, Вместе с тем, по мере изучения свойств (и, прежде всего, субстратной специфичности) «форме кислой ДНКазы, мы пришли к заключению о существовании в печени данного вида моллюсков целого комплекса ДНКаз, отличающихся по заряду (р1) и молекулярной массе, что и отражается на их алекгофоретической подвижности.

Присутствие в среде загрязняющих веществ отражается на молекулярной гетерогенности кислой ДНКазы, что выражается в индукции дополнительных, не обнаруживаемых у контрольных моллюсков, зон активности фермента. Так, при воздействии различных концентраций сульфата меди (II) происходит рад закономерных изменений, которые представлены на рис. 3. Влияние Си21 в динамике по времени и концентрациям характеризуется последовательной активацией/ инактивацией отдельных форм кислой ДНКазы в печени моллюсков, что свидетельствует в пользу адаптивного значения подобных изменений. Видимо, индуцибельные ДНКазы обладают определенными специфическими характеристиками, позволяющими организму реализовывать адаптационные возможности в стрессовой ситуации токсического воздействия.

Как и при действии сульфата меди, изменения в спектре кислых ДНКаз под влиянием бензина происходят, начиная с 18 ч экспозиции

опыта, К этому моменту набор форм фермента подопытных животных значительно обогащается за счет активации ряда «адаптационных» форм (рис. 3). В дальнейшем, при продолжающемся токсическом воздействии, состав ДНКазного комплекса претерпевает существенные изменения (рис. 3).

При действии фенола отмечается активация кислых ДНКаз с ИГ=0.65, 0,54 и 0.82 (рис. 3). Влияние различных концентраций синтетических поверхностно-активных веществ к 48-72 ч приводит к активации высокоподвижных «адаптационных» форм ^ 0.50 и 0.64) во всех опытных вариантах; кроме того, к 72 ч воздействие поллютанта в концентрации 0,04 мг/л приводит к активации формы с IV 0.41, в концентрации 0,4 мг/л - форм с 0,45 и 0.41. Для действия тяжелых металлов (цинк, железо, кадмий) в целом наиболее характерна активация форм с К1=0.82, 0.45, 0.41, Присутствие в среде иодбензола приводит к индукции активности форм с ЯГ 0.65, 0.45 и 0.41, действие хлорбензола - с КГ 0.65.

Таким образом, по сравнению с общей активностью кислых гид рол аз печени живородок, изменения состава кислых ДНКаз носят более специфический характер. Для действия каждого из использованных нами токсикантов характерна собственная, специфическая динамика активации индуцибельных форм ДНКаэы живородок. Формирующийся спектр функционирующих форм ДНКазы зависит, видимо, как от природы поллютанта (особенностей его биотоксического эффекта), так и от силы (концентрации и длительности) его травмирующего воздействия.

8 дальнейшем нами более детально были изучены свойства отдельных компонентов комплекса кислых ДНКаз печени живородки речной. Соответствующие опыты показали, что в печени данного вида моллюсков комплекс кислых ДНКаз представлен как собственно лизосомальными (ДНКазы 1, 4-0), так и выявляемыми в постлизосомальной фракции (ДНКазы 2,3, 10-12) компонентами (табл.1). По результатам определения активности в субклеточных фракциях, у контрольных моллюсков существенную активность обнаруживают только

I»

0.0)"

0.2Т ад; аб-

ав|-1

1,0;

24

1 2 3

48

□ 1 2 3

72

V *

И

16

46

ХЛ =

0,0 0,2 ала б г

0.8 г

.1.0--%

о 0,2 0,4 0,6 0,8 1.0

К

12 3 12 18 24 43 72

72

¡2 =

г 12 3 18 24 48 72

Рис. 3. Схемы энзимограмм кислых ДНКаз печени живородки речной. А — воздействие фенола: 1-10 мг/л; 2 —10"4 мг/л; 3-10 мг/л. Б - воздействие Си2*: 1 - 0,001 мг/л; 2 - 0,01 мг/л: 3 - 0,1 мг/л, В -воздействие бензина: 1 - 0,05 мг/л; 2 - 0,5 мг/л. К - контрольные моллюски. 18, 24, 46, 72 - экспозиция опыта, ч.

вторые. Остальные ДНКазы в норме либо имеют небольшую активность (ДНКазы 1,5, б, 8,9). либо вообще не обнаруживаются (ДНКазы 4,7).

Данные по слектрофотометрическому определению суммарной активности шалых ДНКаз в субклеточных фракциях свидетельствуют, что действие фенола (0.02 мг/л, 48 ч) приводит к активации всего ДНКазного комплекса: в клетках печени происходит рост как удельной, так и общей его активности. В постлизосомальной фракции общая активность комплекса ДНКаз вырастает в 1,3 раза по сравнению с контролем, а суммарно по фракциям органелп - в 2,2 раза, составив 9,4 % от общей активности фермента в клетке (против 5,8 % в контроле). Наибольший прирост активности (более чем в 5 раз) отмечен во фракции клеточных обломков, что может свидетельствовать о нарастании деструктивных процессов в клетках, а, может быть, и о деградации части клеток в результате процессов апоптоза и/или некроза. Наблюдаемый рост нукпеазной активности также может являться следствием активации кислых гидролаэ в крупных аутофагосомах и вторичных лиэосомах, которыми, видимо; в значительной степени представлена фракция клеточных обломков.

Методом изоэлектрофокусирования нами было проведено препаративное разделение исследуемых ДНКаз. Часть полученных препаратов содержала индивидуальные ДНКазы, а в некоторых присутствовали по две формы с идентичными величинами р1, но разными значениями в ПААГ. Отдельные компоненты ДНКазного комплекса обнаружили выраженные отличия в предпочтении атакуемых субстратов (табл. 1). Так, ДНКазы 1, 2, 3 гидропизуют преимущественно денатурированную ДНК. ДНКазы 8,9,10,11 проявляют гораздо большее сродство к нативной ДНК. ДНКазы 4, 5, 6 не обнаружили предпочтений а предложенных субстратах. Наиболее интересные данные получены по ДНКазе 12: фермент слабоактивен в отношении экзогенной ДНК (ДНК из эритроцитов цыплят), но энергично атакует эндогенную ДНК, выделенную нами из тканей моллюсков, что позволяет предположить существование в ДНК живородок особо чувствительных к нукпеазной атаке участков (сайтов) и высокое сродство к ним со стороны данной ДНКазы.

Таблица 1.

Некоторые характеристики кислых ДНКаз из клеток печени живородки речной.

Кислые ДНКазы Субклеточная локализация Ri фермента Pi фермента Активность в отношении различных субстратов, единиц

экзогенная ДНК, денатурир. экзогенная ДНК, нативная эндогенная ДНК. натнвная

1 ЛИЗ, цит* 0,82 4,3 0,046 0,008 0,000

2 цит, лиз 0,76 4,5 0.169 0,029 0,000

3 цит, лиз 0,71 4,5

4 лиз* 0,65* 5,4* 0,037* 0,033* 0,047*

5 лиз 0,59 5,1 0,155 0,167 0,248

6 лиз 0,54 5,1

7 лиз* 0,51* - - - -

S лиз 0,45 5,3 0,030 0,111 0,181

9 лиз 0,41 5,3

10 кит, лиз 0,33 5,5 0,036 0.141 0,263

И цит, лиз 0,29 5,4

12 иит,лнз 0,03 4,7 0,021 0,012 0,231

Примечание к табл. 1. лиз - лнзосомальная фракция; цит - постлизосомальная фракция; *- определено в ситуации токсического воздействия; — - не определено.

В заключение нами были изучены особенности действия различных компонентов комплекса ДНКаз на эндогенную ДНК. В этих опытах выделенную из тканей живородок ДНК подвергали воздействию частично очищенных препаратов ДНКаз и продукты ее гидролиза анализировали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Оказалось, что при суммарном действии ДНКаз 1, 2, 3 наблюдается последовательное уменьшение молекулярной массы атакуемой ДНК, вплоть до деградации ее до фрагментов, не выявляемых используемым

методом (менее 100 п.н.). В то же время, расщепление ДНК ДНКаэами 2 и 3, развиваясь по схожему сценарию, останавливается на стадии фрагментов размером около 100 п.н., что наблюдается даже в ситуации избыточного по времени гидролиза (6 ч). Выявленные отличия не связаны с общей ферментативной активностью в используемых экстрактах, так как во втором случае она была выше. При действии препарата ДНКазы 1 наблюдается постепенное медленное уменьшение молекулярной массы гидролизуемой ДНК без накопления фиксированных по размерам полинуклеотидных фрагментов, характерного для действия ДНКаз 2, 3. Наблюдаемые отличия в характере деструкции предложенного субстрата могут указывать на проявление ДНКазой 1 экзонуклеазной активности в отношении эндогенной ДНК.

Деструкция ДНК ДНКазой 4 приводит, как и в случае действия ДНКаз 2 и 3, к накоплению продуктов размером примерно 100 п.н. Напротив, суммарное действие ДНКаз 5 и 6 имеет исчерпывающий эндонуклеазный характер. Продуктами ступенчатой деградации ДНК ДНКазами 8,9 и 10,11 являются полинуклеотидные фрагменты длиной около 200 п.н. Накопление продуктов деструкции ДНК строго фиксированного размера указывает на возможность атаки этими ДНКазами регулярных участков структуры ДНК, свободных от белков Как известно, такими участками могут быть межнукпеосомные последовательности линкерной ДНК, атакуемые ДНКаэами, участвующими в апоптозе (Самуилов, 2000).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в печени данного вида моллюсков существует целый комплекс каталитически активных белков, обладающих ДНКазной активностью, которые различаются по локализации в клетке и физико-химическим свойствам. ДНКазы 2, 3, 10, 11, 12, на которые в норме приходится основная доля суммарной активности кислой ДНКазы в клетке, способны к эффективному гидролизу ДНК различного происхождения и структурного состояния (эцдо- и экзогенной, нативной и денатурированной). Активируемые при действии различных токсических веществ «адаптационные» (лизосомальные) ДНКазы, видимо, играют

существенную роль в стрессовой ситуации, обеспечивая пластичность метаболизма и должный уровень протекания обменных процессов. Так, ДНКазы 5 и 6, проявляющие высокую активность в отношении всех испытанных субстратов, могут играть заметную роль в процессах аутолиза, ауто- и гетерофагии. Более эффективной и быстрой деградации ДНК, вовлечению в обмен резервного пластического материала в ситуации токсического воздействия может способствовать индукция активности ДНКазы 1, обладающей иным (возможно, экзонуклеаэным) способом воздействия на ДНК. Возможно, некоторые «адаптационные» формы ДНКазы дублируют действие высокоактивных в норме форм фермента, оказываясь, например, более устойчивыми на молекулярном уровне к действию токсических веществ (или обладая иными особенностями, адекватными изменившимся условиям). Так, ДНКаза 4 проявляет значительное сходство в действии на эндогенную ДНК с ДНКазами 2 и 3, но, в отличие от последних, не имеет выраженных предпочтений в атакуемых субстратах (см. табл. 1), Активируемые токсикантами ДНКазы 8, 9 практически не отличаются от ДНКаз 10,11 по субстратной специфичности (см. табл. 1) и действию на эндогенную ДНК. Возможно, активация ДНКаз В и 9, которые расщепляют ДНК моллюсков до фрагментов длиной около 200 п.н. (размер нуклеосом), указывает на их участие в процессе апоптоза клеток печени.

Выводы

1. Воздействие in vivo широкого спектра токсических веществ (тяжелые металлы, фенол, бензин, синтетические поверхностно-активные вещества, галогенпроизводные бензола) вызывает в различной степени выраженные изменения активности кислой ДНКазы, кислой фоофатазы и общей протеолитической активности в печени живородки речной. Реакция гидролитических ферментов на интоксикацию имеет фазный характер, совпадающий со стадиями адаптационного синдрома, и однотипна в отношении различных загрязняющих веществ, что свидетельствует о развитии в организме моллюсков процессов неспецифической адаптации.

2. Чувствительность исследованных ферментов к действию токсикантов Ir» vivo возрастает в ряду: малатдегидрогенаэа-протеазы-кислая фосфатаза-кислая ДНКаэа, что позволяет рассматривать кислую ДНКазу в качестве наиболее яркого маркера токсического воздействия на моллюсков.

3. Воздействие галогенорганических соединений приводит к выраженным изменениям в спектрах множественных форм НАД*-зависимой малатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы печени живородок, что проявляется в инактивации одних и индукции активности других, неактивных в контроле, форм. В то же время, низкая чувствительность малатдегидрогеназы моллюсков к действию других токсикантов и вариабельность злекгорофоретических спектров форм тюкозо-б-фосфатдегидрогеназы в норме не позволяют рассматривать реакции изученных дегидрогеназ в качестве надежного показателя присутствия в среде загрязняющих веществ.

4. При содержании в среде с токсикантами у речных живородок происходит активации «адаптационных» кислых ДНКаз, слабоактивных или патентных в норме. При действии пороговых и лодпороговых концентраций различных токсикантов к 24-48 часам в печени животных формируется определенный спектр белков, обладающих ДНКазной активностью, что создает предпосылки не только для обнаружения, но и для идентификации отдельных групп токсикантов. Напротив, отсутствие изменений в электрофоретических спектрах может трактоваться как свидетельство приемлемого качества воды.

5. Кислая ДНКаэа в печени данного вида моллюсков существует в виде комплекса каталитически активных белков, различающихся по физико-химическим свойствам (величине pl, электрофоретической подвижности, субстратной специфичности) и локализации в клетке. В норме основная доля суммарной активности кислых ДНКаз в клетке сосредоточенна в постлизосомальной фракции; а ситуации токсического воздействия происходит выраженная активация лизосомальных кислых ДНКаз.

6. Выделенные с помощью метода препаративного иэоэлектрофокусирования различные компоненты комплекса ДНКаз проявляют существенные отличия в действии на эндогенную ДНК моллюсков, расщепляя ее до полинуклеотцдных фрагментов, имеющих различные, а в некоторых случаях строго фиксированные, размеры. Активируемые токсикантами ДНКазы с изозлектрической точкой 5,3 расщепляют ДНК моллюсков до фрагментов 200 п.н„ что указывает на возможность их участия в процессе аполтоэа клеток печени.

7. Обладающий широкими возможностями воздействия на ДНК комплекс кислых ДНКаз способен к эффективной деструкции как эндогенной, так и экзогенной ДНК. и может играть существенную роль & регуляции обмена ДНК как в норме, так и в условиях токсического воздействия.

8. Комплекс кислых ДНКаз печени живородки речной в перспективе может использоваться в качестве маркера присутствия в воде пороговых и подпороговых концентраций загрязняющих веществ. Высокая гетерогенность и чувствительность кислых ДНКаз позволяет диагностировать токсическое воздействие на организм по энзим-электрофоротичесхим спектрам, являясь качественным показателем интоксикации моллюсков. Особенно перспективным представляется использование этой тест-функции применительно к определенным видам загрязнений (нефтепродуктами, фенолом).

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Иванов В,Г., Шеленков И.В., Гаверова Ю.Г., Гева О.Н„ Полов А.П.,

Коничева А. П. Влияние хпорорганических экотокси кантов на множественные формы дегидрогеназ живородки речной Viviparus viviparus L. И Дел. в ВИНИТИ 09.11.2000, Nfl 2818-ВОО. 18 с. 1,2 п.л., авторских 20%.

2. Иванов В.Г., Шеленков И.В.. Гаверова Ю.Г., Гева О.Н., Попов А.П., Коничев A.C. Влияние хлорпроизводных метана на множественные формы гидролаэ живородки речной // Деп. в ВИНИТИ 09.11.2000, Na 2819-ВОО. 17с. 1,1 п.п., авторских 20%.

3. Попов А.П., Коничев A.C. Влияние различных токсикантов на спектр множественных форм кислой ДНКаэы речной живородки (Viviparus viviparus L.) U Научн. труды МПГУ. Серия: Естественные науки. М, 2000, С. 254-256. 0,2 пл., авторских 70%.

4. Полов А.П., Коничев A.C. Влияние хлорида меди (II) на активность и набор множественных форм кислой ДНКазы речной живородки {Viviparus viviparus L.) II Научн, труды МПГУ. Серия: Естественные науки. М, 1999, С, 323-325. 0.2 п.л„ авторских 70%.

5. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев A.C., Урванцева Г.А. Влияние хлорида кадмия на активность фосфатазного комплекса моллюсков II Научн, труды МПГУ. Серия; Естественные науки. М, 1998. С. 242-243. 0,2 пл., авторских 40%.

Подп. к печ. 13,11,2002 Обьем 1,25 п.л. Заказ № 394 Тир. 100 Типография МПГУ