Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт одновалентных катионов через мембрану эритроцитов лягушек RANA TEMPORARIA и RANA RIDIBUNDA

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Транспорт одновалентных катионов через мембрану эритроцитов лягушек RANA TEMPORARIA и RANA RIDIBUNDA"

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 2 1 ;.!>Ш ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

АГАЛАКОВА Наталья Ивановна

ТРАНСПОРТ ОДНОВАЛЕНТНЫХ КАТИОНОВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ ЭРИТРОЦИТОВ ЛЯГУШЕК RANA TEMPORARIA И RANA RIDIBUNDA

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ: 03.00.04 — БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1996

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РЛП.

Научный руководитель — кандидат биологических наук Г. П. ГУСЕВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. П. НЕСТЕРОВ доктор биологических наук Л. Л. ВЕРЕНИПОВ

Ведущая организация — Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН.

Защита диссертации состоится 18 нюни 1996 г. в часов на заседании Диссертационного совета К 002.89.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Ин~титуте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, ир. М. Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова.

Автореферат разослан « » мая 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических иа\"к Л. В. ЗУЕВА

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эритроциты человека и животных широко используются для изучения механизмов движения ионов через плазматическую мембрану клеток. Набор ион-транспортирующих систем в эритроцитах отличается большой видовой специфичностью, что открывает уникальные возможности для изучения механизмов функционирования и регуляции частных ион-транспортирующих систем. Подавляющее количество данных по механизмам транспорта одновалентных катионов через мембрану эритроцитов получено в исследованиях на клетках человека. Эритроциты животных других таксономических групп позволяют изучать те системы транспорта, которые не обнаружены в эритроцитах человека или их активность очень мала. Исследования на клетках представителей отряда Carnivora позволили обнаружить Na+/Ca2+ обмен, который специфичен только для этой группы животных (Parker, 1978; Milanick, 1992). Функционирование Na+/Mg2+ обмена характерно для эритроцитов птиц и особенно для клеток грызунов (Willis et al., 1992). Различный уровень активности Na-K-2C1 котранспорта выявлен в эритроцитах человека и других видов млекопитающих (Geck and Heinz, 1986; Haas, 1994), в некоторых из них (хорька) величина котранспорта может быть очень велика, но этот переносчик не обнаружен в эритроцитарной мембране других видов (лошади, кролика) (Contreras et al., 1986; Al-Rohil and Jennings; 1989 Flatman, 1991).

Большое разнообразие транспортных систем обнаружено также в ядерных эритроцитах низших позвоночных и птиц. Эритроциты птиц характеризуются наличием Na-K-2C1 котранспорта, активность которого регулируется катехоламинами и клеточным объёмом (Haas and McManus, 1985). Эритроциты рыб представляют собой удобную модель для изучения чувствительного к катехоламинам Na+/H+ обменника (Nikinmaa and Tufts, 1989). В отличие от других видов животных, мембраны эритроцитов речной миноги не содержат анионного обменника, но обладают высокой проницаемостью для ионов К+, которая в значительной степени обеспечивается наличием в мембранах калиевых каналов (Gusev et al., 1992). Интерес к изучению транспорта катионов через мембрану эритроцитов земноводных обусловлен отсутствием систематических исследований в этой области. Достаточно детальные работы были выполнены только на эритроцитах хвостатой амфибии рода Amphiuma и посвящены в основном

изученшо регуляции клеточного объёма (Cala et al., 1980; Siebens and Kregenow, 1985; Tufts et al., 1987). На эритроцитах друшх видов земноводных были проведены лишь единичные исследования (Tufts et 'al., 1987; Nikinmaa and Tufts, 1989). Лягушки являются животными с сезонным циклом жизнедеятельности и поддержание ионного гомеостаза клеток при низких температурах необходимо для жизнедеятельности организма, однако влияние температуры на транспорт ионов через плазматические мембраны пойкилотермных животных остаётся ещё мало изученным. Кроме того, известно, что мембраны ядерных эритроцитов земноводных содержат систему p-адренорецепторов и активность некоторых ион-транспортирующих систем в этих клетках регулируется катехоламинами. Учитывая вышеизложенное, были сформулированы цель и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение механизмов транспорта ионов Na* и К* через мембрану эритроцитов двух видов лягушек - Rana temporaria и Rana ridibunda. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать возможные системы транспорта ионов натрия и калия через мембрану эритроцитов двух видов лягушек при помощи специфических ингибиторов.

2. Исследовать температурную зависимость активности частных ион-транспортирующих систем.

3. Изучить влияние катехоламинов на транспорт ионов натрия и калия через мембрану эритроцитов лягушек.

Научная новизна исследования. Впервые проведено сравнительное изучение механизмов транспорта Na+ и К+ через мембрану эритроцитов двух видов лягушек. Установлено, что наряду с Na+-K_+-nacocoM в мембране эритроцитов лягушек содержится К-С1 переносчик. Изучены особенности функционирования этого переносчика и показано, что при физиологических условиях К-С1 котранспорт является основной системой, обеспечивающей поступление ионов К+ в эритроциты лягушек.

Впервые прослежены закономерности изменения активности ион-транспортирующих систем при адаптации эритроцитов лягушек к разным температурам. Показано, что поддержание ионного гомеостаза клеток при низких температурах обеспечивается сохранением высокой активности Na+-K+-Hacoca и снижением пассивных входа и выхода катионов.

Впервые показано, что добавление катехоламинов и блокаторов фосфодиэстераз приводит к активации Na+-K+-nacoca в мембране эритроцитов лягушек. Стимулирующее действие катехоламинов устраняется антагонистами (5-адренорецепторов.

Практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о механизмах функционирования и регуляции систем ионного транспорта через плазматическую мембрану клеток и могут быть использованы для интерпретации данных при изучении патологических процессов, связанных с изменениями функционирования частных ион-транспоргирующих систем.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Симпозиуме "Мембранный транспорт и функции клетки" (С.-Петербург, 1994); на Конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" (С.-Петербург, 1995) и на I (XI) международном совещании по эволюционной физиологии (С.-Петербург, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждений, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 199 наименований. Работа изложена на 112 страницах, содержит 24 рисунка и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на изолированных эритроцитах лягушек Rana ridibunda и Rana temporaria. Животные содержались в аквариумах с небольшим количеством воды при температуре 2-4°С в период с октября по май.

Приготовление клеточной суспензии. Кровь из сердца отбирали в пробирки с гепарином, немедленно отмывали забуференным физиологическим раствором и осаждали центрифугированием (2300 g в течение 5 мин при 4°С). Отмытые эритроциты разбавляли стандартной инкубационной средой до гематокрита 20-30 %. Суспензия эритроцитов сохранялась в течение 60 мин при комнатной температуре перед проведением экспериментов. Стандартный физиологический раствор содержал (мМ): 105 NaCl, I MgCh, 5 фосфатного буфера или 10 Tris-HCl (рН 7.6 при 20°С). В инкубационные среды добавляли 10 мМ глюкозы и

физиологические концентрации KCl (2.7-3 мМ). В опытах с удалением хлоридов готовили растворы такого же состава с использованием нитратных солей. При необходимости изменения концентраций Na+ и К+ в инкубационных средах стандартный раствор смешивали с раствором, содержащим (мМ): 105 KCl, 1 MgCh, 5 фосфатного буфера или 10 Трис -HCl (pH 7.6 при 20°С).

Измерение потоков Na+ и К* в эритроциты лягушек. Транспорт ионов Na+ И К+ в эритроциты лягушек двух видов исследовали при температуре 18-20°С с использованием радиоактивных изотопов 22Na и 86Rb. Аликвоты клеточной суспензии (гематокрит 20-30 %) добавляли в пробирки с инкубационной средой в присутствии и в отсутствие стандартных блокаторов ионного транспорта до конечного гематокрита 2-3 %. Клетки преинкубировали 5-30 мин, затем вносили 22Na или 86Rb. Через определенные промежутки времени отбирали 1 мл суспензии и впрыскивали в 10 мл холодного отмывочного раствора. После центрифугирования (2300 g в течение 1 мин при 4°С) отбирали пробы надосадочной жидкости для определения радиоактивности среды, а эритроциты отмывали еще два раза тем же раствором и лизировали в дистиллированной воде. Радиоактивность клеточных лизатов и среды измеряли на гамма-счетчике или с помощью сцинтилляционного счётчика (1209 RACKBETA (LKB Wallac)), используя эффект Черепкова. Потоки катионов рассчитывали следующим образом: Ам ■ С / Aq, • г, где А и - активность 1 мл упакованных клеток, Аср -активность 1 мл среды, С -концентрация Na+ или К+ в среде и t - время инкубации клеток с 22Na или 86Rb.

Выход К*. Отмытые эритроциты преинкубировали в течение 60 мин в стандартных С1- и ЫОз"- инкубационных средах с добавлением 2.7 мМ KCl и 10 мМ глюкозы, затем отмывали еще раз и разбавляли соответствующими бескалиевыми растворами до гематокрита 20-30 %. Аликвоты суспензии отмытых эритроцитов немедленно добавляли в С1- и NO3"- бескалиевые среды. Через определенные промежутки времени отбирали часть суспензии и клетки осаждали центрифугированием. Надосадочную жидкость отбирали для определения концентрации К+ в среде и эритроциты отмывали два раза холодным раствором MgCh и лизировали для определения внутриклеточных концентраций натрия и калия. Стандартные растворы с известными концентрациями К+ готовили на инкубационной среде. Потери К+ эритроцитами рассчитывали по формуле

Ск • (1-Hct)/Hct t, где Ск - концентрация К+ в среде после инкубации эритроцитов, Hct - гематокрит (мл упакованных клеток/мл суспензии), t - время инкубации (час).

Изучение влияния температуры на транспорт Na* и К* в эритроциты. Стандартные хлоридный и нитратный физиологические растворы были забуферены Трис-HCl (HNO3) до рН 7.6 при соответствующих температурах (5 и 25°С или 10 и 20°С). Аликвоты клеточной суспензии добавляли в 1 мл инкубационной среды в отсутствие или в присутствии блокаторов и преинкубировали в течение 30 мин при разных температурах. Вход К+ определяли по накоплению 86Rb за 60 мин при температурах 20 и 25°С и в течение 120 мин при температурах 5 и 10°С. Вход Na+ рассчитывали по накоплению 22Na за 60 мин при 25°С и в течение 120 мин при 5°С. После инкубации клетки отмывали по описанной выше схеме и радиоактивность клеточных лизатов и надосадочной жидкости измеряли с помощью гамма-счётчика. Выход К+ определяли путём измерения потерь калия клетками в бескалиевой среде в течение 60 мин при 20°С и в течение 120 мин при 5°С. Температурную зависимость характеризовали величиной Qio, которая рассчитывалась по отношению величин потоков катионов при увеличении температуры на 10°С.

' Определение внутриклеточной концентрации ионов. Эритроциты отмывали дважды холодным изотоническим раствором, содержащим 72 мМ MgCh и 10 мМ Трис-HCl (рН 7.6 при 4°С) и лизировали в дистиллированной воде. Содержание ионов в лизате отмытых клеток измеряли на пламенном фотометре Flapho-40.

Статистическая обработка результатов. Все результаты представлены в виде средних данных + стандартные ошибки средних. Статистическая достоверность рассчитывалась по критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Концентрация попов Na* и К+ в эритроцитах лягушек. В эритроцитах лягушек R. ridibunda отмечалось низкое содержание Na+ (12.2+0.8 ммоль/л клеток) и высокая концентрация К+(90.1±1.9 ммоль/л клеток, п=33). Средние величины для внутриклеточных концентраций Na+ и К+ в клетках лягушек R. temporaria, составили 12.4 + 0.8 и 88.6 ± 2.1 ммоль/л клеток (п=45), соответственно. Концентрации ионов Na+ и К+ в эритроцитах обоих видов лягушек не изменялись достоверно в разные сезоны года с октября по май.

1.6

£ 1.2

5 л t;

0 s

1 0.8 +

я Z

0)

X 0> c, с

2 а

з;

0.4

10 20 30 40 Время инкубации (мин)

50

60

Рис. 1. Поток Na* в эритроциты лягушки R. ridibunda в зависимости от времени инкубации. Инкубационная среда содержала (мМ): 102 NaCl, 3 KCl, 1 MgCh, 10 глюкозы, 5 фосфатного буфера (pH 7.6 при 20°С). Эритроциты преинкубировали в течение 30 мин при 20°С, затем добавляли 22Na и через определённые промежутки времени отбирали пробы. Представлены средние данные ± стандартные ошибки для 7 опытов.

s

о со "2 о н 0>

5

л с. о 2 2

1.4

1.2

0.8

0.6

0.4

Ч

о

X

ш

0.2

Контроль

Амилорид 1 мМ

Фуросемид 1 мМ

DIDS 0.1 ММ

Рис. 2. Влияние блокаторов на вход в эритроциты лягушки ] г!ШЬипда. Эритроциты преинкубировали в течение 30 мин в отсутствие в присутствии блокаторов, затем добавляли 22№. Вход К; рассчитывали по накоплению изотопа за 30 мин. Представлены средш данные ± стандартные ошибки для 8 опытов.

1

0

-72. Транспорт ионов Na* (22 Na) в эритроциты лягушек двух видов . В первой серии опытов исследовали накопление изотопа 22Na в эритроциты лягушек двух видов в процессе инкубации клеток в стандартной среде с физиологической концентрацией К+. Скорость транспорта Ка+ сохранялась постоянной в первые 30 мин инкубации в эритроциты R. ridibunda (Рис. 1) и в течение 60 мин в клетки R.temporaria. Можно полагать, что накопление ионов натрия в течение этого времени отражает однонаправленный вход натрия в клетки при условиях наших экспериментов. Величина входа Na+ составила 1.9 ± 0.4 ммоль/л/час в эритроциты R. ridibunda и 1.8 ± 0.2 ммоль/л/час в клетки R.temporaria.

Для выявления возможных путей движения ионов Na+ через мембрану эритроцитов лягушек было изучено вдияние стандартных блокаторов ионного транспорта на вход натрия в клетки (Рис. 2). При инкубировании эритроцитов лягушки R.ridibunda в стандартной физиологической среде ни фуросемид (блокатор Na-K-2C1 котранспорта), ни амилорид (блокатор Na+/H+ обмена), ни DIDS (4,4'-диизотиоцианостильбен-2,2'-дисульфоновая кислота, блокатор транспорта Na+, сопряжённого с анионами) не оказывали какого-либо ингибирующего действия на вход Na+ в клетки (Рис. 2). Напротив, в экспериментах на эритроцитах R.temporaria фуросемид и DIDS оказывали неспецифическое действие на мембрану клеток, увеличивая накопление ионов Na+ в клетках. Величины потоков натрия в клетки в бескалиевой среде в присутствии 1 мМ фуросемида и 0.1 мМ DIDS составили 8.6 ± 1.9 и 11.4 + 3.0 ммоль/л/2 часа, соответственно, по сравнению с контролем (3.5 ± 0.4 ммоль/л/2 часа). Это стимулирующее действие "ингибиторов" на вход Na+ проявлялось как в хлоридной, так и в нитратной среде, возрастало при увеличении их концентрации в инкубационной среде, но уменьшалось при добавлении 10 мМ К+. Кроме того, под действием DIDS наблюдались большие потери клетками К+ (43.9 ммоль/л/2 часа) при относительно небольшом накоплении Na+ (16.7 ммоль/л/2 часа). Таким образом, в присутствии DIDS происходило уменьшение суммарного содержания катионов и, следовательно, воды, в эритроцитах лягушки R.temporaria. Подобная неспецифическая стимуляция транспорта Na+ и К+ под влиянием DIDS была описана в эритроцитах хвостатой амфибии рода Amphiuma (Siebens and Kregenow, 1985), а также в эритроцитах овец (Zade-Oppen and Lauf, 1990), механизм этого эффекта пока неясен.

Приведённые выше данные свидетельствуют о том, что вход ионов Na* в эритроциты двух изученных видов лягушек происходит без участия ионных

о со

Ъ о

I-

л Ц

о

2 +

а Z

ч

о X

ш

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

0 20 40 60 80 100

Концентрация №* в среде (мМ)' Рис. 3. Зависимость потока в эритроциты лягушки Л. псШшпйа от его концентрации в среде. Концентрация Ка+ варьировалась таким образом, что общая концентрация Ка+ и К+ в среде составляла 105 мМ. Эритроциты преинкубировали 30 мин, вход Ыа+ определяли по накоплению изотопа за 30 мин. Представлены средние данные ± стандартные ошибки для 6 экспериментов.

16

х"

S 14

2

ю

Т"

■а 12

о

1-

1 10

с

J 8

с

о

2 2, 6

+

л 4

Z

Ч

о X 2

Ш

0

R. ridibunda

+Амилорид 1 мМ

Изотоничес- Гипертоническая кая среда среда

45

3" 40

я

т

а 35 о

5 30

с 25 л

§ 20 2

г 15

z 10 ч

° к

X 5

Ш

R. temporaria

+Амилорид 1 мМ

JZ1

Изотоничес- Гипертоническая кая среда среда

Рис. 4. Влияние сжатия эритроцитов на вход Na* в эритроциты лягушек двух видов. Эритроциты R. ridibunda инкубировали с 22Na в стандартной среде с физиологической концентрацией К+ (3 мМ) (N=6) в течение 15 мин. Эритроциты R. temporaria инкубировали в бескалиевой среде в течение 2-х часов (N=4). Представлены средние данные ± стандартшз о^шб.ки. * - Р < 0.001 по сравнению с контролем.

переносчиков. Подтверждением отсутствия переносчиков для входа Na+ в эритроциты лягушек может служить линейная зависимости потоков Na+ в клетки от его концентрации в среде (Рис. 3). Можно заключить, что при условиях, близких к физиологическим, транспорт Na+ в эритроциты лягушек обеспечивается только диффузионной компонентой. Этот механизм характеризуется константой скорости входа Na+, величина которой составила в среднем 0.012 ± 0.001 час1 (п=10) для эритроцитов R. ridibunda и 0.008 ± 0.001 час-1 (п=5) для эритроцитов R. temporaria.

Хорошо известно, что мембраны эритроцитов многих видов животных, включая земноводных, содержат №+/Н+-обменник, который обычно не функционирует при нормальных физиологических условиях, но активируется при сжатии клеток в гипертонической среде (Kregenow et al., 1985; Tufts et al., 1987). Действительно, инкубация эритроцитов лягушек в стандартной среде с добавлением 200 мМ сахарозы сопровождалась 10-20-кратной стимуляцией входа Na+, которая практически полностью (в среднем на 95 %) блокировалась амилоридом (Рис. 4). Таким образом, транспорт Na* в эритроциты лягушек в гипертонической среде значительно увеличивался благодаря активации амилорид-чувствительного Na+/H+ обмена.

3. Транспорт ионов К+ в эритроциты лягушек двух видов. Эритроциты лягушек инкубировали в стандартной среде при условиях, близких к физиологическим. Однонаправленный вход калия, оцениваемый по накоплению 86Rb, наблюдался в течение 30 мин инкубации в эритроциты R. ridibunda и в течение 60 мин в клетки R. temporaria (Рис. 5). Чтобы выяснить вклад различных транспортных систем в движение К+ через мембрану эритроцитов R.temporaria, использовали стандартные-блокаторы Ыа+-К+-насоса, уабаин, и Na-K-2C1 котранспорта, фуросемид. Величина потока К+ в клетки уменьшалась при добавлении 0.1 мМ уабаина и в значительно большей степени при добавлении 1 мМ фуросемида. Уабаин и фуросемид оказывали аддитивный ингибирующий эффект на транспорт К+ в эритроциты лягушек (Рис. 5).

В таблице 1 суммированы результаты экспериментов по изучению влияния уабаина и фуросемида на вход К+ в эритроциты двух видов лягушек в хлоридной и нитратной средах. Транспорт К+ в клетки значительно уменьшался после замены хлоридной среды инкубации на нитратную. Фуросемид заметно ингибировал вход К+ в хлоридной среде, но не оказывал статистически достоверного изменения величины потока в клетки в нитратной среде. В нитратной среде общий поток К+ в

0 30 60 90 120

Время инкубации (мин)

Рис. 5. Влияние уабаина и фуросемида на накопление К+ (MRb) в эритроцитах лягушки R. temporaria. Стандартная среда содержала (мМ): 103 NaCl, 2.7 КС1, 1 MgCh, 10 глюкозы, 5 фосфатного буфера (рН 7.6 при 20°С). Эритроциты преинкубировали 30 мин в отсутствие и в присутствии блокаторов, затем добавляли 86Rb и рассчитывали накопление изотопа через каждые 30 мин. Представлены средние данные.

Таблица 1. Действие уабаина и фуросемида на вход К* в эритроциты лягушек R. temporaria и R.ridibunda в хлоридной и нитратной средах

Вход К+ в эритроциты (ммоль/л/час)

Состав -

среды Контроль +Уабаин + Фуросемид +Уабаин

Фуросемид

NaCl (N=8) NaN03 (N=7)

NaCl (N=9) NaNOy (N=4)

2.37 + 0.09 0.81 ±0.08

1.98 ±0.20 0.97 ± 0.09

Rana temporaria 1.66 ±0.09* 0.05 ±0.01* Rana ridibunda 1.28 ± 0.12* 0.04 ±0.007*

1.11 ±0.05* 0.77 ± 0.09

1.12 ±0.08* 0.94 ±0.07

0.44 ±0.04* 0.04 ±0.003*

0.58 ±0.10* 0.07 ± 0.004*

Отмытые эритроциты преинкубировали в соответствующих средах в течение 30 мин в отсутствие или в присутствии 0.1 мМ уабаина и 1 мМ фуросемида. Среды содержали 2.7 и 3 мМ К+ в экспериментах на эритроцитах R.temporaria и R.ridibunda, соответственно. Затем добавляли 8бЯЬ и измеряли накопление изотопа за 60 мин. Представлены средние величины ± стандартные ошибки. * - Р < 0.001 по сравнению с контролем.

клетки уменьшался в большей степени, чем при добавлении фуросемида в хлоридной среде. Величина уабаин-чувствительной компоненты входа К+ в эритроциты не различалась достоверно в обеих средах. В нитратной среде добавление уабаина вызывало практически полное ингибирование (в среднем на 95 %) входа К+ в эритроциты обоих видов лягушек. По всей видимости, остаточный поток К+ в клетки в нитратной среде в присутствии уабаина представляет собой диффузионную компоненту.

Ингибирование транспорта К+ в эритроциты лягушки фуросемидом могло указывать на наличие в этих мембранах широко распространённого Na-K-2C1 котранспорта. Однако фуросемид не оказывал ингибирующего действия на вход Na+ в эритроциты этих животных (Рис. 2). Хорошо известно, что фуросемид, кроме Na-K-2C1 котранспорта, может ингибировать некоторые другие С1-зависимые пути, в том числе K-CI котранспорт (Lauf et al., 1992). Поэтому в следующей серии экспериментов использовали буметанид - более селективный блокатор Na-K.-2C1 котранспорта. Буметанид даже в достаточно высокой концентрации (0.1 - 0.2 мМ) не оказывал статистически достоверного влияния на транспорт К+ в эритроциты лягушек: величины входа К+ в клетки в присутствии 0.1 и 0.2 мМ буметанида составили 2.07 ± 0.16 и 1.91 ± 0.25 ммоль/л/час, соответственно,-по сравнению с контролем (1.84 ± 0.23 ммоль/л/час). Известно, что буметанид в концентрации 0.01 мМ вызывает практически полное ингибирование работы Na-K-2C1-котранспортера (Geck and Heinz, 1986). Фуросемид в концентрации 0.2 мМ ингибировал транспорт К+ в эритроциты лягушек в среднем на 35 %, но не оказывал неспецифического стимулирующего действия на вход Na+. Эти результаты свидетельствуют об отсутствии Na-K-2C1 переносчика в мембранах эритроцитов лягушек, но указывают на наличие в них К-С1 котранспорта, который частично ингибируется фуросемидом. Это предположение находится в соответствии с данными, полученными на эритроцитах многих других видов животных, где фуросемид проявляет лишь частичное блокирующее действие (Lauf et al., 1992). Величина СЬзависимого входа К+ в эритроциты обоих видов лягушек составила в среднем 60-70 % от величины суммарного потока в хлоридной среде. В последующих экспериментах величину потока К+ через этот переносчик определяли как разность между величинами потоков К+ в хлоридной и нитратной средах.

Известно.что K-Cl котранспорт является реверсивным, т.е. функционирует в обоих направлениях (Delpire and Lauf, 1991; Lauf et al., 1992). В наших экспериментах выход К+ изучали путём инкубации эритроцитов в номинально бескалиевых хлоридной и нитратной средах. Потери К+ были значительно выше в хлоридной среде по сравнению с нитратной средой в течение всего периода инкубации эритроцитов, но фуросемид не вызывал каких-либо заметных изменений потоков К+ ни в одной из сред. Величины Cl-зависимой компоненты выхода К+ в контроле и в присутствии 0.5 мМ фуросемида составили 5.7 + 1.2 и 5.9 ±1.1 ммоль/л/час, соответственно.

■ Полученные нами данные свидетельствуют о том, что транспорт ионов К+ в эритроциты двух видов лягушек рода Rana происходит через одни и те же механизмы. При физиологических концентрациях калия в среде наряду с активным транспортом большой вклад (около 60-70 %) в поток К+ в эритроциты лягушек вносит Cl'-зависимый транспорт К+, который частично ингибируется фуросемидом. Результаты наших исследований являются первым доказательством присутствия К-С1 котранспорта в мембране эритроцитов земноводных. К.-С1 котранспорт интенсивно изучается в последние несколько лет на эритроцитах многих видов животных (Bergh et al., 1990; Jennings and Schulz, 1991; Starke and Jennings, 1993; Parker, 1991) и человека (O'Neill, 1997, 1991; Kaji, 1993). В эритроцитах большинства исследованных видов животных активность этого переносчика при физиологических условиях не выявляется, однако он может быть активирован при действии некоторых внешних факторов различной физической или химической природы. Особенно интересно, что в эритроцитах лягушек величина К-С1 котранспорта очень велика при физиологических условиях и обеспечивает основную часть поступления К+ в клетки. Функциональное значение этого переносчика для эритроцитов лягушек пока не выяснено. Возможно, он принимает участие в регулировании внутриклеточного содержания ионов и объёма клеток. Активность котранспорта при физиологических условиях была описана в эритроцитах лишь некоторых видов животных - низкокалиевых эритроцитах овец (Dunham et al., 1981), клетках крыс (Ihrig et al., 1992) и лошади (Ellory et al., 1993).

4.Влияние температуры на транспорт ионов через мембрану эритроцитов лягушки Rana temporaria. В наших исследованиях мы использовали кровь лягушек, адаптированных при температуре 4°С, однако эксперименты по изучению механизмов транспорта ионов на изолированных эритроцитах проводились при температуре 20°С. Кроме того, мы обнаружили, что ионный состав эритроцитов

сохранялся постоянным в течение всего периода проведения экспериментов (с октября по апрель). Для выяснения механизмов, за счёт которых поддерживается ионный гомеостаз клеток в течение длительного времени при низких температурах, был изучен транспорт ионов натрия и калия через мембрану эритроцитов лягушки R. temporaria при разных температурах. При повышении температуры от 5 до 25°С вход К+ в эритроциты увеличивался от 0.78 ± 0.08 до 2.16 ± 0.15 ммоль/л/час в хлоридной среде и от 0.30 ± 0.02 до 0.65 ± 0.08 ммоль/л/час в нитратной среде.

На Рис. 6 представлены данные по температурной зависимости входа К+ через отдельные транспортные системы, обнаруженные нами в мембранах эритроцитов. Активность Na+-K+-Hacoca в эритроцитах лягушек обладает наибольшей стабильностью при изменении температуры инкубации. Величина уабаин-чувствительного входа К+ в клетки сохранялась на достаточно высоком уровне даже при охлаждении клеток до 5°С и составила около 70 % от величины потока при 20°С. Достоверное ускорение входа К+ через Na+-K+-Hacoc наблюдалось только в интервале температур 20-25°С. Рассчитанная величина температурного коэффициента Qio составила 1.4.

В отличие от Na+-K+-Hacoca К-С1 котранспорт в эритроцитах лягушек обладает более высокой чувствительностью к изменению температуры. Величина С1-зависимого входа К+, рассчитанная как разность между величинами потоков в хлоридной и нитратной средах, не изменялась значительно в интервалах температур 5-10°С и 20-25°С (Рис.7), однако значительно возрастала при изменении температуры от 10 до 20°С (0.62 ± 0.13 ммоль/л/час при 10°С и 1.51 ± 0.19 ммоль/л/час при 20°С). Выход ионов К+ из эритроцитов через К-С1 котранспорт изменялся в большей степени, чем вход через этот переносчик: потери калия увеличились примерно в 3.7 раза при повышении температуры от 5 до 20°С как в хлоридной, так и в нитратной средах. Величины Cl-зависимого выхода К+ были 9.35 ± 1.6 ммоль/л/час при 20°С и 2.52 ± 0.43 ммоль/л/час при 5°С.

Диффузионный поток К+ в клетки также значительно изменялся в зависимости от температуры инкубационной среды. Его величина не изменялась в интервале температур 5-10°С, но значительно увеличивалась при повышении температуры до 25°С, величина Qio между 10 и 20°С составила около 1.5 (Рис. 7). Несколько более высокие значения Qio (2.4) наблюдались для пассивного выхода К+ из эритроцитов лягушек, инкубированных в нитратной среде. При повышении температуры от 5 до 25°С отмечалось пятикратное увеличение входа Na+ в эритроциты. Величины

О Л 3-

X О I-

0)

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Уабаин-чувствительный вход К+

2

1.6

1.2

~ 0.8 +

ы

ч о к со

0.4

■ т

т т

-

5° 10° 20° 25°

СГ-зависимый вход К*

5° 10° 20° . 25°

Диффузионная компонента

5° 10° 20° 25°

Температура инкубации (°С)

Рис. 6. Температурная зависимость транспорта К+ в эритроциты лягушек.

Уабаин-чувствительный вход К+ рассчитан как разность между потоками в отсутствие и в присутствии 0.1 мМ уабаина. СКзависимый вход К+ рассчитан как разность между величинами потоков в хлоридной и нитратной средах. Величину диффузионной компоненты определяли в нитратной среде в присутствии уабаина. * - Р < 0.01 по сравнению с величиной входа при 5-10°С.

I

О

потоков Na+ в клетки составили 0.50 ± 0.09 ммоль/л/час при 5°С и 2.52 ± 0.28 ммоль/л/час при 25°С, величина Qio бьша около 3.4.

Наши исследования показали, что все транспортные механизмы (Na+-K+-nacoc, К-С1 котранспорт и диффузионная компонента), обнаруженные нами в мембранах эритроцитов лягушек, участвуют в адаптации клеток к низким температурам. В интервале температур 5-10°С не наблюдалось значительных изменений потоков ионов через все эти системы, однако их функционирование в разной степени зависело от изменения температуры инкубационной среды от 10 до 25°С. Na+-K+ насос в мембранах эритроцитов лягушек отличается высокой устойчивостью к охлаждению клеток, что связано, возможно, с особыми свойствами самого фермента или его липидного окружения. При уменьшении температуры инкубации величины потоков К+ в эритроциты через К.-С1 котранспорт и диффузионную компоненту изменялись меньше, чем выход К+ через эти же пути. Максимальное изменение величины транспорта при охлаждении клеток наблюдалось для входа Na+ в эритроциты. Таким образом, поддержание ионного градиента через мембрану эритроцитов лягушек при низких температурах обеспечивается благодаря сохранению высокой активности Na+-K+-nacoca и более значительному падению скорости пассивных входа Na+ и выхода К+, чем пассивного входа К+.

5.Регуляция катехоламинами транспорта нонов в эритроциты лягушки Rana temporaria. Транспортные системы, чувствительные к действию гормонов различной природы, были описаны во многих тканях (Evart and Klip, 1995), в том числе в ядерных эритроцитах низших позвоночных и птиц. В эритроцитах птиц под контролем катехоламинов находится Na-K-2C1 котранспорт (Palfrey et al., 1980; Haas and McManus, 1982). В эритроцитах рыб и земноводных катехоламины способны активировать Na+/H+ обмен (Nikinmaa and Tufts, 1989; Rudolph and Greengard, 1980), а для клеток карпа характерно влияние гормонов на Na+-K+-насос и Na+/H+ обмен (Орлов и Скрябин, 1991). В наших исследованиях на изолированных эритроцитах лягушек R. temporaria изопротеренол не оказывал какого-либо достоверного действия на транспорт Na+ в эритроциты, величина потока Na+ в контрольных клетках (1.37 ± 0.12 ммоль/л/час) не отличалась от величины, полученной для клеток, инкубированных с 10 цМ изопротеренола (1.34 ± 0.15 ммоль/л/час). Однако уже в первые 15 мин после добавления изопротеренола наблюдалось заметное увеличение однонаправленного входа К+ з клетки и это стимулирующее влияние (в среднем на 31 %) сохранялось в течение всего периода инкубации (Рис. 7). В среднем для 34 опытов вход К+ составил 2.78 ± 0.20 в

*

+ И30

■§ 3

к 2

i-

0)

5 4

л

г 2

0) s

О

15

30

Время инкубации (мин)

45

60

Рис. 7. Влияние изопротеренола (ИЗО) на накопление К+ в эритроцитах R.temporaria. Эритроциты преинкубировали 5 мин в стандартной среде при 20°С в отсутствие и в присутствии Ю-5 М ИЗО. Стандартная среда содержала: 103 NaCl, 2.7 КС1, 1 MgCh, 10 Трис-HCl (рН 7.6 при 20°С). Накопление 86Rb определяли через каждые 15 мин. Представлены средние данные ± стандартные ошибки для 6 опытов. * Р < 0.01 по сравнению с контролем (попарно связанные эксперименты).

контроле и 3.67 ± 0.23 ммоль/л/час в причутствии изопротеренола (величина изопротеренол-стимулируемого потока в среднем 0.92 ± 0.08 ммоль/л/час, Р < 0.001). При добавлении норадреналина также наблюдалась активация транспорта К+ в эритроциты, однако величина этого потока была значительно меньше, чем величина изопротеренол-стимулируемого входа.

Хорошо известно, что подобная активация транспорта катионов катехоламинами может быть связана со стимуляцией аденилатциклазы и накоплением внутриклеточного цАМФ. Получены данные q том, что действие катехоламинов в эритроцитах рыб и птиц опосредуется через накопление в клетках цАМФ, что приводит к активации Na+/H+ обменника и Na-K-2C1 котранспорта, соответственно (Mahe et al., 1985; Palfrey et al., 1980). Как показано во многих исследованиях,- действие катехоламинов на транспорт ионов может значительно возрастать после ингибирования активности клеточных фосфодиэстераз (ФДЭ). В наших исследованиях блокирование активности ФДЭ теофиллином и З-изобутил-1-метилксантином (IBMX) само по себе приводило к значительному ускорению транспорта К+ в клетки (Рис. 8). Максимальная стимуляция входа К+ в эритроциты наблюдалась, когда изопротеренол и блокаторы ФДЭ были добавлены в

.а ц

о г г

Контроль ИЗО 1ВМХ

ИЗО Контроль ИЗО +1ВМХ +1ВМХ

5

X

т

+ Уабаин

0.036

0.037

Контроль ИЗО

1ВМХ

ИЗО Контроль ИЗО +1ВМХ +1ВМХ

Рис. 8. Влияние изопротеренола (ИЗО), З-изобутил-1-метилксантина (1ВМХ) и уабаина на вход К+ в хлоридной и нитратной средах. Эритроциты преинкубировалн в течение 30 мин с уабаином (0.1 мМ), а затем в течение 5 мин в присутствии 10"5 М ИЗО и 0.5 мМ 1ВМХ. Вход К* рассчитывали по накоплению изотопа за 60 мин. Представлены средине данные ± стандартные ошибки для 5 и 6 опытов в хлоридной и нитратной средах, соответственно. * Р < 0.01 по сравнению с контролем.

п

инкубационную среду вместе, т.е. их влияние было аддитивным. Величины изопротеренол- и 1ВМХ-активируемых потоков не изменялись после замены хлоридной среды . инкубации на нитратную (Рис. 8). Очевидно, что К-С1 котранспорт не активируется изопротеренолом и блокаторами ФДЭ. Но аддитивное стимулирующее влияние изопротеренола и 1ВМХ на транспорт К+ в эритроциты лягушек полностью ингибировалось в хлоридной и нитратной средах, если клетки были предобработаны уабаином. Эти результаты убедительно доказывают, что действие изопротеренола и блокаторов ФДЭ на транспорт К+ в эритроциты лягушки связано с активацией Ма+-К+-насоса в мембране эритроцитов лягушек. Дополнительным подтверждением активации работы Ыа+-К+-насоса

изопротеренолом является достоверное снижение концентрации Na+ в клетках, обработанных гормоном (10.7 ± 0.7 ммоль/л по сравнению с 12.3 ± 0.7 ммоль/л в контрольных клетках).

Для выяснения чувствительности Ыа+-К+-насоса к изопротеренолу изучали концентрационную зависимость влияния гормона в нитратной среде, в которой около 95 % входа К+ опосредовано активным транспортом (Рис. 9А). Значительное ускорение потока (на 36 %) наблюдалось при концентрации изопротеренола 10-8 М, а максимальная стимуляция входа К+ - при концентрациях гормона 10-6-10-5 М. Концентрация изопротеренола, необходимая для половины максимальной стимуляции потока К+ в клетки, составила около 210-' М. Чтобы определить тип адренорецепторов, ответственных за связывание с катехоламинами, одновременно были проведены параллельные эксперименты с добавлением 10 цМ пропранолола, неспецифического антагониста ß-адренорецепторов (Рис. 9Б). Пропранолол полностью ингибировал транспорт К+ в эритроциты, стимулируемый изопротеренолом при всех концентрациях. Ни один из антагонистов а-адренорецепторов (фентоламин, празоцин и уохимбин) не оказывал какого-либо достоверного ингибирующего действия на вход К+ в эритроциты, стимулируемый изопротеренолом. Результаты этих экспериментов показывают, что стимулирующее действие катехоламинов связано с наличием в мембранах эритроцитов лягушек системы ß-адренорецепторов. Система ß-адренорецепторов была обнаружена ранее в эритроцитах других видов лягушек - Rana pipiens (Mickey et al., 1976; Mukherjee et al., 1976) и Rana catesbiana (Cherksey et al., 1980). Действие катехоламинов в эритроцитах рыб и птиц также опосредовано через ß-специфичные адренорецепторы, которые блокируются пропранололом (Mahe et al., 1985; Palfrey et al., 1980).

Наиболее интересным фактом в наших исследованиях является аддитивное стимулирующее влияние катехоламинов и блокаторов ФДЭ на транспорт К+ в эритроциты лягушек, которая наблюдалась во всех трёх сериях экспериментов. Такой суммирующий эффект не был описан ранее для эритроцитов какого-либо другого изученного вида животных. В исследованиях на Rana pipiens (Rudolph and Greengard, 1980) одновременное добавление в среду изопротеренола и IBMX вызывало значительную стимуляцию входа К+ и Na+ в эритроциты, однако в присутствии каждого из этих соединений в отдельности транспорт ионов практически не изменялся. На основании наших данных можно предположить, что

о я т '2 о н о

5 О

ч

о

X

ш

1.2 0.8 0.4

0.8

0.4

10

10"8 10"7 106 10"5

Концентрация ИЗО (М)

+10'5 М пропранолола

10

10"'

10

10"'

10

Концентрация ИЗО (М)

Рис. 9. Влияние пропранолола на вход К* в эритроциты лягушек, стимулируемый ИЗО в различных концентрациях. Эритроциты преинкубнровали 5 мин с ИЗО в различных концентрациях или в присутствии ИЗО и 10"5 М пропранолола, затем добавляли изотоп и определяли его накопление за 60 мин. Представлены средние данные ± стандартные ошибки для 5 опытов. * Р < 0.01 по сравнению с контролем.

*

*

I

X

действие катехоламинов и блокаторов ФДЭ на транспорт К+ в эритроциты лягушек происходит через разные внутриклеточные посредники. Кроме цАМФ-зависимого пути, были описаны и другие регуляторные механизмы активного транспорта. Другой внутриклеточный путь регуляции может включать фосфолипазу С. В мембранах эритроцитов индюка изопротеренол увеличивает активность фосфолипазы С независимо от цАМФ (Яоопеу е1 а1., 1991). Инкубация эритроцитов с теофиллином и 1ВМХ может быть связана с увеличением внутриклеточной концентрации цГМФ, который также участвует в регуляции транспортных процессов в некоторых тканях (МсКее й а!., 1994).

-20-выводы

1. Показано, что транспорт ионов К+ (86Rb) в эритроциты лягушек двух видов

осуществляется тремя механизмами: через Ыа+-К+-насос, посредством К-С1 переносчика и через диффузионную компоненту. В физиологической среде на долю К-С1 котранспорта приходится 60-70 % от общего потока К+ в клетки. В нитратной среде около 95 % входа К+ происходит за счёт работы Na+-K+-насоса. Величина диффузионной компоненты входа калия в эритроциты не превышает 5 %.

2. Транспорт ионов Na+ в эритроциты лягушек происходит только за счёт

диффузионной компоненты, но при сжатии клеток в гипертонической среде активируется Na+/H+ обменник.

3. При снижении температуры инкубации от 20° до 5°С сохраняется около 70 % активности Ыа+-К+-насоса; выход ионов К+ из эритроцитов через К-С1 котранспорт и диффузионную компоненту уменьшается в большей степени, чем вход К+ через эти же пути. Максимальное изменение величины транспорта при охлаждении клеток наблюдается для входа Ыа+ в эритроциты. Такие изменения режима работы транспортных систем способствуют поддержанию ионного гомеостаза клеток при низкой температуре.

4: Впервые показано, что активность Ыа+-К+-насоса в эритроцитах лягушек находится под контролем катехоламинов. Стимуляция активного транспорта К+, вызываемая изопротеренолом, полностью блокируется р-адренергическим антагонистом пропранололом.

5. Блокаторы фосфодиэстераз также оказывают стимулирующее влияние на поток К+ в эритроциты через Na+-K+-насос. Действие катехоламинов и блокаторов фосфодиэстераз на активный транспорт К+ было аддитивным. Эти данные позволяют предположить, что в эритроцитах лягушек имеются два различных пути внутриклеточной регуляции активного транспорта катионов.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gusev G.P., Agalakova N.I., Lapin A.V. Sodium transport in erythrocytes of the mollusc Anadara broughtonii: evidence for inhibition by quinine // Сотр. Biochem. Physiol., 1994, v. 109 A, pp. 939-948.

2. Лгалакова Н. И., Лапин А. В., Гусев Г. П. Транспорт ионов калия в эритроцитах лягушки Rana ridibunda // Жури. эвол. биохим. и физиол., 1995, т. 31, № 2, с. 161— 169.

3. Агалакова Н. И., Лапин А. В., Гусев Г. П. Транспорт К+ через плазматическую мембрану эритроцитов травяной лягушки // Цитология, 1995, т. 37, № 4, с. 360—361.

4. Гусев Г. П., Агалакова Н. И., Лапин А. В. Транспорт ионов натрия в эритроцитах двух видов лягушек // Цитология, 1995, т. 37, № 4, с. 368.

5. Guscv G. P., Agalakova N. I., Lapin А. V. Potassium transport in red blood cells of frog Rana temporaria: demonstration of a K-Cl cotransport//J. Сотр. Physiol., 1995, v. 165, pp. 230—237.

6. Агалакова H. И. Активация катехоламинами Na-K-nacoca в эритроцитарной мембране лягушки Rana temporaria // В сб. «Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций», С.-Петербург, 1995.

7. Лгалакова Н. И., Лапин А. В., Гусев Г. П. Транспорт ионов натрия в эритроциты лягушек Rana ridibunda и Rana temporaria // Биол. мембраны, 1996, т. 13, № 2, с. 153—161.

8. Агалакова Н. И., Лапин А. В., Гусев Г. П. Влияние температуры на транспорт ионов Na+ н К+ через мембрану эритроцитов лягушки Rana temporaria // В сб. I (XI) международного совещания по эволюционной физиологии, С.-Петербург, 1996.

9. G. P. Gusev, Agalakova N. I., Lapin A. V. Activation of the Na+—K+-pump in frog erythrocytes by catecholamines and phosphodiesterase blockers // Biochem. Pharmacol., 1996 (в печати).

Подписано к печати 8.05.96. Формат бумаги 60х84'/|б- Печ. л. 1,25. Тираж 50 экз. Заказ 343. ГППП-3. 191104, Санкт-Петербург, Литейный пр., 55