Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция метаболизма аденилатов в эритроцитах человека

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция метаболизма аденилатов в эритроцитах человека"

РГБ ОД 1 1 МАР

На правах рукописи

КОМАРОВА Светлана Витальевна

РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА АДЕНИЛАТОВ В ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов, кандидат физико-математических наук В.М. Витвицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.Э. Шноль

доктор физико-математических наук, профессор В. И. Пасечник

Ведущая организация - Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет.

. Защита диссертации состоится МЩЗ/ _1996 г. в часов ь

заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической экспериментальной биофизики РАН по адресу 142292, г.Путцино, Московска область.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан

Я 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

П.А. Нелипович

иСссп

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. 1. В настоящее время достигнуг значительный прогресс в исследовании регуляции метаболических систем клеток. Однако, решение вопроса о взаимодействии различных метаболических систем и о связи физиологии и биохимии клетки в настоящее время возможно, по-видимому, только для наиболее просто устроенных клеток. К таким клеткам относятся эритроциты млекопитающих, физиология и биохимия которых исследованы наиболее полно. В эритроцитах млекопитающих метаболизм аденилатов полностью представлен и активно функционирует. Наряду с гликолизом, регуляция которого хорошо изучена (Сельков Е.Е., 1972, 1975, Rapoport et al., 1974, Атауллаханов и др., 1978, 1981, 1982,) метаболизм аденилатов играет принципиальную роль в поддержании внутриклеточного уровня АТР и, следовательно, может оказывать влияние на АТР-зависимые клеточные процессы (Атауллаханов, 1982). Кроме того, метаболизм аденилатов в эритроцитах может играть определенную роль в регуляции взаимодействия этих клеток с организмом в целом. Один из субстратов для синтеза AMP - аденозин - в концентрациях, близких к физиологическим, оказывает регуляторное влияние на многие органы и ткани организма (Newsholme Е.А., 1978, Newby А.С., 1984, Jakobson E.D. et al., 1992), что позволяет многим авторам рассматривать его как гормон или специфический сигнальный агент. За счет метаболизма аденилатов эритроциты способны потреблять или высвобождать аденозин, участвуя тем самым в регуляции уровня аденозина в крови.

Таким образом, изучение метаболизма аденилатов в эритроцитах человека имеет большое значение для понимания как общих принципов регуляции энергетического метаболизма в клетке, так и механизмов взаимодействия этдельных клеток с организмом.

Целью настоящей работы являлось экспериментальное и теоретическое исследование механизмов регуляции метаболизма аденилатов в эритроцитах геловека и принципов взаимодействия метаболизма аденилатов и шергетического метаболизма клетки.

Основные задачи исследования.

1. Провести экспериментальное исследование взаимосвязи между метаболизмом аденилатов и энергетическим метаболизмом в интактных эритроцитах и в эритроцитах с измененным энергетическим метаболизмом.

2. Построить математическую модель, описывающую взаимодействие ионного транспорта, энергетического метаболизма и метаболизма аденилатов в эритроцитах. С помощью модели исследовать гипотезу о возможной роли метаболизма аденилатов в стабилизации концентрации ионов в клетке.

Научная новизна.

Показано, что внутриклеточный энергетический метаболизм эритроцитов чувствителен к изменению уровня аденозина в крови. Существенно, что повышение концентрации аденозина вызывает обратимое увеличение |АТР[ и пула аденилатов в эритроцитах. В нормальных условиях величина пула аденилатов в эритроцитах поддерживается метаболизмом аденилатов на определенном уровне. Показано, что стабилизация ионного состава эритроцитов при увеличении проницаемости клеточной мембраны для катионов улучшается за счет актавации метаболизма аденилатов. Разработана методика и установка, обеспечивающая длительную стерильную инкубацию эритроцитов в жизнеспособном состоянии при условиях, имитирующих физиологические. Построена математическая модель, качественно описывающая взаимодействие систем ионного гомеостаза, энергетического метаболизма и метаболизма аденилатов в эритроцитах человека. С помощью модели найдены условия, при которых система метаболизма аденилатов обеспечивает наибольшую степень стабилизации объема при неспецифических изменениях проницаемости клеточной мембраны.

Практическая ценность работы. Результаты работы могут найти практическое применение в области консервировании донорской крови и ее компонентов, а так же в биотехнологии при разработке новых методов культивирования клеток и тканей. Результате работы найдут применение в биохимии, биофизике и клеточной физиологии.

Апробация работы состоялась 2 октября 1995 г. на заседании проблемно» комиссии "Консервирование клеток крови, ее компонентов и костного мозга

биохимия, биофизика крови" в Гематологическом научном центре РАМН. Материалы диссертации докладывались на международном симпозиуме "Патология эритрона и обмена железа" в г. Рязани (17-20 января 1994г.)

Публикации.

Материалы диссертации изложены в 3 публикациях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста, состоит из введения, пяти глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов исследования, глав 3, 4, 5 основного текста), заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 130 источников.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физической биохимии системы крови Гематологического Научного Центра РАМН (зав. лаб. - д.б.н., проф. Ф.И. Атауллаханов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе 1 приведен обзор литературных данных о эритроцитах человека, системах энергетического метаболизма и метаболизма адениновых нуклеотидов. Проанализированы экспериментальные данные о кинетических параметрах этой ферментативной системы и известных механизмах регуляции потоков метаболитов. Приведен анализ известных математических моделей энергетического метаболизма и метаболизма аденилатов в эритроцитах человека.

В главе 2 описываются материалы и методы исследований. В работе использовались эритроциты, выделенные из донорской крови стандартным методом. Исследования проводились в изотоническом растворе следующего состава: №С1 - 135 мМ, КС1 - 3 мМ, МвБ04 - 1 мМ, СаС12 - 2 мМ, №НгР04 -1,2 мМ, глюкоза - 5 мМ, альбумин (БСА) - 2 г/л, НЕРЕ5 - 24 мМ, рН =7,4, при 37°С и постоянном перемешивании. Для длительной инкубации эритроцитов в инкубационную среду добавляли также по 0.1 мМ цистеина, глицина, глутамата, а-кетоглутарата и пирувата, 1 мМ лактата, 50 мг/л гентамицина.

Эксперименты по длительной инкубации эритроцитов проводили с использованием гемодиализаторов Hemoflow Е2 фирмы Fresenius, объем внутреннего контура 60 мл. Все процедуры, связанные с отмыванием эритроцитов, заполнением гемодиализаторов и отбором проб из суспензии эритроцитов осуществлялись стерильно. Суспензией эритроцитов заполняли внешний контур гемодиализатора на 2/3 его объема. Заполненный диализатор помещался на качалку в термостатируемый корпус. Инкубация эритроцитов проводилась в течении 20-60 ч при 37°С и постоянном перемешивании. Через внутренний контур гемодиализатора прокачивалась инкубационная среда со скоростью около 3 мл/мин.

Концентрацию АТР определяли модифицированным люциферин-люциферазным методом (Атауллаханов, Пичугин, 1981); нуклеозиды, основания и компоненты пула зденилатов определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Концентрацию К+ в инкубационной среде определяли на пламенном фотометре. Гемолиз определяли спектрофотометрически по выходу гемоглобина из эритроцитов в среду.

При исследовании систем дифференциальных уравнений использовался пакет прикладных программ TRAX, версии 1.2 (автор Левитин В.В.).

Главы 3 и 4 посвящены соответственно описанию и обсуждению результатов экспериментального исследования влияния различных концентраций аденозина на метаболизм аденилатов и энергетический метаболизм в интактных эритроцитах человека и в эритроцитах с измененным энергетическим метаболизмом. В качестве параметров, характеризующих энергетический метаболизм клетки рассматривали энергетический заряд

(([ATP]+0/5[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])) и концентрацию АТР. Для воздействия на энергетический метаболизм эритроцитов использовали либо активацию АТР-потребляющих процессов, либо подавление воспроизводства АТР в гликолизе.

Для регистрации влияния аденозина на концентрацию АТР и пул щенилатов ([ATP]+[ADP]+(AMP]) необходимы достаточно длительные, многочасовые инкубации эритроцитов в присутствии аденозина, т.к. скорость збмсна пула аденилатов в норме составляет около 0.05-0.1 ммоль/ч.л.кл (Dean, 1976, Plagemann, 1986). Наличие в эритроцитах активной аденозиндезаминазы гриводит к быстрому дезаминированию вводимого в суспензию эритроцитов щенозина и не позволяет существенно повысить его внутриклеточную сонцентрацию на длительное время. Поддержание постоянного уровня аденозина з суспензии эритроцитов может быть достигнуто при ингибировании аденозиндезаминазы специфическими ингибиторами (Kyd, 1980) либо за счет тостоянного введения аденозина (Kim, 1990). В работе было проведено «следование влияния аденозина на уровень АТР и пул аденилатов в эритроцитах при разных способах поддержания постоянной концентрации щенозина в суспензии эритроцитов.

Наиболее близким к естественной ситуации in vivo является введение щенозина в суспензию эритроцитов с постоянной скоростью. При этом в суспензии поддерживается низкая концентрация аденозина, близкая к тормалыюму уровню аденозина в крови, порядка 1 мкМ (Kim, 1990, Newsholm, 1978, Moser, 1989). Значительная часть вводимого аденозина дезаминируется с образованием инозина и, далее, гипоксантина и рибозо-1-фосфата. Введение щенозина в этих условиях приводит к росту концентрации АТР и пула щенилатов в эритроцитах, которые зависят от скорости введения и, следовательно, от установившейся концентрации аденозина в суспензии (рис. 1). [Сак начальная скорость роста [АТР], так и средняя скорость роста пула щенилатов в эритроцитах резко зависят от скорости введения аденозина до шачений скорости введения порядка 0.75 ммоль/ч. л. эр. Дальнейшее увеличение жорости введения аденозина не приводит к существенному увеличению жорости роста [АТР]. Максимальная начальная скорость роста [АТР], таблюдаемая в условиях этого эксперимента составляет около 0.45 ммоль/ч. л. эр. Максимальная скорость синтеза пула аденилатов - около 0.35 ммоль/ч. л. эр.

5 0.5

время, ч

Рис. 1.

2.5 2 1.5 1

0.5 0

о 1 ■ 2

аЗ

о 4 ж 5

время, ч

Рис. 2.

О

3

4

I

2

3

4

Рис. 1. Кинетика изменения концентрации АТР в нативных эритроцитах человека в зависимости от скорости введения аденозина в суспензию эритроцитов. Контроль - 1, непрерывное введение аденозина со скоростью 20 мкмоль/ч.л.эр - 2, 200 мкмоль/чл.эр. - 3, 2000 мкмоль/чл.эр. - 3.

Рис. 2. Влияние инозина на увеличение [АТР] в эритроцитах при непрерывном введении аденозина со скоростью 2 ммоля/чл.эр. 1 - контроль, 2 -введение аденозина в суспензию нативных эритроцитов, 3 - введение аденозина в суспензию эритроцитов, обработанных коформицином. 4 - к эритроцитам, обработанным коформицином в начальный момент добавлено 300 мкМ аденозина. 5 - одновременное введение аденозина и инозина со скоростью 2 ммоля/чл.эр.

В присутствии коформицина (ингибитора аденозиндезаминазы) значительный уровень аденозина может поддерживаться в суспензии эритроцитов в течение 5 - 8 ч при относительно низкой исходной концентрации аденозина, порядка 0.1 - 0.3 мМ. При этом пул аденилатов растет со скоростью около 0.15 ммоль/чл.эр., однако [АТР] за время инкубации возрастает незначительно (рис. 2., линия 4). Отсутствие адекватного роста [АТР] при увеличении пула аденилатов связано с тем, что аденозин в присутствии коформицина заметно снижает энергетический заряд эритроцитов. Это говорит о том, что потребление

\'ГР в аденозинкиназной реакции создает значительную нагрузку на шергетический метаболизм эритроцитов. В условиях непрерывного введения щенозина происходит дополнительная активация гликолиза за счет включения жбозо-1-фосфата, который производится по пути аденозин инозин -> -ипоксантин + рибозо-1-фосфат, что обеспечивает поддержание нормального тергетического заряда клетки и рост [АТР]. Таким образом, влияние аденозина ja ]АТР] в эритроцитах существенно зависит от наличия в суспензии инозина рис. 2).

2.5

£ 1-5

0

1 1

ь 0 5 ^ О

К

А-Ь

Ч-Н

0 1 2 3 4 5 6 7 время, ч

4 3.5 3

а"

Л ■")

4,5 I 1

I 0.5

0

« 1

лЗ

0 12345678 время, ч

2

Рис. 3. Кинетика изменения [АТР] (а) и пула аденилатов (Ь) в эритроцитах осле отключения подачи аденозина в суспензию. 1 - контроль, 2, 3 - введение яенозина в суспензию эритроцитов со скоростью 2 ммоля/ч.л.эр. В момент ремени, отмеченный стрелкой прекращено введение аденозина в случае 3.

Полученные данные показывают, что внутриклеточная [АТР] и величина ула аденилатов в эритроцитах могут существенно зависеть от концентрации хенозина в крови. Существенно, что аденозин вызывает обратимое увеличение VTP] и пула аденилатов в эритроцитах (рис. 3). После прекращения введения ¡енозина концентрация АТР и пул аденилатов возвращаются к исходному )овню, который поддерживается в дальнейшем. Таким образом, в нормальных :ловиях величина пула аденилатов в эритроцитах поддерживается метаболизмом

аденилатов на уровне, который определяется, по-видимому, общим состояние энергетического метаболизма клетки.

На временах эксперимента около 6 - 8 ч пул аденилатов при наличи аденозина в суспензии не достигает стационарного уровня. Для увеличен» времени исследования была использована инкубация эритроцитов в диализнс системе с постоянным протоком инкубационной среды. Эритроцить помещенные в гемодиализатор, инкубировались 20 - 60 ч при 37°С и постоянно перемешивании. В ходе инкубации эритроцитов гемолиз не превышал 1% первые сутки инкубации и 3-4% во вторые. В ходе двухсуточной инкубаци форма эритроцитов остается дисковидной, объем клеток существенно у изменяется. IATt*] в интактных эритроцитах остается неизменной в течении 8-1 ч., а затем монотонно снижается со средней скоростью около 25 мкмоль/ч. . эр., таким образом, что к началу 3 суток инкубации концентрация AT составляет около 30-40% от исходной (рис. 4). Добавление в среду 10 мк! аденозина позволяет поддерживать |АТР] на исходном уровне в течение Bcei времени инкубации. 100 мкМ аденозина в среде вызывает рост [АТР] в течени 10-15 ч, после чего достигнутый уровень АТР стабилизируется и уже практическ не изменяется до окончания инкубации.

Он

5

3 V

/

$ * *

X X

л А

А--*-

■

О О

0 6 12 18 24 30 36 42 48 время, ч

о 1 ■ 2

А 3

х 4

Рис. 4. Кинетика изменен» |АТР] в ходе длительно инкубации эритроцитов. 1 контроль, 2 - 1 мкМ, 3 - ] мкМ, 4 - 100 мк! аденозина в омывающе растворе.

4

о

Полиеновый антибиотик амфотерицин В в концентрациях 0.5-3 мгу вызывает увеличение проницаемости мембраны эритроцита для катионов, чт приводит к активации транспортной Na+/K+- АТРазы, снижению уровня АТР

активации гликолиза (Эль-Суфи и др., 1991, Segel et al, 1975, Blum et al, 1969). Введение аденозина приводит к компенсации вызванного амфотерицином В снижения уровня АТР в эритроцитах (рис. 5). Компенсация обеспечивается за счет роста пула аденилатов. Добавление амфотерицина В к эритроцитам приводит к сннжению в hi« энергетического заряда. Одновременное добавление амфотерицина В и аденозина в присутствии коформицина аддитивно снижает энергетический заряд. Непрерывное введение аденозина наоборот компенсирует вызванное амфотерицином В падение энергетического заряда. Во всех случаях в присутствии аденозина наблюдается большее или меньшее снижение вызванного АМВ потока ионов К+ из эритроцита (рис. 56).

а 2

п ^

¡3 1.5

о S S

_s 1 а<

5 о,

......<* 8-

« 1

о 2 А 3

0 1 2 3 4 5 6 7 время, ч

9 т

S

S 7

Е 6

* R

4

н-н

« 1

□ 2 л 3

0 1 2 3 4 5 6 7 время, ч

Рис. 5. Влияние аденозина на уровень АТР (а) и кинетику выхода К+ из эритроцитов (Ь) в присутствии амфотерицина В. Условия инкубации эритроцитов: 1 - контроль, 2 и 3 - 1 мг/л амфотерицина В, 3 - введение аденозина со скоростью 200 мкмоль/ч.л.эр, Ht= 19%.

В ходе инкубации эритроцитов без глюкозы в течение 4-5 часов [АТР] в них уменьшается до 20-50% от исходного значения, а энергетический заряд падает на 30-35%. Добавление глюкозы к таким эритроцитам приводит к частичному восстановлению уровня АТР за 2-3 часа. В присутствии аденозина концентрация АТР поднимается значительно выше, чем без него и практически достигает исходного значения (рис. 6).

Рис. 6. Влияние аденозина на восстановление АТР в истощенных эритроцитах. 1 -контроль, 2,3 - истощенные эритроциты, к- которым в момент, отмеченный стрелкой, были добавлены, (2) глюкоза и (3) глюкоза с аденозином (0.8мМ). За 40 мин до аденозина был добавлен коформицин (1 мкМ).

Итак, в нативных эритроцитах, в эритроцитах с активированным потреблением АТР и в энергетически истощенных клетках наличие аденозина обеспечивает рост пула аденилатов и концентрации АТР. При увеличени проницаемости мембраны эритроцита для катионов это приводит к дополнительной активации ионного транспорта Ыа+/К+-АТРазой и, как следствие, к наблюдаемому снижению потока ионов К.+ в среду. Таким образом, метаболизм аденилатов может играть определенную роль в регуляции АТР-зависимых процессов, в частности, ионных насосов.

Полученные результаты хорошо согласуются с гипотезой о регуляторной роли метаболизма аденилатов, впервые сформулированной в работе Ф.И. Атауллаханова, 1982. Согласно этой гипотезе метаболизм аденилатов подстраивает пул аденилатов так, чтобы за счет изменения абсолютной концентрации АТР модулировать работу Na+/K+-ATPa3bi, обеспечивая стабилизацию концентраций ионов и, следовательно, объема эритроцита.

В главе 5 строится и исследуется простая математическая модель, описывающая взаимодействие ионного транспорта, энергетического метаболизма и метаболизма аденилатов. С помощью этой модели исследуются условия, при которых система метаболизма аденилатов позволяет обеспечить стабилизацию объема эритроцита при изменениях проницаемости клеточной мембраны.

& ''5 О

8 10 о S £

_ 0.5 *

~ 0.0

\ ' £ г°

V Л-»-* • 1

^ £ -Я- 2

200 400

время, мин

В основе модели лежат следующие постулаты:

1. Стабилизация объема эритроцита осуществляется через стабилизацию концентрации ионов внутри клетки.

2. Скорость ионных насосов в эритроците пропорциональна внутриклеточной концентрации Na+ и АТР.

3. Скорость производства АТР из ADP в гликолизе (гликолитический поток) как функция от концентрации АТР представляет собой колоколообразную кривую с круто падающим участком в области концентраций АТР, близких к величине пула аденилатов (Ataullakhanov et al, 1981).

4. Метаболизм аденилатов обеспечивает рост величины пула аденилатов при активации процессов, потребляющих АТР, в частности ионных насосов.

Математическая модель включает трансмембранный ионный градиент (например, градиент Na+) с высокой и постоянной внеклеточной концентрацией и низкой внутриклеточной концентрацией ионов, ионный насос, откачивающий ионы из клетки за счет расщепления АТР, гликолиз, как источник энергии и систему метаболизма аденилатов.

Изменения внутриклеточной концентрации ионов и концентраций компонентов пула аденилатов описываются следующей системой дифференциальных уравнений:

dl/dt = Uj - 3Up

ÜT/dt = Ugi - Up + U.ak - U+ak - Uask - 2Uaprt (1)

dD/dt = Up - Uji - 2(U.ak - U+ak ) + Uask + Uaprt

dM/dt = U.ak - U+ak + U^k + 2Uaprt - Ud

где I, T, D и M - внутриклеточные концентрации ионов, ATP, ADP и AMP соответственно.

U = PJ - скорость пассивного втока ионов в клетку, где Р - проницаемость мембраны клетки, J - внеклеточная концентрация ионов.

ир = W,IT - скорость потребления АТР ионным насосом, где W) -активность ионного насоса.

Ugi = W2 "Г0-52 М0-41- скорость производства АТР из ADP в гликолизе.

Выражение для Ug[ было получено ранее, как аппроксимация экспериментальной зависимости гликолитического потока от (АТР] в эритроцитах человека (Холоденко и др., 1981). Параметр W2 характеризует активность гликолиза в клетке.

U+ak и U_ak - скорости аденилаткиназной реакции в прямом (синтез ADP) и обратном направлениях.

Uask - скорость аденозинкиназной реакции.

Uaprt - скорость аденинфосфорибозилтрансферазной реакции. Вводим новый параметр U, предполагая, что скорости этих реакций постоянны и равны между собой:

U = Uask + Ugprt = 2Uask = 2Uaprt

n k

Ud = W4 T M - суммарная скорость распада AMP в АМР-дезаминазной и пурин-5' нуклеотидазной реакциях. W4 - суммарная активность реакций распада AMP, пик- параметры, отражающие зависимость скорости разрушения AMP от АТР и AMP соответственно. Скорость разрушения AMP в модели зависит от [АТР] так же, как и от (AMP], т. к. известно, что АТР является сильным эффектором и пурин 5'-нуклеотидазы, и АМР-дезаминазы (Van den Berghe et al., 1988, Itoh et al., 1986).

Аденилаткнназная реакция всегда близка к равновесию (Mansell et al., 1981, Molirenweiser et al., 1981). Положив константу равновесия равной 1, перейдем к новым, медленным переменным: энергетическому пулу клетки Е = 2Т + D и пулу аденилатов А = T+D+M

dl/dt = PJ - 3 W,IT

dE/dt = W2 T0-5 M0-4 - W,IT - 2U (2)

dA/dt = U - ХУД^М10

D2 / TM=1 где T = (A+ 3 E- (6AE- 3 E2+A2)0,5 )/6 M = (7A-3 Е- (6AE-3 E2+A2)0 5)/6

Величины параметров, отражающих активности ферментов и потоков были зыбраны следующим образом: ] — J0 — 100 inM Р = Po = 0.06 1/ч W, = 0.2 1/(мМч)

W2 = 13.5 мМ° 1 /ч (3)

W = 0.01 мМ(п+к) U = 0.02 мМ/ч п = 1.2 к = -1

При таком выборе параметров стационарное состояние в этой системе хорошо описывает физиологические значения концентраций и потоков ионов и метаболитов в эритроцитах человека (Segel et al., 1975, Rapoport et al., 1977, Mansell et al., 1981, Атауллаханов и др., 1981, 1984,).

Исследование модели показало, что в широкой области параметров пик существует единственное устойчивое стационарное состояние системы (2). Внутри этой области может быть достигнута стабилизация стационарной внутриклеточной концентрации ионов (Is) при изменениях проницаемости клеточной мембраны (Р). Эффективность стабилизации Is определяется в модели отношением n/k. При значениях остальных параметров, определяемых условием (3), идеальная стабилизация стационарной внутриклеточной концентрации ионов достигается при отношении n/k = -1.12 (рис. 7а). Стабилизация обеспечивается за счет роста пула аденилатов с ростом скорости потребления АТР (линия 1 на рис. 7Ь). При этом рост пула аденилатов определяется в основном ростом внутриклеточной концентрации АТР (рис. 7с, линия 1), в то время как энергетический заряд остается практически неизменным (рис. 7d, линия 1).

О 0.05 0.1 0.15 проницаемость, 1/ч

« я

X и о D"

Я Н

0.

0 0.05 0.1 0.15 проницаемость, 1/ч

Рис. 7. Зависимость стационарных значений внутриклеточной концентрации ионов (а), пула аденилатов (Ь), концентрации АТР (с) и энергетического заряда (d) от проницаемости клеточной мембраны для ионов. Линии 1 получены из модели (2) при значениях параметров, определяемых условиями стационарности (3). Линии 2 получены при неизменном пуле аденилатов.

Исследование модели показало, что эффективность стабилизации внутриклеточной концентрации ионов ухудшается с увеличением скорости метаболизма аденилатов. Одновременно уменьшается область существования устойчивого состояния в системе. Вероятно, низкие скорости метаболизма аденилатов в эритроцитах (Атауллаханов и др., 1984, Ьа1аппе ег а1., 1980, Яаророп I. е1 а1., 1977) обусловлены необходимостью обеспечения устойчивости клеточного метаболизма. Исследование модели показало, что оптимальная

корость метаболизма аденилатов в эритроците составляет от нескольких десятых гроцента до нескольких процентов от величины гликолитического потока. Увеличение этой скорости приводит к тому, что идеальная стабилизация Is уже ie может быть достигнута в области существования устойчивого стационарного кшения системы. При снижении скорости метаболизма аденилатов регуляция метаболизма аденилатов становится неэффективной, т.к. время существенного «менения величины пула аденилатов становится сравнимым с временем жизни эритроцита в кровотоке.

Полученные результаты показывают, что метаболизм аденилатов может функционировать как специфическая регуляторная система, стабилизирующая концентрации ионов, а следовательно, и объем эритроцита. Стабилизация обеспечивается при этом за счет роста пула аденилатов при увеличении скорости потребления АТР. Для обеспечения необходимой регуляции пула аденилатов достаточно, чтобы регулировалась только скорость разрушения AMP, при постоянной скорости его синтеза. Наилучшая стабилизация внутриклеточной концентрации ионов достигается в модели при условии, что АТР является активатором, а AMP - ингибитором процессов разрушения AMP. Управление работой ионных насосов за счет изменения концентрации АТР позволяет в несколько раз увеличить диапазон допустимых изменений проницаемости клеточной мембраны.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что внутриклеточная концентрация АТР и величина пула аденилатов в эритроцитах существенно зависят от концентрации аденозина в среде. Таким образом изменение уровня аденозина в крови может быть одним из механизмов воздействия организма на внутриклеточный энергетический метаболизм.

2. Величина пула аденилатов является регулируемым параметром и поддерживается метаболизмом аденилатов на определенном уровне, который определяется, по-видимому, состоянием энергетического метаболизма клетки.

3. Метаболизм аденилатов обеспечивает рост пула аденилатов в эритроцитах при увеличении проницаемости клеточной мембраны для катионов.

Рост концентрации ATP при этом увеличивает скорость работы ионного насос; что ведет к лучшей стабилизации концентрации ионов в клетке.

4. Для наблюдения за медленными переходными процессами в эритроцит разработана методика стерильной длительной, до 3 суток, инкубаци эритроцитов в жизнеспособном состоянии при условиях, имитирующи физиологические.

5. Построена математическая модель, качественно описывающа! взаимодействие систем ионного гомеостаза, энергетического метаболизма i метаболизма аденилатов в эритроцитах человека. Показано, что наилучша! стабилизация внутриклеточной концентрации ионов достигается в модели npi условии, что АТР выступает в качестве активатора, а AMP - в качеств« ингибитора процессов разрушения AMP. Оптимальная скорость метаболизм; аденилатов в эритроците составляет от нескольких десятых процента дс нескольких процентов от величины гликолитического потока.

Основные материалы диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Атауллаханов Ф. И., Витвицкий В.М., Комарова C.B., Мошаров Е. В. Энергозависимые процессы и метаболизм аденилатов в эритроцитах человека. Биохимия, 1996, 60, 2, 267-275.

2. Атауллаханов Ф. И., Витвицкий В.М., Комарова C.B. Возможная роль метаболизма адениновых нуклеотидов в регуляции объема эритроцитов человека, Биол. мембраны, 1996, 13,2, 204-215.

3. F. 1. Ataullakhanov, V. M. Vitvitsky, S. V. Komarova. A possible role of Adenylate metabolism in human erythrocytes. Simple mathematical model., J. Tlieor. Biol, (in press)