Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вклад клеточных свойств эритроцитов в обеспечение эффективности микроциркуляции и их модификация под влиянием ионов кальция и механического стресса

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Вклад клеточных свойств эритроцитов в обеспечение эффективности микроциркуляции и их модификация под влиянием ионов кальция и механического стресса"

На правах рукописи

Михайлова Светлана Геннадьевна

ВКЛАД КЛЕТОЧНЫХ СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ

В ОБЕСПЕЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ И ИХ МОДИФИКАЦИЯ ПОД ВЛИЯНИЕМ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ И МЕХАНИЧЕСКОГО СТРЕССА

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАЙ 2012

Ярославль - 2012

005043333

Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии человека и животных ФГБОУ ВПО «Ярославский государственный педагогический университет

им. К.Д. Ушинского»

Научный Тихомирова Ирина Александровна

руководитель: доктор биологических наук, доцент, зав. кафедрой

основ медицинских знаний и охраны здоровья детей ФГБОУ ВПО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского»

Официальные Фатеев Михаил Михайлович

оппоненты: доктор биологических наук, профессор, профессор

кафедры нормальной физиологии с биофизикой ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия»

Кирилина Татьяна Владимировна

кандидат биологических наук, доцент кафедры медико-биологических дисциплин ФГБОУ ВПО «Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого»

Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Защита состоится » июД 2012 г. в часов на заседании совета по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.307.02 при ФГБОУ ВПО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского» (150000, г. Ярославль, Которосльная наб., 46в, ауд. 203).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского», 150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, 108.

Автореферат разослан » йЛ^Ы-Я. 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент И.А. Осетров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Эритроцит - высокоспециализированная клетка организма, основная роль которой состоит в транспорте кислорода и углекислого газа. Выполнение данной функции требует от клетки способности к поддержанию функциональной полноценности гемоглобина в течение всей ее жизни (Зинчук В.В., 2001). Однако функциональные свойства как самих эритроцитов, так и крови в целом, во многом определяются еще и мембранными свойствами этих клеток крови: электрофизиологическими характеристиками, обеспечивающими суспензионную стабильность крови и играющими важную роль в процессах адсорбции и межклеточной коммуникации, механическими свойствами (способностью к поддержанию формы, адгезии и деформации при прохождении через узкие капилляры) и комплексом биофизических и биохимических параметров, обусловливающих объединение эритроцитов в агрегаты. Клеточные свойства эритроцитов во многом определяют эффективность микроциркуляции и кисло-родгранспортной функции крови (Козинец Г.И. и соавт., 2002; Новицкий В.В. и соавт., 2004; Muravyov A., Tikhomirova I., 2012).

При движении эритроцитов в кровеносных сосудах даже в условиях физиологических величин напряжения сдвига имеет место деформационный стресс красных клеток крови, сопровождающийся повышением проницаемости мембраны клеток для катионов, в частности, для ионов кальция (Сторожок С.А. и соавт., 1997, Oonishi T. et al., 1997). Ионизированный кальций выступает регулятором множества физиологических процессов, включая различные виды межклеточных взаимодействий и мембранные перестройки, однако механизмы этого участия остаются недостаточно изученными (Авдонин П.В., Ткачук В.А., 1994).

В капиллярах мозга, люминальный диаметр которых меньше, чем в других органах, эритроциты перемещаются в значительно деформированном состоянии, сильно вытянутыми вдоль оси микрососуда (Шошенко К.А., 1982), поэтому способность красных клеток крови к деформации играет важную роль и снижение их деформируемости может быть критическим фактором в развитии ишемических повреждений мозговой ткани.

Традиционно эритроциты считались достаточно редуцированными клетками и рассматривались лишь в качестве простых резервуаров для транспорта кислорода. В исследованиях последних лет экспериментально доказано, что, несмотря на достаточно простую организацию, эритроциты обладают значительным набором сигнальных молекул (Minetti G., Low P.S., 1997; Hiñes P.S. et al., 2003; Sprague R. et al., 2007). Эти факты свидетельствуют об участии красных клеток крови в регуляторных процессах, направленных на интеграцию функций организма.

Изучение молекулярных механизмов изменения клеточных свойств эритроцитов и выявление сигнальных путей, принимающих участие в регуляции микрореологических свойств эритроцитов и их транспортного потенциала представляется актуальной задачей физиологии системы крови на современном этапе (Муравьев A.B., Чепоров C.B., 2009).

Цель: оценить влияние ионизированного кальция и механического стресса на клеточные свойства эритроцитов и вклад этих свойств в обеспечение эффективности микрокровотока в норме и при нарушениях мозгового кровообращения.

Задачи исследования:

• изучить роль ионизированного кальция в модификации адгезивных, микрореологических и электрофизиологических свойств эритроцитов;

• оценить влияние условий сдвигового течения (механического стресса) на микрореологические и электрофизиологические свойства эритроцитов;

• исследовать вклад клеточных свойств эритроцитов в гемореологиче-ский статус в норме и при нарушениях мозгового кровообращения;

• изучить состояние микроциркуляции и механизмов ее регуляции в норме и в условиях ишемии сосудов головного мозга;

• проанализировать значение клеточных свойств эритроцитов в обеспечении кислородного снабжения тканей в норме и при нарушениях мозгового кровообращения.

Научная новизна исследования

Впервые проведена оценка адгезивных характеристик красных клеток крови в присутствии ионов Са2+ методами атомно-силовой микроскопии. Установлена зависимость адгезивных и агрегатных свойств эритроцитов, их мембранного потенциала от концентрации экстрацеллюлярного кальция. Впервые показано, что агрегатные свойства эритроцитов зависят от содержания экстрацеллюлярного кальция, а в условиях деформационного стресса агрегируемость эритроцитов регулируется с участием потенциалзависимых (дигидропиридин-чувствительных) кальциевых каналов. Продемонстрировано, что деформируемость красных клеток крови снижается при увеличении содержания внутриклеточного кальция, как при нарушениях ионного гомеостаза эритроцитов, так и в условиях воздействия механического стресса.

Впервые выполнена комплексная оценка гемореологического статуса и состояния микроциркуляции при острых нарушениях мозгового кровообращения, выявлены особенности регуляторных влияний на микрокровоток в условиях ишемии сосудов головного мозга. Зафиксированы корреляционные взаимосвязи микрореологических характеристик эритроцитов с активными и пассивными регуляторными влияниями на микрокровоток в условиях нормы и при нарушениях мозгового кровообращения.

Проанализирован вклад клеточных свойств эритроцитов в обеспечение кислородтранспортной функции крови и функционирование системы микроциркуляции.

Теоретическая и практическая значимость работы

В исследовании получены новые данные о влиянии ионизированного кальция на адгезивные, агрегатные, деформационные и электрофизиологические свойства эритроцитов человека. Изучены элементы молекулярных сигнальных путей, связанных с изменениями микрореологических параметров эритроцитов.

В работе установлены основные закономерности регуляции функциональных свойств эритроцитов в условиях модификации содержания внеклеточ-

ного и внутриклеточного свободного кальция и под влиянием механического стресса. Материалы диссертационной работы расширяют представления о механизмах регуляции функциональных свойств эритроцитов человека.

Научно-практическая значимость работы заключается в том, что полученные в процессе исследования данные позволяют расширить уже имеющиеся представления о факторах, влияющих на реализацию кислородтранспортной функции крови, и механизмах регуляции этой функции в норме и при нарушениях мозгового кровообращения.

Результаты исследования указывают на важную роль показателя гематок-рита и микрореологических свойств эритроцитов в регуляции текучих свойств крови как в норме, так и при патологии. Практическое значение имеют полученные данные, свидетельствующие об особенностях регуляторных влияний на микрокровоток при нарушениях мозгового кровообращения. Результаты исследования дополняют знания о механизмах регуляции системы микроциркуляции в норме и при нарушениях мозгового кровообращения.

Полученные данные расширяют и дополняют знания по физиологии системы крови и кровообращения и могут быть использованы в преподавании физиологии, патофизиологии и клеточной молекулярной биологии, а также послужить теоретической основой для разработки методов оптимизации кровотока в норме и в условиях ишемии сосудов головного мозга.

Основные положения, выносимые па защиту:

1. Ионизированный кальций участвует в регуляции функциональных свойств эритроцитов человека, оказывая выраженное влияние на микрореологические, адгезивные и электрофизиологические параметры красных клеток крови.

2. Влияние механического стресса на микрореологические и электрофизиологические свойства эритроцитов обусловлено увеличением внутриклеточного пула свободного кальция.

3. В условиях ишемии сосудов головного мозга неблагоприятно измененные клеточные свойства эритроцитов вносят существенный вклад в повышение вязкости крови, снижение эффективности транспорта кислорода в ткани и оказывают влияние на функционирование регуляторных механизмов микрокровотока.

Апробация результатов работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: 62-й студенческой научной конференции (Ярославль, ЯГПУ, 2007); научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, 2007); VII Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2007» (Москва,

2007); V и VI Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007,

2008); III и IV Всероссийских конференциях «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» с международным участием (Москва, 2007, 2009); VI и VII международных конференциях «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль, 2007, 2009); IV и V Всероссийских с международным участием школах-конференциях по физиологии кровообращения

(Москва, 2008, 2012); XV Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2009); VIII Молодежной научной конференции Института физиологии НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2009); III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010» (Москва, 2010); XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); IX Всемирном конгрессе по микроциркуляции (Париж, 2010); XIV и XVI Конференциях Европейского общества по клинической гемореологии и микроциркуляции (Дрезден, 2007; Мюнхен, 2011); Международной научной конференции «Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиогене-за до центрального кровообращения)» (Ярославль, 2011); IV Всероссийской школе-семинаре студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехноло-гии: тооблемы и перспективы» (Белгород, 2011); Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ среди студентов и аспирантов в области биологических наук в рамках Всероссийского фестиваля науки (Ульяновск, 2011); Всероссийском конкурсе «Инновационный потенциал молодежи 2012» среди студентов и аспирантов (Ульяновск, 2011).

По теме диссертации опубликовано 33 печатные работы, в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах печатного текста, включает 16 таблиц и 22 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы с изложением полученных результатов, главы с обсуждением результатов исследования, выводов, библиографического списка, списка сокращений. Библиографический указатель включает 213 источников: 106 отечественных и 107 зарубежных.

ОРГАНИЗАЦИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включены лица обоего пола: 1) практически здоровые добровольцы (п=75, средний возраст 29,6±5,5 лет) и 2) пациенты с острыми нарушениями мозгового кровообращения (ОНМК) (п=30, средний возраст 63,4±13,7 лет). В норме изучали: а) влияние ионизированного кальция на адгезивные свойства эритроцитов и динамику содержания внутриклеточного свободного кальция в условиях механического стресса (п=18); б) эффект ионизированного кальция на микрореологические и электрофизиологические свойства эритроцитов (п=12); в) влияние механического стресса на микрореологические и элекгрофизиологические свойства эритроцитов (п=18); г) гемореологический статус и состояние микроциркуляции (п=27). В группе лиц с нарушениями мозгового кровообращения оценивали реологические свойства крови и состояние

микроциркуляции.

Кровь отбиралась из локтевой вены утром натощак квалифицированным медицинским персоналом в условиях клиники и стабилизировалась антикоагулянтом гепарином (10 Ед/мл). Эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием и трижды отмывали в изотоническом растворе (NaCl 0,154 М) с использованием стандартной лабораторной центрифуги при 1500 об/мин. Все манипуляции с кровью проводились в течение 4 часов после ее забора при t=21±2°C.

У лиц с цереброваскулярной патологией измерения проводились в первые 24 часа после поступления в клинику с диагнозом острое нарушение мозгового кровообращения и оказания неотложной медицинской помощи; из общего числа обследованных в группу были включены те пациенты, которым лечащим врачом впоследствии был поставлен верифицированный диагноз ишемический инсульт.

1. Методы оценки клеточных свойств

1.1. Оценка адгезивных свойств эритроцитов

При помощи атомно-силового сканирующего зондового микроскопа «NTEGRA VITA» (NT-MDT, Зеленоград)* определяли величину силы адгезии зонда (NSG11, жесткость 2,5 Н/м, радиус закругления 10 нм, NT-MDT) к поверхности эритроцита (Sirghi L. et al., 2008; Скоркина М.Ю., 2010). Значение силы адгезии (F) вычисляли по закону Гука (F = k * AZ) на основе данных силовой спектроскопии красных клеток крови (AZ) и с учетом жесткости канти-левера (к).

1.2. Исследование процесса агрегатообразования эритроцитов выполняли методом оптической микроскопии с видеорегистрацией и компьютерным анализом изображения (Муравьев A.B., 2003) в условиях замены плазмы на стандартную суспензионную среду (138 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1 мМ K2S04, 7,5 мМ Na2HP04, 1 мМ MgS04, 5 мМ глюкозы, 3% декстрана MW 70, 3% альбумина; рСа 2,65, 300 мосм/л) и рассчитывали степень агрегации (отношение числа агрегатов к числу одиночных клеток) и средний размер агрегата (среднее число эритроцитов, приходящееся на один агрегат).

1.3. Деформируемость красных клеток крови оценивали:

а) по индексу удлинения эритроцитов в проточной микрокамере (ИУЭ) (Муравьев A.B., 2010): ИУЭ = (L-W)/(L+W), где L - длина деформированной клетки, W - ее ширина; б) по фильтруемости через полимерные мембраны («Владипор», г. Владимир) с фиксированным диаметром пор 5 мкм (Reid H.L. et al., 1976; Hardeman M.R., 2007); в) по величине вязкости суспензии эритроцитов с гематокритом 40% в физиологическом растворе (Муравьев A.B., Чепо-ров C.B., 2009).

1.4. Электрофизиологические параметры эритроцитов (электрофорети-ческую подвижность и электрокинетический потенциал) определяли методом клеточного микроэлекгрофореза (Козинец Г.И. и соавт., 2002).

2. Методы гемореологических исследований

2.1. Измерение кажущейся вязкости крови, плазмы и суспензий эритроцитов со стандартным показателем Ht=40% в разных средах (аутоплазме и физиологическом растворе) выполняли с помощью полуавтоматического капиллярного вискозиметра (Муравьев A.B. и соавт., 2005) при следующих напряжениях сдвига (Па): 0,21; 0,42; 0,64; 0,85; 1,06.

2.2. Определение показателя гематокрита производили общепринятым методом с использованием микрогематокритной центрифуги СМ-70 (Латвия).

2.3. Эффективность доставки кислорода к тканям (Т02) оценивали по формуле: Т02 = Ht/rj, где Ht - показатель гематокрита, г| - вязкость цельной крови (Stoltz J. et al., 1991; Муравьев A.B., Чепоров C.B., 2009).

3. Модельные эксперименты

3.1. Моделирование изменений кальциевого ионного гомеостаза эритроцитов осуществляли с использованием хлорида кальция 50 цМ, 100 цМ и 200 цМ; стимуляторов входа свободного кальция в клетку ионофора А23187 1 цМ и фторида натрия 1 мМ; ингибитора Са-АТФазы ванадата натрия 0,1 мМ; 4) бло-катора кальциевых каналов нифедипина 20 цМ; 5) хелатора внутриклеточного кальция ВАРТА-АМ 6,5 цМ. Инкубировали эритроциты с растворами указанных веществ (за исключением ВАРТА-АМ) в течение 15 минут при 37°С в объемном соотношении 1:1. Экспозиция клеток с ВАРТА-АМ 6,5 рМ составила 40 минут при 37°С. Контрольной пробой служила суспензия эритроцитов в физиологическом растворе (Ht=50%), подвергавшаяся аналогичной по продолжительности инкубации при 37°С.

3.2. Моделирование условий сдвиговой деформации эритроцитов

Для оценки эффекта ионизированного кальция на функциональные свойства красных клеток крови в условиях сдвиговой деформации мембран использовали модель механического стресса эритроцитов (OonishiT. et al., 1997).

4. Оценка динамнки внутриклеточного свободного кальция

Динамику содержания ионов кальция в эритроцитах оценивали методом флуоресцентной визуализации с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Nikon DIGITAL ECLIPSE CI plus по интенсивности флуоресценции индикатора Calcium Green-1 (2,5-10" г/л).*

5. Регистрация параметров микроциркуляции и кислородтранспорт-ной функции крови

Оценку общего состояния микроциркуляции выполняли методом лазерной доплеровской флоуметрии и оптической тканевой оксиметрии с помощью анализатора ЛАКК-02 (НЛП «Лазма», Москва). Определяли изменение перфузии ткани кровью (среднее арифметическое показателя микроциркуляции ПМ, среднее квадратичное отклонение а, коэффициент вариации Kv), относительное насыщение кислородом крови микроциркуляторного русла биоткани (S02), объемное кровенаполнение ткани (Vr); индекс перфузионной сатурации кислорода (Sm); параметр удельного потребления кислорода тканью (U); индекс диффузии кислорода в ткани (ИДК). Выполняли вейвлет-анализ амплитудно-частотного спектра колебаний микрокровотока в диапазоне активных (эндоте-лиальных, нейрогенных, миогенных) и пассивных (дыхательных, сердечных) ритмов, по результатам которого оценивали значения максимальной (Атах), нормированной ((Атах/3а)100%), приведенной амплитуд ((Атах/ПМ)100%) колебаний микрокровотока, а также нейрогенный тонус (НТ), миогенный тонус (МТ) и показатель шунтирования (ПШ) (Крупаткин А.И., Сидоров В.В., 2005).

Показатели микроциркуляции фиксировали в положении лежа на спине после 15-минутного периода адаптации в помещении при t=23±2°C. Световод-ный зонд устанавливали перпендикулярно исследуемой поверхности в стандартной точке на предплечье (Бранько В.В. и соавт., 1999).

* Исследования на атомно-силовом и конфокальном микроскопах выполнялись в Центре коллективного пользования ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», НИЛ Физиологии адаптационных процессов. 8

6. Статистическая обработка результатов

Осуществляли проверку на соответствие распределения эмпирической выборки нормальному закону на основе критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения для оценки статистической значимости различий в независимых выборках применяли t-критерий Стьюдента, в связанных выборках - парный t-критерий Стьюдента. При отклонении распределения от нормального использовали критерий Вилкоксона. Оценка линейной связи между исследуемыми параметрами проводилась на основе коэффициентов корреляции Пирсона. За уровень статистически значимых различий принимали изменения при р<0,05 (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2006; Афанасьев В.В., Сивов М.А., 2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что нативные эритроциты обладают высокой адгезивностью к поверхности, несущей положительный электрический заряд, что считается неспецифическим типом адгезии и объясняется притяжением отрицательно заряженного гликокаликса красных клеток крови (Hategan A. et al., 2003).

