Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нарушение регуляторных свойств альдолазы при опухолевом росте и действии нитрозометилмочевины

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Нарушение регуляторных свойств альдолазы при опухолевом росте и действии нитрозометилмочевины"

I* $ о - 8'

АКАДЕМИЯ НЛУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н. Н. СЕМЕНОВА

На правах рукописи

ТРЕЩЕНКОВА Юлия Алексеевна

УДК 577.152.3

НАРУШЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ АЛЬДОЛАЗЫ ПРИ ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ И ДЕЙСТВИИ Н И Т Р О 3 О Д\ 1Т И Л Л«О Ч Е В И н ы

(03.00.02 — Биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

/

Работа выполнена в Отделе кинетики химических и биологических процессов ордена Ленина Института химической физики АН СССР им. Н. Н. Семенова.

Научный руководитель: ;октор биологических наук,

профессор Бурлакова Е. Б.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Горбачева Л. Б.; кандидат биологических наук Пархоменко И. Н.

Ведущая организация: Институт канцерогенеза

ВОНЦ АМН СССР.

защита состоится « 1990 г. в

. . . час. на заседании специализированного Совета Д.002.26.07 при Институте химической физики АН СССР.

Адрес: 117334 Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИХФ АН СССР.

Автореферат разослан « 1.0. . » -МОг?. . 1990 г.

Ученый секретарь специализированного Совета Д 002.26.07,

доктор биологических наук Ванин А. Ф.

..lecuSflWI XAP<JCTEPHCTHKA PAIOTJ.

ДД" Актуальность проблемы. Изучение регуляции активности фермен-гбв-в-Тканях важно для понимания механизмов, спязивасицгх ^/ккцио-¡альнута активность с процессами метаболизма /Heimiddt I06C,Korn 1986, Ньюсхолм 1977/. Регуляция активности ферментов в клетке юуществляется различными путями: кизкомолекулярнши метаболитами [субстратами, продукта?®!, ионами металлов и др.); иигнбироланием го типу обратной связи в данной последовательности реакций; алло-¡терическими эффекторами /Мопс/, Оычу'-к , J. 1063, Курганов [978/; через образование комплексов при фермент^форментном взаи-юдействии /Sc-U,4j оЛ а(. 13гП,Мс С n<ji <. nt аС 1980, iVad. 1988/, фотеазами посредством ограниченного протеолиза /ll„iici>\ct\ ^ [982, Pxtki it at'. 1983/; ассоциацией-диссоциацией формонтов с мем-iралами субклеточных структур.

В последнее время большое внимание уделяется исследованиям »братимого связывания г лик о ли тэт о ск их ферлентов с субклеточными ¡труктурами и влияния этого связывания на метаболические процессы 1 клетке, такие как гликолиз.

Ванным способом регуляции активности ферлентов в клетке являйся блокирование и деблокирование генов, контролирующих синтез [ндивидуальных ферментов /Уотсон 1907, J,icc-6. Hcnuti. I9GI/.

Б норме всо эти механизмы, осуществляющие тонкую регуляции юрлэнтативной активности, взаимосвязаны и согласованы.

Однако при развитии патологических процессов, таких как зло-:ачествешшй рост, могут изменяться не только синтез ферментов, :х активность, по и чувствительность к различным метаболитам, что гажет приводить "-к нарушениям регуляции клеточного метаболизма. Злокачественный рост считают "болезнью регуляции", для которого [аракт^рны нарушения механизмов регуляции активности ферлентов, iL-фимер, раз балансирование анаболических и катаболических процес-юн, в частности гликолиза-глюконеогенеза / И'Л-С^.г 1977,1383/. [ентральное место в основных метаболических путях гликолиз а, глю-:оноогенеза и метаболизме фруктозы занимает альдолаза. Существует I тканеспецифические форм альдодазы: мышечная (Л), печеночная(3)

мозга (С), синтез которых контролируется различными генами в летке.

Лльдолаза обладает четвертичной структурой и состоит из 4 дентичных субьепниц /Р.^^.-.ct <*JaL 1971, киПеъ 1963, ¿ij&s »r.u*. 963/. На ферменте пмоетоя места сгязгаапия для АТР, ЛМР /Кирг'-к". 981, }\vdтнг.1'1 1981/, которые является конкурентными ингибитор--

ми альдолаз, и длл НАД.НЛДР, способных активировать фермент /Чу-маченко и дрЛ&ВХ.А/ц.Мот 1905/. Альдолаза принимает участив в расщеллашш инозитфосфатов с образованием 1,2-дяацилглицерола,й) кащэго вторичным ыоссендаором и клетке. Инозитфосфаты являются а лрстерическими эффекторами альдолаз и /¡\offit2 с{ а£,- 1086/.

Обраттаое сшзыванпо гликолитичеоких формой х)в с субклетоЧ' ними структурами (в частности ачьдслаз) является одним ил сп^со' ооб регуляции активности фг х: он то л в клатко, и платочного метай лизма в целом.

Альдолаза (во высокоактивные димеры и тетраыеры) способна разовывать гатерологичныо комплексы с гликолитическими фермента Е'шяя на активность таких ферментов как фосфофруктокиназа, фрук зодифоофатаза, глицерофоофатдегидрогеназа и другие /¿\\LM- 19£ Субстраты ФДФ и о;,!1> рассматриваются как внутренние эффекторы, и менение концентраций которых влияет ка активность альдолазы /¿I рих 1986/.

Таким образом, для альдолазы хорошо изучены пути регуляции активности в клетке. Альдолаза чувствительна к различным воздев виям, модификации ее функциональных груш могут коррелировать < *">терей активности и изучение ее структурно-функциональных вза1 отношений может служить хорошей моделью при различных патологи1 ских состояниях.

регуляция субстратами ФДФ и ОМ5

регуляция синтеза на уровне транскрипции и трансляции

\ , л

©Уг \ / /

регуляция на уровне изофер-ментов

ми ферментами и гдаи белками (5

(5 -

ассоциация о ___АЛЬДОЛАЗА)_регуляция

субклеточными V ) ческим ин:

структурам инозит^оа

регуляция аллостери-ческим ингибитором инозит^оофатом

регуляция конку- активатора- протеолиз рентными ингибитора- ми НАЦ.НМР № АТР.АМР

Возмокнчо пути рагул!щии активности альдолазы в клетке.

1аль и задачи работы. Цель настоящей работы заключалась в внясне-ии механизмов регуляции активности а^ьдолазы п органах и тканях »пухолвносителя и onyxojni на разных стадиях опухолевого . }ста и :ри введении нлтрозометцлмочеьнны (HUM).

ß работе били поставлены следующие задачи: [.Изучить изменение активности,кинетические и рсгуляторные (инги-5ирование ЛТР) свойства алъдолазы и ее изофэрмонтних форм различии тканей в рашшэ и позднио сроки роста гелатош 22а. '.Изучить в сравнительное аспекта действие НШ на активность,нинз-гаческие и регуляторнца свойства альдолази раз.тачных ткякей ядоро-зых животных и опухоленоситслей.Изучить действие НШ на иэофе.даон-гный спектр альдолази здоровых животных.

3. Исследовать' механизм действия ILMM на оипцоиную альдолазу из лит кролика в условиях т vitro (активность,кинетические (У/.К,), электрофоретическио свойства, протеолиз трипсином).

4. Изучить обратимое связывание альдолази с органеллами (ядра.мл-гохощфик.синаптосомы.микросомы,миелин) различных тканей.

5.Изучить влияние ¡Ш на активность,кинетические и регуляторныв свойства алъдолазы,связанной с рганелками различных тканей в условиях in Vi vü .

Научная новизна. На основании получокгшх данных шяшленн изменения активности,кинетических и регуляторах свойств альдолаз различных органов опухоленосителей,связанных со стадиями роста опухоля.Охарактеризован!: свойства альдолази гелатомн 22а. Эти результаты позволили прийти к заключению о появлении некоторой "азтономности" и регуляторной "глухоте" нэ только опухолевых клеток, но и клаток различных органов-опухоленосителей.

Проведено сравнительное изучение действия НШ на изменение активности и кинетических свойств пзоферментов альдолазн здоровых т ■анеЙ(почош1,мызтд,мозга,сыворотки крови) в условиях in vivo .Ви-явлены как сходство, так и различие з нарушении регуляции изсфе>-ментов альдолазн у здоровых мышей и опухоленосителей, зэвисяп^б от стадии роста опухоли.

Изучен механизм действия НШ на активность и кинетические параметры альдолази в условиях in utio. Обнаружено значительное Ла-гибирувдее действие ILM.1 на фермент относительно субстратов да и ФМЬ,затрагивавших аминокислоты,не входящие в активный центр форum-та .Действие НШ приводит к значительному уменьшению V и увеличению i^j относительно обоих субстратов.

Обнаружено изменение изофермзнтных ¡пектров альдолазн различиях

органов здоровых мышей при действии ПММ. Сопоставление данных,полученных in v;tic и in 1/1V0 . позволило выявить непосредственное действие НШ на формент в условиях 0' vivn .

Шервыо обнаружено наличие обратимого связывания альдолазы с мембранами органолл мозга, мышц, гопатомы 22а. Изучены и сравнены их кинетические свойства с цитеплазкатическ."ми формами альдолазы этих органов.

Выявлены нарушения в регуляции активности и кинетических свойств альдолаз, связанных с орган елла\ы при действии HUM.

Показано,что нарушение в регуляции активности альдолазы при действии НШ in ию происходит как на клеточном, так и на субклеточном уровнях, что, вероятно, может отражать изменения в метаболическом статусе организма при канцерогенном действии НШ, Научно-практическое анпчоние .Получоннно экспериментальные данные вносят существенный вклад в пошшание закономерностей регуляции клеточного метаболизма в норме и при опухолевом росте и в понимание механизмов регуляции активности фьрмонтов при воздействии биологически активного агонта(1Ш) .обладающего противоопухолевая и канцерогенным дойствиом.Лльдолаза.обладая большой чувствительностью к различным воздействия:»!,является мишенью действия ШМ, и может быть использована для подбора средств и слежамия лечения злокачествешшх новообразований.Данные,полученные в работе, включены в учебный спецкурс "Физико-химические основы регуляции клеточного метаболизма", читаемый проф.Е.Б.Бурлаковой на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ та.М.В.Ломоносова. Ащюбация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзных ■ Биохимичоских съездах(Ленинград 1979,Киев 1986),на 4 Всесоюзной конференции до биохимии мышц,Ленинград 1981,на конференции"Акту-алыша проблемы экспериментальной химиотерапии".Черноголовка 1980, на кокференциипМеханизш канцерогенеза и лейкозогенеза"Диев 1990. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав,заключения и выводов.Первая глава представляет обзор литературы, по священной физико-химическим свойствам и роли изоферментоЕ альдолазы в регуляции метаболических процессов в клетке. Вторая глава содержит описание методов исследования.В третьей,четвертой, пятой и шестой главах приведены экспериментальные данные -и их обсуждение.

Диссертация изложена на 150'страницах машинописного текста,содержит 11: таблзд к 34 рисунков .'библиография включает W наименований

оложения .выносимые на защиту.

.Изменения активности,кинетических и ,.егуля торных свойств альдо-азы различных тканей связаны со стадиями *роста опухоли. .Изменения активности,кинетических к регуляторных свойств аяьдо-аз органов здоровых мышей и опухоленосителой при действии Ш.М зязаны как с непосредственны!.! действием, так и опосредованным зйствием 1Ш.

,Ялия!ше 11Ш на изменение качественного и количественного соста-I изоферментов альдолазы разных органов здоровых животных. Изменение активности,кинетических параметров и чувствительности протеолизу трипсином альдолазы при действии 1Ш в условиях /ть.Ис Ассоциация альдолазы с органолламл различных тканей и влияния М на связывание альдолаз с этими органеллами. содькаши рлтоти

тещалы и методы исследования. В работо использовали мышеи ли-;г С311А обоих полов,весом 18-22 г.В качестве модели опухолевого зта использовали солидную гопатому 22а.Опухоль в физиологичос-1 растворе перевивали животным подкожно,Мышей делили на 2 груп-,из которых одна группа бралас в качество контроля, а другой -|дили внутрибр.талнно, однократно 1Ш (80 мг/кг) .растворенной в дологическом растзоре, на 2 или'7 сутки роста олухолиЛвуез юделенкые сроки роста опухоли (2-С или 8-10 сутки) и после вве-кя 1Ш (2-168 час или 24-72 час) животных забивали декапитаци-извлекали печень,мозг,шпцц и кровь.Из тканей готового гемогэ-ы и цитоллазматические фракции получали с помощью улътрацент-утировашм при 105000^ в течение 60-90 мин.

