Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт одновалентных ионов в эритроцитах карпа: механизм и регуляция

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Транспорт одновалентных ионов в эритроцитах карпа: механизм и регуляция"

Цо 0,4 9.2

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.352.4

СКРЯБИН Георгий Анатольевич

ТРАНСПОРТ ОДНОВАЛЕНТНЫХ ИОНОВ В ЭРИТРОЦИТАХ КАРПА: МЕХАНИЗМ И РЕГУЛЯЦИЯ

03.00.02— Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физи-ко-химии биомембран, биологического факультета, Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор С. Н. Орлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А. С- Соболев

кандидат биологических наук Г. В. Максимов

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН.

Защита диссертации состоится «/^ » л?£/\£1 1992 г.

в часов на заседании специализированного совета

К.053.05.68. в Московском государственном университете им. М- В. Ломоносова по адресу: 119889, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический ф-т.. /-сир ¿1/ор^Зи/-", ссу у , /-/о&а-Л' ' '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » С//у ¿>¡1. 1992 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, доктор биологических наук

Б. А. Гуляев

. г.. . hi Л

.•"¡■дел :ертациЯ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность теш. Поддержание неравновесного распреде-

ления одновалентных ионов между цитоплазмой и внеклеточной жидкостью является одной из основных функций плазматической мембраны. К настоящему времени установлено, что единственной

ретикулоцитах и в эритроцитах большинства представителей млекопитающих является Na+,K+-насос, сопряженный с функцией 1{а+,К+-АТФазы. Эта система обеспечивает компенсацию входящих потоков Na+ и выходящих потоков К*, реализуемых по механизму пассивной диффузии катионов через липидный бислой мембраны и (или) места белок-липидных контактов.

В мембране эритроцитов млекопитающих содержится также набор ионных переносчиков, осуществляющих транспорт по механизму облегченной диффузии: На+,К+,2С1~- и К+,С1~-котранспорт, Ha+/Na+-и Na+/H+-o6MeH, анионный переносчик [Bernhardt et al., 1988].

Однако, в отсутствии внешних стимулов, относительная активность этих ион-транспортирующих систем, также как и единственного типа каналов, обнаруженных в эритроцитах (Ca -активируемые К+-каналы) невысока и составляет от 0,1 до 10% от общей величины входящих и выходящих потоков ионов. Исключение составляет высоко-активный анионный обменник, на долю которого приходится от 10 до 30% мембранного белка, выполняющего основную функцию в регуляции внутриклеточного pH [Knauf, 1937].

Функциональная роль других, перечисленных выше ион-транспортирующих систем сводится, по-видимому, к регуляции клеточного объема.

Набор ион-транспортирущих систем в эритроцитах отличается

системой, обеспечивающей неравновесное распределение Na+ и К+ в

большой видовой специфичностью, что открывает уникальные

возможности для изучения механизмов функционирования и

регуляции частных ион-транспортирующих систем. Так, например,

зрелые эритроциты хищников не содержат Na+,К+-насос, а

трансмембранный градиент катионов создается за счет

сопряженного функционирования Иа+/Са^+-обмена [Parker, 1978] и

Са^+-АТФазы [Bernhardt et al., 1988]. Именно на этих объектах

. р.

получены основные сведения о кинетических параметрах Na /Са -обмена. Эритроциты быка, лошади и низкокалиевые эритроциты овец

не содержат Са^+-активируемых К+-каналов, что создает еозмох-

?+

ность изучения роли внутриклеточного Са в регуляции активности Na+,К+-АТФазы и ионных переносчиков [Bernhardt et al., 1988].

Следует однако отметить, что в безъядерных эритроцитах, как правило, отсутствуют те или иные компоненты системы передачи сигнала от рецептора на ферменты исполнители, что затрудняет изучение гормональной регуляции активности ион-транспортирующих систем. Напротив, в ядерных эритроцитах птиц, пресмыкающихся и рыб содержатся ^-рецепторы, сопряженные с аденилатциклазой. На эритроцитах птиц установлено, что 0-адренергическая стимуляция приводит к активации На+,К+,2С1~-котранспорта [Мс Manus, Schmidt, 1978]. функциональное значение этого явления, не установлено. Обнаружили , что в эритроцитах радужной форели (Salmo gairdneri') (¡-адренергические катехоламины вызывают интенсивное накопление Na+, обусловленное активацией Na+/H+-o6Mem [Nikinmaa,1982; Cossins, Richardson, 1985].

Исходя из приведенных выше данных исследовали вклад частных ион-транспортирующих систем в регуляцию потоков Na+ и в эритроцитах карпа (Cyprinus carpiо) в покое и при действии

агонистов адрено- и холино-рецепторов. Учитывая данные о влиянии активности ионных переносчиков на объем эритроцитов и данные об объем-зависимой регуляции транспорта ионов, также изучили влияние осмолярности среды на трансмембранные потоки одновалентных катионов.

Цель и задачи исследования.

1. Оценить влияние ингибиторов частных ион-транспортирую-щих систем (уабаина, фуросемида и амилорида) на величину входящих потоков и радиоактивного аналога К+ - ®%Ь+, а

, ОС .

также выходящего потока К ( Юз ) в эритроцитах карпа.

2. Изучить влияние адренергических и холинергических агонистов, а также активатора аденалатциклазы (форсколина) и активаторов протеинкиназ А и С (дибутирил ц-АМФ и £-форболового эфира (ТРА)) на активность частных ион-транспортирующих систем.

3. С помощью холерного и коклюшного токсинов оценить вовлечение ГТФ-связыващих белков в регуляцию ионных потоков Ма+ и К'!'

4. Исследовать влияние осмолярности среды на объем эритроцитов карпа и величину трансмембранных потоков Иа+ и К+.

5. Оценить участие анионного переносчика и Са^+-активиру-емых К+-каналов в формировании электрического потенциала мембраны эритроцитов карпа.

Научная новизна работы. Установлено, что в эритроцитах карпа добавление катехоламинов приводит к активации Иа+/Н+-обмена, однако уровень активации существенно ниже, чем в эритроцитах форели, что можно связать с различной двигательной активностью этих рыб. Действие катехоламинов, устраняется антагонистами Д- но не а-рецепторами и иммитируетг I форсколином и дибутирил-ц-АМФ.

Впервые показано, что в отличии от большинства других типов клеток, в эритроцитах рыб относительное участие системы протеинкиназы С в регуляции На+/Н+-обмена существенно меньше, нежели протеинкиназы А. Влияние холинорецепторов на. транспорт одновалентных ионов в эритроцитах карпа не обнаружено.

Впервые установлено, что активация Ка+,К+-насоса при действии /3-адренергических катехоламинов не устраняется полностью добавлением ингибиторов На+/Н+-обмена или переводом клеток в безнатриевую среду. Это наблюдение указывает на возможность сопряжения ^-рецепторов и На+,К+-АТФазы.

Показано, что 2-х кратное увеличение объема эритроцитов карпа приводит к 3-5 кратному увеличению входящих и выходящих потоков что судя по частичному ингибирущему действию

фуросемида связано с активацией К*, С1 "-котранспорта.

Сжатие клеток сопровождается увеличением скорости На+/Н+-обмена более чем на два порядка. Влияние клеточного объема на На+,К+-насос, Иа+,К+,2СГ-котранспорт не обнаружено. Предполагается, что К, С Г -котранспорт и -обмен являются

основными ион-транспортирушдими системами, обеспечивающими регуляцию объема эритроцитов карпа.

Установлено, что в присутствии протонофора увеличение 2+

внешней концентрации Са не приводит к гиперполяризации мембраны эритроцитов карпа. В отсутствии протонофора валиномицин не- влияет на электрический потенциал мембраны эритроцитов карпа. На основании этих данных можно заключить, что

П. I

в эритроцитах карпа отсутствуют Са -активируемые К -каналы, а эффективность работы анионного переносчика в электрогенном режиме крайне низка.

Научно-практическая значимость работы. На основании данных о регуляции активности }1а+/Н+-обмена и На+,К+-насоса (Ьадренергическими катехоламинами, а также данных о низкой активности работы анионного переносчика в электрогенном режиме предложена схема регуляции внутриклеточного рН в эритроцитах рыб /?-адренергическими катехоламинами. По-видимому, обнаруженный механизм реализуется в условиях повышенной двигательной активности и обеспечивает высокое сродство гемоглобина к в условиях закисления плазмы крови, вызванного интенсификацией процессов гликолиза и липолиэа.

Результаты работы представляются также важными для интерпретации данных по нарушениям гормон- и объем-зависимой регуляции ион-транспортирующих систем в эритроцитах.

Основные положения работы используются в курсе лекций и практических занятий, проводимых на кафедрах биофизики и физиологии человека и животных МГУ, а также кафедре биофизики

Томского медицинского института.

Апробация работы. Результаты работы докладывались: на Международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизм его регуляции" (Тбилиси, 1989); Всесоюзной конференции патофизиологов (Кишенев, 1989); заседании Московского общества испытателей природы (Москва, 1990); Всесоюзном семинаре "Вопросы метаболизма рыб" (Планерское, 1990); П-ом Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рыб" (Ростов-Великий, 1990); семинаре Института физиологии Мюнхенского университета (ФРГ, 1991).

Публикации. По тема диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (165 ссылок). Работа изложена на 136 страницах, содержит 13 рисунков и

14 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы Источники эритроцитов. В экспериментах использовали карпов-самцов массой 300-400 г., крыс-самцов линии Киото-Вистар в возрасте 12-15 недель, а также свежую донорскую кровь.

Получение эритроцитов. Кровь забирали у карпа из сердца, у крыс из брюшной аорты под эфирным наркозом, у пациентов - из локтевой вены натощак. В качестве антикоагулянта использовался раствор гепарина в среде А (1000 ед/мл). Среда А мМ:145 NaCl; 5 фосфатный буфер (pH 7,6 при 25° С) - карп. Среда А для крыс и человека имела pH 7,4 при 37° С. После центрифугирования (900g) плазму и клетки белой крови удаляли, а эритроциты трижды промывали средой А. Эритроциты от нескольких животных смешивали и центрифугировали (900 g) 10 мин ("упакованные эритроциты"). Все операции проводили при температуре тающего льда.

Определение объема внутриклеточной воды. Объем клеток, определяемый объемом внутриклеточной воды оценивали по свободно проникающей HgO. Для оценки объема внеклеточного пространства использовали непроникающий через мембрану высокомолекулярный полисахарид инулин. К 1,5 мл среды В добавляли 1,2 мл упакованных эритроцитов, встряхивали, центрифугировали (3000 об/мин, 5 мин, FP-9, Финляндия) и супернатант полностью удаляли. Среда В мМ:145 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl, 5 CaCl, 5 глюкоза, 10 HEPES-трис-буфер (pH 7,6, при 25° С).

К осадку клеток добавляли 1,2 мл среды В, содержащей ^HgO (2 мкКи/мл) или [%]■-инулин (I мкКи/мл). В ряде случаев осмолярность среды повышали добавлением сахарозы (до 500 мЮ

или уменьшали, понижая концентрацию NaCl до 65 мМ. Через 5, 15, и 30 мин инкубации при 25° С 300 мкл суспензии переносили в пробирки и центрифугировали при указанных выше условиях. 50 мкл супернатанта переносили в 0,5 мл 0,5%-ного раствора тритона X-I00 и после добавления 0,5 мл 10%-ного раствора три-хлоруксусной кислоты (ТХУ) вновь центрифугировали. Супернатант (0,8 мл) переносили для определения радиоактивности во флаконы, содержащие 10 мл раствора Брея. Клетки обрабатывали тритоном Х-100 и ТХУ и определяли содержание и [^Ш-инулина.

