Множественные формы ферментов живородки речной как маркеры токсического загрязнения воды

Попов, Алексей Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Множественные формы ферментов живородки речной как маркеры токсического загрязнения воды
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Множественные формы ферментов живородки речной как маркеры токсического загрязнения воды"

Це еооТС о-иис

На правах рукописи

ПОПОВ Алексей Петрович

МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ФЕРМЕНТОВ ЖИВОРОДКИ РЕЧНОЙ КАК МАРКЕРЫ ТОКСИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ

Специальность: 03.00.04- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2002

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии биолого-химического факультета Московского педагогического государственного

университета

Научные руководитель:

доктор биологических наук, профессор КОНИЧЕВ Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Рославцева Светлана Александровна

доктор химических наук, профессор Дедков Юрий Маркович

Ведущая организация -Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии Государственного Комитета РФ по рыболовству

Защита состоится «_16_» декабря 2002 г. в ¡6 час.-ЗОмин. на заседании Диссертационного совета Д 212.154.17 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129278, Москва, ул. Кибальчича,

д. 6, корп. 5, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: 119992, Москва, ГСП - 2, ул. Малая Пироговская, д. 1.

Автореферат разослан «_» ноября 2002 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

ХОЛМОГОРОВА Н.В.

РОССИЙСКАЯ ,

¡УЯЛГСТПЕННЛЯ 1

БИЫНЮТЕКЛ

Я 002_

Актуальность темы. Актуальность изучения воздействия токсических веществ антропогенного происхождения на биохимические процессы у гидробионтов обусловлена как постоянно возрастающим интересом к проблеме биохимической адаптации в изменяющихся условиях среды, так и необходимостью поиска чувствительных тест-объектов и тест-функций для оценки степени загрязненности природных и сточных вод.

В настоящее время биохимическому тестированию воздействия различных экотоксикантов на живые организмы уделяется повышенное внимание. Результаты ряда экспериментальных работ позволяют сделать вывод, что биохимическую диагностику можно использовать не только для оценки интенсивности загрязнения, но и для идентификации по крайней мере отдельных групп токсикантов (Козловская и др., 1996; Сидоров и др., 1990; Юровицкий, Сидоров, 1993).

Последнее положение было положено в основу нашей работы. Мы исходили из того, что для обнаружения токсикантов особенно полезным было бы иметь качественные характеристики биохимических изменений в тест-объекте. Такими качественными показателями могут быть прежде всего множественные формы ферментов, осуществляющие тонкую настройку обменных процессов в условиях адаптации к изменяющимся условиям среды. Естественно, что предпочтение следовало отдать высокоактивным ферментам, контролирующим принципиально важные метаболические процессы, для которых отработаны надежные приемы анализа изоформ. Поэтому наш выбор пал на кислую ДНКазу - один из центральных ферментов обмена нуклеиновых кислот, а также на НАД зависимую малатдегидрогеназу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, принадлежащим к важнейшим ферментам углеводного обмена.

пространственных перемещений и встречаемость речной живородки практически в любых водоемах, вне зависимости от силы антропогенной нагрузки (Брагинский, 1977), позволяют рассматривать данный вид как обладающий широким адаптивным потенциалом к гидрохимическому режиму. Широкая распространенность живородок в гидробиоценозах любого ранга, простота сбора и содержания в лабораторных условиях обусловливают доступность и легкость искусственного культивирования этих . моллюсков. На основании вышеизложенного изучение энзиматических реакций живородки речной на токсическое воздействие представляется вполне обоснованным и перспективным.

Цель и задачи исследования. Основной целью наших исследований стал анализ изменений в наборах множественных форм и функциональной активности ряда ферментов моллюсков, происходящих в результате воздействия различных экотоксикантов. Для достижения этой цели были поставлены следующие главные задачи:

1. Определить активность и состав множественных форм НАД+-зазисимой малатдегидрогеназы, глкжсзо-б-фссфатдегидрогеназы, кислой ДНКазы, а также активность протеаз и кислых фосфатаз в норме у живородки речной.

2. Проследить динамику изменений в активности и спектрах множественных форм ферментов при воздействии на моллюсков различных концентраций токсических веществ.

3. Оценить степень сходства и различия адаптивных изменений у исследованных ферментов в зависимости от концентрации и времени воздействия различных поллютантов (тяжелые металлы, фенол, бензин, синтетические поверхностно-активные вещества, галогенорганические соединения).

5. Провести выделение и осуществить физико-химическую и функциональную характеристику множественных форм наиболее

перспективного в плане биохимического тестирования воды фермента моллюсков.

Научная новизна работы. Впервые изучены наборы множественных форм НАД+-зависимой малатдегидрогеназы, глюкозо-6-

фосфатдегидрогеназы и комплекс кислых ДНКаз печени живородки речной е норме и в условиях токсического воздействия.

Впервые изучена динамика адаптивных изменений активности кислых ДНКаз, кислых фосфатаз и протеаз, а также НАД+-зависимой малатдегидрогеназы в печени речных живородок при воздействии различных концентраций широкого спектра поллютантов. Установлено, что токсическое воздействие вызывает закономерные изменения в активности ферментов, которые можно рассматривать в качестве показателя интоксикации. Наиболее достоверные и воспроизводящиеся изменения зафиксированы в отношении наборов кислых ДНКаз; при действии различных загрязнителей в печени моллюсков формируется определенный спектр белков, обладающих ДНКазной активностью.

Впервые исследована внутриклеточная локализация кислых ДНКаз речной живородки, проведено их препаративное разделение и изучено воздействие на ДНК эндогенного и экзогенного происхождения. На основе полученных данных высказаны суждения о роли отдельных компонентов ДНКазного комплекса в деструкции ДНК у контрольных и подвергнутых действию токсикантов моллюсков.

Практическое значение работы. Результаты работы обосновывают целесообразность проведения анализов по знзимодиагностике загрязнения вод с использованием в качестве тест-функций множественных форм ферментов. Кислая ДНКаза печени живородки речной может быть рекомендована для обнаружения в воде ряда токсических веществ в концентрациях на уровне ПДК и ниже.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы МПГУ в 1999-2000 годах.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, посвященного современному состоянию биомониторинга и биотестирования качества вод; описания объекта и методов исследования; четырех глав, посвященных изложению и обсуждению полученных экспериментальных данных, заключения и выводов. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, включает 36 рисунков и 34 таблицы. Список цитируемой литературы включает 202 названия, из которых 33 работы на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом для наших исследований служил пресноводный моллюск живородка речная (Viviparus viviparus L,). Моллюсков собирали в природном водоеме и содержали до опыта в лабораторных условиях в течение месяца. По окончании периода акклиматизации животных подвергали воздействию растворенных в воде токсических веществ. Опытные группы животных (15-20 особей) помещались в стеклянные сосуды с 1 л воды, куда вносился токсикант; контрольная группа помещалась в чистую воду. По истечении экспозиции опыта (3-96 часов) у животных путем вивисекции извлекали печень, гомогенизировали с 0,5%-ным раствором Тритона Х-100 и очищали экстракт центрифугированием.

Определение общего белка в экстрактах проводили методом Лоури (Lowry et. al, 1951). Определение активности кислой ДНКазы проводили по модифицированному методу Бойда (Бочкова и др., 1982), кислой фосфатазы - по методу Бессея с модификациями (Безбородова, Морозова, 1972), протеолитической активности - по методу Кунитца (Kunitz, 1947), активности малатдегидрогеназы - по Кочетову (Кочетов, 1980). Аналитический диск-электрофорез проводили на колонках полиакриламидного геля (Davis, 1964); обнаружение зон активности кислой ДНКазы в геле осуществляли методом Бойда (Boyd, 1970),

малатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - тетразолиевым методом (Кочетов, 1980).

Субклеточное фракционирование осуществляли методом дифференциального центрифугирования. Препаративное

изоэлектрофокусирование проводили в слое ультрадекса с амфолинами в градиенте рН 3-10 и 4-6. Анализ продуктов гидролиза ДНК кислыми ДНКазами моллюсков осуществляли методом горизонтального электрофореза в 1%-ном агарозном геле с красителем бромистым этидием; изображение визуализировали в ультрафиолетовом свете при длине волны 302 нм. Статистическую обработку результатов проводили по руководству Плохинского (1961),

Результаты и их обсуждение

Результаты проведенных нами экспериментов свидетельствуют, что при действии загрязняющих веществ активность кислых гидролаз печени живородки речной (кислая ДНКаза, кислая фосфатаза, общая протеолитическая активность) претерпевает закономерные изменения, которые носят волнообразный характер. Фазноеть подобных изменений в динамике токсического воздействия наиболее подробно изучена нами на примере сульфата меди (II) и бензина.

Изучение эффекта действия сульфата меди (II) в трех, отличающихся друг от друга на порядок, концентрациях (0.1, 0.01 и 0.001 мг Си2"7л), позволило выявить следующие закономерности. Уже через 3 ч происходят статистически достоверные отклонения активности кислой ДНКазы от контроля под воздействием ионов меди в концентрации 0.1 и 0.01 мг/л, через 6 ч - во всех трех опытных вариантах; на всем протяжении эксперимента активность кислой ДНКазы претерпевает значительные изменения. Обращает на себя внимание однонаправленность изменений энзшатмческой активности в динамике воздействия разных концентраций токсиканта (рис. 1), что является, видимо, отражением адаптационно-компенсаторных процессов, происходящих в организме моллюсков в ответ на интоксикацию.

При воздействии бензина в концентрациях 0.005, 0.05 и 0.5 мг/л после начального периода угнетения (высокие концентрации) или «безразличия» (0,005 мг/л) к 12 ч экспозиции происходит резкий скачок активности кислой ДНКазы до величин, превышающих контрольные значения в три, три с половиной и более чем в семь раз в трех опытных вариантах. После этого наблюдается не менее резкое угнетение активности и падение ее величин ниже контрольного уровня (18-24 ч), сменяющееся повторным ростом к 48 ч. Изменения активности кислой фосфатазы и общей протеолитической активности при воздействии бензина имеют схожую во времени динамику, но менее ярко выражены (рис. 2). Выделим тот факт, что кривые зависимости активности кислой ДНКазы (рис. 1, 2), кислой фосфатазы и протеаз (рис. 2) от продолжительности токсического воздействия имеют форму синусоиды, признанную в практике токсикологии в качестве стандартной и имеющую строгое теоретическое обоснование с точки зрения термодинамики биологических процессов адаптации (Бергер, 1987; Филенко, 1990).

Снижение активности изученных ферментов в первые часы интоксикации (рис. 1, 2) соответствует первой фазе адаптивного ответа организма на стрессовое воздействие, известной как «эффект затаивания». В это время в клетках происходит временное подавление взаимосвязанных процессов синтеза ДНК, РНК и белков и падение интенсивности метаболизма (Голиков, Голиков, 1937). Вторая стадия адаптации тест-организма к токсическому воздействию - фаза активации физиологических и биохимических процессов (Голиков, Голиков, 1987) -характеризуется ростом ферментативной активности кислых гидролаз в печени живородок сверх контрольного уровня (рис. 1, 2). Наблюдаемое нами увеличение активности литических ферментов является, видимо, результатом активации лизосомального аппарата в целом, как одного из инструментов механизма репарации клеточных повреждений. Полагают, что эта реакция является составляющей единого неспецифического адаптационного синдрома клетки, однотипна для всего животного мира и действия разнообразных токсических веществ и других стрессовых факторов (Браун, Моженок, 1987). Если повреждающее воздействие не

250 -1

о а.

а з

§ I

< ч

э4

200 -

159 -

100

50 -

-1-!-1-1-1-1-1-1-1

3 6 12 18 2* 48 72 экспозиция, ч —♦—0,001,ч г,'л —в—0,01 иг/л —А—0,1 мг/л —К—контроль

Рис. 1. Влияние сульфата меди (II) на наивность кислой ДНКазы печени живородки речпой.

800 ч

700

600

500 -

5 а

400

300

200

100 -

3 6 12 18 24 48 72

экспозиция, ч

—♦—кислая фосфатам —»—прогеолитическая активность

—А— кислая ДНКаза И -контроль

Рис. 2. Изменение активности кислых гидролю печени живородки речной при воздействии бензина (0,5мг/л).

превышает адаптационных возможностей организма, фаза стимуляции сменяется серией волнообразных изменений функциональных показателей или продолжается длительное время, завершаясь стабилизацией процессов жизнедеятельности на новом уровне (Голиков, Голиков, 1987; Хлебович, 1981).

Чувствительность исследованных нами ферментов печени живородки речной к действию поллютантов различна. Наиболее выраженные изменения энзиматической активности в результате интоксикации характерны для кислой ДНКазы моллюсков. Напротив, активность НАД+-зависимой мапатдегидрогеназы (МДГ) печени живородок под влиянием тяжелых металлов, бензина, синтетических поверхностно-активных веществ изменяется в небольших пределах, в связи с чем наблюдаемые отклонения во многих опытных вариантах оказываются статистически недостоверными. В целом в динамике токсического воздействия наблюдается тенденция к угнетению активности МДГ подопытных животных, что может указывать на снижение интенсивности аэробного метаболизма в условиях интоксикации.

Вышеперечисленные поллютанты во всех использованных концентрациях не оказали влияния на спектр множественных форм МДГ, выявляемых методом энзим-электрофореза в 5,6%-ном ПААГ, но при этом фермент обнаружил высокую чувствительность к галогенорганическим соединениям. В норме МДГ в печени живородок представлена тремя формами (Р^ 0.38, 0.23 и 0.11). Действие галогенорганических соединений приводит к перераспределению активности между отдельными формами фермента; в ряде вариантов опыта происходит инактивация форм с 0.38 (при действии хлорбензола) и 0.11 ( влияние три- и тетрахлорметана, хлор-, бром-, иодбензола) и в одном случае (под влиянием тетрахлорметана) индукция активности отсутствующих у контрольных моллюсков форм с ЯГ 0.57 и 0.50.

При изучении молекулярной гетерогенности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы живородки речной мы столкнулись с вариабельностью спектров форм этого фермента в норме. В сериях

опытов, проводимых в 1999 и 2000 годах, на энзимограммах у контрольных моллюсков выявлялись соответственно две (Rf 0.40 и 0.30) и одна (Rf 0.40) зоны активности фермента; во втором случае форма с Rf 0.30 являлась «индуцибельной», то есть проявляла активность при действии токсических веществ (хлорпроизводных метана). Под влиянием токсикантов наблюдалась также индукция форм фермента с Rf 0.75 (действие бромбензола) и 0.10 (действие иодбензола).

Исследование состава множественных форм кислой ДНКазы живородок в 7,2%-ном ПААГ показало, что на электрофореграммах ДНКазы в норме выявляются пять зон активности фермента (Rf=0.76, 0.71, 0.33, 0.29, 0.08). Следует отметить, что здесь мы используем термин «формы кислой ДНКазы» исключительно для удобства изложения полученных данных, имея в виду белки, обладающие ДНКазной активностью и характеризующиеся различными значениями Rf в ПААГ. Вместе с тем, по мере изучения свойств (и, прежде всего, субстратной специфичности) «форм» кислой ДНКазы, мы пришли к заключению о существовании в печени данного вида моллюсков целого комплекса ДНКаз, отличающихся по заряду (р!) и молекулярной массе, что и отражается на их электофоретической подвижности.

Присутствие в среде загрязняющих веществ отражается на молекулярной гетерогенности кислой ДНКазы, что выражается в индукции дополнительных, не обнаруживаемых у контрольных моллюсков, зон активности фермента. Так, при воздействии различных концентраций сульфата меди (II) происходит ряд закономерных изменений, которые представлены на рис. 3. Влияние Си2* в динамике по времени и концентрациям характеризуется последовательной активацией/ инактивацией отдельных форм кислой ДНКазы в печени моллюсков, что свидетельствует в пользу адаптивного значения подобных изменений. Видимо, индуцибельные ДНКазы обладают определенными специфическими характеристиками, позволяющими организму реализовыаать адаптационные возможности в стрессовой ситуации токсического воздействия.

Как и при действии сульфата меди, изменения в спектре кислых ДНКаз под влиянием бензина происходят, начиная с 18 ч экспозиции

опыта. К этому моменту набор форм фермента подопытных животных значительно обогащается за счет активации ряда «адаптационных» форм (рис. 3). В дальнейшем, при продолжающемся токсическом воздействии, состав ДНКазного комплекса претерпевает существенные изменения (рис. 3).

При действии фенола отмечается активация кислых ДНКаз с ЯМ=0.65, 0.54 и 0.82 (рис. 3). Влияние различных концентраций синтетических поверхностно-активных веществ к 48-72 ч приводит к активации высокоподвижных «адаптационных» форм (1^ 0.59 и 0.54) во всех опытных вариантах; кроме того, к 72 ч воздействие поллютанта в концентрации 0,04 мг/л приводит к активации формы с РМ 0.41, в концентрации 0,4 мг/л - форм с 0.45 и 0.41. Для действия тяжелых металлов (цинк, железо, кадмий) в целом наиболее характерна активация форм с РУ=0.82, 0.45, 0.41. Присутствие в среде иодбензола приводит к индукции активности форм с 0.65, 0.45 и 0.41, действие хлорбензола - с ИГ 0.65.

Таким образом, по сравнению с общей активностью кислых гидролаз печени живородок, изменения состава кислых ДНКаз носят более специфический характер. Для действия каждого из использованных нами токсикантов характерна собственная, специфическая динамика активации индуцибельных форм ДНКазы живородок. Формирующийся спектр функционирующих форм ДНКазы зависит, видимо, как от природы поллютанта (особенностей его биотоксического эффекта), так и от силы (концентрации и длительности) его травмирующего воздействия.

В дальнейшем нами более детально были изучены свойства отдельных компонентов комплекса кислых ДНКаз печени живородки речной. Соответствующие опыты показали, что в печени данного вида моллюсков комплекс кислых ДНКаз представлен как собственно лизосомальными (ДНКазы 1, 4-9), так и выявляемыми в постлизосомальной фракции (ДНКазы 2,3, 10-12) компонентами (табл.1). По результатам определения активности в субклеточных фракциях, у контрольных моллюсков существенную активность обнаруживают только

1 2 3 1 2 3 1 2 3

0,0 г 0,20,40,6Г 0.811,0.-%

О 0,2

0,4 0,6 0,8 1.0

* ; > = = =

1 2 3

18 24 43 72

в:

с ¡=

г-

С Е

18 24 48 72

Рис. 3. Схемы знзимограмм кислых ДНКаз печени живородки речной. А - воздействие фенола: 1 - 10"5 мг/л; 2 - 10"4 мг/л; 3 - 10 мг/л. Б - воздействие Си2+: 1 - 0,001 мг/л; 2 - 0,01 мг/л; 3 - 0,1 мг/л. В -воздействие бензина: 1 - 0,05 мг/л; 2 - 0,5 мг/л. К - контрольные моллюски. 18, 24, 48, 72 - экспозиция опыта, ч.

вторые. Остальные ДНКазы в норме либо имеют небольшую активность (ДНКазы 1,5, 6, 8, 9), либо вообще не обнаруживаются (ДНКазы 4,7).

Данные по спектрофотометрическому определению суммарной активности кислых ДНКаз в субклеточных фракциях свидетельствуют, что действие фенола (0.02 мг/л, 48 .ч) приводит к активации всего ДНКазного комплекса: в клетках печени происходит рост как удельной, так и общей его активности. В постлизосомальной фракции общая активность комплекса ДНКаз вырастает в 1,3 раза по сравнению с контролем, а суммарно по фракциям органелл - в 2,2 раза, составив 9,4 % от общей активности фермента в клетке (против 5,8 % в контроле). Наибольший прирост активности (более чем в 5 раз) отмечен во фракции клеточных обломков, что может свидетельствовать о нарастании деструктивных процессов в клетках, а, может быть, и о деградации части клеток в результате процессов апоптоза и/или некроза. Наблюдаемый рост нуклеазной активности также может являться следствием активации кислых гидролаз в крупных аутофагосомах и вторичных лизосомах, которыми, видимо, в значительной степени представлена фракция клеточных обломков.

Методом изоэлектрофокусирования нами было проведено препаративное разделение исследуемых ДНКаз. Часть полученных препаратов, содержала индивидуальные ДНКазы, а в некоторых присутствовали по два формы с идентичными величинами р1, но разными значениями в ПААГ. Отдельные компененты ДНКазного комплекса обнаружили выраженные отличия в предпочтении атакуемых субстратов (табл. 1). Так, ДНКазы 1, 2, 3 гидролизуют преимущественно денатурированную ДНК. ДНКазы 8, 9,10, 11 проявляют гораздо большее сродство к нативной ДНК. ДНКазы 4, 5,6 не обнаружили предпочтений в предложенных субстратах. Наиболее интересные данные получены по ДНКазе 12: фермент слабоактивен в отношении экзогенной ДНК (ДНК из эритроцитов цыплят), но энергично атакует эндогенную ДНК, выделенную нами из тканей моллюсков, что позволяет предположить существование в ДНК живородок особо чувствительных к нуклеазной атаке участков (сайтов) и высокое сродство к ним со стороны данной ДНКазы.

Таблица 1.

Некоторые характеристики кислых ДНКаз из клеток печени живородки речной.

Кислые ДНКазы Субклеточная локализация фермента р1 фермента Активность в отношении различных субстратов, единиц

экзогенная ДНК, денатурир. экзогенная ДНК, нативная эндогенная ДНК, нативная

1 лиз, пит* 0,82 4,3 0,046 0,008 0,000

2 цит, лиз 0,76 "4,5 0,169 0,029 0,000

3 них, лиз 0,71 4,5

4 лиз* 0,65* 5,4* 0,037* 0,033* 0,047*

5 лиз 0,59 5,1 0,155 0,167 0,248

б лиз 0,54 5,1

7 лиз* 0,51* - - - -

8 лиз 0,45 5,3 0,030 0,111 0,181

9 лиз 0,41 5,3

10 шгт, лиз 0,33 5,5 0,036 0,141 0,263

11 цит, лиз 0,29 5,4

¡2 ЦИТ,лиз 0,08 4,7 0,021 0,012 0,231

Примечание к табл. I. лиз - лизосомальнм фракция; цит - постлизосомзльная фракция; *- определено в ситуации токсического воздействия;--не определено.

В заключение нами были изучены особенности действия различных компонентов комплекса ДНКаз на эндогенную ДНК. В этих опытах выделенную из тканей живородок ДНК подвергали воздействию частично очищенных препаратов ДНКаз и продукты ее гидролиза анализировали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Оказалось, что при суммарном действии ДНКаз 1, 2, 3 наблюдается последовательное уменьшение молекулярной массы атакуемой ДНК, вплоть до деградации ее до фрагментов, не выявляемых используемым

методом (менее 100 п.н.). В то же время, расщепление ДНК ДНКазами 2 и 3, развиваясь по схожему сценарию, останавливается на стадии фрагментов размером около 100 п.н., что наблюдается даже в ситуации избыточного по времени гидролиза (6 ч). Выявленные отличия не связаны с общей ферментативной активностью в используемых экстрактах, так как во втором случае она была выше. При действии препарата ДНКазы 1 наблюдается постепенное медленное уменьшение молекулярной массы гидролизуемой ДНК без накопления фиксированных по размерам полинуклеотидных фрагментов, характерного для действия ДНКаз 2, 3. Наблюдаемые отличия в характере деструкции предложенного субстрата могут указывать на проявление ДНКазой 1 экзонуклеазной активности в отношении эндогенной ДНК.

Деструкция ДНК ДНКазой 4 приводит, как и в случае действия ДНКаз 2 и 3, к накоплению продуктов размером примерно 100 п.н. Напротив, суммарное действие ДНКаз 5 и 6 имеет исчерпывающий эндонуклеазный характер. Продуктами ступенчатой деградации ДНК ДНКазами 8,9 и 10,11 являются полинуклеотидные фрагменты длиной около 200 п.н. Накопление продуктов деструкции ДНК строго фиксированного размера указывает на возможность атаки этими ДНКазами регулярных участков структуры ДНК, свободных от белков. Как известно, такими участками могут быть межнуклеосомные последовательности линкерной ДНК, атакуемые ДНКазами, участвующими в апоптозе (Самуилов, 2000).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в печени данного вида моллюсков существует целый комплекс каталитически активных белков, обладающих ДНКазной активностью, которые различаются по локализации в клетке и физико-химическим свойствам. ДНКазы 2, 3, 10, 11, 12, на которые в норме приходится основная доля суммарной активности кислой ДНКазы в клетке, способны к эффективному гидролизу ДНК различного происхождения и структурного состояния (эндо- и экзогенной, нативной и денатурированной). Активируемые при действии различных токсических веществ «адаптационные» (лизосомальные) ДНКазы, видимо, играют

t с

* J

существенную роль в стрессовой ситуации, обеспечивая пластичность метаболизма и должный уровень протекания обменных процессов. Так, ДНКазы 5 и 6, проявляющие высокую активность в отношении всех испытанных субстратов, могут играть заметную роль в процессах аутолиза, ауто- и гетерофагии. Более эффективной и быстрой деградации ДНК, вовлечению в обмен резервного пластического материала в ситуации токсического воздействия может способствовать индукция активности ДНКазы 1, обладающей иным (возможно, экзонуклеазным) способом воздействия на ДНК. Возможно, некоторые «адаптационные» формы ДНКазы дублируют действие высокоактивных в норме форм фермента, оказываясь, например, более устойчивыми на молекулярном уровне к действию токсических веществ (или обладая иными особенностями, адекватными изменившимся условиям). Так, ДНКаза 4 проявляет значительное сходство в действии на эндогенную ДНК с ДНКазами 2 и 3, но, в отличие от последних, не имеет выраженных предпочтений в атакуемых субстратах (см. табл. 1). Активируемые токсикантами ДНКазы 8, 9 практически не отличаются от ДНКаз 10, 11 по субстратной специфичности (см. табл. 1) и действию на эндогенную ДНК. Возможно, активация ДНКаз 8 и 9, которые расщепляют ДНК моллюсков до фрагментов длиной около 200 п.н. (размер нуклеосом), указывает на их участие в процессе апоптоза клеток печени.

Выводы

1. Воздействие in vivo широкого спектра токсических веществ (тяжелые металлы, фенол, бензин, синтетические поверхностно-активные вещества, галогенпроизводные бензола) вызывает в различной степени выраженные изменения активности кислой ДНКазы, кислой фосфатазы и общей протеолитической активности в печени живородки речной. Реакция гидролитических ферментов на интоксикацию имеет фазный характер, совпадающий со стадиями адаптационного синдрома, и однотипна в отношении различных загрязняющих веществ, что свидетельствует о развитии в организме моллюсков процессов неспецифической адаптации.

2. Чувствительность исследованных ферментов к действию токсикантов in vivo возрастает в ряду: малатдегидрогеназа-протеазы-кислая фосфатаза-кислая ДНКаза, что позволяет рассматривать кислую ДНКазу в качестве наиболее яркого маркера токсического воздействия на моллюсков.

3. Воздействие галогенорганических соединений приводит к выраженным изменениям в спектрах множественных форм НАД+-зависимой малатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы печени живородок, что проявляется в инактивации одних и индукции активности других, неактивных в контроле, форм. В то же время, низкая чувствительность малатдегидрогеназы моллюсков к действию других токсикантов и вариабельность электорофоретических спектров форм глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в норме не позволяют рассматривать реакции изученных дегидрогеназ в качестве надежного показателя присутствия в среде загрязняющих веществ.

4. При содержании в среде с токсикантами у речных живородок происходит активация «адаптационных» кислых ДНКаз, слабоакгивных или латентных в норме. При действии пороговых и подпороговых концентраций различных токсикантов к 24-48 часам в печени животных формируется определенный спектр белков, обладающих ДНКазной активностью, что создает предпосылки не только для обнаружения, но и для идентификации отдельных групп токсикантов. Напротив, отсутствие изменений в электрофоретических спектрах может трактоваться как свидетельство приемлемого качества воды.

5. Кислая ДНКаза в печени данного вида моллюсков существует в виде комплекса каталитически активных белков, различающихся по физико-химическим свойствам (величине pl, электрофоретической подвижности, субстратной специфичности) и локализации в клетке. В норме основная доля суммарной активности кислых ДНКаз в клетке сосредоточенна в постлизосомальной фракции; в ситуации токсического воздействия происходит выраженная активация лизосомальных кислых ДНКаз.

6. Выделенные с помощью метода препаративного изоэлектрофокусирования различные компоненты комплекса ДНКаз проявляют существенные отличия в действии на эндогенную ДНК моллюсков, расщепляя ее до полинуклеотидных фрагментов, имеющих различные, а в некоторых случаях строго фиксированные, размеры. Активируемые токсикантами ДНКазы с изоэлектрической точкой 5,3 расщепляют ДНК моллюсков до фрагментов 200 п.н., что указывает на возможность их участия в процессе апоптоза клеток печени.

7. Обладающий широкими возможностями воздействия на ДНК комплекс кислых ДНКаз способен к эффективной деструкции как эндогенной, так и экзогенной ДНК, и может играть существенную роль в регуляции обмена ДНК как в норме, так и в условиях токсического воздействия.

8. Комплекс кислых ДНКаз печени живородки речной в перспективе может использоваться в качестве маркера присутствия в воде пороговых и подпороговых концентраций загрязняющих веществ. Высокая гетерогенность и чувствительность кислых ДНКаз позволяет диагностировать токсическое воздействие на организм по энзим-электрофоретическим спектрам, являясь качественным показателем интоксикации моллюсков. Особенно перспективным представляется использование этой тест-функции применительно к определенным видам загрязнений (нефтепродуктами, фенолом).