Другая серия экспериментов выполнена на здоровых мышах,кото-вводили также НШ (30 мг/кг) .Мышей забивали через различные ш после введения НММ (2-160 час и 45 дней).Извлекали органы, >вили гомогонаты и методом дифференциального центрифутированля гчали цитоплазматвческую,ядерную,штоховдриальную и микросоциум фракции.Используя градиент сахарозы очищали ядра, митохоп-:, синаптосомы, миелин мозга.

Количество белка определяли по методу 1с\х/Ху 1951. вность альдолазы с двумя субстратами фруктозодифосфатом (ФД5) уктозомонофоофатом (}'.№) определяли спектрофотометрически при нм с 2,4-динитрофенилгидразином ¡6Иску егл1\. 1949, Р('и {о сI /.За активность принимали начальные скорости л выразили в ^М грата за мин и уд.активность на мг белка.

КонстантыМ и К^ для обоих субстратов (ФДФ и ФМ5) раочитава-

- с -

ли из начальных скоростей тремя способами: по методу Лайнуивера-Бэрка, методом-Корниш-Боудена и в координатах v/s от (S)/KopHiim-Боудеи 1979/. Определяли отношение гзксималышх скоростей (УЭДФ Мш) .характеризующие чистые формы альдолазы мыац.мозга,печени, ф равные 50, 15, I, соответственно.

Методом электрофореза в ПЛАТ vis 1964/ разделяли изоф менткые формы альдолазы.

Окраску на ферментати" нута активность проводили по методу Ъ кео 1974.

Гель-хроматографию на софадексе Г-25 и Г-75 использовали ; освобовдения некоторых фракций от низкомолекулярных веществ и обассоливания кристаллической альдолазы из мышц кролика.

В условиях ы litre изучали действие различных концентрац: НШСОИБ-^'Ю"^!) на активность и кинетические параметры (V »К альдолазы, очищенной из мышц кролика.

Трипсин использовали для изучения протеолиза нативной и м фицированной НШ альдолазы.За протоолизом следили электрофоре! ческим методом.

Для окраски на белок использовали краску Кумасси. гели денситометрировали на хромоскапе 3 при 535 им. В качестве ингибитора использовали ATP (0,15М). Полученные данные обрабатывали статистически /Бе15ли 1975/.

РЕЗУЛЬТАТ!! ИССЛЩНЛШИ И КХ ОШУЖЦЕНИЕ. I. Динамика изменений кинетических свойств изоформентов альдо. в различных органах опухоленосителей в процессе родтд гепа 22а .

При развитии злокачественного новообразования устанавливая: сложные взаимоотношения мажду опухолью и организмом /Кавецкий 1973,Шапот 1975/.Сами опухолевые клетки характеризуются наруи ei.i процессов дифференциревки,набором белков и ферментов близ1 эмбриональна,; ткашы, интенсивным гликолизом и раз балансиров; анаболических и катаболических путей / We&ui- -983/.На примера долазы сдачана попытка выявить системное действие опухоли (г томы 22а) на различные органы мышей-опухоленосителей.

В работе показано,что злокачественный рост вызывает значи ;ше изменения активности, кинетических (V .К,,, отношениеХ/эд ФЮ) и регуляторных (ингибирование АТР) свойств альдолазы j личных органов опухоленосителей, связанных со стадиями росте опухоли.

О 5ч 2

10 сут 0

10 сут

з.1. Изменение кинетических парамотроп V (в), К, (О) цитоплазыа-геской альдолазы различных органов опухоленосителой относктолъ-субстратов ли' (а,б,в) и (г,д,ж). По оси абсцисс - громя хчв пригпвки опухоли (сутки). По оси ордашат - относительные ед.

VI - значения у , К альдолазы здоровых .чшзопшх.

Особенности изменений кинетических свойств альдолазы на ранних стадиях (рис.1)-свидетельствуют о закономерностях воздействия как опухоли на организм, так и обратно иг юненного метаболизма организма на опухоль.

Анализ кинетических данных дает основание полагать, что измене-

f

пая свойств альдолаз в органах связаны как с появлением субъодинш несвойственных нормальным тканям (т.е. нарушения.'.! регуляции га уровне генов, ответственных за синтез субъединиц Л,В и С), так и с ьшшиием измененного метаболизма на кинотические и регуляторные свойства фермента. 1ак, в мозге (рис.1в,к), содержащем 5 изоформ атьдолазы (Л4,АзС,А2С2,С4), кинотические данные свидетельствуют об увеличении вклада субъединиц А^ типа, имеющих большую активность относительно субстратов ФДг и чем субъединицы С-типа; а в мышцах на ранта стадиях (рис. 16,д) - о появлении субъединиц С-тнпа, несвойственных здоровым яивотным.На поздних стадиях как в мозге, так и мышцах опухоленосителей существенный вклад в активность альдолазы вносят субъедшмцы А-типа.Изменение кинетических свойств альдолазы печени опухоленосителя (рисЛ.а,г) ка всех стадиях роста опухоли (1-10 сутки), по нашему мнению, нэ связаны с V"тлением оубъедоппщ альдолазы, несвойственных нормальной печени а вызванны изменением количества или структуры молекул фермента.

В самой опухоли (гепатоме 22а) на основании кинетических и Блактрофоратических данных установлено наличие изоферментной формы альдолазы А-С.