Содержание внутриклеточной воды в I литре исходно упакованных эритроцитов рассчитывали по формуле (Р^-А^/к^, где Aj-общая радиоактивность ^HgO в осадке клеток,

о

А2~радиоактивность HgO, приходящаяся в осадке на внеклеточную воду, A^-радиоактивность ^HgO в супернатанте, объем которого равен исходному объему упакованных эритроцитов в пробе для определения Aj (104 мкл), т.е. A3=Ag-104/40 =2,6-Ag, а А2=

о

A^Ag/Ag (А^- радиоактивность [°Н]-инулина в осадке клеток, Ag и Ag - радиоактивность [%]-инулина и в аликвоте супернатанта.

рр ос.

Вход ^Na и Rb. Упакованные эритроциты (30-50 мкл) переносили в I мл среды В, суспензию встряхивали, центрифугировали (3000 об/мчн, 5 мин) и супернатант удаляли. К осадку

рр

клеток добавляли 200 мкл среды В, содержащей 2 мкКи/мл Na или 0,5-1 мкКи/мл радиоактивного аналога калия - ®®Rb. В ряде экспериментов среда инкубации содержала ингибиторы ион-тран-спортирующих систем, норадреналин, антагонисты о- и |3-адреноре-цепторов, форсколин, дибутирил-ц-АМФ, ТРА. В опытах с холерным и коклюшными токсинами, а также в экспериментах с цитохалази-ном В клетки предварительно преинкубировали с этими веществами

в среде В в течение 2 ч при 25° С (эритроциты карпа) или при 37® С (эритроциты крысы). По окончании инкубации реакцию останавливали добавляя I мл холодной (2 - 4° С) среды А и после центрифугирования супернатант удаляли. Промывку повторяли дважды, осадок клеток лизировали в 0,5 мл 0,5%-ного раствора тритона Х-100 и добавляли 0,5 мл 10%-ного раствора ТХУ. После центрифугирования (900 g, 10 мин) 0,8 мл суспензии переносили в раствор Брея для определения радиоактивности. Скорость входа и рассчитывали по формуле: У-^-А^) (I);

где и А^ - радиоктивность т литров эритроцитов через 1 инкубации при 25® С и через 30 с инкубации при 2-4° С соответственно (имп/мин), а-удельная радиоактивность или (имп/ мин ммоль). Обнаружили, что кинетика накопления «Й, и Ка носит линейный характер до 1,5-2,5 ч инкубации. В этой связи, для определения V время инкубации ограничивали 30 (®%Ъ) и 45 мин (^%а). Об активности Иа+,К+-насоса Ша+,К+-АТФазы) судили по величине уабаин-ингибируемого компонента скорости входа Учитывая, что фуросемид ингибирует как На+,К+,2С1~-, так и На+,С1~- и К+,С1"-котранспорт, величину уабаин-нечувствитель-' ного фуросемид-ингибируемого компонента трансмембранного переноса и обозначали общим термином "котранспорт". . .

Скорость Ка+/Н+-обмена определяли как уабаин-нечувствитель-

ор

ный компонент скорости входа ингибируемый амилоридом.

Выход К 5 мл среды В, содержащей 3-4 мкКи/мл «И,. добавляли 1,5 мл эритроцитов и инкубировали б ч при 25° С. Центрифугировали, супернатант удаляли и эритроциты 4 раза промывали 5 мл холодной среды В без радиоактивности. Для регистрации кинетики выхода 50 мкл упакованных эритроцитов переносили в I

мл холодной среды В, центрифугировали, супернатант удаляли, осадок клеток суспендировали в 200 мкл среды В различной тоничности содержащей 0,2 уабаин и в некоторых экспериментах 0,5 мМ фуросе-мид. Через 60 мин инкубации при 25°С к суспензии добавляли I мл холодной среды А, центрифугировали, I мл супернатанта переносили в 10 мл раствора Брея. Для определения общей радиоактивности системы остаток суспензии обрабатывали тритоном и ТХУ. Скорость выхода определяли по уравнению (I), но в данном случае а-удельная радиоак-сть в клетках в начальный момент времени.

Определение содержания внутриклеточных концентрации калия и натрия. Эритроциты (50 мкл) триады промывали средой, содержащей 160 (¿Л холинхлорида и 10 мМ трис-HCl (рН 7,4, 25°С), добавляли 0,5 мл воды, 0,5 мл 0,3 н. НС1, центрифугировали и супернатант разводили в 100 раз водой. Измерения проводили на атомно-абсор-бционном спектрофотометре АА-855 ("Nippon Jarrel", Япония).

Кинетика перераспределения протонов. К'1,8 мл среды В добавляли 200 мкл эритроцитов, которые инкубировали (30 мин, 25° С) при периодическом встряхивании, после чего в суспензию помещали электрод (Orion 91-15, США) и при постоянном перемешивании добавляли вещества, указанные в подписях к рисункам 8, 9. Изменения рН в диапазона 6,0-6,0 осуществляли с помощью 0,2 н. НС1 и КОН. Измерения проводили на рН-метре РНМ-64 ("Radiometer", Дания). Для расчета количества высвободившихся (поглощенных) протонов определяла буферную емкость суспензии, а для определения изменения pHj - буферную емкость цитоплазмы. В последнем случав 200 мкл эритроцитов лизировали 0,2% тритоном Х-100. .

Определение активности Са^+-АТФазы и На+,К+-АТФазы в эритрг -цитах карпа, обработанных сапонином. Эритроциты трижды промывали

при 20® С в 3-4-кратном объеме среды С - крыса, человек и среда с'-карп. Среда С мМ: 130 KCl, 7,54 MgS04, 10 цитрат-трис (pH 7,4, при 37° С). В среде С цитрат был заменен на 10 ыМ HEPES - трис. Сразу же после промывки 0,3 мл упакованных эритроцитов помещали в 2,7 мл среды D. Среда D мМ: 130 KCl, 8,23 MgSO^, 20 HEPES, 10 лимонная кислота 0,04% сапонин (pH доводили до 7,4 раствором I М трис при 37° С). Через I мин постоянного перемешивания 100 мкл суспензии добавляли в 100 мкл среды Е или F и через 10 мин инкубации при 37° С реакцию останавливали 200 мкл 10%-ного раствора ТХУ. Среда Е мМ: 130 KCl, 8,23 MgS04, 10 лимонная кислота, 20 трис, 20 HEPES, 2 ЭГТА'К 3, 2 АТФ'Nag• В среде F KCl был замещен на эквимолярное количество NaCl. В часть растворов Е и F добавляли 3,67 мМ CaClg и pH доводили при 37° С до 7,4 добавлением I М раствора трис. В целях варьирования концентрации свободного кальция, кальций содержащие и безкальциевые растворы смешивались в заданных пропорциях. Активности Са^+-АТФазы и NatK-АТФазы определяли по приросту содержания неорганического фосфата [Петруняка и др., 1989].

Статистическая обработка результатов. В тексте обсуждаются различия с достоверностью р<0,05, по критерию Стьдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ I. Влияние осмолярности среды на объем эритроцитов.-Эритроциты карпа ведут себя в соответствии с законом Бойля-Вант-Гоффа: объем внутриклеточной воды уменьшается при увеличении осмолярности раствора. При увеличении тоничности раствора от 320 до 520 мосМ объем эритроцитов уменьшается примерно в 2 раза, а при снижении тоничности до 190 мосМ увеличивается на 30%. Изменение . Чьема эритроцитов при перенесении в гипо- или гипертонический

раствор происходит за время < 5 мин.

В следующие 30 мин объем эритроцитов практически не изменяется.

2. Вход Зависилоспъ от объела эритроцитов. По мере сжа-

тия эритроцитов скорость входа в клетки уменьшается примерно на 40-50$? (Рис. 1, б, кривая I), а скорость Иа+,К+,2СГ-ко-

транспорта - более чем на порядок (Рис. 1, б, крив.2). о. Юг

ЕН О

К га

< " С

И) п б «

о к

а о

я ЕН <о

.о « Р

й а <«Г I- ЫОСМ

Рис.1. Зависимость скорости входа °°КЬ в эритроциты от осмоляр-ности среды инкубации. а:1-контроль,2-среда + 0,2 мМ уабаин, 3-среда + 0,2 мМ уабаин + 0,5 мМ фуросемид; б: I- На ,К -насос (уаоаин-ингибируемый ком-т), 2-котранспорт(уабаин-неингибируемый фуросемид чувствительный компонент).

Влияние норадреналина, форсколина и дибутрил-ц-РШ. Добавление норадреналина (НА) приводит к 2-3-кратному увеличению активности Па+,К+-насоса, но не влияет на пассивную проницаемость эритроцитов для {Максимальная активация транспорта

На+,К+-АТФазой наблюдается при М норадреналина. Добавление М не только не сопровождается увеличением общего содержания внутриклеточного натрия, но напртив, снижает этот параметр на 10-15% (Рис.2, а). Этот эффект еще более выражен в условиях

Ю

ингибирования Иа+/Н+-обмена (добавлением амилорида (5 Ю-4 или помещением эритроцитов в безнатриевую среду, где Иа+ заменен на холин-хлорид(-На))(Рис.2,а). Определенный вклад в активацию НаТК+-насоса вносит локальное увеличение концентрации Ма+ в области цитоплазматической мембраны за счет активации норадрена-налином На+/Н+-обмена (Рис.2, б). Добавление ацетилхоли .а (КГ-ПГ4) почти не. влияло на скорость входа ИЬ и на активность

[NaJ

a)

6)

pXL.

1

$

ммоль/литр клеток в час

Йз И Рис.2.Влияние М на содержание N8 в эрит роцитах и уабаин-чув-ствительный копонент входа 86 ИЬ б).

П- контроль

ЕЗ- нос

контр' амилорид"^а к^-амилорид"^ Ка+,К+-насоса в частности. Действие ИА на Ка+,К+-насос практически полностью устраняется антагонистом 0- (пропранолол)(Ю-® М), но не а-адренорецепторов (фентоламин) (КГ4 М) (Рис.3).

P.S 8

f V

§ а

И о ^ о к Я m X Ч .о* 0 ей

ч • о

• О. tt

о. е и

ЕН О О g

* _Х

е 1

о И

о. К

с <D

«<i V

Я т

т

d

S3

8 г 0

о. X— На+,К+-насос

ш •

и о 2 Ей

т й а о О 1

рсколина на вход

и Рис.3.Влияние антагонистов Рис.4.Эффект NA, фо] адренорецепторов и норадрена- дибутирил-цАМФ и ТРА i лина на вход 86Rb в эритроциты. 86Rd в эритроциты.

Активность Na+,K+-mcoca эритроцитов возрастает при добавлении форсколина (Ю-4 М) и дибутирил-ц-АМФ (Ю-4 М) на 125 и 505? соотвественно (Рис.4). На уабаин-нечувствительную компоненту форсколин, д-ц-АМФ влияния не оказывали. Уровень активации Na+, К+- насоса NA и форсколином существенно зависит от осмолярностц среды и уменьшается по мере сжатия клеток примерно в 2 и 5 раз соответственно при изменении осмолярности с 190 до 520 мосМ.

Влияние холерного и коклюшного токсинов. Преинкубация эритроцитов с холерным (7 мкг/мл) и коклюшным (2,8 мкг/мл) токсинами в течении 2 ч не влияет на пассивную проницаемость эрит-

QC . ,

роцитов для Rb, но приводит к активации Na ,К -насоса, причем уровень активации уменьшается при сжатии клеток (Рис.5). Досто-

верного влияния токсинов на котранспорт и (уабаин-н$уросемид)-нечувствительный компонент вход^ не обнаружено.

о.