В условиях нормы адгезия эритроцитов к сосудистому эндотелию относительно невелика, однако этот процесс существенно интенсифицируется при таких состояниях, как полицитемия (адгезия возрастает почти в 4 раза) (Wautier М.Р. et al., 2007) и серповидноклеточная анемия (Gauthier Е. et al., 2005; Zennadi R. et al., 2007). При этом значительно повышается риск развития тромбозов, и повышенная адгезия эритроцитов к эндотелию считается одним из основных факторов, обусловливающих окклюзию сосудов и болевой синдром в этих условиях (Кишат A. et al., 1996; Murphy М.М. et al., 2005). В системе микроциркуляции взаимодействие эритроцитов с эндотелием ведет к задержке красных клеток крови в сосудистой сети, что вызывает гипоксию и инициирует образование серповидных форм.

Применение методов атомно-силовой микроскопии позволило выявить изменения адгезивных характеристик эритроцитов в присутствии несвязанного кальция. В ходе исследования было зафиксировано увеличение силы адгезии кантилевера к поверхности эритроцитов, подвергавшихся воздействию ионизированного кальция 50, 100 и 200 цМ, по сравнению с интактными клетками. Значение силы адгезии возросло на 68 % (р<0,05), 122 % (р<0,05) и 70 % (р<0,01) соответственно.

Некоторые исследователи указывают на общность механизмов агрегации эритроцитов и их адгезии к поверхности (Neu В., Meiselman H., 2006). Сходное влияние свободного экстрацеллюлярного кальция на адгезию и агрегацию эритроцитов зафиксировано и в нашем исследовании: и в том, и в другом случае добавление в среду ионизированного кальция 50 рМ интенсифицировало эти процессы, причем в случае адгезии эффект был более выраженным (рис. 1).

Деформационные свойства эритроцитов под влиянием экстрацеллюлярного кальция изменились незначительно (рис. 1), сходные данные были получены Oonishi T. et al. (1997). Связывание свободного внутриклеточного кальция в клетках хелатором ВАРТА-АМ практически не повлияло на микрореологические характеристики эритроцитов.

180

160

£ 140

К 120

| 100

К 80 а

§ 60

м

3 40 20

0

Контроль А

Рис. 1. Изменения адгезии, агрегации и деформируемости эритроцитов в присутствии экстрацеллюлярного Са" 50 |хМ.

Обозначения: А - сила адгезии эритроцитов, СА - степень агрегации эритроцитов, Б - деформируемость эритроцитов (по фильтруемости); * - различия достоверны при р<0,05.

Внутриклеточный кальций регулирует ряд мембранных свойств эритроцитов, включая поддержание формы, липидного состава мембраны, катионную проницаемость (Ое ОН\'ета Б., БаМапЬа С., 2010). Значительная часть внутриклеточного кальция не является свободно растворенной в цитоплазме, а связана с мембраной и внутриклеточными компонентами (Эккерт Р. и соавт., 1992), которые создают в эритроцитах большую емкость с высоким сродством к этим катионам, поэтому в ионизированной форме в красных клетках крови находится менее 1 цМ кальция (Левицкий Д.О., 1990; Бе ОНуега 8., БаЫапЬа С., 2010). Возможно, этим и обусловлено незначительное влияние дополнительного связывания кальция на микрореологические свойства эритроцитов, зафиксированное нами.

Поддержание высокого трансмембранного градиента концентрации ионов кальция в эритроцитах обеспечивается очень низкой пассивной проницаемостью их мембран к указанному катиону и наличием в них кальциевого насоса, способного активно выводить ионы кальция из цитозоля против градиента концентрации. Повышение концентрации внутриклеточного свободного кальция либо за счет увеличения входа ионов в клетку, либо за счет блокады активного выведения их из клетки (при содержании Са2 в среде 50 цМ) продемонстрировало тенденцию к росту агрегируемое™ эритроцитов (рис. 2) и достоверное снижение их деформируемости (рис. 3).

Опубликованные данные свидетельствуют, что инициирование входа ионов Са2+ в клетку или блокада их выхода из эритроцитов при содержании кальция в среде, сопоставимом с его концентрацией в плазме, ведет к повышению агрегируемости красных клеток крови (Тихомирова И.А., 2006). При содержании кальция в среде, сопоставимом с его внутриклеточной концентрацией, его эффект на агрегатные свойства эритроцитов существенно снижается. Однако даже 50 цМ экстрацеллюлярного ионизированного кальция оказалось достаточным для влияния на деформационные характеристики эритроцитов при варьировании внутриклеточного баланса этого катиона (рис. 3). 10

Контроль А

В Степень агрегации 0 Средний размер агрегата

Са2++А23187 Са2++ГСаК Са2++ШУС>з ВАРТА-АМ

Рис. 2. Изменение степени агрегации эритроцитов и среднего размера агрегата по отношению к контролю (%) в условиях воздействия биологически активных соединений.

Обозначения: Са2+ - ионизированный кальций 50 рМ; А23187 - кальциевый ионофор 1 рМ; Кар - фторид натрия 1 мМ; Ыа\Ю3 - ванадат натрия 0,1 мМ; ВАРТА-АМ - хелатор кальция 6,5 рМ; * - статистически значимые различия с показателями контрольной группы при р<0,05.

0,392

^ 0,388

и

И 0,384

о

(ТГ 0,380

>>

я 0,376 0,372

11111

Контроль Са2+ Са2+ Са2++^Р Са2+

+А23187 чЧЧаУО,

Рис. 3. Изменение индекса удлинения эритроцитов (ИУЭ) при повышении концентрации внутриклеточного кальция в присутствии внеклеточного Са' .

Обозначения: Са2+ - ионизированный кальций 50 рМ; А23187 - кальциевый ионофор 1 рМ; ИаР - фторид натрия 1 мМ; Ыа"У03 - ванадат натрия 0,1 мМ; * - различия достоверны при р<0,05.

Из опубликованных данных известно, что снижение деформируемости эритроцитов имеет место при повышении содержания как вне-, так и внутриклеточного кальция. При этом более существенное воздействие на микрореологические свойства зафиксировано при использовании кальциевого ионофора А23187 (Chunyi W. et al., 2001). Y. Takakuwa et al. (1990) предположили, что мембранная деформируемость эритроцитов снижается при концентрациях ионов кальция более 100 цМ. Наши результаты согласуются с данными, полученными Булаевой C.B. и соавт. (2007), о влиянии внутриклеточного ионизированного кальция на деформационные свойства эритроцитов: авторами было зафиксировано, что при стимуляции входа кальция в клетку при действии агониста а 1 -адренорецепторов фенилэфрина деформируемость снижалась, но этот эффект нивелировался при блокаде кальциевых каналов верапамилом.

На возможность влияния антагонистов медленных (L) кальциевых каналов (производных фенилалкиламинов) на деформационные характеристики эритроцитов указывают и другие авторы (Muravyov A.V., Tikhomirova I.A., 2012). Показано, что ванадат натрия способствует открытию потенциалзависи-мых кальциевых каналов L-типа в эритроцитах человека (Romero P.J., Romero Е.А., 2003).

Известно, что механический стресс цитоплазматической мембраны сопровождается входом кальция в клетку и снижением деформируемости эритроцитов, причем пик этого снижения наблюдается при концентрации экстрацеллю-ляр'ного кальция 50 цМ, что значительно меньше содержания его в плазме (Оо-nishi T. et al., 1997; Saner H. et al., 2000). Полученные нами данные продемонстрировали, что механический стресс сам по себе (в отсутствии ионов кальция в среде) не изменяет ни микрореологических, ни электрофизиологических свойств эритроцитов (рис. 4).

S С А ОЭФП HD ОВСФ

Рис. 4. Изменения (%) микрореологических и электрофизиологических характеристик эритроцитов под влиянием ионов кальция и механического стресса.

Обозначения: СА - степень агрегации эритроцитов; ЭФП - электрофоре-тическая подвижность эритроцитов; О - деформируемость эритроцитов

(по фильтруемости); ВСФ - вязкость суспензии эритроцитов в физиологическом растворе с гематокритом 40% при т = 0,21 Па; МС - механический стресс; Са2+ - ионизированный кальций 50 рМ; различия достоверны: * - при р<0,05, **-при р<0,01.

Однако совместное воздействие механического стресса и свободного внеклеточного кальция сопровождается уменьшением мембранного потенциала красных клеток крови (на 29,7 %, р<0,05) и снижением деформируемости (что определяется как по снижению фильтруемости эритроцитов (на 7,5 %, р<0,05), так и по повышению вязкости суспензии эритроцитов с фиксированным гематокритом в физиологическом растворе (на 18,0 %, р<0,01) (рис. 4). При действии механического стресса в отсутствии ионов кальция зафиксирована выраженная тенденция к снижению агрегируемости эритроцитов, а при введении в среду Са2+ 50 рМ показатели степени агрегации практически не отличались от контрольных значений, по всей видимости, за счет проагрегантного влияния ионизированного экстрацеллюлярного кальция (рис. 4).

То, что наблюдаемые изменения деформируемости эритроцитов при соче-танном действии механического стресса и ионизированного кальция обусловлены входом этих катионов в клетку, подтверждают результаты измерения содержания внутриклеточного кальция методом конфокальной микроскопии (в данных условиях отмечен рост содержания Са2+ на 17%, р<0,05). Однако максимальное увеличение входа ионов кальция зафиксировано при его концентрации 200 рМ, а при более низкой концентрации (50 рМ), соответствующей максимуму падения деформируемости - лишь выраженная тенденция (таблица 1).

Таблица 1

Интенсивность флуоресценции Calcium Green-1 в эритроцитах, подвергавшихся воздействию ионизированного кальция и механического стресса (М±о)

Условия исследования Интенсивность флуоресценции Calcium Green-1 (усл. ед.) Изменения (%)

До механического стресса После механического стресса

Контроль 15,54±5,12 15,48±3,88 -0,35

Са2+50 рМ 15,27±4,35 17,51±6,50 +14,7

Са2+100 рМ 14,97±5,59 16,51±8,24 +10,3

Са2+ 200 рМ 17,94±7,41 21,00±9,72* +17,0

Обозначения: Са2* - ионизированный кальций; * - статистически значимые различия со значениями группы «До механического стресса» при р<0,05.

Полученные данные могут свидетельствовать о том, что в регуляции деформируемости при механическом стрессе задействованы сложные внутриклеточные каскады реакций, обусловленные не только участием ионизированного кальция, но и другими вторичными посредниками. Существование

13

нескольких сигнальных путей регуляции деформационных свойств эритроцитов (с участием ионов кальция и цАМФ) было экспериментально доказано в работах ОогшЫ Т. й а1. (1997). Эта медиаторы могут активировать различные киназы и фосфатазы, приводя к фосфорилированию или дефосфорилированию ключевых белков мембранного цитоскелета и влияя, тем самым, на деформируемость мембраны.

Поскольку при механическом стрессе деформируемость эритроцитов достоверно снизилась в присутствии экстрацеллюлярного кальция, и повышение содержания внутриклеточного кальция было зафиксировано методом конфокальной микроскопии, можно предположить, что вход этих катионов был обусловлен активацией механочувствительных каналов мембраны эритроцита.

Концентрация кальция в красных клетках крови определяется балансом между его активным транспортом из цитозоля в плазму и пассивным потоком в обратном направлении, последний' лимитируется активностью кальциевых каналов мембраны. В цитоплазматических мембранах клеток различных тканей выявлено два типа кальциевых каналов - рецепторуправляемые и потенциал-управляемые. Изменение состояния рецепторуправляемых каналов может осуществляться с участием вторичных посредников через О-белки и прямым сопряжением рецепторов с каналами (Ткачук В.А., 2001). Активация или ингиби-рование потенциалуправляемых каналов происходит при изменении С-потенциала цитоплазматической мембраны. Каналы этого типа имеются во всех клетках возбудимых тканей. Характерной особенностью каналов этого типа является их чувствительность к кальциевым антагонистам - производным дигидропиридина (Авдонин П.В., Ткачук В.А., 1994).

Учитывая экспериментальные подтверждения рецепторопосредуемых изменений микрореологических свойств эритроцитов с участием ионов кальция (Тихомирова И.А., 2006; Муравьев А.В. и соавт., 2008) и чувствительность мембран красных клеток крови к воздействию антагонистов кальция - производных дигидропиридина, можно говорить о наличии в мембранах эритроцитов обоих типов (рецепторуправляемых и потенциалзависимых) кальциевых каналов.

Применение нифедипина (селективного блокатора кальциевых каналов II класса, производного дигидропиридина) не привело к нормализации нарушенной деформируемости и сниженной электрофоретической подвижности красных клеток крови, обусловленных сочетанным воздействием ионов кальция и механического стресса, что согласуется с опубликованными данными о влиянии производных дигидропиридина на деформационные характеристики эритроцитов (ОогшЫ Т. й а1., 1997; Бщка I. е1 а1., 1999). Однако степень агрегации эритроцитов при блокаде потенциалуправляемых кальциевых каналов нифеди-пином достоверно снизилась (на 28,5%, р<0,05) (таблица 2).

Полученные данные позволяют заключить, что регуляция деформационных свойств эритроцитов в условиях механического стресса осуществляется посредством активации не потенциалзависимых, а механочувствительных кальциевых каналов; тогда как агрегатные свойства красных клеток крови регулируются в том числе и с участием дигидропиридин-чувствительных (потенциалуправляемых) кальциевых каналов.

Таблица 2

Реологические и электрофизиологические характеристики крови в условиях воздействия нифедипина (М±о)

Исследуемые параметры Са2+ и MC Нифедипин, Са2+ и MC Изменения(%)

CA (отн. ед.) 0,071±0,052 0,051±0,020* -28,5

РА (отн. ед.) 4,57±0,26 3,90±0,52* -14,6

D (отн. ед.) 0,637±0,041 0,607±0,049 •4,70

ЭФП (ц-сек'-В"'-см) 0,650±0,170 0,626±0,227 -3,67

Обозначения: Са2+ - ионизированный кальций 50 цМ; МС - механический стресс; СА - степень агрегации эритроцитов; РА - средний размер агрегата; Б -деформируемость эритроцитов (по фильтруемости); ЭФП - электрофоретиче-ская подвижность эритроцитов; * - статистически значимые различия с показателями группы «Са2+ и механический стресс» при р<0,05.

Таким образом, нами показана обусловленность ухудшения деформационных свойств красных клеток крови увеличением внутриклеточного пула свободного кальция, независимо от того, вызвано ли это интенсификацией входа ионов кальция в клетку (посредством активации механочувствительных каналов, воздействием ионофора и т.д.) или блокадой его выведения из клетки, а также продемонстрирована зависимость агрегатных свойств эритроцитов от активации потенциалуправляемых кальциевых каналов.

Важность клеточных свойств эритроцитов, обеспечивающих выполнение кровью кислородтранспортной функции, возрастает в условиях патологии, когда сердечно-сосудистая система функционирует особенно напряженно. Высокая чувствительность нейронов мозга к гипоксии и малый диаметр микрососудов в мозговой ткани предопределяют особую значимость реологических свойств крови при нарушениях мозгового кровообращения.

Ишемические нарушения мозгового кровообращения продолжают оставаться одной из наиболее актуальных и социально значимых проблем современной медицины (Верещагин Н.В. и соавт., 1997; Танашян М.М. и соавт., 2001). Установлено, что ведущая роль в развитии ишемического инсульта далеко не всегда принадлежит только структурным изменениям сосудистого русла, а в значительной мере определяется гемореологическими сдвигами и расстройствами в функционировании систем гемостаза и фибринолиза (Ионова В.Г., Суслина З.А., 2002; Суслина З.А., Танашян М.М., 2005).

Известно, что вязкость крови определяется следующими основными факторами: показателем гематокрита, вязкостью плазмы и способностью красных клеток крови к деформации и агрегации. Таким образом, клеточные свойства эритроцитов (начиная от объемной концентрации) и заканчивая микрореологическими характеристиками (агрегацией и деформируемостью), наряду с вязкостью плазмы выступают в качестве основных детерминант текучести крови

(Левтов В.А. и соавт., 1982; Муравьев A.B., Чепоров C.B., 2009).

Расчет коэффициентов детерминации для вышеназванных факторов, определяющих вязкость цельной крови, показал, что наряду с существенным вкладом вязкости плазмы и в норме, и при острых нарушениях мозгового кровообращения значительную роль играют клеточные факторы - показатель ге-матокрита и микрореологические свойства эритроцитов (рис. 5, 6).

□ вп а ж 88 0 вса

Рис. 5. Вклад основных факторов в формирование вязкости цельной крови в условиях нормы.

Обозначения : ВП - вязкость плазмы; Ш - показатель гематокрита; Б -деформируемость эритроцитов; СА - степень агрегации эритроцитов.

овп от го шса

Рис. 6. Вклад основных факторов в формирование вязкости цельной крови при острых нарушениях мозгового кровообращения.

Обозначения: ВП — вязкость плазмы; Ш - показатель гематокрита; О -деформируемость эритроцитов; СА - степень агрегации эритроцитов.

Однако при нарушениях мозгового кровообращения несколько меняется соотношение агрегатных свойств красных клеток крови и их деформируемости: если в норме более важны деформационные характеристики эритроцитов (рис. 5), то при острых нарушениях мозгового кровообращения значительно возрастает роль способности красных клеток крови объединяться в агрегаты (рис. 6).

Представление реологических характеристик крови в виде гемореоло-гического профиля позволяет наглядно продемонстрировать существенные реологические сдвиги, зафиксированные в ходе нашего исследования в группе пациентов с нарушениями мозгового кровообращения (рис. 7).

Достоверное снижение эффективности доставки кислорода к тканям при ОНМК (на 16.7 %, р<0,01) было обусловлено выраженным ростом вязкости крови (на 20 %, р<0,05), который наряду с повышением вязкости плазмы (на 25,8 %, р<0,001) определялся и негативными изменениями клеточных свойств

эритроцитов. Поскольку количественная характеристика эритроцитов (Ш) практически не отличалась от контрольных значений, основной вклад в снижение текучих свойств крови внесли негативные изменения качественных характеристик эритроцитов. К таковым можно отнести как снижение мембранного потенциала красных клеток крови (на 37,7 %, р<0,001), так и неблагоприятные изменения их микрореологических свойств (деформируемости и агрегируемо-сти) (рис. 7).

2 ч о р, Н

а о а а

я кг •я X

е>

Йн

50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50

сг

ВК____ВП_____Н1_______ВСФ

Ш| _

Рис. 7. Гемореологический профиль пациентов с острыми нарушениями мозгового кровообращения.

Обозначения: ВК - вязкость крови; ВП - вязкость плазмы; № - показатель гематокрита; ВСФ - вязкость суспензии эритроцитов (Ш=40%) в физиологическом растворе (показатель деформируемости); О - деформируемость эритроцитов (по фильтруемости); СА - степень агрегации эритроцитов; ЭФП - электро-форетическая подвижность эритроцитов; Шг| - эффективность доставки кислорода в ткани; различия достоверны: * - при р<0,05, ** - при р<0,01; *** -при р<0,001.

Роль клеточных свойств эритроцитов важна не только в обеспечении текучих свойств крови, они оказывают существенное влияние и на состояние микроциркуляции в целом. Сравнение параметров, характеризующих функциональное состояние кожного микрокровотока, в норме и при нарушениях мозгового кровообращения выявило выраженное снижение уровня перфузии (ПМ) при сохранении кислородсвязывающих свойств гемоглобина (параметр Б02) в условиях цереброваскулярной патологии (рис. 8, 9).

Значительно более высокая вариабельность микрокровотока при острых нарушениях мозгового кровообращения указывает на активизацию регулятор-ных механизмов, направленных на поддержание кровоснабжения органов и тканей (рис. 8). Ухудшение кислородного питания тканей в группе пациентов

диагностировалось по 2-кратному увеличению индекса перфузионной сатурации кислорода (Бт) - параметра, находящегося в обратной зависимости от потребления кислорода тканью; достоверному снижению удельного потребления кислорода тканями (и) и индекса диффузии кислорода (ИДК) (рис. 9).

□ контроль Я ОНМК

7,00 т—--------------------------

г-Ь- .........................................

йн Мвв

- *

* Г"*"!

ж ш

я

М 0 Ку

Рис. 8. Показатель микроциркуляции (М), стандартное отклонение (а) и коэффициент вариации (Ку) показателя микроциркуляции в норме и при острых нарушениях мозгового кровообращения (ОНМК). Обозначения: * - различия достоверны при р<0,05.

Рис. 9. Показатели кислородного питания тканей в норме и при острых нарушениях мозгового кровообращения (ОНМК).

Обозначения: 802 - относительное насыщение ткани кислородом; Яш -индекс перфузионной сатурации кислорода; и - параметр удельного потребления кислорода тканью; ИДК - индекс диффузии кислорода в ткани; различия достоверны: * - при р<0,05, *** - при р<0,001.

В группе пациентов отмечено увеличение параметра Уг, характеризующего объемное кровенаполнение ткани и пропорционального числу эритроцитов в зондируемом объеме ткани, на 14,4 % (р<0,05) по сравнению с контролем, что позволяет предположить, что снижение показателя микроциркуляции при острых нарушениях мозгового кровообращения обусловлено снижением линейной скорости эритроцитов, т.е. замедлением микрокровотока. 18

Рассмотрение функционального состояния активных, тонусформирующих звеньев модуляции микроциркуляции при ишемии мозга позволяет отметить рост максимальных амплитуд осцилляций микрокровотока в диапазонах эндо-телиальной, нейрогенной и миогенной активности (рис. 10).

Секреторная функция эндотелия стимулируется биофизическими (такими, как напряжение сдвига) или гуморально-химическими стимулами. Снижение тонуса микрососудов, в том числе за счет активизации эндотелиальных механизмов вазодилатации, по всей видимости, связано с повышением напряжения сдвига в микрососудах, обусловленным ростом вязкости крови и неблагоприятными изменениями клеточных свойств эритроцитов при нарушениях мозгового кровообращения.

Амплитуды кардиальных ритмов при ОНМК достоверно не отличались, а амплитуды дыхательных ритмов почти двукратно превышали аналогичный показатель в контроле (рис. 10). Все это указывает на падение градиента давления в микроциркуляторном русле. Такие изменения микрогемодинамики у пациентов с инсультом можно рассматривать как компенсаторные, направленные на поддержание кислородного обеспечения тканей в условиях ишемии.

A mas 1,20

1,00

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00

□ контроль ■ ОНМК

Рис. 10. Амплитудно-частотный спектр колебаний микрокровотока в норме и при острых нарушениях мозгового кровообращения (ОНМК).

Обозначения: Э - колебания эндотелиальной природы; Н - колебания нейрогенной природы; М - колебания миогенной природы; Д - колебания дыхательной природы; С - колебания сердечной природы; различия достоверны: ** - при р<0,01; *** - при р<0,001.

Сопоставление реологических показателей, измеренных in vitro, и диагностических параметров базального кровотока, определенных in vivo в группах обследуемых, позволило выявить выраженную корреляционную взаимосвязь между рядом реологических характеристик и состоянием капиллярного кровотока, оцениваемым неинвазивным методом лазерной доплеровской флоумет-рии.

Для деформируемости эритроцитов, оцененной по фильтруемости, в норме отмечена прямая корреляционная взаимосвязь с максимальной, нормированной и приведенной амплитудами осцилляции сердечной природы (г=0,668, г=0,686, г=0,617 соответственно, р<0,05), с приведенной амплитудой осцилля-ций дыхательной природы (г=0,569, р<0,05). Корреляционные взаимосвязи реологических показателей и активных компонентов тонуса микрососудов в группе контроля не наблюдались.

При острых нарушениях мозгового кровообращения вклад измененных клеточных свойств в процессы регуляции микрокровотока и кислородное снабжение тканей значительно возрастает. И вязкость крови, и количественная характеристика эритроцитов (№) при острых нарушениях мозгового кровообращения взаимосвязаны со всеми факторами модуляции микроциркуляции: как активными, так и пассивными (таблица 3).

Таблица 3

Взаимосвязь вклада эндотелиальных (Э), нейрогенных (Н), миогенных (М), дыхательных (Д), сердечных (С) осцилляции в общий уровень тканевой перфузии (Ашах/ПМ) и реологических характеристик при острых нарушениях мозгового кровообращения

Реологические параметры Ашах/ПМ

Э Н М д С

Показатель гематокрита -0,560** -0,404* -0.495* -0,562** -0,369

Вязкость крови (0,21 Па) -0,323 -0,289 -0,363 -0,345 -0,229

Вязкость крови (0,42 Па) -0,489* -0,458* -0,469* -0,462* -0,393

Вязкость крови (0,64 Па) -0,503* -0,484* -0,511* -0,517** -0,447*

Вязкость крови (0,85 Па) -0,501* -0,477* -0,491* -0,512* -0,437*

Вязкость крови (1,06 Па) -0,510* -0,484* -0,523** -0,529** -0,452*

Обозначения: статистически значимые коэффициенты корреляции: * -при р<0,05; ** - при р<0,01.

Зафиксирована отрицательная корреляционная взаимосвязь индекса удельного потребления кислорода тканями с вязкостью суспензии эритроцитов в неагрегирующей среде (г=-0,563, р<0,01) при ишемии мозга, что свидетельствует о негативном влиянии на кислородное питание тканей сниженной при нарушениях мозгового кровообращения деформируемости эритроцитов. Хотя прямых корреляций между степенью агрегации эритроцитов и кислородтранс-портной функцией крови установить не удалось, выявлены взаимосвязи индекса удельного потребления кислорода тканями с показателями низкосдвиговой вязкости крови (г=-0,425, р<0,05) и вязкости суспензии эритроцитов в ауто-плазме (г=-0,558, р<0,01), это позволяет заключить, что повышенная агреги-руемость эритроцитов при острых нарушения мозгового кровообращения, наряду со сниженной деформируемостью затрудняет осуществление кислород-транспортной функции крови.

Отмеченные при нарушениях мозгового кровообращения тесные взаимосвязи индекса перфузионной сатурации кислорода с показателем гематокрита (г=0,503, р<0,01), вязкостью плазмы (г=0,425, р<0,05) и вязкостью суспензии эритроцитов в плазме (г=0,594, р<0,01) свидетельствуют о возрастании роли негативно измененных макро- и микрореологических характеристик крови в функционировании системы микроциркуляции и в обеспечении кислородного питания тканей.

ВЫВОДЫ

1. Добавление в среду ионизированного кальция в концентрации 50 (дМ ведет к снижению мембранного заряда эритроцитов на 21,9 %, усилению их адгезивности на 68,0 % и интенсификации процесса агрегатообразования на 20,8 %. Экстрацеллюлярный кальций в указанной концентрации не оказывает значимого влияния на деформационные характеристики красных клеток крови. Снижение деформируемости отмечено при повышении содержания внутриклеточного кальция (как при стимуляции входа ионов Са2+ в клетку, так и при блокаде выхода из нее).

2. Изменение клеточных свойств эритроцитов (снижение мембранного заряда и ухудшение деформируемости) в условиях сдвигового стресса обусловлено повышением концентрации внутриклеточного свободного кальция. Изменение мембранного потенциала сопровождается активацией потенциалза-висимых (дигидропиридин-чувствительных) кальциевых каналов, которые оказывают существенное влияние на процесс объединения эритроцитов в агрегаты в условиях деформационного стресса

3. Негативные изменения клеточных свойств эритроцитов (снижение мембранного заряда, повышение агрегируемое™ и ухудшение деформируемости) при острых нарушениях мозгового кровообращения вносят существенный вклад в повышение вязкости цельной крови и снижение эффективности ее ки-слородтранспортного потенциала. При нарушениях мозгового кровообращения изменяется соотношение вклада деформационных и агрегатных характеристик эритроцитов в формирование реологических свойств цельной крови по сравнению с нормой (в пользу последних).