Наши данные свидетельствуют о том,что в процессе злокачественного роста происходят не только изменения в кинетических константах ферментов и их чувствительностй к регуляции связанных со стадиями роста опухоли, но и о том,что аналогичные процессы происходят в органах опухоленосителя, что в свою очередь вызывает не только изменение чувствительности к регуляции активности фермент; в органах опухоленосителя,но и некоторой метаболической автономности органов,метаболическом разбалансировании за уровне организ: Создается ситуация.когда не только опухолевая клетка "глухая" к регуляции,но и организм утрачивает способность регулировать. П.&аяние КММ на кинетические свойства альдолазы различных ткане'

Как было показано выше, кинетические свойства альдолазы органов опухоленосителей значительно и различным образом изменяются пре опухолевом росте. Представлялось важным иссдедозать чувстви-

■ольность альдолазы к действию такого биолоппоски активного аген-■а, как IM.I, обладающего но только лоч бным. но и канцерогонным и [утагенншл действием.

¡1з литературных данных по включению котки (^СО) 1Ш /Кукушки-а и др. 1979/ извостно, что !Ш прояиляет карбамотирующее дейст-ие на белки и липиды и большой степени, чем на ДНК и РНК.При том могут затрагиваться различные функциональные группы аг.пшо-ислот, такие как ОН-,MIL,-, SH-.C00H. Известно, что питрозоалг.ил-очевшш специфически ингибируют нокоторые ферменты,такие как рансглу^аминаза /Laitl i'i а?- 1079/,глутатионродуктаза /P,a(>s<>ч 973, Tew 1982/, сукцшшл-СоА-дегидрэгеназа' / Roy и is г 198(5/.

После однократного внодонкя IL'.i,! (80 (.¡г/кг) жпштним-опухолонэ-ттолям на 2-е и 7-е сутки роста опухоли наблюдается различны!! гвот изменений кинетических параметров альдолаз различных тканей. 1блюдаемоо уменьшение веса опухоли (—30%) и дальнейшее то^юже-ie роста опухоли не возвращает к норме ни кинетические параметры, I чувствительности альдолазы к регуляции.

В органах опухоленоситолей наблюдаются как общие закономернос-t в действии НШ на кинетически" свойства альдолаз (уменьшениеV увеличошш наиболее выражены относительно 4>Д\>) (рис.2-5),тал различия в динамике этих изменений. Обращает на себя внимание кт,что б ответ на введение IKI наибольшие изменения кинетичес-х свойств альдолаз наблюдаются в печени,крови, мандах в ранний риод.а в мозге - в поздний период роста опухоли (рис.2-5).Таким разом полученные различия изменений кинетически:: и рогуляторинх ойств изоформентов альдолазы дают возможность выявить нарушения метаболизме органов, связанных со стадиями роста опухоли, рактер изменений V и для обоих субстратов альдолазы опухоли личается от органов опухоленосителя. Изменения этих параметров с».о свидетельствуют о дополнительных нарушениях в метаболизме зток опухоли.Мы обнаружили увеличение активности' альдолазы на !о ингибировашш синтеза общего белка после введения ИМ (puc.G). зможно,что такое увеличений активности фс-рмвнта связано с удяи-тем фазы S митотичоского цикла. Иг литературных данных изпест-,что максимальное упеличение активности ряда глпколлтаческпх ментов (в частности альдолазы) происходит в фазе S митотэтеско-цикла клеток опухоли Эрлихч /¡Саиоцхий,Казьмин 1Э74/.Другим воз-;ны;л объяснением повышения активности а/ндаизч модат быть непо-дстпеннал активация геноз,ответственных за синтез альдолазы. Наблюдаемые различия а изменении кинетических и рогуляторвых

'я я ,1 -I—«г'—п—п—Jf^r

Рис.2. Елшшие 1ШМ naV(e) и К,(о) атвдолазы для субстратов ФДФ я 'At пачони опухоленоситаш I - v и L ольдолаза печени опухоле-но си теля без виодошш НММ

-т?з—п—зг-?аг

Рис.3, йшяние НММ HaV («) и К.,(о) альдолазн дая ФДФ сыворот ки крови опухолэноситэля (и =4) I - V ч альдолазы сыворотки крови безмвведбния НММ

Рис.Влияние НММ на\/ (•) и КДа) альдолазы дат субстратов ФДФ и ФШ> мышц осухоле-носителя. I -V и К, альдо-лаз мышц опухоленотзиталя без ьводения """

. «-ЛU II и ^ к JI II з * 4 У ¿0

Рио.5. Етаянин НММ HaV (о) и альдолазы для субстратов ФДФ ] Ф® мозга опухоленоспталя. I -V и К альдолазы мозга on; леносителн без введения

На рис.2-5 пс. оси абсцисс - Еремя введения 1D.H.1 на'2-е или 7-е сутки (указаны стрелками) роста опухоли. По оси ординат - отн voabtrae Ofl.V и К^,.

эойств алъдол' з различных тканей после введения Ш.1 подчеркива-г метаболическую автономность .этих органов,навязанную опухолевым

Рис.С. Влияние НММ на активность (о), V (л),1ч,(о) атьцолаэы относительно ЭДО (э;и .белок мг/ мл (х),вес опухоли (i).По оси абсцисс - время поело введения КММ. , lio оси ординат - относительные единили параметров альдолазы,белка мг/мл,веса опухоли(г) I - параметры альдолазы,белок,вес опухоли без введения ШД1.

« Динамика изменений кинетических параметров злядолазн различных

тканей, здоровых мышад после введения НШ__. *

Представляется важным сравнить действие НИМ на кинетические юйства альдолазы органов здоровых мышей с её действием на альдо->зу оргалов опухоленосителей с долью выяснения особенностей отво-i последних, связанных с нарушением метаболизма в них в процессе [ухолгвого роста.