е* У

Ч С

л и 2 Ч О

о н § а>

л

«

а

О Ь

-г и

о и

-Г Я я в

ЕЧ Я О Ь5 О. (О к о м а и и о «

-г Я

-т-

• я

• о. ц

м ш и

а ч «

о о о

а К к

190

520 иосМ

Рис.5.Влияние холерного и коклюшного токсинов на вход в эритроциты при различных значениях осмолярности среды инк-ии.

Влияние активатора протеинкиназ; С. Добавление в среду

—А

инкубации активатора протеинкиназы С (ТРА, 10 М) приводит к 25-30% уменьшению скорости входа в эритроциты, что связано с уменьшением, как активности Ма+,К+-насоса, так и пассивной проницаемости мембраны для катиона (Рис.4). , Действие ТРА наиболее выражено при увеличении объема клеток.

Влияние ьртохалазина В. Цитохалазин В не оказывает существенного влияния на вход в эритроциты карпа. В интактных эритроцитах крысы обработка цитоутлазином примерно в 3 раза сни-жат степень активации сжатием скорости котранспорта.

3. Выход

«Ю». Скорость выхода «Ъъ из эритроцитов, инкубированных в присутствии уабаина, резко увеличивается по мере набухания клеток (Рис.6). Процесс подавляется фуросемидом. Достоверного влияния Ш на скорость выхода

не

200 ™ ос

Рис.6.Зависимость скорости выхода ^Ь из эритроцитов от осмолярности среды инкубации: I-среда содержит 0,2 мм уабаин,2-среда содержит 0,2 мМ уабаин и 0,5 мМ фурюсемид.

400 и ос и

обнаружено.

18

и

X

о, §

^

л р:

2 I-

а в <м

СУ

4.Вход Зависимость от объела эритроцитов. Скорость входа

рр

1 На практически не измс.'лется при при набухании клеток и увеличивается на порядок при сжатии. Вход^На, индуцированный сжатием уменьшается (Рис.7) на фоне уабаина (кривая!) добавлением амилорида (0,5мМ) (крив.2), фуросемида (0,5 мМ) (крив. 3) и флоретина (0,5 мМ) (крив.4)

200 адо ыосМ Рис.7.Зависимость скорости входа 22Иа от осмолярно-сти среды инкубации. на 80, 50 и 30% соответственно.

Влияние нораЭренсиша, форсколина и ТРА. Норадреналин или

рр

форсколин вызывают 3-х-кратное увеличение скорости входа На, связанное с 30-40-кратным увеличением На+/Н+-обмена и 4-5 кратным увеличением скорости ^транспорта. Добавление активатора протеинкиназы С (ТРА) не влияло на скорость котранспорта и увеличивало скорость На+/Н*-обмена в 10-15 раз. Сжатие приводило к увеличению скорости На+/Н+-обмена и На+,К+-котранспорта в 160 и 8 раз соответственно по сравнению с исходным уровнем.

Влияние кальция, ингибиторов протвинкиназ, холерного и

коклюшного токсинов и цитохалазина В. Исследовали влияние вне-

2+

клеточного кальция, ингибиторов (Са , кальмодулин)-зависимой протеинкиназы (1*24571) (20 мкМ) и протеинкиназы С (полимиксин)

(20 мкМ) а также коклюшного (2,8 мкг/мл) и холерного (7 мкг/мл)

рр

токсинов на прирост скорости входа На в ••эритроциты, индуцированный их сжатием. Существенное уменьшение (в 2 раза) прироста 22

скорости входа На наблюдается только при добавлении коклюшного токсина, что связано с ингибирпванием Иа+/Н+-обмена. 5. Трансмембранный градиент концентрации протонов и электри-

ческий потенциал мембраны эритроцитов карпа. Добавление валгага-мицина (2,5 мкМ) к эритроцитам ..рысы вызывает повышение рН среды инкубации (Рис.8 б, кр.1), что связано с выходом анионов- (в том числе и HCOg) в ответ на гиперполяризацию мембраны, индуцированную валиномицином. Аналогичный эффект был обнаружен, к для' эритроцитов человека [Орлов и др., 1987]. В суспензий эритроцитов карпа (Рис. 8, а, кривая I) валиномицин не влияет на pHQ. ГГо-

Рис.8.Кинетика изменения рН в сус -пензии эритроцитов карпа-а и крысы-б. Добавки: 1-валино-т_шц н (2,5 мкм>,2-III iyo,2% тритон Х-100, ' 11 /3- С1ССР (10 мкМ), 2| /4-SITS (100 мкМ).

__ 5 кии-

4

видимому~это вызвано тем, что скорость функционирования анионного переносчика в эритроцитах карпа в режиме однонаправленого переноса на несколько порядков ниже, чем в'эритроцитах млекопитающих. Низкая скорость переноса анионов была зарегистрирована в эритроцитах миноги, пиявкорота и связывается в эритроцитах рыб с малым содержанием белка полосы 3 (анионного переносчика) [Ellory et al.,1987, Tufts, Boutilier. 1989]. Kr-щентрация внутриклеточного калия в эритроцитах карпа находится на уровне 7080 ммоль/л клеток. Это означает, что при [K+]Q = I мМ значение равновесного диффузионного потенциала для К+ должно составлять -106 - НО мВ. Сравнивая значения pHQ и pHj, определенное в присутствии протонофора, исходя из уравнения Е^ = RT/F (pHj-pHQ), легко подсчитать, что без валиномицина электрический потенциал мембраны в эритроцитах карпа и крысы составляет -24 - 28 И -13 -15 мВ соответственно. В присутствии протонофора кинетика изме-

нения рН (повышения рН цитоплазмы в ответ на добавление валино-мицина и последующего его снижения, связанного с диссипацией градиента концентрации ионов калия) в эритроцитах карпа существенно не отличается от кинетики для эритроцитов крысы (Рис.8, кривые II). В присутствии протонофора (С1ССР) добавление SITS не влияет на кинетику перераспределения протонов, индуцированного валиномицином' (сравн. кривые III и IV, Рис.8).

?+ 4-

В эритроцитах карпа отсутствуют Са -активируемые К -каналы

о.

так как добавление кальция (I мМ) и Са -ионофора (A23I87.I мкМ) в присутствии протонофора (С1ССР. 10 мкМ) не приводит к повышению рН среды инкубации, как это происходит в эритроцитах крысы и и человека (сравн. кривые I и II на Рис. 9). Слабое понижение

рН среды в ответ на введение A23I87 указывает на индуцированный р. .

ионофором Cat; /2Н,-обмен. 6,6 грН , ,

° 2 5 2 3 /—II Рис.9.Кинетика изме-

" нелия рН в суспензии

эритроцитов крысы (I) и карпа (II) .Добавки^

7,4

Ah

z э /—:

_/ ^ и карпа ujj .дооавг

\ - 4 1-С1ССР (10 мкМ),

.1 2-СаС12 (1 ыМ),

... 5 мин ЭДВИЭТ <1

\ I 4 I—I 4-0,2% тритон Х-100.

8,2

6. Активность аденозинтрифосфатаз в эритроцитах карпа, обрабо-----

танных сапонином. Активность Са -АТФазы в эритроцитах человека,

крысы и карпа при .концентрации Са^+ 0,8 мкМ составляет 10, 20 и

2 ммоль/л Клеток в час соответственно. В присутствии 5 мкМ Са^+ 2+

активность Са -АТФазы в эритроцитах человека, крысы и карпа соотносится как 3:5:1. (Рис.10, а). На Рис. 10 б представлены данные о влиянии Са2+ на активность На+,К+-АТФазы. Кроме того, содержание фосфора в эритрощггах кпрпа в 5-6 раз выше, чем в эритроцитах млекопитающих (0,78, 0,89 и 4,37 ммоль/л клеток в

эритроцитах человека, крысы и карпа соответственно), что препятствует определении продукции Pj Ма+,К+-АТФазой при гормональной стимуляции, особенно, при умеренных концентрациях Na|. Для этого

■эр

необходимо проведение экспериментов с использованием Р-у-^ТФ.

и• 40

а)

<D § 20

л «

§ О а

^ О" 5 5о — W~5 60 °а2+. мкм

Рис.10.Зависимость активности Са -АТФазы (а) и Na ,К -АТФазы (б) эритроцитов крысы (I), человека '2) и карпа (3) от концентрации свободного кальция

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ I. Регуляция транспорта ионов при действии катехоламинов. Мембрана эритроцитов карпа содержит следующие системы транспорта одновалентных катионов: Na+,K+-Hacoc (уабаин-ингибируемый компонент входа К+,С1~- или Na+,С1 ~-котранспорт (уабаин нечувствительный, фуросемид ингибируемый компонент входа и

^Na) ;На+/Н+-обмен (амилорид-инг'"5ируемый компонент входа .

2+ +

Са -активируемые К -каналы не являются, по-видимому, облигатор-

ной системой, вовлеченной в функционирование эритроцитов, поскольку они отсутствует не только в эритроцитах карпа и ската [Dickman, Goldstein, 1990],'.но и в эритроцитах лошади, быка и овец [Bernhardt et al., 1988].

1!а+/Н+-сбмен в отсутствии стимуляторов составляет в эритроцитах карпа 1% от общего потока "Na и активируется норадренали-ном примерно в 2-3 раза. Аналогичные данные ранее были получены для эритроцитов форели [Baroin et al., 1984].В клетках большинства тканей позвоночных Na+/H+ обмен находится под контролем

"ротеинкиназы С, но не протеинкиназы A [Grinstein,1986]. Однако, з эритроцитах карпа уровень прироста скорости Na+/H+-o6MeHa при действии активатора протеинкиназы С (ТРА) в 3 раза меньше, чем при действии норадреналина. Эффект можно объяснить активацией fit'"/Н+-обмена норадреналином через вовлечение протеинкиназы А. Эта система, как правило, включает в себя (¡-рецепторы, ГТФ-связывающие белки,' активируемые холерным токсином и каталитическую субъединицу аденилатциклазы [Grinstein, 1986]. В пользу вовлечения каталитической субъединицы аденилатциклазы в регуляцию Na+/H+-o6MeHa норадреналином в эритроцитах карпа говорит тот факт, что действие норадреналина и форсколина (активатора аденилатциклазы) на активность этого переносчика практически не различаются. Норадреналин, наряду с активацией Na+/H+-o6MeHa в Z-3-раза активирует -насос (Рис. 2 6). Катехоламин-индуц.

прирос" активности Na+,K+-Hacoca, вызванный норадреналином, блокируется антагонистом /3 рецепторов (пропранолол) (Рис.3) и имми-тируется активаторами аденилатциклазы (форсколин) и протеинкина-sj А (дибутирил-ц-АМФ)(Рис.4). На основании этого можно сделать пывод, что в проведении сигнала от норадреналина на На+,К+-насос принимают участие те же системы (|3-рецепторы, аденилатци-клаза, протеинкиназа А), которые вовлечены в эритроцитах карпа в регуляцию катехоламинами Ма+/Н+-обмена.

Можно предположить, что активация гормоном Na+,K+-Hacoca в эритроцитах карпа связана только с увеличением концентрации внутриклеточного Na+. как следствие стимуляции Na+/H+-o6MeHa. (Рис.II а). Было обнаружено, например, что в клетках гладкой мускулатур- сосудов действие ангиотензина на Na+,K+-AT$a3y устраняется в безнатриевой среде [Smith, Brock, 1983].

На

ш

r'

te'

над

н

л

>^

Н

Nat---

т

ATP

АДР

Ш

Na+

Kw

/1 • TP

7

M

3ita+

\

ADP

Рис.11.Возможные схемы взаимодействия Иа /Н -обмена и На ,К -насоса при гормональной стимуляции клетки.

а) агонист (А) взаимодействует с рецептором. Вызывает активацию Иа/Н-обмена, который является причиной прироста Иа- и менно этот фактор вызывает активацию Иа,К-насоса.

б)(А) взаимодействует с рецептором и вызывает независимую атива-цию Ма/Н-обмена и Иа.К-насоса.

3Na+ 2К1"

/

4

ADP

i>

в) схема реализуется в эритроцитах ка.жа. ft-агонист (¡3-А) б-рецептор ($-R) G -GTP-связывающий

белок АС-аденилат циклаза Ргк А-протеинкиназа А ?-возможные белки посредники

сАМР АТР|

<Ц _J_, iNar

4PrkA|-----

Не исключено, что активация Na+,К+-АТФазы может быть и не связана непосредственно с активацией На+/Н+-обмена (Рис.II, б). Например, сравнительно недавно было обнаружено, что в сарколемме кардиомиоцитов ингибирухщее действие М-холиномиметиков на Na+,K+ АТФазу опосредовано через прямое взаимодействие ^+,К+-АТФазы с АТФ-связывающими белками [Danilenko et а1.,1990]. Большое содержание в эритроцитах карпа неорганического фосфата не позволяет провести аккуратное исследование влияния норадреналина на активность Ма+,К+-АТФазы в сапонин обработанных клетках. В связи с этим мы исследовали действие норадреналина на активность Na+, К+-насоса в интактных эритроцитах карпа в присутствии ингибито-тора Na+/H+-o6MeHa - амилорида и в безнатриевой среде (Рис.2,6). В присутствии амилорида (5 Ю-4) уровень активации Na+,K+-naco-

са норадреналином уменьшается только на 40-50%, а среде, где На+ заменен на холинхлорид - на 20%, что позволяет связать корадрена-лин-стимулируемую уабаин-ингибируемую компоненту с прямым влиянием катехоламина на ^+,К+-насос.

Активация На+,К+-насоса норадреналином также не связана и с приростом концентрации внутриклеточного Ка+. Прирост внутриклеточного содержания Иа+ удалось обнаружить только в условиях ингибирования Ка+,К+-АТФазы. В отсутсвии уабаина норадреналин вызывает не . увеличение а, напротив, 10-25% уменьшение содержания Ка"^ (Рис.2 а). Тахта; образок», данные, представленные в этой работе позволяют предположить, что механизм активации На+/Н+-обмена и Ка+, К+-насоса в эритроцитах карпа при действии катехоламинов реализуется по механизму, показанному на Рис.11 в. 0-агонист взаимодействует с б-рецептором и через СТР-связывающий белок вызывает активацию аденилатциклазы и прирост уровня активности протеинкиназы А. Протеинкиназа А непосредственно или через некоторые белки посредники активирует На+/Н+-обмен и Ка+,К+насос. Дог олнителъным фактором активации Ка+,К+насоса является прирост примембранного Ма+ ^ вследствие одномоментной активации Иа+/Н+-обмена. Физиологическое значение этого явления обсуждается ниже.

2. I егуляция транспорта ионов при изменении объема клетки. В эритроцитах млекопитающих существуют системы ауторегуляции объема, связанные с активацией На+/Н+-противотранспорта, Ка+,К+, 2С1"-котранспорта при регуляторном увеличении объема (Ш) и К+, С) "-котранспорта яри регуляторном уменьшении объема (Ш)).

В эритроцитах карпа, в отличии от эритроцитов млекопитающих, ' сжатие не приводит к существенному увеличению фуросемид-ингиби-руемой компоненты входящего потока ®6ИЬ(Рис.1), что связано, по-

видимому с отсутствием в эритроцитах карпа некоторых компонентов сигнальных систем, участвующих о активации при сжатии клеток.

Сжатие эритроцитов карпа резко активирует систему IíaVH+-o6-мена (Рис.7). Активация сжатием Na+/H+o6MeHH4Ka является, по-видимому универсальной для механизма RVI, возникшей на ранней стадии эволюции т.к. этот эффект был обнаружен в эритроцитов- всех видов млекоитающих, исследованных на этот предмет я р эритроцитах форели [Motáis et al .-.1989]. Активация сжатием Иа+/Н+-обмена в эритроцитах карпа устраняется в условиях предварительной обработки клеток ингибитором Gj-белка - коклшньм токсином. На основании этого можно предположить, что ГТФ-связывающие белки принимают участие в механизме внутриклеточной сигнализации при уменьиения объема..

Гипоосмотическое набухание эритроцитов карпа приводит к 1,5-2 крагнсцу увеличению входящего потока ®®Rb (РисЛ) и к 5-IG кратному увеличению выходящего потока этого катиона {Рис.6). Ыожно заключить, что генерируемый при набухании яетто-лоток К+, направленный из клеток, принимает участие в формировании RYD и опосредуется, в отличии от эритроцитов млекопитающих системой К+,С1"-котранспорта. 3. Физиологическое значение обнаруженных явлений. COg и С^, свободно проникая через лшщдньй бислой мембраны эритроцитов связываются с гемоглобином, причем сродство гемоглобина к кислороду резко уменьшается при закисления цитозоля . В эритроцитах млекопитающих поддержание рН обеспечивается следующими система!.®: высокое содержание карбоксиангидразы приводит к быстрому переходу COg в Н2СО3, которая диссоциирует на Н+ и НСОд. Концентрацию НСОд поддерживает система переноса анионов (белок полосы 3) за

счет НСО^/СТ-обмена. Этот белок, в виду его высокого содержания

в мембране эритроцитов млекопитающих, способен функцискировать в

режиме однонаправленного RT [Cl-]: RT [HC0ÔL

EL- — In -г 1--In — f-1 (2)

переноса и обеспечивает F [Cl ] F [HCOg^

мемранный потенциал в соответствии с распределением анионов (2). В свою очередь рН цитоплазмы зависит только от величины мембранного потенцила (3). В эритроцитах рыб 2,3 F

рНг рН.+ - Е_ (3)

скорость работы анионного переносчика в RT

режиме однонаправленного переноса существенно ниже [Ellory et al. 1S87, Tufts, 1989] и рН^ в ответ на разнообразные стрессовые ситуации поддерживается за счет системы Ка+/Н+-обмена. Но активация Na+/H+-o6MeHa ведет к увеличению объема клетки, а следовательно к ухудшению их циркуляции в клеточном русле. В этом случае объем эритроцитов поддерживается за счет 3-х механизмов:

1.акт"вации Na+,K+-AT3>a3bi, как за счет прироста Na|n, так и за счет прямого сопряжения этого фермента с £-рецептором (Рис.II в)

2.стимуляции выхода К+, вероятно, за счет активации К+,С1~-ко-транспорта при набухании клеток (Рис. 6).

3.уменьшения активности На+/Н+-обмена по мере набухания клеток по механизму объем-зависимой регуляции (Рис. 7).

ВЫВОДЫ

1. Проведено изучение транспорта ^Rb и а также электрического потенциала в эритроцитах карпа. Установлено, что мембрана эритроцитов карпа содержит Na+,K+-Hacoc, Иа+/Н+-обкен-ник и 1<а+,К+,2СГ (или К+,С1~)-котранспорт. Са^+-активируемые К+-каналы в эритроцитах карпа не обнаружены.

2. При действии норадоеналина, .-жтиваторов аденилатциклазы и протеинкиназы А происходит многократное увеличение Na+/H+-o6-

мена в эритроцитах карпа.

3. При действии норадреналина на эритроциты карпа происходит увеличение входа что связано с 2-4-х-кратной активацией

-насоса. Установлено, что действие норадреналина на Ма+,К+-насос только частично (40-50%) обусловлено приростом внутриклеточного натрия за счет активации На+/Н+-обмена..

При набухании эритроцитов карпа происходит увеличение входящих и выходящих потоков что связано как с актива-

цией К+,С1~-котранспорта, так и неидентифицированной ^-транспортирующей системой.

4. Сжатие эритроцитов карпа стимулирует более чем на 2 порядка На+/Н+-обмен. Действие сжатия на На+/Н+-обмен уменьшается при добавлении коклюшного токсина, что указывает на возможное участие в этом процессе -белка (ГТФ-связывающего белка). Варьирование концентрации внеклеточного кальция, добавление ингибиторов кальмодулина (1124571) и протеинкина-зы С (полимиксина), а также цитохалазина В не воздействует на объем-зависимую регуляцию Ка+/Н+-обмена.

5. Скорость функционирования анионного переносчика в эритроцитах карпа в режиме однонаправленного переноса на несколько порядков ниже, чем в эритроцитах млекопитающих, что обеспечи-чивает высокую эффективность 1Га+/Н+-обмена в регуляции рН^..

6. Предложена схема вовлечения 0-адренергической регуляции Иа+/Н+-обмена и насоса, и объем-зависимой регуляции №а+/Н+-обмена и транспорта К+ в механизм поддержания рН цитоплазмы и сродства кислорода к гемоглобину в эритроцитах рыбы.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах.

1. Орлов С.Н., С1фябин Г.А.. Котелевцев C.B., Козлов Ю.П. Рецептор и объем-зависимая регуляции Na,К,ATРазы и ионных переносчиков. В сб.Международ, симп."Транспорт ионов", Тбилиси,1989.

2. Орлов С.Н., Скрябин Г.А., Котелевцев C.B., Козлов Ю.П. Транспорт одновалентных ионов в эритроцитах карпа: механизмы и регуляция. Биол'. мембр., 1989, т. 6, H 12, с.1261-1277.

3. Орлов С.Н., Покудин Н.И., Скрябин Г.А., Котелевцев Ю.В. Механизмы регуляции транспорта одновалентных катионов в эритроцитах. В сб. Всесоюзн. конф. патофизиологов. Кикенев, 1989.

А « Орлее CAL , Скрябин Г.А., Котелевцев C.B., Козлов Ю.П. Рецептор- и объем-зависимая регуляция Na,K-Hacoca и ионных переносчиков в эритроцитах рыбы. Биол.науки, 1990,N 6(318),с 27-38.

б. Скрябин Г.А., Петруняка В.В., Орлов С.Н., Котелевцев C.B., Козлов Ю.П. Особенности активности аденозинтрифофатаз в эритроцитах карпа, обработанных сапонином. Биохимия, 1990, т.55, вып. 8, с. 1503-1506.

6. Скрябин Г.А., Котелевцев C.B., Орлов С.Н. Влияние 3-метилхо-лантрена и совола на транспорт одновалентных ионов в эритроцитах карпа. В сб. П-Всесоюзн. симпоэ. по биохимии рыб, Ростов-Великий, 1990.

7. Котелевцев C.B. ,• Скрябин Г.А., Ребров В.Г., Ряжский Г.Г., Орлов С.Н. Влияние 3-метилхолантрена и совола на транспорт одновалентных ионов в эритроцитах карпа Cyprinus carpió. Журн. эволюц. биох. и физиол., 1991, т.27, N 3, с. 295-300.

8. Скрябин Г.А., Котелевцев C.B., Орлов С.Н. Объем-зависимая регуляция транспорта Ка+ и К+ в эритроцитах рыбы. Докл. МОИП серия "Общая биол.", св. том I990-1991.

9. Скрябин Г.А., Орлов С.Н. Регуляция катехолаыинами активности Na+,K+-AT$a3bí ¡a Иа+/Н+-обмена в эритроцитах карпа. Докл.МОИП серия "Общая биол.4, св. том I990-I99I.

10. Орлов С.Н., Скрябин Г.А. ß-адренергические катехоламины активируют На+,К+~насос эритроцитов карпа независимо от стимуляции Na /Н+-обмана. Докл.'АН СССР, 1991, т. 316, N 4, с.997-1000.

IWmicaim В печать 03, Û4 199¿a

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»

Зак. ÔO& Тир. 100