Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка промышленной технологии производства рекомбинантного препарата ULP - протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка промышленной технологии производства рекомбинантного препарата ULP - протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков"

На правах рукописи

ЛИТВИНОВА Наталия Алексеевна

Разработка промышленной технологии производства рекомбинантного препарата ЩР — протеиназы для протеолитического процессипга гибридных белков

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2^ИЮЛ 2014

Москва - 2014

005550856

005550856

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» («ФГУП ГосНИИгенетика»)

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Хамитов Равиль Авгатовнч

Официальные оппоненты:

Никитина Зоя Кимовна - доктор биологических наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных средств и ароматических растений», группа микробных продуцентов, руководитель.

Сазонкин Владимир Николаевич - кандидат ветеринарных наук, ФГБУ «Всероссийский государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов», лаборатория контроля качества и стандартизации вирусных лекарственных средств, заведующий.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова».

Защита состоится « » (£С< 7 ¿/^¿2014 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Срябина, 23; тел. 8(495)377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Срябина, 23) и на сайте Ьйр//тЕаую.ги.

Автореферат разослан «// » / ^гР/^Р 2014 г и вывешен на сайте Ьйр//пщаут.ги.

Ученый секретарь диссертационного совета,

профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Вирусные инфекции человека и животных в последние годы приобретают все более широкое распространение. Эффективным способом их лечения является применение иммунобиологических препаратов. Принципиально новым подходом к получению таких препаратов с улучшенными характеристиками является внедрение методов гидролитического расщепления гибридных белков при производстве терапевтических лекарственных средств (Ефимова Н.П., 2002). Высокоэффективной технологией является получение ферментных препаратов с использованием рекомбинантных ДНК в бактериях E.coli, В. Subtilis, и дрожжах S.cerevisiae ввиду их низкой стоимости и безопасности (MonsanP., 1997; Meyer Т., 1999).

Ферменты семейства ULP (Ubiquitin like protein) - протеиназ являются необходимым элементом в универсальной технологии получения различных рекомбинантных белков с тэгом SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier protein) (Müller S., 2001), так как обладают способностью расщеплять различные гибридные белки с высокой точностью и эффективностью (Raymond J. Peroutka III, 2011). Представителями данного семейства являются убиквитин-подобные протеиназы дрожжей (ULP1-2) и сентрин-специфичные протеиназы млекопитающих (SENP1-7).

Одним из вариантов применения ULP - протеиназ является технология производства безметионинового интерферона из гибридного белка - предшественника рекомбинантного SUMO интерферона. На международном рынке в настоящее время существует несколько фирм-производителей, выпускающих фермент ULP - протеиназу, однако продукт каждой компании имеет свои отличительные особенности. Для процесса производства безметионинового интерферона необходима ULP протеиназа, обладающая специфической активностью для конкретного белка - SUMO IFN. Специфическая активность коммерческих протеиназ в отношении данного белка SUMO IFN может сильно отличаться от данных, заявленных в спецификации. Поэтому использование коммерческой протеиназы не гарантирует расщепление SUMO IFN и получение белка безметионинового интерферона и создает необходимость разработки и получения собственного фермента.

В России в данный момент отсутствуют компании, которые занимаются производством субстанций ферментных препаратов, отвечающих всем требованиям качества, обладающих необходимыми характеристиками, высокой специфичностью и активностью в отношении заданных белков, поэтому разработка высокоэффективной технологии получения таких препаратов является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью исследования являлась разработка промышленной технологии получения фермента ULP - протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков при биотехнологическом производстве лекарственных средств. Для выполнения данной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создать штаммы - продуценты ферментов семейства ULP - протеиназ.

2. Оценить специфичность действия полученных ферментов на целевой белок SUMO - интерферон и отобрать наиболее эффективный продуцент.

3. Подобрать условия культивирования штамма - продуцента и очистки фермента.

4. Разработать технологическую схему и валидировать процесс получения ULP -протеиназы.

5. Разработать технические условия на продукт и обосновать его применение при промышленном производстве безметионинового интерферона.

Научная новизна. Впервые были сконструированы штаммы — продуценты ULP - и SENP - протеиназ на основе штамма - реципиента BL21 (DE3), был разработан метод и определена специфическая активность очищенных ферментов ULP - и SENP — протеиназ в отношении гибридного белка - предшественника SUMO интерферона. Разработана технология промышленного культивирования штаммов - продуцентов протеиназ, экспрессирующих фермент внутриклеточно в растворимом виде. Изучено влияние схемы дезинтеграции клеток на выход целевого фермента. Разработана технология хроматографической очистки фермента, обеспечивающая чистоту конечного продукта 9698%, подобран компонентный состав, обеспечивающий стабильность фермента в течение 1,5 лет.

Практическая значимость. Данные, полученные в ходе диссертационной работы, позволяют выбрать и охарактеризовать фермент SUMO - протеиназу, обладающую необходимой активностью и специфичностью в отношении целевого гибридного белка. Фермент ULP - протеиназа используется для получения субстанции безметионинового интерферона альфа-2Ь на производственной площадке ООО «Фармапарк». Разработан нормативный документ - ТУ на производство фермента ULP1 - протеиназа, продукт внесен в производственный регламент процесса получения субстанции безметионинового интерферона на площадке ООО «Фармапарк».

Личный вклад соискателя. Штаммы - продуценты ULP2, SENP1, SENP7 были созданы автором совместно с к.б.н. Шукуровым P.P. Штамм - продуцент ULP1-протеиназы был предоставлен лабораторией экспрессии генов эукариотических систем

ФГУП «ГосНИИгенетика» под руководством к.б.н. Д.Г. Козлова. Автором проведена оценка характеристик штаммов-продуцентов и выбор лучшего штамма для дальнейших исследований, создан мастер - банк и рабочий банк штаммов - продуцентов и проведена его характеризация, проведена разработка способа промышленного культивирования, подбор условий, оптимизация и валидация процессов. Исследование и подбор условий проведения хроматографической очистки фермента проведены автором совместно с C.B. Селищевым. Автором была оценена стабильность и активность фермента во времени.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертации представлены и обсуждены на международном симпозиуме «Биофарма: от науки к промышленности» (Черногория, 2013), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» и сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2013).

Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 5 научных работ, в т.ч. 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК (Биотехнология, Жизнь без опасностей, Биофармацевтический журнал), 1 тезисы научного доклада, 1 патент.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 158 страницах, включает 52 рисунка, 23 таблицы и 4 листа приложений. Список литературы содержит 173 источника, в том числе 158 иностранных авторов. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, описания практического использования результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка литературы и приложений.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Протеиназы семейства ULP, экспрессируемые созданными штаммами, проявляют специфическую активность в отношении гибридного белка - предшественника SUMO IFN, процессируя его С-концевую последовательность по пептидной связи между сайтами Gly-Gly и Lys.

2. Промышленная технология получения ULP - протеиназы, включающая культивирование штамма - продуцента в ферментере в объеме 15 л среды, очистку с использованием аффинного сорбента, обеспечивает выпуск кондиционного продукта с производительностью не менее 180 мг белка с 1 производственного цикла в течение 6 суток.

3. Использование ULP - протеиназы обеспечивает протеолитический процессинг гибридного белка в соотношении фермент: субстрат 1:3500 в технологии производства безметионинового интерферона.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка технологии промышленного культивирования штаммов E.coli -продуцентов ULP - протеиназы проводилась в 2011-2013 гг. в отделе медицинской биотехнологии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Используемые штаммы: Штамм-реципиент - E.coli BL21(DE3), генотип (Е. coli В F- dem ompT hsdS(rB- mB-) gal(DE3)) - лизогенен по DE3, который содержит ген Т7 РНК-полимеразы под контролем lacUV5 промотора. Депонирован во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), Escherichia coli ВКПМ В-6954. E.coli ULP 275А - продуцент ULP1 - протеиназы дрожжей, E.coli ULP 2 - продуцент ULP2 - протеиназы дрожжей, E.coli SENP 1 - продуцент SENP 1 - протеиназы млекопитающих, E.coli SENP 7 - продуцент SENP 7 - протеиназы млекопитающих, E.coli XL - штамм, используемый для молекулярного клонирования.

Реактивы, растворы. При проведении работы использованы реактивы для молекулярного клонирования, компоненты питательных сред, минеральные соли, реагенты для биохимии производства Sigma Aldrich, Panreac, Amresco, Applichem, Fermentas, GE Helthcare.

Методы исследований. Выделение плазмид проводили с помощью набора Аху Prep Plasmid Miniprep (кат № AP-MN-P-250). Разделение фрагментов проводили методом элетрофореза в 1% агарозном геле в присутствии красителя бромистого этидия. Фрагменты элюировали из геля с помощью набора QIAquick gel extraction kit 28706. Реакцию лигирования осуществляли с ДНК-лигазой фагаТ4, инкубировали смесь 12-16 часов при температуре 2-8 °С. Трансформировали компетентные клетки E.coli XL химическим способом с использованием СаСЬ. Оценку выросших колоний проводили рестрихтным анализом, по результатам которого отбирали целевые клоны. Культивирование проводили в ферментере Sartorius stedim Biostat С DCU3 (Sartorius, Германия) в объеме от 10 л до 30 л жидкой питательной среды следующего состава: пептон соевый 10,0 г/л, дрожжевой экстракт 5,0 г/л, Na2HP04 - 7,05 г/л, КН2Р04 - 6,8 г/л, (NH4)2S04 - 3,3 г/л. Процесс проводили при Т=20-38°С, аэрации 5-20 л/мин, и перемешивании 100-500 об/мин. Индуцировали экспрессию белка на 15-17 час путем внесения в биореактор 1М раствора изопропилтиогалактопиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 0,3-0,6 ммоль или внесением лактозы до конечной концентрации 0,5%. Оптическую плотность суспензии определяли спектрофотометрически на приборе Cecil CE 7501(Cecil Aqarius, Германия) при длине волны 600 нм. Разделение суспензии на

клетки и культуральную жидкость проводили в проточном сепараторе СТС-1-06-107 (Westfalia Separator, Германия) при 12 000+10 g, биомассу диспрегировали в буфере для разрушения в соотношении 1:3 с добавлением ингибиторов протеаз на диспергаторе IKA Т8 (IKA, Германия). Клетки разрушали параборически в проточном дезинтеграторе APV 1000 (APV, Дания) 3 раза при давлении 650-750 бар. Степень дезинтеграции контролировалась микроскопией мазка при ЮООх кратном увеличении Axiolab Al(Carl Zeiss, Германия). Хроматографическую очистку белка проводили на приборе Acta Purifier GE Healthcare с использованием сорбентов IMAC HP, SP - сефароза, Sephadex G25. Активность (степень расщепления субстрата) оценивали с помощью электрофореза по Лэмли (ЭФ в ПААГ) и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Очищенный фермент хранили в буфере с 50% глицерина при температуре минус 20+2°С.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Создание штаммов - продуцентов ULP - протеиназ. Для конструирования штаммов-продуцентов протеиназ были использованы гены двух дрожжевых протеиназ убиквитин-подобных белков и двух sentrin — специфичных протеиназ млекопитающих. По литературным данным выбраны и проверены наиболее эффективные каталитические домены протеиназ, специфически отщепляющих частицу SUMO от N- конца гибридного белка (Christopher M. Hickey, Nicole R. Wilson and Mark Hochstrasser, 2012).

Таким образом, из семейства ULP - протеиназ для гидролиза гибридных белков с тэгом SUMO были выбраны следующие ферменты:

1. Ulpl - дрожжевая протеиназа, находящаяся в нуклеоплазме, взаимодействующая с продуктом гена SMT3, содержит 621 аминокислоту, каталитический домен (HIS514-CYS580);

2. Ulp2 - дрожжевая протеиназа, находящаяся в нуклеоплазме, взаимодействующая с продуктом гена SMT4, содержит 1054 аминокислоты, каталитический домен (HIS531-CYS624);

3. SENP1 - протеиназа млекопитающих, локализована в ядерной поре и центре ядра, имеющая сродство и к SUMOl, и к SUM02/3, содержит 643 аминокислоты, каталитический домен на С-конце (HlS533-Cys602);

4. SENP7 локализуется в нуклеоплазме, имеет сродство и к SUMOl, и к SUM02/3, содержит 984 аминокислот, каталитический домен на С-конце (HIS794-Cys926).

Для получения ферментов ULP1, ULP2, SENP1, SENP7 - протеиназ были сконструированы рекомбинантные плазмиды на основе вектора рЕТ-22-15 (Novagen).

Вектор содержит полицистронный лактозный оперон, кодирующий гены метаболизма лактозы, селективный маркер - ген устойчивости к антибиотику ампициллину (ApR) для отбора положительных клонов. В вектор вводили синтетический ген каталитического домена протеиназы (ULP1, ULP2, SENP1, SENP7), в составе которого имеется последовательность 6 остатков гистидина для облегчения выделения и хроматографической очистки фермента.

Для трансформации полученных пладмид использовали штамм E.coli BL21(DE3) -ВКПМ В-6954, несущий в хромосоме ген РНК полимеразы фага Т7. Плазмиды вводили в клетки реципиентного штамма химическим способом, клоны штамма - продуцента отбирали на селективной среде, содержащей антибиотик ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.

Сравнение продуктивности полученных штаммов - продуцентов ULP -протеиназ. Проведен сравнительный анализ культивирования трансформантов на среде LB в присутствии селективного антибиотика ампициллина в концентрации 100 мкг/мкл при температуре 38°С и перемешивании 250 об/мин, и использовании ИПТГ в качестве индуктора.

и t : 3 4 5 м е т а в ю

Рис. 1. Электрофореграмма биомасс штаммов - продуцентов ULP - протеиназ.

1, 6-очищенный препарат протеиназы, 2- ULP2 до индукции, 3- ULP2 после индукции, 4- SENP 7 до индукции, 5- SENP 7 после индукции, 7- SENP 1 после индукции, 8- SENP 1 до индукции, 9-ULP1 до индукции, 10- ULP1 после индукции

Ввиду того, что ферменты имеют различный молекулярный вес, оценку продуктивности проводили методом белкового ЭФ в ПААГ 8% и 15%. Все 4 штамма экспрессируют целевые ферменты (рис.1) с различной эффективностью, кроме того, белок может накапливаться как в растворимом виде внутри клетки, так и в тельцах включениях. Необходимо отметить, что из всех 4 штаммов - продуцентов ферментов индукция экспрессии протеиназы SENP 1 самая высокая. Рефолдинг белка из телец включений -многостадийный трудоемкий процесс, причем потери составляют от 70 до 90%. При

ренатурации белков, обладающих ферментативной активностью, происходит ее снижение в несколько раз. Поэтому необходимо было разработать такую технологию, при которой фермент экспрессируется в растворимом виде. Отработку культивирования штаммов -продуцентов E.coli ULP1, E.coli ULP2, E.coli SENP 1, Е.coli SENP7 с целью получения растворимого фермента проводили изменением нескольких параметров (состава питательной среды, индуктора и условий культивирования). Формирование телец -включений наблюдали при помощи фазово — контрастной микроскопии при увеличении ЮООх. Индукция экспрессии белка контролировалась методом электрофореза в полиакриламидном геле в растворимой и нерастворимой фазе клеточного лизата (рис. 2).

Рис. 2. Электрофорегамма растворимой фракции клеточных лизатов штаммов E.coli ULP1, E.coli ULP2, E.coli SENP 1, E.coli SENP7. Выделены участки с экспрессией целевых ферментов

В результате исследования для каждого штамма -продуцента была выбрана схема культивирования, при которой наибольшее количество фермента экспрессируется в растворимую фазу и не происходит формирования телец включений. Определено, что накопление фермента в растворимой фракции наблюдается у всех штаммов, однако для E.coli SENP 1, E.coli ULP 2 оно наибольшее.

Определение специфической активности ферментов. На основании анализа литературных данных, были выбраны оптимальные физико - химические параметры для действия каждого фермента на заданный субстрат. Для этого была приготовлена серия разведений образцов, содержащих SUMO IFN и ULP-протеиназу с соотношением фермент-субстат 1/10 - 1/1000, инкубировали в течение 45-90 мин. Температура инкубации для дрожжевых протеиназ составляла 10-15 °С, для протеиназ млекопитающих 25°С и 37°С. Концентрацию остаточного (нерасщепленного) белка оценивали методом ОФ-ВЭЖХ по площади основного пика. Для качественной оценки активности использовали метод ЭФ в ПААГ в восстанавливающих условиях, окрашивание Кумасси. Исследование состава буфера для проведения ферментативной реакции показало, что наибольшая активность дрожжевых протеиназ проявляется в присутствии 150 mM NaCl,

10 mM Tris/HCl рН=8,0, 2 шМ dithiothreitol, для протеиназ млекопитающих буфер

содержит Tris НС1 рН=7,5,0,1% Tween 20,150 mM NaCl, 2 mM DTT.

Таблица 1 - Сравнительная характеристика специфической активности полученных протеиназ в отношении субстрата SUMO IFN

Название фермента Степень гидролиза SUMO IFN в зависимости от условий протекания реакции, процент Х+8

Ю°С; 45 минут, буфер 1 15°С; 1,5часа, буфер 2 25°С; 1,5 часа, буфер 3 37°С; 1,5 часа, буфер 4

ULP 1 96,8+0,9 95,1+0,9 94,8+0,9 93,4+0,9

ULP2 50,4+0,5 20,8 ±0,2 36,6+0,4 43,8+0,4

SENP 1 14,4+0,2 6,7+0,1 И >4+0,1 5,6+0,1

SENP7 3,8+0,1 5,3+0,1 1,9±0,1 7,3±0,1

Из полученных данных (табл. 1) следует, что наибольшую активность во всех четырех случаях проявляет фермент ULP1 - протеиназа, расщепляющая субстрат на 9397%; фермент ULP2 - протеиназа расщепляет субстрат на 20-50 %, а протеиназы млекопитающих SENP 1 и SENP7 проявляют низкую активность в отношении гибридного белка SUMO интерферона, расщепляя его не более чем на 15%.Отсутствие N-концевого метионина в последовательности интерферона после отщепления SUMO было доказано методом пептидного картирования с использованием ВЭЖХ.

Таким образом, для дальнейших исследований выбран фермент протеиназа ULP 1, представляющая собой последовательность 275 остатков каталитического домена дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Создание системы клеточных банков промышленного штамма — продуцента и их характеризация. В ходе работы были созданы мастер - банк и рабочий банк штамма-продуцента E.coli ULP1. Лиофильное высушивание штамма проводили в 5 различных средах (табл.2). Подбор криопротектора осуществляли таким образом, чтобы жизнеспособность микроорганизма была максимальной и не снижалась на протяжении всего срока тестирования.

Исследование влияния составов криозащитной среды для лиофильного высушивания на жизнеспособность и продуктивность бактерий показало, что наилучшей является среда КЗ (сахароза 7,5%, декстран 0,5%, глутамат натрия 1%), на которой жизнеспособность штамма - продуцента сохраняется на уровне 4,5* 109 кл/мл на 24 -й месяц хранения. Кроме того, КЗ не содержит компонентов животного происхождения в соответствии с требованиями европейских регуляторных органов.

Таблица 2. Составы криозащитных сред для лиофилизации штамма E.coli ULP1

Название Состав используемого Концентрация компонента

среды крио протектора

К1 Сахароза 10%

Желатин 3%

К2 Сахароза 12%

КЗ Сахароза 7,5%

Декстран 0,5%

Глутамат натрия 1%

К4 Пептон 1,5%

Сахароза 10%

К5 Агар -агар 0,5%

Сахароза 12%

Для производственного штамма - продуцента ULP - протеиназы и его клеточных банков проведена характеризация безопасности, патогенности, фенотипической идентификации, микробиологической чистоты, отсутствия заражения бактериофагами, стабильности при пассировании (степень элиминации плазмиды), в соответствии с руководством ICH Q5D EurPh, 0784. Данная информация о штамме - продуценте и его банках необходима по требованиям международных регуляторных органов как доказательство безопасности и стабильности выпускаемого фармацевтического продукта.

Разработка схемы промышленного культивирования штамма - продуцента ULP1 — протеиназы. Для созданной и охарактеризованной культуры штамма -продуцента ULP1 - протеиназы были исследованы режимы культивирования, обеспечивающие максимальный выход биомассы и целевого фермента. Работа включала оптимизацию состава питательной среды, в ходе которой был подобран углеродсодержащий компонент, индуктор и его концентрация, азотсодержащий компонент, минеральные соли, витамины. Определены физико-химические параметры культивирования: температура, pH, массообменные характеристики процесса, время проведения процесса, при которых достигается наибольший выход биомассы и целевого белка. В качестве источника азота был использован соевый пептон в концентрациях 1-3% и дрожжевой экстракт в концентрациях 0,5-1,5% различных фирм - производителей. Показано, что для достижения максимальной продуктивности штамма - продуцента необходим пептон 140 Amresco в концентрации 1% и дрожжевой экстракт в концентрации 0,5%. Дрожжевой экстракт фирмы Biospringer 0207 не только удовлетворяет потребностям в макро- и микроэлементах в процессе культивирования штамма-продуцента, но и значительно дешевле (в 40 раз) дрожжевого экстракта Sigma-Aldrich Y1625, поэтому он подходит для промышленного производства целевого фермента ULP1 -протеиназы.

В качестве углеродсодержащего субстрата были использованы моносахарид глюкоза и дисахарид лактоза, а также трехатомный спирт глицерин. Культивирование штамма E.coli - продуцента ULP - протеиназы в колбах Эрленмейера при 25°С на стандартной солевой среде с добавлением глицерина 2% или глюкозы 0,5% и индуктора ИПТГ показало, что накопление биомассы на глицерине происходит более равномерно, чем на глюкозе, скорость роста культуры постоянна на протяжении 10-12 часов, достигает 6,1+0,1 o.e. на последний час культивирования. Глюкоза является легкоусвояемым субстратом, поэтому она быстро метаболизируется, лаг-фаза практически отсутствует, экспоненциальная фаза роста культуры ярко выражена, и уже к 13-14 часу культура начинает входить в стационарную фазу роста, причем конечная оптическая плотность составляет 5+0,1 o.e. По данным ЭФ в ПААГ выход белка в этих опытах находится на одном уровне и составляет (5,8+0,1) мг/л.

Выбор схемы подпитки по субстрату. Выращивание культуры штамма-продуцента без подпиток по субстрату не достаточно эффективно, максимальный конечный выход биомассы составляет 9,5 г влажной биомассы с 1 литра КЖ, содержание белка (6,3+0,1) мг/л КЖ. Было исследовано несколько вариантов подпиток.

Рис. 3. Электрофореграмма биомасс с различными типами подпиток. 1 -маркер молекулярных масс, 2 - очищенный фермент, 3 - без подпиток, 4 - подпитка глицерин 3%, 5 - подпитка глюкоза 1% + глицерин 2,5%, 6 - подпитка глицерин + глюкоза + лактоза, 7 - лактоза 0,5%, 8 - лактоза 1%, 9 - до индукции

Добавление 80%-ного глицерина порциями по 100 г на 14-17 час культивирования до концентрации в среде 3% увеличивает выход биомассы на 12,5%, при этом выход целевого белка увеличивается всего на 5% по сравнению с процессом без подпиток. Использование 3-х стадийной подпитки глюкоза/глицерин/лактоза, описанной нами ранее [5], увеличило выход биомассы на 14,7 %, конечная оптическая плотность составила 32,5 o.e., выход биомассы 19,4 г/л влажной биомассы. Однако содержание очищенного белка

составило (8,9+0,1) мг/л КЖ. При использовании лактозы - дополнительного углеродсодержащего субстрата, являющегося индуктором целевого белка, в концентрации 0,5 % на 17-19 час, культура продолжает рост, и выход биомассы составляет 16,3 г/л влажной биомассы. Содержание очищенного белка составило (12,9+0,1) мг/л КЖ, поэтому для дальнейших экспериментов была выбрана эта схема внесения подпитки.

Оптимизация физико-химических характеристик процесса. Влияние температуры. Из литературных данных известно, что синтез внутриклеточного растворимого белка протекает эффективнее, как правило, при пониженной температуре (Studier F.William, 2005). Поэтому культивирование проводилось в диапазоне температур 20-28°С (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость параметров культивирования от температуры

При 28°С процесс

культивирования занимает 1719 часов; конечная оптическая плотность при 600 нм достигает (22,8+0,5) о.е. Во время культивирования штамма продуцента при пониженной температуре 20°С метаболические процессы, происходящие в клетке, замедляются, время культивирования увеличивается до 24-28 часов, однако индукция экспрессии целевого фермента происходит интенсивнее и длится в течение 8-9 часов, во время которых его концентрация возрастает и достигает (15,5+0,5) мг/л. Дальнейшее снижение температуры сильно увеличивает время процесса, поэтому оптимальной при культивировании штамма-продуцента ULP-протеиназы является температура 20+0,5°С.

Влияние рН-среды. В процессе культивирования вместе с накоплением биомассы происходит изменение кислотности среды. При культивировании штамма-продуцента ULP - протеиназы начальное значение рН среды находится в диапазоне 6,8-6,9, на 7-8 час начинается увеличение рН среды и на последний час культивирования достигает значений до 8,4-8,6. Такое высокое значение кислотности среды может негативно отразиться на синтезе белка, поэтому при значениях рН выше 7,3 добавляли ортофосфорную или уксусную кислоту для поддержания рН на уровне 6,9-7,0 единиц.

40 -

Температура, ОС 18 20 22 25 28 30

■ 00, o.e. 7,5 10 13 13,4 22,8 24,5

■ выход белка 16,1 15,5 13,1 12,3 10 8,1

■ время культивирования 35 28 22 20 19 17

Культивирование штамма - продуцента в ферментере. При переносе технологии в условия культивирования в ферментере в объеме среды 15 л были исследованы характеристики продуктивности штамма при перемешивании в диапазоне 300-800 об/мин и аэрации 5-20 л/мин. Были подобраны оптимальные условия массообмена - подача воздуха через барботер со скоростью 10 л/мин и перемешивание мешалкой 300

Рис. 5. Характеристики процесса культивирования штамма - продуцента в ферментере при перемешивании 300 об/мин и аэрации 10 л/мин

об/мин (рис. 5).

"перемешивание, об/минЧО

™ODGOO»M,o.f?.

Подтверждение стабильности процесса культивирования штамма-продуцента ULP - протеиназы. Проведение 3 последовательных установочных серий культивирования продуцента ULP - протеиназы в ферментере в объеме 15 л показало стабильность и воспроизводимость процесса. В результате построены контрольные карты Шухарата. Рассчитано, что средний выход составляет 15,97 г влажной биомассы с 1 литра клеточной суспензии, содержание целевого белка составляет 18,87 мг/л.

Выбор режима дезинтеграции биомассы штамма - продуцента. Конструкция рекомбинантных плазмид и подбор условий культивирования определяет экспрессию детерминируемого ими целевого белка: локализацию в цитоплазме клеток Е. coli либо секрецию через клеточную мембрану в культуральную жидкость. Выбранный штамм -продуцент ULP - протеиназы и разработанная схема культивирования предполагает экспрессию целевого фермента в растворимом виде в периплазматическое пространство клетки. Такая форма накопления целевого продукта имеет ряд трудностей при выделении по сравнению с экспрессией белка в тельцах включениях. Работу с лизатом клеток следует проводить при температуре не выше 30 °С, чтобы избежать инактивации фермента, вместе с тем производительность процесса должна быть максимальной. Поэтому из всех методов был выбран баллистический способ разрушения бактериальной биомассы, который предполагает лизис биомассы в количестве 100 - 500 г за одну серию.

Давление в баллистической камере, бар

Рис. 6. Зависимость параметров суспензии (степени разрушения клеток и температуры суспензии) от нагнетаемого давления

Были исследованы режимы дезинтеграции суспензии, содержащей 100 г биомассы в буфере для разрушения при давлении 100 - 1000 бар при однократном прохождении суспензии через камеру. Из данных, представленных на рис. 6, следует, что при давлении 400 бар разрушается около 25-30% клеток, повышение давления от 550 до 800 позволяет достичь степени разрушения 70-90%. Однако, необходимо учитывать, что основным продуктом является растворимый фермент, который не может быть стабилен при температуре выше 20-25 °С. По результатам экспериментов был выбран режим дезинтеграции при давлении 650-700 бар, при котором температура достигает максимум 20 °С, и степень разрушения клеток составляет 80-85%. Эксперименты с режимами дезинтеграции показали, что наиболее эффективен режим прохождения суспензии через баллистическую камеру последовательно 3 раза при давлении 650-700 бар с паузами по 10 мин. Это позволяет разрушить 95% клеток, причем температура суспензии не поднимается выше 20 °С, сохраняя целевой фермент в нативном виде.

Хроматографическая очистка фермента ULP1 - протеиназа. Генетическая последовательность, кодирующая целевой фермент ULPl-протеиназу, содержит на конце 6 аминокислотных остатков гистидина (6 HIS), что определяет использование металл-хелатной хроматографии на первой ступени очистки. Был исследован процесс хроматографии на мелкозернистом сорбенте IMAC HP, заряженном никелем, который показал на 15 % больший выход фермента, в отличие от крупнозернистого IMAC FF, чистота элюированного раствора фермента составляет 85%. Однако использование рекомбинантных белков с чистотой менее 90% непригодно для фармацевтической промышленности и требует дополнительных методов очистки. Исследование различных

типов хроматографии для доочистки фермента от примесей показало, что наиболее эффективна хроматография на сильном катионообменном сорбенте SP-сефароза. Критическим параметром данной стадии является элюция фермента с колонны, т.к. все примеси обладают схожим зарядом, связываются с сорбентом и разделение происходит путем подбора схемы градиента элюирующих буферов. Эксперименты по выбору схемы и концентрации элюентов показали, что наилучшим вариантом является элюция градиентом имидазола. Первый примесный пик снимается ступенчато, при 40% буфера SPB и собирается во фракции А1-А6, после чего, увеличивая концентрацию буфера SPB до 65%, целевой фермент концентрируется во фракциях А10-В5. Такой способ позволяет получить фермент ULPl-протеиназу в центральных фракциях с чистотой более 95%.

Разработанная схема очистки позволяет получить фермент ULP-протеиназу с чистотой 96-98% и выходом 1,8 мг/г биомассы, что характеризует ее как эффективную технологию, применимую в фармацевтической промышленности. Проведение 3-х валидационных серий хроматографической очистки фермента ULP1 - протеиназы показало воспроизводимость и стабильность данной технологии (табл.3), средний выход в 1 серии составил 170,6 мг очищенного белка, были построены расчетные карты Шухарта.

Таблица 3. Параметры процесса 3-х валидационных серий получения фермента

ULP - протеиназы

Номер серии культивирования Выход биомассы из одной серии, г Номер серии очистки Выход целевого белка в серии, мг

190613 243,60 121213 161,02

080813 230,31 131213 171,84

110913 246,50 141213 179,15

В результате была разработана промышленная схема выделения и очистки фермента ULP-протеиназа с выходом по целевому белку 32 мг/л и чистотой более 98%, позволяющая получить 180 мг очищенного фермента за один производственный цикл. Технологическая схема получения очищенного фермента представлена на рис.7. Схема включает несколько основных стадий, и стадии подготовки рабочих растворов, оборудования и питательных сред. Культивирование штамма - продуцента начинают с разморозки рабочего банка, подготовки инокулята, далее проводят выращивание культуры в ферментере в объеме 15л с целью получения биомассы. Суспензию клеток разделяют на проточном сепараторе, полученную биомассу дезинтегрируют в лизирующем буфере и подвергают хроматографической очистке с Ni - хелатным сорбентом.

Технологическая схема производства ULP - протеиназы

Рис. 7. Технологическая схема и контрольные точки процесса получения ULP - протеиназы

ютер банк и Рабочий банк штамм! - продуцента

Годготовка инокулята для засева в ^^ ферментер 1,5 л 28 °С^^^

сультивирование штамма - продуцента в объеме 15 л 20 °С

Ферментер Sartorius, C-DCU3 \/=42л

:епарация суспензии клеток, ^(ранение биомассы

Определение содержания белка. ЭФ

¡олучение клеточного . лизата ^

1нная хроматография на сорбеь IMAC HP заряженном Ni Объем колонны 1-5 мл 2-8 °С

шонообменная хроматография h¡ сорбенте SP - сефароза. 2-8 сС

Хроматофаф ÄKTA purifier, GE Healthcare

[вэжх]

^ль - фильтрация на сорбен-Sephadex G25, 2-8 °С

{ормирование субстанции, хранение - 20 °С

I день: начало 8.00 II день: окончание 20.00 Время процесса 36 ч

Шейкер - инкубатор Certomat

Пептон 2%, дрожжевой экстракт 1%, минеральные соли

Пептон 2%. дрожжевой экстракт 1%, минеральные соли, ампициллин 100 мкг/мкл, лактоза 25% раствор

Проточный сепаратор Gea Westfalia

Хроматограф ÄKTA purifier, GE Healthcare

Испытание белка на подлинность, специфическую

активность, рН, определение концентрации, содержание примесей белковой природы, МБЧ. ДНК клетки - хозяина

Буфер для лизиса (300 мМ натрия хлорид, 50 мМ натрия фосфат рН=8,0. 20 мМ имидазол)

VII день: начало 09.00 XII день: Окончание 19.00 Время процесса 130 ч

V день: начало 09.00 VI день:Окончание 19.00 Время процесса 34 ч

Дезинтегратор APV1000 : Центрифуга Biofuge Heraus

III день: начало 15.00

окончание 19.00 Время процесса 4 ч

Хроматограф АКТА purifier, GE Healthcare

III день: начало 8.00

окончание 14.00 Время процесса 6 ч

IV день: начало09.00

Окончание 18.00 Время процесса 8 ч

Многоступенчатый градиент Буфера SP А в

Буфер SPB от 0 % до 100 % Буфер SPA (50 мМ Фосфат натрия. рН=6Д

0,1% Полисорбат 20) Буфер SPB (50 мМ Фосфат натрия, рН=6,0. 0.1% Полисорбат 20, 500 мМ натрия хлорид)

Определение чистоты белка во фракциях

Буфер Helat А: 20 мМ TrisHCl рН-8.0. 30 мМ Имидазол. 500 мМ натрия хлорид Буфер Helat В:20 мМ TrisHCl рН=8Д500 мМ Имидазол. 500 мМ натрия хлорид

Испытание фракций на подлинность и примеси

По результатам анализов объединяют целевые фракции и дочищают белок с помощью катионообменной хроматографии. Полученный продукт переводят в буфер для хранения с использованием гель - фильтрации, нормируют субстанцию и анализируют по параметрам качества. Полный цикл получения фермента занимает 6 дней, и дополнительно 5 дней на проведение анализов выходного контроля.

Исследование стабильности фермента ULP1 - протеиназы при хранении. Для использования фермента ULP1 - протеиназы в фармацевтическом производстве необходимо подтвердить его стабильность и соответствие определяемым параметрам в течение всего срока хранения. Фермент был заложен на ускоренное хранение в буферах, содержащих фосфаты, трегалозу, сахарозу и глицерин, значение рН варьировалось от 6,0 до 8,0 при различных температурных режимах. Во все образцы был добавлен 0,1% Полисорбат 20, 150 мМ NaCl. После проведенного анализа образцов методом ЭФ и ОФ -ВЭЖХ было установлено, что при температуре 37°С фермент в течение 14 дней практически полностью деградирует во всех составах буферов, в присутствии стабилизатора и при различном рН концентрация его падает с 0,55 мг/мл до 0,05 мг/мл. При 25°С на 40 день концентрация падает с 0,57 мг/мл до 0,23 мг/мл. Хранение фермента при 2-8°С в течение 40 дней обеспечивает сохранение концентрации на уровне - 0,55 мг/мл. Исследование рН буферного раствора фермента ULP1 - протеиназы в диапазоне 6,0-8,0 при ускоренном хранении при 25°С в течение 40 дней показало, что наилучшим значением водородного показателя является 6,5.

В результате подбора компонентного состава буфера для хранения фермента оптимальной композицией является: 50 шМ натрий-фосфатный буфер, 0,1% Полисорбат 20, 150 мМ NaCl, 50% глицерин. Исследование стабильности 5 серий раствора фермента ULP - протеиназы в течение 18 месяцев показало, что на протяжении всего срока годности сохраняется высокая активность фермента в отношении гибридного белка-предшественника рекомбинантного безметионинового интерферона.

Экономическая эффективность процесса производства ULP1 — протеиназы. Сравнительный анализ существующих на рынке коммерческих протеиназ показал, что стоимость фермента для полного расщепления 1 мг гибридного белка составляет от 5 до $600. Для одного стандартного производственного цикла получения безметининового интерферона на 58 г белка необходимо фермента на сумму около $20 000. При стандартном режиме работы (2 растворения по 58 г белка в неделю) стоимость необходимого количества фермента составляет $1 900 000. Для разработанной технологии затраты на реактивы и материалы для производства 1 серии (180 мг)

фермента ULPl-протеиназы составляют примерно 10 000 руб, расчетная стоимость амортизационных расходов 35 ООО руб. Для одного производственного цикла (58 г белка в объеме 38 л ренатурационного буфера) необходимо 16 мг фермента, стоимость которого составляет 4000 руб, что в 175 раз дешевле коммерческого фермента. Годовые потребности в ферменте обеспечиваются выпуском 1500 мг за 3 серии культивирования и 8 серий хроматографической очистки, затраты на производство фермента при этом составляют 360 000 руб.

ВЫВОДЫ

1. Методами генной инженерии созданы 4 штамма - продуцента протеиназ семейства ULP на основе вектора рЕТ-22-15, содержащих каталитические домены ULP -протеиназ дрожжей и sentrin - специфичных протеиназ SENP млекопитающих.

2. Разработан метод определения специфической активности протеиназ семейства ULP в отношении гибридного белка с тэгом SUMO. Специфическая активность протеиназы, содержащая дрожжевую последовательность 275 остатков каталитического домена ULP1, обладает активностью более 95%.

3. Созданный и охарактеризованный мастер - банка и рабочий банка производственного штамма - продуцента E.coli ULP1 соответствует требованиям, предъявляемыми в фармацевтическом производстве.

4. Технология промышленного культивирования штамма - продуцента в ферментере в объеме 15 л среды обеспечивает необходимую потребность для производства рекомбинантного белка SUMO IFN.

5. Разработанная промышленная технология хроматографической очистки фермента протеиназы ULP1 обеспечивает чистоту более 95% и выход 1,8 мг/г биомассы

6. Проведены 3 валидационные серии культивирования в объеме 15 л и очистки фермента, построены расчетные карты Шухарта, доказана стабильность и воспроизводимость разработанной технологии.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Разработана и утверждена нормативная документация для серийного выпуска фермента ULP1- протеиназы - технологические карты, методики, технические условия, описывающие процесс производства и спецификацию на продукт.

2. Фермент ULP1- протеиназа используется в серийном производстве безметионинового интерферона на этапе протеолитического процессинга белка как необходимый элемент технологического процесса.

3. Разработана и утверждена нормативная документация на выпуск фермента -технические условия на процесс производства дрожжевой ULP 1- протеиназы.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать использование фермента ULP 1 - протеиназы для гидролитического расщепления рекомбинантных гибридных белков с тэгом SUMO лабораториям генетической инженерии.

2. Рекомендовать использование полученных штаммов ULP — протеиназ в качестве продуцентов ферментов для протеолитического процессинга гибридных белков биотехнологическим производствам фармацевтического профиля.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Литвинова H.A./ Разработка составов криозащитной среды для лиофилизации промышленных штаммов-продуцентов ULP - протеиназы и альфа-2-а (альфа-2-b) интерферона./ H.A. Литвинова, Н.В. Стратонова, Р.А.Хамитов // Биофармацевтический журнал. - 2013,- № 5. Т.5.- С.31-37.

2. Разработка технологии промышленного культивирования штамма E.coli -продуцента фермента ULP - протеиназы, осуществляющего протеолитический процессии г SUMO-интерферона, гибридного белка-предшественника альфа-интерферона / Н.А.Литвинова, Н.В.Стратонова, В.С.Леонов, Р.А.Хамитов //Биотехнология. - 2013. - № 5.- С.60-70.

3. Создание промышленной технологии выделения и очистки фермента ULP-протеиназа, осуществляющего гидролиз гибридного белка-предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа/Литвинова H.A., Селищев C.B., Жученко М.А. и др. // Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. -2013,-№4.-С. 90-94.

4. Разработка промышленной технологии получения фермента ULP - протеиназы для протеолитического процессинга гибридного белка - предшественника SUMO - IFN/ Литвинова H.A., Стратонова Н.В., Хамитов P.A. и др. // Тезисы IV Международного симпозиума «Биофарма 2013:от науки к промышленности».- М:Фолиум - 2013 - С.26-27.

5. Способ промышленного культивирования штаммов Е. coli, полученных на основе штаммов BL21(DE3), несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUVS промотора, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения /Хамитов P.A., Скрыпин В.И., Литвинова H.A., Леонов B.C., Стратонова Н.В. // Патент РФ № 2473683. 2013. Бюл. № 3.

Подписано в печать:

09.07.2014

Заказ № 10110 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Объем: 1 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wwvv.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Литвинова, Наталия Алексеевна, Москва

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно - исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

На правах рукописи

04201460538

Литвинова Наталия Алексеевна

Разработка промышленной технологии производства рекомбинантного препарата 11ЬР - протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Хамитов Р.А.

Москва-2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................9

*N

"Т

1.1. Система посттрансляционной модификации SUMO................................9

1.1.1. Метаболический путь системы SUMO. Белок-модификатор SUMO и его изоформы......................................................................................................11

1.1.2. SUMO-специфические протеиназы (SENP).............................................15

1.1.3. Биологические функции системы SUMO.................................................17

1.1.4. Участие системы SUMO в регуляции транскрипции.............................18

1.1.5. Действие системы SUMO в обеспечении стабильности генома............19

1.1.6. Белки, взаимодействующие с SUMO нековалентным образом.............20

1.1.7. Регулирование SUMO модификации........................................................22

1.2. SUMO-протеиназы......................................................................................23

1.2.1. Семейство SUMO-протеиназ.....................................................................24

1.2.2. Структура SUMO-протеиназ......................................................................27

1.2.3. Субстратная специфичность SUMO-протеиназ......................................31

1.2.4. Регуляция SUMO протеиназ......................................................................37

1.3. Клеточная роль SUMO-протеиназ.............................................................40

1.4. Использование SUMO-протеиназы в биотехнологии.............................44

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................................54

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ....................................54

2.1.1. Используемые штаммы..............................................................................54

2.1.2. Реактивы, растворы.....................................................................................55

2.1.3. Создание штаммов-продуцентов...............................................................57

2.1.4. Создание системы клеточных банков.......................................................57

2.1.5. Культивирование штаммов-продуцентов.................................................58

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................................................62

2.2.1. Создание штаммов-продуцентов БЦМО-протеиназ...............................63

2.2.2. Создание системы клеточных банков промышленного штамма — продуцента, и их характеризация........................................................................81

2.2.3. Разработка схемы промышленного культивирования штамма -продуцента ЦЬР - протеиназы...........................................................................85

2.2.4. Разработка схемы выделения и очистки фермента..............................109

2.2.5. Исследование стабильности фермента ULP - протеиназы при хранении ...............................................................................................118

2.2.6. Технологическая схема производства фермента «Дрожжевая ULP1-

протеиназа»..........................................................................................................122

2.2.7. Спецификация критериев качества на продукт «Дрожжевая ИЬР1 — протеиназа»..........................................................................................................125

2.2.8. Экономическая эффективность процесса производства фермента ЦЬР1-протеиназа............................................................................................................127

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................129

4. ВЫВОДЫ.......................................................................................................134

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................................................134

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 135

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.....................................136

ПРИЛОЖЕНИЯ...................................................................................................154

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В современном мире развитие биотехнологии и научные открытия в области энзимологии сделали ферментные препараты одними из самых активных участников многих технологий. Использование ферментов позволяет значительно ускорять технологические процессы, увеличивать выход готовой продукции, повышать ее качество, экономить ценное сырье. Высокоэффективной технологией является получение ферментных препаратов с использованием рекомбинантных ДНК в бактериях E.coli, В. Siibtilis, и дрожжах S.cerevisiae ввиду их низкой стоимости и безопасности [1,2].

Принципиально новым подходом к получению иммунобиологических препаратов с улучшенными характеристиками является внедрение методов гидролитического расщепления гибридных белков при производстве терапевтических лекарственных средств [3].

Ферменты семейства ULP - протеиназ являются необходимым элементом в универсальной технологии получения различных рекомбинантных гибридных белков с тэгом SUMO [4], так как обладают способностью расщеплять различные гибридные белки с высокой точностью и эффективностью [5].

Одним из вариантов применения ULP — протеиназ - является технология производства безметионинового интерферона из гибридного белка -предшественника рекомбинантного SUMO IFN. На международном рынке в настоящее время существует несколько фирм-производителей, выпускающих фермент ULP - протеиназу. Однако, продукт, выпускаемый каждой компанией, имеет свои отличительные особенности. Для процесса производства безметионинового интерферона необходима ULP протеиназа, обладающая специфической активностью для конкретного белка - SUMO IFN. Специфическая активность коммерческих протеиназ в отношении данного белка SUMO IFN может сильно отличаться от данных, заявленных в спецификации. Поэтому использование коммерческой протеиназы не гарантирует расщепление SUMO IFN

и получение белка безметионинового интерферона и создает необходимость разработки и получения собственного фермента.

В России в данный момент практически отсутствуют компании, которые занимаются производством субстанций ферментных препаратов, отвечающих всем требованиям качества, обладающих необходимыми характеристиками, высокой специфичностью и активностью в отношении заданных белков, поэтому разработка высокоэффективной технологии получения таких препаратов является актуальной задачей

Цель и задачи исследований. Целью данного исследования являлась разработка промышленной технологии получения фермента ULP — протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков при биотехнологическом производстве лекарственных средств.

Для выполнения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создать штаммы - продуценты ферментов семейства ULP - протеиназ.

2. Оценить специфичность действия полученных ферментов на целевой белок SUMO - интерферон и отобрать наиболее эффективный продуцент.

3. Подобрать условия культивирования штамма - продуцента и очистки фермента.

4. Разработать технологическую схему и стандартизировать процесс получения ULP - протеиназы.

5. Разработать технические условия на продукт и обосновать его применение при промышленном производстве безметионинового интерферона.

Научная новизна. Впервые были сконструированы штаммы - продуценты ULP - и SENP - протеиназ на основе штамма - реципиента BL21 (DE3), был разработан метод и определена специфическая активность очищенных ферментов ULP - и SENP - протеиназ в отношении гибридного белка — предшественника SUMO интерферона. Разработана технология промышленного культивирования штаммов - продуцентов протеиназ, экспрессирующих фермент внутриклеточно в растворимом виде. Изучено влияние схемы дезинтеграции клеток на выход целевого фермента. Разработана технология хроматографической очистки

фермента, обеспечивающая чистоту конечного продукта 96-98%, подобран компонентный состав, обеспечивающий стабильность фермента в течение 2,5 лет.

Практическая значимость. Данные, полученные в ходе диссертационной работы, позволяют выбрать и охарактеризовать фермент SUMO - протеиназу, обладающую необходимой активностью и специфичностью в отношении целевого гибридного белка. Фермент ULP - протеиназа используется для получения субстанции безметионинового интерферона альфа-2-b на производственной площадке ООО «Фармапарк». Разработан нормативный документ - ТУ на производство фермента ULP1 — протеиназа, продукт внесен в производственный регламент процесса получения субстанции безметионинового интерферона на площадке ООО «Фармапарк».

Личный вклад соискателя. Штаммы - продуценты ULP2, SENP1, SENP7 были созданы автором совместно с к.б.н. Шукуровым P.P. Штамм - продуцент ULP1 протеиназы был предоставлен лабораторией экспрессии генов эукариотических систем ФГУП «ГосНИИгенетика» под руководством к.б.н. Д.Г. Козлова, за что им выражается глубокая благодарность. Автором проведена оценка характеристик штаммов-продуцентов и выбор лучшего штамма для дальнейших исследований, создан мастер - банк и рабочий банк штаммов -продуцентов и проведена его характеризация, проведена разработка способа промышленного культивирования, подбор условий, оптимизация и валидация процессов. Исследование и подбор условий проведения хроматографической очистки фермента проведены автором совместно с C.B. Селищевым. Автором была оценена стабильность и активность фермента во времени.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертации представлены и обсуждены на международном симпозиуме «Биофарма: от науки к промышленности» (Черногория, 2013), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» и сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2013).

Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на _ страницах,

включает 52 рисунка, 23 таблицы и 4 листа приложений. Список литературы содержит 173 источника, в том числе 158 иностранных авторов. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, описания практического использования результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка литературы и приложений.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Протеиназы семейства ULP, экспрессируемые созданными штаммами, проявляют специфическую активность в отношении гибридного белка -предшественника SUMO IFN, процессируя его С-концевую последовательность по пептидной связи между сайтами Gly-Gly и Lys .

2. Промышленная технология получения ULP - протеиназы, включающая культивирование штамма - продуцента в ферментере в объеме 15 л среды, очистку с использованием аффинного сорбента обеспечивает выпуск кондиционного продукта с производительностью не менее 180 мг белка с одного производственного цикла в течение 6 суток.

3. Использование ULP - протеиназы обеспечивает протеолитический процессинг гибридного белка в соотношении фермент: субстрат 1:3500 в технологии производства безметионинового интерферона.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Система посттрансляционной модификации SUMO

Во многих случаях после окончания процесса трансляции клеточные белки подвергаются посттрансляционной модификации, которая обеспечивает клетке дополнительный контроль над активностью белка, его локализацией и стабильностью.

Наиболее известными среди посттрансляционных белков-модификаторов являются убиквитин и ряд убиквитин-подобных белков. Убиквитин и убиквитин-подобные белки обладают общей пространственной структурой, известной как (3-grasp (убиквитин-подобная), и консервативной ферментативной стратегией активации и связывания с субстратом [6]. Одним из убиквитин-подобных белков является белок SUMO (Small Ubiquitin-Related Modifier - небольшой убиквитин-подобный модификатор), который связывается с множеством белков у всех видов живых существ, в том числе у Saccharomyces cerevisiae [7-10], Arabidopsis thaliana [11,12] и humans [13,14].

Соответственно, белок SUMO и его взаимодействие с другими белками влияют на многочисленные клеточные процессы.

В настоящее время посттрансляционная модификация внутриклеточных белков, связанная с их взаимодействием с SUMO, считается важнейшим регуляторным механизмом, который обеспечивает обратимое управление активностью, стабильностью и локализацией белков в клетке. Ферменты, которые были выделены и изучены в ходе многочисленных исследований, осуществляют процессинг, конъюгацию и деконъюгацию белка SUMO с высокой селективностью.

Модификация белком SUMO обычно изменяет свойства модифицированного целевого белка, воздействуя — либо положительно, либо отрицательно — на его взаимодействия с другими клеточными факторами. Как следствие, система SUMO способствует регуляции многочисленных биологических путей, начиная от

цитоплазматического транспорта до репрессии транскрипционной активности и поддержания стабильности генома, путем ее влияния на рекомбинацию и репарацию ДНК.

Как уже было указано выше, SUMO принадлежит к семейству структурно родственных белков, из которых наиболее видным членом является убиквитин [15,16]. Эти белки работают по одному общему принципу, который предполагает их ковалентное присоединение к субстрату.

Для присоединения модификатора к субстрату используется определенный ферментативный механизм, который осуществляет конъюгацию консервативного карбокси (С)-концевого диглицинового остатка SUMO и аминогруппы субстрата, как правило, представляющей собой внутренний остаток лизина.

Таким образом, убиквитин-подобные белки изменяют свойства или реакционную способность модифицированного субстрата и вызывают ряд ответных реакций; часто узнавание модификатора SUMO происходит при помощи специфических областей взаимодействия эффекторного белка.

Реакция конъюгация требует затрат энергии и является легко обратимой; комплекс специализированных ферментов обеспечивает избирательность и динамическое регулирование прямой и обратной реакции. Таким образом, модификация членами убиквитиного семейства может сравниваться с любым другим видом посттрансляционной модификации белка, такой как фосфорилирование или ацетилирование.

Функциональные последствия модификации являются многообразными и комплексными [17-20], и, несмотря на то, что связывание белка-модификатора SUMO с белком-субстратом может иметь различные физиологические последствия, основной молекулярной функцией белка SUMO является управление взаимодействием между модифицированными белками и другими клеточными протеинами.

1.1.1. Метаболический путь системы SUMO. Белок-модификатор

SUMO и его изоформы

Белок SUMO был идентифицирован в ряде исследовательских работ в различных организмах и условиях и потому получил много альтернативных названий, таких как сентрин, Ubll, Piel, Gmpl и Smt3 [21].

Подобно убиквитину, белок SUMO продуцируется в форме незрелого белка-предшественника с расширением на С-конце, который должен быть процессирован для высвобождения зрелого С-концевого диглицинового мотива необходимого для конъюгации с целевым белком-субстратом.

Несмотря на общее структурное сходство SUMO и убиквитина, аминокислотная последовательность и поверхностные свойства SUMO сильно отличаются от убиквитина. Белок SUMO несет неструктурированное расширение на амино (Ы)-конце, что не характерно для других убиквитин-подобных модификаторов.

Кроме того, у высших эукариот имеются несколько паралогов SUMO, последовательности которые существенно отличаются (Рисунок 1).

suvo-1 шв,.,

suvo-2 мо,., ,екжт*..

S'JVM MSE.., .ЕКРШК... .TKN.DHIHLmGQDGSWQFKimT^LBKUlKAVCSR^LSKRQrRFaFDC^PIhlTDTPAQLmD^

SUV0-4 Ен»БКРТББУК«.,«TEmOíflíHLmGQIX'SWQFKIKRQTPLSmimCBPRGLSVKQrBFRFG^QPISGTDKPAQLEireOE^

Рисунок 1. Сравнение последовательностей паралогов SUMO дрожжей и

млекопитающих

Консенсус последовательности на N-конце Smt3, SUMO-2 и SUMO-3, подвергаемые модификации SUMO, участвующие в формировании цепочки поли-SUMO, и пролин-90, который предотвращает обработку в SUMO-4, выделены жирным шрифтом. Расщепляемые С-концевые расширения Smt3 и SUMO-1, -2 и -3 указаны курсивом.

В то время как дрожжевые клетки экспрессируют только одну форму SUMO, кодируемую геном SMT3 (suppressor of the mitotic fidelity gene 3), клетки млекопитающих кодируют четыре изоформы - SUMO-1, -2, -3, -4 (см. Таблица 1).

Таблица 1. Компоненты системы SUMO у млекопитающих и дрожжей

Компонент системы SUMO Видовая принадлежность организма

Млекопитающие S. cerevisiae S. рот be

1 2 3 4

Белок-модификатор SUMO-1 SUMO-2 SUMO-3 SUMO-4a Smt3 Pmt3

Активирующий фермент (El) Sael (Aosl)/Sae2 (Uba2) Aosl/Uba2 Rad31/Fub2

Конъюгирующий фермент (Е2) Ubc9 Ubc9 Hus5

Лигаза (ЕЗ)—SP-RING PIAS1 PIAS3 PI ASxa □ (ARIP3) PIASxPD(Mizl) PIASy Mms21 (Nse2) Sizl (Ulll) Siz2 (Nfil) Mms21 Zip3 Plil Nse2

Лигаза (ЕЗ) -прочие RanBP2 (Nup358) Pc2b HDAC4b RSUMEC

Протеиназа (SENP) SENP1 (SuPr-2) SENP2 (AXAM2, SMT3IP2) SENP3 (SSP3, SMT3IP1) SENP 5 SENP6 (SUSP1, SSP1) SENP7 DESI1 DESI2 USPL1 Ulpl (Nibl) Ulp2 (Smt4) Ulpl Ulp2

Альтернативные названия отдельных ферментов приведены в скобках, а. Эта изоформа SUMO, скорее всего, не конъюгирует in vivo.

b. Эти факторы действуют в качестве субстрат-селективных усилителей реакции сумоилирования и их классификация как классических ЕЗ ферментов все еще является предметом �