После введояия НШ здоровым я ?отным обнаружили значительные ;менения кинетических свойств ольцолазн ьо всех органах (рис.7)) .Следует отметить значительное увеличение К, относительно ФДФ )ис.7-Юа), по глубпта и динамику s?;;x ^.змедашй в различных ткэ-сс эамотне отличается.Н вто же врек-^я измекочия относительно 15 незначительны во всех оргаких(шнсни,гшпг;ах,мозге)(рис.76,9-

^06рагцаог на езбя зккмашге однотипность измунениЧ V для обоих 'бстратов (рис,7-10), более заметное относительна ФД5,чем SM5 юле введения НШ (2-24 час).Наблюдается значителнюе изменение ■Ествительности альдолазы мышц и мезга к ингибируюцему действа

для обоих субстратов.Улицы и мозг содержат альдслазу А-тшта л оферментн Л-С ряда соответственно,которые в порме имеют близкие :ачения констант ингибирования АТР.Поэтому изменьнпе чуяствгтаель-стл к ингибироЕакию АТР не является следствием вклада той та: :ой субъединицы,а скорее объясняется изменением метаболизма в :етке или микроокружения молекулы фермента, выззашшм действием И. НШ вызывает нарушения в регуляции активности альдолазы ре лько на молекулярном уровне,но и ка уровне генов,контролирующих нтоз различных типов альдолаз (А,В,С). Так, после введения 1П/М блюдгшгея зачетные изменения в изофэриеятйом спектре альдолаз злачных органоь(рис.11-13) .различрициеся во врем о та. В шшцах и

ФМР

Рис.7.а-ишнио ПШ naV(e) и К,(А) альдолазы из здоровой печени относительно субстратов ФД£(а) и ФМ1>(б)Л1о оси абсцисс- - время поело виодения Iii,¡.'.¡.По оси ординат относительные oa.V и К, I - V и К., алу^олази печони без введения " Ж»

11 ^ ■ 12 гп ттг

Рис.Э.Ддиянио НЬМ на V («)и К (д) альдолазы мышц относительно 'Ща) и ОШ(б). I- V и К, альдолазы мышц боз введений НШ

~ЧЗ к~тгг

Рис.О.Ишшние ШМ на V (® и iC Со) альдолазы здоро-ьо11 сыворотки крови относительно ФДФ.По оси абсцисс - время после введения 1Г.И.П0 оси ординат -относительные ед. V I - норма.

S7-TV

П-7775-1Ott ..

Рис.Ю.Нлияние НШ на V (®) и 1С,(О)альдолазы мозга относительно ФДФ(а) и Ф:.1:>(б). I- V и1ц, атьдолазы без ввод| ния Uli.".

Па рис.9 и 10 по оси абсцисс - время после введения НГЛ.1. По оси ординат - относительные йд. Vй Kj для ФДФ и ФШ>.

'яс.II.Изменение изоферыэкт-:ого спектра альдолазы в мнш-;ах здоровых ¡.шией после зве-1эш:я Hi.LM.l-HOpf.ia,2- +!П>17: ,168 ч), 3- (45 дней)

Рис.12.Изменение изофермонт-кого спектра альдочазп в печени здоровых мышей после введения Ш1М (168 час). 1-норма, 2-

1,1

И

Рлс.ХЗ.Изменение азоформэнт-ного спектра эльдолаэы в мозге здоровых мышей после введения ШМ,через 72 чао (а) и 158 час (б). I - норма, 2 - +1Ш

печени изменения в изэформентном спектре обнаруживаются только через 138 часов пс-сле введения НШ,которые сохраняются для альдо-лазн измвнекгшми в течение 45 дне!» (рис.11-3)б мышцах. В э.о время изменения отношения У.т,,. г,/№..,-„ находятся в соответствии с глзо-

ч'Д'1' Vяа „

ферментным спектром альдолаэа шшц.З мозге изменения изоформект-кого спектра атьдолазы происходят значительно раньше во врамеки после введения НШ(рис.13а,б) и изменения V' для обоих субстратов также находится в соответствии с полученными спектрами фзтаюита.

I 2 3

1У. Изучение действия 1ДОЛ на ачьдолазу в условиях гп .

Для понимания механизма действия НШ на изоферченты альдол&зы б условиях 1и VI 1/с необходимо было изучить ',ее действие на альдо-лазу .очищенную из мышц кролика в условиях ¡« чИго .Показано,что НММ (0,45-7-значительно ингибирует активность фермента относительно субстратов ФДФ и ФИФ (рис.14).Степень ингибированкя фермента возрастает с увеличением концентраций НИМ.Высокие концентрации субстратов ФДФ (б'КГ^М) и Ф1© (5-10-10"40 (рис.14) и • конкурентный ингибитор ЛТР (рис. 15) не защищают формант от инги-бировашы Hi.E4.Ha основании этих данных делается вывод,что ингиби-ролэшю аедолазы происходит не по активному цонтру.но при этом еатрагиваются аминокислотные- группы существенные для потери активности фермента относительно обоих.субстратов.

Обнаружено значительное влияние НММ на кинетичоские параметры (альдолазн относительно обоих субстратов (табл.1).

При .инкубада (37°С) высокие концентрации НШ (7-Ю чЛ) приводят к значительной потзро активности сльдолазы (70-80^).которая практически но восстанавливалась при разбавления модкфицирсванно-форманта.

Т0-Зг.1

кш

О 0,45

О 0,9

Л 3,5

а ?;о

KNOO

л

л а

■10~гМ 0,13 0.5 1.0

Рис. Т4.Ингкбирование активности очщэнной альдслазы из мышц кролика рэзанми концентрациями HIМ я К (СО относительно субстратов ФД*(а) и С.®(б). Время инкубации 5 мин. при 37°С.

Рис .15 Лнги'бирование очищенной альдолазы из мышц кратка НШ и ЛТР относительно субстратов ФДФ(а) и ФМФ(б). Время инкубации 5 мин при _4 37оС.Концентрации ФД5-1* Ю

10-41,1-в отсутствие ингибиторов- чО, ISi.f ЛТР, 3- +0,9«Т0~ М НМГЛ, 4 -+ АТР-ШММ.

if ньн

Габл.1. Влияние HTM на кинетические параметры альдолазы.очщен-иоЛ из мышц кролика в условиях /•- vitio.

ФДФ

V V

iiorr.ia 21,0 5,0 2,8 1.0

+ ШМ

0,40-1^3!! 17,8 9,0 - -

0.S 12,0 13,0 2,4 3,5

3,1 4,5 13,0 1,7 5,5

7,0 3,5 23,0 1.2 9,0

При электрофорезе в 7$ ПААГ не наблюдалось различий в цодз'-гс-аостй нативной и модифицированной НММ фор?лы альдолазы (рчй.16)-'3,4) .Обнар^ено различие протэолитачесхого действия трипсине на наивный и цэдрфицирозгншл! фешонт (рис. 16-1,2) .Из эле: данных предполагается модификация М^-грутш -остатка или оотат-1 ков, так как трипсин прек.'ущэствонно действует на алъдолазу по ■ Ь)5 - с -остаткам аминокислот ав, 1986/.Этог оста-

ток является суциствсшшм за потерю активности фермента относительно обоях субстратов (ФДФ и ФШ),В условиях í^^v^^гo НММ в • значительной степени инпгбярует активность альмолазы из цитоплазмы печени,мышц и мозга,но в отлично от альдолазы из шщ кролика, пабдэдалась зшцита высокими концентрация:.® субстратов. Таким образом, полуденные результаты по действию ШЛ на аятизность.днте-тическио.свойства,чувствительность к прэтеолизу зюгут взосята в* ■ ныЗ. Еклад в действие НШ в условиях ('ц V! \'о .

Рас.16. ДейзтЕпе трипзаиа (0,05 мг/мл) па загавнуу acv-дел аз у из шэд кролика (I) к моди4ицаооЕ^:пуз5 1ШЛ ядьдол«~ зу (2) после инкз баги*. 30 юга при о7°С. 3 - аг.эктросЬореетде-ская иодБИЯ'Юоть на-тошой и 4 - ее .модтфицирозакной фор®:.

Сопоставление дачных по нллянию ШЛА на кинетические свойства язь-дэлаз органсв-опухоленосггтелеЯ и здоровых мышей в условиях ¡гиги» позволяло еыяеить как сходство, таге и различия в де^стадд 1Ш га

на (чсртент. Сходство заключается в значительном увеличении К^ о: носитольно ФД^ и незначительном относительно 5М2, уменьшении V для обоих субстратов и сами о ранние сроки доело введения 1Ш (224 час). Сравнонио этих данных, полученних т и/✓о с данными по действию НШ на очищенный формент из мищц кролика и цитоплазмати ческой формы альдолазы в условиях т уЦго позволяю сделать ви •вод о непосредственном действии НМ?.! на альдолазу различных органов в условиях ¡ч .1С различиям в действии ¡Ш на свойства альдолаз можно отнести более глубокие и длительные во времони из моненля кяиетичоских параметров альдолазы органоь здоровых животных,чем оиухолоносителей.Слодуот отметить,что в печени опухол носителей наименьшая чувствительность альдолазы к действию Н.Т1 в ражена для «Ж1.Противоположный характер изменений кинетических п раметр^в альдолазы для обоих субстратов обнаружен в мозге опухо-лопоситолей и здоровых мкшей при действии 1К.1.Альдолаза шкщ опу холэносителеЯ монео чувствительна к действию Ш« с обок,»: субстратами,по характер изменений свойств фермента такой же,как у здоровых шшой.

У. Изучение обратимого связывания альдолазы с субклотсчими

стоутстурами различных органов здоровых ли.'зи я под влиянием

Не менее важным представляется выяснение влияния 1Ш на связывание альдолазы с субклеточными структурами различных типов и таким образом влияния на изменение активности альдолазы.

13 настоящее время большое внимание привлечено к изучению ассоциации-диссоциации г.игколитических ферментов с мембранами субклеточных структур и обсуждается участие этого процесса в регуляции активности формантов в клотке.Наиболее изучено обратимое связывание ферментов гликолиза с белком полосы 3 эритроцитов и Р- актином мышц, которые образуют мультнкомплексы /Наыегь 1981,1936; Курганов 1985/.К настоящему времен;: практически отсутствуют данные по обратимому связыванию альдолазы с органеллами различных тканей.Имеющиеся в литературе данные по связыванию альдолазы с мщсросомаш и митохондриями печени Шг /м^/^/находятся к

соответствии с нашими данными по ассоциации альдолаз с этими ор-ганеляами. В работе обнаружено связывание альдолазы с органеллами печени (табл.2),мышц (табл.4),мозга (табл.3).Следует отметить,что активность и У-»«* альдолазы обратимо связанной с органелчами значительно шшэ цитоп..азмат1гческой f5opt.ni фермента,но близки значения относительно обоих субстратов связанней и свободной форм

Табл.2. Петлила НММ на кинетзчзские свойства адьдолазы,

связанной с субклеточными структурам нлоток печена (дан;1не статистически обработаны М -т И - 3-5)

т---- !

субклеточные Фракции 1 1 Л.,. • К^Ю5« | V 1

| 48ч | 158ч 1 18ч \ 168ч ; ' 48ч \ 168ч \ ! 48ч Г 168ч

м^тсхокцрпп 0,С06* -±0,0007 0,0055* ±0,0010 3,67* ±1,01 1,73 ±0,44 0,0069й ±0,00016 ",С09Э* ±0,0040 1,33й* ±0,19 1,43** ±0,29

'■.даре сомы 0,072 ±0,0042 0,095 ±0,016 •3,6й ±1,0 1,33 ±0,38 0,085 ±0,011 0,074 ±0,020 1,82 ±0,3 0,98** ±0,19

1ДР? 0,044 ±0,005 0,024 ±0,0015 2,3 ±0,48 2,05 ±0.~5 0,032 ±0,009 0,019* ±0,0006 1,47 ±0,35 1,38 ±0,2«

Р < 0,5 ** Р< 0,02 относительно контроля V ма"с вырааено з и моль субстрата за на мг белка

Табл.3. Ячияняе НШ на кинетические свойства атьдолазы, сьдзанноЗ с органами .мозга

органами необработанные органеллы ; обработка тритоном х 100 ; ■ обработка Пои 1 £0П

мозга активность 'л?.1 за ¡лик активность />М за ге:н ! К.-10^.1 1 ... ! и тизность ! за :.пгк ! М^

сингл тосомы ноша 168 ч. 0,33 0,42 J 2,9 4,0 6,0 П,7 2,8 3,8 1.0 1,45 2,17 4,5 2,3 7,0

митохотпяп; ногыа 16В ч. ' 0,44 0,42 2,3 7,5 3,2 ■ 9,7 1,0 1.5 1,75 ' 2,3 3,0

ядрд норма 72 ч. - 0,86 2,0 1.3 2.4 2,0 4,0 1,0 1,35 2,6 1,6 3,8

¡шгоосомн норма 72 ч. 168 ч. - - - - 0,27 0,28 0,55 0,31 0,5 0,65 0,97 3,75 I) 35

Табл.4. Птияниа НГ.1.1 на активность и кинетические свойства сгруктур мышц здоровых глыпгай ( Л =1-2) альдодаз из субклет очных

субклеточные фракции активность, иМ за мин V «*акс К,- 1С 5Д2

нот>:.:а 24ч 48ч 163ч 45 дн нот>:.<а 24ч 48ч ко а *а 24т 48 ч

митохондрии 0,12 0,067 0,2 0,0? 0,17 - 0,085 0,29 - 7,0 4,5 ¡лжросош 0,37 . 0,45 0,25 0,33 0,2 0,45 0,67 0,3 2,1 5,5 Г,5

ядра 1,1 1,5 0,73 - - 1,4 2,4 1,3 3,2 7,0 7,5

юрмонта соответствующих органов.На основании элоктрофоретическюс 1ашшх можно сделать вывод,что связанные с органеллаг.ш и цигоплаз-•чтически« формы фермента соответствующих органов содержат одепа-г швы;: спектр изоформентоз альдолазы: по одной форма в ючены и мышцах и по 5 пзоферментов в глозге (но соотношение о тих гаофорч между органеллачи различно и отличается от цитолдаз:..!!). Л мозге по удальной активности свободная и связанная альдолаза распределены неодинаковым образом (рис.17).

Рис.17.Распределение удельной активности альдолазы относительно субстрата -1>ДГ1 в субклеточных структурах и цитоплазме (ц) здорового мозга.

Микросомы (мс) .мдтохондршг (мх), синалтосомы (сс), ядра (я) и миелин (м).

5

ц и сс 8 JT"'

Нами обнаружено, что в гепатоме 22а распределение связанной с органеллами альдола?ы в % отношении к цитоплазмагаческому ферменту по активности в митохондриях близко к мозгу, а в ядрах и макросомах - к мышцам.

После вводенш НММ активность и кинетические свойства альдолазы, связанной с оргакеллаки, различным образом изменяются (табл. 2-4). НлГ.1 влияет на прочность связывания ачьдолазы с раз.лачнымп органеллами. Следует отметить влияние НХ! на изменение отношения ачьдолазы пдтоплазматической к'связанной с субклеточными структура«: и метду собой в печени (рис.18). Значительно изменяется чувствительность альдолазы к инглблрущему действию АТР из митохондрий и микросоа мышц после введения HUM (рис.19).

Рис.18.Етаянио на отноше-. ния максимальных скоростой ак-' топлазматнческой (Их), ш:то--хондриалыгой (Имх), ычкросо-мальной (Уме), адеино.! {V я) альдолаз с субстратами 'Ж> (темные обозначения) и £-.,'1

г» 3

Iй

(светлые обозначения) а: 1,2 - Vu/Vf.oc; 3,4 -

5,6 -i/ix/W б: 1,2 -VAicyVMx;3, i» VmzMI

5,6 - уя/ По оси абсг'тос - врш посла введения НГ.иЛ. и - норма

К II

о.

Рис.19. Ингибирование активное ти альдолазы ATP (0 15 М) отко ситольно субстрата 4ДО из мито хондрий (р ) и микросом (д ) мышц в ношо (н) и поело введения 1Ш.

По оси абсцисс - время поело введения ili.L'vl, н - норма.

i:n кг

Получешшо результаты свидетельствуют о значительных нарушениях в рогуляции активности альдолазы в различных типах ¡слеток на субклеточном уровно после вводеиия 111,1'.! и, возможно, о нарушошшх мотаболичоских процоссов (таких как гликолиз) меток в целом. Подтверждением таких выводов могут служить дашшо о влиянии связывания альдолазы на изменение состояния поверхности мзмбрап и транспортныо свойства мембран / [.си'л о^ь <?1 ¿и7. 1936/. Нельзя исключить влияши фосфолипидоз на связывание альдолазы с мембранами органам, так как в условиях ¡п VI Ни обратимое связывание альдо-дйзы зависит от заряда липосом фосфолипидов / Си^омс*. 1979/. Как ужо отмечаюсь НШ достаточно липофильна и способна к- значительному метилированию ллпидов /И^л&г&с// 1970/, при этом возможно изменение заряда лилидов мембран, которое в свою очередь будет влиять на обратимую адсорбцию фермента. Одновременное влияние НШ на липидц и свойства ферментов несомненно отразится на метаболизме клеток.

Таким образом, при злокачественном росте и воздействии НЫМ наблюдаются нарушения в регуляции активности фермента на разных уровнях, от молекулярного до организма. Изменения шшет:песких свойств альдолазы органов опухоленосителой, связанные со стадиями роста опухоли, осуществляются по разным путям. Вклад в эти изменения вносят как изменения изоферментов альдолазы, различающихся по физико-химическим свойствам и несвойственных нормальным тканям, так и нарушения в метаболизме клеток,навязаниыо опухолевым роото.м.Эти результаты позволили прийти к заключению о появлении некоторой "автономности", и регуляторной "глухоте" ко только опухолевых клеток,но и клеток различных оргапов-опухоленосителеп. Уводенпо противоопухолевого' препарата 11ММ, обладающего и канцерогенным и мутагенным действием,с одной сторо!Ш, оказывгот непосредственное действие на фермент,изменяя его кинетические свойства, чувствительность-к ингибиторам,с другой стороны,вызывает различный

D8T изменений слойств альдолази разных органов опухсленоситалои здоровых Ж1ШОТ1ШХ.Последнее в свою оч редь дало возможность под-рхспуть метаболическую автономность органов опухоленоситэлей.иа-зai;ную опухолевым ростом и выявить значительные нарушения в ротации метаболизма на субклеточном и клеточном уровнях органов вотных,которые могут быть ответственными за метаболическое раздан сировшше' на уровне организма.

' вьшода

Показано,что опухолевый рост вызывает существенные стадийные из-нония активности,кинетических (У.К,Л) и регуляторных свойств аль-лазы з органах о пухоло ко ск т оля (мозге, мышцах, почени), что отра-ет нарушения в регуляции меточного метаболизма этих органов, вязанные опухолевым ростом: на основшши кинетических даншх делается Вывод о появлении в шцах альдолази С, несвойственной нормальной ткани; увеличение нтоза субьедшшц A-типа в мозге одухоленоситоля и отсутствие из-ненийв изофермантном спектре альдолазы в печени опухоленосятелн; в клетках гапатсмы 22а обнаружен(на основашш кинетических и ектрофоретичоских данных) ямбрионалый тип альдолазы А-С. Изучение действия противоопухолевого препарата НШ па свойства ьдолазы органов опухоленоеителей на разных стадиях опухолевого' ста выявило как сходство,так и существенные различия и действии М в условиях in VÍVO : сходстзо проявляется в значительном увеличении ^ для ФДФ и енылении у«д«е .наиболее выраженные относительно ФДФ, чем ФаЕ>; различил обнаружены в динамике и уровне изменений кинетических ойств и чувствительности к ингибированию АТР альдолазы как внут-органов, связанных со стадиями роста, так и между органами опу-леноситоля в процессе роста опухоли. Изучен механизм действия КММ на очищонную альдолззу из мншц аиша в услаг'йх ih viézo;

обнаружонр значительное ингибирование активности альдолазы HI к". 'носителыю субстратов ФДФ и ФШ, степень ингиоировакиа зависит концант'рацг* НШ; ■

показано,что субстраты ФДЗ it 5U5 и кожурентный ингибитор АТГ защишают фермент от иигибироваяия НЖ, что свидетельствует об :гибироваип[ альдолазы не по активному центр; . Пун r/еом щиас-дат модификация аминокислоты существенной для' потер:; активности 'рмента относительно обоих субстратов (ФД* и о®). Ml значите-'

но уменьшает V и увеличивает для обоих субстратов; а) не лояучоно различий электрофоротичоской подвижности л ПЛАТ катишой и модифицированной 1Ш альдолазы;', г) показано различие в дзйствии трипсина на нативнуга и модифицированную НШ адьдолозу методом электрофореза в ПЛАТ. 4. Проведено сравнительное изучение гл:шния 1Ш на активность и кинетические сионства альдолазы здоровых органо.-.! (мозга, мышц, цечо.'й: к сыворотки крови):

г) установлено, что H.L1 вызывает значительные изменения кпнетич. ских свойств альдолазы: уыеньиснио V и уъеличоште 1\(J относителы ОДФ во всех тканях, но максимумы и мпнимуш различаются но глуб) но и по времени в пглх тканях поело введения ЕШ. Показано, что изменения всех параметров альдолазы для iI-i>15 выражены в меньшей CTonehii, чем для

о) обнаружено изменение изоформентных спектров адьдолаз ра-зличш органов после введения НШ, что может свидетельствовать о наруш :сга в рзгуляцшт синтеза альдолазы на давно транскрипции пли трансляция;

а) получоко совпадение данных in vivo и м \'то по иг енешш V и Кj альдолазы для обоих субстратов при действии Ш.1, что свидетельствует о непосредственном дсйста/ KiAi на ферь.еит во г со;', о] галах в ранние сроки после здания;

г) обнаружено, 410 №М влияет на чувствительность альдолазы к И1 газирующему Дайсг-Wua АТР относительно обоих субстратов ъ мозге i мышцах.

Ь. Впервые обнаружена активность ^вдолязи в ядрах, митохондрия; оинаитосог.'.лс, таелкне юз га, а тшке в ядрах, митоховдряях, мпк jxi'.-OKiit. :.сывд и гепатомы 22а и ядрах печени. По активности альдо-лез a jlpv т:л:о ояярани&я с органелла'.ш во всех органах значитоль оетичоутся от цитоллазыаглческогс фермента соответствуздих орга нов, но значение K.J ;угя обоих субстратов свободной и связанной орх'ояыЕла'.иаш^олазы достаточно близки. Изсформенишо спектра альдслазы, связанные о субклеточными структурами, близки к цито плазматическому слзктру фермента соответствующих ортагоз. G. Показано, что НШ оказывает различное и разнонаправленное дэ стпле hp активность, кинотичесюю а регуляторнно (ингибировашв А1Р) свойства альдолазы, связанной с органоллами, а также влияо на прочность евдзшз.-лия альдолазы с мембраками этих органалл ра личных Ti.aHQ'ii.

Список научных ра*от, опубликованных по материала.! диссертации

1. "Ъещонкова Ю.Л. Изменение активности аи-д.ллази в неко-лэрых органах мыпей в процессе развития гепатомы 22а.//Вог.р, лед. химии. -1979. -Т. 4 .-.'55 .-С. G07-6II.

2. Трощенкова H.A. Сравнительное изучение кнт.гическнх тараметров альдолазы из шшц в процессе роста гепатомы 22а

I при дойствпи метилнатрозомочевшш.//В сб. 4 Всесоюзно! «онференции по биохимии шщ.-Ленинград.-1981.-С.III.

3. Трощенкова И.А. Влияние НХ! на кинетические параметры альдолази в органах мышей при развитии гепатомы 22а.//3 натер, всесоюзного совещания "Актуальные проблемы экспериментальной свдютерапии",- Черноголовка.-1980,-Т.I.-С. 137-139.

.4, Трещектсова Ю.А. Газлртшая чувствительность атьдол^зы здоровых мшей и мышей-опухоленосптелей к действию А'-метил-V-нитроз о...очеви;ты .//I) сб. 5 Всесоюзного Биохимического зъоз,ца.-Киев.-1936.-"Нап:а".~Т.2.-С.313-314.

5. Трещенкона Ю.А., Бурлскова Е.Б. Альдолзза печени как возможная мишень действия нитрозометашочевинн.//Биохимия.-IS89.-T. 54 .-.ЧЗ.-С. 516-523.

6. Трещенкова Ю.А. Различная чувствительность изофермен-тов атьдолазы к действию нитрозометпл.ючеЕИны. '/В сб.Республиканской научной кскференщ-н "Механизмы канцеро- и лейкозо-генеза".-1Сиов.-1990.-С.18-19.