4. При острых нарушениях мозгового кровообращения отмечено снижение уровня перфузии, обусловленное падением градиента давления в микро-циркуляторном русле (диагностируемым по соотношению амплитуд кардиаль-ных и респираторных ритмов) и замедлением микрокровотока. В этих условиях достоверно сниженными были индекс диффузии кислорода и параметр удельного потребления кислорода тканями.

5. О компенсаторных изменениях микрогемодинамики при нарушениях мозгового кровообращения, направленных на поддержание кислородного обеспечения тканей в условиях ишемии, свидетельствует активизация регуля-торных механизмов (в диапазонах эндотелиальной, нейрогенной и миогенной активности) и более высокая вариабельность микрокровотока при ОНМК.

6. Корреляционные взаимосвязи между характеристиками красных клеток крови и параметрами микроциркуляции и кислородного снабжения тканей подтверждают важность роли клеточных свойств эритроцитов в обеспечении

эффективности периферического кровотока. В состоянии нормы внешние (кар-диальные и респираторные) регуляторные влияния взаимосвязаны с деформационными свойствами эритроцитов.

7. Неблагоприятно измененные клеточные свойства эритроцитов при острых нарушениях мозгового кровообращения существенно влияют на функционирование системы микроциркуляции и реализацию кислородтранспортной функции крови. Повышенная при ОНМК агрегационная способность эритроцитов наряду со сниженной деформируемостью затрудняет осуществление кислородтранспортной функции крови, о чем свидетельствуют корреляционные взаимосвязи реологических параметров с индексом удельного потребления кислорода тканями и тесная взаимосвязь деформируемости эритроцитов с индексом псрфузионной сатурации кислорода.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ АВТОРА:

1. Петроченко Е.П., Михайлова С.Г., Тихомирова И.А. Функциональные свойства форменных элементов периферической крови при адренергиче-ских воздействиях // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - СПб, 2007. - № 1 (21). - С. 124-125 (авторских - 0,04 п.л.) (Журнал включен в перечень рекомендованных ВАК РФ изданий).

2. Тихомирова И.А., Муравьев А.В., Голубкова Е.В., Петроченко Е.П., Михайлова С.Г. Оценка взаимосвязи агрегируемости эритроцитов и их мембранных свойств // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - СПб, 2007. - № 2 (22). - С. 24-29 (авторских - 0,10 пл.) (Журнал включен в перечень рекомендованных ВАК РФ изданий).

3. Tikhomirova I.A., Oslyakova А.О., Mikhailova S.G. Microcirculation and blood rheology in patients with cerebrovascular disorders // Clinical Hemorheology and Microcirculation. - 2011. - Vol. 49. - № 1-4. - P. 295-305 (авторских - 0,32 п.л.) (Журнал включен в перечень рекомендованных ВАК РФ изданий).

4. Тихомирова И.А., Михайлова С.Г., Лыченко С.В., Ослякова А.О. Оценка состояния микроциркуляции при нарушениях мозгового кровообращения по данным лазерной доплеровской флоуметрии и гемореологическим показателям // Физиология человека. - 2012. - Т. 38. - № 1. - С. 69-76 (авторских - 0,25 пл.) (Журнал включен в перечень рекомендованных ВАК РФ изданий).

5. Михайлова С.Г. Изучение мембранных свойств эритроцитов человека в норме и при нарушениях кровообращения // Вестник студенческого научного общества: материалы 62-й студенческой конференции. - Ярославль, 2007. - С. 363-366.

6. Михайлова С.Г. Сравнительный анализ способов фармакологической коррекции нарушений мозгового кровообращения // Мат. научно-практ. конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях». - Москва, 2007. - С. 266-267.

7. Михайлова С.Г., Тихомирова И.А. Электрофизиологические и агрегатные свойства эритроцитов в норме и при нарушениях мозгового кровообращения // Мат. V Всерос. конференции с международн. участием «Механиз-

мы функционирования висцеральных систем». - СПб, 2007. - С. 207-208 (авторских - 0,10 пл.).

8. Tikhomirova I.A., Muravyov A.V., Petrochenko Е.Р., Mikhailova S.G. Red blood cell aggregation under adrenergic action // Abstracts of 14 Conference of the European Society for Clinical Hemorheology and Microcirculation. - Dresden, Germany. - 27-30 June 2007. - P.l 00 (авторских - 0,02 пл.).

9. Михайлова С.Г., Тихомирова И.А. Влияние фармакологических препаратов на микрореологические свойства эритроцитов при нарушениях кровообращения // Механизмы функционирования висцеральных систем: VI Всерос. конференция с международн. участием. Тезисы докладов. - СПб: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 2008. - С. 143-144 (авторских - 0,10 пл.).

10. Михайлова С.Г., Тихомирова И.А., Муравьев A.B. Влияние механического стресса и ионизированного кальция на мембранные свойства эритроцитов // Тезисы докладов IV Всерос. с международн. участием школы-конференции по физиологии кровообращения. - Москва, 2008. - С. 66-67 (авторских— 0,10 пл.).

11. Михайлова С.Г., Тихомирова И.А., Якусевич В.В. Микрореологические свойства эритроцитов при нарушениях мозгового кровообращения и разных способах фармакологической коррекции // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2008. - Т. 14. - С. 117-118 (авторских - 0,10 пл.).

12. Тихомирова И.А., Петроченко Е.П., Михайлова С.Г., Лыченко C.B., Петроченко A.C. Влияние /Ш0-групповой принадлежности эритроцитов пациентов с ишемизацией сосудов головного мозга на реологические свойства крови при фармакологической коррекции // Механизмы функционирования висцеральных систем: VI Всерос. конференция с международн. участием. Тезисы докладов. - СПб: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 2008. - С. 200

(авторских - 0,02 пл.).

13. Тихомирова И.А., Петроченко Е.П., Михайлова С.Г., Терехин С.С., Милорадов М.Ю. Оценка взаимосвязи состояния капиллярного кровотока in vivo и реологических характеристик крови // Механизмы функционирования висцеральных систем: VI Всерос. конференция с международн. участием. Тезисы докладов. - СПб: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 2008. - С.

201 (авторских - 0,02 пл.).

14. Tikhomirova I.A., Muravyov A.V., Yakusevich V.V., Petrochenko E.P., Petrochenko A.S., Mikhailova S.G. The estimation of rheologicai efficiency of drugs under circulation disorders // Biorheology. - 2008. - Vol. 45. - № 1/2. - P. 102-103

(авторских - 0,08 пл.).

15. Михайлова С.Г., Тихомирова И.А., Муравьев A.B. Изменения микрореологических свойств клеток крови под воздействием механического стресса и ионизированного кальция в среде // Мат. IV Всерос. с международн. участием конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии». - Москва, 2009. - С. 327-328 (авторских - 0,09 пл.).

16. Михайлова С.Г., Тихомирова И.А., Ослякова А.О., Степанов И.О., Малыгин А.Ю. Сравнительная оценка состояния микроциркуляции в норме и при острых нарушениях мозгового кровообращения // Мат. XV Всеросс. съезда сердечно-сосудистых хирургов // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева

РАМН.-М., 2009.-Т. 10. -№ 6. - С. 168 (авторских- 0,02 пл.).

17. Михайлова С.Г., Тихомирова И.А., Петроченко Е.П., Петроченко А.С. Оценка состояния микроциркуляции и кислородтранспортной функции крови при острых нарушениях мозгового кровообращения и ишемической болезни сердца // Мат. конференции «Чтения Ушинского». - Ярославль. - 2009. -С. 46-51 (авторских - 0,21 пл.).

18. Михайлова С.Г., Тихомирова И.А., Петроченко Е.П., Степанов И.О., Малыгин А.Ю. Микроциркуляция и реологические свойства крови при изменениях сосудистого тонуса // Мат. VII международн. конференции «Геморео-логия и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)». — Ярославль, 2009. - С. 36 (авторских - 0,03 пл.).

19. Петроченко Е.П., Тихомирова И.А., Михайлова С.Г., Петроченко А.С. Влияние фармакологических препаратов на микрореологические свойства эритроцитов в норме и при нарушениях кровообращения // Мат. VII международн. конференции «Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)». - Ярославль, 2009. - С. 63 (авторских - 0,03 пл.).

20. Селезнева О.А., Петроченко Е.П., Михайлова С.Г., Тихомирова И.А. Транспортный потенциал и реологические свойства крови в норме и при нарушения кровообращения // Тезисы докладов VIII Молодежной научной конференции Института физиологии НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике». — Сыктывкар, 2009. — С. 176-179 (авторских - 0,06 пл.).

21. Тихомирова И.А., Муравьев А.В., Петроченко Е.П., Михайлова С.Г. Механизмы регуляции микроциркуляции и реологические свойства крови при нарушениях кровообращения // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - Гродно, 2009. - № 2 (26). - С. 112-113 (авторских -0,15 пл.).

22. Тихомирова И.А., Петроченко Е.П., Петроченко А.С., Лыченко С.В., Михайлова С.Г., Белоусова Е.В., Селезнева О.А. Оценка состояния микроциркуляции пациентов с ишемической болезнью сердца и здоровых лиц методом ЛДФ // Мат. IV Всерос. с международн. участием конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургию»: симпозиум «Регионарная гемодинамика и микроциркуляция». - Москва. — 2009. — С. 184-185 (авторских - 0,08 пл.).

23. Tikhomirova I., Muravyov A., Petrochenko Е., Mikhailova S., Stepanov I., Malygin A. Microcirculation and rheological properties in circulation disorders // Clinical Hemorheology and Microcirculation. - 2009. - Vol. 42. - P. 199 (авторских - 0,03 пл.).

24. Muravyov A., Tikhomirova I., Maimistova A., Bulaeva S., Mikhailova S., Cheporov S. Red blood cell microrheology: molecular change mechanisms // Abstracts of the 9th World Congress for Microcirculation. - Paris, France. - 26-28 September 2010. - P. 44 (авторских - 0,03 пл.).

25. Михайлова С.Г. Лазерная доплеровская флоуметрия в оценке состояния микроциркуляции здоровых лиц и пациентов с нарушениями мозгового кровообращения // Медицинский академический журнал. - 2010. - Т. 10. - № 5.-С. 22.

26. Михайлова С.Г., Ослякова А.О., Степанов И.О., Малыгин А.Ю. Механизмы регуляции микроциркуляции и реологические свойства крови при нарушениях мозгового кровообращения // Сборник мат. III Евразийского конгресса по мед. физике и инженерии «Медицинская физика - 2010». - Москва, 2010. - Т. 1. - С. 297-299 (авторских - 0,09 пл.).

27. Тихомирова И.А., Петроченко Е.П., Михайлова С.Г. Взаимосвязь реологических свойств крови и состояния микроциркуляции при разных функциональных состояниях организма // Тезисы докладов XXI Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. - М. - Калуга, 2010. - С. 606 (авторских - 0,03 пл.).

28. Mikhailova S.G., Tikhomirova I.A., Oslyakova A.O. Microcirculation and blood rheology in patients with cerebrovascular disorders // Abstracts of 16lh Conference of the European Society for Clinical Hemorheology and Microcirculation. -Munich, Germany. -18-21 June 2011. - P. 84 (авторских - 0,04 пл.).

29. Михайлова С.Г. Анализ роли ионизированного кальция в механизмах регуляции функциональных свойств эритроцитов человека // Сб. материалов Всерос. конкурса научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области биологических наук в рамках Всероссийского фестиваля науки: в 2 ч. / Ч. 2 - Ульяновск: УлГУ, 2011. - С. 90-96.

30. Михайлова С.Г. Применение атомно-силовой и конфокальной микроскопии в оценке влияния ионов кальция на функциональные свойства эритроцитов // Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы: Сб. трудов IV Всерос. школы-семинара студентов, аспирантов и молодых ученых по тематическому направлению развития ННС «Нанобиотехнология». - Белгород: ИПК НИУ

«БелГУ», 2011. - С. 52-55.

31. Михайлова С.Г., Тихомирова И.А., Федорова М.З., Сладкова Е.А., Забиняков H.A. Применение атомно-силовой микроскопии в оценке влияния ионизированного кальция на адгезивные свойства красных клеток крови // Мат. межд. науч. конференции «Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиогенеза до центрального кровообращения)». -Ярославль, 2011. - С. 13 (авторских - 0,03 пл.).

32. Тихомирова И.А., Муравьев A.B., Петроченко Е.П., Михайлова С.Г. Микроциркуляция и реология крови при нарушениях кровообращения: монография. -Ярославль: Изд-во «Канцлер», 2011. -103 с. (авторских -1,61 пл.).

33. Михайлова С.Г. Тихомирова И.А. Оценка динамики внутриклеточного свободного кальция при моделировании сдвиговой деформации эритроцитов // Тезисы докладов V Всерос. с международн. участием школы-конференции по физиологии кровообращения. - Москва, 2012. - С. 107-108 (авторских - 0,10 пл.).

Подписано в печать Формат 60x84 1/16. Объем пл. Тираж 100 экз. Заказ № 1Ъ2.

Издательство ЯГПУ им. К.Д. Ушинского 150000, г. Ярославль, ул. Республиканская, 108

Типография ЯГПУ им. К.Д. Ушинского 150000, г. Ярославль, Которосльная наб., 44

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михайлова, Светлана Геннадьевна, Ярославль

61 12-3/922

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреяедение высшего профессионального образования «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского»

На правах рукописи

Михайлова Светлана Геннадьевна

ВКЛАД КЛЕТОЧНЫХ СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ В ОБЕСПЕЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ И ИХ МОДИФИКАЦИЯ ПОД ВЛИЯНИЕМ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ И МЕХАНИЧЕСКОГО

СТРЕССА

Специальность 03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук доцент И.А. Тихомирова

Ярославль - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение......................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы..................................................................................................................10

1.1. Эритроциты человека и их функциональные свойства..................................10

1.2. Реологические свойства крови и микрореологические

свойства эритроцитов......................................................................................................................18

1.3. Влияние механического стресса и ионизированного кальция

на клеточные свойства эритроцитов..................................................................................25

1.4. Система микроциркуляции и кислородное питание тканей......................29

1.5. Состояние микроциркуляции и реологические свойства крови

при нарушениях мозгового кровообращения..........................................................40

Глава 2. Организация, материалы и методы исследования............................48

2.1. Методы оценки клеточных свойств..................................................................................49

2.1.1. Оценка адгезивных свойств эритроцитов методами атомно-силовой микроскопии................................................................................49

2.1.2. Оценка процесса агрегатообразования эритроцитов...............51

2.1.3. Определение деформируемости красных клеток крови................52

2.1.4. Оценка электрофизиологических параметров эритроцитов ... 53

2.2. Методы гемореологических исследований................................................................55

2.2.1. Измерение кажущейся вязкости..........................................................................55

2.2.2. Определение показателя гематокрита............................................................55

2.2.3. Определение эффективности доставки кислорода к тканям ... 56

2.3. Модельные эксперименты........................................................................................................56

2.3.1. Моделирование изменений кальциевого ионного гомеостаза эритроцитов..............................................................................................................................56

2.3.2. Моделирование условий сдвиговой деформации эритроцитов............................................................................................................................57

2.4. Оценка динамики внутриклеточного свободного кальция..........................58

2.5. Оценка in vitro влияния пентоксифиллина

на микрореологические свойства эритроцитов........................... 59

2.6. Регистрация параметров микроциркуляции

и кислородтранспортной функции крови........,......................... 60

2.7. Статистическая обработка результатов.................................... 63

Глава 3. Результаты исследования............................................... 64

3.1. Влияние ионизированного кальция на адгезивные свойства эритроцитов...................................................................... 64

3.2. Влияние ионов кальция на процесс агрегации эритроцитов........... 65

3.3. Роль свободного кальция в регуляции деформационных свойств красных клеток крови.......................................................... 67

3.4. Реологические и электрофизиологические параметры эритроцитов при воздействии ионизированного кальция

и механического стресса....................................................... 68

3.5. Оценка динамики внутриклеточного свободного кальция

при моделировании сдвигового напряжения эритроцитов............. 71

3.6. Реологические и электрофизиологические свойства крови

в норме и при острых нарушениях мозгового кровообращения...... 73

3.7. Эффект in vitro пентоксифиллина на клеточные свойства эритроцитов при острых нарушениях мозгового кровообращения ... 75

3.8. Состояние микроциркуляции в норме и при острых нарушениях мозгового кровообращения................................................... 77

3.9. Корреляция показателей микроциркуляции и реологических характеристик в норме и при острых нарушениях мозгового кровообращения................................................................. 82

Глава 4. Обсуждение результатов................................................. 95

Выводы...................................................................................119

Библиографический список........................................................121

Список сокращений...................................................................143

ВВЕДЕНИЕ

Эритроцит - высокоспециализированная клетка организма, основная роль которой состоит в транспорте кислорода из легких в ткани и углекислого газа в легкие. Выполнение данной функции требует от клетки способности к поддержанию функциональной полноценности гемоглобина в течение всей ее жизни, формы, позволяющей эффективно доставлять кислород в ткани, а также способности к деформации, обеспечивающей передвижение эритроцитов по капиллярам (Зинчук В.В., 2001).

До недавнего времени эритроциты рассматривались как редуцированные клетки, лишенные ядра, митохондрий и других органоидов, критерием зрелости которых считалось достаточное содержание гемоглобина - основного переносчика газов крови (и прежде всего кислорода) (Сторожок С.А. и соавт., 1997), т.е. считались просто «контейнерами» для транспортировки газов, и основное внимание при оценке эффективности транспортной функции красных клеток крови уделялось гемоглобину и его функциональным свойствам.

Однако функциональные свойства как самих эритроцитов, так и крови в целом, во многом определяются еще и мембранными свойствами этих клеток крови. К таким свойствам можно отнести электрофизиологические характеристики мембраны, которые обеспечивают суспензионную стабильность крови, играют важную роль в процессах адсорбции и межклеточных коммуникаций; механические свойства (способность к поддержанию формы, адгезии и деформации при прохождении через узкие капилляры) и комплекс биофизических и биохимических параметров, определяющих объединение эритроцитов в агрегаты (Козинец Г.И. и соавт., 2002; Новицкий В.В. и соавт., 2004; Мигаууоу А., ИкЬогшгоуа I., 2012).

Микроциркуляторный гомеостаз и транспорт кислорода во многом определяется сосудистыми факторами и реологическими свойствами крови:

вязкость крови, микрореологические характеристики эритроцитов (агрегация

4

и деформируемость) существенно влияют на реологический профиль крови и кровоснабжение тканей как в норме, так и при патологии (Мельников A.A., 2004; Викулов А.Д. и соавт., 2006; Петроченко Е.П., 2009).

Одним из ключевых параметров, характеризующих текучесть крови и ее реологию, является способность эритроцитов к деформации, благодаря которой обеспечивается перемещение красных клеток крови в капиллярах диаметром меньше их собственного (Новицкий В.В. и соавт., 2004; Муравьев A.B. и соавт., 2008).

В капиллярах мозга, люминальный диаметр которых меньше, чем в других органах, эритроциты перемещаются в значительно деформированном состоянии, сильно вытянутыми вдоль оси микрососуда (Шошенко К.А., 1982), поэтому способность красных клеток крови к деформации играет важную роль и снижение их деформируемости может быть критичным фактором в развитии ишемических повреждений мозговой ткани. Нейроны мозга чрезвычайно чувствительны к недостатку кислорода, поэтому и другие клеточные свойства эритроцитов могут играть существенную роль в обеспечении мозгового кровообращения.

В условиях кровотока эритроциты находятся под постоянным воздействием внешних сил, и даже при физиологических величинах напряжения сдвига, возникающих в кровеносных сосудах при движении крови, имеет место деформационный стресс (реакция эритроцитов на сдвиговую деформацию) (Сторожок С.А. и соавт., 1997, Oonishi Т. et al., 1997). Феномен деформационного стресса до настоящего времени исследован недостаточно, требуется дальнейшее изучение его влияния на функциональные свойства эритроцитов и эффективность кислородтранспортной функции крови.

Деформация эритроцитов, вызванная механическими воздействиями, ведет к повышению проницаемости мембраны клеток для катионов. Ионизированный кальций выступает одним из основных регуляторов множества физиологических процессов, включая многие виды межклеточных взаимо-

действий и мембранные перестройки (Авдонин П.В., Ткачук В.А., 1994), однако механизмы этого участия остаются недостаточно изученными.

Изучение молекулярных механизмов изменения клеточных свойств эритроцитов и выявление сигнальных путей, принимающих участие в регуляции микрореологических свойств эритроцитов и их транспортного потенциала представляется актуальной задачей физиологии системы крови на современном этапе (Муравьев А.В., Чепоров С.В., 2009).

Структурные и физиологические особенности эритроцита, а также доступность для исследования делают его очень удобной моделью для изучения действия эндогенных и экзогенных факторов, позволяют использовать в качестве информативного тест-объекта для оценки состояния организма при различных патологических процессах.

В исследованиях последних лет экспериментально доказано, что, несмотря на достаточно простую организацию, эритроциты обладают значительным набором сигнальных молекул (Minetti G., Low P.S., 1997; Hines P.S. et al., 2003; Sprague R. et al., 2007). Эти факты свидетельствуют об участии красных клеток крови в регуляторных процессах, направленных на интеграцию функций организма.

Экспериментально показано, что, наряду с центральными механизмами регуляции кровотока, эритроциты играют важную роль в обеспечении локальных потребностей ткани в кислороде. Красные клетки крови способны реагировать на механическую деформацию и кислородное голодание ткани высвобождением естественного вазодилататора — АТФ (Sprague R. et al., 2007; Ellsworth M. et al., 2009).

В условиях нормы такой механизм обеспечивает интенсификацию кровотока и обеспечение кислородом ткани в соответствии с локальными потребностями, при патологии и снижении дилатационного резерва сосудов эффективность такой регуляции может оказаться недостаточной. Поэтому изучение вклада функциональных свойств эритроцитов в гемореологический

статус и состояние микроциркуляции при разных функциональных состояниях организма представляет собой актуальную задачу.

Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования было оценить влияние ионизированного кальция и механического стресса на клеточные свойства эритроцитов и вклад этих свойств в обеспечение эффективности микрокровотока в норме и при нарушениях мозгового кровообращения.

Задачи исследования:

• изучить роль ионизированного кальция в модификации адгезивных, микрореологических и электрофизиологических свойств эритроцитов;

• оценить влияние условий сдвигового течения (механического стресса) на микрореологические и электрофизиологические свойства эритроцитов;

• исследовать вклад клеточных свойств эритроцитов в гемореоло-гический статус в норме и при нарушениях мозгового кровообращения;

• изучить состояние микроциркуляции и механизмов ее регуляции в норме и в условиях ишемии сосудов головного мозга;

• проанализировать значение клеточных свойств эритроцитов в обеспечении кислородного снабжения тканей в норме и при нарушениях мозгового кровообращения.

Научная новизна исследования

Впервые проведена оценка адгезивных характеристик красных клеток крови в присутствии ионов Са2+ методами атомно-силовой микроскопии. Установлена зависимость адгезивных и агрегатных свойств эритроцитов, их мембранного потенциала от концентрации экстрацеллюлярного кальция. Впервые показано, что агрегатные свойства эритроцитов зависят от содержания экстрацеллюлярного кальция, а в условиях деформационного стресса

агрегируемость эритроцитов регулируется с участием потенциалзависимых (дигидропиридинчувствительных) кальциевых каналов. Продемонстрировано, что деформируемость красных клеток крови снижается при увеличении содержания внутриклеточного кальция, как при нарушениях ионного гомео-стаза эритроцитов, так и в условиях воздействия механического стресса.

Впервые выполнена комплексная оценка гемореологического статуса и состояния микроциркуляции при острых нарушениях мозгового кровообращения, выявлены особенности регуляторных влияний на микрокровоток в условиях ишемии сосудов головного мозга. Зафиксированы корреляционные взаимосвязи микрореологических характеристик эритроцитов с активными и пассивными регуляторными влияниями на микрокровоток в условиях нормы и при нарушениях мозгового кровообращения.

Проанализирован вклад клеточных свойств эритроцитов в обеспечение кислородтранспортной функции крови и функционирование системы микроциркуляции.

Теоретическая и практическая значимость работы

В исследовании получены новые данные о влиянии ионизированного кальция на адгезивные, агрегатные, деформационные и электрофизиологические свойства эритроцитов человека. Изучены элементы молекулярных сигнальных путей, связанных с изменениями микрореологических параметров эритроцитов.

В работе установлены основные закономерности регуляции функциональных свойств эритроцитов в условиях модификации содержания внеклеточного и внутриклеточного свободного кальция и под влиянием механического стресса. Материалы диссертационной работы расширяют представления о механизмах регуляции функциональных свойств эритроцитов человека.

Научно-практическая значимость работы заключается в том, что полученные в процессе исследования данные позволяют расширить уже имею-

8

щиеся представления о факторах, влияющих на реализацию кислородтранс-портной функции крови, и механизмах регуляции этой функции в норме и при нарушениях мозгового кровообращения.

Результаты исследования указывают на важную роль показателя гема-токрита и микрореологических свойств эритроцитов в регуляции текучих свойств крови как в норме, так и при патологии. Практическое значение имеют полученные данные, свидетельствующие об особенностях регулятор-ных влияний на микрокровоток при нарушениях мозгового кровообращения. Результаты исследования дополняют знания о механизмах регуляции системы микроциркуляции в норме и при нарушениях мозгового кровообращения.

Полученные данные расширяют и дополняют знания по физиологии системы крови и кровообращения и могут быть использованы в преподавании физиологии, патофизиологии и клеточной молекулярной биологии, а также послужить теоретической основой для разработки методов оптимизации кровотока в норме и в условиях ишемии сосудов головного мозга.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ионизированный кальций участвует в регуляции функциональных свойств эритроцитов человека, оказывая выраженное влияние на микрореологические, адгезивные и электрофизиологические параметры красных клеток крови.

2. Влияние механического стресса на микрореологические и электрофизиологические свойства эритроцитов обусловлено увеличением внутриклеточного пула свободного кальция.

3. В условиях ишемии сосудов головного мозга неблагоприятно измененные клеточные свойства эритроцитов вносят существенный вклад в повышение вязкости крови, снижение эффективности транспорта кислорода в ткани и оказывают влияние на функционирование регуляторных механизмов микрокровотока.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эритроциты человека и их функциональные свойства

Эритроциты являются специализированными клетками, осуществляющими дыхательную функцию крови. В процессе созревания они утрачивают ядро (Велын У., Шторх Ф., 1976). У здорового человека в обычных условиях число циркулирующих эритроцитов составляет 25-30-1012 клеток. При физиологических условиях нормальный эритроцит (нормоцит) имеет форму двояковогнутого диска с утолщением по краям. Средний диаметр нормоцита у взрослого человека равен 7,5 мкм, а толщина 2,2 мкм (Клетки крови й костного мозга / Под ред. Г.И. Козинца, 2004; Новицкий В.В. и соавт., 2004). Созревшие эритроциты циркулируют в крови 100-120 дней, после чего фагоцитируются клетками ретикулоэндотелиальной системы костного мозга (а при патологии - также печени и селезенке) (Физиология человека / Под ред. Р. Шмидта и Г. Тевса).

Двояковогнутая форма эритроцитов и их сравнительно небольшие размеры обеспечивают увеличение площади поверхности клеток, что способствует более быстрой и равномерной диффузии газов через плазмалемму (Новицкий В.В. и соавт., 2004; Новожилов A.B., Катюхин Л.Н., 2008; Муравьев A.B., Чепоров C.B., 2009).

В настоящее время высказано предположение, что двояковогнутая форма дискоцитов во многом способствует ламинарному току крови, благодаря чему в крупных сосудах эритроциты сосредоточены в основном по периферии. Это повышает момент инерции эритроцитов и уменьшает их подверженность ротации в кровотоке, что способствует ламинарному потоку крови, а также сопрово