Разработка и изучение иммунобиологических свойств нового лекарственного средства - бактиспоринпласта

Янгирова, Земфира Закарияновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и изучение иммунобиологических свойств нового лекарственного средства - бактиспоринпласта
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и изучение иммунобиологических свойств нового лекарственного средства - бактиспоринпласта"

На правах рукописи

Янгирова Зсмфира Закарияновна

Разработка и изучение иммунобиологических свойств нового лекарственного средства - бактиспоринпласта

03.00.07. - микробиология 14.00.25. - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2005

Работа выполнена в лаборатории препаратов крови Уфимского филиала «Иммунопрепарат» Федерального Государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства Здравоохранения и Социального Развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Лукманова Клара Абдулловна

Научный консультант

кандидат биологических наук, с.н.с. Кузнецова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Киреева Найля Ахняфовна

заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии РФ, доктор медицинских наук, профессор Лазарева Дина Наумовна

Ведущая организация: Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ и CP РФ

Защита состоится «о? Í» 2005 г. в /Т часов на заседании

Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105

Автореферат разослан «г]/(&_0 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.

Лукманова К.А.

йООЬ-Ч

тоом

SA 33

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Профилактика и лечение гнойных ран является одной из важных задач современной научной и клинической медицины, так как ежегодно в России и странах СНГ регистрируется около 5 млн. больных с гнойно-воспалительными заболеваниями (A.A. Воробьев и др., 1996). В связи с повышением устойчивости бактерий к антибиотикам возникла необходимость разработки альтернативных лечебно-профилактических мероприятий, среди которых важное место занимает использование пробиотиков, в том числе из бактерий рода Bacillus, обладающих антимикробной активностью. Бактерии Bacillus subtilis продуцируют более 70 различных антибиотиков (В.В. Смирнов и др., 1982, 2001). Лабильность структуры антибиотического вещества, продуцируемого живой бактериальной клеткой, предотвращает адаптацию возбудителя к препарату, не формируются устойчивые штаммы инфекционных агентов. Использование живых бактериальных клеток, продуцирующих широкий спектр антибиотиков в минимальных количествах, предотвращает подавление местного и системного иммунитета и развитие побочных осложнений в виде дисбактериоза или аллергических реакций (В.В. Смирнов, 2002; В.И. Никитенко, 2002).

Антибактериальная активность бактерий рода Bacillus усиливается действием продуцируемых литических ферментов, активно лизирующих клетки как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Синтезируемые бактериями протеолитические ферменты стимулируют регенерационные процессы тканей теплокровных, обладают тромболитическим действием (В.В. Смирнов, 2001). Пробиотики из бактерий рода Bacillus широко представлены препаратами для перорального применения. Однако их сложно использовать местно для лечения ран.

В последнее время получило развитие новое направление в совершенствовании лекарственных форм для местного лечения ран - разработка аппликационных покрытий для эпидерв, "" гически активных

соединений в организм Наиболее перспективным направлением является создание раневых покрытий на основе биодеградируемого природного полимера коллагена (Л.П. Истранов, 1984; Р.К. Абоянц, 1999; А.Б. Шехтер,1999).

Таким образом, разработка нового комплексного ранозаживляющего микробиологического препарата для местного применения на основе биорастворимого полимера - коллагена и Bacillus subtilis, а также изучение его фармакологической активности является актуальной задачей.

Цель исследования

Создание нового имуннобиологического препарата - бактиспоринпласта, изучение его специфической и фармакологической активностей.

Задачи исследования

Разработать медишшский иммунобиологический препарат на основе бактерий В. subtilis ЗН в форме коллагеновой губки для местного лечения ран и профилактики гнойных осложнений.

Изучить биологические свойства нового препарата: количество живых клеток Bacillus subtilis, антагонистическую активность в отношении тестовых штаммов условно-патогенных микроорганизмов.

Определить оптимальные условия хранения и срок годности бактиспоринпласта.

Провести оценку безвредности созданного препарата.

Изучить ранозаживляющую эффективность аппликационного лекарственного средства на животных.

Научная новизна

Впервые: - разработана технология получения нового ранозаживляющего лекарственного средства бактиспоринпласта для местного применения; - установлена стабильность биологических свойств бактерий штамма В. subtilis ЗН в созданной лекарственной форме;

показано, что бактиспоринпласт обладает высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенных бактерий;

- показана высокая ранозаживляющая активность бактиспоринпласта на модели условно-чистых и гнойных ран экспериментальных животных.

Научно-практическая значимость

1. Создан новый препарат - Бактиспоринпласт для профилактики осложнений и лечения гнойных ран, показана его эффективность при заживлении экспериментальных ран у животных.

2. По результатам исследований разработана нормативно-техническая документация на Бактиспоринпласт.

3. Изготовлены экспериментально-производственные серии нового препарата -Бактиспоринрласта.

Внедрение результатов исследования в практику

На основе материалов, представленных в диссертации, составлена нормативно-техническая документация на бактиспоринпласт; приготовлены экспериментально-производственные серии препарата. Производство предполагается осуществлять на базе филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ «Иммунопрепарат».

Основные положения, выносимые на защиту

- Создание нового лекарственного средства на основе эубиотика бактиспорина и уксусно-кислого раствора коллагена в форме пластины для нанесения на рану.

- Новая лекарственная форма превосходит по ранозаживляющей активности пероральный препарат - бактиспорин, а по спектру антибактериальной активности, стабильности не уступает ему.

- Бактиспоринпласт представляет удобную лекарственную форму для местного применения. При практическом использовании подавляет инфекцию, очищает раны от гнойно-некротических тканей и стимулирует репаративные процессы в ране.

Апробация работы

Сибири и Поволжья (Оренбург, 2003), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 2 в центральной печати.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 126 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 22 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы (2 главы), раздела собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и библиографического списка, содержащего 182 источника, в том числе 121 отечественных и 61 зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

При создании ранозаживляющих покрытий в качестве основных действующих веществ использовали следующие материалы:

- концентрат бактиспорина, полученный с использованием производственного штамма B.subtilis ЗН, депонированного в коллекции микроорганизмов ГИСК им. Л.А.Тарасевича под № 248;

- в качестве вспомогательного вещества, адсорбирующего действующее начало и как формообразующую основу, применили 2 % раствор коллагена (ФСП 42-0282-1221 -01) производства завода Белкозин.

Для исследования биологических свойств бактиспоринпласта использовали:

- питательные диагностические среды: картофельную, полусинтетическую с дрожжевым диализатом, агаризованную среду Гаузе № 2, среду Эндо, среду Сабуро, среду с мочевиной (скошенный столбик), солевой агар;

- тест-штаммы, предусмотренные ВФС 42-2904-97 на «Бактиспорин сухой»: Staphylococcus aureus «Никифоров», Staphylococcus aureus «Филипов», Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Escherichia coli 157, Shigella flexneri, Candida albicans, полученые из музея живых культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича.

Работу проводили на животных, выращенных в питомнике лабораторных животных Филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ и СР РФ «Иммунопрепарат»: белых мышах массой 14-16 г , белых крысах массой 180-200 г, морских свинках массой 210-220 г, кроликах породы Шиншилла массой 2,0-2,2 кг.

Животных содержали на стандартном рационе вивария. Условия проведения эксперимента для контрольных и опытных групп были идентичными.

При получении нового лекарственного средства для местного применения использовали методы: диспергирования 1 % коллагеновой композиции с бактериальной взвесью на гомогенизаторе и сублимационного высушивания композиции на установке ТГ-50.

Количество живых микробных клеток определяли путем последовательных десятикратных разведений с последующим высевом на картофельную среду в соответствии с ВФС 42-2904-97 на «Бактиспорин сухой» в нашей модификации. Для этого пластину размером (40x50) мм разрезали на мелкие кусочки ножницами и заливали 20 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Экстрагировали при 37 °С при периодическом помешивании в течение 50-60 минут. Из полученной взвеси готовили ряд последовательных десятикратных разведений в стерильном 0,9 % растворе хлорида натрия. Из разведений 10"6 и 10"7 высевали по 0,1 мл микробной взвеси на четыре чашки Петри с картофельным агаром и тщательно растирали шпателем по поверхности. После (18±4) ч инкубации при температуре (37±1) °С производили подсчет выросших колоний и вычисляли содержание живых бактерий в одной дозе препарата по формуле:

К = ах10|,+1,

где а - среднее количество колоний на чашку с данного разведения (н);

(н+1) - количество разведений с учетом высева 0,1 мл на чашку. Затем производили пересчет на 1 пластину.

Для изучения антагонистической активности препарата к тест-штаммам использовали метод отсроченного антагонизма в соответствии с ВФС 42-2904-97 на «Бактиспорин сухой» в нашей модификации. Для этого разрезали бактиспоринпласт

на полоски, размером 10x50 мм и пинцетом выкладывали по диаметру чашки Петри на подсушенную агаризованную полу синтетическую среду с дрожжевым диализатом. После (48±4) ч инкубации при температуре (37±1) °С перпендикулярно к выросшей из пластины культуре подсевали штрихом тест-штаммы условно-патогенных бактерий: St. aureus «Никифоров», St. aureus «Филипов», Pr. mirabilis, Pr. vulgaris, E.coli 157, S. flexneri, Candida albicans. Через ( 18+4) ч инкубирования при температуре (37+1 ) °С, учитывали зоны угнетения роста тест-штаммов в мм.

Биохимические свойства штамма B.subtilis ЗН в концентрате бактиспорина и экстракте из пластин исследовали согласно ВФС 42-2904-97 на «Бактиспорин сухой».

Для определения рН пластин, потери в массе при высушивании, адсорбционной способности бактиспоринпласта использовали физико-химические методы.

Ранозаживляющую активность коллагеновых покрытий изучали на 180 белых половозрелых беспородных крысах в трех сериях опытов по заживлению ран: условно-чистых плоскостных, гнойных (модель абсцесса) и гнойно-плоскостных ранах.

I истологические исследования осуществляли совместно с профессором Ф А. Каюмовым, срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, одновременно проводили гистохимическое исследование гликогена -методом Мак-Мануса (БГМУ, кафедра гистологии).

Токсиколог ическое исследование препарата проводили в тесте изучения кожно-резорбтивных свойств на белых мышах, местного раздражающего действия -на кроликах, в реакции гиперчувствительности «замедленного» типа на мышах и аллергизирующего действия на морских свинках.

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационно-статистического анализа с использованием критерия достоверности по Стьюденту. Результаты считали достоверными при уровне вероятности р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изготовления бактиспоринпласта использовали концентрат биомассы бактиспорина, в качестве формообразующей основы раствор 2 % коллагена. Предварительно экспериментально установили, что уксуснокислый раствор коллагена совместим с концентратом бактиспорина, образует гомогенную композицию бежевого или желтовато - бежевого цвета, при этом, специфическая активность (колониеобразующие единицы (КОЕ) и уровень антагонистической активности) в композиции не снижались.

Эксперименты показали, что увеличение содержания бактериальных клеток в пластине выше 3x109 нецелесообразно, так как это существенно не влияет на повышение антибактериальной активности. В препарате «Бактиспорин сухой» для перорального применения 1 доза содержит не менее 1х109 кл/мл и является дозой, оказывающей клинически выраженный эффект (В.В. Смирнов, 1982). Исходя из литературных данных и проведенных нами исследований, установили, что для получения бактиспоринпласта необходимо смешение концентрата биомассы, содержащей (2-6)х109 кл/мл, и 2 % раствора коллагена в объемном соотношении 1:1. После замораживания и сублимационного высушивания слоя композиции толщиной (0,6-1,0) мм получали пористые губки толщиной (0,5-0,9) мм заданного размера (40x50) мм. Каждая пластина содержала 6 мл композиции, представляющей собой смесь коллагена и концентрата бактиспорина. Созданные пластины были названы «Бактиспоринпласт». Всего получено 7 экспериментально-производственных серий препарата «Бактиспоринпласт», объемом 100-150 пластин каждая.

Бактерии штамма B.subtilis ЗН в бакгиспоринпласте образуют новую композицию, описания которой нет в литературе. При смешении компонентов бактиспоринпласта возможна сорбция или иммобилизация бактерий на коллагене, что может повлиять на свойства штамма. Поэтому провели сравнительное изучение основных свойств штамма B.subtilis ЗН в концентрате биомассы и экстрагированного из бактиспоринпласта.

Изучение морфологических свойств штамма B.subtilis ЗН до соединения с коллагеном и после экстракции из бактиспоринпласта показало, что

морфологические свойства сравниваемых бактерий аналогичны и характерны для первой группы рода Bacillus подгруппы Б: грамположительные спорообразующие палочки, размером (0,3-0,7)х(1,8-2,2) мкм, клетки не раздуваются при спорообразовании, споры элипсовидные, расположены центрально, не образуют глобул в цитоплазме клеток при выращивании на глюкозном агаре.

Провели сравнительное изучение основных биохимических свойств штамма B.subtilis ЗН в концентрате биомассы штамма до соединения с коллагеном и экстрагированного из бактиспоринпласта на способность продуцировать: протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу; ферментировать глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу; гидролизовать крахмал, мочевину; расщеплять тирозин и утилизировать цитрат; образовывать аммиак, индол и сероводород.

Установили, что штамм B.subtilis ЗН, экстрагированный из бактиспоринпласта, не отличается по этим свойствам от биомассы штамма до ее соединения с коллагеном.

Таким образом, созданная новая лекарственная форма «Бактиспоринпласт» не изменяет свойств штамма B.subtilis ЗН.

В процессе изготовления бактиспоринпласта изучили показатели специфической активности полученного препарата: количество живых клеток B.subtilis ЗН (КОЕ) и антагонистическую активность в отношении условно-патогенных микроорганизмов.

Определение содержания КОЕ и морфологию клеток В. subtilis ЗН изучали в исходном концентрате биомассы до соединения с коллагеном, в жидкой композиции с коллагеном и в губке после сублимационного высушивания. Для определения КОЕ в готовом препарате готовили экстракт из пластины. На всех этапах изготовления пластин на диагностических средах получили однотипные колонии (рис. 1.).

На рисунке 1 представлены колонии штамма В. subtilis ЗН через 1 сутки после титрования экстракта бактиспоринпласта. Все колонии в R-форме, диаметром 2-2,5 мм, шероховатые с волнистым краем, непрозрачные, бежевого или желтовато-бежевого цвета, сухой консистенции. В процессе изготовления пластин не происходило диссоциации микробной популяции.

Приведенные данные указывают, что морфологические свойства бактерий В.яиЫПю 3 Н в процессе получения бактиспоринпласта остаются стабильными.

Результаты определения содержания живых клеток В. эиЬпИэ ЗН на этапах получения лекарственной формы представлены в таблице 1.

* '¡^т'^к» - • ' ■ 1

ф 9 в» *» -Г* * ,' **

. . «I* " -

* # А».

Рис.1. Морфология колонии В.виММз ЗН из экстракта бактиспоринпласта Таблица 1. Содержание живых микробных клеток В^иЫШв ЗН

Серия Количество живых микробных клеток (Х±8х)

препарата В концентрате биомассы, кл/мл В композиции, кл/мл В готовом препарате, кл/пл

1 2 3

1 (4,3±0,2)х109 (1,4±0,2)х109 (2,6±0,4)х109

2 (3,9±0,4)х109 (1,3±0,3)х109 (2,6±0,3)х109

3 (4,1±0,3)х109 (1,5±0,2)х109 (2,4±0,3)х109

Примечание. Представлены средние данные 5 опытов

Одна пластина бактиспоринпласта содержит 3 мл концентрата биомассы бактиспорина или 6 мл композиционной смеси. Как следует из данных таблицы, не происходит снижения концентрации бактериальных клеток на последовательных стадиях изготовления бактиспоринпласта, то есть изготовление пластин идет в щадящем режиме для бацилл.

Изучение антагонистической активности штамма В.виЬйНя ЗН по отношению к условно-патогенным тест-штаммам было проведено на этих же технологических этапах. Данные исследования антагонистической активности представлены в таблице 2.

Таблица 2. Антагонистическая активность бактиспоринпласта в отношении тест-иггаммов

Серия препара та Технологический этап Зона угнетения роста тест-штаммов, мм (Х±8„) п=7

81. аигеия «Никифоров» 81. аигеив «Филипов» Рг. пжаЬШБ Рг. уи^аш Е.со1( 157 З.Яехпеп С.аНнсапБ

1 Концентрат биомассы 19±1 17±1 17±1 18±2 13±1 19±1 31±1

Смесь биомассы и коллагена 18±2 16±2 17±2 17±2 14±2 17±2 33±2

Готовый препарат 19±1 18±2 18±2 19+2 11±3 18±3 31±1

2 Концентрат биомассы 19±1 16±3 16±2 18±3 13±2 18±2 31±2

Смесь биомассы и коллагена 18±2 15±3 17±2 18±1 13±3 19±1 32±1

Готовый препарат 17±3 17±3 16±3 20±2 14±1 17±2 33±1

3 Концентрат биомассы 19±1 16±2 17+2 19±2 13±2 17±3 33±1

Смесь биомассы и коллагена 16±3 18±2 17±2 17±3 14±2 17±2 32±1

Готовый препарат 18±2 17±3 18±1 18±2 13±1 18±2 31±3

Как следует из представленных данных, бактериальные клетки, находящиеся в композиции с коллагеном, сохраняют высокий уровень антагонистической активности в отношении тестовых штаммов. Задержка роста в тесте отсроченного антагонизма к штаммам: St. aureus «Никифоров», St. aureus «Филипов», Pr. mirabilis, Pr. vulgaris, E. coli 157, S. flexneri составляет 11-20 мм, a С. albicans до 34 мм.

Таким образом, установлено, что показатели специфической активности (КОЕ и антагонистическая активность) препарата в процессе его изготовления (в концентрате, жидкой композиции и в готовом препарате) не имели достоверных отличий (р>0,05). Препарат был стабилен на всех технологических этапах.

Контроль экспериментально - производственных серий на отсутствие посторонней микрофлоры проводили в два этапа. На первом этапе просматривали мазки, приготовленные из экстракта препарата и окрашенные по Грамму, в которых выявляли только характерные для бацилл грамположительные спороносные палочки. На втором этапе высевали экстракт бактериальных клеток препарата на чашки Петри с дифференциальными средами для выявления посторонней микрофлоры согласно ВФС 42-2904-97 на «Бактиспорин сухой». Во всех сериях препарата на питательных диагностических средах отсутствовал рост посторонних микроорганизмов и грибов, что является основанием для заключения об отсутствии контаминации пластин.

Изучены физико-химические свойства бактиспоринпласта, необходимые для составления нормативно-технической документации.

Для определения рН водного экстракта бактиспоринпласта брали навески пластин 0,5 г, измельчали ножницами, заливали 50 мл воды очищенной и выдерживали в течение 15, 30, 45 и 60 мин при комнатной температуре периодически перемешивая. Полученные данные представлены в таблице 3

Как следует из таблицы 3, достаточным является экстрагирование в течение 15 минут, поскольку полученные данные рН существенно не отличались при увеличении времени экстракции во всех изученных пробах.

Таблица 3. pH водной вытяжки из бактиспоринпласта в зависимости от времени

экстрагирования

№ п/п Время экстрагирования, мин pH водной вытяжки пластин

I II III

1 15 5,1±0,4 5,3±0,2 5,1 ±0,4

2 30 5,2±0,3 5,0±0,4 5,4±0,1

3 45 5,0±0,5 5,0±0,5 5,3 ±0,5

4 60 5,2+0,3 5,2±0,3 5,4±0,3

Значимость различий Р]-2 3-4>0,05 Pl-2-3-4>0,05 Pl-2-3-4>0,05

Примечание. Представлены средние данные 7 опытов

В результате вышеописанных исследований отработан и введён в проект ФСП на бактиспоринпласт метод определения и показатель pH водной вытяжки пластин, который составил 4,5 - 5,5.

Данные определения потери в массе при высушивании пластин представлены в таблице 4.

Таблица 4. Потеря в массе при высушивании бактиспоринпласта

№ серии Потеря в массе

Абсолютная, г Относительная, %

1 0,04+0,001 13,4±0,4

2 0,05+0,001 12,0+0,4

3 0,04+0,001 13,9+0,5

Примечание. Представлены средние данные 7 опытов

Как следует из данных таблицы, показатели потери массы при высушивании находились в пределах 11,6 - 14,4 %. При этой влажности препарат оставался стабильным. На основании экспериментальных данных в проект ФСП внесли требование остаточной влажности не более 15 %.

В связи с тем, что способность полимера сорбировать жидкость - это явление, определяющее переход полимера в гелеобразное состояние, что имеет существенное значение при лечении ран, изучали процесс набухания структурообразователя. При погружении образцов бактиспоринпласта в физиологический раствор при (2СН2) °С наблюдали проникновение в ей поры жидкости (некоторое набухание препарата) и частичную экстракцию бактерий из губки (помутнение раствора).

Количество сорбированной влаги достигало максимума через 20 минут и составило 95 % от веса пластины. То есть губки обладали высокой адсорбционной способностью, имеющей существенное значение в механизме лечения ран.

Для получения информации о скорости и полноте высвобождения действующего вещества (бактерий В. эиМШв), взаимосвязи его с носителем (коллагеном) была изучена динамика экстракции бактерий из пластин. Каждую пластину отдельно заливали 20 мл физиологического раствора и помещали в термостат при температуре (36±1) °С, периодически перемешивая. Через 1,2,3,4,5 часов проводили отбор проб, заменяя всю свободную жидкость аликвотой физиологического раствора, и определяли количество колониеобразующих единиц (таблица 5).

Таблица 5. Кинетика выделения живых бактерий В. зиЫШв из пластины

Время экстракции КОЕ в 1 мл. экстракта

0-15 минут (1,3-2,3)х10

15-30 минут (1,2-6,9)х10'

30-45 минут (4,6-9,1)х108

45-60 минут (1,5-6,1)х109

1-2 часа (5,5-7,5)х10*

2-3 часа (1,4-5,5)х107

3-4 часа (ЗД-6,4)х10в

4-5 часов (3,5-6,8)х105

Примечание. Представлены средние данные 7 опытов

Как следует из результатов, представленных в таблице, коллаген обеспечивает постепенное высвобождение бактерий из пластин. Бактериальные клетки обнаруживали в среде уже через 15 минут после начала опыта, максимальная концентрация экстрагировалась за период от 45 до 60 минут, которая составила (1,5-6,1)х109 клеток в пластине. Диффузия клеток в раствор продолжалась не менее 5 часов с постепенным снижением количества бактерий. Из сказанного следует, что в отличие от нанесения на рану жидкой лекарственной формы или приема внутрь бактиспорина, аппликация губки непосредственно на рану позволяет пролонгировать поступление В. $иЬШ15 в организм.

Исследование хронической токсичности бактиспоринпласта проводили на белых мышах при использовании десятикратной терапевтической дозы в течении 30 дней. Изучение местного раздражающего действия осуществляли путем нанесения 2 капель экстракта препарата на слизистые оболочки кроликов в конъюктивальном тесте. Полученные данные свидетельствовали о безвредности препарата.

В тесте активной кожной анафилаксии на белобоких морских свинках показатели сенсибилизации в опытной группе, получавшей экстракт препарата в разведениях 1:50 и 1:100, и контрольной группе, получавшей физиологический раствор, статистически не отличались, то есть бактиспоринпласт не обладал аллергическими свойствами немедленного типа. На модели гиперчувствительности «замедленного» типа при внутрикожной сенсибилизации мышей экстрактом из бактиспоринпласта величина отека задних лап мышей не превышала допустимый предел, что свидетельствовало об отсутствии у препарата аллергизирующих свойств типа ГЗТ.

Для изучения влияния бактиспоринпласта на заживление плоскостной раны, использовали 4 группы белых крыс по 10 голов.

Экспериментальную полнослойную рану создавали под эфирным наркозом на депилированном участке в межлопаточной области. С этой целью иссекали участок кожи с подкожной клетчаткой и подшивали к краям раны фторопластовое кольцо диаметром 15 мм. Коллагеновые пластины помещали в рану (каждые трое суток) и закрывали перфорированной полиэтиленовой пленкой. В качестве сравнения использовали 3 группы контроля: 1) заживление при пероральном ежедневном введении фармакопейного препарата «Бактиспорин сухой» (вторая группа);

2) заживление под коллагеновой губкой без препарата (третья группа);

3) контроль - обработка раны раствором фурацилина (четвертая группа).

Кольцо удаляли на четвертые сутки и определяли площадь раны, которую принимали за 100 %. С этого момента оценивали площадь раневой поверхности на 4, 6, 8,11,15,19 и 21 сутки.

Как следует из результатов, приведенных на рисунке наибольшей ранозаживляющей активностью, обладал бактиспоринпласт, в данной группе крыс время полного заживления составило 11 суток у девяти животных из десяти.

Несколько медленнее, на 11-15 сутки (и только у одной крысы на 19 сутки), происходило заживление раны при пероральном применении «Бактиспорина сухого», однако существенно быстрее, чем при использовании коллагеновой губки без препарата - на 15-19 сутки. Применение препаратов во всех случаях приводило к ускоренному восстановлению раневой поверхности в сравнении с контрольной группой без лечения (21-24 сутки).

Лечебную эффективность исследуемых пластин оценивали по сокращению площади раневой поверхности, срокам заживления. Результаты действия препаратов на заживление плоскостных ран представлены на рисунке 3.

Исходная 4 сутки 6сутки 8сутки 11 сутки Исутки 19сутки 21 сутки Время от начала лечения

| И Ьактиспоринпласт ВБактиспорин ВКоллагеновая губка В Контроль [

Рис. 3. Динамика заживления плоскостных ран у крыс

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем На следующем этапе исследований изучили ранозаживляющую эффективность бактиспоринпласта на модели гнойной раны (абсцесса). Опыт проводили на белых крысах. Животных разделили на четыре группы аналогично первому опыту.

Для формирования абсцесса использовали модель вживления марлевого тампона в подкожную клетчатку (I.P Ciroud, WG. Spector, 1973). Под эфирным наркозом на депилированном участке в межлопаточной области вшивали под кожу марлевый тампон, смоченный 1,0 мл инфицирующего материала (патогенная культура S. aureus в концентрации 3,6x109 кл/мл по стандарту мутности). Лечение начинали через 72 часа после заражения и проводили путем вскрытия гнойника, удаления тампона и аппликации пластин. К этому времени у всех животных отмечали признаки гнойного воспаления: отек и гиперемия краев раны и окружающих тканей, наличие в полости раны гноя и некротических масс. Смену ранозаживляющих пластин осуществляли через каждые трое суток. Пробы для гистологических исследований брали на 3, 7, 11, 15 сутки после операции. Данные учитывали по срокам заживления в сутках, скорости заживления ран в процентах за сутки (таблицы 6 и 7).

Таблица 6. Скорость заживления гнойной раны у белых крыс в зависимости от использованного препарата

№ п/п Препарат лечения Скорость заживления ран, %

В I фазе Во II фазе Средняя

1 Бактиспоринпласт (местно) 13,4±0,6 11,2±0,4 8,2±0,5

2 Бактиспорин сухой (перорально) 12,0±0,5 10,3±0,6 7,4±0,5

3 Коллагеновая губка (местно) 11,4±0,6 9,9±0,5 7,1 ±0,4

4 Контроль 9,7±0,6 8,7±0,7 6,1±0,5

Значимость различий Р,-2<0,05 PI-350,05 Рм<0,05 Рг-з>0,05 PJ.4<0,05 Pu<0,05 PI.2>0,05 PI.3>0,05 Рм<0,05 Рм>0,05 Рг-«<0,05 Рз-120.05 Р,.2>0,05 Pio<0,05 Рм<0,05 Рг-з>0,05 Р2-4<0,05 РЗ-<<0,05

Наступление второй фазы, очищение раны от гноя и некротических тканей при применении бактиспоринпласта происходило быстрее, чем в остальных группах, скорость заживления раны была самой высокой.

Состояние ран у всех групп крыс к началу лечения было аналогичным, то есть имели место отек, гиперемия краев раны и окружающих тканей, гной и некротические массы в полости абсцесса.

На третьи сутки от начала лечения у крыс 1, 2 и 3 групп отмечали уменьшение отека и гиперемии краев раны, гнойное отделяемое уменьшилось, в то время как у животных 4 группы в ранах увеличилось количество гноя и некротических тканей.

Таблица 7. Сроки заживления гнойных ран у белых крыс

№ группы Препарат лечения Срок очищения от гноя, сут Срок полного заживления, сут.

1 Бакгиспоринпласт (местно) 6,4±0,1 15,6±0,5

2 Бактиспорин сухой (перорально) 7,4±0,3 16,9+0,4

3 Коллагеновая губка (местно) 9,8±0,4 19,0±0,8

4 Контроль 12,6±0,4 21,6±1,0

Значимость различий Р1.2<0,05 Pi.3S0.05 Рм<0,05 Рм<0,05 Р2-»<0,05 Рз^<0,05 Р1-2<0,05 Р1.з<0,05 Ры<0,05 Рг.з<0,05 Р2^<0,05 Рз-4<0,05

На седьмые сутки в 3 группе воспалительная реакция была слабо выражена, а в 1 и 2 группах - практически отсутствовала. В 4 группе состояние ран практически не изменилось, края раны были инфильтрированы, количество гноя и некротических масс немного уменьшилось.

На одиннадцатые сутки у животных 1 и 2 групп к этому времени раны были чистыми, активно гранулировали. В 3 группе у большинства животных раны очистились, гранулировали. У крыс 4 группы уменьшился отек краев ран, гнойного отделяемого стало меньше, появились единичные грануляции.

Таким образом, наиболее эффективным ранозаживляюшим средством для местного лечения гнойных ран является бактиспоринпласт. Лечебный эффект при применении «Бактиспорина сухого» и коллагеновой губки был ниже.

Следующим этапом исследования было изучение ранозаживляющего действия бактиспоринпласта на модели гнойной плоскостной раны, которую формировали согласно методу описанному выше. После вшивания фторопластового кольца на рану наносили 0,5 мл микробной взвеси S. aureus в концентрации 5х109 кл/мл. Лечение начинали после нагноения раны (на 4-е сутки). Результаты регистрировали по срокам заживления (в сут.), сокращению площади ран, морфологическим исследованиям раны. Одну группу крыс, как группу сравнения, лечили ранозаживляюшим средством - мазью левомеколь, поскольку она в настоящее время широко применяется в клинической хирургии.

Динамику раневого процесса оценивали по регрессу воспалительного процесса, срокам очищения раны от гнойно - некротических масс, появлению грануляций, эпителизации, срокам полного восстановления кожного прокрова. Полученные результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8. Продолжительность раневого процесса у крыс с гнойными плоскостными

ранами кожных покровов

№ труп пы Препарат Очищение от гноя, сут Появление грануляционной ткани,сут Срок появления эпителизации, сут Срок полного заживления, сут

1 Бактиспорин пласт 7,3+0,1 6,2±0,7 11,2±0,б 16,1+0,7

2 Бактиспорин сухой 8,2±0,3 7,8±0,9 13,5±0,7 18,6±0,7

3 Мазь левомеколь 10,5±0,3 9,9±0,8 15,7±0,6 19,8±0,8

4 Контроль 14,7±0,4 14,5+0,9 20,6±1,0 23,6±1,0

Значимость различий PI-2<0,05 Рм<0,05 Рм<0,05 Р2-з<0,05 Р2.4<0,05 Рз-4<0,05 Pi-2>0,05 PI З<0,05 Рм<0,05 Р2-З<0,05 Р2-4<0,05 Рз-£0,05 Pt.2>0,05 Pi.3<0,05 Ры<0,05 Р2.з<0,05 Р24<0,05 Рз-4<0,05 PI-2<0,05 PI З<0,05 Рм<0,05 Р2-з>0,05 Р2.4<0,05 РЗ-4<0,05

Сопоставление показателей, представленных в таблице 8, свидетельствуют о том, что наибольшей терапевтической эффективностью обладал бактиспоринпласт. При его применении формирование и рост грануляционной ткани визуально определяли уже на 6-е сутки с момента лечения. Ранние сроки развития грануляционной ткани способствуют более ранней эпителизации. Окончательное заживление наступало на 16-17 сутки, в то время как в группе сравнения: применение бактиспорина сухого - на 18-19 сутки, лечение мазью левомеколь - на 19-20 сутки, а в контрольной группе - на 24 сутки.

Таким образом, наши исследования показали эффективность бактиспоринпласта при лечении гнойной, плоскостной раны в результате комплексного лечебного эффекта антагонистически активных бактерий В. subtilis и коллагена на репаративные процессы. ВЫВОДЫ

1. Разработан новый иммунобиологический препарат - бактиспоринпласт, на основе коллагена и концентрата биомассы бактиспорина, для местного лечения и профилактики гнойных ран.

2. Новая лекарственная форма не изменяет морфологических и биохимических свойств штамма В. subtilis.

3 Разработанная технология получения бактиспоринпласта обеспечивает содержание в одной дозе препарата не менее 1х109колониеобразующих единиц.

4. Новый препарат обладает высокой антагонистической активностью по отношению к тест-шгаммам Staphylococcus aureus «Никифоров», Staphylococcus aureus «Филипов», Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Escherichia coli 157, Shigella flexneri, составляет 11-20 мм, а к грибам Candida albicans 25 - 34 мм.

5. Созданная лекарственная форма - бактиспоринпласт стабильна при хранении в течении 2 лет при температуре (4-22) °С.

6. Бактиспоринпласт безвреден, не обладает местнораздражаюшим и аллергизирующим действием.

7. Применение бактиспоринплаета при лечении экспериментальных условно-чистых и гнойных ран у животных стимулирует репаративные процессы и позволяет сократить сроки заживления.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Салихова Н.Х., Лукманова К.А., Гиззатуллина Ф.З., Янгирова 3.3. Разработка и испытание гелей для создания твердых лекарственных форм.// Научный прорыв -2002, посвященный Году Здоровья, 70-летию БГМУ и Дню Республики: Сборник научных трудов конференции ученых РБ. - Уфа,2002. - С. 18-21.

2. Алсынбаев М.М., Салихова Н.Х., Абдуллин А.И., Янгирова З.З., Зайнутдинова Ф.Н. Лабораторно-клиническое исследование терапевтической эффективности коллагеновых губок// Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке./ Матер. Всерос. науч. конф. Пермь, 2003. - С. 332 - 335.

3. Салихова Н.Х., Варламова Т.И., Щевелева Ж.М., Янгирова З.З., Гиззатуллина Ф.З. Биотехнологические аспекты создания твердых лекарственных форм для местного применения// Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке. Матер. Всерос. науч. Конф. Пермь, 2003. - С.344 -346.

4. Лукманова К.А., Кузнецова Т.Н., Салихова Н.Х., Янгирова З.З., Нигматуллин Т.Г. Бактерийные иммунобиологические препараты для местного применения// Матер. Межрегиональной науч. конф, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С. .П. Карпова. Тезисы докладов (7-10 октября, 2003). / Томск, 2003,-С.145 -146.

5. Салихова Н.Х., Янгирова З.З., Зайнутдинова Ф.Н., Лукманова К.А., Нигматуллин Т.Г., Истранов Л.П., Абоянц Р.К. Биохимические подходы к созданию твердых ранозаживляющих покрытий// Биохимия: от исследования молекулярных механизмов до внедрения в клиническую практику и производство./ Матер. Межрегиональной конф. биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья. -Оренбург, 2003. - С.464 - 467.

6. Янгирова 3.3., Зайнутдинова Ф.Н., Салихова Н.Х., Лукманова К.А. Разработка технологии получения новой лекарственной формы бактиспорина-

Бактиспоринпласта// Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии / Матер. Всероссийской науч. конф. молодых ученых.-Уфа, 2004 -С. 103-105.

7. Янгирова 3.3., Зайнутдинова Ф.Н., Лукманова К.А., Кузнецова Т.Н. Исследование антибактериальной активности Бактиспоринпласта// Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии / Матер. Всероссийской науч. конф. молодых ученых.-Уфа, 2004.-С.105-107

8. Янгирова 3.3., Зайнутдинова Ф.Н., Лукманова К.А., Кызина Н.В., Нигматуллин Т.Г. Токсикофармакологическое изучение Бактиспоринпласта// Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии / Матер. Всероссийской науч. конф. молодых ученых.-Уфа, 2004.-С.224-226.

9. Салихова Н.Х., Абдуллин А.И., Янгирова 3.3., Хафизов P.M., Лукманова К.А. Опыт коллагенопластики в местном лечении гнойных ран// Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии / Матер. Всеросс. науч. конф. молодых ученых - Уфа, 2004.-С. 185-186.

10. Янгирова 3.3., Зайнутдинова Ф.Н., Салихова Н.Х., Лукманова К.А., Кузнецова Т.Н., Нигматуллин Т.Г. Бактиспоринпласт - новый препарат для лечения гнойных ран// Человек и лекарство, 2004.- С. 854.

11. Янгирова 3.3 Микробиологический препарат для лечения ран// Материалы II конкурса научных работ молодых ученых и аспирантов УНЦ РАН и АН РБ, Уфа: Гилем, 2004. - С. 71-73.

12. Лукманова К.А., Янгирова 3.3., Салихова Н.Х., Зайнутдинова Ф.Н., Гиззатуллина Ф.З., Нигматуллин Т.Г. Изучение ранозаживляющего действия твердых лекарственных форм иммунобиологических препаратов для местного применения// Экспериментальная и клиническая фармакология, 2004. - Том 67 - №3 -С.73-75.

13. Лукманова К.А., Янгирова 3.3., Салихова Н.Х., Магазов Р.Ш. Обоснование состава, технологии и стандартизации оригинальных лекарственных форм интерферона и бактиспорина// ЖМЭИ- 2005. - № 5 (принята к печати).

Р-5 378

РНБ Русский фонд

2006-4 5233

Подписано в печать 25.03 05 г. Формат £0x84 '/« Бумаг: белая 80 т/ьг Отпечатано на ризографе Уел лея. л. 1,5 Тираж 100 эаз. Заказ М 538

ПД№ 7-0159 от 25.05.01 г Отпечатано а ООО «Виртуая» с готового орягинал-макгтэ 450000, г Уфа, ул. Легаша, 14/16 Тел 51-04-27, тел./факс 51-11-71

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Янгирова, Земфира Закарияновна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Использование бактерий рода Bacillus в медицине.

Глава 2. Ранозаживляющие лекарственные средства

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Материалы исследований.

3.2. Методы исследований.

Глава 4. Обоснование состава и разработка технологии бактиспоринп ласта.

4.1. Обоснование состава бактиспоринпласта и гомогенизация композиции коллаген — концентрат бактиспорина.

4.2. Разработка режима сублимационного высушивания композиции.

Глава 5. Изучение биологических, физико-химических свойств препарата.

5.1. Изучение специфической активности бактиспоринпласта.

5.2. Изучение физико-химических свойств препарата.

5.3. Изучение стабильности бактиспоринпласта.

Глава 6. Изучение ранозаживляющего действия бактиспоринпласта.

Глава 7. Исследование безвредности нового препарата.

7.1. Исследование хронической токсичности бактиспоринпласта.

7.2. Изучение местного раздражающуго действия на слизистые. оболочки.1.

7.3. Исследование аллергизирующего действия препарата.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и изучение иммунобиологических свойств нового лекарственного средства - бактиспоринпласта"

Актуальность темы. Профилактика и лечение гнойных ран является одной из важных задач современной научной и клинической медицины, так как ежегодно в России и странах СНГ регистрируется около 5 млн. больных с гнойно-воспалительными заболеваниями (А. А. Воробьев и др., 1996). В связи с повышением устойчивости бактерий к антибиотикам, возникла необходимость разработки альтернативных лечебно-профилактических мероприятий, среди которых важное место занимает использование -пробиотиков, в том числе из бактерий рода Bacillus, обладающих антимикробной активностью. Бактерии В. subtilis продуцируют более 70 различных антибиотиков (В.В. Смирнов и др., 1982, 2001). Лабильность структуры антибиотического вещества, продуцируемого живой бактериальной клеткой, предотвращает адаптацию возбудителя к препарату, не формируются устойчивые штаммы инфекционных агентов. Использование живых бактериальных клеток, продуцирующих широкий спектр антибиотиков в минимальных количествах, предотвращает подавление местного и системного иммунитета и развитие побочных осложнений в виде дисбактериоза или аллергических реакций (В.В. Смирнов, 2002; В.И. Никитенко, 2002).

Антибактериальная активность бактерий рода Bacillus усиливается действием продуцируемых литических ферментов, активно лизирующих клетки как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Синтезируемые этими бактериями протеолитические ферменты стимулируют регенерационные процессы тканей теплокровных, обладают тромболитическим действием (В.В. Смирнов, 2001). Пробиотики из бактерий рода Bacillus широко представлены препаратами для перорального применения. Однако их сложно использовать местно для лечения ран.

В последнее время получило развитие новое направление в совершенствовании лекарственных форм для местного лечения ран -разработка аппликационных покрытий для эпидермального введения биологически активных соединений в организм. Наиболее перспективным направлением является создание раневых покрытий на основе биодеградируемого природного полимера коллагена (Л.П. Истранов, 1984; Р.К. Абоянц, 1999; А.Б. Шехтер,1999).

Цель исследования

Создание нового иммунобиологического препарата — бактиспоринпласта, изучение его специфической и фармакологической активностей.

Задачи исследования

Разработать медицинский микробиологический препарат на основе бактерий В. subtilis ЗН в форме коллагеновой губки для местного лечения ран и профилактики гнойных осложнений.

Изучить биологические свойства созданного препарата: количество живых клеток Bacillus subtilis, антагонистическую активность в отношении тестовых штаммов условно-патогенных микроорганизмов.

Определить оптимальные условия хранения и срок годности — бактиспоринпласта.

Провести оценку безвредности созданного препарата.

Изучить ранозаживляющую эффективность аппликационного лекарственного средства на животных.

Научная новизна

Впервые: разработана технология получения нового ранозаживляющего лекарственного средства бактиспоринпласта для местного применения;

- установлена стабильность биологических свойств бактерий штамма В. subtilis ЗН в созданной лекарственной форме;

- показано, что бактиспоринпласт обладает высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенных бактерий;

Научно-практическая значимость

1. Создан новый препарат — Бактиспоринпласт для профилактики осложнений и лечения гнойных ран, показана его эффективность при заживлении экспериментальных ран у животных.

2. По результатам исследований разработана нормативно-техническая документация на Бактиспоринпласт.

3. Изготовлены экспериментально — производственные серии нового препарата - Бактиспоринпласта.

Основные положения, выносимые на защиту

- Новая лекарственная форма превосходит по ранозаживляющей активности пероральный препарат — «Бактиспорин сухой», а по спектру антибактериальной активности, стабильности не уступает ему.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на II конкурсе научных работ молодых ученых и аспирантов АН РБ и УНЦ РАН (Уфа, 2003); Межрегиональной науч. конф, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П.Карпова. (Томск, 2003), Межрегиональной конф. биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья. (Оренбург, 2003), Всероссийской научной конференции молодых ученых. — «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 2 в центральной печати: «Экспериментальная и клиническая фармакология» и ЖМЭИ.

Объем и структура диссертационной работы.

Диссертация изложена на 132 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 22 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы (2 главы), раздела собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и библиографического списка литературы, содержащего 182 источника, в том числе 121 отечественных и 61 зарубежных работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Янгирова, Земфира Закарияновна

ВЫВОДЫ

1. Разработан Бактиспоринпласт - новый иммунобиологический препарат, на основе коллагена и концентрата биомассы бактиспорина, для местного лечения ран, профилактики гнойных осложнений.

2. Новая лекарственная форма не изменяет морфологических и биохимических свойств штамма Bacillus subtilis.

3. Разработанная технология получения Бактиспоринпласта обеспечивает содержание в одной дозе препарата не менее 1x109 колониеобразующих единиц.

4. Новый препарат обладает высокой антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам Staphylococcus aureus «Никифоров», Staphylococcus aureus «Филипов», Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Escherichia coli 157, Shigella flexneri, зона задержки роста составляет 11-20 мм, а грибов Candida albicans 25 - 34 мм.

5. Созданная лекарственная форма — Бактиспоринпласт стабильна при хранении в течение 2 лет при температуре (4-22) °С.

6. Бактиспоринпласт безвреден, не обладает местнораздражающим и аллергизирующим действием.

7. Применение Бактиспоринпласта при лечении экспериментальных условно-чистых и гнойных ран у животных стимулирует репаративные процессы и позволяет сократить сроки заживления.

Заключение

Проблема профилактики и лечения гнойных ран и раневой инфекции является актуальной со времен Гиппократа и продолжает оставаться одной из наиболее важных задач современной клинической медицины.

Наблюдающееся в последние годы возрастание устойчивости патогенной микрофлоры к антибиотикам, снижение иммунологической резистентности организма человека, наличие сопутствующих заболеваний (сахарный диабет, дисбактериоз и др.), - все эти причины приводят к увеличению длительности процесса заживления ран и нарастанию вероятности раневых гнойно-воспалительных осложнений. Возникновение осложнений заметно ухудшает результаты лечения, удлиняет сроки временной нетрудоспособности, приводит к значительным экономическим потерям и нередко ухудшает качество жизни пациентов (И.А. Ерюхин, 1998). По данным ряда авторов 30-35 % всей хирургической патологии связаны с гнойной инфекцией и до 7 % из них заканчиваются летальным исходом (А.А. Воробьев и др., 2002).

Эффективность применения антибиотиков при лечении гнойно-воспалительных заболеваний снижается за счет формирования широкой резистентности к антибиотикам патогенных микроорганизмов (С.В. Сидоренко, 1999; Г.К. Решедько, 2001; Д.Дж. Дикема и др, 2001; JI.C. Страчунский, 2003; Л.Г. Воронина и др., 2004; П.В. Буданов и др., 2004). Причинами возрастания антибиотикоустойчивости микроорганизмов является нерациональное использование антибиотиков, снижение иммунитета и ухудшающаяся экология (А.М Егоров, 2001; И.В. Николаева и др., 2001; В.А. Малов, 2002; Ю.В. Лобзин и др., 2001; Klein G., 2000; Ouchi Kazunobi, 1999). Так загрязнение природных экосистем тяжелыми металлами ведет к росту антибиотикоустойчивости бактерий за счет непрямой селекции (Мс. Arthur et al., 2000).

Открытие и широкое применение новейших антибактериальных средств не только не разрешило этой проблемы, но привело к возникновению и росту устойчивой к антибиотикам флоры, что выдвинуло новые сложные задачи перед медицинской наукой и практикой здравоохранения. (В.М. Тимербулатов и др., 1997). В связи с этим возникает необходимость разработки альтернативных лечебно-профилактических мероприятий, среди которых важное место занимает местное лечение.

В качестве альтернативы антибиотикам для профилактики раневой инфекции, подавления патогенных микроорганизмов и нормализации состава микрофлоры экологических ниш организма, все больше авторов предлагают применять биопрепараты из живых сапрофитных микроорганизмов, способных оказывать выраженное антагонистическое действие на патогенную и условно-патогенную микрофлору (Н.Н. Ворошилина и др., 1983; Г.Е. Афиногенов и др., 1984; Э.В. Горшевикова и др., 1992; I.B.Saraculova et al, 1997; Г.М. Пичхадзе и др., 2000).

В качестве лекарственных средств, имеющих некоторое преимущество перед антибиотиками, могут быть использованы препараты - пробиотики, в том числе из бактерий рода Bacillus, обладающие широкой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Г.М. Пичхадзе и др., 2000; Т.М. Фурзикова и др., 2000).

Бактерии рода Bacillus характеризуются более разнообразной и выраженной антимикробной активностью, чем многие другие микроорганизмы (В.В. Смирнов и др., 2001). Этот эффект связан прежде всего с продукцией антибиотических веществ, число которых приближается к 200. Наиболее продуктивным видом бацилл является В. subtilis, которые образуют более 70 различных антибиотиков.

Описываются все новые антибиотики, продуцируемые бациллами, в т.ч. В. subtilis. Широкое разнообразие антибиотических веществ, имеющих в основном полипептидную природу, объясняется лабильностью структуры полипептида. Изменение нескольких аминокислот в полипептидной цепочке приводит к образованию нового антибиотического вещества. Поэтому выделяют группы антибиотических веществ (бацилломицины, бациллопептины и др.) (В.В. Смирнов, 1982, 1996).

Антимикробная активность бактерий рода Bacillus усиливается действием продуцируемых литических ферментов, активно лизирующих клетки как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Синтезируемые бактериями протеолитические ферменты стимулируют регенерационные процессы тканей теплокровных, обладают тромболитическим действием (В.В. Смирнов, 2001).

Бациллы продуцируют также метаболиты, например лектины, стимулирующие активность лимфоцитов и повышающие уровень эндогенного интерферона. При разных способах введения живых бацилл, выделяемые ими метаболиты, приводят к увеличению активности фагоцитов, способны оказать как локальный, так и системный иммуномодулирующий эффект (В.В. Смирнов и др., 1982, 1991, 1996, 2001).

Создание лекарственного средства на основе живых бактерий рода Bacillus решает задачу многофакторного подхода к лечению раны, включающего: антибиотическое, ранозаживляющее, противовоспалительное и иммуномодулирующее действие.

Таким образом, преимущества бактерий B.subtilis при лечении ран перед антибиотиками очевидны: под его влиянием не наступает адаптации возбудителя, и, следовательно, не формируются устойчивые штаммы, не происходит подавления иммунитета, возникновения дисбактериоза.

В ГУЛ "Иммуиопрепарат" (г. Уфа) было освоено производство препарата-пробиотика «Бактиспорин» для перорального применения на основе штамма В. subtilis ЗН. Клинические испытания Бактиспорина показали его высокую эффективность в гинекологической и урологической практике для лечения бактериального вагиноза и урогенитальных инфекций; в профилактике послеоперационных гнойно-септических осложнений; в профилактике перинатальной патологии у новорожденных, в восстановительной терапии туберкулезных больных; при лечении гастродуоденальной патологии и язвенных больных (О.В. Галимов и др., 1999; Н. С.Бродинова и др., 1999; JI. Н.Мазанкова и др. 1997г.; А.А.Фазылова и др., 1998, 1999,2000; Р.Р.Загидуллина, ГлебоваН.Н., 2000; Э.С. Симонова и др., 2000, Р.Х. Гатауллина., 2001, 2002; Р.Х. Гисматов и др, 2002; Т.В. Хасанова, 2001,2002).

По данным микробиологического исследования этот пробиотик обладает высокой антибактериальной активностью в отношении целого ряда условно — патогенной микрофлоры — гемолизирующих эшерихий, протеев, стафилококков, стрептококков, клебсиелл, псевдомонад, дрожжевых грибов и других (Михайлова Н.А. и др., 1997). Помимо пробиотических свойств, у Бактиспорина показано наличие иммунокорригирующей и ферментативной, в частности, протеолитической активности (Михайлова Н.А. и др., 1998; Хасанова Т.В., 2003).

Поэтому при создании местного ранозаживляющего средства, для нанесения на очаг повреждения, выбрали концентрат биомассы препарата Бактиспорин, в котором действующим началом является штамм B.subtilis ЗН.

Для создания местной аппликационной формы необходимо было подобрать формообразующий материал, который бы абсорбировал на себе бактериальные клетки. Изыскание безопасных аппликационных лекарственных форм для эпидермального введения биологически активных соединений в организм для лечения воспалительных заболеваний кожных и слизистых покровов представляет большой интерес. Немалое значение при создании различных носителей придается сейчас не только вопросу повышения эффективности медикаментов, но и непосредственному воздействию фиксирующих материалов на раневой процесс. Максимально отвечают вышеуказанным требованиям покрытия на основе биоадекватного природного полимера коллагена.

В лаборатории коллагеновых препаратов НИЦ ММА им. И.М.Сеченова под руководством профессора Абоянц Р.К., Истранова Л.П. и др. ведутся исследования по созданию и внедрению в медицинскую практику лечебных препаратов для местного применения. Формообразующей основой вышеназванных препаратов является коллагеновая губка. Коллаген нетоксичен, безвреден, обеспечивает медленное рассасывание раневого покрытия и пролонгированное действие лекарственного вещества в ране. Кроме того, покрытие обеспечивает защиту от инфекции и плазмопотери, выполняет дренажную функцию. Коллаген и продукты его лизиса стимулируют репаративные процессы в ране.

Для поддержания оптимальной концентрации препарата в месте введения, снижения побочных эффектов целесообразно применение лекарствееных форм пролонгированного действия на основе полимеров медицинского назначения.

Учитывая положительные свойства бактиспорина и коллагена целью работы явилось создание на основе этого природного биополимера нового оригинального отечественного препарата антибактериального и ранозаживляющего действия, а также перспектива его использования в практической медицине.

Экспериментальный раздел работы посвящен получению нового ранозаживляющего иммунобиологического препарата для местного применения, изучению его биологических свойств и клинической эффективности в модельных опытах на животных.

На первом этапе исследований было установлено, что уксуснокислый раствор коллагена совместим с концентратом бактиспорина, при этом количество живых бактерий остается стабильным в подобранных условиях гомогенизации, состава композиционной смеси и режима сублимационного высушивания коллагеновой композиции. Разработана технология получения сухой коллагеновой губки, содержащей биомассу живых бактерий Bacillus subtilis.

В результате проведенных исследований был получен препарат, получивший название «Бактиспоринпласт». Бактиспоринпласт представляет собой пористую губку размером 50 х 40 мм, толщиной от 5,0 до 9,0 мм, массой от 0,25 до 0,35 г.

Губки имеют высокую прочность, проницаемы для паров воды, сильно набухают в воде, так как в структуре материала имеются водородные, ионные, вандерваальсовы и другие слабые силы между макромолекулами и отсетствуют прочные ковалентные межмолекулярные связи; поэтому они легко растворимы и имеют низкие показатели структурной стабильности. Губки имеют большую внутреннюю поверхность, гидрофильны.

Бактерии штамма B.subtilis ЗН в бактиспоринпласте, образуют новую композицию, описания которой нет в литературе. При лиофильном высушивания бактиспоринпласта возможна сорбция или иммобилизация бактерий на коллагене. Поскольку бактерии рода Bacillus обладают выраженной адаптивной изменчивостью свойств, в зависимости от условий существования, проведено изучение стабильности основных свойств штамма B.subtilis ЗН, экстрагированного из бактиспоринпласта.

Изучение морфологических и биохимических свойств штамма B.subtilis ЗН до соединения с коллагеном и после экстракции из бактиспоринпласта показало, что свойства сравниваемых бактерий аналогичны друг другу. Т.о. установлено, что в новой лекарственной форме бактериальные клетки штамма B.subtilis не изменяют своих свойств.

На основании изучения микробиологических и биохимических свойств бактерий в бактиспоринпласте был сделан вывод о стабильности свойств микробной популяции штамма В. subtilis ЗН при изготовлении новой лекарственной формы - Бактиспоринпласта.

Экстракция бактериальных клеток физ. раствором из Бактиспоринпласта показала, что полученный препарат обладает высокой специфической активностью: количество живых бацилл в пластине составляет от 2,4'109 до 3,1*109. В тесте определения антагонистической активности зона задержки роста тест - штаммов была не менее 10 мм на всех этапах получения препарата: St. aureus — 11 — 20 мм, Pr. mirabilis — 13 — 19 мм, Pr. Vulgaris — 14-21 мм, Е. coli - 10 — 16 мм, S.flexneri — 15 — 20 мм, С. albicans 28 — 34 мм.

Установлено, В. subtilis достаточно хорошо связываются коллагеновой субстанцией, придавая ей антимикробные свойства. При определении зон задержки роста тест — штаммов ряда бактерий установлено, что В. subtilis из коллагеновой губки свободно диффундируют в питательную среду из бактиспоринпласта и обладают такой же активностью, как и бактиспорине сухом для перорального применения, при этом сорбированные белком бактерии В. subtilis постепенно высвобождаются.

Моноспоровый рассев бактериальной популяции на всех этапах получения бактиспоринпласта выявлял однотипные колонии штамма В. subtilis ЗН в R форме диаметром от 2,0 до 2,5 мм, шероховатые с волнистым краем, непрозрачные, бежевого или желтовато — бежевого цвета, сухой консистенции. Отсутствие диссоциации бактериальной популяции В. subtilis ЗН при создании новой лекарственной формы — Бактиспоринпласта, свидетельствует о стабилизации свойств бактерий иммобилизованных на коллагене и обеспечивает выраженный лечебный эффект, характерный для R-форм популяции бактерий В. subtilis (Смирнов В.В., 1982).

Следующим этапом исследований явилось изучение ранозаживляющей активности Бактиспоринпласта. Известно, что пероральный прием препаратов из споровых бактерий ускорял заживление ран (В.И. Никитенко, 1996). Бациллы из желудка проникают в кровь, лимфу, накапливаются в селезенке, лимфатических узлах, печени области очагов воспалений или ран, оказывая свое лечебно-профилактическое действие (В.И.Никитенко, 2003).

Поэтому необходимо было сравнить эффективность заживления ран при пероральном приеме препарата Бактиспорина и при использовании Бактиспоринпласта — местно. Изучение ранозаживляющей активности бактиспоринпласта провели в экспериментах на белых крысах.

В первом опыте определяли влияние коллагеновых препаратов на заживление плоскостной раны, которую создавали иссечением участка кожи с подкожной клетчаткой и подшиванием к краям раны фторопластового кольца диаметром 15 мм. Кольцо удаляли на четвертые сутки и с этого момента оценивали площадь раневой поверхности. Наиболее явным ранозаживляющим действием, обладал бактиспоринпласт. В данной группе крыс время полного заживления составлило (11,0±0,7) суток, что на 10 суток раньше чем в контрольной группе. Несколько медленнее на (13,0±2,0) сутки происходило заживление раны при пероральном применении «Бактиспорина сухого» однако существенно быстрее, чем при использовании коллагеновой губки без препарата - на (17,0±2,0) сутки. Применение препаратов во всех случаях приводило к ускоренному восстановлению раневой поверхности в сравнении с контрольной группой (23,0±1,7) сут.

Т.о. использование нового местного ранозаживляющего средства «Бактиспоринпласт» превышало по эффективности пероральное действие известного препарата пробиотика «Бактиспорна». Кроме этого, использование Бактиспорина вызывает бессимптомную бактериемию, как и применение любого другого препарата-пробиотика из спорообразующих бактерий рода Bacillus (Смирнов В.В., 1986; Никитенко В.И., 2003). Явление бактеримии не всегда проходит бессимптомно для организма, прием препаратов из спорообразующих бактерий иногда сопровождаются побочными явлениями, в том числе эндокардитами, пиелонефритами и др. (Смирнов В.В., 1982). Использование же Бактиспоринпласга, как показали наши исследования, не сопровождается проникновением бактериальных клеток в кровяное русло, т.е. является более безопасным способом использования бактериального препарата из бактерий рода Bacillus

Проведенные исследования лечения гнойных ран, во втором опыте на крысах, подтвердили полученные ранее результаты. Ранозаживляющая эффективность была изучена на моделях гнойной раны (абсцесса и плоскостной), в качестве инфицирующего материала использовали патогенную культуру S. aureus в концентрации 3,6-109 кл/мл. Для развития гнойного процесса культура стафилококка была выбрана исходя из того обстоятельства, что по данным исследований, проведенных в Институте хирургии им. А.А.Вишневского (Кузин М.И. и др., 1979; Патритий В.К. и др., 1991, Хасанова Т.В., 2003), основными возбудителями острых гнойных заболеваний мягких тканей являются грамположительные бактерии и, прежде всего, S. aureus. Частота выделения стафилококков при гнойных осложнениях ран достигает 91,5 %.

Наиболее высокий показатель скорости заживления ран отмечен при использовании бактиспоринпласга - 8,2±0,5 % за одни сутки. При этом определение СЗР по фазам раневого процесса выявило интересный факт: наибольший показатель во второй фазе отметили в группе, где использовали пластины Люцерон (12,4±0,5 %), и группе бактиспоринпласт - 11,2±0,4 % за сутки. Исследования сроков очищения от гнойно-некротических масс экспериментальных гнойных плоскостных ран показали, что в группе, где применяли бактиспоринпласт срок очищения составил — 7,3±0,1 сут., Бактиспорин сухой - 8,2±0,3 сут., пластину Люцерон - 10,9±0,3 сут., мазь левомеколь - 10,5±0,3 сут., в контрольной группе - 14,7±0,4 сут Из проведенных исследований следовало, что Бактиспоринпласт наиболее эффективно вызывал заживление гнойной раны.

Эффективность нового противораневого средства Бактиспоринпласта обеспечивается комплексным действием коллагена и живых бактериальных клеток. Подавление инфекции в ране, отторжение и расплавление некротических тканей обеспечивают бактерии В. subtilis, освобождающиеся при лизисе губки и выделяющие антибиотические вещества, подавляющие рост наиболее часто встречающихся возбудителей хирургической инфекции. Живые бактериальные клетки вырабатывают протеолитические ферменты, способствующие некролизу поврежденных тканей, выделяют биологически активные вещества, нормализующие гомеостаз в ране. (В.В. Смирнов, 2002). Коллаген вызывает адсорбцию продуктов микробного и тканевого распада, способствует очищению раны, пролонгирует выделение бактерий В. Subtilis в ране. Сочетание действия живых метаболически - активных бактерий в ране с влиянием коллагена оказывает комплексный лечебный эффект.

Бактиспоринпласт уменьшает воспалительные явления, активизирует реакцию макрофагов, стимулирует пролиферацию и дифференцировку фибробластов, фибриллогенез, созревание грануляционной ткани и эпителизацию. Препарат оказывает стабилизирующее воздействие на процессы регенерации тканей кожи и их производных. На фоне благоприятного течения всех трех фаз воспалительного процесса отмечается восстановление кровообращения раневой зоны кожи с одновременным развитием капиллярной сети дермы кожи, способствующей восстановлению метаболического процесса регенерирующих тканей кожи. Бактиспоринпласт обладает, прежде всего, антибактериальным свойством, этим самым он помогает в первые часы после травмы защитным свойствам нейтрофильных лейкоцитов, макрофагов, плазматических клеток и многих других клеточных структур. Также бактиспоринпласт содержит в своем составе белок коллаген, влияющий на метаболизм клеток, с которыми он контактирует, оказывает регуляторное воздействие на различные клеточные структуры. В то же время, элементы лизиса коллагеновых волокон являются ориентиром для клеток при их размножении и дифференцировке.

Поскольку при пероральном приеме бактиспорина происходит бессимптомная транслокация штамма B.subtilis через слизистые оболочки желудка в кровь в количестве до 1/1000 (В. И. Никитенко, 2003; В. В. Смирнов, 2001), нами проведено исследование возможности проникновения микроорганизмов в кровь, при местном применении коллагеновых пластин с В. subtilis. Для этого на раневую поверхность животных накладывали бактиспоринпласт с последующим забором венозной крови в динамике. Нанесение препарата на раневую поверхность крыс не приводило к появлению бактерий в крови через 15, 30, 60, 120 минут и через 24 часа. Таким образом, использование бактиспоринпласта на моделях условно-чистых и гнойных ран крыс не сопровождается проникновением микроорганизмов из губки в кровоток, что свидетельствует об отсутствии опасности сепсиса при использовании препарата путем непосредственного наложения на рану.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Янгирова, Земфира Закарияновна, Уфа

1. Ахапкина И.Г., Бутова Л.Г., Фомкина И.П., Блинкова Л.П. Штамм Bacillus subtilis- продуцент фунгицидного вещества// ЖМЭИ. 1995. -N 17.-С. 91-92.

2. Бабенко Ю.С., Соколова И.Е., Гниломедова JI.E. Химиотерапевтичекая активность литических ферментов при стафилококковой инфекции // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - Т.35, N. 11. - С. 9-11.

3. Берченко Г.Н., Кесян Г.А. Влияние коллагеновых препаратов на заживление гнойных ран больных / Г.Н.Берченко, Г.А.Кесян. // Клинический опыт и проблемы коллагенопластики: Матер, науч. -практич. конф. М., 1999. - С. 48 - 49.

4. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, П.Ф. Коровкин. М.: Медицина, 1990. - 528 е., 73 Ленинджер А.Л. Основы биохимии: В 3-х т. / Пер. с англ. — М.: Мир, 1985. — Т.1. — 367 с.

5. Бизюлявичюс А.С., Кислухина О.В. Литические ферменты в ветеринарии. Обзор литературы // Ветеринария. 1988. - N 3.- С.56-59.

6. Бизюлявичюс А.С., Шаблинская А.И., Жукайте В.П., Кислухина О.В. Антибактериальный спектр лизосубтилина Г10Х // Антибиотики и химмиотерапия. 1989. - Т.34, N 8. - С. 579-581.

7. Богданова Л.А., Быстрова Т.Н., Гончар A.M. и др. Иммобилизованные ферменты для медицины и ветеринарии // Науч. приют, разраб. (Генетика, селекция, биотехнол.): Ин-т цитол. и генет. СО РАН. -Новосибирск. - 1997. - С. 70.

8. Богомолова Н.С. Клиническое значение неферментирующих бактерий, выделенных из внешней среды хирургического стационара / Н.С. Богомолова, Т.Я. Пхакадзе // Хирургия. — 1990. №6. — С. 47-50.

9. Ю.Винник Ю.С., Перьянова О.П., Якимов С.В. и др., Метод лечения гнойных ран с использованием антагонистов. /International journal on immunorehabilitation. 1998. - № 4., С. 143.

10. П.Виханский Ю.Д., Ярулин В.Р., Есипова В.В. и др. Селекционное и физиологическое исследование культуры Bacillus circulans продуцента бутирозина // Антибиотики и химиотерапия. 1992. - Т. 37, N 6. - С. 5-7.

11. Влияние абсорбирующих материалов с лекарственными препаратами на раневой процесс / В.М. Буянов, В.Н. Егиев, А.Я. Акимова, И.В. Грицкова // Хирургия. 1993. - №11. - С. 7-10.

12. Воленко А.В. Иммобилизованные порошкообразные препараты для профилактики нагноений хирургических ран / А.В. Воленко, В.В. Бровкин // Альманах клинической медицины. 1999. - С. 122-126.

13. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопас-ности. ССБТ. ГОСТ 12.1.007-76., М., 1976; Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологи-ческого эффекта.-Л., 1963 г.-С.81-106.

14. Вьюницкая Б.А., Бойко Н.В., Спивак Н.Я., Ганова Л.А./ Некоторые механизмы действия новых микробиотиков.// Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства.: Сборник тезисов. — Алма-Ата, 1990. — С. 17.

15. Герольд М. Антибиотики // М., Медицина. 1966. - 405 с.

16. Гирголав С.С. Огнестрельная рана.- Л.: Воен.-мед. акад., 1956.-330 с

17. Гисматов Р.Х. Иммуномодулирующее действие бактиспорина при комплексной терапии туберкулеза легких. Автореф. дисс. к-та мед. наук./ Гисматов Р.Х. — Уфа, 2004 г.

18. Глянцев С.П., Саввина Т.В., Заец Т.Л. Сравнительное изучение активности протеолитических ферментов, применяемых в хирургии для очищения гнойных ран // Бюлл. экспер. биол. и медицины. 1996. -N6.-С. 716-720.

19. Д. Дж. Дикема. Использование антибактериальных препаратов и антибиотикорезистентность у Streptococcus pneumoniae. // Клиническая микробиология и антимикробная терапия. — 2001 г. — Т.З. № 2 — С. 126-132.

20. Добыш С.В. Современные перевязочные средства для лечения ран во второй фазе раневого процесса / С.В. Добыш, А.В. Васильев, О.В. Шурупова // Материалы Международной конференции / Под ред. В.Д. Федорова, А.А. Адамяна. М., 2001. - С. 115.

21. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. — М., Высшая школа, 1986 г.-447 с.

22. Ежов В.А., Козловский А.Г., Кулаев И.С. и др. Лизомаст новый ветеринарный препарат // 2 Съезд Биохим. о-ва РАН, Москва, 19-23 мая, 1997: Тез. стенд, сообщ. Ч. 2. - Пущино. - 1997. - С. 494-495.

23. Ерюхин И.А. Инфекции в хирургии. Старая проблема накануне нового тысячелетия (ч.1)//Вестн. хир. 1998. - № 1 . — С. 85-91.

24. Ерюхин И.А. Хирургические инфекции: Руководство / И.А. Ерюхин, Б.Р. Гельфанд, С.А. Шляпников. СПб.: Питер, 2003. - 864 с.

25. Жолнер Л.Г., Павлова И.Н., Тиньянова Н.З. Протеазы и их роль в литической активности термофильного штамма Bacillus sp. 86. // Микробиол. ж. 1988. - Т. 50, № 1. - С. 20-25.

26. Захарова И.Я., Павлова Е.Н. Секреторные гидролазы термофильных бацилл, проявляющих литические свойства / Биосинтез ферментов микроорганизмов: Тез. докл. 4 Всес. конф. Ташкент, 19-22 сент., 1988. - Ташкент. - С. 11-12.

27. Иванова Л.А. Экспериментально-теоретическое обоснование применения коллагена в технологии лекарственных форм. Автореф. дисс. док-pa фарм. наук./ Л.А. Иванова— Москва, 1981. — 36 с.

28. Ильин Г.И., Москвичев Б.В. Производство ферментных препаратов микробного синтеза для медицины // Сб. статей: Ферменты микроорганизмов. М., ВНИИСЭНТИ. - 1989. - С. 320.

29. Интраоперационная профилактика раневых гнойно-воспалительных осложнений./Тимербулатов В.М., Плечев В.В., Корнилаев П.Г., Муртазин З.Я. Уфа, БГМУ, НПО «Башбиомед», 1997. - С. 5,58.

30. Исследование биологически активных покрытий на основе коллагена / Р.Г.Мурадян, И.А.Чекмарева, А.А.Адамян, Б.В.Втюрин и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. 1995. - № 11. - С. 529 - 531.

31. Истранова Е.В., Абоянц Р.К., Истранов Л.П. Ихтиокол — новая субстанция коллагена //Фармация. — 2004, № 5. — С. 34-36.

32. Каспаров А.А. Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду / А.А. Каспаров, И.В. Саноцкий. М., 1986. - 426 с.

33. Кислухина О.В., Калунянц К.А., Авиженис В.Ю. Технология производства лизосубтилина ГЗ X // Тезисы докладов ВНИИИ биосинтеза белковых веществ. 1974. - Вып. 2. - С. 77-83.

34. Кислухина О.В., Маргарян Б.А. Способ получения литических ферментов // А. с. N 749890Б. 1980.

35. Клинические аспекты хирургической анатомии и экспериментальной хирургии / Абоянц Р.К. , Белова JI.A., Смольяницкий А.Я. и др. // М., 1979 г.- С.134-136.

36. Коллагенопластика в медицине. Под ред. Кованова В.В., Сыченикова И.А М.: Мед., 1978 г. - 256с.

37. Коллагеновая губка "Цитотимакол" стимулятор заживления ран / В.В. Малинин, М.А. Буракова, Н.Д. Сидорова и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 1998. - №11. - С. 54-56.

38. Коллагенопластика в медицине. / Коллагенопластика: 30-летний опыт применения коллагена в медицине / Р.К. Абоянц, Л.П. Истранов, Т.Г. Руденко, А.Б. Шехтер // Клинический опыт и проблемы коллагенопластики: Тез. науч.-практич. конф. — М., 1999. С. 5-8.

39. Конычев А.В. Особенности микрофлоры гнойных ран в большом городе / А.В. Конычев, О.Б. Бегишев, Т.П. Лебедева // Вестн. хирургии им. И.И. Грекова. 1991. - №4.- С. 28-31.

40. Красильников А.П. Сопоставление показателей антибактериальной активности антибиотиков и антисептиков / А.П. Красильников, А.А. Адарченко, О.П. Собещук // Госпитальные инфекции и лекарственная устойчивость микроорганизмов. — М., 1992. — С. 72-74.

41. Кудря В.А., Колтукова Н.В., Захарова И.Я. Иммобилизованная эластотераза // Микробиол. ж. 1994. - Т. 56, Т 1. - С. 70-71.

42. Кулаев И.С. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине // Сорос, образ, ж. 1997. - N 3. -С. 23-31.

43. Кузин М.И. Раны и раневая инфекция / М.И. Кузин, Б.М. Костюченок -М.: Медицина, 1990. 592 с.

44. Лечение гнойных ран гелевином и биологически активными сорбентами / А.А. Адамян, С.В. Добыш, С.П. Глянцев и др. // Хирургия. 1998. - №3. - С. 28-30.

45. Лечение ран у детей./Исаков Ю.Ф., Немсадзе В.П., Кузнечихин Е.П., Гинадман Г.А. // М.: Медицина, 1990. С.69-73.

46. Лившиц B.C., Зайков Г.Е. Лекарственные формы на основе биодеструктирующихся полимеров (обзор) // Хим. фарм. журнал. -1991-Т. 25-№1.-С. 15-18.

47. Лобзин Ю.В. Практические рекомендации по ведению пациентов с инфекционной диареей. // Клиническая микробиология и антимикробная терапия, 2001 г., -№ 2 — Т.З. — С. 163-180.

48. Лукин А.А., Розов А.Н., Планутене М.В. Спорообразование у шт. Bacillus lichrniformis, несинтезирующих бацитрацин и сериновые экзо и эндопротеазы // Антибиотики. 1989. - N. 12. - С. 886-889.

49. Лукманова К.А., Алсынбаев М.М., Истранов Л.П., Истранова Е.В., Абоянц Р.К. Ранозаживляющее покрытие. Патент РФ №2116079. Бюлл., 1998.-№ 21.

50. Мазанкова Л.Н., Михайлова Н.А., Курохтина И.С. и др. Бактиспорин -новый пробиотик для лечения острых кишечных инфекций у детей// Человек и лекарство: Тез. докл. Y Российского Национального Конгресса, Москва, 8-12 апреля 1997г. М. - С. 199.

51. Мазанкова Л.И. Бактиспорин — новый пробиотик для лечения острых кишечных инфекций у детей. / Мазанкова Л.И., Михайлова Н.А., Курохтина И.С. // Тез. докл. 5 Российского Национального Конгресса: Человек и лекарство. — М., 1999 г. — С 23.

52. Манжаров Н.В. Местная подготовка глубоких ожогов к оперативному лечению / Н.В. Манжаров // Актуальные вопросы комбустиологии, реаниматологии и экстремальной медицины. Саранск, 1996. - С. 8889.

53. Местное применение эубиотиков при комплексном лечении гнойной раны челюстно-лицевой области / Е.И. Дерябин, Т.В. Мацулевич, Ю.В. Козьминых, Ю.А. Кормухин // Стоматология. 2000. - №6. - С. 31-34.

54. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания — высушивания биологических препаратов / И.В.Звягин, И.А.Хорьков, Э.Ф.Токарик и др. М., 1981. - 34с.

55. Нарциссов Т.В. Местное лечение гнойных ран / Т.В. Нарциссов, А.В. Старицкий, Н.И. Василенко // Клин, хирургия. 1992. - №1. - С. 33-35.

56. Нечаев Э.А. Хирургическая инфекция клиника, диагностика, лечение: Руководство для военных врачей. - М., 1993. - 296 с.

57. Николаева И В. Лекарственная устойчивость штаммов Staphylococcus aureus, выделенных у детей с дисбактериозом кишечника. // ЖМЭИ, -№ 1-С. 9-13.

58. Никитенко В.И. Вместо лекарств бактерии. // Наука в СССР. — 1991 г. -№ 4 С. 116-121.

59. Орлова М.В., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н. и др. Антибактериальная активность Bacillus laterosporus // Биотехнология. 1995. — N 1-2. - С. 22-26.

60. Пирузян Л.А., Михайловский Е.М. Сапрофитная микрофлора в качестве продуцента биологически активных веществ для целей микробной сапрофитной фармакотерапии. // Известия Академии наук, серия Биологическая. 1992. - N 6. - С. 860-869.

61. Пичхадзе Г.М., Русанов В.П., Новоселов В.Е. Антагонистическая активность эубиотика Максимилин к раневой инфекции и его влияние на резистентность микроорганизмов к антибиотикам. // Стоматология, 2000 г. 79 - № 4, С. 22-27.

62. Полонская М.В. Коллаген вспомогательное вещество в производстве готовых лекарственных средств / М.В.Полонская, Л.С.Новикова, Г.В.Беляева // Материалы научного форума общественного движения «Здоровый мир».-Спб., 1998.- С. 131.

63. Применение биоспорина в лечении экспериментальной гнойной раны / Э.В. Горшевикова, Ю.А. Фурманов, А.Т. Слабоспицкая и др. // Клиническая хирургия. 1992. - № 9-10. - С. 30-32.

64. Применение раневых покрытий для лечения ожоговых ран /А.А. Алексеев, А.Э. Бобровников, М.Г. Крутикова и др. // Российский медицинский журнал. — 2004. № 1. — С. 26-30.

65. Пхакадзе Т.Я. Новые антисептики и дезинфектанты в хирургии / Т.Я. Пхакадзе, Н.С. Богомолова, Л.И. Виноградова // Хирургия. 1996. -№ 1. - С. 52-57.

66. Рахманов Р.К. Местное лечение гнойных ран кукумазимом / Р.К. Рахманов, Ж.А. Нарчаев, Х.К. Абдурахманов // Вестн. хирургии им. И.И. Грекова. 2002. - Т.161, №4. - С. 74-75.

67. Решедько Г.К. Механизмы резистентности к аминогликозидам у нозокомиальных грамотрицательных бактерий в России: результаты многоцентрового исследования. // Клиническая микробиология и антимикробная терапия. — № 2 — Т. 3 — 2001 г. — С. 111 -125.

68. Руководство по иммунологическим и аллергологическим методам в гигиенических исследованиях / Федосеева в.н., Порядин Г.В., Ковальчук JI.B. и др. // М., Промедэк, 1993.-320 с.

69. Салганик Р.И., Гончар A.M., Троицкий А.В. Композиция для ферментативного гидролиза белков // Пат. N 2003346, Россия А 61К 37/54. Опубл. 30.11.93. - Бюл. N 43.

70. Сангвикол новая лекарственная форма сангвиритрина / Е.В. Истранова, С.В. Чернова, Р.К. Абоянц идр. // Фармация, 2002. - № 4. — С.27 - 29

71. Свечникова Е.Б., Максютова Л.Ф., Хунафин С.Н. и др., Опыт использования бактиспорина в комплексном лечении детей с термической травмой.//Тез. докл.: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Санкт - П. — 1999 г. -С. 268.

72. Серов В.В. Соединительная ткань: функциональная морфология и общая патология / В.В. Серов, А.Б. Шехтер. М.: Медицина, 1981. -310с.

73. Слабоспицкая А.Т. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов / А.Т. Слабоспицкая, С.С. Крымовская, С.Р. Резник // Микробиологический журнал. 1990. - №2. - С. 9-14.

74. Слуцкий Л.И. Матрикс соединительной ткани как механохимическая конструкция / Л.И. Слуцкий // Теоретические вопросы травматологии и ортопедии. М., 1990. - С. 3-19.

75. Смирнов В.В. Бактерии рода Bacillus — перспективный источник биологически активных веществ./ Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Пинчук И.В.// М1кробюлог. Журнал. 2001 г. - Т. 63, № 1 - С. 72-78.

76. Смирнов В.В. О некоторых механизмах возникновения бессимптомной бактеримии.// Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б.// Микробиологический журнал. — 1988 г. — Т. 50, № 6. — С. 56-59.

77. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. -Киев, 1982-С. 280.

78. Смирнов В.В., Резник С.Р. Спорообразующие аэробные бактерии итоги и перспективы исследований // XI Украинский Республиканский съезд микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. Одесса, 9-11 октября 1985: Тезисы докладов Киев, 1985 - Ч. 1. - С. 15-16.

79. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальныхпрепаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол.ж. 1992. - Т.54, N 6.- С. 82-92.

80. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А. и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus // Микробиол.ж. 1993. - Т. 55, N4-С. 92-112.

81. Смолянская А.З. Эпидемиология лекарственной устойчивости возбудителей в соматических клиниках / А.З. Смолянская // Антибиотики и химиотерапия. 1993. - Т.38, №6. - С. 62-66.

82. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов. // Антибиотики и химиотерапия. — 1996 г. — Т. 41, № 10 — С. 13-15.

83. Стручков В.И. Руководство по гнойной хирургии / В.И. Стручков, В.К. Гостищев, Ю.В. Стручков. М.: Медицина, 1990. — 110 с.

84. Теория и практика местного лечения гнойных ран (Проблемы лекарственной терапии) / Н.А. Ляпунов, Б.М. Даценко, Н.А. Мохерт и др. Киев, 1995. - 190 с.

85. Теория и практика местного лечения ран: Руководство для врачей / Е.П. Безуглая, С.Г. Белов, В.Г. Гунько и др. Киев: "Здоров'я", 1995. -С.383.

86. Тиньянова Н.З., Павлова И.Н., Жолнер Л.Г. Особенности биосинтеза литических ферментов термофильными бактериями / Микробиол. ж. 1988.-Т. 50,N 1. С. 15-19.

87. Фазылова А.А. Клинико-иммунологическое обоснование применение споробактерина и бактиспорина при дисбиозе кишечника у детей раннего возраста: Автореф. Дисс. к-та. мед. наук. — Уфа, 1998 г. — 26 с.

88. Фупзикова Т.М., Сорокулова И.Б. Воздействие антибиотических препаратов и их комбинаций с пробиотиками на микрофлору кишечника мышей.// М1кроб1ол. ж. 2000 г. — 62 - № 3, С. 26-35.

89. Ханин А.Г. Лечение гнойных ран коллагеном с иммобилизованным гентамицином / А.Г. Ханин, А.С. Суховеров // Хирургия. 1997. - №6. -С. 44-46.

90. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология. М., 1992. - С. 52.

91. Хасанова Т.В. Использование бактиспорина и СПСА-вакцины для профилактики и лечения гнойно-септических осложнений в хирургии. Автореф. дисс. к-та мед. наук./ Хасанова Т.В. — Уфа, 2003. — 23 с.

92. Хохлов A.M. Клинический опыт применения препарата "Дигестол" / A.M. Хохлов, Т.М. Наумова, С.В. Бычков // Клинический опыт и проблемы коллагенопластики: Тез. науч.-практич. конф. — М., 1999. С. 52-53.

93. ПЗ.Чадаев А.П. Современные методики местного медикаментозного лечения инфицированных ран / А.П. Чадаев, А.Д. Климиашвили // Хирургия. 2003. - №1. - С. 54-56.

94. Шестакова И.С. Структура и свойства коллагенов / М.: Легкая индустрия 1968.

95. Шехтер А.Б. Заживление ран как ауторегуляторный процесс и механизм стимулирующего действия коллагена / А.Б. Шехтер, А.В. Николаев, Г.Н. Берченко // Архив патологии. 1977. - №5. - С. 25-33.

96. Шехтер А.Б. Современные представления о структуре коллагена / А.Б. Шехтер, Л.П. Истранов // Архив патологии. 1970. - Т.32, № 7. - С. 3.20.

97. Шехтер А.Б. Экзогенный и эндогенный коллаген в регенерации: теоретические основы коллагенопластики // Клинический опыт и проблемы коллагенопластики. Матер, науч.-практич. конф. — М., 1999. -С. 9-11.

98. Шилова Э.О. Применение "Полисорба" и препаратов гиалуроновой кислоты в комплексном лечении гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей: Автореф. дис. канд. мед. наук. Уфа, 2002. — 22 с.

99. Яковлева М.Б., Козельцев B.JI. Протеолиз коллагена некоторыми видами микромицетов и спорообразующих бактерий // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. - Т. 30, N 1. - С. 121-126.

100. Яковлева С.Г., Марквичев Н.С., Никифорова O.K. Исследование кинетики роста В. subtilis BG 2036 // Биотехнология. 1993. - N 3. - С. 37-39.

101. Anderson L.E., Coffey G.L., Senos G.D., et al. Butirosin, a new aminoglycoside antibiotic complex. Bacterial origin and some microbiological properties // Antimicrob. Agents Chemother. 1972 - N 2. P.79-93.

102. Attinger C.E. Debridement. The key initial first step in wound healing / C.E. Attinger, E.J. Bulan // Foot Ankle Clin. 2001. - Vol. 6. - №4. - P. 627-630.

103. Bechard J., Eastwell K.C., Sholberg P.L. et al. Isolation and partial chemical characterization of an antimicrobial peptide produced by a strain of Bacillus subtilis // J. Agr. and Food Chem. 1998. - V. 46, N 12. - P. 53555361.

104. Bagnyuk V.M. The biotic role microorganisms and their application / Sth Int. Symp. Microb. Ecol. (ISMES), Kyoto, Aug. 27. Sept. 1990.

105. Barenberg S.A. Ultrastructural deformation of collagen / S.A. Barenberg, F.E. Filisko, P.H. Geil // Connect. Tiss. Rec. 1978. - Vol. 6. - P. 25-35.

106. Blaznic J, Kumel I.M., Salamum B. et al. Sdravljenje kronicne granulomotozne bolezni z acidofilnem mlecom // Zdrav.Vesth. 1976. N 45. - P. 77-79.

107. Cokon R.D., Harwood C.R., Archibald A.R. Protein export during growth of Bacillus subtilis: the effect of extracellular protease deficiency //Lett. Appl. Microbiol. 1991. - V. 12, N 3. - P. 91-94.

108. Dowsett C. The management of surgical wounds in a community setting / C. Dowsett // Br. J. Community Nurs. 2002. - Vol. 7. - P. 33-38.

109. Duckova K. Study of topical dispersions with an immunomodulatory activity / K. Duckova, M. Bukovsky, J. Kucera // STP pharma sci. 1997. -№ 3. - P. 223-228.

110. Foster S.J., Johnstone K. Pulling the trigger: the mechanism of bacterial spore germination / Mol. Microbiol. 1990. - V. 4, N. 1. P. 137-141.

111. Gilmore M.A. Phases of wound healing / M.A. Gilmore // Dimens. Oncol. Nurs. 1991. - Vol. 5. - № 3. - P. 32-34.

112. Gupta M., Kaur M., Gupta K.G. Lytic effect of Bacillus subtilis elastase ou gram-positive and negative bacteria // Indian J. Exp. Biol. 1992. - V. 30, N 5.-P. 380-383.

113. Haenel H., Bending J. Intestinal flora in health and disease // Progr. Food and Nutr. sci. 1975. - V. 21, N 1. - P. 64.

114. Hashimoto K. Ultrastructure of freeze-cleaved dermal collagen / K. Hashimoto // Acta dermato-venerol. 1974. - Vol. 54. - P. 214-248.

115. Israil A. Lantibioticele // Bacterid., virusol., parazitol., epidemiol. -1992.-V. 37,N3-4.-P. 1-8.

116. Holz C.M., Stahl U. Ribosomally synthesized antimicrobial peptides in prokaryotic and eukaiyotic organisms // Food Biotechnol. 1995. - V. 9, N 3.-P. 85-117.

117. Katz E., Demain A.L. The peptide antibiotics of Bacillus:Chemistry, biogenesis and possible function // Bacteriol. Rev. 1977. V. 41. - P. 449474.

118. Katzer W., Loeffler W., Zahner H. et al. Chlorotetaine from Bacillus subtilis (ssp. amyloliguefaciens) BGSC 1E2 // Forum Microbiol. 1990. 13, N13.-P. 81.

119. Kugler Martin, Loeffler Wolfgang, Rapp Claudius et al. Rhizocticin A, an antifungal phosphono-oligopeptide of bacillus subtilis ATCC 6633: biological properties / Arch Microbiol. 1990. - 153, N 3. P. 276-281.

120. Liu Chi-Li, Overholt Janet M. Cell wall lytic enzymes from Bacillus pabuli // Патент N 5374545 США, C12 N 9/00, публ. 20.12.94.

121. Loeffler W., Katzer W., Kremer S. et al. Gegen Pilze wirksame antibiotika der Bacillus subtilis Gruppe / Forum Microbiol. 1990. V. 13, N 13. - P. 156-158, 160-163.

122. Murao S., Takahara Y. Lytic enzymes for gram-negative bacteria produced by Bacillus subtilis YT-25//Agr. and Biol. Chem. 1973. - V. 37, N 11. - P. 2671-2673.

123. Nesemann G., Prave P., Sucatsch D., Vertesy L. Polyene antibiotic from bacteria//Natur Wissenschaffen. 1972. -V. 59.-P. 81-82.

124. Ortiz J.M. Estudios moleculares sobre hexosaminidases de origen bacteriano // Ann. Real. Acad. Farm. 1975. - V. 41, N 11. - P. 53- 157.

125. Pazlarova I., Fens L. Changes in Bacillus subtilis population during continious cultivation // Folia microbiol. 1977. - V. 22, N 6.- P. 477-482.

126. Priest F.G. Products and applications//Bacillus. New York: London. -1989.-P. 293-320.

127. Rocchietta J. The use of Bacillus subtilisin the treatment of the diseases // Minerva. Med. 1969. -V. 60, N 3/4. - P. 117-123.

128. Ross R. Human wound repair II. Inflammatory cells epithelial-mesenchymal interrelations and fibrogenesis / R. Ross, G. Odland // J. Cell. Biol. 1968. - Vol. 39. - №1. - P. 152-168.,

129. Shoji J. Recent chemical stadies on peptaid antibiotics from the genus Bacillus// Adv.Appl.Microbiol. 1978. - V. 24. - P 187-214.

130. Shuller Friederike, Benz Roland, Sahl Hans-Georg The peptide antibiotic subtilin acts by formation of voltage-dependent multi-state pores in bacterial and artificial membranes / Eur. J. Biochem. 1989. -V. 182, N 1. - C. 181186.

131. Tobiishi M., Yoshimoto Т., Tauru D. Purification and some properties of a bacteriolytic enzyme produced by Bacillus sp. ML-208 // J. Ferment. Technol. 1977. - V. 55, N 5. - P. 485-492.

132. Nozari-Renard J. Induction d 5, Olnterferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - V. 129a. - N 4. - P. 525-542.

133. Nouveax pansements dans le traitement des plaies / F. Granel, S. Reichert-Penetrat, A. Barbaud, J.L. Schmutz // Ann. Med. Nancy et Lorraine. 1999. - № 5. - P. 263-264.

134. Ono I. Effects of a collagen matrix containing prostaglandin E (1) on wound contraction / I. Ono, L.J. Zhou, T. Tateshita // J. Dermatol. Sci. -2001. Vol. 25. - № 2. - P. 106-115.

135. Ross R. The fibroblast and wound repair / R. Ross // Biol. Rev. (Cambr.). -1968. Vol. 43. - № 1. - P. 51-95.

136. Rutten H.J. Prevention of wound infection in elective colorectal surgery by local application of a gentamicin-containing collagen sponge / H.J. Rutten, P.H. Nijhuis // Eur. J. Surg. Suppl. 1997. - Vol. 578. - P. 31-35.

137. Sasaki N. Elongation mechanism of collagen fibrils and force-strain relations of tendon at each level of structural hierarchy / N. Sasaki, S. Odajima // J. Biomechanics. 1996. - Vol. 29. - № 9. - P. 1131.1136.

138. Sloma A., Rufo G.A., Pero J. Residual protease-III // Пат. N 5294542, США C12P 21/06. Опубл. 15.03.94. - НКИ 435/69.1.

139. Ward,O.P. Proteinases // in: Microbial En2ymes and Biotechnology. Applied Science. 1983, London. P. 251-317.

140. Well J.A., Ballinger M., Matthews D., Carter P. Sutilisin: A enzyme made for engineering // J. Cell. Biochem. 1995. - Suppl. 19b. P. 233.

141. Материал с медленно выделяемым из него лекарством. Патент Японии (JP) В 4-616844-6169 А 61 К 9/70 L 15/44. // 1992.

142. Antimicrobal non-woven fabric. Патент США. МКИ 4401712. Willard L. Morrison (США). 4 р.

143. BandabIe with hemostatic agent and methods вог preparing and employing the same. Патент США МКИ 4390519 P.N.Sawyer (США). — 8 p.

144. Collagenous dressing. Патент США МКИ 4407787 Axel Sterrmerger (Germany) 4 p.

145. Dominated collagen film dressing. Патент США. МКИ 3800792J/J/ Vc Knight, D.Clarc, E.Vier (США). 9 P.

146. First — aid ahesive bandage. Патент Великобритании. МКИ 2193537 A Taakaki Murata (Gr.Br.) 10 P.

147. Greco R.M. Hialuronic-acid stimulates human fibroblast proliferation within a collagen matries / R.M.Grego, J.A.Locono, H.R.Ehriich // J.CM Physiol. 1998. -V.177. -#3. - P.465 - 473.

148. Haemostatic adhesive bandage / Патент США. МКИ 4616644. Lowell Saferstein, Julius A, Lindquist, Stephen J.Wolf. (США). 7P.

149. First aid adhesive Bandage. Патент Великобритании. МКИ 2193637 Taakaki Murata (Gr. Br.) — 10 p .

150. Medical adhesive sheets. Патент США МКИ 450589l.T.Ito (Japan). -P. 10.

151. Medicated wound dressing. Патент Великобритании МКИ 2170713 A.Stefan, D.Popov, Nicolay A., Nicolay T.Komarov (Bulgaria). 3P.

152. Pharmaceutical composition. Патент США. МКИ 4615881. H.Deibig, R.Riner (Germany). 5p.

153. Process for obtaining composite pharmaceutical preparation. . Патент США. МКИ 4 4485087 // S.Otsuca, Y.Ito, T.Yoshicawa, S.Tokuda. 6p.

154. Ramachandran G.N. Structure of collagen at the molecular lever. — Treatise on collagen at the molecular lever: N.Y.Acad.Press., 1967. V.I.-P.103-105.

155. Surgical dressing. Патент США, МКИ 3870041.Graham I, Davis (США) -4p.

156. Surgical dressing of absorbale polymers. Патент США, МКИ 3875937. Edward Emil Schmitt, Rocco A.Palistina (США). 7p.

157. Surgical sponde or bandage. Патент США, МКИ 3678933. F.L.Moore, A.Leon. Perkinson. — 8p.

158. Wound dressing. Патент США. МКИ 4203435.Manfred Krull. Holger Buchmald. Wilhelm Kirsch. 12p.

159. Wound dressing materials. Патент США. МКИ 4625720. Peter M. Loc. -12 р.

Информация о работе

Янгирова, Земфира Закарияновна
кандидата биологических наук
Уфа, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка и изучение иммунобиологических свойств нового лекарственного средства - бактиспоринпласта - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы