Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis

Каменек, Людмила Кирилловна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis"

РГ8 Ой 2 2 СЕН т

На правах рукописи

К а м в н ё и

Людмила Кирилловна

Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений

специальность 06.01.11 - защита растешш

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва- 1998

Работа выполнена в Ульяновском государ ствсшюм университете

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

М.В. Шгеряшис

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.К. Шильникова

доктор биологических наук, профессор А.И. Шаталкин

доктор биологических наук, профессор В-Г. Шестаков

Ведущая организация : Цснгралыгый инеппуг агрохимического обслуживания сельского хозяйства

Защита состоится: ¡Ц OKÄSCbllSt 1998 г. в /^ часов, на заседании Диссертационного совета Д_120.35.09 в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, И - 550, Тимирязевская ул. 49, Ученый совет ТСХА .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (ТСХА).

Автореферат разослан (М-Н^И SXjiJt 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук _А УЦллЖ_ В.А. Шкаликов

I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Защита растений от повреждений является одним из важнейших резервов повышения урожайности сельскохозяйственных культур, а также сохранения лесного и паркового фонда. В условиях агроценоза необходимость применения защитных мероприятий практически безальтернативна.

В настоящее время ведущим в этой области является химический метод борьбы с насекомыми-вредителями, который наряду с неоспоримыми преимуществами, такими как высокая эффективность и быстрота достигаемого результата, имеет и существенные недостатки. Среди них основными можно считать токсичность химических инсектицидов для полезной энтомофауны и теплокровных животных при низкой избирательности в отношении фитофагов, их сравнительно медленную деток-сикацию в окружающей среде, приводящую к неизбежному ее загрязнению, и все чаще встречающееся развитие резистентности у насекомых -вредителей, следствием которой становится необходимость увеличения норм расхода пестицидов и кратности обработок. Поэтому усилия специалистов в области защиты растений направлены на разработку таких систем защитных мероприятий, при которых применение химических средств было бы сведено до абсолютно необходимого минимума. Это тем более актуально, что до сих пор не удалось создать высокоизбирательных и нетоксичных химикатов.

Перспективной альтернативой химической защиты растений служит биологическая регуляция численности в рамках интегрированной системы, и в частности, использование патогенных для насекомых микроорганизмов. Наибольший интерес в этом отношении представляет спорообразующая кристаллофорная бактерия Bacillus thuringiensis, поражающая многие виды насекомых - фитофагов, препараты на основе которой используются в настоящее время во всем мире.

Эффективное применение таких препаратов, а также создание новых более совершенных требует знания многих особенностей патогена, насекомого - объекта подавления, механизмов их взаимодействия и влияния на них окружающей среды. Известно, что основным действующим началом Bacillus thuringiensis, в целом ответственным за комплекс патологических проявлений, является дельта - эндотоксин, продуцируемый ею. Остальные токсины и споры лишь усиливают вызванную им патологию. Существующие ныне препараты на основе целой бактерии в своем составе содержат много балластных веществ (вегетативные клетки, элементы культуральной среды). При их массовом применении соз-

дается предпосылка к чрезмерному обсеменению среды спорами. Создание и использование средств на основе чистого дельта-эндотоксина позволило бы обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность защитных мероприятий.

В мировой литературе накоплен обширный материал, описывающий строение, состав, физико-химические свойства кристаллов, включая их судьбу в кишечнике восприимчивого насекомого под действием pH и кишечных ферментов. Установлено, что синтез дельта-эндотоксина в процессе споруляции генетически запрограммирован (Дебабов и соавт., 1987; Feitelson et al., 1992), и что строение и химические свойства токсинов разного происхождения имеют значительное сходство (Честухина и соавт., 1986; 1987; Ellar, 1996). Дельта-эндотоксины класса Cry I А, токсичные для чешуекрылых, способны связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры ( Hodgman & Ellar, 1990; Smith & Ellar, 1994). Все это позволило предположить единство механизма действия дельта - эндотоксина данного патотипа на всех восприимчивых насекомых.

Несомненно, что патологические изменения в организме насекомого являются следствием воздействия токсина на биохимические процессы в клетках кишечника. Многочисленные исследования,посвященные этому вопросу (Heimpel, 1977; Faust, 1984; Aronson et al., 1986; Gill et al., 1992; и другие), касались в основном изучения влияния дельта-эндотоксина на транспорт веществ, в первую очередь неорганических ионов, через цито-плазматические мембраны, которое не является первичным (Himeno et al., 1985). Предпринятые попытки до настоящего времени не привели к созданию теории механизма действия дельта - эндотоксина на насекомых, позволяющей связать в единое целое накопленные факты.

Для решения этой проблемы было проведено детальное изучение механизма действия дельта - эндотоксина, позволившее сформулировать концепцию, основные положения которой удовлетворительно согласуются с результатами, полученными ранее. Сформулированные положения, касающиеся как самого механизма, так и подходов к его изучению, можно рассматривать как новое перспективное направление в бактериологии и токсикологии, служащее целям защиты растений.

званной эндотоксином патологии, улучшения существующих ныне препаратов на основе Вас. thuringiensis и создания принципиально новых эн-дотоксин-содержащих препаративных форм.

В связи с этим были поставлены следующие задачи .

- Изучить детально цитопатическое действие дельта - эндотоксина на клетки культуры и кишечника насекомых(непарного шелкопряда и монашенки).

- Уточнить особенности строения и свойства дельта - эндотоксина как разобщителя окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях клеток кишечника насекомых (капустных белянки и совки, боярышницы, непарного шелкопряда, монашенки).

- Выявить влияние разобщающего действия дельта - эндотоксина на основные процессы в клетках кишечника насекомых отряда чешуекрылых (клеточное дыхание, поглощение глюкозы, гликолиз, интенсивность синтеза АТР, систему активного транспорта неорганических ионов - К+, Na+, Mg2+ и Са2+ ).

- Установить биохимические факторы возникновения устойчивости насекомых к дельта - эндотоксину.

- Выяснить возможность повышения эффективности препаратов на основе Вас. thuringiensis путем усиления патологического процесса, вызванного дельта - эндотоксином.

- Разработать принципы получения и применения новых препаративных форм на основе чистого дельта - эндотоксина.

Научная новизна результатов исследований. Впервые проведено комплексное изучение влияния дельта-эндотоксина Вас. thuringiensis на биохимические системы организма насекомых (окислительное фосфори-лирование, гликолиз, транспорт ионов). Сформулированы и обоснованы научные положения, совокупность которых можно квалифицировать как новое перспективное направление в изучении патогенеза бактериальных токсинов белковой природы.

Впервые с использованием современных методов исследований, доказано, что первичным действием дельта-эндотоксина является разобщение окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях, обусловленное его протонофорными свойствами. При этом способность разобщать не зависит от источника происхождения токсина (в пределах патотипа), но прямо пропорциональна его концентрации.

Установлено, что усиление клеточного дыхания в течение первых 10 минут воздействия дельта-эндотоксина Cry I А на фоне резкого снижения синтеза АТР связано с разобщением окислительного фосфорилирования и дыхания, приводящего к деэнергизации митохондрий.

Начальное стимулирование потребления клетками глюкозы связано с включением механизма, компенсирующего снижение синтеза АТР в ходе окислительного фосфорилирования за счет аэробной, а при дальнейшей деэнергизации клетки и снижении потребления кислорода, - анаэробной стадии гликолиза.

Впервые показано, что вакуолизация клеток, приводящая к их деструкции, вызвана нарушением работы ион - транспортирующей АТ-Разной системы вследствие общей деэнергизации клеток, результатом которого является пассивный нерегулируемый приток ионов натрия и воды в клетку и, как следствие, вакуолизация мембранных структур.

Показано, что механизм действия дельта-эндотоксинов Cry I А класса универсален и един для клеток кишечного эпителия чувствительных насекомых - фитофагов отряда чешуекрылых, не зависит от вида насекомого, а его проявления прямо пропорционально связаны с концентрацией токсина.

Впервые проведен анализ защитных механизмов насекомых к действию дельта-эндотоксина. Показано, что увеличение активности транспортной М§2+-зависимой К+, Na+ - АТРазы клеток кишечника, а также лактатдегидрогеназы в гемолимфе коррелирует с восприимчивостью насекомых к данному токсину и бактерии в целом.

Дано теоретическое обоснование разработки нового поколения бактериальных препаратов для защиты растений от листогрызущих вредителей сельского хозяйства и леса, содержащих очищенный и активированный дельта-эндотоксин и обладающих высокой биологической эффективностью и экологической безвредностью.

Практическая значимость работы. Результаты выполненной работы, вскрывающие механизмы взаимодействия патогена с организмом насекомого-хозяина, послужили теоретической основой при разработке серии бактериальных препаратов нового поколения на основе очищенного и активированного дельта-эндотоксина, обладающих инсектицидно-стью, более чем в 10 раз превышающей таковую для применяемых в настоящее время, что позволяет соответственно снизить их расход. Они абсолютно безвредны и практически растворимы, что делает перспективным их использование методом аэрозольного распыления. Приоритет в разработке этих инсектицидов защищен патентами Российской Федерации.

нению бактериальных препаратов в условиях сельского и лесного хозяйства. Предлагаемые технологии апробированы в ряде хозяйств Алтайского края, Новосибирской и Ульяновской областей.

Материалы на один из препаратов на основе очищенного и активированного дельта-эндотоксина (Дельта) переданы в Госкомиссию при МСХ РФ, которой в летнем сезоне 1996 года проведены Государственные испытания препарата, подтвердившие его высокую инсектицидность против листогрызущих вредителей на капусте.

Основные положения выносимые на защиту:

- Создание принципиально новых препаративных форм инсектицидных препаратов на основе очищенного и активированного дельта-эндотоксина и разработка технологии их применения.

- Механизм действия дельта-эндотоксина, на организм чувствительных насекомых-фитофагов отряда чешуекрылых.

-Факторы возникновения устойчивости к дельта-эндотоксину и пути её преодоления.

- Разработка методов повышения эффективности эндотоксинсо-держащих препаратов.

- Характеристика морфологических, ультраструктурных и биохимических изменений клеток кишечного эпителия чувствительных чешуекрылых вследствие воздействия дельта-эндотоксина.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на V совещании энтомологов Сибири (Новосибирск, 1979); XIV Тихоокеанском международном научном Конгрессе, Комитет К (Хабаровск, 1979); V Всесоюзной конференции по экологической физиологии, биохимии и морфологии (Фрунзе, 1977); IV региональной конференции молодых ученых Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1980); региональной научно-практической конференции молодых ученых Сибири по актуальным проблемам земледелия (Новосибирск, 1981); Всесоюзной школе молодых ученых и специалистов по актуальным проблемам теории и практики защиты растений (Сухуми, 1982); Всесоюзных научно-практических конференциях по микробиологическим средствам защиты растений (Новосибирск, 1985, 1986); Всесоюзной конференции координационного Совета программы «Сибирь» (Новосибирск, 1987); конференциях Сибирского отделения Всесоюзного микробиологического общества РАН (Новосибирск, 1983, 1997); Всесоюзных и региональных научно-практических и производственных конференциях и совещаниях по проблемам экологии и сельского хозяйства (Барнаул, 1987, 1990, 1991, 1992, Ульяновск, 1977); Всесоюзной научно-практической конференции по овощеводству (Минск, 1992); производственной конференции

специалистов лесного хозяйства России (Ульяновск, 1993);научно-практических конференциях НИИ овощного хозяйства (Москва, 1982 -1986).

Публикации результатов исследований. Основные положения опубликованы в 47 работах, включая 7 авторских свидетельств и патентов СССР и РФ.

Объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 345 страницах компьютерного набора, содержит 61 таблицу и 49 рисунков. Диссертация состоит из введения и 8 глав, включающих обзор литературы, результаты исследований и их обсуждение с учетом существующих в литературе данных, заключение, выводы, материалы и методы исследований и список литературы. Список цитируемой литературы содержит 420 источников^ том числе 117 на русском языке. Диссертация снабжена приложением в виде актов и официальных заключений об эффективности разработанных автором препаратов и технологических приемов их применения.

Объекты и методы исследования. В соответствии с поставленной задачей было изучено действие дельта-эндотоксинов различных штаммов Вас. thuringiensis subsp. galleriae, alesti, kurstaki, thuringiensis, sotto, den-drolimus (Cry IА класса), токсичных дня чешуекрылых, на клетки кишечника и целый организм боярышницы, капустных белянки, моли, огневки и совки, непарного шелкопряда, монашенки, обыкновенного соснового пилильщика in vitro и in vivo.

Объекты и механизмы их взаимодействия исследовались методами ИК- и .ЯМР-спектроскопии, атомной абсорбционной спектроскопии, спектрофотометрии, пламенной фотометрии, электронной сканирующей и трансмиссионной ультрамикроскопии, световой микроскопии, ультрацентрифугирования и других.

Использованы современные биохимические методики определения активности ферментов, модифицированные для изучения тканей насекомых; определения уровней концентрации неорганических ионов, глюкозы, лактата, АДР и неорганического фосфата в гемолимфе и клетках насекомых; изучения разобщающего действия дельта - эндотоксина на искусственные фосфолипидные мембраны и интактные митохондрии; выделения дельта - эндотоксина в чистом виде.

В процессе проведения исследований были широко использованы методы лабораторных и полевых испытаний.

Достоверность всех полученных результатов оценивали методами математической статистики.

2. Механизм действия дельта-эндотоксина на насекомых

2.1 Состав, строение и физико-химические свойства эндотоксина, как разобщителя окислительного фосфорилирования и дьгхания

Изучение 24 подвидов Вас. thuringiensis, обладающих активностью в отношении чешуекрылых, показало, что для них обязательны кристаллы бипирамидальной формы, которые не отмечены у подвидов, активных только для жесткокрылых и двукрылых ( Faust et al., 1982). Кристаллический белок имеет аминокислотный состав, обычный для других бактериальных белков, хотя наиболее представлены глутаминовая и ас-парагиновая кислоты, составляющие 25 % от общего количества (Честухина и соавт., 1978; 1982). Разные подвиды мало отличаются по количественному составу и соотношению аминокислот. Белок кристалла является сложным (гликопротеин) и содержит более 5 % углеводов, включая аминосахара, которые могут участвовать в связывании токсина с рецепторами клеток насекомых (Pfannenstiel et al., 1978). В результате связывания токсин проникает в мембрану, формируя в ней каналы-поры (Smith & Ellar, 1994) высокоспецифичные для молекул самого дельта-эндотоксина (Кагава, 1985). Это позволяет предположить, что первичным является его действие на внутриклеточном уровне.

Главным компонентом дельта-эндотоксина считают полипептид с молекулярной массой 130 - 140 кД, отсутствующий в составе мелких ку-боидальных кристаллов и представляющий протоксин, который становится токсичным при дальнейшем расщеплении щелочным кишечным соком до компонентов с массой около 70 и 30 кД, являющихся собственно токсинами (Chestukhina et al., 1982). N- терминальные части таких полипептидов образуют стабильные домены, гомологичные для разных се-рототипов Вас. thuringiensis и отвечающие за токсичность всей белковой молекулы. Универсальность и гомологичность строения и состава истинных эндотоксинов различного происхождения показывает, что все они относятся к семейству близкородственных белков, скорее всего обладающих и одинаковым механизмом действия на насекомых ( Chung-jatupornchai et al., 1988).

Для более детальной характеристики дельта - эндотоксина был использован метод ИК-спектроскопии, эффективный при идентификации органических веществ и определении их молекулярной структуры. Ранее предпринятое изучение этим методом спектров эндотоксинов различных подвидов бактерий (Трусков и соавт., 1976; Лысенко и соавт., 1984; Кольчевский и Ермолова, 1985), снятых при использовании таблеток с бромистым калием, не обнаружило их различий с другими белками.

Сравнение спектров дельта-эндотоксина в бромистом калии и абсолютном пиридине позволило установить, что сильная полоса поглощения в бромистом калии неионизированной карбоксильной группы СООН в области 1730 см -1 исчезает в пиридине, который, имея щелочную природу , ионизирует карбоксильную группу до СОО. При растворении кристалла эта группа освобождается и обладает лабильным («кислым») протоном, который может быть легко отдан дельта - эндотоксином. Для большинства белков пик такой интенсивности в этой области не характерен.

Это было подтверждено методом ЯМР - спектроскопии в апротон-ном биполярном растворителе ДМСО (диметилсульфоксиде) и в ДМСО с добавлением дейтериевой воды (D20). В ДМСО проявляется полный спектр сигналов от протонов эндотоксина, а при внесении D20 наиболее лабильные протоны должны заместиться на дейтерий, приведя к изменению химического сдвига и интенсивности сигнала. Сравнение спектров обнаружило, что сильный сигнал в области 12 м.д., проявляющийся в ДМСО, полностью исчезает при добавлении D20 .

Значительная величина пика указывает на наличие в полипептиде большого числа лабильных протонов, которые он способен легко отдавать после растворения в щелочном содержимом кишечника насекомого, обусловленное в первую очередь доминирующим содержанием в его составе аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Вещества, обладающие лабильными протонами, можно рассматривать как потенциальные разобщители процессов окислительного фос-форилирования (синтеза АТР) и дыхания в митохондриях. Разобщители переносят протоны через мембрану митохондрий, изменяя её электрохимический градиент и приводя таким образом к блокированию синтеза АТР (деэнергизация митохондрий).

Дельта-эндотоксин оказался способным в концентрации 100 мкг/мл переносить протоны через искусственную фософолипидную «черную» мембрану, снижая ее сопротивление в 5 раз. Это подтверждает наличие у него разобщающих свойств, а так же способность ассоциироваться с фосфолипидами, проникая через их слой или встраиваясь в него и образуя потонные каналы. Степень разобщения зависела от концентрации эндотоксина. При значениях менее 50 мкг/мл эффект не регистрировали.

10 20

3 9 IS 21 27 33 39 4S Врем, мин

Изучение действия дельта-эндотоксина на процессы дыхания и окислительного фосфорилирования в интактных митохондриях методом проникающих ионов подтвердило эти результаты. На рисунке 1 представлена схема изменения потенциала интактных митохондрий, выделенных из клеток кишечника гусениц непарного шелкопряда, под действием растворенного эндотоксина в концентрации 35 и 70 мкг/мл. Последовательное добавление эндотоксина вызывало падение потенциала. на 1,3 и 5,3 мЗ в течение 7 и 12 мин, соответственно.

Следовательно, разобщающее действие дельта-эндотоксина может являться первичным. В пользу этого говорит и наличие в клетках кишечного эпителия насекомых морфофункционалыюго объединения митохондрий с цитоплазматичсекими мембранами, благодаря которому действие токсина становится направленным и очень быстрым (в течение 1 мин.).

2.2. Цитопатическое действие на клетки кншечника и культуру тканей насекомых

При изучении цитопатического действия дельта- эндотоксина на клетки кишечника разных видов насекомых неизменно наблюдали исчезновение базальных включений, набухание апикальной микроворси-ночной области, появление везикул в эндоплазматическом ретикулуме, потерю рибосом, изменения в митохондриях (Endo and Nishiitsutsuji-Uwo, 1980 и другие), которые появляются спустя 5 - 15 мин после перорально-го введения токсина. Нарушения в кишечных клетках начинаются с апикального конца и нарастают с течением времени. Однако в доступной

Рис. 1.

Мембранный потенциал, мВ

Измерение потенциала митохондрий с помощью проникающего иона ТФФ при действии дельта-зн-дотоксина ВасМи^^еми: стрелками указано добавление к суспензии митохондрий (I) ЮмМсук-цината натрия (2); 35 и 70 мкг/мл дельта-эндотоксина (Зи4), полученного обработкой кишечным соком; 2мкг/мл антимииина(5):50 мкМ аскорбата натрия (6);5 мМ ЩГг(СН)*} (7); 8и16 мкМ * ДЦКД (8и9); 2 мМ КСХ(10).

литературе не обнаружено данных, указывающих на то, как наблюдаемые изменения развиваются во времени, и какие из них являются первичными.

Эксперименты на клеточной культуре позволили детально исследовать временную динамику цитопатических изменений, вызываемых дельта - эндотоксином, в зависимости от его концентрации. Для этого нами была использована перевиваемая линия клеток кишечника непарного шелкопряда SC Ld - 135. Изучение проводили методами световой, электронной сканирующей и трансмиссионной микроскопии, с использованием дельта - эндотоксинов subsp. galleriae и kurstaki в двух концентрациях (0,75 и 0,08 мг/мл). Методом световой микроскопии было установлено, что через одну минуту после начала инкубации клеток с раствором эндотоксина во всех сериях опытов начиналась вакуолизация, степень которой была пропорциональна его концентрации (90 % клеток при концентрации 0,75 и 50 % - 0,08 мг/мл). Через 15 мин вакуолизация достигала 100 %, при этом клетки значительно увеличивались в размерах и появлялись признаки их разрушения. Через 30 мин инкубации при использовании 0,75 мг/мл эндотоксина и через 2 ч при концентрации 0,08 мг/мл целых клеток не обнаружено.

Изучение методом сканирующей микроскопии показало, что под действием вакуолизации, вызванной эндотоксином, происходит сглаживание рельефа клетки и значительное увеличение ее размеров в зависимости от его концентрации через 1 мин (0,75 мг/мл токсина) или через 15 мин (0,08 мг/мл). Увеличение объема клетки приводит к растяжению ци-топлазматической мембраны и, как следствие, к ее повреждению (рис. 2).

Одновременно происходит вакуолизация клеточных органелл, которые также в результате этого разрушаются (рис. 3). Полученные данные демонстрируют, что вакуолизация является непосредственной причиной деструкции клеток, независимо от того, чем она изначально вызвана и каковы ее механизмы.

Электронные микрофотографии демонстрируют значительные изменения внутриклеточной структуры при внешней целостности цито-плазматической мембраны. Ядро становится менее плотным для электронов, в нем образуются вакуоли, наружная ядерная мембрана лишена рибосом, в кариоплазме мало хроматина (рис. 3 - III). Кристы митохондрий сильно вакуолизированы, при этом сами органеллы не претерпевают значительного увеличения,так как матрикс крайне сокращен (рис. 3 - IV).

Рис. 2. Культура клеток непарного щелкопряда. Сканирующая микроскопия, х 5 ООО -10 ООО

1. нормальная клетка; 2. сглаживание клеточной поверхности в результате вакуолизации;3. разрыв цитоплазматической мембраны;4. образование пустот в результате разрушения вакуолей.

Рис. 3. Ультраструктура участка клетки непарного шелкопряда (электронная трансмиссионная микроскопия , х 20.000 - 58.000): I - норма; II - то же, участок, богатый митохондриями; III и IV - после обработки дельта - эндотоксином. 1 - ядро; 2 - оболочка ядра (а - внутренняя мембрана, б - наружная); 3 - хроматин (а - конденсированный, б- диффузный); 4 - рибосомы; 5 - полисомы; 6 - митохондрии; 7 - комплекс Гольджи; 8 - вакуоли.

Такая форма митохондрий, определяемая как «конденсированная», характерна для деэнергизованного состояния и наблюдается при обработке веществами - разобщителями окислительного фосфори-лирования и дыхания (Бакеева и Ясайтис, 1972).

Следует также отметить сильную вакуолизацию цистерн эндоплаз-матического ретикулума, резкое сокращение числа рибосом на наружной поверхности мембраны эндоплазматического ретикулума и в цитоплазме (рис. 3 - III и IV), что неизбежно должно привести к снижению синтеза белка. Подобных нарушений не наблюдали в контроле (рис. 3-1 и И).

Во временной последовательности первичными являются описанные изменения митохондрий и вакуолизация мембранных структур (1-5 мин после начала инкубации).При этом все митохондрии в течение этого периода приобретали конденсированную форму, тогда как вакуолизация продолжала нарастать вплоть до момента разрушения клетки, являясь следствием деэнергизации. Остальные нарушения возникают вслед за этим спустя 5-15 мин и увеличиваются во времени, приводя к разрушению клеток. Интенсивность и скорость изменений зависела от концентрации эндотоксина и не была связана с его источником. Уменьшение количества хроматина и рибосом, свидетельствующее о снижении интенсивности синтеза нуклеиновых кислот и белка, так же связано с деэнер-гизацией клетки, которая, судя по представленным данным, первична.

2. 3. Действие дельта - эндотоксина на синтез АТР и дыхание в митохондриях

Разобщающее действие дельта-эндотоксина на митохондрии неизбежно должно оказать влияние на основные процессы, протекающие в клетках кишечника насекомых, и в первую очередь, синтез АТР, сопряженный с поглощением кислорода.

Ранее отмечали стимулирование дыхания митохондрий и поглощения клетками глюкозы через 5 мин после начала действия эндотоксина в концентрации 70 мкг/мл и подавление этих процессов при больших концентрациях на фоне снижения синтеза АТР (Travers et al., 1976). При этом не было предпринято детального анализа данного эффекта и его роли в механизме действия токсина.

Изучение особенностей влияния эндотоксина на поглощение Ог митохондриями показало, что через 1 мин инкубации стимулирование имело место как при концентрации 70, так и 150 мкг/мл (рис. 4 ).

Максимальное поглощение глюкозы через 1 мин (150 %) наблюда-

ли при 150 мкг/мл. Через 5 мин активирование от 103 до 120 % характерно для концентраций от 20 до 100 мкг/мл. Очевидно, что при концентрациях выше 150 мкг/мл усиление поглощения Ог наступает ранее 1 мин и не регистрируется. Степень усиления прямо пропорциональна концентрации токсина.

Динамика изменения интенсивности дыхания была исследована при концентрациях эндотоксина 50 и 100 мкг/мл (табл. 1). Эффект начального стимулирования в течение первых 10 мин сменяется угнетением в период более 15 мин.

Наряду с первоначальным стимулированием поглощения кислорода наблюдается существенное снижение синтеза АТР (табл. 1). Синтез АТР угнетается через 1 - 5 мин в 6 (50 мкг/мл) и 10 раз (100 мкг/мл), незначительно возрастает через 10 мин и резко снижается через 15 до 12 и 25 раз, соответственно. К концу опыта (через 30 мин) образование АТР практически прекращается.

Эффективность фосфорилирования, выражается показателем дыхательного контроля (Р/О), который снижается в 7,5 - 32 раза (100 мкг/мл) и 5,5 - 21 раз (50 мкг/мл) (табл. 1). С учетом того, что кислородо-потребление в первые 10 мин даже более интенсивно, чем в норме, подобное уменьшение Р/О в этот период свидетельствует о разобщении процессов дыхания и окислительного фосфорилирования, в результате которого митохондрии утрачивают способность синтезировать АТР, приводя к деэнергизации клетки и, следовательно, к нарушению энергопотребляющих процессов (транспорт ионов и неэлектролитов, синтез белка и другие).

01мин инкубации □5мин инкубации

концентрация дельта-эндотоксина (мкг/мл)

Рис. 4 Изменение потребления Ог интактными митохондриями под действием разных концентраций эндотоксина.

Таблица 1.

Влияние дельта-эндотоксина на интенсивность дыхания и синтез АТР митохондриями В. raori

Концентра -ция токсина, мкг/мл Показател ь Значение показателя, мкМ/мг белка/мин

1 мин 5 мин 10 мин 15 мин 30 мин Норма (в отсутствие токсина)

100 потребление Ог 2,08+ 0,24 1,66± 0,25 1,61+ 0,03 1,18± 0,14 0,82± 0,12 1,60±0,33

синтез АТР 0,3 3± 0,03 0,33+ 0,04 0,40± 0,05 0,12± 0,03 0,05± 0,02 3,00±0,07

Р/О 0,16 0,20 0,25 0,10 0,06 1,9

50 потребление Ог 1,89± 0,09 1,78+ 0,30 1,66± 0,19 1,41+ 0,15 1,12± 0,26 1,60±0,33

синтез АТР 0,47+ 0,07 0,48± 0,06 0,57± 0,04 0,25± 0,04 0,10±0, 03 3,00+0,07

Р/О 0,25 0,27 0,34 0,18 0,09 1,9

2.4. Действие дельта-эндотоксина на обмен глюкозы Снижение продукции АТР за счет окислительного фосфорилиро-вания в митохондриях, должно вызывать компенсаторный ответ со стороны другого важнейшего процесса аккумуляции энергии - гликолиза. Расщепление глюкозы в цитоплазме клеток (гликолиз), является основным источником субстратов для дыхательной цепи митохондрий и дополнительным резервом некоторого количества АТР, синтезируемого в ходе гликолитического процесса.

Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях в первые 10 мин действия токсина приводит к усилению поглощения Ог, а следовательно, и глюкозы. У насекомых, в отличие от млекопитающих, доминирует пассивный опосредованный транспорт глюкозы в клетку по градиенту концентрации (Freherne, 1958), так что исчерпание данного углевода в результате усиления дыхания вызывает интенсификацию его поглощения клеткой. Основными продуктами гликолиза в кишечных клетках насекомых, образующимися в равных коли-

чествах, являются пируват и 3-фосфоглицерат (Тыщенко, 1986). Оба они поступают в митохондрию и превращаются в ней в субстраты дыхательной цепи. Образование пирувата катализирует фермент лактатдегидро-геназа (ЛДГ), а 3 -фосфоглицерата-3-фосфоглицератдегидрогеназа, по изменению активности которых можно судить о скорости образования указанных метаболитов.

Результаты, представленные на рисунке 5, демонстрируют ускорение катаболизма глюкозы в первые 10 мин действия эндотоксина.

А, % от исходной

время, мин

Рис. 5 Изменение активности 3-фосфоглицератдегидрогеназы в ци-тозоле клеток непарного шелкопряда под действием дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл и 50 мкг/мл.

Вслед за этим происходит угнетение гликолитического процесса вплоть до полного затухания через 30 мин. Стимулирование наступает тем быстрее, чем больше концентрация токсина (46 % через 5 мин при 100 мкг/мл и 42 % через 10 мин при 50 мкг/мл), и связано с начальным усилением дыхания. Через 30 мин активность фермента снижается практически до нулевых значений.

Снижение уровня поглощения О2 клетками кишечника после 10 мин действия токсина приводит к переключению гликолиза на анаэробный режим, то есть синтез лактата. Активирование ЛДГ наблюдали в период времени от 10 до 15 мин (рис. 6).

Угнетение активности ЛДГ в начальный период времени (1-5 мин) связано с подавлением образования лактата в условиях повышенной

аэробности. Снижение активности ЛДГ через 15 мин обусловлено нарушением целостности клеточных мембран в тот период, в результате чего данный растворимый фермент выходит в гемолимфу.

А, % от исходной

180 т 160 140 + 120 100 БОбО-4020 0

10 мг на гусеницу

5 мг на гусеницу

время, мин

Рис. 6. Изменение активности ЛДГ в клетках кишечника непарного шелкопряда под действием дельта - эндотоксина.

Фермент начинает появляться в гемолимфе через 5 мин после введения токсина. Степень активирования зависит от дозы токсина и достигает 86 % (10 мг/гус.) и 62 % (5 мг/гус.) от суммарной активности в клетках и гемолимфе через 3 ч, что может служить мерилом степени деструкции клеточных мембран.

2.5. Влияние дельта-эндотоксина на мембранный транспорт ионов

Неизбежным следствием деэнергизации клеток является нарушение основных энергопотребляющих процессов, и в первую очередь активного транспорта ионов. Ранее отмечено значительное изменение концентраций ионов по сравнению с нормой в гемолимфе насекомых разных видов в результате воздействия Вас. thuringiensis и её эндотоксина (Narayanan and Jayaraji, 1974 Past and Angus, 1965 и другие), которое не наблюдается в течение первых 10 мин действия токсина (Fast and Morrison, 1972).

Основными ион-транспортными системами в клетках являются Mg2+ - зависимые АТРазы. Системы обладают высокой энергоемкостью и используют энергию АТР, гидролизируемого самой АТРазой. Ранее

было установлено, что при разобщении дыхания и окислительного фос-форилирования у позвоночных наблюдается стимулирование АТРазной активности (McMurray andBegg, 1969).

Нами установлено, что нарушению уровней концентрации ионов калия в гемолимфе через 30 мин после перорального введения эндотоксина (на 19,0 %) предшествовало значительное активирование АТРазы, начинающееся спустя 5 мин и достигающее через 15 мин 632 %. В дальнейшем степень увеличения активности фермента пропорциональна изменению концентрации К+ в гемолимфе.

Отмечено увеличение концентрации Na+ в 1.4 , Са2+ в 1.3 и Mg2+ в 1.5 через 30 мин действия токсина. Аналогичные результаты получены для монашенки при введении 0,5 мг/мл токсина. Дельта-эндотоксин не способен в отсутствие фермента гидролизовать АТР и не является источником фосфата или ионов.

Известно, что инообмен осуществляется не только между кишечными клетками и гемолимфой, но и возможно с большей интенсивностью, между этими клетками и содержимым кишечника. Начиная с 15 мин после введения токсина, значительно изменялись концентрации всех определяемых ионов в клетках кишечника непарного шелкопряда (табл. 2) и монашенки.

Максимальное увеличение в 2,3 (2 раза у монашенки) отмечали через 1 ч для ионов Na1". В это же время повышался уровень Са2+ (1,3 раза для обоих видов) и снижались К+ (примерно в 2 раза) и Mg 2+ (на 25 -30 %).

Ранее описанные результаты показывают, что в этот период происходит нарастание степени вакуолизации, связанной с нарушением транспорта ионов, и в первую очередь Na+. Повышение концентрации Na+ в клетке по сравнению с нормой приводит к увеличению скорости пассивного транспорта воды в неё, что и является непосредственной причиной вакуолизации.

Существенны различия в степени активирования Mg2*- зависимой К+, Na+ -АТРазы разных видов насекомых in vitro под действием различных концентраций дельта-эндотоксина (табл. 3).

Максимум активирования отмечен при концентрациях токсина 0,075 - 0,125 мг/мл. В наименьшей степени изменялась активность фермента у капустной совки (1,4 раза) и более значительно у обыкновенного соснового пилильщика и боярышницы (2,1 и 2,4 раза, соответственно). Полученные закономерности согласуются с результатами определения восприимчивости разных видов насекомых к дельта-эндотоксину и бактериальным препаратам (табл. 4).

Таблица 2

Влияние дельта-эндотоксина ( 1 мг/мл) на концентрацию ионов в ткани среднего кишечника гусениц непарного шелкопряда

Время после обработки Концентрация ионов (мэкв-г1 сырого веса)

К+ % Ыа+ % Са % %

исходная 27,6+1,9 - 62,8+5,2 - 14,1+1,2 - 25,7+2,6 -

5 мин 28,2+2,2 102 61,4+4,6 98 13,6+2,0 96 28,4+4,1 11 1

10 мин 26,8+2,3 97 63,2+3,8 101 14,5+1,9 103 26,3+2,5 10 2

15 мин 19,3+1,8** * 70 101,7+4,0** 162 17,6+0,9** 125 24,5+2,8 94

30 мин 17,1 + 1,2** * 62 136,3+8,4** * 217 18,3+1,3*** 130 20,0+2,1* ** 78

1 ч 15,5+1,4** * 56 145,7+.10,2-** 232 133 1Л 1 1 О 1* ** 75"

3 ч 18,8+2.2** * 68 111,8+8,7** * 178 18,0+0,7*** 128 20,6+1,7* ** 80

6ч 20,7+2,5** 75 81,0+5,1** 129 15,8+1,6** 1 12 21,1+2,6* ОЛ

12 ч 22,4+1,9** 81 63,0+7,0 100 13,5+2,4 96 23,9+3,7 93

18 ч 22,1 + 1,0** * 80 58,4+6,3 93 12,7+2,2 90 23,1+2,7 * 90

Примечание: *р < 0,05;** р <0,01;*** р < 0,001 при п = 20 (п - число пар измерений)

Согласно этим данным максимальной чувствительностью к эндотоксину обладает капустная белянка, несколько меньшей - боярышница и монашенка, средней - обыкновенный сосновый пилильщик и непарный шелкопряд, низкой - капустная совка. Личинки пилильщика невосприимчивы к бактерии.

Результаты изучения М§2+ -АТРазы в разных тканях насекомых при пероральном введении дельта -эндотоксина и содержащих его препаратов позволили установить, что стимулирование её активности наступает быстрее и в большей степени при использовании растворенного эндотоксина по сравнению с препаратом. Активирование наблюдали в более ранние сроки в клетках кишечника в отличие от целых гусениц, что под-

тверждает первичность действия эндотоксина на клетки кишечника. Величина активирующего воздействия иа АТРазу коррелировала с

Таблица 3

Влияние дельта-эндотоксина на активность -зависимой

АТРазы кишечника гусениц in vitro

Концентрация токсина (мг/мл) Активность Mg2+ -АТРазы

капустная совка Р обыкновенный сосновый пилильщик Р боярышниц а Р

Контроль 0,о9±0,08 0,88+0,12 1,36±0,04

0 005 0,9310,13 1 1ЛЛ ЛГ) 0,05 1,43±0,23

0,013 1,23±0,11 1,1010,13 1,96+0,18 0,01

0,025 1,26+0,12 0,01 1,40±0,08 0,01 2,82+0,30 0,001

0,075 1,23+0,12 0,05 1,7710,17 0,01 3,2910,19 0,001

0,125 1,28±0,17 0,05 1,8В±0,14 0,001 3,1510,25 0,001

• 0,175 1 094-0 07 ! 42+0 2! 0,05 2,71+0,И 0,001

0,225 0,78+0,12 1,21+0,19 2,3010,27 0,01

п=10 (п - число пар измерений).

Таблица 4

ЛД50 для гусениц некоторых видов насекомых при воздействии дельта-эндотоксина и энтобактерина

Вид эидотоксин ЛД50, мг/г веса энтобактерин, ЛД50, спор/гусеницу

боярышница (0,13±0,03)*10-i (1,1±0,2) *102

капустная белянка (0,05±0,05) • Ю-1 (0,8+0,4) • 102

капустная совка 19+3 О невосприимчива

обыкновенный сосновый пилилыцик (0,65±0,20)» 10-' невосприимчив

непарный шелкопряд (0,87±0,24) • 10 1 (1,7±0,4) «103

монашенка (0,25±0,08) • 101 (2,4+0,5) •! О2

Примечание: (1) - ЛД50 (мг/мл) определена для гусениц капустной совки четырехдневного возраста из лабораторной популяции.

чувствительностью вида к токсину и была максимальной для капустной белянки (рис. 7); средней - обыкновенного соснового пилильщика и низкой - капустной совки (рис. 8).

Характерной особенностью графиков является наличие пиков в первые 30 - 60 мин действия эндотоксина. Отсутствие подобного пика типично для очень чувствительных видов и означает, что начальное активирование фермента наступает ранее 30 мин. Второй пик усиления активности наблюдали через 12 - 24 ч. Он соответствует максимальному развитию патологических изменений, для которого присуща массовая гибель насекомых восприимчивых видов. После 24 ч кривые характеризуются возвратом активности АТРазы у выживших особей до исходного уровня (ремиссия).

В связи с этим динамика изменения активности Mg2+-АТРазы может служить моделью протекания заболевания, где период «острой» интоксикации (обычно первые 1 - Зч) сменяется включением защитных механизмов (3- 12ч), а затем, у видов чувствительных и при достаточной дозе токсина - максимальным (летальным) развитием болезни (12 - 24ч), за которым наступает гибель. Продолжительность стадий может варьировать в широких пределах, и они тем короче, чем выше восприимчивость вида к эндотоксину и чем больше концентрация (доза) последнего. При малых дозах и у видов устойчивых (капустная совка) стадия максимального развития болезни завершается постепенной ремиссией в результате включения защитных механизмов или прекращения влияния токсина. В этом случае наблюдают практически полное восстановление активности АТРазы, пищевой и двигательной активности.

Патологические изменения, вызванные дельта-эндотоксином Cry I А класса у различных видов насекомых, укладываются в общую схему. В первую очередь возникают изменения в митохондриях, приобретающих конденсированную форму, свидетельствующую о деэнергизации. Во всех случаях вызываемые эффекты связаны с концентрацией дельта-эндотоксина и временем его действия. Последовательность метаболических нарушений в клетках кишечника насекомых различной восприимчивости одинакова и включает снижение синтеза АТР в результате разобщающего действия эндотоксина на митохондрии, начальное стимулирование протребления О2, сменяющееся его угнетением в результате потери энергии. С последним связано усиление в ранний период интоксикации гликолиза и потребления глюкозы, заканчивающееся в условиях резкого снижения дыхания переключением гликолиза на анаэроб ный режим с образованием лактата. Все это вызывает нарастающую деэнер-гизацию клеток, которая приводит к деструкции энергозависимых

Аш-цвпость (

мг Рп мг1 белкам

0,20

0,15

0.10

0,05

II ъ

н-

Время, ч

Рис.7 Изменение активности АТРазы кишечника боярышницы при скармливании: 1. энтобактерина; 2. эндотоксина; 3. контрольного раствора.

« а

н -

о *

¡5

Ё £ < =

0,15

0,10

0,05

Время, ч

Рис.8.Изменение активности АТРазы кишечника капустной совки при скармливании: 1. энтобактерина; 2. эндотоксина; 3. контрольного раствора.

Таблица 5

Влияние дельта - эндотоксинов на ЛД50 и Г^2+-АТРазу кишечника капустной белянки

Биотип ВТ Содержание эндотоксина, ыг/г сухой массы культуры ЛДзо Относительная активность АТРазы

эндотоксина, . Ю-3 г/гусеницу культуры, . 10 4 м.ед./гусеницу

IV, 128,7+19,7 1,96+0,56 3.9+1.2 2,7+0.7

ш, 94,1 ±7,3 1,32+0,06 3,5+1,3 3,6±1,1

1П2 102,2з7,6 2.061-0.29 2,8+0,3 2,4+0,3

V 96.4 +6,5 2,08+0,68 2,8—0,4 3,1+1,4

IV! 65.512.2 1.27+0.11 5,8+0,8 * 2,0+0,1

XII 62,2+7,6 1,40+0,20 6,5+0,6 * 3,5+0,9

* -Р>0,05

Активность в отсутствие токсина принята за 1. Концентрация токсина 0.075 мг/'мл. Время инкубации 5 мин.

ион-транспортных АТРазных (вакуолизация) и биосинтезирующих систем (потеря хроматина и рибосом).

Дополнительным доказательством универсальности действия Сгу I А дельта-эндотоксинов разных биотипов служат результаты сравнительного изучения их влияния на один и тот же вид (капустную белянку)

/__г\

Не обнаружено достоверных расхождений в ЛД 50 и активировании фермента под действием растворенного токсина изученных биотипов. В то же время ЛД 50 культуры для IV! и XII в 2 раза больше, чем для остальных, что коррелирует с содержанием в них эндотоксина.

Следовательно, при едином механизме действия эндотоксина различия носят количественный характер и связаны с чувствительностью вида (табл. 3).

2.6 Факторы устойчивости насекомых к дельта-эндотоксину

Поскольку доказано, что механизм действия дельта-эндотоксина един для всех чувствительных насекомых, особый интерес представляет выяснение причин существенного различия в степени восприимчивости (сравнительной устойчивости) для разных видов.

Важным фактором чувствительности к дельта-эндотоксину является рН кишечного сока, который должен быть выше 9,0, создавая условия, необходимые для растворения кристаллов. Низким рН (6 - 8) обусловлена устойчивость пилильщиков к Вас. Липг^сгшь и интактным

кристаллам, которую удается преодолеть, используя предварительно растворенные кристаллы, при этом ЛД 50 на вторые сутки составила 0,07мг/г массы насекомого. Такая восприимчивость относится к среднему уровню. Это подтверждает значительное активирование Mg2+ -АТРазы под действием эндотоксина (табл. 3). Создание препаратов на основе гидролизованного эндотоксина позволяет расширить круг насекомых-объектов подавления, включив в него пилильщиков.

На скорость и глубину растворения эндотоксина в кишечнике влияет так же присутствие восстановителей и веществ, связывающих эндотоксин. Первые (аскорбиновая кислота) усиливают, а вторые (фосфолипиды, ташшны, фенолы) снижают эффективность токсического действия.

У видов, способных растворять дельта-эндотоксин, чувствительность к нему варьирует в широких пределах. При этом отсутствует прямая корреляция со степенью щелочности кишечного сока. Так, у устойчивой капустной совки щелочность выше, чем у высокочувствительной

..................^ .......„ .............._..... ............... /т*---... —. 1 п-гт-----

jvaiiyi/inuii иьллпйи,и увслпчш5ас1ь>1 ь uujpatiuM (uaiypmia, 1У /UJ, 1UI да.

как восприимчивость к эндотоксину при этом резко снижается.

Предварительное активирование дельта-эндотоксина, обработанного кишечным соком гусениц капустной белянки, не приводит к увеличению его эффективности в отношении капустной совки IV возраста.

В тоже время обработка эндотоксина в концентрации 1,5 мг/мл кишечным соком капустной совки значительно снижает его токсичность для гусениц капустной белянки IV возраста. ЛД50 для эндотоксина при этом составляет (0,5+0,2) Ю-2 мг/гусеницу, а после обработки кишечным соком капустной совки (5,9+1,7) 10 2 мг/гусеницу, то есть почти в 12 раз больше. Это свидетельствует о наличии в кишечном соке совки инакти-ваторов эндотоксина. Таковыми могут быть ионы металлов - комплек-сообразователей.

Сравнительный анализ ионного состава кишечного сока капустных совки и белянки, собранных на одних и тех же растениях, показал, что у гусениц капустной совки V возраста содержание Са2+ в 5 раз выше, а Mn2+, Zn2+ и Mg2+ ниже в 2,5 , 2,3 и 7,5 раза, соответственно, по сравнению с белянкой того же возраста. В кишечнике гусениц совки полностью отсутствовали ионы Ni2+, тогда как у белянки их уровень достаточно высок (0,68 мг/мл). Ранее отмечали способность ионов Mg2+ (Штерншис и Каменек, 1986) и Zn2+ (Salama et al., 1988) усиливать действие токсина, а Са2+- блокировать его (Crawford and Hawen, 1988). В связи с этим изменение концентрации ионов, особенно Са2+ и Mg2+, может являться важным фактором устойчивости к патогену.

Таблица 6

Содержание ионов -комплексообразователей в кишечном соке гусениц

Вид Возраст Содержание ионов, мкг/мл

Ca Mgi+ Ni2+ Си Z. Fe Mn

капуст- 1П 9,85 99,64 0 - - - -

ная сов- IV 160,72 58,68 0 - - - -

ка V 154,90 16,16 0 0,51 2,26 5,48 1,03

капустная V 32,08 120,05 0,68 0,57 5,22 4,33 2,62

белянка

Следует отметить резкое нарастание Са2+ (в 5 раз ) и уменьшение Mg2+ (в 6 раз) в кишечном соке при переходе от III к V возрасту (табл. 6). Установлено, что гусеницы капустной совки весьма чувствительны к дельта-эндотоксину только в первые 4 дня после выхода из яиц. JlKso при этом составляет 19 мг/мл (табл. 3). В дальнейшем нарастает устойчивость, и гусеницы старше III возраста практически невосприимчивы к токсину. Анализ действия эндотоксина на АТРазу кишечника показал, что достоверное активирование фермента в 1,5 раза наблюдали только для гусениц до II возраста и при высоких концентрациях токсина 0,075 -0,125 мг/мл. В более старших возрастах достоверных изменений активности не отмечали. Поскольку результаты получены in vitro, они исключают инактивирующее влияние кишечного сока на дельта-эндотоксин. Следовательно, устойчивость гусениц старших возрастов может быть так же обусловлена и уменьшением числа рецепторных центров связывания эндотоксина на поверхности клеток кишечного эпителия, что снижает возможность проникновения в клетку и токсического действия. В связи с этим количество рецепторов кишечных клеток, комплементарных к узнающей рецепторы последовательности каждого вида токсина, может служить фактором, определяющим степень восприимчивости насекомого.

Защитные свойства гемолимфы, видимо, играют незначительную роль в проявлении резистентности к токсину, но могут оказаться довольно существенными при ее возникновении в результате повторного введения сублетальных доз.

З.Разработка энтомоцидных препаратов на основе дельта-эндотоксина и технологии их применения

Результаты изучения механизма действия Cry I А дельта-эндотоксина на чувствительные к нему виды насекомых явились теоретической основой для разработки нового поколения бактериальных препаратов, совершенствования существующих и повышения эффективности их применения.

Использование очищенного и активированного дельта-эндотоксина в качестве действующего начала новых препаратов позволяет усилить их биологическую эффективность при значительно меньших нормах расхода по сравнению с существующими, расширить их инсектицидный спектр действия, улучшить технологические свойства при применении, включая возможность аэрозольного распыления. Еще более важным является существенное повышение экологической безопасности методов регуляции численности вредителей с использованием таких препаратов, благодаря отсутствию спор и балластных веществ, малому расходу и дозированию действующего начала.

3.1. Разработка и изучение нового поколения биопрепаратов

на основе дельта-эндотоксина.

Разработана и запатентована серия препаратов-аналогов на основе очищенного и активированного дельта-эндотоксина Cry IA типа разных подвидов Вас. thuringiensis, отличающихся друг от друга различными комбинациями активаторов, прилипателей, смачивателей - стабилизаторов и наполнителей, и представляющих собой смачивающиеся порошки (с.п.). Ниже приводятся данные испытаний одного из серии препаратов с условным названием - Дельта с.п..

Новый препарат превосходит существующие лепидоцид с.п. (смачивающийся порошок) и с.к. (сухой концентрат) по адгезивной способности, стабильности рабочей суспензии и смачиваемости (табл. 7.)

Препарат обладает избирательным действием в соответствие с чувствительностью вида к эндотоксину. ЛД 50 составляет 2,0 - 2,1 мкг/г веса для капустной белянки и моли и репной белянки, 3,2 - капусной огневки и 9,6 - капусной совки 1П возраста.

Скорость воздействия препарата в условиях полевого опыта иллюстрируют данные таблицы 10.

Таблица. 7

Физические свойства и биологическая активность Дельта с.п. в сравнении с существующими препаратами

Препарат Параметры

смачиваемость ,с адгезивная способность, % стабильности рабочей суспензии,% ЛК50 *,%

Дельта с.п. 60 66,0 89,3 52-10-5

лепидоцид с.п. 53 58,7 72,0 5 10-з

лепидоцид с.к. 530 44,0 61,2 16-Ю-з

*- ЛК 50 для гусениц капусной белянки IV возраста

Таблица 8

Гибель насекомых под действием Дельта с.п.

Норма расхода, г/га Вид насекомого Гибель по суткам, %

I 2 3

100 капустная белянка 67 100 -

200 то же 81 100 -

100 капустная совка 19 52 67

200 то же 38 71 86

Скорость воздействия на репную белянку и капустную моль сравнима с таковой для капустной белянки. Препарат показывает полный (100 %) защитный эффект в отношении изученных видов на 2- 3 сутки после обработки, за исключением капустной совки, для которой высокая гибель (до 86 %) достигается через 7 суток.

Инсектицидное действие препарата сохраняется при постепенном ослаблении в течение 10 дней после обработки капусты в оптимальных условиях среды (температура 18-28 °С, влажность 70 - 90 %, отсутствие

дождей) (табл. 9).

Таблица 9

Зависимость периода защитного действия Дельта с.п. от температуры воздуха

Температура воздуха Гибель по суткам, %

1 2 5 10

18-28 95 75 45 16

28- 36 70 72 18 3

Ниже 15 8 2 0 0

Расход препарата из расчета 150 г/га. .

Опыт выполняли в фитотроне при постоянной влажности около 80 %. Здоровых гусениц капустной белянки III возраста высаживали на растения через 1, 3, 5 и 10 суток, экспонировали в течение суток, учеты гибели проводили на 3 сутки, что позволило избежать эффекта нарастания дозы, характерного для полевого опыта, и выявить реальную продолжительность защитного действия препарата. При температурах выше 28° С и ниже 15° С более резкое снижение защитных свойств препарата обусловлено инактивацией действующего начала при повышенной температуре и снижением пищевой активности насекомых. Сравнение действия препарата Дельта с.п. с лепидоцидом с.к. проведено в условиях полевого опыта в течение нескольких сезонов. С очень высокой эффективностью, превышающей таковую для ровикурта в 1,5-2 раза, Дельта с.п. регулировал численность капустной белянки при всех нормах расхода. Эффективность лепидоцида была либо на уровне ровикурта (при расходе 2 кг/га), либо уступала ему (1 кг/га) (рис. 9). В отношении гусениц капустной совки зарегистрирован меньший эффект, как для Дельта с.п., так и для лепидоцида,сравнимый с действием ровикурта при нормах расхода 0,3 и 3 кг/га, соответственно (рис. 9).

Результаты таблицы 10 показывают, что при интервале между обработками 7 дней дельта с.п. и лепидоцид обеспечивали низкую повреж-денность растений (товарный вид) при прибавке урожая до 11 и 17 %, соответственно.

Важным преимуществом препарата Дельта с.п. является то, что он может быть использован методом аэрозольного распыления, снижающим его расход до 10 - 20 г/га. При применении Дельта с.п. для защиты леса в Ульяновской области от повреждений гусеницами непарного

йзс.З, численности каптетнн:: бэдж-кз /I/ з соеке /2/

после обработок препаратам Дельта /а,-' к лзнлдоцлд с.к./б/ в 70 -лови5К полевого опыта:

-о—контроль без обработки;—розпкург; А » Дельта 0,1 л легш-доллд I з:г/га; —«—Дельта 0,2 : ледпдоддд 2 кг/га; -о— Дельта С,3 л лепддоцзд 3 кг/га; - >;о:;экс обработки. Ддя капусгаэх: совки -количество особе:'" на 23 учетных рас-гениях.

Таблица 10

Поврежденность и урожайность капусты при сравнительной оценке препаратов

Препарат Норма Поврежден- Урожай-

расхода, ность ность

кг/га

% расте- степень, ц/га прибавка,

ний балл %

необрабо- - 30 2-3 786 -

танный

контроль

лепидоцид 1 20 1 -2 762 -

лепидоцид 2 15 1-2 861 10

лепидоцид 3 10 1 917 17

Дельта 0,1 14 1-2 785 -

Дельта 0,2 10 1 792 1

Дельта 0,3 5 1 868 11

ровикурт 0,1 % 5 1 855 9

шел-

копряда в сезон вспышки численности 1992 г. методом аэрозольного распыления достигнута биологическая эффективность 81-94 % при расходе 10 г/га. Это сравнимо с ; действием ; химического препарата Карате (90 - 95 %), примененного методом авиационного опрыскивания. Согласно оценке станции защиты леса,использование Дельта с.п. в защитных мероприятиях позволяет снизить затраты на их проведение в 50 - 100 раз. Официальные испытания в Комитете по биологическим средствам при Госхимкомиссии Министерства сельского хозяйства РФ подтвердили высокую биологическую эффективность Дельта с.п. против комплекса вредителей капусты.

Препарат не является фитотоксичным и не портит товарного вида и запаха продукции. Маловероятна возможность возникновения устойчивости к нему при соблюдении регламентов применения. Он не содержит спор и не обсеменяет окружающую среду. Простоту применения препарата обеспечивают высокая растворимость, малый расход и строгая дозированность действующего начала. Безвредность действующего начала для теплокровных, рыб и полезной энтомофауны, отсутствие спор и токсических веществ делает защитные мероприятия с его применением экологически безопасными.

3.2. Особенности применения бактериальных препаратов для борьбы с капустной совкой

Обеспечение гарантированного защитного эффекта эндотоксинсо-держащих препаратов против капустной совки требует учитывать не только характер устойчивости вредителя к патогену, но и особенности его биологии, включающие длительность периода откладки яиц и их от-рождения, при котором в популяции постоянно присутствуют гусеницы старших возрастов. Преодолению устойчивости совки способствует повышение норм расхода препаратов, создающее избыток действующего начала, необходимый для связывания инактивирующих вещества в кишечнике, а так же увеличение кратности обработок и сокращение интервалов между ними, обеспечивающие воздействие именно на гусениц младших возрастов и учитывающее естественную инактивацию инсектицида. В полевых испытаниях не наблюдали устойчивого подавления численности при любых нормах расхода препарата и интервалах между обработками 10 дней. Снижение численности в первые 5 дней после каждой обработки до 49 - 60 % не влияло на поврежденность и урожайность капусты по сравнению с необработанным контролем. В то же время устойчивый защитный эффект наблюдали при нормах расхода 0,2 - 0,3 Дельта с.п. и 2 - 3 кг/га лепидоцида и интервале не менее 7 дней (рис. 9), а так же 0,1 и 1 кг/га и 5 дней, соответственно. Это обеспечивало сохранение товарного вида растений и увеличение урожайности (табл. 10). Технология была испытана в ряде овощных хозяйств и позволила увеличить рентабельность защитных мероприятий в 13 и более раз. Предложена оптимальная технология гарантированной защиты капусты против комплекса листогрызущих чешуекрылых, включая капустную совку.

3.3. Пути повышения эффективности препаратов на основе дельта-эндотоксина

Эффективным приемом усиления действия зндотоксинсодержащих препаратов является введение активирующих адъювантов. В лабораторных условиях была испытана серия добавок, увеличивающих инсетицид-ность препаратов. Для полевых испытаний были выбраны аскорбиновая кислота и ЭДТА, продемонстрировавшие максимальный усиливающий эффект.

Адъюванты добавляли в количестве 10 % от веса препарата. Их активирующее действие обусловлено способностью связывать ионы-комплексо'образователи в кишечнике гусениц (ЭДТА), усиливать разобщающее действие дельта-эндотоксина (аскорбиновая кислота, М^СЬ, СиБС^) или увеличивать проницаемость мембран (дезоксихолат).

При интервалах между обработками 7 дней и кратности 3 достигнута высокая инсектицидность при применении низких норм расхода препаратов (табл. 11), превышающая таковую для химической защиты, проводимой в обычном режиме защитных мероприятий хозяйства.

Таблица 11

Эффективность применения активированных бактериальных форм против капустной совки в условиях полевого испытания

Препарат Норма ра- хода, кг/га Снижение численности, % Поврежденность ■ растений Урожайность

I обработка III обра ботка % балл т/га % при бавки

контроль без обработки - 24,6 54,2 20 1,5 60,6 -

Дельта 0,1 35,4 90,7 10 1,0 96,5 62,2

Дельта +ЭДТА 0,1 50,7 97,8 5 1,0 102,1 68,5

Дельта +аскорбино-вая кислота 0,1 74,9 98,7 7 1,0 101,1 66,8

лепидоцид 1 22,2 84,0 15 1,2 64,9 7,1

лепидоцид+ ЭДТА 1 39,9 99,0 6 1,0 86,7 43,1

лепидод+аск-ор биновая кислота 1 60,5 98,1 6 1,0 95,7 57,9

актеллик 0,1 % 42,4 96,2 10 1,1 81,4 34,3

Предлагаемые приемы открывают возможности дальнейшего усовершенствования эндотоксинсодержащих препаратов и могут быть использованы как в промышленном производстве препаратов, так и при их применении в полевых условиях путем введения соответствующих добавок в готовую препаративную форму.

выводы

1. Установлен ранее неизученный механизм действия белкового бактериального токсина Вас. thuringiensis, отличный от известного для холерного токсина и включающий проникновение в клетку-мишень кишечного эпителия чувствительных насекомых с последеющим воздействием на митохондрии.

2. Первичным эффектом дельта-эндотоксина является разобщение окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях клеток-мишеней кишечного эпителия, приводящее к блокированию синтеза АТР в течение первой минуты воздействия. Стимулирование поглощения Ог в начале интоксикации связано с высокой потребностью дыхательной цепи в воссановлении потенциала при разобщении. Первичность разобщающего действия дельта-эндотоксина на митохондрии подтверждена методами электронной микроскопии.Направленное воздействие является следствием быстрого проникновения эндотоксина через ци-топлазматическую мембрану и обеспечивается благодаря наличию мор-фофункционального объединения последней с митохондриями.

3. Методами воздействия на искусственные фосфолипидные мембраны и интактные митохондрии, ИК- и ЯМР- спектроскопии уточнено строение дельта-эндотоксина и его свойства как разобщителя протоно-форного типа, обладающего большим количеством лабильных протонов.

4. Угнетение синтеза АТР в митохондриях и усиление поглощения Ог в первые 10 мин приводит к интенсификации процесса гликолиза в цитоплазме по аэробному механизму, частично компенсирующего потерю клеткой энергии за счет усиления потребления глюкозы , с последующим его ингибированием до полного прекращения в результате угнетения дыхания.

5. Снижение потребления кислорода интенсифицирует анаэробный гликолиз с образованием лактата в цитоплазме кишечных клеток. Изменение активности ЛДГ в гемолимфе может служить простым тестом определения чувствительности насекомых к эндотоксину, поскольку, чем она выше, тем быстрее и в большем количестве обнаруживается фермент.

6. Деэнергизация клеток приводит к нарушению активного транспорта ионов К+, Na+, Са2+ и Mg2h через цитоплазматическую мембрану клеток кишечного эпителия, которому предшествует активирование АТРазной транспортной системы. Следствием нарушения ионного транспорта является нарастающая во времени вакуолизация, возникаю-

щая в результате нерегулируемого притока воды и приводящая к разрушению (лизису) клеток.

7. Выявлена связь между характером активирования Mg2+-ATPaзы и чувствительностью вида к дельта-эндотоксину, а также особенностями протекания вызванного им патологического процесса. Пики активирования фермента соответствуют максимальному развитию болезни (5 - 60 мин и 12 - 30 ч). Второй пик не наблюдается у высокочувствительных видов и при большой дозе токсина. Снижение активности соответствует включению защитных механизмов.

8. Механизм действия дельта-эндотоксина одинаков в пределах патотипа А для всех чувствительных к нему видов. Различия носят количественный характер и связаны с особенностями организма насекомых, а все проявления токсического действия пропорциональны его концентрации (дозе) и времени воздействия.

9. Важнейшими причинами устойчивости насекомых к дельта-эндотоксину являются неспособность растворять его из-за отсутствия в кишечнике условий (низкий рН у обыкновенного соснового пилильщика), секреция в его полость инактивирующих факторов (капустная совка) и, вероятно, отсутствие или малое количество рецепторных центров на поверхности клеток кишечного эпителия, обеспечивающих проникновение токсина.

10. Выявленные закономерности явились теоретической основой для разработки высокоэффективных препаративных форм на основе дельта-эндотоксина (серия Дельта) и способов их применения, обеспечивающих гарантированную защиту растений от вредителей и обладающих высокой степенью экологической безопасности. Препараты защищены патентами РФ, не имеют в настоящее время аналогов и представляют новое поколение биологических инсектицидов.

11. Предложены пути совершенствования эндотоксинсодержащих препаратов. Введение активирующих адъювантов (ЭДТА и аскорбиновой кислоты), усиливающих разобщающее действие дельта-эндотоксина, повышает инсектицидность Дельта против капустной совки в условиях полевого испытания при норме расхода 0,1 кг/га на 15 и 39,5 %, после первой обработки. Эффективность третьей обработки при этом достигает 98 - 99 %, обеспечивая полный защитный эффект.

12. Разработана технология применения эндотоксинсодержащих препаратов против комплекса листогрызущих вредителей капусты, включая капустную совку, позволяющая исключить использование химических инсектицидов. С учетом биологических и фенологических особенностей вредителей рекомендуется проведение 3 обработок с интерва-

лом 7 дней при норме расхода Дельта 0,2 или лепидоцида 2 кг/га, причем первая должна быть выполнена в период массовой яйцекладки и отрож-дения гусениц капустной совки. В сезоны вспышки численности капустной белянки целесообразна четвертая обработка при норме расхода Дельта 0,1 или лепидоцида 1 кг/га. Использование предлагаемой технологии в ряде овощеводческих хозяйств позволило увеличить рентабельность защитных мероприятий в 5 -13 раз.

Рекомендации к производству

1. Новая препаративная форма Дельта с.п. и ее аналоги могут выпускаться на базе существующих производственных мощностей для производства бактериальных инсектицидов, согласно разработанной технологии и техническим условиям. Внедрение не требует существенных материальных и технических затрат.

2. Предлагается оптимальная технология5она предполагает проведение 3 обработок с интервалом 7 дней и нормой расхода Дельта 0,2 или лепидоцида 2 кг/га. Первую обработку необходимо выполнять в период массовой яйцекладки и отрождения гусениц капустной совки. В сезоны вспышки целесообразна четвертая обработка при норме расхода Дельта 0,1 или лепидоцида 1 кг/га. В отдельные годы может появиться необходимость применения препаратов в таких же нормах расхода в начале июля против гусениц капустной моли. Предлагаемая технология позволяет исключить применение химических инсектицидов, кроме защиты всходов от повреждения крестоцветными блошками при безрассадном способе производства капусты, и получить практически экологически безопасную продукцию.

3. Препарат Дельта с.п. перспективен для применения против чешуекрылых в стадии гусеницы (белянок, огневок, совок, шелкопрядов, листоверток, молей) и перепончатокрылых в стадии личинки (пилильщиков) - вредителей овощных, технических и садовых культур, а так же леса.

Препарат совместим с большинством химических и биологических пестицидов и может применяться в сочетании с выпуском насекомых -энтомофагов, благодаря чему может быть использован в общей системе защитных мероприятий, принятых в хозяйстве.

Дельта с.п. не обладает фитотоксичностью, не влияет на вкус и запах обрабатываемых растений, не портит их товарного вида. Маловероятно возникновение резистентности насекомых к препарату. Количество действующего начала точно устанавливается с помощью любого из

известных методов определения содержания белка.

Благодаря хорошей смачиваемости легко растворяется в воде при приготовлении рабочей суспензии, хорошо распрыскивается с помощью любого из существующих опрыскивателей, удобен при аэрозольном распылении. Рабочий раствор имеет высокую стабильность.

Ввиду нетоксичности и малого расхода препарата не следует определять его остаточные количества на растениях и в окружающей среде. В связи с этим не устанавливаются и сроки ожидания для уборки, прополок и других полевых мероприятий.

Таблица 12

Рекомендуемая технология применения препарата Дельта

культура Вредный норма рас- норма рас- способ, время кратность

объект хода препа- хода рабо- обработки, ог- обработок

(назначение - рата, г/га чей жидко- раничения, ре- ,сроки

инсектицид) сти, л/га комендуемые ожидания

марки машин

капуста Капустная 100-200 400 опрыскивание 1-2/0 через

белянка, ка- 0,01-0,02% сус- 7-10 дн.

пустная моль, пензией против

капустная ог- гусениц 1-2

невка, репная возраста каж-

белянка дого поколения

Капуста Капустная 150-200 400 опрыскивание 2-3/0 через

совка 0,015-0,02% 6-7 дн.

суспензией в

период массо-

вого отрожде-

ния гусениц /не

менее 2 раз с

интервалом 6-7

дней/.

Рекомендуемые

опрыскиватели:

ПОМ-бЗО или

ОРР-1 для ма-

лых площадей.

Гарантированный срок хранения 18 мес. в сухом месте при температурах от -20 до + 20° С. В таблице 13 приводится технология примене-

ния препарата.

4. Эффективность предлагаемых и существующих препаратов может быть повышена путем введения малых количеств (5-10 % массы препарата) безвредных активирующих добавок (например, аскорбиновой кислоты или ЭДТА) как в процессе промышленного получения, так и в условиях хозяйства перед приготовлением рабочих растворов.

Основные публикации по теме диссертации

1. Каменек JI.K. Изменение активности мнггохондриальной Mg2+-зависимой АТФазы Pieris brassicae L. при заражении их Bacillus thuringien-sis in vivo // Биологические методы борьбы с вредными организмами. -Новосибирск, 1980. -С. 22-25.

2. Каменек JI.K. Механизм действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis как инсектицидного компонента бактериальных препаратов //14 Тихоокеанский научн. Конгресс: Тез. Докл. - М., 1979. - Комитет К. -С. 75.

3. Каменек JI.K. Влияние эндотоксина Bacillus thuringiensis на Mg2+-зависимую АТФазную систему насекомых. //Фауна и экология членистоногих Сибири. - Новосибирск: 1981. - С.52 -55.

4. Каменек JT.K. Влияние эндотоксина Bacillus thuringiensis на Mg2+-зависимую АТФазу некоторых видов насекомых.// Микроорганизмы в защите растений. - Новосибирск, 1981. - С.72 - 77.

5. Каменек Л.К., Харина Н.И. Цитологическое действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на культуру клеток // Использование микроорганизмов в сельском хозяйстве и промышленности. Новосибирск, 1982. - С. 28 -30.

6. Каменек JI.K. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на обыкновенного соснового пилильщика.//Сб.: Микробиологическая защита растений в Сибири. - Новосибирск, 1982. - с. 28 - 30.

7. Каменек Л.К. Свойства и механизм действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis // Интегрированная защита растений от вредных организмов. - Новосибирск, 1983. - С. 133- 144.

8. Штерншис М.В., Каменек Л.К., Спиченко Л.Н. Применение эн-томогенных бактериальных препаратов с активирующими добавками -микроэлементами // Методические рекомендации. - Новосибирск, 1983. -15 с.

9. Каменек Л.К., Новикова Л.К. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis и бактериальных препаратов на его основе на капустную совку (Mamestra brassicae L.) //Сиб. вестник с.-х. науки. - 1984. - № 4. -С. 52 - 54.

10. Каменек Л.К., Штерншис M.B. Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на активный транспорт ионов у насекомых.//Изв. СО АН СССР, сер. биол. - 1984. - в.З. - С. 113 -117.

11. Каменек Л.К., Штерншис М.В. Разобщающее действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensisV/HnTerpiipoBainiaH защита растений от болезней и вредителей в Сибири. - Новосибирск, 1985. - С. 139 - 148.

12. Штерншис М.В., Каменек Л.К. Усиление действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis.// Интегрированная защита с.-х. Культур от болезней и вредителей в Сибири. - Новосибирск, 1986. - С. 80 -85.

13. Каменек Л.К., Ильяшевич Н.К. Сравнительная оценка некоторых серотипов Bacillus thuringiensis// Интегрированная защита растений от вредителей. - Новосибирск, 1987. - С. 98 - 103.

14. Каменек Л.К. Структура, свойства и механизм действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis II Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений. - Новосибирск, 1987. - С. 42 - 57.

15. Штерншис М.В., Спиченко Л.Н., Каменек Л.К., Крупко Л.А. Применение баковых смесей микробиологических инсектицидов на капусте в Западной Сибири //Метод, рекоменд. - Новосибирск, 1987. - 23 с.

16. Каменек Л.К., Фомичева С.В. Изучение путей преодоления устойчивости капустной совки к бактериальным инсектицидам II Биоценозы Алтайского края и влияние на них антропогенных воздействий: Тез. Докл. - Барнаул, 1990. - С. 32 -35.

17. Каменек Л.К. Особенности борьбы с капустной совкой с помощью бактериальных препаратов // Пути интенсификации овощеводства.-Минск, 1991.-С. 48 - 50.

18. Каменек Л.К. О причине устойчивости капустной совки к препаратам на основе Bacillus thuringiensis // Агротехника и селекция овощных культур. - М., 1992. - С. 115 -119.

19. Каменек Л.К. Особенности борьбы с капустной совкой с помощью лепидоцида II Агротехника и селекция овощных культур. - М., 1992. -С. 119-128.

20. Каменек Л.К. Новый высокоэффективный и экологически безвредный препарат Дельта //Проблемы экологии Ульяновской области: Тез. Докл. - Ульяновск. 1997 . - С . 66 - 67.

21. Штерншис М.В., Каменек Л.К. Инсектицидный бактериальный препарат//Авт. свид. СССР. - 1983. - № 1050150.

22. Штерншис М.В., Каменек Л.К., Спиченко Л.Н., Комарских ' Р.П., Пахтуев А.И., Мурза В.И. Способ получения бактериальных энто-мопатогенных препаратов //Авт. свид. СССР. - 1983. - № 1064626.

23.Каменек JI.K. Способ получения эндотоксинсодержащих энто-мопатогенных препаратов.//Патент РФ № 2027369. - 1995.

24. Каменек Л.К. Способ получения бактериального энтомопато-генного препарата.//Патент РФ № 2062577. - 1996.

25. Каменек Л.К. Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на интенсивность дыхания и синтез АТР в митохондриях //В кн. Морфогенез и адаптация. - Ульяновск. 1998. - С. 41 -46,

26. Каменёк Л.К. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на обмен гшокозы в токсин-чувствительных клетках //В кн. Морфогенез и адаптация. - Ульяновск. 1998. - С. 47 - 52.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Каменек, Людмила Кирилловна, Москва

Л - рз . # г /А

:у,у .л ученую стспе. u ДС LClO

/ / ,

/ л ! 1

Ульяновский государственный университет

На правах рукописи УДК 595. 70: 576. 8. 097. 29.

К а м е н е к

Людмила Кирилловна

Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений

(специальность 06.01.11 -защита растений от вредителей и болезней)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор М.В. Штерншис

москва - 1998 JC

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение.............................................................................................. 4.

1. Bacillus thuringiensûs и ее токсины....................................................................................................12.

1.1. Из истории вопроса..........................................................................................................................................12.

1.2. Эпизоотические свойства бактерии........................................................................................16.

1.3. Споры Bacillus thuringiensi s................................................................................................................18.

1.4. Инсектицидные токсины Bacillus thuringiensi s......................................................21.

2. Белковый кристаллический дельта-эндотоксин........................................................31.

2.1. Происхождение белкового кристалла..................................................................................31.

2.2. Форма и размеры кристаллов............................................................................................................40.

2.3. Химический состав и свойства..........................................................................................................45.

2.4. Внутримолекулярная организация кристаллического белка..........50.

2.5. Проникновение дельта-эндотоксина через клеточную мембрану............56.

3. Механизм действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensi s на насекомых........................................................................................................................................................................................68.

3.1. Патологические изменения в организме насекомых, вызванные Bacillus thuringiensi s и ее дельта-эндотоксином..............................................................................................................................................................................68

3.2. Действие дельта-эндотоксина на клеточные культуры тканей насекомых..............................................................................................................................77.

3.3. Разобщающие свойства дельта-эндотоксина............................................................101.

3.4. Действие дельта-эндотоксина на Н+-АТРазную систему и дыхание в митохондриях........................................................................................................................................116.

3.5. Влияние дельта-эндотоксина на обмен глюкозы..............................................126.

3.6 Действие дельта -эндотоксина на клеточный транспорт

ионов..........................................................................................................139.

4. Универсальность механизма действия дельта-эндотоксина на насекомых..................................................................................................................................................................................175.

5.Факторы устойчивости насекомых к действию дельта-эндотоксина..................................................................................................................................................................................188.

6. Особенности применения бактериальных препаратов для борьбы с капустной совкой........................................................................................................................201.

7.Разработка энтомоцидных препаратов на основе дельта-эндотоксина и технологии их применения.....................................................214.

7.1. Физические свойства препарата....................................................................................................216.

7.2. Биологическая активность препарата..................................................................................218.

7.3. Пути повышения эффективности препаратов на основе дельта-эндотоксина..............................................................................................................................................230.

7.4. Производственные испытания препарата Дельта против листогрызущих гусениц на капусте....................................................................................................240.

7.5. Сведения по биологическим и технологическим свойствам препарата Дельта..............................................................................................................................247.

7.6. Испытание препарата Дельта против вредителей леса

методом аэрозольного распыления........................................................................................253.

8. Материалы и методики исследований........................................................................................255.

8.1. Культивирование и идентификация микроорганизмов..........................255.

8.2. Получение препаратов дельта-эндотоксина..............................................................256.

8.3. Лабораторные насекомые и получение препаратов их тканей.....................................................................................................................................................................................258.

8.4. Спектральное изучение дельта-эндотоксина.....................................................262.

8.5. Методы электронной и световой микроскопии......................................................263.

8.6. Прямое изучение разобщающих свойств дельта-эндотоксина..................................................................................................................................................................................265.

8.7. Биохимические методы исследований..................................................................................266.

8.8. Лабораторная и полевая оценка действия препаратов,

содержащих дельта-эндотоксин..................................................................................................................271.

Заключение......................................................................................................................................................................................276.

Выводы.................................................................................................298.

Список цитируемой литературы.................................................................302.

Приложения................................................................................................................................................................................346.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы: Защита растений от повреждений является

одним из важнейших резервов повышения урожайности сельскохозяй-культур

ственных^а также сохранения лесного и паркового фонда. В условиях агроценоза необходимость применения защитных мероприятий практически безальтернативна.

В настоящее время ведущим в этой области является химический метод борьбы с насекомыми-вредителями, который наряду с неоспоримыми преимуществами,такими как высокая эффективность и быстрота достигаемого результата, имеет и существенные недостатки. Среди них основными можно считать токсичность химических инсектицидов для полезной энтомофауны и теплокровных животных при низкой избирательности в отношении фитофагов, их сравнительно медленную детоксикацию в окружающей среде, приводящую к неизбежному ее загрязнению, и все чаще встречающееся развитие резистентности у насекомых - вредителей, следствием которой становится необходимость увеличения норм расхода пестицидов и кратности обработок. Поэтому в настоящее время усилия специалистов в области защиты растений направлены на разработку таких систем защитных мероприятий, при которых применение химических средств было бы сведено до абсолютно необходимого минимума. Это тем более актуально, что до сих пор не удалось создать высокоизбирательных и нетоксичных химикатов.

Известно, что основным действующим началом Bacillus thuringiensis, в целом ответственным за комплекс патологических проявлений, является дельта - эндотоксин, продуцируемый ею. Остальные токсины и споры, лишь усиливают вызванную им патологию. Существующие ныне препараты на основе целой бактерии в своем составе содержат много балластных веществ (вегетативные клетки, элементы культурной среды). При их массовом применении создается предпосылка к чрезмерному обеднению среды спорами. Создание и применение средств на основе чистого дельта-эндотоксина позволило бы обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность защитных мероприятий.

В мировой литературе накоплен обширный материал, описывающий строение, состав, физико-химические свойства кристаллов, включая их судьбу в кишечнике восприимчивого насекомого под действием pH и кишечных ферментов. Установлено, что синтез дельта-эндотоксина в процессе споруляции генетически запрограммирован (Дебабов и соавт., 1987; Feitelson et al., 1992), и что строение и химические свойства токсинов разного происхождения имеют значительное сходство (Честухина и соавт. 1986; 1987; Ellar, 1996).Дельта-эндотоксины класса Cry I А, токсичные для чешуекрылых, способны связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры ( Hodgman & Ellar, 1990; Smith & Ellar, 1994). Все это позволило предположить единство механизма действия дельта - эндотоксина данного патотипа на всех восприимчивых насекомых.

вопросу (Heimpel, 1977; Faust, 1984; Aronson et al., 1986; Gill et al, 1992; и другие), касались в основном изучения влияния дельта-эндотоксина на транспорт веществ, в первую очередь неорганических ионов, через цитоплазматические мембраны, которое не является первичным (Himeno et al., 1985). Предпринятые попытки до настоящего времени не привели к созданию единой теории механизма действия дельта - эндотоксина на насекомых, позволяющей связать в единое целое накопленные факты.

Для решения этой проблемы было проведено детальное изучение механизма действия дельта - эндотоксина, позволившее сформулировать единую концепцию, основные положения которой удовлетворительно согласуются с результатами, полученными ранее. Сформулированные положения, касающиеся как самого механизма, так и подходов к его изучению можно рассматривать как новое перспективное направление в бактериологии и токсикологии, служащее целям защиты растений.

Цель и задачи исследования: Целью настоящего исследования являлось выяснение механизма действия дельта - эндотоксина на организм насекомых на разных уровнях биологической организации (биохимическом, клеточном, организменном, видовом) и использование полученных результатов для поиска путей усиления вызванной эндотоксином патологии, улучшения существующих ныне препаратов на основе Вас. thuringiensis и создания принципиально новых эндотоксин^содержащих препаративных форм.

В связи с этим были поставлены следующие задачи .

- Изучить цитопатическое действие дельта - эндотоксина на клетки культуры и кишечника насекомых (непарного шелкопряда и монашенки).

- Уточнить особенности строения и свойства эндотоксина как разобщителя окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях клеток кишечника насекомых (капустных белянки и совки, боярышницы, непарного шелкопряда и монашенки).

- Выявить влияние разобщающего действия дельта - эндотоксина на основ-

ные процессы в клетках кишечника насекомых отряда чешуекрылых (клеточное дыхание, поглощение глюкозы, гликолиз, интенсивность синтеза АТР, систему активного транспорта неорганических ионов - калия, натрия, магния, кальция).

-Установить биохимические факторы возникновения устойчивости насекомых к дельта - эндотоксину.

- Выяснить возможность повышения эффективности препаратов на основе Вас. thuringiensis путем усиления патологического процесса, вызываемого дельта - эндотоксином.

Научная новизна результатов исследований. Впервые проведено комплексное изучение влияния дельта-эндотоксина Вас. thuringiensis на биохимические системы организма насекомых (окислительное фосфорилиро-вание, гликолиз, транспорт ионов). Сформулированы и обоснованы научные положения, совокупность которых можно квалифицировать как новое перспективное направление в изучении патогенеза бактериальных токсинов белковой природы.

Впервые доказано с использованием различных методов, что первичным действием дельта-эндотоксина является разобщение окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях, обусловленное его протоно-форными свойствами. Способность разобщать при этом не зависит от источника происхождения токсина (в пределах патотипа), но прямо пропорциональна его концентрации. Установлено, что усиление клеточного дыхания в течение первых 10 минут воздействия дельта-эндотоксина Cry I А на фоне резкого снижения синтеза АТР, связано с разобщением окислительного фосфорилирования и дыхания, приводящего к деэнергизации митохондрий.

Установлено, что начальное усиление потребления клетками глюкозы связано с включением механизма, компенсирующего снижение

синтеза ATP в ходе окислительного фосфорилирования за счет аэробной, а при дальнейшей деэнергизации клетки, и снижении потребления кислорода анаэробной стадии гликолиза. Это подтверждает динамика изменения активности 3-фосфорглицератдегидрогеназы и лактатдегидрогёназы-ферментов, катализи/рующих ключевые стадии гликолитического процесса.

Впервые показано, что вакуолизация клеток, приводящая к их деструкции, вызвана нарушением работы ион - транспортирующей Mg 2+~зависимой АТРазной системы вследствие общей деэнергизации клеток, результатом которого является пассивный нерегулируемый приток ионов натрия и воды в клетку и, как следствие, вакуолизация мембранных структур. Установлено, что нарушение транспортных функций клеточных мембран и, вслед за этим, их целостности вызывает выход лактатдегидрогеназы в гемолимфу и значительное повышение содержания лактата в ней.

Показано, что механизм действия дельта-эндотоксинов Cry I А класса универсален и един для клеток кишечного эпителия чувствительных насекомых - фитофагов, не зависит от вида насекомого, а его проявления прямо пропорционально связаны с концентрацией токсина.

Впервые проведен анализ защитных механизмов насекомых к действию дельта-эндотоксина. Показано, что увеличение активности транспортной 1У^2+-зависимой K+,Na+ - АТРазы клеток кишечника, а также лактатдегидрогеназы в гемолимфе коррелирует с восприимчивостью насекомых к данному токсину и бактерии в целом. Высказано предположение, что основной причиной различной восприимчивости является наличие или отсутствие на цитоплазматической мембране клеток кишечного эпителия специфических акцепторных центров, комплементарных к токсину данного вида, их количества и степени комплементарности, а так же секреция в кишечнике веществ-инактиваторов. Дано теоретическое обоснование разработки нового поколения бактериальных препаратов для защиты растений от

листогрызущих вредителей сельского хозяйства и леса, содержащих очищенный и активированный дельта-эндотоксин и обладающих высокой биологической эффективностью и экологической безвредностью.

Практическая значимость работы. Результаты выполненной работы, вскрывающие механизмы взаимодействия патогена с организмом насекомого - хозяина, послужили теоретической основой при разработке серии бактериальных препаратов нового поколения на основе очищенного и активированного дельта-эндотоксина, обладающих инсектицидностью, более чем в 10 раз превышающей таковую для применяемых в настоящее время препаратов, что позволяет соответственно снизить их расход. Они абсолютно безвредны и практически растворимы, что делает перспективными их использование методом аэрозольного распыления. Приоритет в разработке этих инсектицидов защищен патентами Российской Федерации.

Выявленные закономерности позволили предложить приемы повышения эффективности препаратов на основе дельта-эндотоксина, защищенные четырьмя авторскими свидетельствами СССР на изобретения. Разработаны практические рекомендации по эффективному применению бактериальных препаратов в условиях сельского и лесного хозяйства. Предлагаемые технологии апробированы в ряде хозяйств Алтайского края, Новосибирской и Ульяновской областей.

физиологии, биохимии и морфологии (Фрунзе, 1977); IV региональной конференции молодых ученых Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1980); региональной научно-практической конференции молодых ученых Сибири по

Информация о работе

Каменек, Людмила Кирилловна
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 06.01.11

Диссертация

Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis"

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Каменек, Людмила Кирилловна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений