Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и функции дельта-эндотоксинов и протеиназ

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и функции дельта-эндотоксинов и протеиназ"

А/ 0<!?3

ЛоисЪ* «и - )

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР л «у ■ л л

6' ,1 / , I О /

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ___

ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ 1У ^А

ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНОВ И ПРОТЕИНАЗ ВАСШПЗ ТНиШвШБХЗ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

На правах рукописи УДК 577.112

ЧЕСТЮСИНА Галина Георгиевна

Москва - 1990

Работа выполнена в лаборатории химии белка Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышлеш микроорганизмов (зав. лабораторией - доктор химических наук, профессор В.М.Степанов).

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю-В.Езепчук

доктор биологических наук, профессор В.В.Мосолов

доктор биологических наук, профессор Ю.П.Ввдецкий

Ведущее предприятие: Институт молекулярной биологии АН СССР

Защита состоится " "_" 1990 г в " " час.

на заседании Специализированного совета Д.025.01.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу : 113545, Москва, I Дорожный проезд, дом 1.

Диссертация разослана " "_ ¡990 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

В.И.Щербак

Актуальность темы.

Внедрение интенсивных технологий возделывания сельскохозяйственных культур неизбежно требует расширить применение микробиологических средств защиты растений в связи с проблемой охраны окружающей среды. Установления партии и правительства "О совершенствовании научного эбеспечения развития агропромышленного комплекса страны" (1987Г) И "О «эренной перестройке дела охраны природы в стране" (1988) подчеркивают ?еобходимость тщательного изучения л внедрения биологических методов защиты сельскохозяйственных и лесных культур от вредителей.

Микробиологические средства защити растений обладают высокой :пецифичностью ентомоцидного действия, поражая строго определенные вида ¡асекомых и не оказывая отрицательного эффекта на окружающую среду, [рименение микробных энтомоцидных препаратов ке вызывает резистентности насекомых, они безоп&:;ны для людей, животных, растений.

Среда микробиологических средств защиты растешй важное место от-одится ентомопатогенным бактериальным препаратам. К группе энтомопато-енных, так называемых кристаллообразующих бактерий, -относят культуры ac.tlmrlngleTiats, flac.spiaericus, Bac.popllllae, которые в процессе поруляции образуют в клетке кристалловидные включения белковой природы.

Ведущей группой бацилл, продуцирующих внтомодаднме кристаллы , яв-яется Bac.thurlngleTisls (ВТ). Вид ВТ делится на 32 подвида на основании азличий в биохимических свойствах вегетативной клетки. Дельта-эндоток-аны, образующие кристаллы, у разных подвидов ВТ различаются по специ-ичности ентомоцидного действия , поражая насекомых отрядов lepldoptera, Iptera, Coleóptera.

В нашей стране внтомопатогенные бактериальные препараты стали ис-зльзовать около 25 лет назад и в настоящее время мощности по производ-гву биологических инсектицидов на основе ВТ достигают десятков тыс. экн. Интенсивное использование микробных инсектицидов требует научного 5еспечения бактериологического метода защиты растений.

Несмотря на столь важное практическое значение бактерии ВТ отно-1тельно мало изучены,в физиолого-биохимическом отношении, особенно го относится к характеристике основного фактора патогенности - белко->му кристаллообразующему дельта-вндотоксину, который.в дальнейшем для шаткости мы будем называть просто ондотоксином. Тек, к началу данной 1боты было только известно, что кристаллы, продуцируемые разными подвиги, Несколько отличаются по форме и размер^. Сведения о белковом ютаве кристаллов были крайне противоречивым, не было единой точки

зрения на размеры молекул эндотоксинов, отсутствовал сравнительный анализ физико-химических евойстп вндотоксинов из разных подвидов Ь'Г, отличающихся по специфичности антомоцидного эффекта.

Токсичность Подвид серотип tepícloptera Díptera Coleopter

thuringienala (ГШ) 1 + + -

ftnítimua (FIN) 2 + - -

aleatl (ALE) 3a + - -

kurataki (OJR) ЭаЭЬ + + -

sotto (SO?) 4a4b + - -

dendrolImua (DEN) 4а4Ь + - -

kenyae (Ш) 4a4o + + -

gallerlae (GAL) 5a5b + - -

canaáienalз (CAN) 5a5c + - -

entomooidua 1ШТ) 6 + - -

aubtoxlcua (SUB) 6 ? - -

atzcuai (Л2) 7 + + -

morrtsonl (МОЯ) 8a8b + + -

tenebríonta (TEN) 8a8b - - +

oatrinia (ÜST) 8a8o - - -

tolworthl (TOl) 9 + + -

darmstadienata (DAR) 10 + + -

toimmoffl (2OT) 11 a11b + - -

kyushiwnala (Ш) 11a11 с - + -

thompaont (THO) 12 + - -

paülataní (РАК) 13 + - -

iaraelensls (BTI) 14 - + -

dakota (DAK) 15 - - -

indiana (1ND) 16 - - -

tohokiienala (ТОН) 17 - - -

kumamotoenata (KUH) 18 + - -

toehigtenala (TOO) 19 - - -

mhanenala (WH) 20 + - -

shondongieriata (5H0)

уарапепаla (YAP) 23 - - -

Цель и задачи исследования:

Цель данной работы - изучение структурной организации а функциональных свойств широкого круга эндотоксинов ВТ.

Для ее решения били намечены следующие этапы работы: установление Зелкового состава ентомодадних кристаллов, образуемых разными подви-хат ВТ; выяснение роли эндогенных протеиназ при оценке белкового состава кристаллов и разработка способов их инактивации на основе изучения 5язико-химических и функциональных свойств ферментов; разработка мето-(ов выделения эндотоксинов (протоксинов) и истинных токсинов;выявление »азличий между эндотоксинами на основании анализа мол.массы, изучения нтигенных свойств и сравнения триптических пептидов; изучение молеку-:ярной организации ендотоксинов методом ограниченного протеолизэ; уста-овление элементов первичной структры у ряда вндотокс1шов с разной спе-яфичностью действия; изучение структурной организации истинных токсинов а примере эндотоксина подвида ALE; выявление одновременной продукции гаммами нескольких эндотоксинов с разной специфичностью и оценка роли того факта в определении спектра энтомоцидной активности препаратов.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые:

Установлена молекулярная организация дельта-эндотоксинов ВТ, кото-íe, как показано в данной работе, у большинства подвидов представлены ¡лками с Мг около 130000, построенными из одной полипептидной цепи.

Показано, что N-концевая половина молекулы эндотоксина существует в [де устойчивого к протеолизу N-домена, ответственна за биологическое >йствие и соответствует истинному токсину.

N-домен имеет субдоменную организацию и формируется Из двух глобул, ■зко отличающихся по первичной структуре.

Предложена гипотеза структурно-функциональной организации ендоток-иов, как цепи доменов, из которых аминоконцевой выступает как собст-нно токсин, следующий за ним - как "узнающий" рецептор домен, а С-кон-вая половина молекулы ввжна, еидимо, для поддержания белка в раство-мом состоянии.

Получены денные, указывающие на существенные различия в первичной руктуре у дельта-эндотоксинов, резко отличающихся по специфичности томоцидного эффекта (эндотоксины подвидов GAL,ВТI).

Показана одновременная продукция рядом штаммов нескольких эндотокси-в, отличающихся по первичной структуре и биологической активности.

Выделены и охарактеризованы внеклеточные протеиназы ВТ(сериновэя п галлопротеиназа). Установлена принадлежность Суриковой протеиназы к

особой групп« тиолзависимих протеинзз в семействе субтилизшюв.

Сравнение серино&их тиолзависимих протеиназ, образуемых разным] подвидами показало, что и* изменчивость значительно меньше, че! изменчивость соответствующих эндотоксинов.

Полученные данные прояснили молекулярные основы функционирования а; дотоксинов, что обеспечило базу для направленного создания генно-инжене; ними методами штаммов-продуцентов эндотоксинов с заданными свойствами.

I. БЕЛКОВЫЙ СОСТАВ КРИСТАЛЛОВ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНОВ ВТ.

Цротеиназы ВТ и их влияние на этолсцидные белки при растворении кристаллов.

К началу данной работы (¡975г) в литературе имелись весьма противоречивые данные о белковом составе кристаллов эндотоксинов, продуцируемых как штаммами разных подвидов ВТ, так и штаммами одного подвида. Более того, исследователи нередко расходились в оценке белкового состава кристаллов одного и того же штамма. Так, число компонентов в кристаллах, по данным разных авторов, варьировало от одного до шести, еще более значительными были расхождения в оценке молекулярной массы главных компонентов - от 370000 до 1500.

В связи с етим на первом месте стояла задача установления истинного белкового состава кристаллов и его сравнительного анализа для различных подвидов и штаммов ВТ. Изучение белкового состава кристаллов ВТ было на чато с характеристики эндотоксинов, формирующих кристаллы подвида З'Ш шт.tnsectus.

Кристаллы ВТ растворяются в жестких условиях - при рН >12, а в при сутствии тиоловых реагентов - при рН 8-9- Иногда, как в случае кристаллов штамма (nsectus, для растворения требуется добавление денатурирующих реагентов (мочевина, гуанидин). Растворение кристаллов шт.1nsectus при совместной обработке 8М мочевиной и 10 мМ ДТТ (рН 8,5) приводило к появлению в растворе нескольких белковых компонентов (Мг от 145000 до 80000), обнаруживаемых с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 6DS (Рис.1). Увеличение времени растворения с одного до 12-48 ч при 37° способствовало накоплению в растворе компонентов меньшей мол.массой (около 80000). При растворении кристаллов теми i реагентами, но при ¡00°, практически весь белок концентрировался полосе, соответствующей белку с мол.массой около 145000.

Мы предположили, что при относительно мягких условиях растворен; (20-37°), несмотря на присутствие денатурирующих реагентов, происход: ограниченный гидролиз внтомоцидного белка примесными протеиназами.

Рис.1 Влияние примесных протеиназ на оегговные белковое компоненты кристаллов подвида THU (шт.insectus) при разных способах растворения.

Электрофорез в 5% полиакриламидном геле в присутствии SDS. Кристаллы растворяли : а)при рН 12; б) в р-ре 8М мочевины и 10мМ Д'ГТ, рН 8,5 при 20° ! ч; в) также как "б", но при 37° 48 ч; г S также как "б", но при 100° 2 шш; д) также как "в", но в присутствии ФМСФ.

ействительно, при растворении кристаллов шт.insectus при 20°, но в рисутствии ингибиторов сериновых и металлогротеиназ (®1СФ и ЭДТЛ) в астворе обнаруживался преимущественно компонент с Мг 145000.

Был сделан вывод, что кристаллы шт.Insectus построены из одного асокомолекулярного белкового компонента , а множественность наблюдаемых ри электрофорезе белков отражает действие примесных протеиназ на входную молекулу эндотоксина при растворении, поскольку денатурация элкового субстрата способствует его протеолизу.

Природа сорбированных на кристаллах протеиняз была определена с по-эщыо специфических хромогенных пептидных субстратов, синтезированных в ашей лаборатории Л.А.Люблинской, и специфических ингибиторов. В репаратах кристаллов подвидов THUfшт.Insectus) и GALfшт.612) обнаружена ктивность по субстрату сериновых протеиназ - Z-Ala-Àla-Leu-pNA и эталлопротеиназ - DNP-Gly-Gly-Val-Lys.

Очевидно, что присутствие в препаратах кристаллов протеолптичеокнх зрментов , различие в соотношении протеиназ разтшх классов,обнаруженное разных штаммов, разница в условиях, растворения белков "(присутствие гнатурируотих агентов, время обработки, температурный режим) -все эти акторы могут существенно влиять на протеолйз и тем самым на характер и эотношение выявляемых в кристалле белковых компонентов.Это в значительна мере объяснило причину противоречивости литературных данных об енто-опатогенных белках ВТ.

Опыт работы с эндотоксинами позволяет сделать общий вывод о эобходймости тщательного контроля за протеолизом при работе со всеми элками, особенно в условиях, приближающихся к денатурирующим.

Разработка спасойоб бибеленш белковых кожючсшоа \

из кристаллических тел включения.

В конце процесса спорообразования 1ST происходит лизис спорангиев в культуральной жидкости оказывается смесь спор, кристаллов и обломков клеточных оболочек.

Для выделения кристаллов был применен подход, основанный на различии физико-химических свойств поверхностей частиц. Ми модафициров ли метод Pendleton(1969),основанный на использовании двуфазной систе - 1% сульфат натрия-ксилол, заменив сульфат натрия водой. Такая модифи кация дала возможность получать кристаллы из разных подвидов ВТ, выращенных на среде, содержащей 0,5% трипказина, 0,4% дрожжевого экстракта 0,5% глюкозы,- 0,5% Nad, 0,05% CaClg, 0,01% MgS04, с чистотой более 99

Расщепление ендотоксина примесными протеиназами, происходящее при растворении кристаллов, требовало найти способ удаления и инактивации протеолитческих ферментов.

Поскольку образование кристаллов совпадает с началом споруляции вполне вероятно, что синтезирующиеся в вто же время внутриклеточные фе менты ВТ(см.раздел 9) могут захватываться кристаллами в процессе их сборки. На поверхности уже сформировавшегося кристалла могут сорбироваться внеклеточные протеиназы. Еще одним источником протеиназ могут оказаться обломки клеточных оболочек. Действительно, при отделении последних с помощью центрифугирования суспензии кристаллов(при 4000 об мин, 4 мин) содержание ггротешшз снижается.

Наиболее эффективным способом освобождения кристаллов от протеолитически активных примесей является кислотная денатурация протеиназ. С етой целью суспензию кристаллов, предварительно промытых 1М NaCl, выдерживали при рЦ 2,0 и 20° в течение 3 ч, а затем промыва водой. Очевидно, выдерживание в !M NaCl вызывает десорбцию протеиназ, инкубация при рН 2,0 .инактивирует ферменты, неустойчивые в кислой сре (см.раздел 9).

Действенным способом инактивации протеиназ оказалась •гермоденатурация при 100° в процессе растворения кристаллов в буфе (рН 8,5), содержащем 8М мочевину и 1% меркаптоэтанол.

В литературе известен метод выделения эндотоксинов, минуя стада получения чистых кристаллов. Он основан на избирательной экстрам, белка кристаллов из споро-кристаллических смесей меркаптосоединениг при рН 9,5-10,5 или щелочью (рН >12). Однако, в етом случае, г наличии спор и обломков клеточных оболочек, особенно велика опаснос ггротеолиза исходного белка приме сними 1гротеиназами. '

Мы перенесли способ растворения кристаллов при одновременной эрмоденатурации протеиназ, оправдавший себя при работе с препаратами ютых кристаллов, на споро-кристаллические смеси и назвали его методом горячей екстракции". Опыты с акристаллическими мутантами показали, что т этик условиях дополнительно экстрагируется лишь белок споровой 5олочки с Мг 12000.

Разработанный способ выделения неповрежденного эндотоксина шосредственно из автолизата культуры микроорганизма предоставляет грокие возможности для сравнительного изучения белкового состава зисталлов одновременно у большого числа штаммов ВТ, что важно и может 1ть использовано при проведении генетико-селекционных работ.

Установление истинного белкового состава кристаллов ряда подвидов ВТ.

Белковый состав кристаллов 50 штаммов, относящихся к 20 подвидам ' был проанализирован в основном методом "горячей екстракции" юро-кристалшческих смесей.

У большинства проанализированных штаммов при электрофорезе в 5!? >лиакриламидном геле в присутствии БОЭ видна только одна полоса, гатветствующая белкам с Мг 130000, 135000 или 145000 (Табл.1). >стоверность обнаруженных небольших отличий в мол.весах эндотоксинов 1зных гатаммов доказана при анализе смесей указанных белков.

Таблица I

Белковый состав кристаллов разных подвидов ВТ

Мг

15000

135000

I30000

135000 130000

145000 130000

135000 1эоооо

65000

М(1пз) А1Б(1225) ПМ(1162) СА1(696)

'-(223) ЕШ( 1228) ГОНГ 1226) -"-(449)

Ш(1227) САК 1167) -"-(273)

ОАЬ(ЧЗ) ТН0(1166) -"-(220)

№0Ш1252) ты 2472) -"-(561)

ВА[Ц1254) ТОК 1253)

БЮ(2460)

Т0С( 1121)

СМ (1236)

йАЬ(612) -"-(650) -"-(223)

Вместе с тем, было отмечено, что штампы подвида О AL имеют более сложный белковый состав - некторие из них содержат дьа (Mr 135ÜOO j 130000) или три белка (i J5u00, 130000 и Ь50и0).11з дьух - трех белков построены кристаллы ряда штаммов li'i'l (см. раздел 5).

Таким образом, применив инактивацию протеинзэ при растворени: кристаллов, мы впервые, уже в 1979г, показали, что кристаллически включешзя различных подвидов ВТ построены в основном и высокомолекулярных белков (Ыг около 130000).

Большинство из изученных нами штаммов продуцировало кристаллы содержащие белок(белки) с одинаковой мол.массой ( ¡30000, 135000 или 145000).Вместе с тем, обнаружение у подвида GAL штаммов, в состав кристаллов которых входят одноврменно несколько (до трех) отличающихся по мол.массе белков, давало основание предполагать, что такая множественность ¡эндотоксинов может встречаться и у других подвидов ВТ и не была выявлена нами только в связи с относительно ограниченны числом проанализированных штаммов.

Обнаруженные нами различия мол.массы изучаемых белков могли быть следствием внутриклеточного процессинга эндотоксина в процессе ег биосинтеза. Однако, нельзя было исключить, что речь идет о белках продуктах разных структурных генов.

2.СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭНДОТОКСИНОВ РАЗНЫХ ПОДВИДОВ ВТ.

Сравнение антигенных свойств энйатокшюв.

Ранее неоднократно предпринимались попытки использовать дг сравнения вндотокинов ВТ иммунологические метода анализа (Krywienezyk, 1971, Pedleton,' 1968). При этом установлено, что ендотоксины, образуем! рядом подвидов ВТ, имеют по меньшей мере один общий антиген и, следовг тельно, в определенной мере сходны. В то же время обнаруживались и aim гены, свойственные белку-ендотоксину того или иного подвида.

Методом двойной радиальной иммунодиффузии нами были охарактеризов; ны антигешше свойства эндотоксинов из 21 подвида ВТ. Кроличьи внтитео получены к эндотоксинам 7 подвидов - THÜ (шт.tnaecíua), АШ (шт. 1225 PEN (шт. 1227), GAH шт. II-67 И эндотоксины с Mr 135000 и 130000 1 шт.612), УНО(шт.ПбЬ), ti'1'i (шт.2395) и РЛЖшт. 1124).

Установлено, что с кроличьими антителами против эндотоксин! подвидов А1£ и DEN дают реакцию эндотоксины 12 из 21 подвергнутой сравнению подвида (Табл.2). Следовательно, многие подвида ВТ продуциру ют антигешю близкородственные эндотоксины, существование которых пока зано также Lynch (1987) при анализе с помощью кроличьих антител проти

Таблица 2

Антигенная характеристика эндотоксинов разных подвидов ВТ

Подвид штамм Антигенные группы

тни 40, 49 С

THU Insectus г;

FIX 1162 X

ALE 1225 A.

KUR HB-1-D A

SOT 1226 A

V4S 1227 A

mi 1228 A

GAL 612, 696 A В

GAL 11-67 В

GAL 16, 73 A

CAN 1236 X

ENT 1244 A

AIZ 1250 A В С

MOR 1252 A

TOL 1253 A

DAR 1254 A

тно 1166 К

TW 1255 A

BTI 2395 Е

РАК 1124 F

m 2472 X

TOC 1121 X

SHO 2460 X

A,B,C,D,E,F - ендотоксины, образующие полосы преципитации с антисывороткой к раствору ендотоксинов подвидов ALE(тт. 1225), т<шт.11-67У, THU (шт. insect U3), ГН0(шт.116б), ВТК шт.2395) и РДК( 1124) соответственно. X - ендотоксины, не даицие иммунной реакции ни с одной из использованных антисывороток.

¡эндотоксина подвида KUH (шт-HLM-D) • Эта группа близкородственных эндотоксинов в дальнейшем рассматривается нами как группа kurataki.

Эндотоксины некоторых подвидов - Tiíü,í'lN,САН,GAL, WO, ВТ1, РАЯ, ТОЙ, KUM, Î'ОС, ÏÏUH, SHO - не образуют полос преципитации с антисыворотками к вндотоксинам подвидов ALS и DEN (Табл.2).

Таким образом, среди вндотоксинов ВТ, наряду с большой группой an тигенно и, следовательно, структурно родственных белков, встречаются ендотоксшш, первичная структура которых может существенно отличаться с ендотоксинов группы kuratakt.

Эндотоксину подвидов OTtuiT.ínsectua), BTI(шт.2395), GAUшт.11-67) ТИО(шт.Пбб), А4Я(шт.П24) не только резко отличаются по антигеннь свойствам от ендотоксинов группы kureîakl, но не сходки и между собоВ так как не образуют преципитата с кроличьими антителами прота гетерологичных эндотоксинов.

Bestie детально изучены антигешпше свойства ендотоксинов подви/ G4L, штаммы которого продуцируют кристаллы, отличающиеся по белковок составу (см.раздел 1).

Показано, что раствор кристаллов шт.И-67 не реагирует с антитела*, к вндотоксинам подвидов ALE и DEN и,следовательно, кристаллы етого шта». ма образуются белками, иммунологически отличными от ендотоксинов груша kurstakl, Kaí< бцло установлено р дальнейшем (см.раздел 6), кристаллы шт.11-67 формируются, двумя белками с одинаковой мол.массой (130000), которые отличаются по антигенным свойствам не только от указанной группы, но и между собой (образуемые ими полосы преципитации с антите-телами к исходному раствору кристаллов етого штамма дают перекрест).

Эндотоксин подвида GAL с Мг 135000, формирующий кристаллы шт. 1Ь i 73, не реагирует с антителами к вндотоксинам шт.11-67, но образует поле су преципитации с антисыворотками к вндотоксинам подвидов AIE и DEN и, таким образом, серологически близок вндотоксинам группы kuratakt. 3ti штаммы, содержащие только белок с Мг 135000, не токсичны для гусениц Gallería mellonella, объекте, чувствительном только к токсинам подвида GAL. Вероятно, специфическая активность етого подвида связана с проду: цией ендотоксинд(ов) с Мг 130000.

В кристаллах шт.696 подвида GAL одноврменно присутствуют по меньшей мере два антигена (выявлены две полосы преципитации с антисывороткой к белкам шт.612). Один из них родственен ондотокеннам грул kurstakl, а другой - белкам шт.11-67 подвида GAL.

Сложный бедковий состав характерен и для ряда штаммов других подвидов ВТ. Так, раствор кристаллов шт.1252 подвида UUH дает полос:

треципитации с кроличьими антителами против нескольких аНтигенно отличник ендо токсинов (шт. II-67 подвида GAL, uir.lnsectus под вида ГШ, шт. 1225 подвида ALK) и, невидимому, продуцирует не менее трех, эазных белков-эндотоксинов.

Таким образом, эндотоксины, продуцируемые не только разными юдвидами, но. даже и разными штаммами одного подвида существенно сличаются по антигенным свойствам. Наиболее распространены среди годвидов ВТ эндотоксины антигешю родственной группы kwstakl, в то зремя как дру1-ие типы эндотоксинов продуцируются только определенными юдвидами. Выявление в растворе кристаллов некоторых штаммов ВТ !ескольких антигенов указывает на возможность одновременной продукции ieскольких разных эндотоксинов.

Оценка голологш первичной структуры эмйотоксиксв подбидов ALE U GAL.

К началу 1980 г никаких прямых данных о различиях первичной структуры эндотоксинов разных подвидов ВТ не было. Правда,, косвенно об этом ;видетельствовали результаты иммунологических исследований этих белков, выявленные нами небольшие различия мол.массы у эндотоксинов, а также об-}аружение у подвида BTI эндотоксина с необычно низкой Mr - 28000.

Не было ясно, как велики могут быть эти различия, связаны ли они с вменениями первичной структуры или вызваны лишь процессами посттранс-5яшюиноЙ модификации. Не было ответа на вопрос, сосредоточены ли амя~ токислотные замены в отдельных участках полипептидной цепи, например, на ;е Й- или С-конце, или распределены по всей первичной структуре.

Мы попытались оценить степень гомологии аминокислотных последовательностей этих белков, выбрав для этой цели два эндотоксина, которые эазличаются по мол.весу (подвид ALE - 135000, подвид GAL - 130000),по антигенным свойствам и по специфичности энтомоцидного эффекта. Мы полагали, что используемый обычно для сравнения протеолитических гидроляза-гов белков метод "отпечатков пальцев" окажется в нашем случае непригод-чым из-за большой длины цепи (около 1300 остатков) и образования очень глажной смеси пептидов. Ввиду этого, для фракционирования триптических пептидов нами била -применена хроматография на катионообмэннике Cliromo-beads с последующим разделением полученных фракций тонкослойной хроматографией на микрокристаллической целлюлозе. Для более надежной идентификации сходно расположенных зон на пластинках, мы екстрагировали пептид«, зодрржащиеся в выявленных зонах, и определяли их аминокислотный состав.

В идеальном случае, для сравнения триптических гидролизатов двух

белков потребовалось бы выделение всех образовавшихся пептидов. Однако отот путь слишком трудоемок. Примененный нами подход значительно прощ полного разделения пептидов,однако, его возможности ограничены прежд (•сего тем, что разделение методом тонкослойной хроматографии даж одинаковых по пептидному составу фракций может дать нескольк различающиеся результаты из-за частичного перекрывания зон Следовательно, примененный метод имеет тенденцию к переоцешсе различий составе гидролизатов. Для того, чтобы оценить, насколько указанны ограничения метода сказываются в реальных условиях эксперимента, был проведены по два параллельных опыта с разделением одинаково полученны триптических гидролизатов белка кристаллов родвида А1£ (шт.1225) и вА (шт. I1-67). . Обнаружено большое сходство профилей ©люции дву гидролизатов одного и того же белка (Рис.2) и почти полное совпадем хроматограмм соответствующих пиков (Рис.Э). Для двух параллельных опыто с белком из штамма П-67 был сделан аминокислотный анализ 58 зон (28 зо в одном и 30 зон в другом опыте). В 14 случаях аминокислотный соста попарно сравниваемых зон практически совпал, т.е. обнаружено 50

Аго Pf

А i M a в F m ~ Л A Л - r i. \ 14 LÀ - —A--л -у \д/Г J\n \ j\r __Г-- _ - - V

5,1

ie S '¡¡> • ne кк tpatrima

I S Ш n

Б / \ i? / \ /Рай ® 7 -

tu fiP i£7c7 ■ кн фракций

Б vl/V ^Lx/v

«о "" m фрзтеоа i

Рис.2 Профили влюции триптических гидролизатов вндотоксинов со смол

Chromobeads. А и Б - два параллельных опыта для гидролизата белк

кристаллов из подвида GAL (шг.П-67), В - опыт с гидролПзагом белк кристаллов из подвида AIE.

BQfl-BPGÜQB-

н 5 гш Ы п й Н ёз Н

г? 'í ífvr /<70 "Ce-«« 4¿t-isi '¡с «rú Mi-lio i ь* fse *п-т re o-/»

□еавпопав

=i О

t4-9C

П

==¡ p ~ S

S Г" —! Г ¡

ГГЛГ /0 « í9-<Gf 10Г-1И fSíWH 'Jf W НЛ-fVS *Í5-1(1 l/u-tUS

а в с

" n n П

i ; I I i < I

□ П р п G

TS-гi Í4Í0 31-Vi Í7--53 юч ч* чг '7! "32 ИГ 147-1S-! '¡в 'Я! *6¡-fTQ 42 40-101 НО-ПО

[с.З. Тонкослойная хроматография фракций, собранных при разделении аттических гидролизатов белка кристаллов на колонке со смолой tromobeads. А, Б и В - относятся к тем же опытам, что и на рис.2. Цифры ¡означают ХЛ пробирок, содержащих анализируемую фракцию.

¡впадения. Очевидно, что 50% совпадения (вместо теоретически ожидаемых >056) есть мера той переоценки различий между белками, которую следовало задать от использованного метода.

Аминокислотный состав зон, полученных при разделении белка из под-да ALE, сравнивался с анализами, полученными в каждом из двух опытов белком штамма 11-67. В обоих случаях получено только 10% совпадения.

Сопоставление наблюдаемых процентов совпадения (10% вместо 50$ при гализе заведомо одинаковых белков) указывает на существенное различие 1авниваемых последовательностей. Малое 'гасло сходных зон говорит о том, ■о различия не Локализованы в каких-то отдельных участках последователь->сти, например, в дополнительном участке, имеющемся у белка кристаллов даида ALE, полипептидная цепь которого несколько длиннее, чем у белка металлов шт.11-67. Несомненно, что аминокислотных замен в последова-льности белков много и они разбросаны по всей длине полипептидной цепи.

Таким образом, еще в 1982 г нами впервые получены данные, указнваю-'е на резкие структурные отличия между некоторыми эндотоксинами ВТ, ко-рые будучи несомненно родственными белками, тем не менее значительно сошлись в процессе еволюции, что, вероятно,диктовалось необходимостью -дстройки под разных хозяев. Эти результаты . были подтверждены через

насколько лет при анализе первичной структуры ряда аидотоксинов, установленной прочтением соответствующих структурных генов.

з. протоксищ и истинные токсины вт.

Известно, что белок кристаллов (дельта-вндотоксин) являете! протоксином, поскольку он поражает гусениц только при попадании i организм насекомого с пищей. Протоксин активируется с образование! истинных токсинов ферионтамл кишечшжа гусениц (близких по специфичное!! трипсину и химотрипсшу).

Для получения и выделения истшпшх токсинов нами били вибраш ендотоксшш трех подвидов ВТ (ГШ -шт. Inaectus, ALE к GAL) макекмальш отличающиеся между собой по ряду параметров - мол.весу, иммунологическш свойствам, первичной структуре и специфичности ентомоцидного еффекта.

Установлено, что ферменты разной специфичности, в том числ! трипсин, химотрипсин, проназа, властаза, субтилпзин BPH', внутриклеточн, сериноеая протеиназа Вас.amylolyquefaclena, ферменты кишечника гусени: Gallería mellonella неизменно гидролизуют все ендотоксшш до фрагменте с Иг около 70000, что свидетельствует о наличии в структуре Оелк< стабильного домена. Фрагменты такого же мол.веса били обнаружен Sonimervile (19В1) в триптических гидролиззтах рэстворов ендотоксино подвидов TOL, ГШ, DES.

Были основания полагать, что стабильный домен с Мг 7000 соответствует истинному токсину. Действительно, фрагменты таког мол.веса, выделенные из триптических гидролизатов эндотоксина подвид GAL{mx.11-67, см. раздел 6) и ALE coipannioT всю биологическую активност и специфичность действия исходной молекулы протоксина, причем первый и них токсичен для гусениц Galleria mellonella не только при введении ег с кормом, но и при иъецирорагаш в гемоцель, что характерно только дл истинного токсина.

Для получения истинных токсинов были подобраны условия, которые способствовали исчерпывающему гидролизу протоксина до фрагментов с К около 70000.Известно, что белки кристаллов склонны к агрегации. Hai-показано, что таким свойством обладают и низкомолекулярные фрагменты ¡ (в еще большей мере) отабилыше домены. В связи с втим для полу чет истинных токсинов, причем сохраняющих би-хяогичоск ую активность, t отделяли от низкомодокуляршл пептидов с помощью гель-фильтрации в растворе 2М 1!аС1 (при выделении истинных токсшюв подвидов GAL и TOD и в растворе i'.U KS СИ (при выделении домена подвида ALE).

Проведенный нами анализ показал, что И-концевов аминокислотой

тротоксинов подвидов GAL, ALE, TOL, ÎHU и у соответствующих им зтабильных доменов является метионин. Полученные результаты совпали с цаннымн Bulla (1981) для протоксина подвида WR и выделенного из него Еграгмента с Мг 68000.

Эти дэнные дали основание полагать, что при протеолизе сристаллообразующих белков расщеплению подвергается С-концевая часть голипептидной цепи и, следовательно, в образовании стабильного домена гчаствует N-концевая половина молекулы.

Следует отметить, что при■определении N-концевой последовательности ' истинного токсина подвида ALE в качестве аминоконцевого вместо (етионина обнаружен остаток изолейшша. Вероятно, такое разли'ше (бусловлено разными способами растворения кристаллов (при рН 12,5 или 1,5 в присутствии меркаптанов). Скорее всего, растворение кристаллов гри 12,5 вызывает частичную денатурацию белка, в результате которой нановится доступным и отщепляется трипсином N-концевой пептид.

Действительно, нами было показано, что при рН 11,5 происходит ¡встичное изменение третичной структуры эндотоксина етого подвида - в (елочной среде молекула претерпевает конформационный переход с точкой олуперехода при рН 11,2.

Методом автоматического секвенирования по Эдману была определена оследовательность первых 29 аминокислотных остатков истинного токсина одвида ALE, которая оказалась идентичной структуре ендотоксттов группы urstakl (см.раздал 6), начиная с 29 аминокислотного остатка.

Таким образом, при образовании истинных токсинов одновременно с граниченным протеолизом шарнирного участка, соединяющего этот N-домен с -концевой половиной молекулы, может избирательно отщепляться оследовательность из 28 аминокислотных остатков с аМинного конца, что е снимает биологической активности.

Выявлены некоторые различия в свойствах N-доменов этих подвидов -азная чувствительность к гидролизу субтилизином ВРИ' и растворимость.

Как видно из Табл.Э, аминокислотный состав эндотоксинов протоксинов) сходен и согласуется с литературными данными для ндотоксинов других подвидов.

Выделенные истинные токсины по аминокислотному составу в основном ходны с протоксинами. Вместе с тем, во всех истинных токсинах по срав-ению с исходными протоксинами резко понижено содержание остатков изина. Компенсаторное накопление в втой часта молекулы остатков аргини-а возможно имеет определенное физиологической значение и связано с шг-экич значением рН в кишечнике гусениц (рН 9-Н). При этих условиях

Таблица 3.

Аминокислотный состав протоксинов СП) и истинных токсинов (Т) ВТ. (число остатков на 100)

п Т п т Т(0К) Т(ГО

Аминокислота 130000 65000 135000 70000 65000 650С

ТО! ТО! А!Е А1£ ал! СА1

1 2 Сув 1,2 0,9 1.1 1,0 - -

Авр 12,2 И.7 12,3 11,1 12,6 10,-1

ТЬг 6,4 8,0 6,5 6,3 7.7 7,"1

Бег 7,7 9,8 8,1 9,4 10,3 9,1

01ц 13,2 10,5 12,9 11,0 9.9 9,'

Рго 4,1 4,8 4,6 5-7 4,4 6,

01у 7.6 7,5 ' 7,5 7,9 10,1 71

А1а 5,7 5,7 5,5 5,7 6,5 7

6.3 4,5 6,0 7,3 4.2 6

Не 5,8 6,7 5,2 6,3 5,5 6

Ьец 8,1 9,3 8,8 9,8 9.0 , 8

Туг 4,5 3,9 4,5 3,1 3,4 4

РЬо 4,5 5,5 4,9 6,0 3,5 5

Н1в ».? 1,3 2,2 2,1 2,2 2

Ьув 3,2 1,0 3.0 1,0 1.8 1

АГ£ 5,5 6,9 6,2 5,0 6.5 6

Цег 1,0 1.0 0,7 0,8 0,8 0

Тгр 1.1 0,6 1.2 0,6 -

¡00 100 100 100 100 1

могут оставаться заряженными только г у амидогруппы аргинина.

Макду собой истинные токсины, квк и соответствующие протоксшш. аминокислотному составу существенно не отличаются. Следует, одна отметить, что в связи с болыюй мол.массой изучаемых белков да незначительные на первый взгляд различия могут отражать дово.г существенную разгшцу ме»£Ду белками, что и было впоследствии подте ждено при установлении их первичной структуры.

Истинные токсины трех изученных подвидов отличаются по содержат остатков мотиомша. - по 5 остатков обнаружено в молекулах Ы-доменс

подвидов ALE и GAL и 7 остатков - у истинного токсина подвида TOL. Мы сравнили размеры фрагментов, полученных после расщепления BrCN N-доме-нов указанных подвидов. При этом все фрагменты из BrCN гидролизата истинного токсина подвида GAL отличались по мол.массе от фрагментов из N-доменов подвидов ALE и TOL, которые,в то же время, имели три фрагмента с равной мол.массой. Эти результаты свидетельствовали о различии в положении по крайней мере некоторых остатков Метиогаша в полипептидных цепях истинных токсинов из разных подвидов и еще раз подтверждали предположение о существовании различий в первичной структуре изучаемых белков.

Проведенные исследования впервые показали, что истинные токсины соответствуют стабильным к протеолизу доменам, В образовании которых принимает участие N-концевая половина молекулы протоксинов. N-домены из разных подвидов отличаются по ряду свойств и первичной структуре.

4. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ИСТИННОГО ТОКСИНА ПОДВИДА ALESTI(ALE).

Установление элелеятов первичной структуры.

Для изучения первичной структуры истинного токсина подвида ALE осуществляли глубокий гидролиз эндотоксина субтилизином ВРИ'. Эндотоксин предварительно денатурировали 0,05М NaOH в течение часа при 37°. После гидролиза субтилизином (при рН 10,5 в течение часа) были получены фрагменты с Мг Порядка 10000. Эти фрагменты были выделены из суммарного гидролизата гель-фильтрацией на колонке с сефадексом 0-75 в денатурирующих условиях (7М мочевина, 1% SDS, 1мМ ДТТ).

Для установления первичной структуры фрагменты с Мг 10000, не разделяя, гядролизовали трипсином. Несмотря на го, что выделение Етрагментов проводили в денатурирующих условиях, для полного их расщепле-яя трипсином оказалась Необходимой дополнительная денатурация фенолом, 1то свидетельствует о высокой стабильности структуры втих фрагментов.

Чтобы разделить смесь триптических пептидов была применена хроматография на ионообменнике Chromobeads с последующей дочисткой некоторых 1з 47 полученных фракций с помощью ЁЭЖХ на колонке с обращенной фазой (С|д) в градиенте концентрации ацетонитрила.

Было получено 48 хроматографически чистых пептидов, которые были :еквенированы по Здоану микрометодом Chang(¡993) «i на автоматическом ¡еквенаторе.

Сравнительный стсниз сцщокислатных послеаобтелъностей триптичеасих пептиаоЬ истинного токсина поööuöci ALE и первичной структуры эндотоксинов noübuoa KUH. Ко времени установления нами аминокислотных последовательностей триптическик пептидов N-домена подвида ALE била опубликована (Schnepí, 1935) полная первичная структура вндотоксина подвида KUH, определенная прочтением соответствующего структурного гена (штЛШ-1-D).

Опираясь на гомологию с последовательностью етого ендотоката нам удалось расставить в структуре часть трилтических пептидов вндотоксина подвида ALE (Рис.4).

Вместе с тем, для девяти пептидов ми не нашли гомологии в последовательности вндотоксина KUH HD-1-P. Шесть из них оказались идентичными последовательности вндотоксина из другого штамма етого подвида (HD-73), установленной чуть позже Adang (1985), также в результате секведагрования соответствующего структурного гена.

Сравнение структуры двух ендотоксинов подвида KUH и вндотоксина подвида ALB показало, что у всех ендотоксинов аминоконцевая четверти молекулы (остатки с } по 346) отчетливо гомологичны, встречаются толькс единичные замены. Так, при сопоставлении вндотоксина подвида ALE сс структурами обоих эндотоксинов подвида KUH обнаружено только 5 замен среди 151 поддающегося сравнении остатка. Следовательно, эта часть молекулы у всех трех токсинов весьма консервативна.

Вторая четверть молекулы (остатки 347-617) вариабельна у все: токсинов , причем на етом отрезке сосредоточено 90% всех замен, обнаруженных в структурах ендотоксинов HD-1-D и HD-73 (подвид KUR).

С-концевые половины ендотоксинов RD-1-D и HD-73 (около 60< остатков) почти идентичны.

При внимательном рассмотрении структуры вариабельной четверг вндотоксинов, где заменено 50% аминокислотных остатков, выявлен неравномерное распределение замен, которые группируются в вид нескольких участков длиной от 7 до 3J остатка. Всего обнаружено Э таки вариабельных последовательностей (346-35S, 369-375, 379-407, 430-465 476-486, 498-525. 537-558, 563-610). Между втими блокамц последовательности ендотоксинов HD-1-D и HÜ-73 идентичны.

Из Пб аминокислотных остатков, идентифицированных в этом район последовательности токсина подвида ALE, только 59 или 50$ идентичи остаткам в последовательностях обоих ендотоксинов подвида КУН, т.е приходятся на идентичные последовательности вндотоксинов HD-1-D и HD-"¡ между вариабельными блоками. 54 аминокислотных остатка из триптичесм

пептидов эндотоксина подвида ALE входят в последовательности, строго соответствующие структуре либо одного, либо другого эндотоксина подвида

ют.

Таким образом, при сравнении последовательности вариабельного участка ендотоксина подвида ALE и эндотоксинов подвида KUR сохраняется тот же весьма высокий уровень аминокислотных замен, который наблюдается и при сопоставлении токсинов подвида KUR Между собой.

KUR HD-1-D íffiNNHíIHEOIPyHCLSHPBVEVLOaERIBTayTPIDISLSLTQPLbSEP ALE IETGYTPIDISLSLTqFLLSS?

KUR HD-73 ffi>UNPNirJECIPYNCLSHPEVEVLGGSRIETGYYPIDISLSLTqFLX,SEF

51

KUR HD-1-D VPGAGPVLGLVDIIWGIFGPSqWDAPPVQIEQLIHQRIEEFARNQAISRL

ALE XPGAGFV {ЙУХ)1ЕдЬ1№3

KUR HD-73 VTGAGFVXGLTOIIWGIFGPSQffDAfjlf/QIEQLIMQRIEEFARHqAISRL

101

KÜR HD-1-D EGLSNLYqiYAESFREWEADPTNPALREEMRIQFffl)MH3ALTTAIPLLAV ALB EGLSDLYqiYABAFR PTNPALREMR _

KUR HD-73 EGLSIILYQIYAESFREffEADPTIIPALREEMRIQFiroiMSALTTAIPXgfVV

151

KUH HD-1-D QKYQVTLLSTYVQAAJJUJLS'/LRDVSVPOQRQGFDAATirrSRYÍíDLTRbI ALE GqR YNDLTRLI

KUR HD-73 QlfYQVPLLSVYVQAANIJlLSVLRDySVFGqRQGFDAATIHSRYHDLTRLI

201

KUR HD-1-D GIÍYTDYAVRWYHTGLERVffGPDSRDff?IlYÍÍQFRREX.TLTTLDIVAIiFSNY ALS GgYTDYAVRffYHTGLERVWGPDSRDWVRYHQFR _ _

KUR HD-73 GmrTDYAVR\mTGLERyWGPDSRDffraYllQFRRELI0TVLDIVALF|{íY

251

5¡m HD-1-D DSRRYPYRTVSQLTRBIYTIÍPVLEUFDGSFRGWAQfllEQHXRQPHLMDIL ALÄ BYPYRTVSQLTREIYTNPVIÜNFDGSFRGSiqRIES^— KUR HD-7" ----------------------------------

-73 DSmPYRCTSQLTREriTHFVLENFm^ 301

KUR HD-1-D HSITIYTDVJffiGFlIYWSGHqlTASPV-GFSftPEFAPPLFGttAGHAAPPS^L;

ALE _ ___ _ AAKJQRlI

KUR HD-73 HSITIY!n@m(@YliS5Hqi^3CTGFSGPEi^FI@^3HAAI^3RIf

351

KUR HD-1-D ^MGLGIFRTLSSPLYRRIILGSGPMQBliVIJJGTEFSlÄ^TjlbPS " —* TI.33 -, n #LDGT ЛЯ

ALE KUR HD-73

VAQ1 VAQI

400

KUR HD-1-D TIYPqROTVDSLDTlPPQDIIOTPPRAaFSIiR-LSHVTM-LSQA^ASAVQ

ALE

KUR HD-73 (Ä^^JTVDSLr^CPP!|||J/FPE|aFSHR-LSmQi|^

¡uFSHR-LSHVfi'ípí

iPS'tSÍ VBlj 5FSHSÍ VBlj

447

KUR HD-1-D LRAPTF3WQH-H3A EFIIÍIIIPSSQITQIPLTKSTMLOSGISVVKGPGFTG

ALE |TtuPMF®^0í311BP __ ---,. GPGPTG

KUR hd-73 0UPMFS%i:-RSAEFimi]g^x$qi@cgotifg8-SV||GPGFTO

KUR HD-1-D GDILRRTSPGQISTLRVinTAPbSQ—:---RYRVRIRYAíiTTIiLQFHTSI

ALS GDI bRRTSPGQI5TLRV KU API-SO-----RYRVRYRYASTT__

KUR HD-73 P3TSYRVly^itYAS^^TjpiilLíryiíW j

541

RUR HD-1-D DGRPIUQGtIPSATMSSGSHLQSGSPRTVGFTTPMIPSNGSSVÍTLSAHVF AIJ3

¡Г!ГЙ HD-73 IGH3 ijFsTjifñ) A1pj: [LQf, YFSsUÜj í fl7!): ffijlíj Y- -фУ RrjP 591

Kim HD-1 -D NSGNEVYTDRIEyTOAEYTF'EAEYDLERAQKAraEIJ?TSSMQlGÜ(TDVT AX^E

KUR HD-73

Рис.4. Аыинетсислотная последовательность триптических пептидов эндотоксина подвида ALE в сравнении со структурами вндотоксююв подвида KUR (KD-1-D и HD-73).

Эти аминокислотные замены сгругац<рована по меньшей мере в тр1 протяженнее вариабельные участка (346-353, 438-450, 498-525).

На участке 346-358 аминокислотная последовательность эндотоксина подвида ALE совпадает со структурой токсина HD-73 и в то же врем; полностью, за исключением трех остатков (Jíüt 350, 354, 356), отличается с последовательности эндотоксина ¡ÍD-1-D¡ причем многие замены аминокислот

345

KUR HD-1-D PPVLV-SU{I¡íilli{T ALE

EUR HD-74

PQQRIVAÜLGQQVYR PQQRIVAQ1GQGVYR

приводят к радикальному изменению аминокислотного остатка (Ji 347, 348 353, 355, 357).

Такой же характер изменений наблюдается и на участке 438-450, гд токсин подвида ALE воспроизводит последовательности токсина HD-73 вклхмая и вставки (остатки 438, 443).

437

13JR ffi>-|-P fujlSQAAGAVYT—ijti" 41Е UERSGF3NSSVS1IR

KUR HD-73 MERSGFSIISSVSITR

Нап^лотив, участок порледователыюсти эндотоксина подвида ALB 498-52 идентичен последовательности эндотоксина HD-1-D (воигроизводится да» делеция 521-525).

497___

KUR HD-1-D DILRRTSPQQISTLRVNITAPLSQ-----R

ALE DILRRTSPCQISTLftVNITAPISQ-----R

KUR HD-73 cJbvy^f^rfliaifJI^^rHrpSTS'jjR

Кроме вариабельных блоков аминокислотных остатков, совпадающих с последовательностями либо эндотоксина HD-1-D, либо HD-73, В структуре ендотоксина подвида ALE обнаружены последовательности (три пептида), свойственные только ему. Два из этих триптических пептидов удалось локализовать в структуре опираясь на гомологии с опубликованной Thorne (1986) структурой еще одного ендотоксина подвида KUR (шт.ШМ).

' 390

KUR HD-1-D

KUR HD-73 ALE

KUR HD-1

FASLTTNÍ1

PSTX1]

№

тан íjip. fLUCFGQPPvjr^'

YOT-SSMIP:

LWLGL

cjlDI'

Этот участок последовательности у эндотоксинов можно рассматривать как гипервариабельный.

Один из пептидов (LWGTYTDYAFGR) ендотоксина подвида ALE локализвать пока не удалось. Возможно, он соответствует структуре каких-то других, пока еще не изученных 'эндотоксинов ВТ или же является специфическим только для токсина данного подвида.

К настоящему времени установлена полная структура трех вндотоксинов подвида KUR и ендотоксина подвида THU(шт.Berliner), относящихся к внтигегаю родственной груше kurstakl. N-концевая половина молекулы у всех втих белков образуется двумя структурно резко отличающимися областями - консервативной и вариабельной.

2д Консервативная обл. kur hd-1-d i-:-

34Q Вариабельная обл.

z^anoDQDc:

kuh hd-73

АЬЕ

опя

czir.-j

ТШ1 (Berlina J KUH HD-1

i: гта-гш-ио-о-а zzzziíH-Esi-Ecaa-ac

l:

^'ЯЯШШШШШ^ПСК^

Рис.7 Структурная организация N-доменов вндотоксинов группы fetzrsíakt.

i

Вариабельная часть молекулы может представлять собой (как в случае эндотоксина подвида THU (шт.Berliner) структуру, объединяющую последовательно части вариабельной области эндотоксинов HD-1-D (остатки 347-454) и вндотоксина подвида KUR HD-73 (остатки 455-640).В случае г.;адотоксинов подвида ALE и подвида KÜR (HD-1), кроме последовательностей характерных для эндотоксинов HD-1-D и HD-73 . в структуре встречаются участки, специфичные только для вндотоксинов ALE и HD-I.

Такое неравномерное распределение аминокислотных замен в последовательности N-концевых доменов, а также их своеобразная олочноегь, позволяют сделать предположение о функциональной значимости 8тих половин, тем более, как нам удалось показать, они обладают выраженной пространственной автономией.

Доленная организация истинного токсина подвида ALE.

Консервативную и вариабельную области истинного токсина подвида ALE удалось получить в виде фрагментов с Mr 30000(или £5000) и ЗЗООО, соответственно^ результате ограниченного протеолиза субтилизшюм BPH* вндотоксина, подвергнутого предварительно денатурации в мягких условиях (pH 12,5 в течение 10 мин при 37°). Фрагменты с такой же мол.массой образуются при гидролизе вндотоксина подвида KUR (HD-1-D).

фрагменты из субтилизинового гидролизата вндотоксина подвида ALE были выделены гель-фильтрацией на сефадексе G-200 в денатурирующих условиях (Рис.6).

Установленная последовательность 10 аминокислотных остатков нг N-конде фрагментов с мол.весом 30000 и 25000 - LYQIEQLINQR, былг локализована в структуре по гомологии с последовательность« вндотоксинов подвида KUR, начиная с остатка J» 77. Следовательно, оба ей фрагмента соответствуют консервативной области истинного токсина l отличаются только протяженностью структуры на карбоксильном конце .

Аминоконцевую последовательность фрагмента с мол.весом ЗЗООС установить не удалось, что, возможно, связано о присутствием на егс N-конце остатка глутамииа, который способен цкклизоваться t пироглутаминовую кислоту. Однако, установлено, что етот фрагмент содеркиг все остатки лизине, имеющиеся в составе истинного токсин; (Табл.4). А так как известно, что у всех истинных токсинов подвид; KUR остатки лизина локализованы только в вариабельной области, мок® предполагать, что фрагмент с мол.весом ЗЗООО соответствует подобно! (вариабельной) части в структуре вндотоксина подвида ALE.

Рис.7 Гель-фильтрация на колонке с сефадекеом 0-200 (2,5*83 см) субтилизинового гидролизата эндотоксина подвида ALE (А). Колонка уравновешена 4М мочевиной, 1% SDS, I мМ ДТТ, 1мМ ЭДТА, рН 8,6. На влектрофореграмме (В) -выделяемые фракции I (Mr 33000) и 2 (Mr 30000). СубтШШЗЛН

( i t m ni 11111

н 30000 ц 33000 1НП^ГИ15ГН"75ГЬГ15П

I—гьши |

i 30000 i | 33000 1

Рис.9 Схема протеолиза субтилизином БРН" эндотоксина подвида Л1£ после инкубации последнего при рН 12,5 В течение 10 мин при 37°.

Таблица 4.

Аминокислотный состав истинного токсина и высокомолекулярных фрагментов ендотоксина подвида А1Ж

Аминокислота Белки 65000 (Mr) ЗЗООО 30000

A6J) 70 33 32

Thr 40 22 20

Ser 60 34 24

Glu 70 30 30

Pro 36 16 10

Gly 51 31 21

Ala 36 20 18

Val 47 18 16

Met 5 4 4

lie 40 18 18

Ьец 62 " 27 23

ТуY 20 10 10

Phe 38 20 14

His 13 5 4

bye É 6 1

Arg 32 20 21

Субтилизин

i i il J 1 I i I M I H П I

M зоооо H ззооо И^51Ч~Щ-4~1б7УГТ5Г

Г~тг) ГЖ1 гж) гт ■

;с. 7 Схема протеолиза субтилизином 8PN' ендотоксина подвида j после инкубации последнего при pH 12,5 в течение 60 мин при 31

Каждый из выделенных фрагменте!» (Mr 30000, 25000, ЗЗООО) под действием субтилизина ВРИ' гидролизуется до фрагментов с Mr около 10000. Фрагменты с такой же мол.массой были получены и выделены нами ранее после гидролиза субтилизином исходной молекулы вндотокеинэ, подвергнутой предварительно глубокой щелочной денатурации.

Локализация фрагментов с МгЮООО в структуре молекулы, представленная на Рис.7, дана с учетом распределения по последовательности триптических пептидов, полученных при 'гидролизе этих фрагментов (см.Рис.4). В консервативной области можно допустить наличие двух фрагментов. Вариабельная область, вероятно, организована в виде трех фрагментов с мол.весом около 10000, из которых С-концевой неустойчив при гидролизе субтилизином, тек как из этого района не было выделено ни одного триптического пептида.

Таким образом, консервативная и вариабельная области структуры истин ного токсина подвида ALE существует в виде автономных субдоменов, кавдый из которых в свою очередь организован из нескольких доменов.Можно полагать, что такая молекулярная организация характерна для эндотоксинов ряда подвидов ВТ, во всяком случае для всех ендотоксинов группы kuratakl.

Воалохноя функциональная значимость консервативного и вариабельного

Ооленов в структуре истинных токсинов группа kurataki.

Хорошо известно, что эндотоксины разных подвидов ВТ различаются по специфичности энтомоцидного эффекта для личинок отряда Lepldoptera.

Как видно из данных Таблицы 5» составленной нами по литературным данным, вндотоксины подвида KUR (HD-1-D и HD-73) и ALE отличаются по токсичности для ряда видов гусениц.

Таблица 5-

Токсичность ендотоксинов подвидов KUR CHD-1-D и HD-73) и ALE для

гусениц различных видов.

Эндотоксин Bombyx Trtchoplusta Hellothls Plodta Inter Ostrlnla morí vil vlrescena punctella nubllalls

VJR HD-1 -D + - - + +

4LE + - -

Ш HD-73 - + + +

•Можно предположить, что вариабельная половина молекулы истинного токсина ответственна за узнавание в кишечнике чувствительных насекомых соответствующих рецепторов, которые могут существенно отличаться. Ьероятно, различия в ентомоцидном действии етих трех токсинов обеспечивают вариабельные участки последовательности истинных токсинов. Обнаруженная вариабельность структуры и, что особенно важно блочнасть аминокислотных замен, позволяют объяснить возможность подстройки структуры эндотоксинов под биологические особенности различных видов гусениц.

Консервативная по структуре Ы-концевая половина молекулы истинного токсина .видимо, является той частью молекулы протоксина, которая ответственна за неизвестный пока механизм непосредственного токсического действия.

Таким образом, ендотоксины подвидов А1£ и KUR и, вероятно, все ендотоксшш, относящиеся к антигенно родственной группе kurstakl, сходны не только структурной, но и функциональной организацией молекулы. Все они имеют С-ковцевую половину молекулы, которая подвергается протеолизу при образовании истинного токсина и не существенна для внтомоцидногс действия. В истинном токсине (N-домене) существуют два большиз функциональных района, осуществляющих узнавание мишени (вариабельная область) и собственно токсическое действие (консервативная область).

5. эндотоксины подвида ш, патогенные для личинок отряда DIPi'EllA.

Подвид B'1'I, открытый в 1977 г, резко отличается от других подвида! ВТ специфичностью ентомоцидного еффзкта - он поражает личинок многих видов отряда двукрылых (Diptera) и не токсичен для личинок Lepläoptera.

Кристаллы, образуемые штаммами втого подвида по данным разных авторов содержат, как правило, белок с Мг £8000, а также белки большей мол.массы(130000 и 70000), относительное содержание которых в кристалла; варьирует у разных штаммов BTI.

При растворении кристаллов ВТК шт.2395) в присутствии ДФ® и ОДТА i растворе в сопоставимых количествах присутствовали белки с Мг 130000, 70000 и 28000. Однако, после предварительной кислотной обработки кристаллов(наиболее действенного способа инактивации примесных протеина: содержание в растворе белка с Мг 70000 резко уменьшалось, что не бил> связано с ухудшением его растворимости.

Бил сделан вывод, что кристаллы BTL (шт.2395) сформированы двумя эндотоксинами (Мг 130000 и 28000), а белок с Ыг 70000 , по аналогии с эндотоксинами других подвидов ВТ, является продуктом протеолиза первого

из них и соответствует его стабильному N-концевому домену.

Эти белки различаются по растворимости, что позволяет разделять их с помощью избирательной екстрвкшш различными растворителями. Например, белок с Мг 28000 переходит в раствор в присутствии 8М мочевины при рН 7,0. После обработки кристаллов соляной кислотой (рН 2,) растворимость белка с Mr 130000 ухудшается, в результате чего 0,05М Na-карбонатным буфером (рН 10,0), содержащим 10мМ ДТТ, екстрагируется сначала белок с Мг 28000, а затем в 0.05М'NaOH растворяется белок с Mr 130000.

Белки BTI с Mr 130000 и 70000 отличаются от эндотоксинов других подвидов ВТ повышенной чувствительностью к протеолитическому расщеплению.

Аминокислотный состав белка с Мг 28000 (Табл.6) сходен с опубликованным Tyrell (1981).

Белки с Mr 130000 и 70000 по аминокислотному составу близки белкам соответствующей мол.массы (протокеинам и истинным токсинам) из других подвидов ВТ. Вместе с тем, обращает на себя внимание возрастание, по сравнению с эндотоксинами других подвидов ВТ, содержания лизина, как в исходной молекуле, так и у белка с Мг 70000. Эта закономерность подтверждена в последующем при анализе аминокислотных последовательностей ряда белков BTI - Мг 134000 (Ward,1988), Mr 127500 (Sen, 1988), Mr 72357 (Donovan, 1988), Mr 70000 (Thome, 1987 ) .установленных прочтением соответствующих структурных генов.Действительно, в обоих белках BTI с Mr около 70000 и в N-концевой половине молекулы белков с Mr 130000 содержится около 30 остатков лизина, в то время как у вндотоксинов группы kursta&l - только четыре. Низкое содержание лизина компенсируется у последних возрастанием числа остатков аргинина (до 50), У эндотоксинов ВГГ с Mr 70000 содержание обеих основных аминокислот в N-концевой половине примерно равное, а у епдотоксина Mr 134400 число остатков аргинина в три раза меньше, чем лизина.

В связи с втим в кишечнике личинок при рН 10 молекула ендотоксинов группы kurstakt будет сохранять исходный положительный заряд, в то время как у вндотоксинов BTI общий положительный заряд молекулы уменьшится. Если учесть содержание в эндотоксинах отрицательно заряженных групп, то оказывается , что молекула эндотоксинов группы ktirataitI будет при рН 10 иметь нейтральный заряд, в то время как ендотоксшш BTI - отрицательный. Возможно, такое распределение заряженных аминокислот в молекулах обеспечивает определенную функциональность - например, формирование на поверхности молекулы отрицательно заряженных участков, важных для взаимодействия с соответствующими рецепторами в эпителии кишечника насекомых.

Автоматическим методом Эдмана определена последовательность 16 вми-

аа

Таблица 6.

Сравнение аминокислотного состава белков кристаллов ВТ1 (шт.2395) и вндотоксинов из других подвидов ВТ (число остатков на 100)

Бедки (Мг)

Аминокислота 28000 70000 130000 70000 130000

ВТ1 ВТ1 ВТ1 ВТ ВТ

Авр 15,4 14,9 15.8 11.1-11.7 12.3-13.6

№г 8,4 8,0 10,2 6.3-8.0 6,4-6.8

бег 7,25 8,4 8.7 9.4-11,а 7,7-8,1

С1ц 12,0 11.3 10,5 10,5-11,2 12,4-13.2

Рго 4,4 5.6 3.8 4,8-5.7 3.7-4,6

«у 6,4 5.4 6.2 7,5-8,0 7,3-7,9

8,5 7.7 6,3 5,7-6,2 5,5-6,9

8,3 5,9 5.1 4,4-7.3 5,6-6,3

На 6,1 6.7 5,1 5,5-6,7 5,2-5,8

Ьеи 9,2 9.9 8,6 8,5-9.8 8,1-8,8

Туг 2,6 3,0 4.1 3.1-3.9 4,0-4,5

РЬе 3,9 5.3 3.7 4,2-6,0 4.2-4,9

Шв 1,2 2,8 2,2 1,3-2,1 1.9-2,3

Ьуэ 3,0 2,0 4.9 1,0-1,3 2,8-3,2

Аг0 1.8 4.6 3.4 5,0-6.9 5.5-6,2

нокислотшх остатков Л-концевых участков белка с Мг 28000 и 70000.

Впервые показано, что аминоконцевая последовательность белка В'1'1 с Ыг 28000 не имеет структурного сходства с эндотоксинами группы кигз!ак{. Полная первичиая структура, установленная впоследствии секве-нированием соответствующего структурного гена, подтвердила правильность наших данных и представлений о структурном своеобразии этого белка, обладающего в отличие от всех других эндотоксинов ВТ, гемолитической активностью.

Н-концевая последовательность белка ВТ1 с Мг 70000 и эндотоксинов группы ЁигаХаЫ имела только четыре совпадающих аминокислотных остатка из 18 сравниваемых. Это позволило сделать вывод о существенном структурном отличии и етого белка ВТ1 от ендотоксинов группы &игз1а&1, которые, как известно, отличаются крайне высоким консерватизмом

структуры в N-концевпм участке последовательности.

Нам не удалось найти гомологии между установленной нами последовательностью белка BTI о Mr 700QQ и структурой вндотоксинов BTI с Mr .134400, 127500 и 70000(Thome). Однако, 14 из 16 аминокислотных остатков выделенного нами белка оказались идентичными N-концевой последовательности белка BTI о Mr 72357 (Donovan). Более того, амино-концевая последовательность фрагмента (Ыг 40000) изучаемого нами белка оказалась идентичной на протяжении 14 остатков структуре белка BTI Donovan(см стр.35).

Можно било бы предположить, что речь идет об одном и том же белке. Тем не менее, мы считаем, что имеем дело с N-концввым доменом белка с Mr 130000, поскольку при его расщеплении BrCN были получены фрагменты, мол. веса которых (40000, 35000 и 5000) не соответствуют теоретически рассчитанным (7000, 85000, 4400, 2200, 1500, 37000, 2Э000, 1000, 6500) для соответствующих фрагментов белка BIT Donovan.

BTI 127500 (Sen) BTI 70000

BTI 72357 (Donovan)

BTI 70000 (Thome)

BTI 28000

Ш 130000 (Schnepi)

MetjAspSerGyBTyrProbeuAl aAsnAspLeuGlnG lySerMe tLeu Me tGlu.tBrjXxxjProLeiaAspThrbeuSerIIeValABnGluThrABp' MetGlikBpSerSerteuAspThrLeuSerlleValAsnGluThrAop

Met AsnProTyrGInA snLysAsnQluTyrG1ul1ePheA snA1aPro Met jlujisn LeuAenPheTrpProjLeujj luAspIleLyeTyrAsnPro MetishksndenproksnlleAsnOluOyelieProTyrABnCyeLeu

Рис.11 N-концевые последовательности вндотоксинов BTI.

Таким образом, впервые выделен и охарактеризован один из шсокомолекулирных вндотоксинов, продуцируемых подвидом BTI - белок с ir 70000 (предположительно N-концевой домен белка с Мг130000), Показано, [то етот эндотоксин, также как и ендотоксин с Mr 28000, резко отличается го первичной структуре от вндотоксинов других подвидов ВТ, что ¡оррелирует с существеными различиями в специфичности действия в тих ¡елков (токсичностью в отношении насекомых разных отрядов - lepíctoptera ; Díptera ). В то же время, выявленные структурные отличия мееду разными ндотоксинами подвида BTI дают основание ожидать более узкой пецифичности в действии этих белков на разных представителей отряда Uptera (например, Culex, Aedes, Anophölee), что характерно для труктурно отличных вндотоксинов других подвидов ВТ в отношении асекомых отряда íepldoptera.

6. характеристика эндотоксинов подвида GALLERLAE (GAL)

Производство инсектицидных препаратов на основе культур подвида СЧ£(препарат внтобактерин) организовано у нас в стране в 1959 г. Промышленное производство препаратов обусловило необходимость получения высокопродуктивных фагоустойчивых штаммов. При этом, нередко генетико-селекционнэя работа приводила к отбору фагоустойчивых и кристаллообра-зукщих штаммов, которые, однако, теряда активность по отношению к тест-насекомому втого подвида - гусеницам Gallería mellonella и поэтому рассматривались как нетоксичные. Это требовало тщательного анализа кристаллообразующих белков, продуцируемых разными штаммами втого подвида.

Мы показали ранее, что внтомоцидные кристаллы, продуцируемые подвидом GAL, часто имеют многокомпонентный состав и содержат несколько белков с разной мол.массой -135000, 130000и 65000, но только присутствие одного из втих компонентов (белка с Mr 130000), коррелирует с токсичностью штаммов втого подвида для гусениц Gallería mellonella. Для изучения были выбраны кристаллы, продуцируемые-штаммом II-67, содержащие по данным електрофореза только один белок с Mr 130000, при активации которого ферментами образуется истинный токсин с Mr около 65000.

В растворе истинного токсина при рокет-иммуноелектрофорезе (рн 8,6) были обнаружены два различающиеся по заряду компонента, один из которых двигался к катоду (положительный компонент, ПК), а другой - к аноду (отрицательный компонент, ОК).

Оба компонента имеют мол.массу около 65000. Для их разделения была применена ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе при рН 8,6 в присутствии 2М мочевины. Белок, соответствующий ЛК, не связывался с ионитом а ОК - влюировался при невысокой концентрации NaCl.

Протоксины, соответствующие каждому из втих компонентов были разделены также с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. При этом, протоксин, соответствующий ПК. (ППК), слабо связывается с ионитом и елюируется 0,3M NaCl (Рис.9). Протоксин, соответствующий ОК (II0K), связывается очень прочно и его удалось выделить только в виде фрагмента с Mr 95000, который образуется после инкубации с трипсином протоксина, прочно связанного ионитом.

Выделенные белки (ПК и ОК) отличаются между собой и от эндотоксинов группы kuratatil по антигенным свойствам (см.раздел 2) и по спектру биологического действия в отношении насекомых отряда Lepltíaptera. ГШ токсичен для гусениц Gallería mellonella, вызывая 100$ ингибирование питания у насекомых в концентрации 2 мкг/г корма, в то время как ОК топ'ибирует привес гусениц на 90% только при концентрации 55 мкг/г.

Рис.9. Разделение протоксинов(ПШ и ПОК), соответствующих ПК и OK,

с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе (I,6x30см).

Колонка уравновешена р-ром 2М мочевины, 1мМ ДТТ,40мМ NaCl, pH 8,6. I - ППК (Mr 130000), II- фрагмент ПОК (Mr 95000).

Напротив, OK значительно более токсичен для гусениц Lymantria dispar, при этом для OK равна I мкг/г, а для ПК - 55 мкг/г корма

концентрация токсина в корме, вызывающая гибель ЬО% насекомых).

OK и ПК имеют близкий аминокислотный состав, похожий на состав истинных токсинов из других подвидов(Табл.Э).

С помощью автоматического метода Эдмана была установлена амшкжонцевая последовательность как для OK, так и для ПК.

Для OK обнаружено 65$ гомологии структуры с последовательностью соответствующих участков вндотоксинов группы kurstcikl, что доказывает их несомненное родство. Вместе с тем замена 7 аминокислот на участке протяженностью в 23 аминокислотных остатка, расположенном в районе строго консервативном по последовательности у вндотоксинов группы kurstakt, указывает на существенное расхождение этих структур. Это ставит под сомнение установившееся в последние годы представление о строгой консервативности структуры N-концевоЯ четверти эндотоксинов, ответственной за механизм действия. Вероятно, ето справедливо только в отношешш антигенно близкородственных вндотоксинов группы kurstcúii.

Действительно, эндотоксины подвидов THU и ¿'JV2', полная первичная структура которых установлена соответственно Brizzard и Hornel 1 в конце ¡988 г, антигенно не родственные эндотоксинам группы íturstakí, хотя также поражающие насекомых отряда leplclptera, как и OK структурно отличаются от эндотоксинов етой группы в М-концевой четверти молекулы. Причем, если эндотоксин подвида Ef>? на отрезке последовательности из 23 аминокислотных остатков имеет примерно такой же процент замен (39-í), как

KUR HD-1-D GAL fOK) ENT THü

Рис.10. Сравнение N-концевой последовательности одного из истинных токсинов подвида GAL (ОК) со структурой ендотоксинов группы kurstakl, в также ендотоксинов подвидов ГШ и ENT.

BTdYTPIDlSIS1

I ETGNTVy

S^jïfci

DlSI CÍLli PI

""" QTG If|l¡AGKILGV¡t ïY.

и OK (35%). то для ендотоксина подвида THU характерно гораздо больше отличий (74Ж). Эта же закономерность прослеживается при сравнении полных огруктур ендотоксинов подвидов ГHI) и EUT с ендотоксинами группы kuratokl Таким образом, среда кристаллообразующих белков ВТ, токсичных для Leptdoptera, впервые обнаружен токсин, существенно отличающийся от ендотоксинов хорошо охарактеризованной группы kurstakt В структурно консервативном у последних N-концевом районе. Вероятно, етот белок (ПОК) вместе с эндотоксинами EUT и THU следует отнести к особой структурной групп® ендотоксинов ВТ, сохранившей высокий консерватизм в организации С-ко1сцовой половины молекулы (77-95$ гомологии при сраненин WJ и ЕЭТ о ендотоксинами группы kuratakl), но претерпевших довольно существенные расхождения (40-70%) в структуре N-концевой четверти Молекулы,

GAL (ПК) BTI 70000

BTI 1344000

BTÎ 127500 Ш 70000

YFUÏiWïSm_

УРШШ' -m-bOTTNYKDWLN[/pQDNC}Qyû YPlgj íj- -lO^SrNYKDWbMjJjQQHQQYO УРШ1 JL-EGSM|5^NVKI)Vnpp^QQYQ YPUpT^-NPljl^Dljrrafill РШТАВДГОЕА

Рис. II, Сравнение аминоконцевой последовательности истинного токсина подвида GAL (ПК) с ендотоксинами подвидов BTI и ТЕП.

Ачиноконцевая последрвательность второго токсина подвида GAL -ПК - вовсе не гомологична ендотоксинам группы kurstakl, а также вн-дотоксинам подвидов ГШ и ENT. В то же время неожиданно обнаружено сходство ПК (60Я> гомологии) с последовательностью ендотоксинов ВТ! и TEN (Hotte,¡987), поражающих личинки других отрядов насекомых - Díptera и Coleóptera.

Как уже говорилось (раздел 5). ввдотоксшш ВТ1 резко отличаются по

структуре от эндотоксинов других подвидов и с эндотоксинами группы йигз£а&( в С-концевой половине молкулы имеют 40% гомологии и только 20% - в И-концевой. Между собой эндотоксины ВТ1 (Иг 134400 и 127500) в М-концевой половине молекулы также имеют только 20% гомологии (около 120 совпадающих аминокислотных остатков). Поэтому наличие у них протяженного участка из 22 гомологичных аминокислотных остатков свидетельствует о высоком консерватизме его структуры,что, возможно, отражает определенную функциональную нагрузку. Именно на втом отрезке структуры и обнаружена гомология между токсинами ВТ1, TEN и ПК.

Резкое структрное отличие ПК от эндотоксинов группы кигз1а&1 и определенное сходство с эндотоксинами ВТ1, обнаруженное на коротком отрезке структуры (всего II аминокислотных остатков) в N-конце, получило подтверждение при анализе участков аминокислотных последовательностей, установленных секвестрованием структурного гена протоксина, соответствующего ПК(ППК). Работы по клонированию и секвенированию этого гена проводятся в лаборатории под руководством А.Л.Остермана, Как видно из данных, представленных на Рис.12 , в С-кокцевом районе, высоко консервативном у эндотоксинов группы ^^)^гэíQíгí, эндотоксинов подвидов ГШ и ЕЯТ, ПШ отличается от последних примерно в той же мере, что и эндотоксины ВТ1.

KUR HD-1-D GAL (ППК) BTI

KUR HD-1-D GAL (ППК) BTI

WR fffl-1-D

0Л1(ППК)

BTI

KUR HD-1-D GAL (ППК) BTI

1000

kghvdveAihqrsvEviI CMSdASVQC dgkthí LVI¿ vtgí- a^/ql idgvsv lyig|\ 1050

EJVSC

vsc.

1025

ot iivQPíJbiíyvbH VTJÍ

V3i WVHÍ|cPbi}iG т^УкУЕ!!^! 1075

TEiLTl1

GCVTIUEIENI GYVTlrftbAHF GYVOju|jvEEtiqK <LTF 1100

VjrpNDYTVMClEEYGGAVTSR

1

í&EEEiypm. MÍ'DYDINGTV\

fí|j ЕЕ-------------

1125

NRGYHEAPSVPADVASVyEíIKSraDGHRENPCEí'NRGYRCyTPbPVC

YL

ХФ

1150

i^bTfjreírrfii

• EjlOETECr vmmec

v DVíJllljl dryhie íg etbc

1175

; прШшжвв rmnp.....

i jjíjsiE LICMNB

'V

Рис. 12 Сравнение аминокислотных последовательностей С-кояцевых участков протококков подвидов OIR (HD-1-D), GAL (ППК) и BTI (Mr 134400)

Хотя нам не удалось обнаружить токсичности ПК на одном из представителей отряда Díptera - личинках Аейез aegyptl, не исключено, что втот эндотоксин может поражать других насекомых данного отряда.

Таким образом, впервые установлено, что среди эндотоксинов, поражающих личинки одного и того же отряда (Lepldoptera), есть белки, отличающиеся по структуре от эндотоксинов группы kurstakt в такой же мере, как и токсичные для насекомых другого отряда - Díptera, ендотоксюш BTI. Вероятно, это в какой-то мере отражает уникальную специфичность действия этого эндотоксина на гусениц Gallería mellonella, устойчивых ко всем другим известным в настоящее время эндотоксинам ВТ.

7. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭНДОТОКСИНОВ ВТ.

Эндотоксины большинства подвидов ВТ с Mr около 130000 имеют сходную молекулярную организацию и содержат в своей структуре стабильный N-концевой домен, соответствующий истинному токсину.

В условиях ограниченного протеолиза трипсином удалось показать, что расщепление протоксина протекает ступенчато путем последовательного отрыва от карбоксильного конца небольших фрагментов, имеющих у всех эндотоксинов одинаковый размер (Мг около 15000). Эти С-концевые фрагменты после отщепления от молекулы протоксина не так стабильны, как N-до-мен, и быстро и глубоко деградируют.

Разница в мол.массе у исходных протоксинов (в работе были использованы эндотоксины подвидов GAL, ALE, THU с Mr 130000, 135000 и 145000 соответственно) сохраняется у истинных токсинов (65000, 70000 и 60000) и, следовательно, у всех протоксинов расщепляемая С-концевая половина имеет примерно равную мол.массу (около 65000),

Сходство молекулярной организации С-концевой половины молекулы, даже у антигенно неродственных вндотоксинов, подтверждено при анализе первичной структуры этих белков (98J6 гомологии в этой части молекулы обнаружено среди вндотоксинов группы kurstakt; 80-95$ - между эндотоксинами подвидов THU, ЕНТ и ендотоксинами группы kurstakl и 40% гомологии между последними И эндотоксинами BTI).

Функциональная роль этой части молекулы вндотоксинов до сих пор не ясна. Ранее, учитывая высокое содержание в ней остатков цистеина, предполагали 00 участив в поддержании структуры кристалла. Действительно,

остатки цистеина распределены в молекуле эндотоксинов ассиметрично, причем подавляющее большинство (90%) приходится именно на С-конец. Такой принцип построения сохраняется даже у структурно отдаленных белков. Однако, эндотоксины BTI с Mr 70000 и 28000, москитный фактор (Mr 65000), токсин подвида TEN (Mr 70000) формируют кристаллические включения в клетке, не имея подобной части молекулы. Поэтому, более вероятно, что С-концевая половина молекулы способствует поддержанию белка в растворе, так как более гидрофильна по сравнению с очень склонной к агрегации N-концевой половиной молекулы, что, возможно, отражает ее приспособленность к взаимодействию с мембранами.

N-Концевая половина молекулы у эндотоксинов группы kurstakl (ИНН и ALE) построена из двух субдоменов, соответствующих консервативной и вариабельно? по структуре четвертям молекулы. Если такая организация белка действительно отражает определенную функциональность, то подобный принцип организации должен сохраняться и у других ендотоксинов, в том числе и у иммунологически и, следовательно, структурно отличных.

Нами показано, что белок BFI с Mr 70000 (Ы-домен белка с Mr 130000) при ограниченном протеолизе трипсином расщепляется с образованием фрагментов с Mr около 40000. После 'отделения образующихся при гидролизе низкомолекулярных пептидов сумма фрагментов подвергнута автоматическому секвенироваиию. Прочитаны две аминокислотные последовательности, одна из

I 362

Mr 40000 Mr 40000

которых повторяла установленную нами ранее аминоконцевую последовательность этого белка, а другая - совпала с последовательностью белка с Mr 72357 (Donovan), начиная с 362 остатка. Это свидетельствует о наличии в структуре N-концевой половины белка BTI, как и в эндотоксинах группы Izurstakl, двух субдоменов, соответствующих первой и второй четвертям молекулы протоксина. Следует однако отметить, что для ендотоксинов BTI не характерно разделение субдоменов по структуре на консервативный и вариабельный.

Полученные результаты позволили предложить модель структурно-функциональной организации эндотоксинов ВТ (Рис.13).

з:

ЭНДОТОКСИНЫ (протоксины), активные на Lepidoptern (Mr 130000). | 65000-80000 Hl5T.Nl5T.|—ÍI5TÍ]--1~15т71

Истинный токсин

Консервативный участок //Вариабельный' ////участок///

токсическое узнавание действие мишени

30000 9//33QÓ0'//

ш

Эндотоксины, активные на Díptera (подвид ви) (..... 70000-60000 м 30000 1—Р 30000 У

40000

40000

Рис. 13 Структурно-функциональная организация вндотоксинов ВТ.

8. МНОЖЕСТВЕННОСТЬ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНОВ ВТ.

Одновременная продукция нескольких эндотоксинов, отличающихся пс мол.массе (135000, 130000 и 65000) и антигенным свойствам, была показаш нами еще в 1980г при анализе белкового состава кристаллов разных штаммот подвида GAL (см.разделы 1 и 2). Обнаружение и разделение двух эндотоксинов с одинаковой мол.массой (130000), формирующих кристаллы штамма 11-67 этого подвида, и доказательство их существенного структурного различия (раздел 5), определяющего резкие отличия в специфичности их внтомоцид-ного еффекта, явилось прямым доказательством одновременной экспрессии одним штаммом двух разных структурных генов вндотоксинов.

Таблица 7.

Одновременная продукция вндотоксинов рядом штаммов ВТ.

Подвид штамм Эндотоксины Mr Источник

E1IR . HD-1 133000 130000 65000 (Yamomoto,1988)

BTI HD-567 134400 127500 67000 28000

ENT HD-110 140000 135000 133000 (Hoft,1988)

AIZ HD-127 135000 133000 130000 65000

Ш HD-551 140000 133000

FIN 130000 130000 (Fitz-Jamee,1997

GAL 612 135000 130000 65000 данная работа

GAL 11-67 130000 130000 _ и _

Действительно, в последнее время у ряда подвидов ВТ (KUR, AIZ, MOR, ENT) из одного штамма клонированы от двух до пяти структурных генов дельта-эндотоксинов (Visser,1988). Однако, одновременная экспрессия нескольких генов, приводящая к продукции штаммом нескольких ентомоцидгшх белков, до последнего времени била показана только для штаммов подвида BTI (эндотоксины с Mr 130000, 70G00 и 28000), поражающего личинок отряда Díptera. Нами впервые обнаружена одновременная продукция двух отличающихся по специфичности действия эндотоксинов, патогенных для личинок отряда Lepldoptera.

Множественность эндотоксинов, продуцируемых одним штаммом, расширяет круг чувствительных к его действии насекомых, что обеспечивает ему определенное екологическое преимущество.

е. ПРОХЕОЛИТЙЧЕШШ ШШГШ BÏ,

Роль эндогенных протеиназ в гидролизе эндотоксинов в момент растворения кристаллов и в процессе работы с этими растворами подробно обсуждалась ранее. Не исключено, что протеиназы могут вызывать гидролиз не только растворов ендотоксинов, но действовать и на кристаллы при длительном хранении споро-кристаллических смесей. Возмо*яшй протеолиз кристаллов может быть причиной падения инсектицидной активности промышленных препаратов при хранении.

Разработка эффективных способов защиты белка от протеолиза требовала подробной характеристики участвующих в этом процессе ферментов. К началу нашей работы били обнаружены и частично охарактеризованы внеклеточная ыеталлопротеиназа подвида ЯУЙ (Li,1975) и внутриклеточная сериновая протеиназа (Leoadet,1980).

Спектр внутри- и внеклеточных протеиназ ВТ и дияалика их

образования.

Динамика появлеш!я протеиназ в клетках и в культуральной жидкости изучена нами в процессе роста трех (шт.696, Il-67,6a) кристаллообразующих и одного (49с) акристаллнческого штамма подвида GAL, а также у одного (шт.20) аспорогешгаго, не образующего кристаллы мутанта.

Активность протеиназ в экстрактах из бактериальных клеток и в культуральной жидкости определена на разных стадиях роста и споруляции культур с помощью специфических хромогендах субстратов. Сериновые протеиназы, активные по субстрату ZAAXptíA, обнаружены в клеточных экстрактах всех изученных штаммов. Эта ферменты различаются по электрофоретической подвижности. Так у всех исследованных штаммов была

обнаружена протеиназа с Г^ 0,9. Вероятно, втот фермент, аналогичен внутриклеточной сериновой протеиназе, описанной у ВТ Ьесайе!;, и покои на внутриклеточную сериновую Протеиназу Вао.БиЬНПв. В екстракта* некоторых штаммов (20, 6а) обнаружена протеиназа, остающаяся пр: електрофорезе в верхнем геле, а также протеиназа с 0,1-0,2.

У всех штаммов ВТ в клеточных екстрактах выявлена протеолитическа* активность по п-китроанилиду -карбокси-прогагонил-фешмаланина - субстрату, специфичному для химотрипсиноподобнах протеиназ. Н^ ггротеиназы равен 0,1, рН оптимум - 7,0.

Активность по п-нитрознилиду И- бензоил-ЕЬ-аргинина, субстрату трипсиноподобных ферментов, обнаружена у штамма 49с.

Таким образом, в клетках разных штаммов ВТ обнаружено не менее четырех сериновых протеиназ.

Обнаружить в экстрактах клеток металлопротеиназу по субстрату Й№-С1у-С1у-11е-А^ не удалось.

На Рис.14 представлены сводите графики по динамике образованна сериновых протеиназ в клетках и культуральной жидкости изучении; штаммов. Видно, что сериновые протеиназы внутри клеток появляются на ра! них втапах споруляции и достигают макимального уровня к в то вре

мя как внеклеточные появляются позднее и уровень их активности постоянно возрастает вплоть до момента образования терморезистетных спор ("Ц ¿>)

культуральной жидкости (II) в процессе роста и спорообразования ВТ. 1 - шт.696, 2- шт.I1-67, 3 - шт.ба, 4 - шт.49с, Ъ - шт.20.

время споруляции. Протеазная активность измерена по ЙААЬрМА.

Рис.14 динамика появления сериновых протеиназ в клетках (I) и

У акристаллнчаокия штаммов (49с и 20) активность внутрихлеточны протеиназ серинового типа снижена по сравнению с кристаллообразующим штаммами в 3-4 раза, И , скорее всего, не они являются причине

отсутствия кристаллов в этих штаммах.

Помимо сериновнх протеиназ некоторые штаммы ВТ секретируют металлопротеиназу и/или карбоксипептидазу типа В или С, что следует из обнаружегшя активности в культуральной жидкости по субстратам ЕНР-С1у-01у-11е-Ащ и ШР-А1а~А1а-1уБ.

Начало синтеза металлопротеиназы предшествует секреции сериновой протеиназы (Рис.15).

I Л,-,Лг ю * нЫ/м,

о

■* о л а в 16

Уровень продукции внеклеточных ферментов различаться на два порядка.

Нами подробно охарактеризованы внеклеточные зериновая и металлопротеиназа.

Рис.15. Динамика накопления внеклеточных протеиназ в процессе роста культуры ВТ.

I - Аб40 культур BTI и FIN; 2-3 - активность сериновых протеиназ BTI и FIN соответственно; 4 - активность металлопротеиназы

в культуре BTI.

зависит от штамма и может

протеиназы БТ

Четаллопротеияаза ВТ.

Для выделения протеиназ ВТ был использован метод аффинной 1 хроматографии на сорбентах (сефароэе и силохроме), содержащих ковалентно трисоединенный циклический антибиотик бацитрацин. Протеиназы связываются ' 2 бацитрацином, содержащим ряд гидрофобных аминокислот. В то же время, ' дз-за содержания нескольких Б-аминокислот и, возможно, особенностей 1щклопептидной структуры, бацитрацин устойчив к ■ протеолизу. Металлопротеиназа не столь прочно связывается с сорбентом, как зериновая протеиназа, и для ее олюции требуется только воздействие зысокой иошюй силы - добавление 1М ЫаОХ. Для десорбции сериново! тротеиназы необходимо присутствие изопропанола (24%).

Металлопротеиназа была выделена из культуральной жидкости тт.2395 тадвида ВТ1 (Табл. 8).

Выделенный фермент гомогенен при диск-электрофорезе в присутствии ЗОБ. Молекулярная масса фермента около 35000, оптимум рН фермента 7,0, температурный оптимум - около 60°. Фермент стабилен при рН 8,0-6,0. При

Таблица 8.

Очистка внеклеточной металлопротеиназы ВТ ( из подвида ВТ1).

Белок Суммарная Удельная Степень Выход Стадии очистки А280 активность активность очистки %

е.в. е.а. ^¿во

Культуральная

жидкость 16000 125 0,007 1 100

Хроматография на

бацитрацин-силохроме 900 64 0,07 10 51

Гель-фильтрация на

сефадксе 0-25 138 60 0,43 70 50

Хроматография на

бацитрацин-сефарозе 34 50 1,5 210 40

Гель-фильтрация на

сефадксе 0-25 16 55 3,5 500 44

температуре 70 в присутствии ионов кальция фермент сохраняет 505 активности в течение 30 мин.

Вас.ату. Вас.аиЫ. ВасЛЬегт. ВТ

Ваа.сег.

1

А1аА1аТВД№г01уТ: А1аА1аА1 Не

10

ИуТЬгТЬгЬеиЬуе

Т1ггС1^5ег01уТНх^1ггЬеиЬу ТЬгС1уТЫуегТ1и)УаЮ1^а^01у

ЛуЬуери

'ЛуГ

Л1аТ1и

Уа1

;егЬеиАвп

Уа1Рго1>еиАеп

А_Г£ 'ЛуУа11еи01уЛБр

Уа1|И1гС1уТПгАЕпЬувУа1С1уТ11гС1уЬуви1уУа1ЪеиС1уАар Уа1ТЬг01уТ1ггЛвпЬувУа101уТ1ггС1у1<уЕ01уУа1Ьеи01уАвр

Рис.16 Сравнение аминоконцевой последовательности металлопротеиназы ВТ -ферментами B.amylollquefaclenз,B.вvbtlltв,B.thermoprotealltlcua,B.cereu.

Аминоконцевая последовательность металлопротеиназы ВТ (Рис.16) идентична известной последовательности металлопротеиназы Вас.сегеиз Вместе с тем, металлопротеиназа ВТ на етом отрезке структуры имеет 75! гомологии с термолизином и только 40-45% гомологии - с протеиназам Вас.ату1о11дие/ас1епз и Вас.зиЬЬШз

Внеклеточные серинабые тиолэависшсые протеипазы ВТ и ВЛС.СЕШ/5".

Практически все микроорганизм продуцируют протеолитически ферменты, относящиеся к классу сериновых протеиназ. Среди ферменто

этого класса выявлено несколько семейств еволюционно родственных протеинаэ, которым свойственна не только одинаковость построения каталитического центра, но и однотипность пространственной структуры, обеспеченная более или менее выраженной гомологией первичных структур. Наиболее изучены семейства химотрипсина (к нему относятся все сериновце протеиназы животных, а также сериновые протеиназы некоторых стрептомицетов) и субтилизина, которое включает в себя протеиназы бактерий и некоторые протеиназы стрептомицетов и грибов. В составе семейства субтилизинов в настоящее время выделяют несколько подсемейств - собственно секреторные субтилизшш, подсемейство внутриклеточных сериновых протеиназ, а также подсемейство SH-содержащих сериновых протеиназ, к которому до последнего времени относили только ферменты, обнаруженные у термофильного актиномицета Thermactln.im.yces vulgaris и стрептомицета Streptomyces rectus.

Несмотря на достаточно подробную изученность протеиназ, секретируемых бациллами, до недавнего времени среди них не находили тиолзависимых сериновых протеиназ. ВТ оказался первым видом, для которого показан синтез подобного фермента. Установление близкого структурного сходства протеиназы ВТ с тиолзависиыой сериновой ггротеиназой из таксономически отдаленного микроорганизма термоактиноммцета, делало интересным поиск ферментов данного типа и у других видов бацилл, и, прежде всего у видов, родственных ВТ. Такого типа фермент был обнаружен у Вас.сегеиз, микроорганизма, очень близкого ВТ.

Аминокислотный состав внеклеточных сериновых протеиназ ВТ и Bac.cereus, выделенных методом аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих ковалентно связанный фенилборонат или циклопептид бацитрацин, сопоставим с субтилизинами. Однако, исследуемые протеиназы отличаются от секреторных субтилизинов повышенным содержанием глутаминовой кислоты и, главное, присутствием цистеинв. В еще большей мере выделенные ферменты близки по аминокислотному составу тиолзависимой сериновой протеиназе из Tha.vulgaris, характерным признаком которой является как раз наличие цистеинв в аминокислотном составе.

Ферменты ВТ и Вас.cereus безусловно принадлежат к классу сериновых протеиназ, так как полностью икактивируютея под действием специфических ингибиторов протеиназ этого класса - ФМСФ и ДФ$. Однако, в отличие от субтилизинов, но подобно тиолзависимой сериновой протеиназе термоактиномицетов, их активность подавляется и реагентами на сульфгидрильную группу - парахлормеркурбензоатом я ацетатом

ртути.Очевидно, что обнаруженный в составе этих протеиназ остаток цистеина, существенен для активности ферментов, поскольку расположен, по аналогии с тиолзагзисимой сершговой протеинаэой из термоактиномицета, в непосредственной близости от функциональных групп активного центра, в частности остатка аспарагиновой кислоты-32. .ЗН-группа в тиолзависимых еериновых протеиназах обладает необычны««! свойствами и не реагирует с

Таблица 9

Основные физико-химические характеристики внеклеточных. еериновых протеиназ ВТ (подвид СЛ1), Вас.сегеиа, Tha.mlgaгíg и субтилизинв ВРЯ*.

Характеристики Субтили- Т.vulgaris ВТ Вас.

зин BPN" GAL сегеиа

Молекулярная масса Оптимум рН активности по Ш^рИА

Температурный оптимум активности по ЙЛАХрИА рН стабильность

Удельная активность по ЙААЬрМА (мкмоль мин на I мг белка) Остаточная активность {%) после обработки:

<10"°М)

(10~3М)

Д4Ф «МСФ

Hg(OH3COOH)2 р-хлормеркурбензоатом ЭДТА(10~3М)

(10 3М)

(10 3М)

27600

8,5

40° 4-10

2/9

28000

8,2

55° 7-9

17,5

29000 29000 8,5 8,4-8,6

45

140

45

10 5-Ю

150

0 0 0 0

0 0 0 0

100 0 0 0

100 0 0 0

100 82 88 85

влкилируицими реагентами, такими как иодацетамид и N-птилонмалвимид, не окисляется, хотя присоединение иона ртути или ртутьоргоническш соединений полностью блокирует фермент.

По функциональным свойствам (Табл.9) внеклеточные сериновые протеиназы ВТ и Вас.сегеиа проявляют много общих черт как < Ь^бти^гаинами, так и с ферментом из Tha.vulgaris.

Сермювые тиолзависимые протеиназн ВТ и Bac-.cereus расщепляю'

хромогенные пептидные субстраты субтилизила — п-нитроанилиды ряда защищенных трипептидов, белковые субстраты, а также сложноэфлрнне субстраты.

Помимо большого сходства внзимологических свойств, аминокислотного состава, содержания функциональна важной меркаптогруппы протеиназы ВТ и Вос-сегеиз необычайно близки ферменту из Т)ш.ии1§аг1з и по П-концевой последовательности - для них отмечено совпадение 12 аминокислотных остатков из 14 сравниваемых.

Рис.17 N-концевые последовательности тиолзависиыых сериновых протеиназ ВТ (подвида GAL, ВТ!, FIN), Bac.cereus, Tha.vulgaris и субтилизин? BPN'.

Степень гомологии первичных структур всех трех рассматриваемых сериновых протеиназ с амшюконцевой последовательностью еубтшшзина BPN' не высок - только четыре совпадающих остатка из 14 сравниваемых. Поэтому сопоставление только N-концевых последовательностей тиолзавнсимых протеиназ бацилл и субтилизинав давало лишь скудные указания на наличие отдаленного сходства между первичными стуктурами этих ферментов. В результате само отнесение тиолзависимых сериновых протеиназ этих видов бацилл к семейству субтилизина было основано на их функциональном сходстве и соответствии ряда общих характеристик - молекулярной массы, аминокислотного состава, некоторых внзимологических свойств, но не могло опираться на прямые структурные дашше.

Впервые такие данные были получены при сопоставлении первичных структур участков ферментов, непосредственно примыкающих к остатку серина-221 активного центра. Для втого было проведено расщепление тиолзависимых сериновых протеиназ ВТ и Bac.cereus по единственному имеющемуся в их структуре остатку метионина. Образующиеся при атом С-концевые фрагменты обоих ферментов, содержащие около 60 аминокислотных остатков, были отделены от остальной части молекулы ультрафильтрацией через мембрану UM-10 и их ашшоконцевая последовательность определена твердофазным методом Эдмана.

В.amy. В.Itch. Tha.v. ВТ

233

AlSlPHVAGiAiÜÍJlLSKHPKVVTNT

igPHYAGjAjUI ATPHVAGVAgbL/js

atphvaqvaall¿|n

iiskhpni à

ф -й

усаллл

3SLQN I^rKL-GDSïfîjïGK ¡rise I atyl-GSSX YjYGK aa Ï SN Г AjDKISGTGT WAK jrvnaykav X SS ГТВК1 SGTGTYViKfJ jrvnaïkav

[jlfWQAAA

ak

Рис.IB Последовательность С-концевых участков внеклеточных сериновых протеиназ ВТ (подвидов GAL, BTI, FIN), Tha.vulgaris

(Tha.v.) и субтилизинов - BPN' (В.amy.) и Карлсберг (B.ltch.).

Результаты определения n-концевых аминокислотных

последовательностей С-концевых фрагменов протеиназ ВТ и Вас.сегеиз впервые дали прямое доказательство структурного соответствия тиолзависимых сериновых протеиназ бацилл и субтилизинов. На участке 222—243 из 22 сравниваемых аминокислотных остатков у субтилизина и протеиназ ВТ и Вас.сегеиз совпадают ii (50%). Это - бесспорное свидетельство гомлогии первичных структур, видимо, распространяющееся и на пространственные структуры. Сходство гораздо выше при сопоставлении непосредственно примыкающего к серину-221 участка 222-233 - на нем из II сравниваемых совпадает 9 аминокислотных остатков или 82%. Очевидно, втот участок менее вариабелен из-за его функциональной" нагруженности".

Выявлено очень большое сходство участков 222-243 тиолзависимых протеиназ двух видов бацилл с тиолзависимой протеиназой из термоактиномицетов - единственное отличие состоит в замене остатка алакина-232 у протеиназ бацилл на глицин в протеиназе термоактиномицетов. В аминоконцевых участках етих ферментов процент совпадений несколько меньше - 6426 при сравнении протеиназа ITia. vulgaris и Вас.сегеиз и 1\% - для пары протеиназ Tha.vulgaris и ВТ.

Таким образом, тиолзависимые сершювые протеиназы Вас.сегеиз и ВТ чрезвычайно близки между собой, что отражает близость втих двух видов бацилл. В то же время обе они весьма близки и протеиназе из термоактиномицетов, что позволяет объединить их в особое подсемейство субтилизинов - тиолзависимых сериновых протеиназ. Консерватизм первичных структур тиолзависимых сериновых протеиназ микроорганизмов, до последнего временя' считавшихся принадлежащими к весьма разным таксонам, требует внимательного анализа и может указывать на вволюционные связи между термоактиномицетами и упоминавшимися выше двумя видами бацилл. Наконец, получены несомненные свидетельства структурного родства тиолзависимых сериновых протеиназ и субтилизина, надетою обосновывающие

принадлежность подсемейства тиолзависимых сершговых протеиназ к семейству эволюционно родственных субтилизинов.

В заключение следует отметить, что роль сульфгидрильной группы в тиолзависимых сериновых протеиназах пока не ясна, но неизменное появление остатков цистеинв, обладающих сходной реакционной способностью в нескольких ферментах, образуемых представителями различных таксонов микроорганизмов - термоактиномицетами, бациллами, дрожжами и грибами, указывает на их возможное участие в функционировании протеиназ.

10. представления об эволодш эндотоксинов и протеиназ вт.

Значителыше различия в первичной структуре эндотоксинов ВТ, обычно не свойственные белкам, шттезируемым микроорганизмами одного вида, указывают на необычно высокий темп эволюции этих белков. В связи с этим возникал вопрос, произошло ли закрепление различий и в ряде других биохимических и физиологических характеристик в процессе дифференцирования подвидов ВТ или же изменения подобного масштаба затронули только эндотоксины. Для выяснения этого вопроса мы сравнили между собой сериновые протеиназы, секретируемые клетками разных-подвидов ВТ. Для этого били выбраны подвида ВТ - GAL, BTI и PIN, существенно различающиеся биохимией и морфологией вегетативных клеток и, главное, свойствами эндотоксинов.

Сериновые протеиназы, продуцируемые этими подвидами, были получены з чистом виде и охарактеризованы. Выделенные ферменты близки между зобой по химическим свойствам, мол.массе, оптимуму протеолитической активности , аминокислотному составу и аминоконцевой последовательности зблизи остатка серина активного центру (Рио.!8).

Полное структурное совпадение на участке 222-243 у протеиназ из )азличных подвидов ВТ вполне закономерно в связи с выявленным ранее у •иолзависимых сериновых протеиназ высоким консерватизмом структуры на (Том участке, непосредственно примыкающим к Сер-22!•

Вместе с тем, сериновые протеиназы трех подвидов ВТ характеризуются ¡ледуюцими особенностями (Табл. 10).

Так, удельная активность протеиназы из подвида BTÍ, определенная по убстрату ZAAlpNA, совпадает с удельной активностью протеиназы подвида AL и на порядок превышает удельную активность протеиназ« подвида FIII фермента из термоактиномицетов.. Температурный оптимум действия ротеиназы из подвида Gilaaгодится при 45°, что близко к температурному птимуму протеиназы подвида BTI (40°), тогда как протеинаэа подвида FIN

Таблица 10.

Особенности функциональных свойств протеиназ из различных подвидов ЬТ.

Показатели ВТ1 Подвид ГШ 0А1

Удельная активность по ЯААЪрНА 150 15 140

(мкмоль мин мг белка)

Температурный оптимум активности 45

по 2ААХр!И 40° 35°

Остаточная активность по ЙААЬрКА

после I ч инкубвции при 60°(Ж) 25 5 (2

Электрофоретичеекая подвижность

при рН 6,5:

Количество полос 2 1 2

К^ основной . 0,62 0,46 0,46

минорной 0,46 нет 0,30

проявляет максимум протеолитической активности при 35°, а ферме* термоактиномицетов - при 55°.

Различается тиолзависимые сериновые протеиназы и по степе1 инактивации при 60°, при етом относительно более термостабилы протеиназа подвида ВТ1.

Обнаружены некоторые различия в Я-концевых последовательност! изученных ферментов (Рис.17).На участке из аминокислот удалось обнаружить структрное отличие у протеиназы подвида ВТ1 (лизин-9) по сравнению с ферментами двух других подвидов (аспарагин-9). Весьма вероятно, что различия в структурах ферментов затрагивают и другие участки последовательности полипепгидной цепи.

Выявленные отличия в свойствах сериновых протеиназ разных подвид ВТ, отражающие определенные, весьма небольшие, различия в первичн структурах ферментов, являются результатом вволюции микроорганизм приведшей к диссоциации вида на подвида. Такие различия закрепились ряде других характеристик микроорганизма - антигенных свойсте жгутиков, влектрофоретической подвижности встераз и т.п.

Вместе с тем следует заключить, что ввол кадия фермента шла далеко столь быстро, как у эндотоксинов. Аномально высокий темп вволхя. последних, приведший к удивительно большой вариабельности их первича структуры и к функциональным различиям, обусловлен плазмидг

локализацией структурных генов вндотоксшюв, существованием механизма трэнсцепции у ВТ, наличием в одном геноме нескольких генов близкородственных эндотоксинов, что обеспечивает возможность межгешшх рекомбинаций.

выводы.

I. Установлена молекулярная организация дельта-эндотоксинов ВТ, "которые, как показано в работе, у большинства подвидов представлены бел5сами с Мг около 130000, построенными из одной полипептидной цепи. Показано, что: »

- N-Концевая половина молекулы эндотоксина (протокеина) существует в виде стабильного к протеолизу домена (Mr fiSOOO-QOOOO), ответственна

за биологическое действие исходного белка и соответствует истинному токсину ВТ, образующемуся в кишечнике чувствительных гусениц под действием лротеиназ насекомого.

- С-Концевая половина молекулы протокеина (Иг около 65000) у всех эндотоксинов представлена рядом менее стабильных доменов (Мг 15000- 35000). -Истинный токсин (N-концевая половина молекулы) имеет субдоменную организацию и формируется из двух глобул (мол.вес 30000 и ЗЗООО у эндотоксинов группы kurstaki и по 40000 - у эндотоксинов BTI), соответствующих двум первым четвертям молекулы протокеина.

- Аминоконцевая четверть молекулы (остатки 30-346) у эндотоксинов группы surataíst ( подвиды ALE и КУЙ) . представлена в виде структурно крайне юнеервативного района, в то время как вторая четверть молекулы (остатки ¡47-617) является вариабельным районом структуры, в котором наряду- с нвЗриантными участками, имеется несколько вариабельных блоков юследовательности.

Результаты изучения доменной организации и первичной структуры, рагментов эндотоксина привели к гипотезе о структурно-функциональной ргаиизации дельта-ендотоксинов, как цепи доменов, из которых шшоконцевой выступает как собствешю токсин, следующий за ним - как узнающий" рецептор домен, а С-концевая половина молекулы важна, видимо, ля поддержания бежа в растворимом состояний, поскольку аминоконцевая оловина молекулы склонна к агрегации, что может быть связано с ее заимодействием с мембранами.

. Получены данные, указывающие на существнныв различия в первичной труктуро вндотоксшюв резко отличающихся по специфичности биологически действия. Так,

- обнаружено различие мол.массы (145000, 135000, 130000, 65000 и 28000) у эндотоксинов разных подвидов.

- Выявлены еидотоксины, различающиеся по антигетшм свойствам.

- Выделены и охарактеризованы белки подвида В'1'I(мол.вес 70000 и 28000) и впервые показаны глубокие различия в первичной структуре эндотоксинов, захватывающие амкнокояцевоЯ район.

- Впервые среда эндотоксинов, патогенных для насекомых одного' отряда (Leptdoptera), обнаружены белки (подвид GAL), отличающиеся по структуре от эндотоксинов группы kuratakl примерно в той же мере, что и вндотоксины BTI,поражающие насекомых другого отряда (Díptera).

Э- Впервые показана одновременная продукция одним штаммом (подвид GAL) нескольких эндотоксинов резко отличающихся по первичной структуре, иммунологическим свойствам и специфичности ентомоцидного еффекта. Множественность эндотоксинов, продуцируемых одним штаммом, расширяет круг чувствительных к его действию насекомых, что обеспечивает ему определенное экологическое преимущество.

4. Показано присутствие в препаратах кристаллов примесных протеина: эндогенного происхождения, часто приводящих к искажению белкового состава кристаллов. Разработаны методы, позволяющие исключить действие протеиназ при работе с эндотоксинами.

Установлено, что ВТ секретирует сериновую и металлопротеивазу, способные принимать участие в процессинге эндотоксинов. Действие этих протеиназ может быть одним из факторов, ответственных за нестабильность промышленных инсектицидных препаратов при хранении.

Выделена и охарактеризована металлопротеиназа ВТ, продуцируемая подвидом ВН. Показана ее структурная идентичность на N-конце молекул! метвллопротеиназе Вас.сегеиз и большее сходство с термолизино! (металлопротеиназой Bac.thermoproteolltlcue) по сравнению металлопротеиназами Bac.subtllls и Вас.атуlollquefactena

Установлено, что сериновая лротеиназа ВТ и близкородственног микроорганизма Вас.сегеиз принадлежат к особой группе тиолзависпмы сериновых протеиназ и очень Слизки аналогичному фермент термоактиномицетов (ThermoaciInomycee vulgar1з), что подтвержден определением N- и С-концевых последовательностей ферментов.

Сравнение сериновых тиолзависимыж протеиназ, образуемых разным подвидами-ВТ ( PIN, GAL, BTI) показало, что их изменчивость значительно меньше, чем изменчивость соответствующих эндотоксинов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛШГШЩ РАБОТАХ :

1. Г.Г.Честухина,'Л.И.Костина, И.А.Залунин, Т.С.Котова,'С.П.Катруха, Ю.С.Кузнецов, В.М.Степанов. Белки кристаллов S-ендотоксина B.thuringlenais . Биохимия, 1977, т.42, 1660-1667.

2. Г.Г.Честухина, И.А.Залунин, Л.И.Костина, Т.С.Котова, С.П.Катруха, Л.А.Люблинская, В.М.Степанов. Протеиназы, связанные с кристаллами B.thurtngtensls. Биохимия, 1978, т.43, 857-864.

3. Г.Г.Честухина, Т.С.Котова, И.А.Залунин, Л.М.Ермакова, Ф.С.Клепикова, В.М.Степанов. Протеиназы B.thuringiensis в онтогенезе. В кн.: Экспериментальное изучение развития микроорганизмов, Пущино, 1978, 20-24.

4. И.А.Залунин, Г.Г.Честухина, В.М.Степанов. Белковый состав кристаллов разных серотипов B.thurlnglensla. Биохимия, 1979, т.44, 693-697.

5. Г.Г.Честухина, Т.С.Котова, И.А.Залунин, В.М.Степанов. Протеиназы в процессе роста и спорообразования B.thliringiensla. Биохимия, 1979,

т. 44, 796-802.

6. Г.Г.Честухина, А.С.Епремян, И.А.Залунин. Спектр и динамика внутриклеточных протеиназ B.thurlnglensi3. В кн.: Химия протеолитических ферментов. Углич, 1979, 91-92.

7. G.G.Chestukhina, I.A.Zalunin, L.I.Kostina, T.S.Kotova, S.P.Katrukha, V.M.Stepanov. Crystal-forming proteins of B.thurlnglenala. The limited hydrolysis by endogeneous proteases as a oause of their apparent multiplicity. Bioohera.J., 1980, v. 187, 457-465.

3. С.П.Катруха, Г.Г.Честухина, В.М.Степанов. Химическая характеристика белка кристаллов B.thurtnglensia. Гидролиз бромцианом. Химия природных соединений. 1980, т.5, 384-386.

3. А.С.Епремян, Г.Г.Честухина, Р.Р.Азизбекян, Е.Ы.Нетыкса, В.М.Степанов Внеклеточная сериновэя протеиназа B.thutrlTlgiensla. Биохимия, 1981, т. 41, 920-927-

[О. V.M.Stepanov, G.G.Chestukhina, G.N.Rudenskaya,_ A.S.Epremyan, A.L.Osterman, O.M.Khodova, L.P.Belyanova. A new subfamily of microbial serine proteinases? Structural similarities of ВасНХиз thuringlensls and Thermoacttnlmycea vulgaris extraoellular serine proteinases. Bioohem.Biophys.Res.Communs., 1981, v 101, 1680-1687. .

1. V.M.Stepanov, G.G.Chestukhina, I.A.Zalunin, L.I.Kostina, A.L.Mikhailova. Structural features of Bacillus thurlngienala crystal protein. Chemistry of Peptides and Proteins, v.1, 1982, 423427.

2. И.А.Залунин, Г.Г.Честухина, Е.Д.Левин, Е.А.Тимохина, В.М.Степанов. О

различии первичных структур б-эндотоксинов, образуемых разными серотипами В.thurlnglensis. Биохимия, 1982, т. 47, 1570-1576.

13. А.С.Епремян, Г.Г.Честухина, А.В.Гайда, А.Л.Остерман, О.М.Ходова, Степанов.В.М. Тиолзависимые сериновые протгиназы. 11.Внеклеточная сериновая протеиназа Вас.сегеиз. Биоорганическая химия. 1982, т. 8, 1649-1658.

14. G.G.Chestukhina, L.I-Kostina, A.L.Mikhailova, S.A.Tyurin, F.S.Klepikova, V.M.Stepanov. The main features of Bacillus thurlnglensis S- endotoxin molecular structure. Archives of Hiorobiol., 1982, v 132, 159-162.

15. А.Л.Михайлова, Ф.С.Клепикова, Г.Г.Честухина, В.М.Степанов. Мето;

определения активности ентсмопатогенного кристаллообразунлцего белкг ВасШиз thurlnglensis. Прикладная биохимия и микробиология. 1984, т.20, 682-687.

16. Г.Г.Честухина, С.А.Тюрин, Л.И.Костина, Ф.С.Клепикова. Ограничений протеолиз и внутримолекулярная организация кристаллообразующиз белков В.thurlnglensis. В кн.: Регуляция микробного метаболизм; факторами внешней среды. 1983, Пущино, 149.

17. О.П.Загнитько, Г.Г.Честухина, Л.П.Ревина, В.М.Степанов. Тиолзависимые сериновые протеиназы. 111. Аминокислотные последовательности вблизи остатка серина активного центра протеиназ В.thurlnglensis и B.cereus. Биоорганическая химия, 1984, т. 10, 383-389.

18. В.С.Гаспарой*, Г.Г.Честухина, И.А.Болотина, В.М.Степанов, В.И.Пермогоров. Исследование 6-ендотоксина из B.thurlnglensli методом кругового дихроизма. Молекулярная биология, 1985. т. . 19 1422-1428.

19. Г.Г.Честухина, С.А.Тюрин, Е.Д.Левин, В.И.Остославская, Е.А.Тимохина Домены в молекулярной организации б-вндотоксина В.thurlnglensis. В трудах 16 конф. ФЕВО, Москва, 1984, 315.

20. О.П.Загнитько, Л.П.Ревина, Г.Г.Честухина, В.М.Степанов. Тиолзависимые сериновые , протеиназы. 1Y. Первичная структур; С-концевого фрагмента протеиназы Bactllus' thurlnglensis Биоорганическая химия, 1985, т. 1!, 769-777.

21. Г.Г.Честухина, С.А.Тюрин, а.Л.Остерман, И.А.Залунин, Л.И.Костина О.м.Ходова, В.М.Степанов. Структурно.-лфункциональные особенност! внтомоцидного белка В.thurlnglensis. В трудах 5 Всесоюзного биохимического съезда , Киев, 1986, 20.

22 Г.Г.Честухина, О.П.Загнитько, Л.П.Ревина, Ф.С.Клепикова, В.М.Степанов. Внеклеточные сериновые протеиназы подвидов B.thurlnglensla

эволюционируют существенно медленнее соответствующих дельта-зндо-токсинов. Биохимия, 1985, т. 506 1724-1732.

23. G.G.Chestukhina, I.A.Zalunin, L.I.Kostina, M.E.Bormatova, F.S.Klepikova, O.M.Khodova, V.M.Stepanov. Structural features of crystal-forming proteins, produced by Bacillus thurlngiensis subspecies Israelensia. FEBS Lett, 1985, v '190, 345-348.

24. Г.Г.Честухина, С.А.Тюрин, А.Л.Остерман, О.М.Ходова, В.М.Степанов. Аминокислотные последовательности пептидов N-концевого домена

fi-ендотоксина подвида ALE. Гипервариабельные участки ендотоксинов B.thuringtensls. Биохимия, 1986, т.51, Ю48-Ю50.

25. И.А.Залуиш, Д.И.Костина, Г.Г.Честухина, М.Е.Барматова, Ф.С.Клепикова, О.М.Ходова, В.М.Степанов. Сравнительное изучение белков, образующих ентомоцидные кристаллы Bacillus thurlngiensis подвида israelensia. Биохимия, 1986, т.51, 449-457.

26. G.G.Chestukhina,' S.A.Tyurin, A.LlOsterraan, O.M.Khodova,

V.M.Stepanov. Amino acid sequences from the N-terminal domain of Bacillus thurlngiensis, subspecies' alesti, S -endotoxin. Hypervariable regionse of Bacillus thurlngiensis Q-endotoxins. FEBS Lett., 19_86, v 198, 283-286.

27. С.А.Тюрин, Г.Г.Честухдаа, А.Л.Остерман, О.М..Ходова, Е.А.Тимохнна, Ф.С.Клепикова, В.М.Степанов. Молекулярная организация N-концевого домена эндотоксина подвида alesti Bacillus ttvuringiensia. Биохимия, 1987, т.52; 918-926.

28. V.M.Stepanov, G.G.Chestukhina, I.A.Zalunin, A.L.Osterman, L.I.Kostina. Molecular organization of Bacillus thurlngiensis delta-endotoxin. J.Microbiol.Abstracts В., 1987, v 22, 87-3.

29. G.G.Chestukhina, L.I.Kostina, I.A.Zalunin, O.M.Khodova, V.M.Stepanov Bacillus thurlngiensis, subspecies gallerlas, simultaneously produces two delta-endotoxins strongly different in their primary structure and entomooidal activity. FEBS Lett., 1988, v 232, 249251.

30. А.Л.Остерман, А.И.Карвсин, О.П.Загнитько, С.В.Калугер, Г.Г.Честухина, М.Ю.Фонштейн, Н.К.Янковский, В.М.Степанов. Клонирование и сравнительная характе'ристика двух структурно ' отдаленных S-ендотоксинов Bacillus thurlngiensis подвидов galleriae и kurstakt. Молекулярная биология, 1989, т. 23, 463-472.

Результаты работы докладывались на Всесоюзных и международных съездах, симпозиумах и конференциях : 12 конференции ФЕБО (1978, Дрезден), 2-ом Всесоюзном симпозиуме по химии протеолитических ферментов (1979, Углич), III и IY СССР-ФРГ симпозиумах по химии пептидов и белков (1980, Махачкала, 1985, Фрунзе), на Y Микробиологическом съезде (1980, Рига), па YI и YII Всесоюзных симпозиумах по химии белков и пептидов, (1983, 1987, Рига), на Y Всесоюзном биохимическом съезде (1986, Киев), на 13 Международном биохимическом съезде (1985, Амстердам), на Всесоюзных конференциях по проблемам создания и применения микробиологических средств защиты растений (1985, 1987, 1989, Велигок), на 1 Советском-Болгарском симпозиуме по биологическим средствам защиты растений (1989,Пловдив).

список сокращений, встречающихся в тексте работц.

Использовали международные однобуквеннке латинские сокращения 1азваний аминокислот.

ДЭАЭ - диатиламиноэтал

4МСФ - фенилметилсульфонилфторид

Д4Ф - диизопропилфторфосфат

ЭДТА - втилендиаминтетраацетат

ДТТ - дитиотрейтол

SDS - додецилсульфат натрия

Z - бензилоксикарбонил

pNA - п-нитроанилид

DNP - динитрофенил

Bacillus thurlngtensts (ВТ)