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Иванов В.Г., Шеленков И.В., Гаверова Ю.Г., Гева О.Н., Попов А.П., Коничева А.П. Влияние хлорорганических экотоксикантов на множественные формы дегидрогеназ живородки речной Viviparus viviparus L. //Деп. в ВИНИТИ 09.11.2000, № 2818-ВОО. 18 с. 1,2 п.л., авторских 20%.

2. Иванов В.Г., Шеленков И.В., Гаверова Ю.Г., Гева О.Н., Попов А.П., Коничев A.C. Влияние хлорпроизводных метана на множественные формы гидролаз живородки речной // Деп. в ВИНИТИ 09.11.2000, № 2819-ВОО. 17с. 1,1 п.л., авторских 20%.

3. Попов А.П., Коничев A.C. Влияние различных токсикантов на спектр множественных форм кислой ДНКазы речной живородки (Viviparus viviparus L.) // Научн. труды МПГУ. Серия: Естественные науки. М. 2000. С. 254-256.0,2 п.л., авторских 70%.

4. Попов А.П., Коничев A.C. Влияние хлорида меди (II) на активность и набор множественных форм кислой ДНКазы речной живородки (Viviparus viviparus L.) // Научн. труды МПГУ. Серия: Естественные науки. М. 1999. С. 323-325. 0,2 п.л., авторских 70%.

5. Цветков И.Л., Попов А.П., Коничев A.C., Урванцева Г.А. Влияние хлорида кадмия на активность фосфатазного комплекса моллюсков // Научн. труды МПГУ. Серия: Естественные науки. М. 1998. С. 242-243. 0,2 п.л., авторских 40%.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Попов, Алексей Петрович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Проблема нормирования загрязнения вод.

1.2. Оценка токсичности воды по биологическим показателям.

1.3. Применение методов биотестирования в практике охраны вод.

1.4. Биологические методы анализа качества вод.

1.5. Энзимодиагностика загрязнений.

1.6. Множественные формы ферментов как показатели токсичности воды.

1.7. Выбор тест-объектов и тест-функций для токсикологических исследований.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.г.

2.1.1. Особенности биологии экспериментальных животных.

2.1.2. Сбор материала, содержание моллюсков в лабораторных условиях и схемы токсикологических экспериментов.

2.2. Методы.

2.2.1. Подготовка биологического материала и экстракция белков.

2.2.2. Спектрофотометрическое определение активности ферментов.

2.2.3. Выявление множественных форм ферментов методом энзим-электрофореза.

2.2.4. Гель-фильтрация.

2.2.5. Субклеточное фракционирование.

2.2.6. Препаративное изоэлектрофокусирование.

2.2.7. Выделение ДНК из тканей живородки речной.

2.2.8. Анализ продуктов гидролиза эндогенной ДНК моллюсков.

2.2.9. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Изменение активности ферментов печени живородки речной под воздействием различных токсикантов.

3.1. Определение оптимальных параметров для обнаружения активности исследуемых ферментов.

3.2. Влияние тяжелых металлов на активность малатдегидрогеназы и кислых гидролаз печени живородки речной.

3.2.1. Действие тяжелых металлов на гидролазы печени живородки речной.

3.2.2. Влияние тяжелых металлов на активность малатдегидрогеназы моллюсков.

3.2.3. Реакция лизосомального аппарата на токсическое воздействие.

3.3. Изменение активности ферментов живородки речной в динамике токсического воздействия бензина. Общие закономерности реагирования ферментных систем организма на интоксикацию.

3.4. Влияние различных концентраций синтетических поверхностно-активных веществ и фенола на активность литических ферментов моллюсков.

3.5. Гидролазы живородки речной: влияние галогенпроизводных бензола. Чувствительность тест-ферментов к токсическому загрязнению воды.

Глава 4. Множественные формы малатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы печени живородки речной и влияние на их активность галогенорганических соединений.

Глава 5. Влияние токсических веществ на множественные формы кислой ДНКазы печени живородки речной.

5.1. Изменение спектра форм кислой ДНКазы моллюсков в результате интоксикации солями тяжелых металлов.

5.2. Влияние бензина на молекулярную гетерогенность кислой ДНКазы в печени живородок.

5.3. Множественные формы кислой ДНКазы живородки речной как показатели токсического воздействия на организм.

Глава 6. Комплекс кислых ДНКаз печени живородки речной: молекулярная гетерогенность, субклеточная локализация, особенности действия на эндогенный и модельный субстраты.

6.1. Субклеточная локализация кислых ДНКаз.

6.2. Разделение кислых ДНКаз.

6.3. Особенности действия кислых ДНКаз печени живородки на

Введение Диссертация по биологии, на тему "Множественные формы ферментов живородки речной как маркеры токсического загрязнения воды"

Последнее положение было положено в основу нашей работы. Мы исходили из того, что для обнаружения токсикантов особенно полезным было бы иметь качественные характеристики биохимических изменений в тест-объекте. Такими качественными показателями могут быть прежде всего множественные формы ферментов, осуществляющие тонкую настройку обменных процессов в условиях адаптации к изменяющимся условиям среды. Естественно, что предпочтение следовало отдать высокоактивным ферментам, контролирующим принципиально важные метаболические процессы, для которых отра'ботаны надежные приемы анализа изоформ. Поэтому наш выбор пал на кислую ДНКазу - один из центральных ферментов обмена нуклеиновых кислот, а также на НАД+-зависимую малатдегидрогеназу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, принадлежащим к важнейшим ферментам углеводного обмена.

Объектом наших исследований являлся пресноводный моллюск живородка речная. Отметим, что моллюски еще не стали классическими объектами ни в водной токсикологии, ни в экологической биохимии, хотя результаты ранее опубликованных работ (Горомосова и др., 1987; Короленко и др., 1984; Цветков и др., 1997) свидетельствуют о том, что в процессе токсического воздействия в организме моллюсков происходят закономерные перестройки обмена веществ, что отражается на уровне активности и молекулярной гетерогенности их ферментов. Ограниченность пространственных перемещений и встречаемость речной живородки практически в любых водоемах, вне зависимости от силы антропогенной нагрузки (Брагинский, 1977), позволяют рассматривать данный вид как обладающий широким адаптивным потенциалом к гидрохимическому режиму. Широкая распространенность живородок в гидробиоценозах любого ранга, простота сбора и содержания в лабораторных условиях обусловливают доступность и легкость искусственного культивирования этих моллюсков. На основании вышеизложенного изучение энзиматических реакций живородки речной на токсическое воздействие представляется вполне обоснованным и перспективным.

1. Определить активность и состав множественных форм НАД+-зависимой малатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, кислой ДНКазы, а также активность протеаз и кислых фосфатаз в норме у живородки речной.

4. Сопоставить возможность и целесообразность использования удельной активности и наборов активных форм ферментов в качестве маркерных биохимических показателей загрязнения водной среды исследованными токсикантами. 5. Провести выделение и осуществить физико-химическую и функциональную характеристику множественных форм наиболее перспективного в плане биохимического тестирования воды фермента моллюсков.

Научная новизна работы. Впервые изучены наборы множественных форм НАД+-зависимой малатдегидрогеназы, глюкозо-6фосфатдегидрогеназы и комплекс кислых ДНКаз печени живородки речной в норме и в условиях токсического воздействия.

Практическое значение работы. Результаты работы обосновывают целесообразность проведения анализов по энзимодиагностике загрязнения вод с использованием в качестве тест-функций множественных форм ферментов. Кислая ДНКаза печени живородки речной может быть рекомендована для обнаружения в воде ряда токсических веществ в концентрациях на уровне ПДК и ниже. 8

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, посвященного современному состоянию биомониторинга и биотестирования качества вод; описания объекта и методов исследования; четырех глав, посвященных изложению и обсуждению полученных экспериментальных данных, заключения и выводов. Работа изложена на 171 странице машинописного текста, включает 36 рисунков и 34 таблицы. Список цитируемой литературы включает 206 названий, из которых 34 работы на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Попов, Алексей Петрович

Выводы

4. При содержании в среде с токсикантами у речных живородок происходит активация «адаптационных» кислых ДНКаз, слабоактивных или латентных в норме. При действии пороговых и подпороговых концентраций различных токсикантов к 24-48 часам в печени животных формируется определенный спектр белков, обладающих ДНКазной активностью, что создает предпосылки не только для обнаружения, но и для идентификации отдельных групп токсикантов. Напротив, отсутствие изменений в электрофоретических спектрах может трактоваться как свидетельство приемлемого качества воды.

6. Выделенные с помощью метода препаративного изоэлектрофокусирования различные компоненты комплекса ДНКаз проявляют существенные отличия в действии на эндогенную ДНК моллюсков, расщепляя ее до полинукпеотидных фрагментов, имеющих различные, а в некоторых случаях строго фиксированные, размеры. Активируемые токсикантами ДНКазы с изоэлектрической точкой 5,3 расщепляют ДНК моллюсков до'фрагментов 200 п.н., что указывает на возможность их участия в процессе апоптоза клеток печени.

Заключение

В заключение еще раз остановимся на перспективах использования биохимических реакций живородки речной для констатации загрязнения воды. Широкая распространенность живородок в гидробиоценозах любого ранга, простота сбора и содержания в лабораторных условиях обусловливают их доступность и легкость искусственного культивирования. Ограниченность пространственных перемещений и встречаемость практически в любых водоемах, вне зависимости от силы антропогенной нагрузки [Брагинский, 1977; Строганов, 1973], позволяет рассматривать данный вид моллюсков как обладающий широким адаптивным потенциалом к гидрохимическому режиму. Принадлежность моллюсков к организмам, в адаптации которых к изменяющимся условиям окружающей среды ведущую роль играют процессы, происходящие на уровне тканевого й клеточного метаболизма [Хлебович, Бергер, 1975], делает их особенно перспективными для целей именно биохимического тестирования загрязнения вод. Результаты нашей и ряда опубликованных ранее работ [Горомосова и др., 1987; Короленко и др., 1981, 1984; Маляревская, Карасина, 1985; Федорова и др., 1981; Цветков и др., 1997] свидетельствуют о том, что в процессе токсического воздействия в организме моллюсков происходят закономерные перестройки обмена веществ, что отражается на уровне активности и молекулярной гетерогенности ферментов. Чувствительность исследованных нами ферментов печени живородки речной к действию поллютантов различна. На основании этого показателя в качестве наиболее перспективного маркера токсического загрязнения воды нами предлагается кислая ДНКаза изученных моллюсков.

Построенные нами кривые зависимости активности кислой ДНКазы от концентрации токсикантов и продолжительности их действия полностью соответствуют тем, которые признаны стандартными в практике токсикологии, и, следовательно, являются проявлением «неспецифических» адаптационных процессов, единообразных в животном мире для токсического воздействия любой природы. Таким образом, достоверное отклонение величины активности кислой ДНКазы подопытных моллюсков от контрольных с высокой долей уверенности можно считать свидетельством интоксикации и присутствия в тестируемой воде загрязняющих веществ.

В то же время фазность токсического эффекта делает возможным ситуацию, когда на момент измерения активность фермента в опытном варианте приблизится к контрольной, что должно было бы свидетельствовать об отсутствии интоксикации. Отсюда возникает необходимость проведения наблюдений в динамике по времени и концентрациям. Кроме того, существенной проблемой является интерпретация полученных результатов (определение нормы, значимость наблюдаемых отклонений и т.д.).

В этом отношении множественные формы ферментов могут оказаться более показательной характеристикой интоксикации. Кислая ДНКаза изученных моллюсков обнаруживает, с одной стороны, стабильность характеристик в норме (в отличие от Г-6ФДГ), благодаря чему не затруднено само определение нормы, с другой стороны -возможность изменения состава активных форм при действии токсикантов. Наличие молекулярной гетерогенности кислой ДНКазы, легко обнаруживаемой в печени живородок, позволяет диагностировать токсическое воздействие на организм по числу форм фермента визуально, не имея аппаратуры для количественной обработки энзимограмм.

Полученные нами результаты позволяют предположить, что кислая ДНКаза живородки речной обладает достаточной чувствительностью к токсическому воздействию любой природы. Все использованные нами поллютанты - представители основных групп экотоксикантов - в концентрациях на уровне ПДК вызывали достоверные изменения общей активности энзима и почти все - в спектре множественных форм фермента. Анализ наблюдаемых изменений свидетельствует о перспективности использования для тестирования загрязнений воды показателей активности и молекулярной гетерогенности кислой ДНКазы живородок при 24- и 48-мичасовой экспозиции опыта, обеспечивающей оптимальное сочетание оперативности и информативности. Полученные нами данные свидетельствуют, что через 24-48 ч токсического воздействия достаточной силы в клетках печени тест-моллюсков происходят закономерные перестройки состава функционирующих изоформ кислой ДНКазы. В то же время, динамика развития адаптационных процессов в организме подопытных животных приводит к тому, что при действии высоких концентраций поллютантов к 72-96 ч экспозиции может наблюдаться полная или почти полная инактивация адаптационных форм энзима (рис. 5.1, 5.4, 5.5). С другой стороны, при действии достаточно высоких концентраций различных -загрязнителей к 24 и/или 48 ч эксперимента в печени подопытных моллюсков формируется определенный, специфический для каждого вещества, спектр форм данного тест-фермента, что создает предпосылки не только для обнаружения, но и для идентификации отдельных групп токсикантов. Конкретные спектры индуцибельных форм кислой ДНКазы живородок, не повторяющиеся при действии других поллютантов, для Си2+ составляют формы с 0.82, 0.59 и 0.54, для других использованных металлов -0.82, 0.45, 0.41, для фенола - 0.82, 0.65, 0.54, для СПАВ - 0.59 и 0.54, для бензина - 0.82, 0.65, 0.59, 0.54, 0.45, 0.41 (рис. 5.1 - 5.6). Полное или почти полное отсутствие изменений в электрофоретических спектрах кислой ДНКазы через 24-48 ч экспозиции свидетельствует, видимо, о приемлемом качестве воды. Так, судя по значительным изменениям активности кислых гидролаз подопытных моллюсков, речные живородки высокочувствительны к фенолу. Воздействие токсиканта в концентрации, составляющей 1/100 от предельно-допустимой, приводит к выраженным изменениям состава изоформ кислой ДНКазы к 72 ч экспозиции (рис. 5.5). Но для целей биотестирования представляет интерес обнаружение в воде загрязняющих веществ в концентрациях, близких к ПДК, оказывающих выраженный токсический эффект на гидробиоценозы в целом. В концентрациях не ниже 1/10 от ПДК фенол тестируется по выраженному изменению состава множественных форм кислой ДНКазы живородок к 24-48 ч действия (рис. 5.3, 5.5).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попов, Алексей Петрович, Москва

1. Айвазова Л.Е., Соколова С.А., Ткаченко В.Н. Исследование токсичности сточных вод иодбромного производства // Биотестирование природных и сточных вод. М.: Легкая и пищев. пром. 1981. С. 51-57.

2. Асатиани B.C. Ферментные методы анализа. М.: Наука. 1969.

3. Афанасьев Ю.И., Ноздрин В.И. Возможная роль лизосом в стресс-реакции клетки // Структура и функции лизосом. Тез. докл. Междунар. симпозиума. М. 1976. С. 30-32.

4. Ахмедов A.A., Серопова Н.С. Оценка детоксикации перметрина в водной среде по активности сукцинатдегидрогеназы в печени рыб // V Всесоюзная конференция по водной токсикологии (Одесса, 18-22 апреля 1988 г.). Тез. докл. М. 1988.С. 99-100.

5. Бейм A.M. Эколого-токсикологические исследования сточных вод целлюлозно-бумажной промышленности // Физиология и токсикология гидробионтов. Ярославль: Яросл. ун-т. 1988. С. 77-83.

6. Бергер В.Я. Методологические аспекты изучения адаптивных явлений // Вопросы теории адаптации. Труды Зоол. ин-та АН СССР. Л. 1987. Т. 160. С. 13-30.

7. Бергер В.Я., Пахомов А.Н., Мухленков А.Г. Исследование состава изозимов эстераз и лактатдегидрогеназы при адаптации моллюска Littorina littorea к изменениям солености среды //Журн. общ. биол. 1975. Т. 36. № 4. С. 579-584.

8. Бергер В.Я., Харазова А.Д. Исследование субстанциональных изменений и синтеза белка в процессе адаптации некоторых беломорских моллюсков к пониженной солености среды // Цитология. 1971. Т. 13. № 10. С. 1299-1303.

9. Бердышев Г.Д., Бабенюк Ю.Д. Нуклеазы рыб и их изменения в постнатальном онтогенезе // Нуклеазы. Биологическая роль и практическое использование. Киев: Наукова думка. 1985. С. 77-103.

10. Ю.Биргер Т.И. Метаболизм водных беспозвоночных в токсической среде. Киев: Наукова думка. 1979. 190 с.

11. И.Бочкова А.П., Филиппович Ю.Б., Коничев A.C. Выделение, очистка и свойства кислой дезоксирибонуклеазы грены тутового шелкопряда // Биохимия. 1982. Т. 47. Вып. 3. С. 489-496.

12. Брагинский Jl.П. Биологические тесты как метод индикации токсичности водной среды // Пробл. анал. химии. 1977. Т. 5. С. 27-38.

13. Брагинский Л.П. О некоторых принципах подбора тест-объектов в исследованиях по водной токсикологии // Критерий токсичности и принципы методик по водной токсикологии (Известия Гос. НИИ оз. и реч. рыб. х-ва. Т. 78). М.: Изд. МГУ. 1971. С. 172-182.

14. Брагинский Л.П. Эколого-токсикологический скриннинг как метод предотвращения загрязнения вод токсическими продуктами нового синтеза // Проблемы сохранения, защиты и улучшения качества природных вод. М.: Наука. 1982. С. 164-171.

15. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука. 1987. 232 с.

16. Брызгало В.А. Гидробиологические методы в мониторинге качества вод // II Всесоюзная школа по экологической химии водной среды (Ереван, 11-14 мая 1988 г.). М.: ИХФАН СССР. 1988. С. 138-151.

17. Бурдин К., Поляков Е. Металлотионеины, их строение и функции // Усп. совр. биол. 1987. ТЮЗ. Вып. 3. С. 390-400.

18. Бурковский А.Л. Биологический контроль сточных вод на промышленном предприятии // Критерий токсичности и принципы методик по водной токсикологии (Известия Гос. НИИ оз. и реч. рыб х-ва. Т. 78). М.: Изд. МГУ. 1971. С. 256-259.

19. Бурковский А.Л. Разработка метода эффективного биоконтроля сточных вод промышленного предприятия // Проблемы водной токсикологии. Петрозаводск. 1975. С. 246-249.

20. Васильев A.C. Коллоидальная устойчивость сывороточных белков у осетровых рыб в норме и при расслоении мышечной ткани // Второй симпозиум по экологической биохимии рыб (Ростов Великий, декабрь 1990). Тез. докл. Ярославль. 1990. С. 31-33.

21. Веселов Е.А. Биологическая оценка промышленных стоков целлюлозно-бумажного производства // Проблемы водной токсикологии. Петрозаводск. 1975. С. 195-197.

22. Винберг Г.Г. Общегидробиологическая основа санитарно-гидробиологических исследований // Биологическое самоочищение и формирование качества воды. М. 1975. С. 5-9.

23. Волков И.В., Заличева И.Н., Ганина B.C., Ильмаст Т.Б., Каймина Н.В., Мовчан Г.В., Шустова Н.К. О принципах регламентирования антропогенной нагрузки на водные экосистемы // Вод. ресурсы. 1993. Т. 20. № 6. С. 707-713.

24. Волков И.В., Заличева И.Н., Каймина Н.В., Ганина B.C., Мовчан Г.В. Региональные особенности токсикорезистентности гидробионтов и система токсобности // Экспериментальная водная токсикология. Рига: Зинатне. 1990. Вып. 14. С. 225-231.

25. Волков И.В., Заличева И.Н., Моисеева В.П., Самылин А.Ф., Харин В.Н. Региональные аспекты водной токсикологии // Вод. ресурсы. 1997. Т. 24. № 5. С. 556-562.

26. Воскресенский К.А. , Митин A.B. Спектры изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) нимф поденок и веснянок при действии сточных вод // Самоочищение и биоиндикация загрязненных вод. М.: Наука. 1980. С. 71-74.

27. Врочинский К.К., Щербаков Ю.А. Оценка действия веществ на водные организмы с учетом фазности токсичности // Теоретические проблемы водной токсикологии. Норма и патология. М.: Наука,-1983. С. 36-41.

28. Высоцкая Р.У. О влиянии смоляных кислот на активность лизосомальных ферментов в опытах in vivo и in vitro // Экологическая физиология и биохимия рыб. Тез. докл. IV Всесоюз. конфер. Астрахань. 1979. Том 1. С. 71-72.

29. Высоцкая Р.У., Богдан В.В., Руоколайнен Т.Р. Сравнительное изучение активности лизосомальных ферментов в печени, сердечной и скелетной мышцах некоторых рыб // Сравнительная биохимия рыб и гельминтов. Петрозаводск. 1977. С.35-39.

30. Высоцкая Р.У., Крупнова М.Ю., Мигаловский И.П. Ферменты лизосом в раннем развитии сига: влияние ионов цинка // Реакция гидробионтов на абиотические воздействия (к разработке теоретических основ биотестирования). Ярославль: Яросл. ун-т. 1984. С. 54-60.

31. Высоцкая Р.У., Руоколайнен Т.Р., Болотников И.А. Изменение активности лизосомальных ферментов у кур под влиянием температурного фактора // Экологическая биохимия животных. Петрозаводск. 1978. С. 109-114.

32. Высоцкая Р.У., Руоколайнен Т.Р., Сидоров B.C. Влияние различных концентраций фенола на активность лизосомальных ферментов печени животных // Сравнительная биохимия рыб и их гельминтов. Петрозаводск. 1977. С. 73-77.

33. Высоцкая Р.У., Руоколайнен Т.Р., Чеченков A.B. Изучение активности кислой фосфатазы у молоди лосося при разных условиях выращивания // Биохимия пресноводных рыб Карелии. Петрозаводск. 1980. С. 41-47.

34. Высоцкая Р.У., Сидоров B.C., Руоколайнен Т.Р. К вопросу о значении исследования лизосом для экологической физиологии и биохимии рыб // Экологическая физиология рыб. Тез. докл. Ill Всесоюз. конфер. Ч. 1. Киев. 1976. С.132-134.

35. Голиков А.Н., Голиков Н.В. Угнетение и стимуляция как фазы процесса адаптации // Вопросы теории адаптации. Труды Зоол. ин-та АН СССР. Л. 1987. Т. 160. С. 4-12.

36. Горомосова С.А. Элементы углеводного обмена у мидий в норме и при воздействии ядов // Биологические основы борьбы с обрастанием. Киев: Наукова думка. 1973. С. 133-154.

37. Горомосова С.А., Миловидова Н.Ю., Таможняя В.А., Шапиро А.З. Некоторые эколого-биохимические показатели устойчивости моллюсков к загрязнению // Гидробиол. журн. 1987. Т. 23. № 1. С. 61-66.

38. Государственный доклад "О состоянии' окружающей природной среды Российской Федерации в 1995 году". М. 1996. 452 с.

39. Груздев А.И., Касаткина C.B. Активность изоферментов лактатдегидрогеназы икры сигов, развивающейся при повышенных концентрациях ионов цинка иникеля // Сравнительная биохимия водных животных. Петрозаводск: Карел, филиал АН СССР. 1983. С. 134-140.

40. Груздев А.И., Сидоров B.C. Регуляция гликолиза изоферментами лактатдегидрогеназы в тканях радужной форели при влиянии абиетиновой кислоты // Физиология и биохимия гидробионтов. Ярославль. Яросл. ун-т. 1987. С. 12-18.

41. Гусев А.Г. Биологические основы нормирования в охране рыбохозяйственных водоемов от загрязнения // Критерий токсичности и принципы методик по водной токсикологии (Известия Гос. НИИ оз. и реч. рыб. х-ва. Т. 78). М.: Изд. МГУ. 1971. С. 29-42.

42. Данильченко О.П., Бузинова Н.С., Колоносова Л.Б. Оценка действия оловоорганических соединений по функциональному состоянию моллюсков // Гиробиол. журн. 1985. Т. 21. № 5. С. 94-97.

43. Дедков Ю.М. Состояние и проблемы аналитики сточных вод // Вод. ресурсы. 1980. № 3. С. 149-159.

44. Дин Р. Процессы распада в клетке / Пер. с англ. М.: Мир. 1981. 120 с.

45. Дохолян В.К., Ахмедова Т.П., Костров Б.П., Коваленко Л.Д., Шлейфер Г.С. Влияние компонентов буровых растворов на некоторые виды рыб // Сб. науч. тр. Гос. НИИ оз. и реч. рыб. х-ва. 1993. Вып. 335. С. 105-111.

46. Емельяненко В.В., Крайнюкова А.Н. Способ биологической оценки токсичности воды / А. с. 1144203, СССР, МКИ А 01К61/00, 01 № 33/18 // опубл. 15.09.89. Бюл. № 34.

47. Жизнь животных: В 7-и томах / Под ред. В.Е. Соколова. М.: Просвещение. 1983.

48. Израэль Ю.А. Экология и контроль состояния природной среды. М.: Гидрометеоиздат. 1984. 560 с.

49. Каминский B.C. Современные проблемы нормирования качества поверхностных вод // Вод. ресурсы. 1980. № 3. С. 160-168.

50. Каплин В.Т. Превращение органических веществ в природных водах // Автореф. дисс. .д-ра хим. наук. Иркутск. 1973. С. 46.

51. Карасина Ф.М. Влияние тяжелых металлов и синтетических поверхностно-активных веществ на физиолого-биохимические показатели пресноводных беспозвоночных//Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Киев. 1986. 20 с.

52. Кирпичников B.C. Генетика и селекция рыб. П.: Наука. 1987. 520 с.

53. Козловская В.И., Флеров Б.А. Фосфорорганические пестициды и их опасность для водных животных // Теоретические вопросы водной токсикологии. П.: Наука. 1981.С. 77-87.

54. Козловская В.И., Волкова Т.В., Комов В.Т. Холинэстераза нервных ганглиев и водный обмен у Limnaea stagnalis при интоксикации хлорофосом // Биология внутренних вод. Информ. бюл. Л.: Наука. 1982. № 55. С. 49-51.

55. Козловская В.И., Новичкова Н.С., Флеров Б.А. Изменение белкового состава сыворотки крови карпа при отравлении хлорофосом и полихлорпиненом // Физиология и паразитология пресноводных животных. Л. 1979. С. 42-49.

56. Козловская В.И., Чуйко Г.М., Мензикова О.В., Подгорная В.А. Энзиматический метод определения в воде фосфорорганичёских пестицидов и их метаболитов // Биология внутренних вод. Информ. бюл. СПб.: Наука. 1996. № 100. С. 65-72.

57. Колупаев Б.И. Использование метода определения функционального состояния гаммарид для биотестирования вод // Гидрохим. материалы. 1984. Т. 89. С.8-11.

58. Колупаев Б.И. О критериях физиологической нормы гидробионтов // Теоретические проблемы водной токсикологии. М.: Наука. 1983. С. 138-141.

59. Колупаев Б.И. Чувствительность тест-функций как основа для выбора биотестов на токсичность водной среды // Гидробиол. журн. 1989. Т. 25. № 5. С. 52-54.

60. Кондратьева Е.А. Характеристика токсичности сточных вод сульфатцеллюлозного производства на разных этапах очистки // Проблемы водной токсикологии. Петрозаводск. 1975. С. 209-211.

61. Коробова J1.H. Стадии адаптивного процесса у микроводорослей при действии циклогексана // Биол. науки. 1988. № 11. С. 68-72.

62. Короленко П.И. К вопросу терминологии в области водной токсикологии // Гидрохим. материалы. 1981. Т.82. С. 25-33.

63. Короленко Т.А. Биохимические аспекты лизосомотропизма. Новосибирск: Наука. 1983. 118 с.

64. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа. 1980. 272 с.

65. Кравченко М.С., Собина H.A. Аналитический контроль природных и сточных вод. Проблемы и перспективы //Тез. докл. I респ. конф. по аналит. химии (Киев, 16-18 октября 1979 г.). Киев. 1979. С. 86-87.

66. Крайнюкова А.Н. Биотестирование в охране вод от загрязнения // Методы биотестирования вод. Черноголовка: ОИХФ. 1988. С. 4-14.

67. Крайнюкова А.Н., Рязанов A.B., Емельяненко В.В. Метод биотестирования по реакции закрывания створок раковин двустворчатых моллюсков // Методы биотестирования вод. Черноголовка: ОИХФ."1988. С. 57-65.

68. Лесников Л.А. Сравнение принципов разработки и использования нормативов качества воды в СССР и США // Теоретические вопросы водной токсикологии. Л.: Наука. 1981. С. 57-68.

69. Лояныч A.A. К проблеме охраны окружающей среды // Сб. науч. тр. Гос. НИИ оз. и реч. рыб. х-ва. 1993. Вып. 335. С. 3-5.

70. Луканин В.В. Исследование адаптивных реакций сцифомедузы Белого Моря Aurelia aurita L. к изменению солености внешней среды // Соленостные адаптации водных организмов. Л. 1976. С. 26-58.

71. Лукьяненко В.И. Общая ихтиотоксикология. М.: Легкая и пищев. пром. 1983. 320 с.

72. Лукьяненко В.И. О генеральной концепции охраны водоемов от загрязнений // Вестн. АН СССР. 1990. №4. С. 75-81.

73. Львова Т.Г. Санитарная гидробиология с основами водной токсикологии: Учебное пособие. Калининград: Калининградский ун-т. 1996. 70 с.

74. Майер Ф.Л., Мерл П.М., Шоттгер P.A. Тенденции водной токсикологии в Соединенных Штатах: перспективы // Теоретические вопросы водной токсикологии. Л.: Наука. 1981. С. 40-56.

75. ЭЗ.Маляревская А.Я. Биохимические механизмы адаптации гидробионтов к токсическим веществам // Гидробиол. журн. 1985. Т. 21. № 3. С. 70-82.

76. Маляревская А.Я. Специфические и неспецифические изменения при действии различных токсикантов как показатели патологического состояния организма рыб // Теоретические проблемы водной токсикологии: норма и патология. М.: Наука. 1983. С. 99-105.

77. Маляревская А.Я., Карасина Ф.М. Обратимость изменений активности дыхательных ферментов и уровня общего тиамина у моллюсков при отравлении солями тяжелых металлов // Гидробиологические исследования пресных вод. Киев: Наукова думка. 1985. С. 144-150.

78. Метелев В.В. Токсичность и некоторые вопросы механизма действия пропанида на организм рыб//Тр. ВНИИ вет. санитарии. 1974. Вып. 50. С. 72-75.

79. Методические указания по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение / Под. ред. О.Ф. Филенко, С.А. Соколовой. М.: Изд-во ВНИРО. 1998. 145 с.

80. Методы биоиндикации и биотестирования природных вод / Под ред. Брызгало

81. B.А., Хоружая Т.А. П.: Гидрометеоиздат. Вып. 2. 1989. 276 с.

82. Митин A.B. Спектры изоформ ферментов гемолимфы нимф поденок при воздействии на них промышленных стоков // Гидробиол. журн. 1985. Т. 21. № 5.1. C. 84-89.

83. Митин A.B., Кончин В.В. Спектры изоферментов неспецифических эстераз при действии малых концентраций трибутилоловохлорида на развивающуюся икру вьюна // Оловоорганические соединения и жизненные процессы гидробионтов. М.: Изд. МГУ. 1975. С. 219-224.

84. Мороз И.Е. Видовая и возрастная чувствительность рыб к хлорорганическим токсикантам // Экспериментальная водная токсикология. Рига: Зинатне. 1990. Вып. 14. С. 150-159.

85. Морозова В. П., Безбородова С. И. Кислая внеклеточная фосфомонозстераза Aspergillus clavatus // Микробиология. 1972. Т. 12. Вып. 3. С. 404-412.

86. Мур Д., Рамамурти С. Тяжелые металлы в природных водах. Контроль и оценка влияния / Пер. с англ. М.: Мир. 1987. с.

87. Немова H.H. Внутриклеточные протеиназы в эколого-биохимических адаптациях у рыб // Автореф. дисс. . д-ра биол. наук. М. 1992. 43 с.

88. Немова H.H. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. Петрозаводск: Карел, науч. центр РАН. 1996. 104 с.

89. Немова H.H., Сидоров B.C. Влияние некоторых токсических факторов на лизосомальные протеиназы пресноводных рыб // Гидробиол. журн. 1990. Т. 26. № 4. С. 69-73.

90. Немова Н.Н, Крупнова М.Ю., Кяйвяряйнен Е.И., Волков И.В. Влияние токсических факторов на протеолитическую активность в икре и ранних личинках рыб // Изв. РАН. Сер: биол. 1994. № 4. С. 528-534.

91. Немова H.H., Кяйвяряйнен Е.И., Крупнова М.Ю. Влияние промышленных стоков на активность внутримышечных кальций-зависимых протеиназ ряда пресноводных рыб // Вопр. ихтиол. 1996. Т. 36. № 3. С. 420-422.

92. Неорганическая биохимия: в 2-х томах / Пер. с англ. М.: Мир. 1978. Т. 1. 711 с.

93. Обобщенные показатели качества вод 83. Практические вопросы биотестирования и биоиндикации. Черноголовка. 1983. 200 с.

94. Обобщенный перечень предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно безопасных уровней воздействия (ОБУВ) вредных веществ для воды рыбохозяйственных водоемов. М.: ВНИРО. 1990. 46 с.

95. Определитель пресноводных беспозвоночных Европейской части СССР. П.: Гидрометеоиздат. 1977. 512 с.

96. Отчет о результатах командирования за границу по линии советско-американского сотрудничества в области охраны окружающей среды в США 11-23 ноября 1980 г. (постановление ГКНТ и Совмина СССР от 07.01.80, т. 2, с. 265, п. 46.1). Харьков. 1981. 74 с.

97. Отчет о результатах командирования советских специалистов по линии международных научно-технических связей во Францию 22-28 марта 1982 г. (постановление ГКНТ № 3 от 19.01.81, т. 3, с. 296, № 500.1). Госкомгидромет СССР. 1982. 25 с.

98. Оценка и регулирование качества окружающей природной среды. Учебное пособие для инженера-эколога / Под ред. А.Ф. Порядина и А.Д. Хованского. М.: НУМЦ Минприроды России, Изд. Дом «Прибой». 1996.

99. Панин Л.Е., Маянская H.H. Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении. Новосибирск: Наука. 1987. 198 с.

100. Патин С.А. Биотестирование как метод изучения и предотвращения загрязнения водоемов // Биотестирование природных и сточных вод. М.: Легкая и пищ. промышл. 1981. С. 7-16.

101. Патин С.А. Влияние загрязнения на биологические ресурсы и продуктивность Мирового океана. М.: Пищ. пром-сть. 1979. 304 с.

102. Патин С.А. Исследовательские и прикладные аспекты водной токсикологии // II Всесоюзная школа по экологической химии водной среды (Ереван, 11-14 мая 1988 г.). М.: ИХФ АН СССР. 1988. С. 96-107.

103. Плохинский H.A. Биометрия. Новосибирск: СОАН СССР. 1961. 364 с.

104. Покровский A.A., Тутельян В.А. Лизосомы. М.: Наука. 1976. 382 с.

105. Правила охраны поверхностных вод. М.: 1991. 38 с.

106. Путинцев А.И. Некоторые представления об адаптации и закономерностях реагирования гидробионтов на токсическое воздействие // Сравнительные аспекты биохимии рыб и некоторых других животных. Петрозаводск: Карел, филиал АН СССР. 1981. С. 127-146.

107. Путинцев А.И. Рост молоди речных рыб и показатели липидного обмена // Биологические процессы в загрязненных модельных водоемах. М.: Изд. МГУ. 1984. С. 125-137.

108. Райдер К., Тейлор К. Изоферменты / Пер. с англ. М.: Мир. 1983. 106 с.

109. Розенгарт Е.В., Касьяненко Ю.И., Хованских А.Е., Эпштейн Л.М. Кислая фосфатаза кальмаров и других гидробионтов бассейна Тихого океана // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1993. Т. 29. № 2. С. 127-131.

110. Рославцева С.А. Проблема резистентности членистоногих к инсектоакарицидам (по материалам Восьмого международного конгресса по химии пестицидов) //Агрохимия. 1997. № 3. С. 89-92.

111. Руоколайнен Т.Р., Высоцкая Р.У. Активность лизосомальных ферментов в печени окуня из разных зон Онежского озера // Сравнительная биохимия водных животных. Петрозаводск: Карел, филиал АН СССР. 1983. С. 85-95.

112. Руоколайнен Т.Р., Сидоров B.C. Модификация спектра молекулярных форм кислой фосфатазы печени рыб при интоксикации смоляными кислотами // Методы ихтиотоксикологических исследований. Л. 1987. С. 114-116.

113. Руоколайнен Т.Р., Высоцкая Р.У., Сидоров. B.C. Влияние смоляных кислот на гетерогенность кислой фосфатазы печени форели // Теоретические вопросы биотестирования. Волгоград. 1983. С. 60-64.

114. Сазонова В.Е., Панькина Е.В. Сравнительный анализ чувствительности двух биотестов для определения степени токсичности воды // Вод. ресурсы. 1998. Т. 25. № 1. С. 80-84.

115. Самоочищение и биоиндикация загрязненных вод / Под. ред. М.М. Телитченко. М.: Наука. 1980. 278 с.

116. Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть // Биохимия. 2000. Т. 65. Вып. 8. С. 1029-1046.

117. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М.: Медицина. 1960. 254 с.

118. Семин В.А., Иголкина Е.Д. Энзимоиндикация загрязнения водных экосистем // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Т.6. Л.: Гидрометеоиздат. 1983. С. 137-145.

119. Серавин Л.Н. Анализ понятия «гомеостаз» //Тр. Биол. ин-та ЛГУ. 1972. Т. 21. С. 3-27.

120. Сидоров B.C. Эволюционные, и экологические аспекты биохимии рыб // Автореф. дисс. . д-ра биол. наук. М. 1986. 56 с.

121. Сидоров B.C., Высоцкая Р.У. Природоохранительные аспекты экологической биохимии рыб // Природные ресурсы Карелии, их использование и охрана. Петрозаводск: Карел, филиал АН СССР. 1988. С. 132-144.

122. Сидоров B.C., Юровицкий В.Г., Кирилюк С.Д., Такшеев С.А. Принципы и методы эколого-биохимического мониторинга водоемов // Биохимия экто- и эндотермных организмов в норме и при патологии. Петрозаводск: Карел, науч. центр АН СССР. 1990. С. 5-27.

123. Смирнов Л.П., Кирилюк С.Д. Влияние загрязнения окружающей среды на фракционный состав низкомолекулярных пептидов из различных тканей сигов // Изв. РАН. Сер. биол. 1994. № 4. С. 617-622.

124. Современные методы в биохимии / Под. ред. В.Н. Ореховича. М.: Медицина. 1968.372 с.

125. Современное состояние методов оценки качества поверхностных вод суши: обзорная информация. Гидрометеорология. Серия: Контроль загрязнения природной среды. Обнинск: ВНИИГМИ МЦД. 1985. Вып. 1. 47 с.

126. Сорвачев К.Ф. Основы биохимии питания рыб. М. 1982. 247 с.

127. Справочник предельно допустимых концентраций вредных веществ в пищевых продуктах и среде обитания. М. 1993. 142 с.

128. Строганов Н.С. Методика определения токсичности водной среды // Методики биологических исследований по водной токсикологии. М.: Наука. 1971. С. 1460.

129. Тимофеева С.С., Беспалова В.З., Черемных Н.В. Использование окислительно-восстановительных ферментов в индикации загрязнений // V всесоюзная конференция по водной токсикологии (Одесса, 18-22 апреля 1988 г.). Тез. докл. М. 1988. С. 76-77.

130. Токин И.Б., Зензеров B.C. К проблеме изучения механизма действия загрязнителей на клеточном и субклеточном уровнях // Проблема изучения действия загрязнителей. Аппатиты. 1977. С. 22-43.

131. Туманов A.A., Постнов И.Е., Осипова Н.И., Зимин А.Б. Химико-биологический метод оценки содержания фенола в воде с помощью дафний // Методы биотестирования вод. Черноголовка: ОИХФ. 1988. С. 104-106.

132. Филатова Г.А., Гвозденко С.И. К вопросу об использовании методов энзимоиндикации при определении степени пестицидной интоксикации рыбестественных водоемов // Методы ихтиотоксикологических исследований. Л. 1987. С. 128-129.

133. Форощук В.П. К вопросу об экологическом нормировании содержания антропогенных веществ в водной среде // Тез. докл. VII Всесоюзного симпозиума по проблемам прогнозирования, контроля качества воды водоемов и озонирования. Таллин. 1985. С. 222-224.

134. Хейсин Е.М. Краткий определитель пресноводной фауны. М.: Учпедгиз РСФСР. 1962. 148 с.

135. Хейфец Л.Я., Кравченко М.С., Осыка В.Ф., Кочуровская Г.Г. Нормирование и контроль качества вод // Вод. ресурсы. 1988. Т. 15. № 2. С. 122-129.

136. Хлебович В.В. Акклимация животных организмов. Л. 1981. 136с.

137. Хлебович В.В., Бергер В.Я. Некоторые аспекты изучения фенотипических адаптаций //Жур. общ. биол. 1975. Т. 36. № 1. С. 11-25.

138. Хоружая Т.А. Перспективы использования биохимических тест-функций в биомониторинге пресных вод // Гидробиол. журн. 1989. Т. 25. № 5.1. С. 47-52.

139. Хочачка П., Сомеро Д. Биохимическая адаптация / Пер. с англ. М.: Мир. 1988. 567 с .

140. Хочачка П., Сомеро Д. Стратегия биохимической адаптации / Пер. с англ. М.: Мир. 1977. 398 с.

141. Цветков И.Л. Кислая фосфатаза гидробионтов как маркерный фермент токсического воздействия на организм //Дисс. . канд. биол. наук. М. 1998. 183 с.

142. Цветков И.Л., Зарубин С.Л., Урванцева Г.А., Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. Кислая фосфатаза гидробионтов как фермент-индикатор биохимической адаптации к воздействию токсических веществ // Изв. АН. Сер. биол. 1997. № 5. С. 539-545.

143. Чекунова М.П., Фролова А.Д. Роль лизосом в токсикологии металлов // Структура и функции лизосом. Тез. докл. 3-го всесоюз. симпоз. Тбилиси. 1986. С. 228-229.

144. Юровицкий Ю.Г., Сидоров B.C. Эколого-биохимический мониторинг и эколого-биохимическое тестирование в районах экологического неблагополучия // Изв. АН. Сер. биол. 1993. № 1. С. 74-82.

145. Adriaanse М., Niedrlander H.A.G., Stortelder Р.В.М. Monitoring water quality in the future. Volume 1: Chemical monitoring. Institute for Inland Water Management and Waste Water Treatment (Riza), Lelystad, The Netherlands. 1995.

146. Andersson Т., Bengtsson B.E., Forlin L. et al. Long-term effects of bleached kraft mill effluents on carbohydrate metabolism and hepatic xenobiotic biotransformation enzymes in fish // Ecotoxicol. Environ. Safety. 1987. V. 13. P. 53-60.

147. Arillo A., Bagnasco M., Bennicelli C. et al. Mixed-function oxidase induction as a test for the biological monitoring of water: limitations and prospects // Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 1992. V. 68. P. 543-548.

148. Avila J.L. The influence of the type of sulphate bond and degree of sulphation of glycosaminoglicans on their interaction with lysosomal enzimes // Biochem. J. 1989. V. 171. № 19. P. 9789-9792.

149. Boyd J.B. Characterization of acid deoxyribonuclease from the lavral salivary glaud of Drosophila Pujdei // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 209. № 2. P. 349-356.

150. Chan K.M. PCR-cloning of goldfish and tilapia metallothionein complementary DNAs // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 205. P. 368-374.

151. Clegg J.S. Biochemical adaptations associated with the embrionic dormancy of Artemia salina//Trans. Amer .Microsc. Soc. 1974. V .93. P. 481-490.

152. Cytochrome P 450: biochemistry and biophysics / Eds Archakov A.I., Bachmanova

153. G.I. Moscow: INCO-TNC, Joint Stock Company. 1992. P. 333-337.

154. Cytochrome P 450: Biochemistry and Biophysics / Ed. Schuster I. L.; N.-Y.; Philadelphia: Taylor & Francis. 1989. P. 679-684.

155. Davis J.R. Disc electrophoresis. Method and application to human serum proteins // Ann. N-Y. Acad. Sci. 1964. V. 121. № 2. P. 404-427.

156. Goksoyr A., HusoyA.M., Larsen H.E. etal. Environmental contaminants and biochemical responses in flatfish from the Hvaler Archipelago in Norway // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1991. V. 21. P. 486-496.

157. Haasch M.L., Quardokus E.M., Sutherland L.A. et al. Hepatic CYP1A1 induction in rainbow trout by continuous flowthrough exposure to (3 -naphtoflavone // Fundam. Appl. Toxicol. 1993. V. 20. P. 72-82.

158. Hamza-Chaffai A., Amiard-Triquet C., El Abed A. Metallothionein-like protein: is It an efficient biomarker of metal contamination? A case study based on fish from the Tunisian coast //Arch Environ. Contam. Toxicol. 1997. V. 33. P. 53-62.

159. Hogstrand C., Galvez F., Wood C.M. Toxicity, silver accumulation and metallothionein induction in freshwater rainbow trout during exposure to different silver salts//Environ. Toxicol, and Chem. 1996. V. 15. №7. P. 1102-1108.

160. Hogstrand C., LithnerG., Haux C. Relationship between metallothionein cooper, and zink in perch (Perca fluviatilis) enviromentaily exposed to heavy metals // Mar. Environ. Res. 1989. V. 28. P. 179-182.

161. Hogstrand C., LithnerG., Haux C. The importance of metallothionein for the accumulation of copper, zinc and cadmium in enviromentaily exposed perch, Perca fluviatilis // Pharmacol. Toxicol. 1991. V. 68. P.492-501.

162. Kunitz M. Cristalline soybean tripsin inhibitor. General properties // J. Gen. Physiol. 1947. V. 30. P. 318-326.

163. Lowry O.H., Rosenbrought N.J., Farr A.L., Rangal R.L. Protein measurement with the Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 2. P. 265-275.

164. Methods of measuring the acute toxicity of effluents to aquatic organisms // US EPA, Cincinnati, Ohio. 1978.

165. Newman M., Strzelecka T., Dorner L.F., Schildkraut I., Aggarwal A.K. Structure of bam HI endonuclease bound to DNA: partial folding and unfolding on DNA binding // Science. 1995. V. 269. P. 656-663.

166. Olsson P.E., Haux C. Increased heratic metallothionein content correlates tocadmium accumulation in enviromentally exposed perch Perca fluviatilis // Aquat. Toxicol. 1986. V. 9. P. 231-242.

167. Rassel W., Khorama H. Studies on polynucleotides. X. Enzyme degradation. Some properties and mode of action of spleen phosphodiesterase // J. Biol. Chem. 1961. V. 236. №4. P. 1144.

168. RochM., McCarter J.A., Matheson A.T., Clark M.Jr., Olafson R.W. Hepatic metallothionein in rainbow trout Salmo gairdneri as an indicator of metal pollution in the Campbell River system//Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1982. V. 39. P. 1596-1601.

169. Schlenk D., Zhang Y.S., Nix J. Expression of hepatic metallothionein messenger RNA in feral and caged fish species correlates with muscle mercury levels // Ecotoxicol. Envirom. Saf. 1995. V. 31. P. 282-286.

170. Stegeman J.J., Kloepper-Sams P.J., Farrington J.W. Monooxygenase induction and chlorobiphenyls in the deep-sea fish Coryphaenoides armatus // Science. 1986. V. 231. P. 1287-1289.

171. Stegeman J.J., Smolowitz R.M., Hahn M.E. Immunohistochemical localization of environmentally induced cytochrome P450 1A1 in multiple organs of the marine teleost Stenotomus chrysops (Scup) // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1991. V. 110. P. 486-504.

172. Tebo L.B. Effluent monitoring: historical perspective // Environ. Hazard Asses. Effluents. Proc. Pellston Environ. Workshop, Cody Wyo., 22-27 Aug. 1982.1. P. 13-31.

173. Use of toxicity tests with fish in water pollution control II ASTM, Philadelphia, P.A. 1973.

174. Van Genderen J., Noordsij A. Chemisch-toxicologisch onderzoek voor de171drinkwater voor-ziening // H2O. 1991. V. 24. P. 458-463.

175. Van Loon W.V.G.M., Hermens J.L.M. Monitoring water quality in the future. Volume 2: Mixture toxicity parameters. Research Institute of Toxicology (RITOX), Utrecht, The Netherlands. 1995.

176. Vigano L., ArilloA., De Flora S., LazorchakJ. Evaluation of microsomal and cytosolic biomarkers in a seven-day larval trout sediment toxicity test // Aquat. Toxicol. 1995. V. 31. № 3. P. 189-202.

Информация о работе

Попов, Алексей Петрович
кандидата биологических наук
Москва, 2002
ВАК 03.00.04

Диссертация

Множественные формы ферментов живородки речной как маркеры токсического загрязнения воды - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы