Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение штамма-продуцента протеаз и оптимизация его продуктивности

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение штамма-продуцента протеаз и оптимизация его продуктивности"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИИ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

На правах рукописи

УДК 577.156

ГОВОРУНОВА

Валентина Алексеевна

ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ПРОТЕАЗ И ОПТИМИЗАЦИЯ ЕГО ПРОДУКТИВНОСТИ

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте прикладной микробиологии.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Бабаева П. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Грачева И. М.

кандидат технических наук,

старший научный сотрудник Уваров И. П.

Ведущая организация:

Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Минмедпрома СССР.

па заседании специализированного совета Д 098.07.01 при Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии по адресу: 125299, г. Москва, ул. Клары Цеткин, 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан «Й » ^^^ 1991 года.

Защита состоится

1991 года в

часов

Ученый секретарь специализированного совета

Гусева И. И.

ОБЩ ХАРАКТМСТЖА РАБОТЫ. .

; Актуальность теш. Протеолитические ферменты микробного происхождения находят широкое применение в различных, областях народного хозяйства. Однако потребности в них удовлетворяются ещё ке полностью. В решений этой проблемы можно выделить следующие направления: в) получение высокопродуктивных ^агоустоЯчмвых итаммов-проду-центов протеаз и оптимизация режимов их культивирования, 6) управление процессом синтеза протеолитических ^ерлентов в ходе культивирования бактерий. Последнее направление зачастую ограничивается оптимизацией среды культивирования. В то же время имеются указания на возможность управления метаболизмом, бактериальной клетки путем направленного изменения внутриклеточного ионного гомеостаза, что достигается индукцией проницаемости мембран бактерий для определенных ионов с помощью канадообразующих соединений. В настоящее время этот подход' еще не реализован в отношении каких-либо продуцентов. Поэтому испытание его при производстве протеаз представляется актуальным.

В промышленных условиях протеолитические ферменты выделяют из супернатанта культуральной жидкости. Биомасса а этом процессе является отходом .производства. Яри "промышленной наработке средств защиты растений целевым продуктом является биомасса, а отходом - куль-туральная жидкость. Совмещение этих-двух процессов позволило бы создать малоотходную технологию получения протеаз из культуральной жидкости и споро-кристаллического комплекса из биомассы.

Цели исследования . Целями работа являлись:

1) получение нового фагоусгойчивого продуцента протеаз на основе ВасШив 1Лцг1п£1епа1в

2) оптимизация продуктивности полученного продуцента.

Задачи исследования.В задачи исследования входило:

1.Изучить протеолитическув активность диссоциантов штамма 26 вас. 1Ьиг1пг1епв1з уаг. еаНе^ае • полученных при рассеве на МПА, с

целью выявления возможных продуцентов протеаз.

2. Исследовать культурально-морсологические и 4изиолого-биохимичес-кие свойства выявленных штаммов-продуцентов.

3. Оптимизировать среду и условия культивирования этих штаммов.

4. Изучать возможность регуляции биосинтеза протеаз путем направленного изменения внутриклеточного ионного гомеостаза бактерий-продуцентов под действием грамицидина. .

5. Исследовать ф!эико-химические свойства протеаэ, синтезируемых

полученными штаммами.

б..Испытать возможность совместного культивирования бактерий-продуцентов средств защиты растений и продуцентов протеаэ с цель» создания малоотходной технологии производства биологически активных веществ.

Научная новизна и практическая значимость работы»

Получен штамм GFP-51 Bacillus thuringiensie v. gallería«,синтезирующий протеолитические ферменты, активность которых сопоставима с активностью промышленных, штаммов Bacillus eubtilij-продуцентов про-теаз. Штамм обладает устойчивостью к фагам Вас. thuringiensie . На данный штамм получено авторское свидетельство V II8I3I6.

Для штамма подобрана оптимальная среда культивирования, активность фермента на которой выше в раза. по сравнению с активное- -тью на исходной среде.

Исследован протеолитический комплекс, синтезируемый бактериями штамма GFB-51. Показано, что в его состав входят нейтральные и щелочные протеазы. -

Предложен способ совместного выращивания продуцентов протеаз продуцентов средств защиты растений (штаммы 3,4, 5 серотиповВас. thuringienelej. Данный способ испытан в условиях ЦЗД Бердского химического завода. На способ получено авторское'свидетельство 9 I3I6239.

Установлено,, что в процессе культивирования бактерий штамма gfp-51 в присутствии грамицидина Д в концентрации, индуциинцей проницаемость мембран бактерий для ионов К* , протеолитическая активность культуральной жидкости достигает максимального значения на четыре часа раньше,, а уровень активности повышается вдвое. , ;.■

Апробация работы. Результаты.работы докладывались на 2 Всесоюзном симпозиуме по химии протеолитических ферментов, на 3 Всесоюзной конференции по теории и практике управляемого культивирования микроорганизмов, на совещании специалистов ВПО " Биопрепарат " по проблеме изучения физиологии роста и развития микроорганизмов. Фрагменты работы были представлены на отчетных конференциях и конкурсах молодых ученых ВНИИ прикладной микробиологии.: .

Публикации. По материалам диссертации опублиховано 5 работ..

Структура риссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, списания материалов и методов исследования, вести рвздр-

- & -

лов собственных исследований,, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 13 таблицами иГфисунками.

£1атериалы и методы исследования ,

В работе использованы микроорганизмы-продуценты средств защиты растений 3,4,& серотшов Бас. <;кит1пБ1епз1в и штамм Вас. зиЫ;1Иа - промышленный продуцент протеаз. Культивирование бактерий з зависи- 1 мости от его целей проводили на твёрдых или в жидких питательных сре-: дах. Посевной материал получали следующим образом. Культуры бактерий ' выращивали на скошенных столбиках картофельного агара при ь до полного спорообразования. Споры с.',швали стерильным Физраствором и прогревали в зависимости от микроорганизма при определенном значении температуры. Прогретые суспензии спор вносили в колбы Эрленме- : Йера с,мясо-пептонным бульоном.. Культивирование проводили на качал -ке со скоростью врадения 220 об/мин. при ЗО^С до про^-растания спор. Полученные таким образом культуры бактерий.содержали веггта -тивные клетки и использовались в качестве посевного материала для засева ферментационной среды. Этот этап культивирования проводили ; при тех же условиях.

Морфологию клеток изучали с помощью- световой и электронной мик- > роскопии. За развитием микробных культур на жидких питательных сре -дах следили путём регистрации мутности на спектрофотометре СФ-26 в в I см юовете при длине волны 540 нм. Титр клеток или спор' в культу-ральной жидкости определяли путём подсчёта колоний, образующихся на твёрдой питательной среде .

Протеолитическут» активность определяли либо в ферментных препа- ; ратах, полученных из супернатанта культуральной жидкости по модифи- ) рованному методу Ансона, «ибо в самой культуральной жидкости после удаления из неё клеток по методу Петровой И. С. иВинцюнайте!«. М. Концен- \ трациг белка определяли по методу Лоури.Удельную протеолитичёскуга активность культуральной жидкости выражали в ед/мг белка культураль- \ ной жидкости, препарата - в ед/г препарата. Способность бактерий ус- ! ваивать углеводы, синтезировать ферменты определяли по общепринятым \ методикам.

За изменением рН культуральной жидкости з процессе роста бакте- [ рий следили путём отбора проб во времени и измерения рН на рН-метре рН-121. .

Серотипирование штамма проводили постановкой реакции агглвтина- • ции. 5агочузствительность определяли по методу "Грациа и капельным двуслойным методом из десятикратных разведений вирулентных фагов. .

Активность ионов калия и натрия в культуральной жидкости изме -

ряди с помощью ионселективкых электродов фирш * Орион Выход ионов калия из бактерий под действием грамицидина Д - наблюдали на установке, состоящей иэ измерительной ячейки со стеклянным ¿(-селективным електро-дсм, сигнал от которого усиливали рН-метром MW-0I и подавался на самописец КСП-4. Содержание ионов в отмытых от среда клетках определяли следующим образом. Клетки дважды отмывали от.культураяьной жидкости 50 мМ .трис-НС 1 буфером и в виде суспензии помещали в ячейку с измерительна электродом. Затем для индукции выхода из клеток внутриклеточных ионов в ячейку вносили спиртовой раствор грамицидина Д. Зная объём суспензии клеток, прирост активности ионов переводили в количество и относили к массе суммарного белка клеток г мг.

Белки из супернатанта культураяьной жидкости ваделяли традиционными методами - высаливанием сернокислым .аммонием, осаждением спиртом и ацетоном.

Определение молекулярной массы протеаз проводили по методу Энд -рюса. Зависимость протеолитическЬЙ активности ферментного препарата от pH исследовали в буферных растворах с различными значениями pH.. Влияние температуры на протеолитическую активность определяли в диапазоне значений температуры от 20^С до 70®С.

Изучение влияния специфических ингибиторов (диизопропилфторфос-фата, фенилматклсульфонилфторида, натриевой соли этилендиаминтетра-уксусной кислоты/ на активность протеаз проводили при комнатной температуре и постоянном помешивании в течении 30 минут. После этого опрв деляли остаточную протеолитическув активность препарата по моди^ици -рованному методу Ансона.

Исследование влияния ионов» H^.Ug*2, lda+2t Са+2,Яв+3, К*,« а+, . Си+2,2п+2 на активность протеаз проводили следующим образом; Раствор ферментного препарата подвергали диализу в растворе Исследуемого иона (использовали хлорвдц) в течение 48 часов при t* 4®С. После диализа определяли активность протеаз по кодифицированному методу Ансона.

Антагонизм между штаммами бактерий и оценку инсектицидной активности культур определяли традиционными методами. Достоверность результатов исследования оценивали общепринятыми методами.

Результаты исследований и их обсуждение

I. ¿¡олучение ьтау-ма-продуцента протеаз . •

Как известно, для бактерий рода Bacillus характерно явление есте твенной изменчивости, проявляющееся в образовании морфологически отли чающихся колоний при высеве штаммов на твёрдые питательные среды. Полученные. таким образом диссоцианты зачастую характеризуются различни-ыи физиолого-биохимическими свойствами. Это явление было положено в оонову получения нового щташа-продуцента протеаз из культуры станка

26Bacillus thuringiensis v, galleriae . При выращивании штамма 26 на дрожжеполисахаридной среде (ДПС) в условиях лимита по источнику азота и последующем высеве бактерий на иясо-пептонный агар были получены морфологически отличающиеся колонии. В результате исследования способности этих диссоциантоз синтезировать протеолитические ¿Рерменты на ФДПС (Фильтрат дрсжжеполисахаридной•среда^ был отобран клон, обладавший наибольшей активностью (табл.1)-.

Таблица I

Протеолитическая активность дкссоцкантов штамма 26

I? диссоцианта 1 2 3 4 5 6 7

Протеолитическая 0,25 0,08 0,03 0,Ob 0,44 0,29 0,2S

активность куль- fa 0±0I 0±0I q^ Qi0I 0±01 туральной жид- ' . -кости, ед/мгбелка

Клон },- 5 получил в дальнейшем название штамм gfp -51. В результате изучения его культурально - морфологических и физиолого-биохими-ческих.свойств показано, что в отличие от исходного штамма 26 полу -ченный штата сбраживает- сахарозу, арабинозу, не сбраживает маннит. По остальным проверенным ¿изиолого-биохимическим свойствам не отли -чался от него. Установлено, что штамм gfp -51 относится к 5 серовари- ■ анту Bacillus thuringiensis , обладает устойчивостью к (Тагам бактерий вида thuringiensis , характеризуется генетической и биохимической

(по синтезу npoTeasj стабильностью. Штамм GFP -51 синтезирует протеазы, активность которых сопоставила с активностью промышленным продуцен-тов'протеаз (штаммыВас. eubtilisj. Полученный штамм депонирован в Щ -Ш ВНИИ генетика и защищен авторским свидетельством. Штамм может быть использовал в качестве сменной культуры в производстве протеолитических ферментов.

2. Исследование подходов к повышению продуктивности штамма GFP -51

2.1. Влияние ионного гомеостаза бактерий штамма-■ GPP-5I на протеолитическую активность культуральной жидкости

Из литературных источников следует, что метаболические свойства бактерий в значительной степени зависят от ионного состава внутри -клеточной среды. Известно также, что изменить ионный гомеостаз бактерий можно с помощью каналообразупщих веществ, которые после встраивания в цитоплазматическуп мембрану бактерий избирательно индуцируют проницаемость для определенных ионов. Зтот подход был испытан в отношении бактерий штамма GFP-5I. В качестве каяалообразующего вещества ! использован антибиотик грамицидин Д. Установлено, что при периодичес-

ком культивировании бактерий штата СРР-51 на бреда ФДДС, протеоли-тическая активность культуральной жидкооти достигает максимума к 16 часам роста (рис. I .кривая I). Культура к этому времени достигает стационарной фазы своего развития ( рис. 2.кривая I). При добавлении грамицидина Д в концентрации 2 мкг/ил наблюдалось у длина ню лаг-фазы (рис.2,кривая 2). Максимум протеазной активности культуральной жидкости в этих условиях приходился на 12 час роста культуры ( рис.1, кривая 2), что соответствовало ранней экспоненциальной фазе ее развития. Судя со оптической плотности, концентрация клеток, растущих в присутствии грамицидина Д на 12 час культивирования даньшэ конца нтрации клеток, растущих без антибиотика ( рис.2,кривая 2). В то аэ время протеолитичесхая активность культуральной жидкости почти е два раза выш в культуре, раэвишшуйся на фоне антибиотика по. сравнении с контрольной культурой ( рис.1, кривые I и 2 ). Таким образом, вод действием антибиотика происходит сувдствонное изменение мэтабо -лизма бактерий штамма СКР-51, проявляться в изданениях характера роста и протэолитической активности культуральной жидкости. Подученные нами данные указывают на возможность повышения протаолитической активности культуральной жидкости бактерий штамма ОРР-51 под воз -действием грамицидина £ за счет изменения внутршсдеточногошвнаго Го-

• .'. .1 1§40

2.4 •

2.0

1.6

1.2 I-

0,8

0.4

/г о

0.2 «

0

0 2-ФДПС. грамицидин у-ФДЮ граиицвдин+КС1

1 /-ФДПС

3-ШС + КС1

Рис. 2. Влиянш грамицидина Д а КС1 на рост клеток шта1в<аСР/,-51 в тариодичаской куль-*УРЭ

8 & ¿3 "24 Время, час

Известно, что грамицидин обладав* способностью избирательно увеличивать проницаемость яскусствэнных и биологических мембран для ионов К*, Д'а"1", Н*. На основании этого можно ожидать, что наш на низ протеазной « активности в культуре штаммаСРР-51 под влжянаэм грамицидина происхо -дит в результате изшнаняя состава внутри бактерий. Это подтвердилось ! в опыта по индукции грамицидином Д проницаемости мэмбраи бактерий штаммаСРГ-51 для ионов.калия ( рио,3).

КД ГРАМ.Д

100 .

50

4 8 12 Время,мин

Рис.3. Индукция грамицидином Д проницаемости мембран для новоек* (штамм ОРР-51). Стрелками показаны моменты добавок в измерительную ячейку клеток ( I иг суммарного белка/мл) и грамицидина Д ( конечная концентрация 2 ыкг/мл).

С помощью ионоселективньпс.электродов было установлено, что куль-туральная среда, в которой выращивали бактерии,- содержит 16 мМ К*и 40 mMN а+. Введение в среду культивирования дополнительного количества К4" в виде KCl в целом незначительно изменяло характер роста куль -туры и протеолитическую активность кульгуральной жидкости шташаОРР-51 (рис. 1,кривая 3 и рис.2,кривая 3) .В то же время, у клеток, обработанных грамицидином, при введении в среду культивирования KCl существенно подавлялась протеолитическая активность(рисЛ,кривая4]. Рост культуры при этом соответствовал росту клеток, обработанных грамицидином, в среде без дополнительного внесения KCl (рис.2,кривая 4) . Если же в питательную среду наряду с KCl вводить NaCl в концентрации 100-200 мМ, то эффект грамицидина снимался.

В связи с вышеизложенным следует подчеркнуть, что дальнейшее изучение управления свойствами культуры штамма GFP-5I за счёт измене -ния внутриклеточного ионного гомеостаза'после обработки грамицидином может позволить оптимизировать процессы получения протеаз и в' промышленных условиях.

2.2. Оптимизация питательной среды для синтеза протеаз бактериями штамма йРР-51.

На начальном этапе исследования свойств бактерий штамма ^рр -51 в качестве питательной среды для него использовали ВДПС, на которой максимальная протеолитическая активность культуральной жидкости составляла 0,44 - 0,06 ед/мг бедка культуральной жидкости. Исходя из индивидуальных потребностей штаммов-продуцентов в источниках азота, углерода, макро- и микроэлементов, методами математического планирования экспериментов была проведена оптимизация жидкой питательной среды для биосинтеза протеаз штаммом 0?Р-51, На первом этапе оптимизации, используя метод случайного баланса, был проведен отсеивающий эксперимент. После анализа вклада варьирования различных факторо в общую дисперсию эксперимента были выявлены существенные компоненты питательной среда: сухие кормовые дрожжи, кукурузный экстракт, сое -вая му?са, Ы гЭС^, ШЗ 04, Са&2» К^НРО^, КН2Р04. Данные факторы были выбраны для проведения следующего этапа оптимизации среды - постанов ки дробного факторного эксперимента (Д5Э) . На этом этапе работы ис

пользовалась матрица ДФЭ каждом этапе выполнения эксперимента :

опыт ставился в трех повторностях. Работа по. оптимизации среды про- i водилась при помощи ЭВМ с использованием пакета программ. При этом расчитывались коэффициенты уравнения регрессии» проводилась статистическая обработка данных, оценивалась значимость коэффициентов уравнения регрессии, проводилась проверка его адекватности. В результате проведения оптимизации среды удалось повысить протеолитическую активность культуральной жидкости штамма GPP -51 в четыре раза. Состав исходной и полученной сред приведен в таблице 2.

Таблица 2

Составы исходной и оптимизированной жидких питательных сред

Компоненты * питательной среды Концентрация компонентов в среде {%)'

Исходная среда Оптимизированная- среда

? ез04 х 7 Н20 0,001 - .

гпЗ 04 х 7 Н^ 0,001 ' - .

¡^ С>4 х 7 Н20 0,05 0,04

Мпе^ х 7 Н£0 0,03 0,05

К2НР04 х 3 Н20 0,02. 0,08.

кн2ро4 0,5 • 1,13

СаС12 0,01 0,23

^Н4/2 304 0,02 0,02

Си э 04 X 5 Н20■ 0,001 0,001

И а-цитрат 0,0Г 0,01

глутаминовая к-та 0,014 : -

никотиновая к-та 0,0001 -

N а-аспартат 0,015 -

соевая мука 2,0 0,5

сухие кормовые дрожжи 0,2 2,0

кукурузный экстракт 5,0 0,5

2.3. Совместное культивирование микроорганизмов - основа для разработки малоотходного микробиологического производства

В настоящее время при производстве протеолитических ферментов целевой продукт получают из супернатанта культуральной жидкости, биомасса в этом процессе является отходом производства. В производстве биологических инсектицидов '(средств-защиты растений) ' целевой продукт - биомасса, содержащая споро-кристаллический комплекс. Суперна-тант культуральной жидкости при этом сливают в трап. Технология, поз- ' золяющая полностью использовать продукты культивирования (супзрнатзяс

и биомассу^ одного процесса, является основой для -создания малоотход ного производства биологически активных веществ'/ БАВ /. При этом'отходы производства сводятся к минимуму, что способствует охране окружающей среды.

С целью выявления возможнбсти получения протеаз и биологическбго ■инсектицида в одном процессе в работу были взяты штамм 163Вас. subtil: . штамм GPP -51 Вас. thuringieneie -продуценты протеаз и ттамш' -продуценты СЗР - Z -52, 49-8, 79, 12Д, 69-6 Вас. thuringieneie. Для исследования поведения этих бактерий в жидкой питательной среде, оптимизированной для продуцента протеаз,. необходимо'было выяснить, не являются ли они антагонистами. При этом установлено, что штамм 163 Вас. sub tili^THeTaeT рост штаммов Вас. thuringienaiilTawwu В. thuringieneie друг к другу антагонистических свойств не проявляли. Поэтому было проведено выращивание в жидкой питательной среде следующих пар микроорганизмов : штамм OPP-5I и штамм Z -52, штамм GFP -51 и штамм 49-8, штамм GPP-5I и штамм 79, штамм GFP-5I и штамм 12Д, штамм GPP-5I и штамм 69-6. с целью одновременного получения протеаз и биологического ин -сектицида в результате одного культивирования.

Известно, что характер развития микробных популяций при совместном культивировании зависит от ряда факторов, среди которых - соотношение посевных доз микроорганизмов, время и последовательность внесения их в питательную среду. Результаты влияния соотношения вносимых посевных доз бактерий-продуцентов при совместном культивировании на получение протеаз и биологического инсектицида-представлены в таблицах # 3-7.

Таблица 3

Протеолитическая активность супернатанта культуральной жидкости и инсектицидная активность споро-кристаллического комплекса/биомассы/ при совместном культивировании штамма GFP-5I и штамма 2-52 '

Посевные дозы штаммов-х" ДО7 Протеолитическая И и

Z-52 GF?5I . активность препарата /х I07 сп/мл/

/ед/г препарата/

2 - __ _ . 2,5

- 2 170 -

2 2 30 10

2 4 50 14

4 2 16 SQ .

2 6 34 70

6 2 10 130

Таблица 4

Влияние соотношения посевных доз продуцентов на свойства продуктов при совместном культивировании штаммов ОРР -51 и 49-8

Посевные дозы штамуов х 10 49-8 С7Р-51

7

Протеолитическая активность препарата

/х 10 сп/мл/

г.. - - - 3

- 2 180 -

2 2 25 100

4 2 70 10

6 2 . 58 . 50

2 * 6 " 79 200

2 4 46 • 150 ■

'.•'.'•.■ . Таблица 5

Влияние соотношения посевных доз. продуцентов на свойства продуктов при совместном культивировании штаммов 12Д и ОУР-51

Посевные дозы штаммов х 10 12Д ■ ОРР-51 -

Протеолитическая , Ь К^ активность препарата,^ /х 10^сп/мл/

2 г

4

6 2

2 2 4 2 2

180

51

96' 81 35

8

13

9

3,7.

12

Таблица б

Влияние соотношения посевных доз продуцентов на свойства продуктов при совместном культивировании штаммов ОРР-51 и 79

Посевные дозы штаммов х I1 79 вРВ-б!

Протеолитическая активность препарата

Ь %0г,

/х 10 сп/мл/

2 — . _ 2

- 2 180 -

2 2 42 10

2 4 74 32

4 2 110 0,5

6 2 65 4

2 6 50 4.7

#

Таблица 7

Влияние соотношения посевных доз продуцентов на свойства продуктов при совместном культивировании штаммов 69-6 и огр-5Г Посевные дозы штаммов х 10 Протеолитическая ГКцп"

69-6 СРР-51 * активность препарата /х 10 сп/мл,

_/ед/г препарата/ _

2 - - 4

2 180

2 2 Асинхронноеть развития штаммов

4 2 п—" м—"

1в 2 "-п

2 ' 4 30 20

2 10 60 6,5

2 1В__130__5

Анализ данных приведенных в табл. 3-7, позволяет сделать некоторые общие выводы по совместному культивированию двух продуцентов. Во-первых, протеолитическая активность ферментного препарата всегда выше при выращивании монокультуры штамма ОРР-51 по сравнению с таковой при совместном культивировании со всеми исследованными продуцентами СЗР. Одним из возможных объяснений этого факта может быть синтез второй культурой (продуцентом СЗР) какнх-либо Протеинов, что приводит к снижению удельной активности йротедз в ферментном пре -парате. Во-вторых, инсектицидная активность биомассы при совместном культивировании, как правило, была ниже по сравнению с активностью монокультуры. Однако, при совместном выращивании штамма вРр-51 со штаммами 79,12Д,69-6 инсектицидная активность биомассы сопоставима, а то и вше, чем в контроле. По-видимому, в- этих 'случаях присутствие бактерий-продуцентов протеаз в препарате усиливало его вирулентность, поскольку в нем содержатся споры обеих культур и расчёт ЬКзд проводится с учётом общего титра спор.

В результате исследования влияния последовательности внесения культур при их совместном выращивании на биосинтетическую активность установлено, что все штаммы-продуценты СЗР, кроие штамма 69-о, следует вносить в питательную среду одновременно со штаммом ОУ?-51 для достижения поставленной цели. Штамм 69-6 вносят в среду при выходе бактерий штамма в фазу экспоненциального роста. В этом слу - :

■чае отмечается типичный рост культур с хорошими показателями фер - | ментативной и инсектицидной активностей.

Данные, указывающие на'преимущества совместного культивирования ми к ро о^ган^з.».: о в по срав#ению с выращиванием монокультур представлены

Таблица 8

Совместное к раздельное выращивание штатов- продуцентов БАВ

Штамм

Титр спор, млрд/мл

Протеолити- í K¿q

ческая ак- (сп/мл7 тивность, ед/г пре-

Испольэуемые Количес-продукты куль- тво ис-. тивирования пользуе-

к.ж,

69-6 Bao. thurlnglensia На оптимизи- (2* 0.5/ 0,5 + 2 (1,8 +5/ не рованной среде х 10 " х 1(Р исп. использ. 100

69-6 Bao. thurlnglenala на дрохжеполи- 8,5 х 10^ - (2,4 ♦ 4J не сахаридной среде в промышленных усяови- х I07 исп. ях использ.

CU?P-5I Bao.tliurlngienoieHa оптимизи- (3,5-I)xI0^ ISG + 10 - исп. рованной среде не исп. 100

Вас. subtilie- промышленный проду- ' t ' ' 60+220 - исп. цент протеаэ не исп.

СИ?-51 + 69-6 Bac.thurlnfiieaaie на (2,5±0,5;хЮ* 120 ± 20 поп. оптимизированной среде . штамм GFP-5I (X,5Í0,5jxI0y (3+7jxI07 штагчэд 69-6 использ. 100

биомасса мой сре-

сл i

Условные обозначения:

знак."-" - штамм данным свойством не обладает . к.ж. - культуральная жидкость

Из таблицы 8 следует, что при выращивании штамма GPP -51 и штамма 69-6 . на оптимизированной среде величины ферментативной и инсектицидной ак -тивностей сопоставимы с таковыми при раздельном выращивании этих культур. Кроме того, при совместном выращивании штаммов GF?-51 и 69-6 на оптимизированной нами среде полученные значения протеолитической ак -тивности ферментного препарата практически не отличаются от активности протеаз, синтезируемых промышленным продуцентом - штаммом Bacillus subtllie^TO же следует подчеркнуть при сравнении данных noL K^q. Из таблицы 8 также следует,что совместное культивирование является более эффективным, так как: 1) повышается рентабельность производства( за одну ферментацию возможно получение двух продуктов одновременно - протеаз и инсектицидного препарата ), «^расход питательной среды сокра -■ щается вдвое, ЗГ появляется возможность более полного использования продуктов культивирования.

3. Исследование физико-химических свойств протеаз ферментного препарата штамма GPP -51

С целью выделения протеаз из культуральной жидкости штаммаGFP -51 были использованы традиционные метода - высаливание, осаждение белков спиртом и ацетоном. Наиболее полного выделения протеаз удалось достичь при осаждении белков культуральной жидкости ацетоном. Полученный таким образом ферментный препарат, содержащий протеазы, высушивали в присутствии хлористого кальция. ,

При разделении ферментного препарата на' сефадексе g -75 получены четыре белковых фракции. Первая из .них обладала протеолитической ак,- . тивностьг. Данные по исследованию физико-химических свойств этих про. теаз представлены в таблице 9,

Таблица 9

Физико-химические свойства протеаз ферментного препарата штамма GFB-5I *

рН—оптимум действия протеаз " t*- оптимум действия протеаз Действие на протеазы и а^-ЭДА ДСФ

7,8 и 9,6 55 и 40 . + . + ' +,

Наличие ингибирующего э£фекга обозначено знаком" + Ка2~ЗД1А - натриевая соль зтилендкамиктетрауксусной кислоты, £ЖЖ - фенилметилсульфо-нилфгорид, диизопрогшлфгорфосфат. •

Из таблицы следует, что штамм GPP-5I синтезирует как нейтральные так и щелочные протеазы, так как активность ферментного препарата угне тается специфическими ингибиторами нейтральных и щелочных протеаз. Та-

сим образом, штада GP?-51 является продуцентом протеолитического ком-: иекса, что расширяет диапазон его литического действия.

шведа

1. Получен новый фагоустойчивый продуцент протеаз штамм gpp -51 Вас. thuringieneie v.galleriae . Штамм- депонирован в Ц!«Ш ШЖ гене,-:ика (J? Б-3004) и защищен авторским свидетельством £ ПШ16.

2. Методами математического планирования экспериментов подобрана штательная среда, на которой протеолитическая активность культураль-юй жидкости в четыре раза выше по сравнению.с исходной средой.

3. Определены режимы культивирования бактерий штамма gfp-5I с ;елыя получения протеаз при периодическом культивировании в лабора -'орных условиях. Установлено, что засев среды вегетативными клетками »(Мективнее засева споровым инокулюмом. •

4. Показано ,что грамицидин Д в концентрации 2 мнгДсл повышает ¡ротеолитическую активность культуральной жидкости штамма GFP-5I. При »том наблюдается увеличение проницаемости мембран бактерий для ионов ¡алия, натрия, ео до рода. Способность грамицидина Д увеличивать протео-штическую активность куль^-ральной жидкости штамма GFP-5I может быть ¡вязана с изменением внутрибахтериального ионного состава.

5. На основании действия специфических ингибиторов Протеаз на ^ер-рентный препарат показано, что в его состав входят сериновые- и метал- ; юпротеазы. Препарат обладает двумя максимумами протеолитической ак - ; живности - при рН=7,8 и рН=9,6, температурах, равных 40^и 55°С.

6. Исследовано влияние неорганических катионов (Я Н^К^а*^ , n^tCa*2, Си , zrf2, р е"^! на активность протеаз ферментного препара-•а штамма ОУР -51. Установлено, что в,зависимости от концентрации [НГ4-1(П2ы) ионы либо ингибйровали активность, либо увеличивали ее

to сравнению с контролем i Ионы НН^, На+ по мере возрастания концентрами увеличивали протеолитическую активность. Ионы Уе4^, Mg+2, Zn+2, * в концентрации 10"^ U повышали активность протеаз препарата, в ксн-¡ентрации Ю-2 и 10"^ У ингибировали ее. Ионы Нп +2, С i2, при всех ¡сследованных концентрациях угнетали протеолитическую активность.

7. Впервые показана возможность совместного выращивания получен-гого продуцента протеаз (штамм GPP-51) и продуцентов средств защиты ' астений (штаммы Z-52, 49-8, 79, 12Д, 69-6 Вас. thuringieneie)с це- | !ью одновременного получения двух целевых продуктов - протеаз из куль- ; •уральной жидкости и биологического инсектицида споро-кристалличес-:ого комплекса из биомассы. Установлено, что в микробную.ассоциацию «обходимо вводить бактерии одного вида.

8. Выявлены оптимальные соотношения посевных доз штаммов-продуцен ов при совместной выращивании дхя синтеза ими биологически активных

веществ:штамм2 -52 и штамм СИ? -51 » 1:2, штамм 49-8 и штамм gf2-5I ' = 2:1, штамм 79 и штамм gfp-oi * 2:1, штамм 12Д и штамм gip-öi » 2:1, штамм 69-6 и штамм gfp-5I »1:9. Доказано, что в питательную среду вначале необходимо внести штамм gsp-5I, затем - штамм 69-6. Инокуля-ты остальных бактерий, составляющих микробные пары, следует вносить ь среду одновременно.

- СПИСОК ПУБЛИКАЦИЯ ПО TS1S ДИССЕРТАЦИИ

1. Байдусь А.Н., Говорунова В.А., Артюхина В.В. , Бабаева П.В.Вы- . деление протеолитичзского комплекса Вас. tburinglensia .// Материалы второго Всесоюзного симпозиума по химии протэолитических ферментов, 9-II окт. 1979г.- Углич, 1979.- С. 68.

2. Бабаева ii.B., Голорунова В.А., , Кобелева .В,А., Абросимова Л.й. Исследование литического комплекса ферлентов. исходного и генетически измененного штамма Вас. thürineieneii./' Тезисы докладов третьей Всесоюзной конференции 1981 г.-Киев.: Наукова думка, I93I.-C. 103. .

3. Пучков £.0., Говорунова В.А.', Бабаева II.В. Влияние грамицидина Д на экзспротеазнух) активность Бас» tburtngienBie // Прикл. биохим. и микробиол..- 19вЗ.-т.1У,в.5.-С.599-602.

4. A.c. II8X3I6 СССР, Ж3 С I2/V9/54 . Штамм Вас. tburlasieaslo v.galleriae GFE-5I - продуцент протеолитических ферментов/Ф.П. Галушка, В.А. Говорунова, A.B. Нестеренко, П.В.Бабаева, В.Б.Смирнов, А.Н.Федотов С СССР). - J? 3745646 , Заявлено 28.05.84 , Опубл.30.12.86 , Бюл.

f- 48.-С.289.

5.Бабаева П.В. .Говорунова В.А.-,Нестеренко A.B.,Галушка Ф.П. Сравнительная характеристика активности литичееких ферментов генетически родственных штаммов // Тезисы докладов третьей Всесоюзной конференции 1981 г.-Киев.:Наукова думка, 1981. -С.I0I-I02.