Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция аденозин 5'-монофосфат дезаминазы в эритроцитах человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция аденозин 5'-монофосфат дезаминазы в эритроцитах человека"

На правах рукописи УДК 577.23

МОШАРОВ Евгений Витальевич

РЕГУЛЯЦИЯ АДЕНОЗИН 5'-МОНОФОСФАТ ДЕЗАМИНАЗЫ В ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена в Гематологическом Научном центре РАМН

Научные руководители:

профессор, доктор биологических наук Ф.И. Атауллаханов кандидат физико-математических наук В.М. Витвицкий

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук А.Д. Виноградов доктор биологических наук Ю.Г. Каминский

Ведущая организация:

НИИ фармакологии РАМН

Защита диссертации состоится

«/0«

¿//я/// 1998 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.001.45.02 в Гематологическом научном центре РАМН по адресу 125167, г.Москва, Новозыковский проезд, дом 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан "_"_1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

/В.Д.Рсук/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время достигнут значительный прогресс в исследовании эегуляции клеточного метаболизма. В то же время, механизмы регуляции и ¡заимодсйствия многих важных метаболических систем в клетке остаются не юными. Это относится даже к такому важному внутриклеточному параметру, сак концентрация аденозин 5'-трифосфата (АТФ). Концентрация АТФ останавливается в результате взаимодействия энергетического метаболизма и метаболизма аденилатов. Энергетический метаболизм обеспечивает (заимопревращение между АТФ, аденозин 5'-дифосфатом (АДФ) и аденозин 5'-юнофосфатом (АМФ), определяя энергетический заряд клетки АТФ+0,5АДФ)/(АТФ+АДФ+АМФ). За счет регуляции энергетического 1етаболизма достигается хорошая стабилизация энергетического заряда во всех глетках. Метаболизм аденилатов определяет величину пула аденилатов -АТФ+АДФ+АМФ) - и концентрацию АТФ, уровень которого в клетках разных ипов сильно различается. Более того, у разных индивидуумов концентрация ^'ГФ в клетках одного типа также может значительно различаться. Причины тих различий до сих пор не ясны, более того, до конца не известна роль «етаболизма аденилатов в регуляции внутриклеточной концентрации АТФ. Таким образом, изучение регуляции метаболизма аденилатов имеет важное начение для понимания общих принципов регуляции энергозависимых фоцессов в клетке.

Человеческие эритроциты являются удобным объектом для изучения 1етаболизма аденилатов, который в эритроцитах млекопитающих не связан с интезом и гидролизом нуклеиновых кислот. Весьма вероятно, что его задачей [вляется исключительно регуляция внутриклеточных концентраций аденилатов, I в первую очередь, АТФ. Метаболизм аденилатов в эритроцитах человека ■строен довольно просто. Он включает два пути синтеза АМФ (из аденина и денозина) и два пути разрушения АМФ (через АМФ-дезаминазную и пурин 5'-|уклеотидазную реакции). Перераспределение между АМФ и другими щенилатами (АДФ и АТФ) катализируется высокоактивной аденилаткиназой.

Имеющиеся теоретические данные (Атауллаханов и др., 1996, Комарова 996) указывают на важную роль ферментов, катализирующих разрушение АМФ | регуляции пула аденилатов в эритроцитах. Результаты, полученные на

выделенных из эритроцитов АМФ-дезаминазе и пурин 5'-нуклеотидазе демонстрируют сложную кинетику этих ферментов, однако, могут не отражать реального их поведения в целой клетке. Во-первых, в процессе очистки свойства ферментов могут меняться, во-вторых, при исследовании выделенного фермента может быть не учтено влияние каких-либо эффекторов, присутствующих в целом эритроците. Подтверждением этому может служить то, что, скорость работы выделенной АМФ-дезаминазы при физиологических концентрациях АМФ, в присутствии всех известных эффекторов (Almaraz L. et al 1988, Вис Н. A. et al 1986, Ogasawara N. et al 1986, Yun, S.-L. et al 1978), оказывается в несколько раз выше, чем скорость разрушения АМФ, наблюдаемая в нативных эритроцитах (Bontemps F. et al. 1986, Marlewski M. et al 1991, Paglia D.E. et al 1986, Van den Berghe G. .et al 1988, 1990).

Таким образом, представляет интерес исследование кинетики разрушения АМФ в условиях, наиболее приближенных к внутриклеточным.

Цель работы.

Экспериментальное и теоретическое исследование механизмов регуляции метаболизма аденилатов в эритроцитах человека, а так же принципов взаимодействия метаболизма аденилатов и энергетического метаболизма клетки.

Задачи работы.

-экспериментальное исследование взаимосвязи между метаболизмом аденилатов и энергетическим метаболизмом в интактных эритроцитах человека и в эритроцитах с измененным энергетическим зарядом;

-изучение кинетики ферментов разрушающих АМФ (АМФ-дезаминазы и пурин 5'-нуклеотидазы) в гемолизатах эритроцитов человека;

-исследование влияния известных низкомолекулярных эффекторов на кинетику разрушения АМФ в гемолизатах эритроцитов;

-построение математической модели метаболизма аденилатов, опирающейся на полученные экспериментальные данные о кинетике ферментов, разрушающих АМФ.

Научная новизна.

-показано, что за счет активации метаболизма аденилатов при увеличении проницаемости клеточной мембраны для катионов улучшается стабилизация концентрации ионов в эритроците;

-получена зависимость скорости разрушения АМФ от концентрации АМФ в гемолизате эритроцитов человека, причем эта скорость при физиологических концентрациях АМФ, соответствует литературным данным о скорости работы этого фермента в нативных эритроцитах;

-показано существование продуктной активации АМФ-дезаминазы инозин монофосфатом (ИМФ), причем эта активация пропадает при диализе гемолизата;

-показано, что ИМФ способен, по крайней мере частично, снимать ингибирующее действие ортофосфата на АМФ-дезаминазную реакцию;

-с помощью математического моделирования показано, что введение продуктной активации АМФ-дезаминазы за счет ИМФ практически не влияет на метаболизм эритроцита при нормальных условиях, однако, значительно ускоряет гибель клетки при нагрузках на энергетический метаболизм, превышающих предельно допустимые значения;

-разработана новая методика хроматографического определения нуклеотидов, нуклеозидов и оснований, позволившая проводить одновременное измерение концентраций этих компонентов в метаболической смеси. Научно-практическая ценность.

Исследование системы метаболизма аденилатов позволяет лучше понять механизмы регуляции уровня АТФ в клетке. Это может иметь практическую ценность при разработке новых методов хранения донорской крови. Результаты работы найдут применение в биохимии, биофизике и клеточной физиологии. Кроме того, они могут пригодиться в медицине при диагностике заболеваний, :вязанных с нарушением нормального функционирования АМФ-дезаминазы и ¡урин 5'-нуклеотидазы. Результаты работы используются в курсе лекций 'Регуляция клеточного метаболизма", читаемом на физическом факультете МГУ трофессором Ф.И.Атауллахановым.

Предложенная методика хроматографического определения концентраций туклеотидов, нуклеозидов и оснований в перхлорных экстрактах позволяет :низить материальные затраты на проведение подобного измерения.

Апробация работы состоялась 9 октября 1997 г. на заседании проблемной сомиссии "Консервирование клеток крови, ее компонентов и костного мозга; шохимия, биофизика крови" в Гематологическом научном центре РАМН.

Материалы диссертации докладывались на конференциях: Bio Thermo Cinetics of The Living Cell (1996, Лувьян-Ла-Нев, Бельгия), XI Meeting of the Eur.

Assoc. for Red Cell Research (1997, Гозд-Мартулек, Словения), 2-ой Биохимический конгресс (1997, Москва, Россия), Purines (1997, Нью Орлеан, США).

Публикации.

Материалы диссертации изложены в 4 публикациях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов исследования, глав 3, 4, основного текста), обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 112 источников.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физической биохимии системы крови Гематологического научного центра РАМН (зав. лаб. - д.б.н., проф. Ф.И. Атауллаханов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В главе 1 приведен обзор литературных данных об эритроците человека, его энергетическом метаболизме и метаболизме адениновых нуклеотидов. Проанализированы известные экспериментальные данные о кинетических свойствах ферментов метаболизма аденилатов и известных механизмах регуляции потоков метаболитов.

: В главе 2 описываются материалы и методы исследований. В работе использовались эритроциты, выделенные из крови здоровых доноров. Исследования на целых эритроцитах проводились в изотоническом растворе следующего состава: NaCl - 135 мМ, KCl - 3 мМ, MgS04 - 1 мМ, СаС12 - 2 мМ, NaH2PÜ4 - 1,2 мМ, альбумин (БСА) - 2 г/л, HEPES - 24 мМ, pH =7,4.

Для получения гемолизата отмытые эритроциты инкубировались 24 часа в растворе содержащем 150 мМ NaCl, 30 мМ KCl и 50 мг/л гентамицина (раствор А) при 37°С, после чего 3 раза отмывались раствором А и 3 раза раствором, содержащим 150 мМ KCl, 2 мМ MgCh, 10 шМ TrisHCI и 3 мМ ß-меркаптоэтанола, pH 7,4 (раствор В). Далее эритроциты лизировались

добавлением сухого сапонина, из полученного гемолизата центрифугированием удалялись мембраны и его рН доводился до значения 7,4.

Для диализа 20 мл гемолизата против 1л раствора В, использовалась мембрана с порами, пропускающими молекулы размером менее 12 кДа.

Зависимость скорости разрушения АМФ от концентрации АМФ (У(АМФ)) получали двумя способами. При больших концентрациях АМФ (более 0,5 мМ) использовалась методика измерения начальной скорости разрушения добавленного к инкубационной смеси АМФ. При концентрациях АМФ близких к физиологическим (меньше 0,5 мМ) нами была использована методика непрерывного введения АМФ. Суть методики состоит в том, что в ячейку с гемолизатом непрерывно с постоянной скоростью вводился раствор В, содержащий АМФ. Установление стационарной концентрации АМФ в ячейке говорит о том, что при этой концентрации скорость разрушения АМФ равна известной нам скорости введения АМФ в гемолизат, что позволяет построить зависимость У(АМФ).

Определение концентраций нуклеотидов, нуклеозидов и оснований проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по разработанной нами оригинальной методике. Дополнительно концентрацию АТФ определяли модифицированным тоциферин-люциферазным методом (Атауллаханов, Пичугин, 1981); концентрацию экстраклеточного К+ определяли на пламенном фотометре; гемолиз - спектрофотометрически по выходу гемоглобина из эритроцитов в среду; определение ортофосфата - с помощью тест-набора для определения фосфата.

Для аппроксимации полученных экспериментально кривых использовалась программа Excel фирмы Microsoft. При исследовании систем дифференциальных уравнений - пакет прикладных программ DBSolve (автор И.Горянин).

Часть экспериментальной работы, касающаяся исследования целых эритроцитов выполнена в соавторстве с C.B. Комаровой. В построении и анализе математической модели метаболизма эритроцита принимал участие М.В.Мартынов.

Глава 3 посвящена описанию и обсуждению результатов экспериментального исследования. В первой части 3 главы рассматривается влияние различных концентраций аденозина на метаболизм аденилатов и

энергетический метаболизм в интактных эритроцитах человека и в эритроцитах с пониженным энергетическим зарядом. Для снижения энергетического здряда эритроцитов использовали активацию транспортной Na,+K+- АТФазы путем увеличения проницаемости мембраны эритроцита с помощью полиенового. антибиотика амфотерицина В. Амфотерицин В в концентрациях 0,5-3 мг/л вызывает увеличение проницаемости мембраны эритроцита для катионов, что приводит к активации транспортной Na+/K+- АТФазы, снижению уровня АТФ и. энергетического заряда клетки, и активации гликолиза (Эль-Суфи и др., 1991, Segel et al„ 1975, Blum et al., 1969).

При концентрациях аденозина (Ads) меньше 1 мМ его уровень в суспензии интактных эритроцитов в течении длительного времени удаётся поддержать в присутствии коформицина. При этом в ходе инкубации наблюдается медленное снижение концентрации ■ Ads и накопление гипоксантина (Нх) в суспензии. Инозин в суспензии не регистрируется, а сумма концентраций Ads и Нх медленно уменьшается (рис.1). Наблюдаемое в присутствии коформицина падепие концентрации аденозина сопровождается незначительным ростом концентрации АТФ (табл.1) и увеличением пула аденилатов (табл.2).

Рис.1.Кинетика изменения концентраций аденозина, инозина и гипоксантина при добавке 0.1 мМ аденозина в суспензию нативных эритроцитов человека без коформицина (А) и в присутствии коформицина (В).

Таблица 1. Влияние аденозина на уровень АТФ в интактных эритроцитах и в эритроцитах, обработанных амфотерицином В. Концентрация аденозина составляла : в опыте 5 - 0,8 мМ, в остальных опытах - 0,3 мМ. Концентрация амфотерицина В: в опытах 1-3,5 - 3 мг/л суспензии, в опыте 4 - 1 мг/л суспензии. В таблице приведены средние значения и стандартные квадратичные отклонения. В

Стационарная концентрация АТФЛммоль/л.кл.1

№ опыта. Аденозин и Амфотерицин В,

Контроль. коформицин Амфотерицин В. аденозин и

коформицин.

1 1,7±0,1 1,9±0,2* 1,51±0,08** 1,86+0,08**

(5) (5) (4) (5)

2 1,5+0,2 1,7+0,1* 1,15±0,05** 1,7±0,2

(6) (5) (6) (5)

3 1,4±0,1 1;47±0,08 1,04+0,05** 1,24+0,07**

(4) (4) . (4) (4)

4 1,37±0,07 1,5±0,2 1,2+0,1** 1,3+0,1

(6) (6) (6) (6)

5 1,2+0,1 . 1,3±0,1 1,0+0,1** 1,3+0,1

(7) (5) (7) , (7)

* - Данные отличаются от контроля с вероятностью погрешности а<0,1

** - Данные отличаются от контроля с вероятностью- погрешности а<0,05. Остальные

данные достоверно от контроля не отличаются.

Таблица 2. Влияние аденозина на пул аденилатов в эритроцитах, обработанных амфотерицином В. Приведены начальные (нач.) и конечные (кон.) уровни пула аденилатов в ходе инкубации. Ошибка определялась погрешностью измерения концентраций компонентов пула аденилатов и составляла около 10%.

№ опыта Время инкубации (ч) Пул аденилатов, [ммоль/л.кл.]

Контроль Аденозин и коформицин Амфотерицин Амфотерицин аденозин и коформицин

нач. кон. нач. кон. нач. кон. нач. кон.

1 7 2,45 2,25 2,45 3,50 2,45 2,30 2,45 3,10

2 8 1,90 2,10 2.00 3,25 1,90 2,10 1,80 2,60

5,5 2,00 1,70 2,20 2,75 2,10 1,60 1,85 2,45

:' 4 5 - - 1,85 2,40 1,85 1,85 1,85 2,35

б • 5 §4

О

м

3 3

X

и

о 1 •

-о-в-

К суспензии эритроцитов добавлены: О Алсиозил; О Амфотерипия В; А Амфотерицин В и адеиознн.

100

200 300

Время, |МШ1]

На рис.2 представлены данные по влиянию аденозина на кинетику выхода К+ из эритроцитов, обработанных амфотерицином В. Обусловленное наличием аденозина повышение внутриклеточной

концентрации АТФ (табл.1) и рост пула аденилатов (табл.2), приводит к значительному снижению, вызванного амфотерицином В, выхода К+ из эритроцитов.

Особо следует отметить, что

Рис.2. Влияние аденозина в присутствии

коформицина на кинетику выхода К+ из ПРИ добавлении к эритроцитам

эритроцитов, обработанных амфотерицином амфоТерицина В энергетический В.

заряд клетки падает, но снижения пула аденилатов не происходит. Согласно существующим в литературе представлениям, при увеличении внутриклеточной концентрации АМФ (в нашем случае в присутствии амфотерицина В) должна увеличиться скорость его разрушения, что приведет к падению концентрации АМФ и, как следствие, к нормализации энергетического заряда эритроцита. При этом пул аденилатов должен снижаться, однако в наших экспериментах он растет также как и в контрольных эритроцитах с нормальным энергетическим зарядом. То же самое можно сказать о росте пула аденилатов в присутствии аденозина - он приблизительно одинаков в нативных эритроцитах и эритроцитах, обработанных амфотерицином В. Эти результаты указывают на то, что скорость разрушения АМФ зависит не только от концентрации субстрата, но и от энергетических потребностей клетки,

' _ Полученные результаты хорошо согласуются с . гипотезой о роли метаболизма аденилатов в регуляции объема эритроцита, впервые ¿формулированной в работе Ф.И. Атауллаханова (Атауллаханов, 1982). Согласно этой гипотезе, увеличение внутриклеточной концентрации АМФ вследствии увеличения АТФазной нагрузки должно приводить к росту пула

аденилатов, чтобы за счет изменения абсолютной концентрации АТФ модулировать работу Ыа+/К+-АТФазы, обеспечивая стабилизацию концентраций ионов и, следовательно, объема эритроцита. Экспериментальные данные по влиянию аденозина на вызванный амфотерицином В выход К+ показывают, что метаболизм аденилатов действительно может играть роль в регуляции АТФ-зависимых процессов, в частности, ионных насосов.

Во второй части главы 3 описываются эксперименты по изучению кинетики разрушения АМФ в гемолизате энергетически истощенных эритроцитов в котором отсутствуют АТФ, АДФ и 2,3-дифосфоглицерат.

На рис.3 представлена зависимость скорости разрушения АМФ от концентрации АМФ в гемолизате эритроцитов человека.

Разрушение АМФ в гемолизате истощенных эритроцитов человека осуществляется в основном за счет работы АМФ-дезаминазы. Как видно из рисунка, при физиологических концентрациях АМФ (менее 0,1 мМ) скорость разрушения АМФ очень мала и соответствует литературным данным о скорости работы АМФ-дезаминазы в эритроцитах человека (Hawkins et al, 1980).

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 Концентрация АМФ, [мМ]

160-, о

140

4 <

5 а

.- 100-

80

60-

&

с] С.

Л

в

о а о а U

20

о

без добапок

в присутствии 5 мМ ИМФ

0 2 4 6 8 10 12

Концентрация АМФ, [мМ]

20

40

Рис.3. Зависимость скорости разрушения АМФ от концентрации АМФ в гемолизате истощенных эритроцитов человека, при низких (А) и высоких (В) уровнях АМФ.

120-

? 100

без добавок В присутствии:

В гемолизате эритроцитов нами впервые обнаружено активирующее действие ИМФ на скорость АМФ-дезаминазной реакции (рис.ЗВ). Показано, чтс ИМФ увеличивает Ут и уменьшает Кт фермента^ не влияя на кооперативное« его работы. Активирующее действие ИМФ никогда ранее не описывалось I литературе, более того, на АМФ-дезаминазе из белых мыщц лосося былс обнаружено ингибирующее действие ИМФ (Лущак и др, 1995). Это указывает на то, что кинетические свойства выделенного фермента сильно отличаются от свойств, наблюдаемых нами в гемолизате, и следовательно, могут отличаться от свойств АМФ-дезаминазы в целых эритроцитах.

Диализ гемолизата эритроцитов приводит к тому, что зависимость скорости разрушения АМФ от концентрации АМФ становится гиперболической функцией (рис.4) с Кп = 4±1 мМ и активностью 150±2С мМ/ч.л.кл., что соответствует данным полученным на выделенной АМФ-дезаминазе в отсутствии эффекторог (Уип е1 а1, 1978; КаророП е1 а1, 1979 Авкап е1 а1, 1968).

ИМФ не активирует АМФ-дезаминазную реакцию в гемолизат« после диализа (рис.4). Это объясняет то1 факт, что до нас эту активацию никто ж обнаружил на выделенном ферменте I

Рис.4. Зависимость скорости разрушения

АМФ от концентрации АМФ в указывает на то, что в недиализованно\ диализованном гемолизате эритроцитов

человека. гемолизате действие ИМФ сводится I

тому, что он снимает действие какого-то низкомолекулярного ингибитора, удаляющегося во время диализа. На рол! такого ингибитора подходит ортофосфат, который является ингибиторои фермента (рис.4)# и данные по совместному действию ИМФ и ортофосфата Н! активность АМФ-дезаминазы в диализованном гемолизате эритроцито: подтверждают эту гипотезу. Гемолизат до диализа содержал 1,5 - 2,5 м!У ортофосфата,при этом скорость разрушения АМФ при его концентрации 1 м\

Концентрация АМР, [мМ]

составляла около 5 мМ/ч.л.кл. Приблизительно такую же скорость мы обнаруживаем в диализованном гемолизате эритроцитов в присутствии 2-3 мМ КН2РО4. Добавка 5 мМ ИМФ в обоих случаях приводит к 2х-3х кратной активации АМФ-дезаминазы. По всей видимости, ИМФ и ортофосфат конкурируют за одно место связывания на АМФ-дезаминазе, причем ортофосфат является ингибитором фермента, а ИМФ нет.

Глава 4 посвящена изучению, с помощью математического моделирования, влияния продуктной активации АМФ-дезаминазы на метаболизм эритроцита.

Полученная экспериментально зависимость скорости АМФ-дезаминазной реакции от концентраций АМФ и ИМФ хорошо описывается следующим выражением:

а гпр^

[ИМФ)

^атрс!

|АМФ|х 1 +

|ИМФ]

где: ^т[х] = 100 мМ/чл.кл. Кт = 3,0 мМ Ка, = 3,5 мМ Ка2 = 10 мМ п = 2,5

Для того чтобы ответить на вопрос о том, какое значение для эритроцита может иметь обнаруженная нами активация АМФ-дезаминазы за счет ИМФ, мы исследовали математическую модель эритроцита, описанную в работах Атауллаханова и Комаровой (Атауллаханов и др. 1996; Комарова 1996), дополнительно включив в нее АМФ-дезаминазую реакцию и метаболизм ИМФ. При этом были рассмотрены варианты с наличием и отсутствием продуктной активации АМФ-дезаминазы. Модель включает в себя в упрощенном виде гликолиз, трансмембранный ионный градиент, ионный насос, и метаболизм аденилатов.

Анализ полученной модели показал, что введение АМФ-дезаминазной реакции, практически не влияет на метаболизм эритроцита при физиологически нормальных условиях. Как в присутствии, так и в отсутствии продуктной активации АМФ-дезаминазы, в модели обеспечивается стабилизация внутриклеточной концентрации ионов при значительном изменении проницаемости клеточной мембраны для катионов.

■Л ' /

В модели, помимо физиологически нормального состояния, устойчивым является и нулевое состояние. При переходе в это состояние уровень АТФ i клетке стремится к нулю, а внутриклеточная концентрация ионов растет дс равновесия со внешней средой. При сильном увеличении проницаемое™ клеточной мембраны, область притяжения нулевого стационарного состояния сильно увеличивается. Поэтому, значительное скачкообразное увеличение проницаемости мембраны приводит к необратимому переходу системы к этому состоянию, то есть к гибели клетки. Критическим уровнем, для модели с продуктной активацией АМФ-дезаминазы, является увеличение проницаемости мембраны в 2,5 раза, а для модели без активации - в 2,8 раза.

Как видно из рисунка 5, наличие положительной обратной связи в модели с активацией АМФ-дезаминазной реакции за счет ИМФ, в несколько раз увеличивает скорость падения концентрации АТР и роста внутриклеточной концентрации ионов при увеличении проницаемости клеточной мембраны, выше этого критического уровня.

' 160

" 140-

к

§ 120 «

е-

| 100

X

0 Ьй

3 80

X

1 60

Г40 -

20

0 50 100 150 200 250 300 Время, [ч]

50 100 150 200 250 300 Время, [ч]

Рис.5. Изменение внутриклеточных концентраций АТФ (А) и Ыа+ (В) при увеличен™ проницаемости клеточной мембраны для катионов в 2,81 раза в моделях с продуктно] активацией АМФ-дезаминазы инозин монофосфатом (сплошная линия) и без нее (пунктирна линия).

Таким образом, активация разрушения АМФ за счет ИМФ может ускорять гибель сильно поврежденных клеток, являясь при этом своеобразным механизмом апоптоза эритроцита. Следовательно, обнаруженная нами продуктная активация АМФ-дезаминазы может иметь важное значение для физиологии эритроцита, так как позволяет быстрее удалять из кровотока нежизнеспособные клетки.

ВЫВОДЫ.

1. Метаболизм аденилатов может обеспечивать рост пула аденилатов и концентрации аденозин 5'-трифосфата (АТФ) в эритроцитах с увеличенной проницаемостью мембраны для катионов. Рост концентрации АТФ способствует улучшению стабилизации концентрации ионов клетки. Ключевую роль в регуляции метаболизма аденилатов играют ферменты разрушения аденозин 5'-монофосфата (АМФ): пурин 5'-нуклеотидаза и АМФ-дезаминаза.

2. Получена зависимость скорости разрушения АМФ от концентрации АМФ в гсмолизате эритроцитов. Эта зависимость описывается 5-образной кривой со степенью сигмоидности равной 2,3 и определяется в основном АМФ-дезаминазой. Скорость АМФ-дезаминазной реакции при физиологических концентрациях АМФ не превышает 0,01 мМ/ч.л.кл., что снимает противоречие между низкой скоростью разрушения АМФ в нативных эритроцитах и высокой активностью выделенной АМФ-дезаминазы.

3. Обнаружено активирующее действие инозин 5-монофосфата (ИМФ) на скорость АМФ-дезаминазной реакции. Активирующий эффект обусловлен тем, что ИМФ уменьшает ингибирование АМФ-дезаминазы ортофосфатом.

4. Построена математическая модель, качественно описывающая взаимодействие энергетического метаболизма, ионного гомеостаза и метаболизма аденилатов в эритроцитах человека. Введение в модель продуктной активации АМФ-дезаминазы за счет ИМФ практически не влияет на метаболизм эритроцита при физиологически нормальных условиях. При больших нагрузках на энергетический метаболизм, приводящих к гибели клетки, активация разрушения АМФ за счет ИМФ значительно ускоряет разрушение эритроцита.

Основные материалы диссертационной работы изложены в следующи:

публикациях:

1. Лтауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Комарова С.В., Мошаров Е.В Энсргозависимые процессы и метаболизм аденилатов в эритроцитах человека Биохимия, 1996, 61, 2, 266-275.

2. Koinarova S.V., Vitvitsky V.M., Mosharov Е.М., Martynov M.V., Ataullakliano' F.I., Interections of adenylate metabolism, energy metabolism and ion transport ii human erythrocytes, BioTliermoKinctics of Living Cell, 1996, 101-103;

3. Мошаров E.B., Комарова С.В., Витвицкий В.М., Лтауллаханов Ф.И Регуляция ЛМР-дезамипазы в эритроцитах человека. Тезисы 2-оп Биохимического Конгресса. Москва, 1997, 217-218.

4. Mosharov E.V., Komarova S.V., Ataullaklianov F.I., Vitvitskii V.M. Regulation о AMP-deaminase in human erythrocytes. Purines and their reccptors, Abstract book USA, 1997, ThP17.

Отпечатано в фотомножительной мастерской Геологического ф-та МГУ Тираж ига экз. Заказ № Ь'Э