Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов"

На правах рукописи

ЛЕОНОВ Вячеслав Сергеевич

Разработка технологии производства субстанций терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 МАР 2015

005560316

Москва-2015

005560316

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Хамитов Равиль Авгатович

Официальные оппоненты:

Птицын Леонид Романович - доктор биологических наук, доцент, ЗАО «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика», лаборатория № 6, заведующий, +7 (495) 780-32-66, е.таП: lconidj3titsyn@agri.ru.

Колышкин Владимир Михайлович - доктор биологических наук, ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России, советник директора, +7 (915) 015-92-15, е.таП: vkolyshkin@rambler.ru.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», +7 (495) 917-49-00, е.таП: info@instmech.ru, http://www.instmech.ru.

Защита состоится «22» апреля 2015 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 337-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23) и на сайте http://wvw.mgavm.ru.

Автореферат разослан «2Ч_» ЦУ&Ъ^ЦЬЛ 2015 г. и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Вакцины против ВПЧ 6/11 и 16/18 типов широко применяются в медицине для профилактики таких заболеваний, как рецидивирующий респираторный папилломатоз, аногенитального кондиломатоз и рак шейки матки.

К настоящему моменту в мире существуют две эффективные профилактические вакцины против ВПЧ - квадривалентная вакцина Гардасил и бивалентная вакцина Церварикс. Терапевтических вакцин для иммунотерапии заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6/11 и 16/18 типа в мире не существует.

Согласно патентам и ряду научных работ (RU2282461, RU2290204) в качестве активного компонента терапевтических вакцин против ВПЧ может использоваться гибридный рекомбинантный белок, состоящий из слитых последовательностей онкобелка Е7 ВПЧ и белка теплового шока 70 кДа Mycobacterium tuberculosis.

Выбор раннего белка Е7 в качестве мишени обусловлен его ключевой ролью в жизненном цикле вируса и способностью конститутивно экспрессироваться в пораженных вирусом эпителиальных клетках. Он способен влиять на дифференциацию и пролиферацию инфицированных клеток [Сахарова О.В., 1999]. Постоянный синтез белка Е7 необходим для поддержания опухолевого фенотипа инфицированных клеток, а их ин-гибирование приводит к регрессии ВПЧ-обусловленного заболевания.

Известно, что вирусами папилломы не инфицируются антигенпрезентирующие клетки (АПК), избегая тем самым прямого пути активации иммунитета. У больных ВПЧ-ассоциированными заболеваниями регистрируется очень слабый иммунный ответ на эти белок Е7 [Benton С., 1992]. Иммуногенность белка Е7 в составе терапевтических вакцин увеличена за счет присоединения к нему белка теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis, который активирует антигенпрезентирующие клетки и участвует в процессинге антигена [Khlebodarova Т.М., 2002].

У крупного рогатого скота, лошадей и кроликов довольно часто наблюдаются папилломы (бородавки) кожи, слизистых оболочек ротовой полости и наружных половых органов. Чаще всего папилломы возникают в области головы, шеи, на сосках и вымени, особенно у молодых и высокопродуктивных коров [Э.И. Веремей, 2006].

Вакцинирование крупного рогатого скота белком Е7 4 типа бычьего папилломави-руса замедляет рост папиллом, индуцируя их регресс, который сопряжен с сильным клеточным иммунным ответом. Вакцинированный скот вырабатывает антитела против Е7 и производит Е7-специфичные Т-клетки [Сашро M.S., 1993]. Ветеринарная вакцина на основе гибридного белка, состоящего из белка Е7 и белка теплового шока HSP70, может обладать еще большей эффективностью.

При производстве вакцины Гардасил в качестве продуцента используется рекомби-

нантный штамм Saccharomyces cerevisiae, экспрессирующий растворимый капсидный белок LI соответствующего серотипа в количестве 300-400 мг/л, а при производстве Церварикса - линия генномодифицированных клеток насекомых, экспрессирующая капсидный белок LI в количестве 100-200 мг/л культуральной жидкости [Cook J.C., 1999].

Продуценты для производства компонентов терапевтической вакцины имеют более низкую продуктивность. Кроме того, для терапевтической вакцины против ВПЧ необходимы дозировки активных компонентов, пятикратно превышающие используемые в профилактических вакцинах.

Для создания эффективной и коммерчески рентабельной технологии производства отечественной терапевтической вакцины, которая могла бы сравниться с зарубежными технологиями, необходимо обеспечить продуктивность процесса культивирования сравнимую или большую, чем у зарубежных аналогов. Разработка и реализация на практике эффективной технологии производства отечественных вакцин против ВПЧ-ассоциированных заболеваний является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлась разработка технологии производства двух терапевтических вакцин для иммунотерапии заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6/11 и 16/18 типов, на основе 4-х гибридных рекомби-нантных белков Е7 ВПЧ соответствующего серотипа и белка теплового шока HSP 70 Mycobacterium tuberculosis.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать универсальный способ культивирования рекомбинантных штаммов SCR-702-E7(6)-HSP70, SCR-702-E7(l 1)-HSP70, SCR-702-E7(16)-HSP70 и SCR-702-E7(18)-HSP70, созданных на основе штамма-реципиента S. cerevisiaeD702 и экспрес-сионного вектора pPDX3U-E7-HSP70, продуцирующих гибридные белки E7(6)-HSP70, E7(l 1)-HSP70, E7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70.

2. Создать математическую модель стадии биосинтеза целевого белка Е7(1б)-HSP70, позволяющую прогнозировать выходные параметры процессов культивирования.

3. Разработать способ дезинтеграции биомассы штаммов-продуцентов SCR-702-E7(11)-HSP70, SCR-702-E7(6)-HSP70, SCR-702-E7(16)-HSP70 и SCR-702-E7(18)-HSP70.

4. Создать на основе полученных субстанций готовые лекарственные формы двух терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки.

5. Разработать опытно-промышленные регламенты на производство вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека.

4

Научная новизна. Впервые в России создана математическая модель стадии биосинтеза целевого белка E7(16)-HSP70, позволяющая оптимизировать процесс культивирования. Рассчитанная по матёматической модели двухстадийная подпитка лимитирующим компонентом позволяет максимизировать объемную продуктивность и прогнозировать выходные параметры процесса культивирования. Оптимизированная двухстадийная подпитка состоит из подпитки по экспоненциальному закону при удельной скорости роста 0,08 ч"' и подпитки с расходом, рассчитанным по оптимальному постепенно снижающемуся профилю скорости роста, вычисленному с применением методов вариационного исчисления, а именно уравнений Эйлера-Лагранжа.

Впервые в России разработана универсальная технология промышленного культивирования штаммов, созданных на основе штамма-реципиента 5. cerevisiae D702 и экспрессионного вектора pPDX3U-E7-HSP70, продуцирующих гибридные рекомби-нантные белки E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70 и E7(18)-HSP70.

На основании разработанного способа культивирования подана заявка на патент РФ №2013146057 на изобретение «Способ микробиологического синтеза гибридного белка E7(6)-HSP70 или E7(l 1)-HSP70 или E7(16)-HSP70 или E7(18)-HSP70», принято решение Роспатента о выдаче патента (приоритет от 16.10.2013).

Практическая значимость. Разработанная технология использована в производстве ГЛФ вакцин для проведения доклинических испытаний и исследований стабильности в рамках государственных контрактов № 16.N08.12.1024 и № 13411.1008799.13.173 от Минобрнауки и Минпромторга России.

Разработаны и утверждены опытно-промышленные регламенты на производство терапевтических вакцин под №00479942-03-14 и № 00479942-01-15.

Произведены опытные серии двух терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки, прошедшие контроль согласно ФСП.

Личный вклад соискателя. Автор выполнял работу по созданию и характериза-ции клеточных банков культур, исследованию ростовых и продуктивных свойств штаммов-продуцентов, разрабатывал способ культивирования штаммов-продуцентов, разрабатывал математическую модель процесса биосинтеза, способ дезинтеграции биомассы, осветления клеточного лизата. Самостоятельно выполнял работы по масштабированию процессов культивирования, дезинтеграции и проведению установочных серий. Разработка методики очистки целевых белков выполнялась совместно с Селищевым C.B. Разработка способа получения фармацевтических субстанций и ГЛФ терапевтических вакцин, контроль стабильности проводились совместно с Жученко М.А. Нормативная документация на производство вакцин разрабатывалась совместно с Кухаренко А.Е.

Штаммы-продуценты были получены в лаборатории эукариотичееких систем экспрессии генов под руководством. Козлова Д.Г (ФГУП ГосНИИгенетика), за что выражаю ему глубокую благодарность.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» (Москва, 2014).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, подана 1 заявка на патент.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 190 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практическое использование результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список литературы (221 источников, из них 180 иностранных авторов). Диссертация включает 48 рисунков, 20 таблиц, 22 страницы приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Промышленная технология, основанная на использовании штамма-реципиента Saccharomyces cerevisiae D702 и экспрессионного вектора pPDX3U-E7-HSP70, базирующаяся на двухстадийном культивировании с оптимизированными подпитками, обеспечивает получение целевых рекомбинантных белков E7(16)-HSP70, Е7(18)-HSP70, E7(l 1)-HSP70 и E7(6)-HSP70 для изготовления терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 16/18 и 6/11 типов, с продуктивностью не менее 180,0 ± 17,5 мг, 692,4 ± 72,1 мг, 425,1 ± 35,3 мг, 395,0 ± 43,2 мг очищенного белка с 1 л культуральной жидкости, соответственно.

2. Математическая модель стадии биосинтеза целевого белка E7(16)-HSP70 позволяет путем использования оптимизированного профиля подпитки лимитирующим компонентом увеличить объемную продуктивность полунепрерывных процессов культивирования штаммов-продуцентов SCR-E7(16)-HSP70, SCR-E7(18)-HSP70, SCR-E7(11)-HSP70 и SCR-E7(6)-HSP70, соответственно, в 16,7 раз, в 9,4 раз, в 10,6 раза и в 10,2 раза по сравнению с периодическим процессом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2012 - 2014 гг. на базе ФГУП "ГосНИИгенетика". Вакцины для проведения доклинических испытаний получены по разработанной технологии в Отделе Медицинской Биотехнологии (ОМБ) ФГУП "ГосНИИгенетика". Анализ субстанций целевых белков проведен в лаборатории физико-химического контроля ОМБ ФГУП "ГосНИИгенетика".

Микроорганизмы. В работе использованы штаммы Saccharomyces cerevisiae SCR-

6

E7(6)-HSP70, SCR-E7(11)-HSP70, SCR-E7(16)-HSP70, SCR-E7(18)-HSP70 продуценты гибридных белков E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70, E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70 (депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номерами Y-3919, Y-3853, Y-4057, Y-4058, соответственно).

Питательные среды, растворы и реактивы. При проведении работы использованы компоненты питательных сред, минеральные соли, реагенты для биохимии производства Amresco, Sigma Aldrich, Panreac, Merck, сорбенты Imac 6 FF (GE Healthcare), QHP Sepharose (GE Healthcare) и Superdex 200(GE Healthcare).

Методы исследований. Культивирование штаммов-продуцентов проводили в ферментере Biostat СЗО (BBI, Германия) общим объемом 42 л в объеме жидкой питательной среды от 10 л до 30 л. В процессе культивирования контролировали концентрацию растворенного кислорода в среде, величину pH, температуру процесса, объемную подачу воздуха, перемешивание. В ходе процесса культивирования в среду асептически вносили подпитки - стерильные растворы сахарозы, глюкозы, глицерина, дрожжевого экстракта, казаминовых кислот, фосфатов. Продолжительность процесса составляла 36-65 ч. Клеточная плотность культуральной жидкости в процессе культивирования определялась измерением абсолютно сухого веса (АСВ) клеток из расчета на 1 л культуральной жидкости в анализаторе влажности Sartorius MA 150 (Германия).

Дезинтеграция биомассы и осветление лизата. Биомассу продуцента размораживали в течение 6 часов при температуре +4°С и диспергировали в лизирующем буфере ЛБ (100 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 30 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 4 М мочевины, 0.1 % полисорбата 20, 1 мМ EDTA, 5 мМ дитиотрейтола, 2 мМ PMSF, pH 8.0) в соотношении биомасса: буфер 1:3. Суспензию клеток разрушали в дезинтеграторе APV 1000 (APV, Дания) при давлении 950 бар с последующим охлаждением в теплообменнике до температуры 8-10°С. Общее число циклов дезинтеграции определялось результатами фазово-контрастной микроскопии (Carl Zeiss Axiostar, Германия), т.е. не менее 95% клеток должно было быть разрушено.

Биохимическая очистка. Очистку проводили на хроматографе АКТА Purifier 100 (GE Healthcare) с применением металл-хелат аффинной, ионообменной и гельфильт-рующей хроматографии.

Измерение удельной продуктивности. Для анализа использовали образцы культуральной жидкости продуцента гибридного белка, нормированные из расчета, чтобы 1 мл образца имел АСВ 10 мг. Образец биомассы с 150-200 мг стеклянных шариков и 0,1 мл лизирующего буфера дезинтегрировали в аналитическом дезинтеграторе Bullet Blender (Next Advance, США). Затем определяли содержание растворимого гибридного белка в полученном супернатанте методом электрофореза в 8% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли в восстанавливающих условиях. Оценка элек-

7

трофореграмм и расчет выхода целевого продукта проводился с использованием программного обеспечения Gene Tools (Syngene, Англия).

Определение концентрации глюкозы и глицерина в культуральной жидкости. Образец культуральной жидкости продуцента гибридного белка осаждали при 4000 об/мин в течение 15 мин. В супернатанте определяли содержание аналита методом ВЭЖХ на аналитическом хроматографе Ultimate 3000 (Dionex, США) на колонне YMC Polyamine II. В качестве стандартов использовали растворы глюкозы и глицерина в концентрации 5 мг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка технологии производства терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов

Технология получения двух терапевтических вакцин против заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека 6/11 и 16/18 типов, основана на получении в клетках 4-х рекомбинантных штаммов-продуцентов S. cerevisiae 4-х гибридных ре-комбинантных белков, состоящих из слитых последовательностей онкобелка Е7 ВП( соответствующего типа (6, 11, 16 или 18) и белка теплового шока 70 кД Mycobacterium tuberculosis, дальнейшей дезинтеграции биомассы штаммов продуцентов, выделении и очистке целевых белков из клеточных лизатов, а такж сорбции целевых белков на адъювант.

Структура гибридного рекомбинантного белка, состоящего из слитых последова тельностей онкобелка Е7 ВПЧ соответствующего типа и белка теплового шока 70 кД Mycobacterium tuberculosis приведена на рисунке 1.

N-конец С-конец

Онкобелок Е7 Белок теплового шока Н5Р70,16 С-

соответств\тошего концевых аминокислотных остатков

серотнпа (6. 11. 16 или 18) которого замещены на искусственную

последовательность, включающую б остатков гистшшна

Рис. 1. Структура гибридного рекомбинантного белка Е7-Н8Р70

Целевые белки экспрессируются в штаммах-продуцентах Е7-Н8Р70 при отсутст вии в среде углеродсодержащих субстратов (сахарозы и глюкозы). Присутствие в сре де несбраживаемых углеродсодержащих субстратов (таких как глицерин и этанол) н препятствует синтезу целевого белков.

Обоснование общей стратегии процесса культивирования

Промотор Gall, под контролем которого находится синтез белка E7-HSP70, не обладает галактозозависимой индукцией, но по своей сути является индуцируемым. В случае индуцибельного промотора процесс культивирования делится на две части -этап накопления биомассы и этап биосинтеза целевого белка.

Стадия накопления биомассы должна проводиться с использованием сахара в качестве углеродсодержащего субстрата. Культура должна максимально эффективно использовать углеродсодержащий субстрат и накопить большой пул биомассы за минимальное время, т.е. экономический коэффициент Yxs и объемная производительность по биомассе Qx должны быть максимальными.

Стадия биосинтеза должна пройти с максимально большой объемной продуктивностью целевого белка Qp и, соответственно, Qp является основным параметром оптимизации и математического моделирования стадии биосинтеза.

Оценка штаммов-продуцентов в периодическом процессе в биореакторе в объеме 10 л

Продуктивность и ростовые свойства штаммов-продуцентов были оценены в периодическом процессе культивирования в объеме питательной среды 10 л. В таблице 1 приведены данные по продуктивности штаммов.

Таблица 1. Выходные параметры оценочных процессов культивирования штаммов-продуцентов 8СК-702-Е7(6)-Н8Р70, 8СК-702-Е7(11)-ШР70, 8СЫ-702-_Е7(16)-Н8Р70, 8СК-702-Е7(18)-ШР70_

Штамм-продуцент Выходные параметры процесса культивирования

Продолжительность процесса, ч Конечная концентрация биомассы, г АСВ/ л Конечный титр целевого белка в КЖ, мг/л Объемная продуктивность, мг/(л-ч)

SCR-702-E7(6)-HSP70 48 16,2 ± 1,0 200,0 ± 22,0 4,17 ±0,46

SCR-702-E7(ll)-HSP70 48 16,5 ± 1,0 200,0 ± 22,0 4,17 ±0,46

SCR-702-E7( 16)-HSP70 48 16,4 ±1,0 56,0 ± 6,0 1,17 ± 0,13

SCR-702-E7(l 8)-HSP70 48 15,5 ±0,9 365,0 ±40,0 7,60 ±0,83

Самую низкую продуктивность показал штамм-продуцент 5СЛ-702-Е7(16)-НБР70. Было решено проводить исследования и оптимизацию процесса на этом модельном штамме, а затем апробировать разработанную схему на остальных штаммах.

Разработка этапа накопления биомассы

Ферментационная стратегия культивирования продуцентов осложнена наличием

Крэбтри-эффекта, при котором внесение относительно малых порций сахарозы в культуру приводит к запуску процесса брожения, мгновенному образованию этанола и потере контроля над ведением процесса.

В ходе разработки этапа накопления биомассы были исследованы и подобраны оптимальные параметры процесса: состав среды культивирования, режим подачи угле-родсодержащего субстрата, температура процесса, аэрация и уровень растворенного кислорода в среде, величина рН и другие.

Остановимся подробнее на выборе режима подачи углеродсодержащего субстрата. Штаммы-продуценты Е7-Н8Р70 являются Крэбтри-положительными. Эта особенность I штаммов ведет к брожению, снижению выхода биомассы, нецелесообразному расходу субстрата, и, главное, неуправляемому росту культуры, поэтому одной из задач этого этапа являлась его минимизация.

Исследованы 3 режима подачи углеродсодержащего субстрата:

1. Периодический процесс - весь субстрат вносится в начале процесса. Культура последовательно проходит стадии брожения и аэробной ферментации.

2. Периодический процесс совместно с подпиточным - часть субстрата вносится в начале процесса, а после окончания брожения начинается подпиточный процесс, в котором субстрат подается в лимитирующих количествах.

3. Подпиточный процесс - субстрат подается с постоянной скоростью с начал? культивирования.

На рисунке 2 приведены кривые роста штаммов-продуцентов в процессах с раз личными режимами подачи углеродсодержащего субстрата.

10 20 30 40

время культивирования, ч

•♦"250414, постоянная подпитка сахаром 1,6 г/л/ч

•0»021012, стартовая

сахароза 30 г/л, с 24,5 ч по 53,5 час подпитка сахарозой 1.5 г/л/ч

»111013,стартовая сахароза - 30 г/л

Рис. 2. Кривые роста штаммов-продуцентов 8СК-702-Е7-Н8Р70 в процессах с различными режимами подачи углесодержащего субстрата

В таблице 2 показаны выходные параметры процесса накопления биомассы с раз личными режимами подачи углеродсодержащего субстрата.

Таблица 2. Выходные параметры процесса культивирования при различных _режимах подачи углеродсодержащего субстрата_

Режим Параметры процесса

Конечная концентрация биомассы АСВ, г/л Продолжительность процесса, ч Объемная продуктивность по биомассе Qp, г/(л-ч)

I. Стартовая сахароза 16,0 ± 1,0 48 0,33 ± 0,02

II. Стартовая сахароза + постоянная подпитка сахарозой 20,2 ± 1,4 28 0,72 ± 0,05

III. Постоянная подпитка сахарозой 19,5 ± 1,3 24 0,81 ±0,06

Для дальнейшей разработки нами выбран режим III, как наилучший по эффективности использования субстрата и по объемной продуктивности.

Этап биосинтеза целевого белка Выбор углеродсодержащего субстрата. Существует несколько альтернативных способов индукции экспрессии целевого белка: автоиндукция при исчерпании сахара из среды, индукция при использовании несбраживаемых углеродсодержащих субстратов, таких как глицерин или этанол и индукция при лимитированной подаче сахара.

Для исследования влияния способа индукции на продуктивность были реализованы пять режимов культивирования. Наилучшим по всем показателям является режим 2Ь -процесс с внесением глицерина (табл. 3), который и был выбран для дальнейшей оптимизации.

Таблица 3. Выходные параметры процессов с разными способами индукции

Способ индукции Выходные параметры процессов культивирования продуцента 8СЯ-702-Е7-Н8Р70 с различными способами индукции

Выход белка с 1 л КЖ, мг/л Объемная продуктивность, мг/(л-ч)

1а. Однократное внесение стартовой сахарозы 56,0 ± 6,0 1,17 ± 0,13

1Ь. Подпитка сахарозой с 0 по 32 ч 12,0 ± 1,5 0,17 ±0,02

2а. Внесение этанола 46,3 ± 5,6 0,94 ±0,12

2Ь. Внесение глицерина 650,5 ± 60,3 10,54 ± 0,97

3.Постоянная подпитка сахарозой 7,0 ± 0,8 0,11 ±0,01

При реализации 3 режима культура штамма-продуцента белка Е7(16)-Н8Р70 очень быстро переходила от дыхательного метаболизма к метаболизму брожения и обратно, такого рода осцилляции приводили к снижению скорости роста и продуктивности. Для других штаммов этот режим показал достаточно высокую эффективность.

Особенности роста культуры 8С1*-702-Е7-Н8Р70 при индукции синтеза целевого белка глицерином. При синтезе многих рекомбинантных белков удельная скорость образования продукта яР является функцией удельной скорости роста культуры ц или яР= ад.

На рисунке 3 показаны кривые удельной скорости роста культуры на этапе биосинтеза при внесении глицерина в различных точках. Наблюдаемые при этом пилообразные колебания удельной скорости роста |1 приводят к колебаниям удельной скорости образования продукта вследствие чего снижается общая объемная продуктивность процесса <3Р, и увеличивается продолжительность процесса культивирования.

Рис. 3. Скорость роста (А) и удельная скорость образования продукта (Б) при культивировании штамма-продуцента 8СК-Е7(16)-Н8Р70 на этапе биосинтеза при индукции в разных точках: 1 - при концентрации биомассы 19,4 г АСВ/л, 2 -при 26,4 г АСВ/л, 3 - при 32,2 г АСВ/л

При использовании лимитированной подпитки по глицерину вместо однократного внесения пилообразный вид кривой удельной скорости роста сохранялся.

Для дальнейшей оптимизации стадии биосинтеза необходимо иметь метод управления скоростью роста культуры.

Определение лимитирующего компонента в ходе стадии биосинтеза при культивировании штамма 8СК-Е7(16)-Н8Р70. Мы предположили, что в ходе процесса имеется некий неизвестный нам лимитирующий компонент, который и обуславливает такой характер колебаний скорости роста. Для его определения была поставлена ферментация, в ходе которой после внесения глицерина поочередно вносили предположительно лимитирующие компоненты.

На рисунке 4 показано их влияние на потребление кислорода культурой. Внесение дигидрофосфата калия резко ускорило рост культуры, что отразилось на наклоне кривой аэрации. Таким образом, лимитирующим компонентом в данной комплексной среде является дигидрофосфат.

22,5 23 23,5 24 24,5 25 25,5 время культивирования, ч

25 30 35 40 время культивирования, ч

"удельная скорость роста кудельная продуктивность

Рис. 4. Изменение потребления кислорода культурой штамма SCR-E7(16)-HSP70 в ходе внесения добавок (А). Удельная скорость роста и удельная продуктивность при культивировании штамма SCR-E7(16)-HSP70 с комплексной подпиткой фосфатами, дрожжевым экстрактом и казаминовыми кислотами (Б)

Для проверки этого предположения была проведена ферментация с постоянной подпиткой дигидрофосфатом. В состав подпитки также были включены казаминовые кислоты, как легко доступный источник аминокислот, и дрожжевой экстракт. В ходе ферментации кривая скорости роста, показанная красным цветом, сначала вышла на плато, а затем плавно снижалась, никаких резких колебаний не наблюдалось. Кривая удельной скорости образования продукта имела аналогичный характер. Таким образом, с помощью подачи фосфатов можно управлять скоростью роста культуры и, следовательно, оптимизировать стадию биосинтеза.

Математическое моделирование. Поскольку производство многих белков в дрожжах определяется его стоимостью, крайне желательно иметь инструмент, позволяющий надежно и достаточно просто предсказывать и оптимизировать продуктивность, время процесса и титр продукта. Таким инструментом является математическое моделирование. Оно позволяет минимизировать временные и финансовые затраты на фармацевтическую разработку и производство продукта. Применяя методы вариационного исчисления, основанные на уравнениях Эйлера-Лагранжа и принципе максимума Понтрягина, можно решать различные оптимизационные задачи [Zhang, 2005]. В ряде работ зависимость удельной скорости образования qp от скорости роста ц описывается уравнением, подобным уравнению Моно [Maurer, 2006, Hensing, 1994]:

a,, =qP (1)

ЧРп ""max kq+im

Для того, чтобы определить константы этого уравнения и построить зависимость в виде кривой мы исследовали диапазон скорости роста культуры 0,02-0,09 ч"1 в ряде

13

ферментаций, одновременно определяя удельную скорость образования продукта.

Массив экспериментальных данных был обработан в программе вгарЬег и с помощью метода наименьших квадратов были вычислены константы уравнения цр= 5,2542 мг/(г АСВ-ч) и кч=0,0382 ч"1.

Полученная по уравнению кривая зависимости удельной скорости образования белка от удельной скорости роста показана на рисунке 5.

Рис. 5. Зависимость удельной скорости образования белка E7(16)-HSP70 от скорости роста uiTaMMaSCR-E7(16)-HSP70, полученная с помощью экспериментальных значений из процессов культивирования: 160514, 010814, 070814

Средняя ошибка аппроксимации при построении уравнения регрессии составила 11,9 %. Коэффициент детерминации - 0,72. Методом дисперсионного анализа по критерию Фишера было показано, что уравнение является статистически значимым.

Объемная продуктивность, которая является основным параметром оптимизации, определяется величиной удельной скорости роста \х и величиной удельной скорости образования продукта qP, которая, в свою очередь, также зависит от ц. Таким образом, параметр \х является основной переменной при оптимизации стадии биосинтеза.

Зависимость qP=f(jj.) соблюдается в рамках граничных условий, обусловленных особенностями роста штамма-продуцента и экспрессии целевого белка:

1) внесение глицерина в момент времени to=0 (23 час культивирования);

2) неконтролируемое падение скорости роста и ее подъем до величины 0,08 ч"'с tono t=3,5 час (рис. 4Б);

3) экспоненциальная стадия роста со скоростью 0,08 ч"1 с t=3,5 час по t=7,5 час и постепенное снижение скорости роста с t=7,5 часа (рис. 4Б);

4) неконтролируемое падение скорости роста и удельной скорости образования

белка из-за токсического воздействия целевого белка на клетку при концентрации целевого белка более 15,5 мг/г АСВ.

Для решения оптимизационной задачи мы воспользовались методом вариационного исчисления.

Пусть X = Х(0 - количество биомассы, Р = Р(1) количество продукта и ц = ц(1) -удельная скорость роста в момент времени Рост биомассы описывается уравнением Х'СО = ^(0 •ЯСО.Где начальное значение Х(0) = Хо. Выход продукта описывается уравнением Р'(0 = 9р(о • ¿"(О.где ¿¡гр - удельная скорость образования, которая и зависит от удельной скорости роста ц согласно уравнению (1), и начальное значение Р(0) = Ро-

Прежде всего, мы максимизируем интегральный (общий) выход продукта в фиксированном временном интервале [О, Т]. 1/Т Р(Т) —► Мах эквивалентно Р(Т) —> Мах.Следовательно, мы можем вывести:Р(с) = /0тР'(г) • Аг = Яртах ¡1 к ■ ^

Подстановка Х'(1)/Х($ вместо [¡(I) приводит к максимизации интеграла

«»-¿г^Ь* (2)

Этот интеграл имеет экстремум, только если дифференциальное уравнение Эйлера-

Лагранжа---—— = О удовлетворено для Р = Р(Х,Х) - --:

дх ах дХ к'Х^Х

Вычисление уравнения Эйлера-Лагранжа приводит к * ,. - — Под-

(лд'ЛтА ) Ол (Лл'лтА у

ставляя /и([)Х(1) вместо Х'(0 получаем - £ =

Вычисление дифференциала и избавление от общего знаменателя дает:

2 • кц • + + кч • д2(с) = 0 (3)

~ = -ц3 -кя- цг (4)

интеграл можно преобразовать следующим образом:

1 + + = 1 + с (8)

Мы решили это дифференциальное уравнение и получили следующее выражение для И(01 + С = 1 + 2.1П1£- (9)

Из начальных граничных условий (ц=0,08 ч"1 в момент времени 1=7,5 часа) были определены параметр с и оптимальное значение общего периода подпитки Т, после че-

15

го рассчитана кривая оптимальной скорости роста культуры.

Скорость потребления субстрата зависит от скорости роста культуры и количества биомассы и определяется следующим уравнением = + т5~) ■ Хп ■ сН. (10)

Определяем скорость подачи подпитки Б для поддержания оптимальной скорости роста. На рисунке 6 изображен вычисленный по модели профиль подачи подпитки.

Рис. 6. Профиль оптимальной скорости роста штамма 8СГ*-Е7(16)-Н8Р70 в процессе биосинтеза (А) и рассчитанный оптимальный расход подпитки (Б)

Прогноз и апробация

Для апробации моделированной подпитки было проведено три процесса культивирования штамма 8СК-Е7(16)-ШР70.

На рисунке 7 приведены кривые удельной скорости роста в ходе биосинтеза в сравнении с прогнозируемой кривой.

25 27 29 31 33 35 37 39 _время культивирования, ч_

Рис. 7. Изменение удельной скорости роста штамма-продуцента 8СЯ-Е7(16)-ШР70 в ходе биосинтеза белка Е7(16)-Н8Р70 в процессах с оптимизированной подпиткой: ц- спрогнозированный профиль оптимальной скорости роста, 1-010914,2-070914,3- 140914

Начиная с 36 часа, скорость роста падает быстрее, чем было спрогнозировано в мо-

дели и чем дальше, тем большее расхождение наблюдается между моделью и кривой роста, полученной в процессе культивирования. Такое снижение скорости роста связано с токсическим действием белка Е7(16)-Н8Р70, хотя при экспрессии других гибридных белков такого эффекта не наблюдалось.

В таблице 4 приведены выходные параметры периодического процесса, процесса с внесением глицерина и процесса с подпиткой, рассчитанной в математической модели. Объемная продуктивность в ферментации с подпиткой, рассчитанной математическим моделированием, в 1,86 раза больше, чем в ферментации с внесением глицерина и в 16,7 раз больше, чем в периодическом процессе.

Таблица 4. Сравнение эффективности технологических схем этапа биосинтеза

Параметр культивирования Технологическая схема

Однократно е внесение глицерина Однократное внесение глицерина + подпитка, рассчитанная математическим моделированием Периодиче ский процесс

Объемная продуктивность, мг/(л-ч) 10,54 ±0,97 19,5 ±2,0 1,17 ± 0,13

Конечный титр продукта в куль-турапьной жидкости, мг/л 650,5 ± 60,3 740,2 ± 75,4 56,0± 6,0

Конечная концентрация биомассы в культурапьной жидкости, г АСВ/л 39,3 ± 1,5 44,6 ± 1,6 16,4 ± 1,0

Продолжительность культивирования, ч 65 38 48

Апробация подпитки в процессах культивирования 4-х штаммов 8СЯ-Е7-Н8Р70

При культивировании штаммов-продуцентов гибридных белков Е7-Н8Р70 6,11 и 18 типов была использована та же математическая модель. При этом мы приняли, что Чртах и УХ5 для этих штаммов равны значениям чртах и УХ5, экспериментально полученным для штамма 8СЯ-Е7(16)-Н8Р70; в процессе культивирования использовался профиль подпитки, рассчитанный для штамма 8СЯ-Е7(16)-Н8Р70.

На рисунке 8 показано накопление целевого белка в ходе культивирования с оптимизированной подпиткой. Продуцент белка Е7-Н8Р70 18 типа показал максимальный титр по продукту среди всех четырех штаммов.

Рис. 8. Накопление белков Е7(16)-Н8Р70, Е7(18)-Н8Р70, Е7(И)-Н8Р70 и Е7(6)-Н8Р70 при культивировании 4-х штаммов-продуцентов в процессах с оптимизированной подпиткой: Р - прогноз накопления продукта, 1- Е7(6)-Н8Р70, 2 - Е7(11)-ШР70, 3 - Е7(16)-Н8Р70, 4 - Е7(18)-Н8Р70

В таблице 5 показаны выходные параметры процессов культивирования штаммов 8СЯ-Е7-Н8Р70 при апробации оптимизированной подпитки. Оптимизация подпитки значительно повлияла на объемную производительность и титр целевого продукта.

Таблица 5. Выходные параметры процессов культивирования 4-х штаммов

8С1*.-Е7-Н8Р70

Штамм-продуцент Периодический процесс Процесс с оптимизированной подпиткой Эффект оптимизированной подпитки на объемную продуктивность

Конечный титр целевого белка в КЖ, мг/л Объемная продуктивность, мг/(л-ч) Конечный титр целевого белка в КЖ, мг/л Объемная продуктивность, мг/(л-ч)

5СЯ-Е7(18)-Н8Р70 365,0 ±40,0 7,60 ± 0,83 2770,6 ±260,2 71,5 ±6,7 9,4

8СЯ-Е7( 16)-НБР70 56,0 ± 6,0 1,17 ± 0,13 740,2 ±75,4 19,5 ±2,0 16,7

8СК-Е7(11)-Н8Р70 200,0 ±22,0 4,17 ±0,46 1680,5 ± 170,1 44,5 ±4,5 10,6

8СЯ-Е7(6)-Н8Р70 200,0 ± 22,0 4,17 ±0,46 1600,3 ±165,6 42,4 ± 4,4 10,2

Конечный титр целевых белков Е7(6)-Н8Р70 и Е7(11)-Н8Р70 составил 1600,3 ± 165,6мг и 1680,5 ± 170,1мг с литра соответственно, а для белков Е7(16)-Н8Р70 и Е7(18)-Н8Р70 - 740,2 ± 75,4мг и 2770,6 ± 260,2 мг с литра.

Для штамма 8СЯ-Е7(16)-Н8Р70 объемная продуктивность возросла в 16,7 раз, конечный титр в - 13,9 раз. Для штаммов 8СК-Е7(И)-Н8Р70 и 8СЯ-Е7(6)-Н8Р70 - объемная производительность возросла в 10,6 и 10,2 раза, а титр конечного продукта в 8,4 и 8,0 раз, соответственно. Объемная производительность штамма 8С11-Е7(18)-Н8Р70 возросла в 9,4 раза, а титр конечного продукта в 7,6 раз.

На рисунке 9 приведена универсальная технологическая схема этапа культивирования четырех штаммов-продуцентов 5С11-Е7-Н5Р70 в процессе производства вакцин.

-^Рабочий банк**'*

продуцента 5СР-702-Е7-НЗР70 ^Минус70

Выраш,и вание4"^ инокулята для засева в ферментер, 1,5 л, 28 °С

"культивирование ш тамш-продуцента ЭСР-702-Е 7-Н5Р 70 в ^чщленгере.ЗО л,

Ферментер С 30, БаЛопиз

'"Сбор и фасовка биомассы 3930 г,

хранение ццМинус 70 °С

Пептон - 20г/л,

.Дрожжевой экстракт—20 г/л,

VI жера л ьнье соли

50% р-р глюкозы-подпитка 1,8 г/лАч

80% р-р глицерина - добавка на 23 час роста

10%р-р дрожжевого зкстракта- подпитка с 23 часа

10% р-р казагимновых кислот- подпитка с 23 часа

3% р-р КН2Р04-подпитка с 23 часа

12,5% р-р аммиака - титрант

20 % р-р фосф .кисхпоты - титрант

гено гаситель

И-Шдень: начало 8.00

окончение 19.00 Время процесса 35 ч

Сепаратор УУейй! ¡а СТС1-107

III день: начало 19.00

скончание 23.00 Время процесса 4 ч

1день: начало 11.00

окончаьме 8.00 Время гроцесса 21 ч

Шейкер-инкубатор термо ста тируемый

>1<идка я питательна я среда 50 % р-р глюкозы

Рис. 9. Технологическая схема производства терапевтических вакцин - этап культивирования штамма-продуцента

Разработка способа дезинтеграции

После проведения процесса культивирования необходимо выделить и осветлить белок для последующей очистки.

Нами был разработан процесс дезинтеграции, заключающийся в последовательном пропускании суспензии клеточной биомассы через гомогенизатор, оснащенный охлаждающим теплообменником. В ходе работы было исследовано влияние давления в камере разрушения гомогенизатора и количества циклов дезинтеграции на выход общего клеточного белка и целевого продукта (рис.10). Показано, что использование давления значением в 950 Бар в ходе дезинтеграции позволяет в два раза интенсифицировать процесс по сравнению с разрушением при 600 Бар. Охлаждение клеточной суспензии между циклами дезинтеграции и использование ингибиторов протеаз и восстанавливающего агента в составе буфера позволило получить стабильный продукт с низкой степенью агрегации.

Разработанный способ дезинтеграции был масштабирован в 8 раз и апробирован в ходе разрушения биомассы 4 штаммов-продуцентов.

19

; / К Ч

// ; / /х- г С- с fAv \ > X ч> 1 X г 1-е

F /

1 ff* IP* {

г А ^-- •— b-ÉWgj W^ г

4 Содержание лроду кта Е7(16)Н8Р70 в дезингеграте, 950Бар —в— Сосдер жание общего белка, 950 Бар

-Л— Содер жание пр оду кта

Е7(16)Н8Р70 в дезингеграте, 750Бар —— Соедер жание общего белка, 750 Бар

- Содер жание пр оду кта E7(16)HSP70 в дезингеграте, бООБар Содержание общего белка, 600 Бар

доество циклов дезинтеграции

Рис. 10. Влияние давления на эффективность дезинтеграции биомассы штамма-продуцента 8СК-Е7(16)-Н8Р70

В табл. 6 приведены параметры разработанного способа разрушения, состав лизи-рующего буфера и средний выход продукта с 1 г биомассы.

Таблица 6. Параметры режима разрушения, состав буфера и средний выход

белка с 1 г биомассы

Разработанный режим разрушения Соотношение буфер — биомасса, состав буфера Степень разрушения биомассы, процент ± а Средний выход с 1 г биомассы, мг/г

Давление 950 бар, 7 циклов дезинтеграции. Между циклами суспензию охлаждали в течение 15 мин до 8-10 °С. 3:1 pH 8,0 ЮОмМ Tris-HCl, ЗОмМ имидазола, 5мМ DTT, 1 мМ EDTA, 2 мМ PMSF, 500 MMNaCl, 0.1 % Tween 20, 4M Urea 98 ±1 6,2±0,5 мг белка E7(16)-HSP70

16,8±1,0 мг белка E7(18)-HSP70

16,4±1,0 мг белка E7(6)-HSP70

16,0±1,0 мг белка E7(l 1)-HSP70

Средний выход продукта с 1 г биомассы составил 6,2 ± 0,5 мг, 16,8 ±1,0 мг, 16,4 ± 1,0 мг и 16,0 ± 1,0 мг для гибридных белков Е7(16)-ШР70, Е7(18)-Н8Р70, Е7(6)-Н8Р70 и Е7(11)-Н8Р70 соответственно.

Очистка субстанции гибридных рекомбинантных белков

После разрушения биомассы продуцента полученный клеточный лизат каждого из гибридных белков осветляли путем центрифугирования на проточной центрифуге (Thermo, Германия) и фильтрации с помощью фильтра Sartopore 2 диаметром пор 0,22 мкм. Полученный раствор гибридного белка подвергали 4-х стадийной очистке: ме-талл-хелат аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, стадии концентрирования и гель-фильтрационной хроматографии.

В табл. 7 показана достигнутая после всех стадий очистки средняя финальная продуктивность с 1 л культуральной жидкости: 180,0 ± 17,5 мг белка E7(16)-HSP70, 692,4 ± 72,1 мг белка E7(18)-HSP70/ л, 425,1 ± 35,3 мг белка Е7(11)-НБР70/ л, 395,0 ± 43,2 мг белка E7(6)-HSP70/ л. Потери в ходе очистки составили 75 %.

Таблица 7. Выход гибридных белков до и после проведения очистки

Параметр продуктивности Субстанция продукта

E7(6)-HSP70 E7(11)-HSP70 E7(16)-HSP70 E7(18)-HSP70

Средний выход белка с 1 л КЖ, мг/л (после культивирования) 1600,3 ± 165,6 1680,5 ± 170,1 740,2 ± 75,4 2770,6 ± 260,2

Средний выход очищенного белка с 1л КЖ, мг/л 395,0 ± 43,2 425,1 ±35,3 180,0 ±17,5 692,4 ±72,1

Изготовление ГЛФ вакцин

Сорбция антигенов на адъювант осуществлялась в реакторе. Содержание гидро-ксида алюминия в вакцине составляло 0,8 мг/мл. В зависимости от вида вакцины концентрация антигенов Е7(6)-Н8Р70, Е7(11)-Н5Р70 составляла 0,2 мг/мл и 0,2 мг/мл, антигенов Е7(16)-Н8Р70, Е7(18)-Н8Р70 - 0,4 мг/мл и 0,4 мг/мл соответственно. Затем производился розлив готовой вакцинной массы по бутылям.

Полученные серии вакцины против рецидивирующего респираторного папиллома-тоза, аногенитального кондиломатоза и вакцины против рака шейки матки оценивали по параметрам ФСП и направляли в доклинические исследования.

На рис. 11 приведена универсальная технологическая схема на этапах дезинтеграции, биохимической очистки субстанции гибридных рекомбинантных белков и изготовления ГЛФ в процессе производства двух терапевтических вакцин.

Д«имтегр«ср APVLeb 1000, Прото««« цетрауг»Н«»еи» Suite» (17 ООО обАла^ скорость прсгтс*»25 imJ моф

Лжмрукпдей буфер (100 ^ Tru-HCl pH S.O. 30 ьМ имидюсш» 500 mM NaCl, 4 M ночевки», 2 Ш PMSF, 5M ДТТ. 0.1 % пагасорб« 20,1ьМ EDTA, pH SD)

Буф ер VPH IMAC А (20 mM Ï п$Й61. -1 тМ EDTA, 10 тМ GSH. 0.1 % Tween 20, pH 8,0)

Буфер VPH IMAC В (20 mMTfis-HCI pH 8.0, 500 mM Imidaz, 500 mM NaCI. 10 mM GSH, 1 mM EDTA, 10 % глицерина 0.1 %

Буф ер VPHQ HP А (20 mM TrisHCI, 10 тМ GSH.1 тМ EDTA 0,1 % Tween 20, рН80) Буф ер VPH Q HP В (20 тМ TrisHCI. 1M NaCI. 10 тМ GSH.1 тМ ЕОТА.0.1 % Tween 20. pH BjO)

Градие нт из б уф e pa VPH Q НРА в буфер VPH О HP В от 0 до 100 %

продолжительностью 0.24 л

VPH SE (25 mM NaH2P04; 150 mW NaCt 146 mM Sucrose; 0.02 % Tweeo-80, pH 7 .4)

VPH SE (25 mM NaH2P04; 160 mM NaCI; 146 mM Sucrose; 0.02 % Tween-80, pH 7.4)

Испытание белка на подлинность, pH, наличие белковых примесей, МБЧ.ДНКштзмма-продуцекта

Гель шдроксида алюминия с содержанием алюминия 10 мг/мл

Буф ер ГЛФ (0,86 мг/мл Натри я дигидро ф осф ат мо но гидрат. 6,71 мг/ыл Натрия гидрофосфат додекагидрат. 3,76 мг/мл NaCI.50 мг/мл Сахароза,0005 мг/мл Полисорбат 20

Рис. 11. Технологическая схема производства терапевтических вакцин - этап выделения, этап биохимической очистки и этап изготовления ГЛФ вакцин

ВЫВОДЫ

1. Разработан универсальный способ двухстадийного культивирования, состоящий из этапов накопления биомассы и биосинтеза целевого белка, для каждого из которых определены оптимальные условия культивирования, в том числе режимы внесения питательного субстрата. Способ культивирования позволяет с использованием оптими-

зированного профиля расхода подпитки лимитирующим компонентом позволяет достичь продуктивности 740,2 ± 75,4 мг/л, 2770,6 ± 260,2 мг/л, 1600,3 ± 165,6 мг/л и 1680,5 ±170,1 мг/л по гибридным белкам Е7(16)-Н8Р70, Е7(18)-Н8Р70, Е7(6)-НБР70 и Е7(11)-Н8Р70, соответственно.

2. Математическая модель стадии биосинтеза целевого белка Е7(16)-Н8Р70 путем оптимизации профиля расхода подпитки лимитирующим компонентом позволила увеличить объемную продуктивность полунепрерывных процессов культивирования штаммов-продуцентов 8С11-Е7(16)-Н8Р70, 8СЯ-Е7(18)-Н8Р70, 8С11-Е7(11)-Н8Р70 и 8СК-Е7(6)-Н8Р70, соответственно, в 16,7 раз, в 9,4 раз, в 10,6 раза и в 10,2 раза по сравнению с периодическим процессом.

3. Разработанный способ дезинтеграции клеток штаммов-продуцентов путем 7-кратного пропускания клеточной суспензии через гомогенизатор АРУ 1000 при давлении 950 бар обеспечивает стабильность целевого продукта и выделение из 1 г биомассы гибридных белков Е7(16)-Н8Р70, Е7(18)-Н8Р70, Е7(6)-Н8Р70 и Е7(11)-Н8Р70 в количестве 6,2 ± 0,5 мг, 16,8 ± 1,0 мг, 16,4 ± 1,0 мг 16,0 ± 1,0 мг соответственно.

4. Разработанная технология, включающая способы культивирования, дезинтеграции и биохимической очистки целевых белков Е7(16)-Н8Р70, Е7(18)-Н8Р70, Е7(11)-Н8Р70 и Е7(6)-Н8Р70 обеспечивает получение фармацевтических субстанций продуктов, соответствующих требованиям спецификации нормативного документа, в количестве 180,0 ± 17,5 мг, 692,4 ± 72,1 мг, 425,1 ± 35,3 мг, 395,0 ± 43,2 мг очищенного белка с 1 л культуральной жидкости, соответственно.

5. На основе полученных субстанций произведены опытные серии готовых лекарственных форм двух терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногениталыюго кондиломатоза и против рака шейки матки, прошедшие контроль качества согласно ФСП.

6. Разработана документация для включения в регистрационное досье вакцин против ВПЧ - ассоциированных с заболеваний, в том числе опытно-промышленные регламенты.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Штаммы-продуценты гибридных белков Е7(6)-Н8Р70, Е7(11)-Н8Р70, Е7(16)-ШР70, Е7(18)-Н8Р70 были депонированы в ВКПМ (Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов) под номерами У-3919, У-3853, У-4057, У-4058 соответственно.

2. Разработанная технология использована в производстве ГЛФ вакцин для проведения доклинических испытаний и исследований стабильности в рамках государст-

23

венных контрактов № 16.N08.12.1024 и № 13411.1008799.13.173 от Минобрнауки и Минпромторга России.

3. Разработаны и утверждены опытно-промышленные регламенты на производство вакцин, содержащие схемы и описание производственных процессов под № 0047994203-14 и № 00479942-01-15.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать использовать созданную математическую модель для оптимизации стадии биосинтеза новых штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента 5. cerevisiae D702.

2. На основании данных, полученных в ходе проведения доклинических исследований по параметрам острой и хронической токсичности, специфической токсичности (репродуктивности, генотоксичности, мутагенности) рекомендовать использовать терапевтическую вакцину против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и терапевтическую вакцину против рака шейки матки для проведения клинических испытаний.

3. Обоснованные научные подходы по разработке технологии производства субстанций терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и рака шейки матки могут быть использованы при создании ветеринарных терапевтических вакцин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Леонов, B.C. Разработка промышленного способа культивирования штаммов-продуцентов гибридных рекомбинантных белков Е7 вируса папилломатоза человека 6 и 11 типов и белка теплового шока HSP 70 / B.C. Леонов, H.A. Литвинова, Е.В. Горожанина // Биофармацевтический журнал - 2014. - Т. 6. - №1. - С. 12-16.

2. Леонов, B.C. Разработка промышленного способа дезинтеграции биомассы штаммов-продуцентов гибридных рекомбинантных белков Е7 вируса папилломатоза человека 16 и 18 типов и белка теплового шока HSP 70 / B.C. Леонов, Е.В. Горожанина, С.А. Черепушкин // Биофармацевтический журнал - 2014. - Т. 6. -№6. - С. 10-16.

3. Леонов, B.C. Оптимизация биосинтеза гибридных рекомбинантных белков Е7 вируса папилломатоза человека 6, 11, 16 и 18 типов и белка теплового шока HSP 70 методом математического моделирования / B.C. Леонов, И.Р. Яхин, Н.В.Стратонова // Биофармацевтический журнал - 2015. - Т. 7. - № 1. - С. 13-17.

Подписано в печать:

11.02.2015

Заказ № 10532 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Объем: 1 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru