Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование метаболизма некоторых фосфатов эритроцитов в условиях криоконсервирования

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование метаболизма некоторых фосфатов эритроцитов в условиях криоконсервирования"

АКАДЕМИЯ НАУН УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРОБИОЛОГШ И КРИОМЕЦИЦИНЫ

На правах рукописи

МУСАТОВ Владимир Иванович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАБОЛИЗМА НЕКОТОРЫХ ФОСФАТОВ ЭРИТРОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ.

03.00.22. - криобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научные руководители: канд.ф.-м.наук Зинченко В.Д.

канд.хим.наук Бхезовский В.М.

Харьков-1992

Работа выполнена в Институте проблем криобиологии и криомедицины АН УКРАИНЫ

Научные руководители - канд. физ.-маг. наук Зинченко В.Д., канд. хим. наук Бжезовский В.М.

Официальные оппоненты: профессор, докт.биол.наук В.В.Лемешко профессор, докт.хш.наук Заев Е.Е.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Госагропрома

Защита состигся " "_ 1992 года в " " часов на заседании

специализированного совета Д 016.60.01 при Институте проблем криобиологии и криомедицины АН Украины (310015, г. Харьков, ул. Переяславская, 23)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИПКиК АН Украины Автореферат разослан " " _ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета Д 016.60.01, доктор медицинских наук

А.Н.Го'льцев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы■

Актуальность темы определяется прежде всего тем, что состояние энергетического аппарата клеток относится к числу существенных факторов, регулирующих жизнеспособность и репарацию криоконсерви-рованных клеток [Белоус A.M. Бондаренко В.А., 1982]. Хранение клеток после цикла замораживания-оттаивания сопровоздается дополнительными изменениями молекулярной структура мембраны и клетки в целом [Белоус A.M., 1981]. Выживаемость клеток во многом зависит от темпов восстановления клеточного метаболизма и, в частности, энергетической системы клетки [Лемешко В.В., 1983]. Внутриклеточный пул макроэргических соединений, проницаемость мембраны и величины потоков субстратов следует рассматривать, как важные параметры клетки, которые мохно определить методом ЯМР-спектроскопаи.

Сохранность энергетических структур является необходимым условием высокого выхода клеточного материала в процессе криоконсер-вации, тем более, что при нормальном течении метаболизма клетки способны к репарации некоторых поврежденных структур [Лоевский М.М., 1985, Ворошлин A.M., 1987]. Ясное представление об изменениях метаболизма на разных стадиях криоконсервирования может служить основой для научного подхода в разработке криобиологических технологий. Информация об изменениях клеточного метаболизма на стадиях введения криопротектора (КП) в клеточную систему, замораживания - оттаивания, экспозиции клеток в различных средах, представляет интерес для специалистов, занятых разработкой практических приемов криконсервирования.

В работе главное внимание уделено гликолитическому пути, в котором глюкоза транспортируется в клетку и превращается в лактат в серии из 11 реакций, катализируемых различными ферментами. Методом 31Р-ЯМР следили за изменением содержания АГФ, 2,3-ДФГ в неразрушенных эритроцитах человека в условиях, когда клетки суспендировались в криозащитном растворе, охлаздались до температуры близкой к нулю, а затем подвергалась замораживанию-оттаиванию. При этом предполагалось выявить те стадии процесса криоконсёрвирования, к которым наиболее чувствителен механизм энергообеспечения клетки. Одна из функций АТФ и 2,3-ДФГ - поддержание нормальной формы и

объема эритроцитов, о чем свидетельствует четкая корреляция между ■концентрацией указанных выше макроэргических соединений и морфологическими изменениями клеток в целом [Y.Suzuki, T.Nakajima, 1991]. Поэтому, одновременно с регистрацией концентрации АТФ и 2,3-ДФГ с помощью ЯМР-спектроскопии, следили за изменениями объема эритроцитов. С другой стороны в эритроцитах ферментативный процесс анаэробного превращения глюкозы служит единственным источником энергообеспечения клеток. В гликолитическом цикле нарабатывается метаболический запас макроэргических соединений - АТФ и 2,3-ДФГ, играющих ключевую роль в биоэнергетических процессах. Таким образом, изучение процессов превращения этих и других сбменоактивных форм вещества в гликолитическом пути расширяет наши знания о протекании этого сложного процесса в кивых системах, в связи с чем тема работы представляет интерес и в общебиологическом плане.

Цель и задача работы.

Целью работы явилось исследование временной зависимости содержания 2,3-ДФГ в условиях истощения по глюкозе в свежевыделенных эритроцитах человека при добавлении криопротекторов, после замораживания до минус 1дб°С и оттаивания, в процессе хранения оттаянных эритроцитов, с одновременным определением объема, рН и концентрации ионов Klg2+.

В связи с указанной выше целью были поставлены следующие задачи:

1) исследовать скорость деградации 2,3-ДФГ в различны условиях инкубации эритроцитов;

2) исследовать изменение рН в клетках в присутствии криопротекторов проникающего и непроникааденго типа и оценить степень влияния отдельных компонентов криозащитной среды на трансмембранный градиент рН эритроцитов человека;

3) исследовать динамику изменения объема клеток при экспозиции в криозащитных и других растворах;

4) исследовать динамику изменения уровня подвижных ионов Mg2+ в присутствии пропандиосахароля (ПДС) после замораживания-оттаивания;

Всю совокупность полученных результатов предполагалось использовать в построении модели влияния криоконсервирования на аппарат энергообеспечения эритроцитов.

Научная новизна.

В работе использованы новые методические подходы на основе ЯМР высокого разрешения, позволяющие изучають процессы метаболизма непосредственно в клетке, без ее разрушения.

Впервые непрерывно изучена динамика изменения основных фосфорсодержащих соединений (АТФ, 2,3-ДФГ) и %2+ крови, вне- и внутриклеточного рН, а также накопление неорганического фосфата в эритроцитах, непосредственно в процессе подготовки объектов к криоконсервации и деконсервации с различными криопротекторами. С помощью искусственного зонда исследована динамика изменения объема эритроцитов на фоне изменения концентрации 2,3-ДФГ в средах с проникающими и непроникавдими криопротекторами. Показано, что метаболизм макроэргических соединений существенно различен в интактных эритроцитах и в гемолизате. Установлен факт чувствительности сигналов 2,3-ДФГ к проникновению криопротектора внутрь эритроцитов. Для объяснения полученных экспериментальных результатов использовали модель, основанную на доннановской теории мембранного равновесия.

Няудная и практическая тонкость.

Проведенные в работе исследования позволяют выявить влияние ряда наиболее используемых криозащитных веществ проникающего

и непроникающего типов на длительность лаг-фазы и на скорость распада 2,3-ДФГ в эритроцитах человека на стадиях подготовки к крио-консервированию и после замораживания-оттаивания. Полученные результаты представляют практическую ценность для разработки технологий криоконсервирования.

Ценным для практического применения может быть использование внутриклеточного зонда, как источника информации об изменении объема и кинетики гемолиза в процессе суспендировадая эритроцитов в различных средах.

Проведенные исследования показывают, что 31Р-ЯМР в криобиологии дополняет известные методы и расширяет возможности экспериментатора в изучении внутриклеточных процессов в условиях криоконсервирования.

¿ЕЩЕ защипает.

1. Результаты исследования кинетики распада 2,3-ДФГ, АТФ и накопления неорганического фосфата эритроцитов в ходе подготовки к

криоконсервированию и после замораживания-оттаивания.

2. Результаты измерения рН в эритроцитах в процессе суспендирова-ния в средах с различными криопротекторами.

3. Способ использования искусственного зонда для оценки изменений объема эритроцитов в ходе подготовки их к 'криоконсервированию.

Апробация работы.

Материалы диссертационной раооты докладывались на 6-й Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров П-13 октября 1988 г. в г.Харькове, на 4-й Всесоюзной конференции по химии низких темепратур 21-23 декабря 1988 г. в г.Москве, на 8-й Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине", 1990 г. в г.Черноголовка, на областной научно-практической конф. 27-29 декабря 1989 г. в г.Харькове, на конференциях молодых ученых ИПКиК АН Украины 1988, 1989, 1990 гг. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ и получено одно авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и иллюстрированна 2 таблицами и 24 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, который включает 153 источника, списка сокращений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Для исследований использовали донорскую кровь человека, полученную на Киевской станции переливания крови, забранную на цитрате натрия. Кровь отмывали при комнатной температуре, центрифугируя при 800 ё в течение 5 мин два или три раза с равным объемом физиологического раствора. Надосадочную жидкость сливали и получали образцы эритроцитов с гематокритным отношением 7056. В некоторых случаях для исследований использовали кровь оператора, забранную в пробирки с цитратом натрия непосредственно перед началом эксперимента.

. Для приготовления суспензий эритроцитов в растворах криоза-щитных веществ готовили маточные среды, содержащие 30-50 масс % криозащитного вещества в физиологическом растворе, которые добавляли к эритроцитам небольшими портят, доводя концентрацию криозащитного вещества до требуемого значения.

Использовали полиэтиленгликоли фирмы Merok и Fluka квалификации "Purum", ДМСО, глицерин, 1,2-пропандиол, соли naCi, Na2HP04, ортофосфорную кислоту, оксиэтилендифосфоновую кислоту - отечественного производства (ХЧ). Диметилметилфосфонат синтезировали в Институте органической химии АН Украины и очищали перекристаллизацией из водного раствора. Растворы готовились на бидистилляте.

Спектры 31Р-ЯМР получали на частоте 81,026 МГц на спектрометре Brukep нх-200 и на частоте 121,46 МГц на спектрометре Varían VXR-300. При работе на спектрометре НХ-200 образцы помещали в ампулы диаметром 10 мм, объем образца составлял 2-3 мл, на спектрометре VXR-300 - в ампулы диаметром 5 мм, объем образца 0,6 мл.

Каждый спектр 'получали в результате 100-300 накоплений при 90-градусном радиочастотном импульсе со временем задержки между импульсами 2,5-3 сек. Накопление производили на участке памяти 8 К при разрешении 2 Гц на точку. Использовали режим широкополосного подавления спин-спинового взаимодействия с протонами.

Кинетический анализ проводили при накоплении серии спектров в автоматическом режиме и их последующей автоматической обработке. Химические сдвиги измеряли относительно внешнего эталона - раствора оксиэтилидендафосфоновой кислоты в тяжелой воде, запаянного в стеклянный капилляр. Сигнал тяжелой вода использовали для стабилизации резонансных условий. В некоторых экспериментах в качестве эталона применяли 85)6 раствор ортофосфорной кислоты в d20 в стеклянном капилляре, который, однако, менее удобен, т.к. его сигнал перекрывается с сигналом неорганического фосфата исследуемых соединений. Температура образца поддерживалась на уровне 37±0,5°С системой автоматического термостатирования, либо оставалась комнатной.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Динамика изменения уровня макрозргических соединений и объема эритроцитов щи добавлении криопртекторов.

Сведения о динамике изменения уровня макрозргических соединений получали на основании анализа серий спектров 31Р-ЯМР эритроцитов, снятых на одном и том же образце в процессе его инкубации в различных криозащитных средах. На риси представлена серия спектров 31Р-ЯМР отмытых эритроцитов без криопротектора, снятых с интервалом 30 мин при температуре 37°С.

Рис.1. Серия спектров 31Р-ЯМР (фрагмент в области сигналов 2,3-ДФГи Фн) отмытых эритроцитов без добавления криопротекторов. Отнесение сигналов (слева направо): I-фосфор в третьем положении 2,3-ДФГ; 2- фосфор во втором положении 2,3-ДФГ; 3-неорганический фосфат. Температура 37°С.

Из рис.1 видно, что в течение первых 4 часов инкубации интенсивность сигнала 2,3-ДФГ мало изменяется, а сигнал Фн в спектре не регистрируется. Этот промежуток времени - т , в дальнейшем мы назовем стадией постоянных значений или лаг-периодом. По" истечении этого времени начинается вторая стадия, на которой интенсивность сигнала 2,3-ДФГ уменьшается со временем с одновременным ростом сигнала Фн. Интенсивность сигналов АТФ уменьшается в течение первых 2-3 часов инкубации, а далее в течение 9 часов инкубации меняется незначительно. На основании таких серий спектров строили зависимость интенсивности сигнала Фн (1н), нормированного к суммарной интенсивности сигналов всех фосфорсодержащих соединений (1о), регистрируемых в спектре 31Р-ЯМР (рис. 2).

Как видно из этого рисунка действие всех исследованных нами криопротекторов приводит к сокращению гик изменению скорости распада 2,3-ДФГ. По значениям то при 37 С, исследованные системы можно расположить в следующей последовательности: контроль- 5 часов, ОДС- 3,9 ч, ПЭГ-1500 - 3,5 ч, глицерин- 2,7 Ч, ПЭГ-300 -

1,8 ч, ПЭГ-400 - 1,5 ч. Однако по степени влияния на скорость распада 2,3-ДФГ последовательности криопротектных веществ другая: контроль < глицерин < ПДС < ПЭГ-400 < ПЭГ-1500 < ПЭГ-300

Рис. 2. Зависимость отношения интенсивности сигнала Фн

(1н) к общей интенсивности сигналов фосфора (1о)

в спектрах 31Р-ЯМР эритроцитов от времени инкубации в различных средах. Температура инкубации 37 С. Обозначенные звездочкой прямые соответствуют температуре 20 С.

Относительно механизма влияния неводных криозащитных компонентов на протекание гликолиза в клетках не существует четкой концепции. Высказывалась гипотеза о специфическом взаимодействии I,2-ЦЦ с ферментами шунта Раппопорта-Луберинга [Лоевский М.М., 1985 г.]. В наших экспериментах продемонстрировано существование прямого взаимодействия молекул I,2-ПД и 2,3-ДФГ, что видно по изменению разрешенносги спектра 31Р-ЯМР 2,3-ДФГ в присуствии I,2-ПД. Однако влияние непроникающих криопротекторов на протекание данного биохимического процесса свидетельствует о том, что механизм действия КП более слохен и затрагивает, вероятно, мембранносвязанные белки и процессы трансмембранного переноса вещества. В целом, присутствие криозащитных компонентов действует на энергетический аппарат клетки деструктивно. Аналогичные исследования процесса ути-

I

L

2 3 5 6 7 » 9

вив (чяс)

лизации макроэргических соединений были проведены после замораживания-оттаивания эритроцитов в криозащитной среде НДС. Было обна-

Рис. 3. фрагменты серии спектров 31Р-ЯМР (121 МГц) отмытых эритроцитов в области сигналов ДММФ. Сигнал внутриклеточного ДММФ расположен справа.

ружено, что замораживание-оттаивание вызывает значительное ускорение процесса деградации 2,3-ДФГ. Если в спектре незамороженных эритроцитов после инкубации в среде НДС при 37°С в течение 4 часов сигнал 2,3-ДФГ четко регистрируется, то после замораживания-оттаивания он падает за это же время до уровня шумов 'и отмечается заметный гемолиз. Таким образом, в технологической последовательности операций криоконсервирования процедура замораживания является дополнительным деструктивным фактором, нарушающим энергетический статус клеток.

Изменение объема эритроцитов в ходе инкубации регистрировали по химическому сдвигу сигнала ДММФ. На рис.3 показаны фрагменты серии спектров области сигнала ДММФ, отмытых эритроцитов, не подвергавшихся замораживанию. Левый сигнал соответсвует внеклеточному, правый - внутриклеточному ДММФ. Видно, что разность химических сдвигов двух сигналов ДММФ в процессе инкубации при 37°С не изме-

няется, что указывает на неизменность объема клеток. Однако, сиг-

Рис. 4. Фрагменты спектров Р-ЯМР эритроцитов, после замораживания-оттаивания под защитой ПДС. Слева - серия сигналов ЛШ&, справа - сигналов 2,3-ДФГ и Фн. Кавдый спектр получали в течение 43 минут.

нал внутриклеточного ДММФ непрерывно возрастает по интенсивности в течение времени инкубации. Причиной постепенного проникновения ДММФ в клетку может быть изменение барьерной функции мембраны и осмотические эффекты, связанные с нарушением ионного гомеостаза клетки вследствии изменения энергетического статуса. Аналогичная серия спектров для эритроцитов после замораживания-оттаивания под защитой ПДС показаны на рис.4. В течение 170 минут сигнал внеклеточного ДММФ увеличивается, хотя разность химических сдвигов внутри- и внеклеточного ДММФ остается неизменной. К исходу 210 мин инкубации наблюдается инверсия интенсивностей внутри- и внеклеточных сигналов ДММФ, сближение сигналов и их слияние. Последнее

объясняется гемолизом клеток. При инкубации в тех же условиях незамороженных клеток в среде ПДС сигналы ДММФ остаются неизменными по амплитуде и по химическому сдвигу в течении значительно большего времени. Таким образом, процедура замораживания-оттаивания приводит к заметному изменению барьерной функции мембран и к ускорению гемолиза эритроцитов. Использованный в настоящей работе способ контроля изменения объема эритроцитов и их гемолиза с помощью зонда ДММФ может быть рекомендован для применения в качестве теста сохранности эритроцитов после различных экстремальных воздействий.

Влияние замораживания-оттаивания под зашитой ПДС as уровень свободных ионов Mg2+ 2 эритроцитах.

В основе использованного в работе методического подхода, лежит зависимость химических сдвигов сигналов 31Р-ЯМР молекул АТФ от концентрации ионов магния [Gupta R.K., 1931]. Проводили исследование динамики изменения концентрации свободных ионов Mg2+ в эритроцитах, суспендируемых в растворе 15% ПДС без замораживания и после замораживания-оттаивания. Зависимость концентрации свободных ионов Mg2+ от времени, рассчитанная с помощью простого регрессионного анализа, показана на рис. 5 (а,б) для образца без замораживания и после замораживания-оттаивания.

Видно, что глубокое замораживание приводит к увеличению начальной концентрации свободных ионов Mg2+ в клетке и увеличивает скорость их связывания в 2.5 раза по сравнению с незамороженными образцами, хотя общая интенсивность сигналов АТФ менялась значительно медленнее и практически не отличалась для обоих типов образцов. Отмеченное уменьшение содержания свободных ионов магния после замораживания, на наш взгляд, может способствовать выключению значительного количества молекул АТФ из метаболизма, что может приводить к быстрому разрушению клеток в восстановительный период. Измерение рН в эритроцитах, суспендированных в средах с различными криопротекторами

Неразрушающий контроль значений внутри- и внеклеточного рН в эритроцитах проводили на основании анализа химических сдвигов сигнала Фн в спектрах 31Р-ЯМР эритроцитов, по методу предложенному Муном и Ричардсом [Moon R.B., Richards J.H.J., 1973 г.].

Исследовали криопротекторы проникающего и непроникающего типов и сложную среду ПДС, содержащую как проникающую, так и непро-

ис. 5. Зависимость содержания свободного магния в эритроцитах до замораживания (а) и после замораживания-ототоева (б) от времени, в среде пропандиосахаролъ (ЦДС). .Теиш-пвратура. инкубация 37°д.'

никамцую компоненты. По характеру действия на величину рН изучение криопротекторы можно разделить на три группы:

¡.сигнал Фн не расщепляется на два и рН с течением времени не изменяется;

2.сигнал Фн не расщепляется, но происходит закисление среда;

3.сигнал Фн расщепляется на два, т.е. регистрируется трансмембранный градиент рН.

.К первой группе относятся проникающие КП: глицерин, ДМСО, ЦЦС, непрониканций - ПЭГ-400 и многокомпонентная среда ПДС. После замораживания-оттаивания эритроцитов в среде ПДС наблюдается такая же динамика изменения рН, как и в образцах без замораживания. В ряду ПЭГ встречаются представители всех трех групп. Ко второй группе относится ПЭГ-зоо. В эритроцитах, суспендированных в ПЭГ-ЗОО наблюдается снижение рН в течение 8 часов инкубации. Объяснение такого влияния растворов ПЭГ-зоо, может заключаться в том, что этот КП, занимает пограничное положение между проникающими и непроникающиш КП. Вероятно, в течение времени инкубации происходит частичное проникновение некоторых фракций КП в цитоплазму, что вызывает нарушение доннановского равновесия на мембране и изменяет перераспределение малых ионов. К третьей груше, для которой характерно расщепление сигнала неорганического фосфата на два, относятся ПЭГ-600, ПЭГ-1500 - непроникающие через мембрану эритроцитов соединения. Несколько неожиданным оказался результат, полученный с I,2-пропандиолом (1,2-ЦЦ), который относится к КП проникающего типа. Его введение в суспензию эритроцитов при 37°С вызывает трансмембранный градиент рН около 0,3 ед. рН, который сохраняется в течение 7 часов инкубации, на фоне незначительного закисления (0,12 ед. рН/час), как внутри, так и внеклеточной среды. Таким образом, известная модель возникновения трансмембранного градиента рН нуждается в уточнении. В этой модели принимается, что возникновение трансмембранного градиента рН связанно с отличием буферной емкости цитоплазмы и внеклеточной среда. Согласно такому подходу, проникающие КП не должны вызывать трансмембранного градиента. Полученные результаты указывают на то, что возникновение этого градиента на клеточной мембране связано не только с проницаемостью КП через мембрану, но, вероятно, и с его способностью мо-дифщировать мембрану к влиять на ее проницаемость.

Влияние высоких концентраций компонентов криозашитной сраш

на трансмембранннй градиент рН.

Как видно из представленного выше анализа условий возникновения градиента рН на мембране эритроцитов и его величины, действие I,2-ПД и среды ЦДС на' этот показатель существенно различно. Поскольку в состав ПДС входят кроме I,2-ПД сахароза и NaCl, мы исследовали действие этих добавок, на динамику изменения рН в эритроцитах в экспериментах, подобных описанным выше для систем КП. Сахарозу и NaCl добавляли в достаточно высокой концентрации (до 1 М). Таким образом мы моделировали ситуацию, возникающую при замораживании-оттаивании, когда клетки оказываются в гиперконцентрированном растворе. Одновременно с раствором сахарозы вводили ®н, который входит в состав фосфатного буфера. Сразу после введения раствора сахарозы возникает градиент рН, составлякций 1 ед. рН. В течении 1 часа инкубации наблюдается изменение соотношения интенсивностёй сигналов Ф° и Ф* так, что сигнал Ф* значительно превышает Ф°. В отличие от рассмотренных ранее систем с криозащитныш веществами в составе суспендирующей среды, здесь ситуация прямо противоположная - сигнал Ф° значительно больше Ф*. Вероятнее всего, такое перераспределение концентрации Фн обусловлено изменением доннановского равновесия, вызванного высокой концентрацией непроникакщего вещества - сахарозы. Из-за эффекта Доннана, проникащее вещество вытесняется через мембрану из того объема, где локализовано непроникапцэе вещество, поэтому концентрация ионов Ф* существенно возрастает.

На основании анализа химических сдвигов построили зависимость рН внутри- и внеклеточной среды от времени инкубации при 37°С, в присутствии I М сахарозы (см. рис 6). Видно, что рН внеклеточной < среды непрерывно возрастает, тогда как рН внутриклеточной среда остается неизменной. С целы) контроля, мы провели измерения рН образцов при помощи стандартной методики стеклянного электрода и обнаружили, что величина рН среды возрастает со временем. Возможно, возрастание рН внеклеточной среды связано с выходом продуктов метаболизма, причем постоянство внутриклеточного рН является результатом буферной емкости цитоплазмы. К концу периода инкубации резко возрастает интенсивность внеклеточного Фн, что может служить косвенным подтверждением, высказанного предпологения. Одновременно с

сахарозой в суспензию был добавлен ДММФ. Разность химических сдв гов ДШ^ и ДММФо в этом случае весьма значительна и составля 0.55 м.д.. Это указывает на то, что эритроциты сильно сжаты осм тичесикими силами. Таким образом, на основании проведенных иссл дований можно высказать предположение о действии сахарозы в сост ве ЦЦС. Вероятно, способствуя выходу продуктов метаболизма и пов; шая таким образом рН среда, сахароза компенсирует снижение р возникающее за счет гликолиза.

Рис. 6. Зависимость величины вне- (+) и внутриклеточного рН (Л) в суспензии эритроцитов от времени после добавления 1 М сахарозы, при температуре 37 С.

Подобные исследования изменения рН1 и рНо мы провели в присутств] 0.4 М ЫаС1. Результаты представлены на рис. 7. В присутств] нейтральной соли р^ и рНо не изменяется в течение времени инкуб; ции в пределах погрешности измерений.

Таким образом, полученные результаты показывают, что одн< временное введение проникающих и непроникаицих компонентов в крис защитные среда позврляет направленно влиять на осмотическую реш цшо клеток, на трансмембранный градиент рН, на транспорт ионов ч< рез мембрану и энергетическое состояние клетки, для создаш максимально щадящих условий суспендирования.

pti

s -

|> *_л i i A

5 10 ts IQ V

ss ie «í íu ss cv

(MUHj

Рис. 7. Зависимость величины вне- (Д) и внутриклеточного (о) рН в суспензии эритроцитов после добавления 0.4 И Nací. Инкубация в течении 1 часа при температуре 37°С.

ВЫВОДЫ.

1. Утилизация 2,3-ДФГ, выполняющего роль резервного источника энергообеспечения в изолированных эритроцитах, состоит из двух стадий: стадии постоянных значений (лаг-фаза) и стадии спада, как в отсутствии, так и в присутствии криозащитных добавок. Инкубация эритроцитов в средах с исследованными криозащитными добавками при 37°С, приводит к сокращению лаг-периода и к ускорению распада 2,3-ДФГ на второй стадии.

2. Показано, что процесс замораживания-оттаивания эритроцитов ведет к ускорению распада 2,3-ДФГ и к более быстрому снижению уровня свободных ионов в процессе инкубации размороженных эритроцитов при 37°С.

3. Выявлено существование прямых межмолекулярных взаимодействий 2,3-ДФГ и 1,2-ЦД в эритроцитах.

4. Установлено, что трансмембранный градиент рН в эритроцитах возникает при введении криозащитных добавок как проникающего, так и непроникающего типа. Механизм возникновения градиента рН на мембране эритроцитов связан не только с буферной емкостью цитоплазмы, но и с влиянием криопротектора на барьерную функцию мембраны.

о

7

5. На примере сахарозы показано, что действие непроникаищих компонентов криозащитных сред на перераспределение ионов Í и ®к противоположно действию проникающих криозащитных добавок. Этот факт может быть использован при создании криозащитных составов с минимальным деструктивным влиянием на клетку.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Способ оценки проникновения веществ в клеточные суспензии A.c. N 1642342 СССР, МКИ G 01 N 24/08, 33/483 / Зинченко В.Д., Щетинский М.И., Мусатов В.И., Моисеев В.А..- Опубл. 15.04.91 Еюл. N 14.

2. Зинченко В.Д., Мусатов В.И. Об изменении внутриклеточного pH в эритроцитах после замораживания-оттаивания под защитой 1,2-ДЦ / Сб. науч. раб. "Биохимические аспекты криоповреждения и криозащиты клеточных систем", Харьков.- 1989.- С. 34-38.

3. Зинченко В.Д., Мусатов В.И., Николаев Б.Н., Петров Л.Н., Шляков A.M., Кушнир И.Э., Яблучанский Н.И. Исследование эритроцитов человека методом 31Р-ЯМР при некоторых заболеваниях печени / Тез.докл. VII Всес. конф. "Магнитный резонанс в биологии и медицине", май 1989 г., Звенигород.- Черноголовка,- 1989.- С. 239.

4. Щетинский М.И., Мусатов В.И. Исследование перераспределения крио-протекторов меаду внутри- и внеклеточной средой эритроцитов методом ЯМР / Сб.науч.раб. "Теоретические и.практические аспекты современной криобиологии".- Киев:"Наук. думка".- 1989.- С. 36-39.

5. Зинченко В.Д., Мусатов В.И., Моисеев В.А., Кушнир И.Э., Бабак О.Я. Применение метода 31Р-ЯМР при некоторых заболеваниях печени / Тез. обл. науч.- практ. конф. 27-29 декабря 1989 г. "Научно-технические проблемы современной терапии", Харьков.- 1989.- С. 177-179.

6. Зинченко В.Д., Загнойко В.И., Мусатов В.И., Бжезовский В.М. О метаболизме некоторых фосфорсодержащих соединений в печени зимоспящих животных по данным 31Р-ЯМР / Тез.докл. Всес. конф. "Механизмы зимней спячки", Махачкала.- 1990.- С. 49.

7. Мусатов В.И- Исследование состояния 2,3-ДФГ в криоконсервированных эритроцитам методом 31Р-ЯМР / Сб.науч.раб. "Холодовой анабиоз",- Киев: "Наукова думка",- 1991,- С. 52-56.

Ответственный за выпуск - академик АН Украины В.И. ГШЦЕЖО

Подписано к печати 4.02.92 г., физ.п.л. I, учетн.изд. л. I.

Заказ 2G, тираж 100.

Ротапринт ФТИНТ АН Украины, 310164, Харьков-164, пр. Ленина, 47