Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионизирующей радиации на эритроцитарные мембраны и эритропоэз

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионизирующей радиации на эритроцитарные мембраны и эритропоэз"

ТШИССЮИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Ш.Д!£АВАЖШИЛИ

На правах рукописи

ОРШЦАДЗЕ Георгий Леванович

УДК 577.3:612.111.3:612.014.481.1

вшзнкв исшзютсш радиации на эритгсцитаегк

¡.'ЕМЕРАНЫ И 0ЕИТР0ПСЭЗ 03.00.02 - Биофизика

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических пздх

Тбилиси - 1990

работа выполнена в Отделе радиобиологии Института физиологии им. й.С.Бериташвили АК 1'СС?

Научный руководитель - член-корр< АК ГСС?,

заведующим Отделом радиобиологии, профессор К.С.Надарейпвили

Официальные оппоненты - главный научный сотрудник Института биофизики АН СССР, доктор биологических наук, профессор К.Г.Акоев

доктор медицинских наук, профессор З.А.Зурабашвили

Ведущая организация - НИК гематологии и переливания крови и.'.:. Г.ы.Цухацзе ЫЗ ГССР

\ _ Зашта диссертации состоится п О К.Т 9 1990 г. в ¿¿о часов на заседании Специализированного совета^1 Л.057.02.19 при Тбилисском государственном университете км. Ив.Джавахишвили по адресу: 380043, г. Тбилиси, Университетская 2, Биологический Факультет Шг.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тбилисского государственного увиверсиз

¿те та.

Автореферат разослан " Ч " Ое_УП п)|>§.990 г.

Ученый секретарь Специализированного созета доктор биологических наук,

профессор //, Н.Г.КОТШШЗЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования» Биологическим мембранам^ наряду с геномом, принадлежи ведущая роль в формировании и развитии лучевого поражения ввиду их особо ванной роли во всех явлениях кизнедеятель-ности.'в процессах саморегуляции и гомеостаза клетки. Развиваемые в последнее время представления о тесном структурно-функциональном взаимодействии ДНК с мембранными комплексами придают выявлению критических, пусковых процессов лучевых повреждений биологических мембран особый интерес. Разнообразие типов начальных повреждений и структурно-функциональные особенности различных клеток, проявляемые как в явлениях усиления первичных радиационных повреждений, так и в восста-навливаюаих процессах, механизмах репарации, затрудняют идентифшшил.л критических начальных повреждений, причинно связанных с конечным радиобиологическим эффектом (Кудряшов,1987).

С этих позиций, особый интерес представляет изучение механизмов лучевого поражения эритроцитов, выйокоспениализировашшх и одних из наиболее простых по строению и легко доступных клеток организма.

В настоящее время накоплен большой фактический материал относительно влияния ионизирующей радиации на эритроциты: зафиксированы значительные изменения в липидных и белковых компонентах оритроиитар-ных мембран, выявлены дозозависимые сдвиги функции как эритроиитарных мембран, так и клеток в целом. Однако, до сих пор не существует четкого представления о механизмах лучевого поранения эритроцитов, не определены те начальные изменения, которые о большей степенью вероятности приводят к конечному радиобиологическому эффекту - радиационному гемолизу. Имеющийся в настоящее время экспериментальный материал не отражает особенностей лучевого поражения разновозрастных эритропи-тов. Вместе а тем известно, что в течение жизненного пикла эритроциты претерпевают значительные функциональные и физико-химические изменения. В связи о этим выявление особенностей лучевого поражения эритроцитов разных возраотных групп имело бы важное значение не только

-ч -

о точки зрения решения вопроса возрастной радиочувствительности, но и для понимания общих механизмов лучевого поракения эритроцитов. Вероятно, объяснение этого факта надо искать в несовершенстве методик дифференцированного исследования эритроцитов разных возрастных групп. Поиски новых методических подходов в этом направлении оправдана и тем, что их мокно применять доя оиенки изменения динамического равновесия популяиионного состава эритроцитов периферической крови (ЭПК), зависящего от темпов элиминаций повревденных или устаревших клеток, возрастного соотношения в системе депо-циркуляция,а такке характера и темпов поступления в циркуляцию молодых форм эритроцитов за счет эритропоэтической активности. Изучение этого вопроса представляется целесообразным не только о точки зрения экономичности, оперативности и большой доступности для автоматизации самого процесса исследования, но и значения этой информации доя выяснения общебиологических механизмов функционирования и адаптации системы крао-ной крови в целой.

Работа выполнена пр теме научно-иооледовательоких работ Отдела радиобиологии Института физиологии АН ГССР: "Исследование молекулярных, клеточных и организменных механизмов и различных классов модификаторов на животных", номер Тсрегистрапии 01860033346. -

Цель и основные задачи работа. Целью данной работы является установление кинетичеоких характеристик и причинно-следственных отношений процессов, приводящих к радиационному гемолизу эритроцитов, выяснение характерных особенностей этих, процессов в эритроцитах разных возрастных групп, исследование возможности применения различия в отуктурно-функииональных характеристиках разновозрастных эритроцитов для определения популяиионного спектра ЭПК, определение информационной значимости данного параметра для опен'кй функционального состояния системы красной крови и организма в целом в норне и при различных патологических пропесоах, в том числе - лучевой болезни.

-5 -

Задачи исследования состояли в следующем:

1. Разработать методику дифференцированного исследования эритроцитов разных популяций;

2. Идентифицировать механизм реализации конечного радиобиологического эффекта^ набухания и гемолиза эритротгтов;

3. Исследовать зависимость динамики радиационного набухания разновозрастных эритроцитов: а) от дозы облучения; б) от блокирования или стимулирования свобода орадикалышх реакций путем введения в среду . суспендированяя облученных эритроцитов про- и антиоксидантов в разные ороки после облучения; в) от создания гипоксических условий до

и на разных этапах пострадиационного периода и на основании сравнительного анализа этих данных установить характер начальных реакций', индуцируемых ионизирующей радиацией, причинно связанных с конечным радиобиологическим эффектом для эритроцитов разных возрастных групп. Установить последовательность этапов радиационного поражения эритроцитов ;

■ 4. В рамках предложенной методики исследовать динамику популяци-онного состава ЭПК в норне и при различных степенях лучевой патологии?

Основные положения, выносимые на зашггу:

1. Экспериментальные данные, об изменении пространственной организации эритропитарных мембран в качестве основной причины радиационного набухания эритроцитов.

2. Экспериментальные данные об интенсификации реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ)' как запускавдого механизма радиационного поражения эритроцитов, полученных при помощи оригинальной методики дифференцированного исследования популяции ЭПК.

3. Экспериментальные данные о вариантах, имеющих эндогенный и экзогенный генез, динамичеокого равновеоив оиотемы крвоной крови у кроликов в норме г ара лучевых поражениях.

- б - ___ ____

Научная новизна исследования. РазработашИциншшиадьно новая

/Методика дифррёнцированного исследования эритроцитов разных популяций, позволяющая избирательно изучать различные аспекты функционирования как разновозрастных эритроцитов, так и их мембран. Впервые экспериментально доказано, что причиной радиационного набухания и лизиса клеток являются структурные изменения эрктроиитарних мембран, приводящие к нарушению их пространственной организаций У^тайовлён^Г ^со начальНБйа'иешакими, 'причинно связанным!!^ кешечниы радиобиологическим аффектом являются цепные реакции свободнорадикального ПОЛ. При этом установлено, что основным поранакцим фактором при облучешш / являются вторичные продукты ПОЛ. Выявлен один из возможных механиз-

о адио чувств:____ _ ' ^

рзЛ

/ _иор возрастных различий.

I Е^иены ко^бг^пи^^в-Ге Ш1^гсг

С, степетш^гипароомотического^катия^с^ц^опуляиш! эритрошгтдр.^' Теоретическая и практическая пенность тоботы. Изучение механизмов радиационного поракешш на уровне мембранных структур клетки представляет интерес для широкого круга исследователей, работающих в области биофизики мембран и'радиобиолоиль/Результаты и выводы /данного исследования уточняют и значительно дополняют существующее / представление о пусковых механизмах радиационного поранения биологических мембран, создают предпосылки для отработки диагностических п прогностических критериев использования изменений в системе красной крови и в клинической практике. «'-~ ' " ---

.Апробация работы. Материалы*диссертации доложены на У Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси,1937), на 1У Всесоюзной иколе "Современные проблемы радиобиологии" (Пермь, 1988), на ЗУ Республиканской конференции био-медипинского технического общества Грузии (Тбилиси,1989).

Рубликапии. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих частей: введения, обзора литература» экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литература ( 204 ооыдки) . Диссертация изложена на 117 страницах, содержит 19 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Опыта проводились на свежих эритроцитах человека и кролика. Всего в опытах использовано 45 кроликов весом 2,5-3,5 кг. Наблюдения за изменениями ЭПК у контрольных и облученных кроликов проводили в течение 2 месяцев и более.

Кровь, отобранною в количестве 15 мкл из ушной вены кролика или из пальпа человека утром, перед приемом пили, разбавляли в Ю-мл изотонического раствора НаС1 (150 мМ HaOl, .4 мМ трис- HCl, рН=7,2-7,3. "Тени"' эритроцитов получали по методу (Лишо и др. ,1974).

Облучение проводили на установке РУМ-17 при условиях: 220 кВ, 15 мА, фильтр 0,5 мм Си. В опытах in vitro суспензию крови облучали в диапазоне доз 1-350 Гр при мощностях 8,5 Гр/ыин и 19,5 Гр/мин. Доза тотального облучения нррлииов составляла 6 и 8 Гр при мощности дозы - 0,25 Гр/мин,

В зависимости от поставленной цели в эксцериментах применяли следующие растворы: 150 мМ NaCl, 75 мМ KCl + 75 ыМ HaOl, 150 мМ '.КОХ, 150 Uli ИаСХ + I мЫ оуабаин, 150 мМ HaOl + 5 мМ или 10 мМ сахарозы, 150 мМ на-глюконата. Во всех растворах для поддержания рН=7,2-7,3 применяли 4 ыМ трио- НОХ. в качеотве про- и антиокоидан-тов применяли и аокорбиновую кислоту (АК) в концентрациях "

0,05 мМ и 0,1 мМ в иооледуемом объеме соответственно. Гипокоичеокие .уоловия соэдавали путей продувки иооледуемой суспензии инертным га-

зом аргоном. Объем исследуемой суспензии составлял 10 мл, время продувки - 10 мин.

Измерения проводила на автоматизированной установке получения эритрометрических кривых оригинальной разработки, состоящей из электрометрического счетчика "Пикоскель", измерительно-вычислительного комплекса нтл.-Ю24*Бма-666.в и формирователя импульсов (Нада-рейшвкди и др.,1978), применяющегося в качестве связывающего звена между счетчиком частил и анализатором. Установка позволяла получать первичный экспериментальный материал в виде гистограмм распределения эритроцитов по объемам. Тщательному компьютерному анализу подвергнуты более 10 тысяч эритрограмм ЭПК человека и кроликов.

Суть разработанного и использованного в работе метода дифференцированного исследования эритроцитов разных возрастных популяций состоит в определении относительных изменений объемов для эритроцитов разных объемов в разные моменты после определенного внешнего воздействия:

. ДТГ / V « (V' - Т) / V (I)

где V и V* - объем эритроцита до и после внешнего воздействия соответственно. 4

Исходные постулаты, лекашие в основе методик®, экспериментально хорошо проверены и заключаются в следующем: I) распределения эритроцитов по объемам соответствуют распределениям этих клеток по возрасту, ыакропиты относятся к молодым формам клеток, которые в лропесое старения переходят в норыо- и ыикроииты; 2) эритроциты одинаковых • объемов (возраста) и их мембраны имеют одинаковые функциональные характеристики и физико-хиыцческие свойства^

• Исходя из.этих постулатов, принимая, что ан - количество эритроцитов в интервале объемов V , ? + йт , которые после внешнего воздействия принимают значения в интервале т' , т' + «IV мокно записать:

-9 "

<и . и-$(у)<1у - н-Ш'НУ*

где N - общее число исследуемых эритроцитов, 5(7) и ¥ (V')- плотности вероятности обнаружения эритроцитов с объемами соответственно V и V1 , определяемые из распределения эритроцитов по объемам, полученным экспериментальным путем; Отсюда получаем дифференциальное уравнение:

решение которого у' - V (V) устанавливает взаимооднозначное соответствие между объемами эритроцитов до и после внешнего воздействия. Подставкой решения уравнения (2) в выражение (I) получаем искомые значения ДУ/У для эритроцитов разных объемов (возраста). Подбирая внешние воздействия (изменение рН, концентрации внеклеточных анионов и катионов, действие^ультрафиолетового и ионизирующего излучений и т.д.) и по значениям Ду/у в разные моменты после внешнего воздействия определяя кинетику изменения объемов эритроцитов разных объемов, получаем возмокность исследовать отдельные аспекты функционирования эритроцитов разных возрастных групп.

На Рис.1 представлены данные в виде кривых время-эффект для различных доз облучения отдельно для макро- (Рис.1а) и микроцитов (Рис.1в), полученные описанным выше методом. Кривые достоверно показывают, что в облученных эритроцитах после латентного периода наступает фаза сравнительно резкого увеличения объема, после чего наступает фаза медленного набухания, которая заканчивается гемолизом. Следует отметить, что характер кинетики набухания у эритроцитов человека и кролика не отличаются. Различными являются только дозы, приводящие к одинаковому радиобиологическому эффекту. Гемолитические объема с увеличением возраста эритроцитов уменьшаются, у кроликов они равняются 135, 130 и 125% исходного объема для макро-, вормо- и микро-

(2)

Результаты и их обсуждение

иитов соответственно. Наблюдается четкая зависимость от дозы облучения как величины латентного периода, так и скорости набухания эритро-питов. При этом, по данным критериям степень радиационного поражения в молодых эритроцитах вше, чем в старых, т.е. старые эритроциты более радиорезистентны, чем молодые. Этот результат противоречит данным, полученным методом кислотных вритрограмм. Причину этого проти-■ ¿V

J&fi.-fc Динамика набухания

макропитов (а) и мик-рошаов (в), облученных в дозах: I) 300 Ifc; 2) 250 Гр; 3) Г70 £р; 4) 130 £р; 5) контроль. По оси абсцисс - время (часы); по оси ординат -относительные изменения объемов (52).

воречия, вероятно, следует искать*в различии механизмов кислотного и радиационного гемолизов.

О причинах радиационного рабухания эритроцитов В настоящее время не существует единого мнения относительно причины радиационного набухания эритроцитов» До недавнего времени в качестве основной причины набухания однозначно принималось нарушение

водно-осыотического баланса между клетками и средой. Однако, в пост леднее время ряд авторов ( саг^аГога вt а1 .,1987 и др.) отводит ведущую роль в набухании и лизисе клеток структурным изменениям мембран облученных эритроцитов. Принимается, что нарушение водно-осмотического баланса вызвано поражением транспортной функшш эритропитар-ных мембран, в частности, подавлением активного транспорта и увеличением проницаемости одновалентных катионов На* и к+ , обусловливающих выравнивание электрохимических градиентов и, как следствие, появление некомпенсируемого осмотического давления, развиваемого не-диффундируюшда анионом гемоглобином. В результате этого возрастает поток вода, набухание и лизис клеток. С целью проверки этой гипотезы били проведена опыта, в которых наблюдали за динамикой набухания облученных эритроцитов при внесении в ореду суспендирования 5-10 мМ

I

оахароза. Предполагалось, что внесение недиффундирувдего вещества должно компенсировать развиваемое нъ осмотическое давление и предотвращать набухание. Достоверных изменений в кинетике набухания не зарегистрировано. Этот результат свидетельствует о том, что радиационное набухание происходит не вследствие нарушения осмотического баланса, в противном олучае необходимо допуотить, что мембрана облу-ченнах эритроцитов уже не яйляются барьером для сахарозы.

С целью окончательного выяонения данного вопроса были проведена опыта, в которых наблодали за кинетикой набухания облученных эритроцитов при их суспендированли в средах, где при сохранении оомотич-нооти варьировали концентрациями Я а* и Х+ . Ивменениякинетикк набухания в этих опытах не обнаружена. Установлено, что введение в ореду суопендированкя облученных эритроцитов 0,5-1 м!1 оуабанна не влияет на динамику радиационного набухания эритроцитов. Для определения возможного вклада индуцируемых ионизирующей радиацией структурных изменения в эритроцитарнах мембранах в радиационном набухащи эритроцитов были проведена исследования на эритропитарных "терях", внутри и

вне которых создавали идентичный электролитный состав. Зафиксировано набухание как нативных эритроцитов, так и эритропитарных "теней" (Рис.2), при этом при одинаковой дозе облучения скорость набухания "теней" выше, чем нативных клеток, вероятной причиной чего мокет быть повревдение мембран при получении "теней".

На основании приведенных экспериментальных данных мокно закль-чить, что причиной радиационного набухания эритроцитов является нарушение пространственной организации мембран вследствие структурных изменений, индуцируемых ионизирующей радиацией.

О возможных запускающих механизмах радиационного поражения эритроцитов

В настоящее время не существует единого мнения о запускающих процессах радиационного поракеняя биологических мембран. Наиболее распространенным и экспериментально обоснованным, является предположение о ведущей роли индуцируемого ионизирующей радиацией усиления процессов перекисного окисления липидов (Тарусов,1969). Однако, ряд

исследователей ( Bdnarde et al., 1984; Фоменко и др.,1989) опираясь на данные об относительной радиочувствительности липидной и белковой фаз, считают белковую фазу более радиочувствительной, чем липидную. Насколько существенен вклад этих изменений.в формировании конечного радиобиологического эффекта, на основании имеющихся в настоящее время экспериментальных данных не представляется возможным.

Между тем, считается общепризнанной ведущая роль свободаоради-кальных состояний в радиопоражении клеток, облученных в условиях, близких к физиологическим. В модельных опытах на отдельных молекулярных компонентах плазматических мембран показано, что кинетика овобод-норадикальних реакций и их модификация различными физико-химически^ факторами имеют свою специфическую особенность в белковой и липидаъи фазах. Исходя из этог;о, исследуя влияние различных модификаторов свободнорадикальных процессов на конечный радиобиологический эффект (набухание и лизис эритроцитов), можно, с одной стороны, идентифицировать' субстрат свободнорадикальных реакций, причинно связанных о конечным радиобиологическим эффек?ом, а с другой- - проследить пути развития радиационного поражения эритроиитарных мембран.

Кривые, представленные на Рис.3 отражают функциональную зависимость скорости набухания, определенной по линейному участку кривых набухания в фазе быстрого набухания макро- и микроцитов, и момента пострадиационного внесения в среду суспендирования ОД мМ аскорбиновой нислоты (АК) при разных дозах облучения. Кривые наглядно показывают, что внесете АК в пострадиационный период значительно замедляет скорость набухания, при этом максимальный эффект наблюдается при внесении АК сразу после облучения. С увеличением интервала времени между облучением и внесением антиоксиданта скорость увеличения объема возрастает и, начиная о определенного момента еще до начала набухания, .выходит на плато, принимая значение4 равное, скорости набухания без внесения АК'. Извеотно, что не само образование овободнорадикального

состояния, а его реализация является единичным актом запускающих процессов, приводящих к конечному радиобиологическому эффекту. Следовательно, радиозащитный эффект АК в пострадиационный период ограка' ет блокирование процессов реализации свободнорадикальных состояний

Рио.З. Зависимость скорости набухания макроцитов (а) и микропитов (ь) от момента внесения в среду суспендирован® 0,1 мМ аскорбиновой кислота, облучошта в дозах 350 Гр (I), 330 Гр (2) и 320 Гр (3) {мощность дозы - 19,5 Гр/мин). Стрелками указаны моменты начала набухания. Кровь кролика. По оси абопиоо— время (мин); по оси ординат - скорость набухания (проиент/мин).

ного эффекта о увеличением интервала времени между облучением и введением АК отражает увеличение вероятности реализации свободнорадикальных состояний с течением времени в пострадиационный период. Следовательно, можно утверждать, что кривые, представленные на Рис.3, отражают, динамику накопления первичных продуктов свободнорадикальных состояний в пострадиационный период. Скорость набухания при введении АК сразу пооле облучения фактически в 2,5-3 раза меньше, чем скорость набухания без введения антиоксиданта, следовательно, доля процессов, протекающих в пострадиационный период и блокируемых АК составляет приблизительно 3/4 от всех начальных реакций, причинно связанных о конечным радиобиологическим эффектом. Наклон кдавых на Рио.З в точке Т=0 показывает,.что эти процеооы, т.е. реализация свободнорадикальных состояний, происходят и во время облучения. Исходя из этого, в хорошем приближении можно утверждать, что фактически все свободаора-дшшльные соотояния, индуцируемые ионизирующей радиацией, причинно овязанные с конечным радиобиологическим эффектом, реализация которых, в основном, происходит в пострадиационный период, инактивируются АК.

Исследования влияния гипоксии в пострадиационный период на динамику набухания эритроцитов выявили, что ооэдание пшоксичеояих условий сразу пооле облучения значительно уменьшает скорость набухания, при этом радиозащитный эффект при создании гипоксйческих условий и введение АК сразу пооло облучения - величины одного порядка, что указывает на то, что реализация овободнорадикальных состояний соответствует реакции окисления. Создание пшоксичеоких условий через 15-20 минут после облучения никаких изменений в динамике радиационного набухания не вызывает.

Свободнорадикальные ооотояния в пострадиационный период М017Т поддерживаться как протеканием цепных свободнорадикальных реакций, окисления, субстратом которых являются мембранные липида, так и дол-гоживущими свободнорадикальными состояниями, индуцируемыми ионизи-

- 1й -

руюцей радиацией в белковых макромолекулах. Однако, представляется маловероятным, что долгокивуше свободаорадикальные состояния, представляющие лиаь часть свободнорадикалышх состояний, индуцируемых ионизирующей радиацией в молекулах белков, вносят основной вклад в конечный радиобиологический эффект. Об этом свидетельствует и гот факт, что пострадиационные реакции на начальном этапе являются в основном реакциями окисления, то характерно для цепных реакций ПОЛ, тогда как долгоживущие свободаорадикальные состояния могут реализоваться и другим путем.

С другой стороны, допуская, на основании литературных данных, что поражение осуществляется через долгокивущие свободнорадикальные состояния, следовало бы опадать появление деструктивных явлений, т.е. набухания, уке на стадии реализации свободнорадакальных состояний, что противоречит полученным нами данным. Убедительный аргументом в пользу этого, что начальными запускающими реакциями радиационного поражения являются цепные реакции ПОЛ, являются результаты исследовании влияния ионов двухвалентного аелеза на динамику набухания эритроцитов.

Представленные на Рис.4 кривые показывают изменение динамики радиационного набухания эритроцитов при введении ^о^ в разных концентрациях и в разные моменты пострадиационного периода.' Введение 0,05 мМ Уеэо^ в ореду суспендарования сразу после облучения вызывает значительное укорочение латентного периода (Рис.4, кривая 2), Югда как введение 0,15 мМ УеБО^ , напротив, увеличивает латентный период (Рис.4, кривая 4). Введение 0,05 ыМ уево4 через 20-25 минут после облучения, т.е. тогда, когда свободнорадшшльные реакции уке прекращены, фактически сразу приводит к набуханию (Рис.4, кривая 3). Инкубация необлученных эритроцитов в среде 0,05 мМ лво^ в течение воего периода наблюдения к изменению объема не приводит. Эти резуль-

таты можно объяснить только в рамках цепных свободнорадикальных реакций ПОЛ.

20 40 60 80 100 120 Т :

■ Рис.4. Динамика набухания эритроцитов (нормошггов), облученных в дозе 330 Гр (I), при введении в среду суспендирования облученных эритроцитов 0,05 мМ л>бо4 сразу после облучения (2) и через 25 минут после облучения (3), при введении 0,15 мМ РеЕОф сразу после облучения (4). Мощность дозы - 19,5 Гр/мкн. Стрелкой указан момент введения Уе30ф . Кровь кролика.

На основании приведенных вышее данных можно считать доказанным, что начальными реакциями, причинно связанными о конечным радиобиологическим эффектом, являются индуцируемые ионизирующей радиацией цепные реакции ПОЛ. Эти реакции в пострадиационный период при комнатной температуре постепенно затухают, при этом скорость затухания в старых эритроцитах выше, чем в молодых. В свою очередь, скорсоть затухания определяется соотнопзнием вероятностей инициации цепей под действием ионизирующей радиации и го2* , присутствующего в гемоглобине, и обрывом цепей на эндогенных антноксидантах или в мекрадикаль-Них взаимодействиях. Следовательно, причиной высокой радиорезистентности старых эрктрояитой могут быть, с одной стороны, изменение концентрации у«2

в процессе старения из-за перехода гемоглобина в

метгемоглобин, а о другой - возрастные изменения концентрации мембранных SH -групп и мембранных ненасыщенных жирных кислот. Окончательное решение вопроса трббует дальнейших исследований.

В заключение, ооноваваясь на литературные и полученные лами данные можно предположить одедушую гипотетическую охему радиационного поражения эритроцитов: под воздействием ионизирующей радиации происходит интенсификация ПОЛ, накопление вторичных продуктов пере-кионого окисления липидов, приводащйз с одной стороны, к изменению опонтанной кривизны мембранного биолоя, а о другой - к полимеризации и агрегации белков иитоскелета, обеспечивающих их устойчивость..

Доследование популяццонного состава эритроцитов периферической крови кролика в норде и при радиационном облучении

Разработанную нами методику дифференцированного исследования разновозраотиых эритроцитов применили ддя оценки динамики по пуля иконного состава дШ.{ь качестве теста на принадлежность эритроцитов х определенной возраотной популяции использовали различие в степени ^ пшеросмотичеокого сжатия эритроцитов рааных возрастных групп (¿¡^

На Рис.5 предотавлены распределения абсолютного значения относительных изменений объемов для эритроцитов разных объемов при их оуопендировании в гипертонической ореде. |T(V)I=I4V/Vl, которые соответствуют распределениям по степени пшеросмотичеокого ожатия эритроцитов равных объемов в разные дни наблюдения у исследуемого кролика^ Характер функциональной зависимости отражает неоднородность попу ля ци-онного состава ЭПК, однако /значительные вариации области изменения функции распределения невозможно объяснить только вариациями попудяци-онного соотава ЭШС. Необходимо ввести хотя бы еще один фактор, влияющий на степень гипероомотическоро ожатия ЭПк/относительная инвахяант-ность характера функции распределения указывает на то, что неизвестный фактор влияет на вою популяцию ЭПК одинаково. Исхода из этого, вычисляя ореднее для всей популяция значение отепени ишероомотического ожатия

/мим Умакс V [мкм^

Рио.5. Распределения эритроцитов разных объемов по степени ги-перосмотичеокого сжатия при их оуспендировании в гипертонической среде в первый день наблвдения (I), через 7 (2) и 14 (3) дней о момента начала наблвдения.

в каждый момент времени: ?

^ тая

|?| п ( V )|( Ду/7 )|ау

Уш±п

где п(т> плотность вероятности обнаружения у эритроцита объема и вычленяя его из общего распределени А (V) = (|Т( У)|-|Т|) получим возможность раздельно определять закономерности изменения кай фактора» действующего на всю популяцию эритроцитов, так и популяционный оостав ЭПК,

На Рис.6 представлена динамика изменения значений^ Наблюдается четко выраженная цикличность в изменении значения)Т| с периодом около 25 дней. Характерной особенностью этих колебаний является постоянство периода и амплитуда. Вместе с этим, необходимо отметить, что фазы колебания у всех подопытных животных совпадают. На основании этих данных можно предпрложить, что они относятся к инфрадианным колебаниям экзогенного происхождения. Относительно природы зафиксированных

колебаний на основании имеющегося экспериментального материала трудно судить, однако, достаточно высокая синхронность мевд колебаниями I Т]и среднего объема ЭПК позволяет в качестве вероятной причини предположить колебания осчощгашшх. свойств плазмы крови._

ляшш эритроцитов значения степени пшеросмотического сжатия для двух исследуемых кроликов.

Анализ функции распределения А( V) у исследуемых кроликов выявил наличие существенных различий в системе красной крови у отдельных индивидов одного и того же вида, вызванных как вариациями гемопоэтичес-кой функции, так и вариациями темпов элиминации старых эритроцитов из кровяного русла.

В рамках вышеизложенного подхода, с целью его апробации, были проведены исследования красной крови у кроликов, облученных в летальных и сублетальных дозах. Сразу после облучения изменений не зафиксировано, однако, уже через 60-90 минут после облучения наблюдаются • существенные, малозависящие от доза облучения изменения в. поведении Функции распределения степени гиперосмотического сжатия у всех исследуемых кроликов. Можно предположить, что они отражают увеличение ги-пертоничнооти плазмы крови, а также изменения популяпионного оостава

ЭПК за счет поступления в кровяное русло депонированных эритроцитов. Последнее подтверждается и тем, что параллельно наблюдается увеличение количества циркулирующих эритроцитов на единицу объема крови. Необходимо отметить, что эти изменения исчезают у всех исследуемых животных через 10-12 часов после облучения.

Представленные на Рис.7 семейства кривых иллюстрируют изменения параметра А(V ) со второго по 17 день после облучения в дозе 8.0 Как видно из этого рисунка, начиная уже со второго йвя, наблюдаются

Уммн

A(v) Ю 5

-5-10

Умгкс у До облучения

Умкн

Умии

-5' -Я-

Mvb

ids'

Умакс V

Срезу посла облучения

Умакс у

I- й день после облучения

А(»)

Ю

Умим 5 __^

Умакс у

-5-

6-й день после

-Ю облучения

A(v)

JO-

S' Умин

-5 Умахс у

9-й день после 1

облучения I

. A(v>

Ю / '

Умим

функпий ) на различных этапах после облучения кроликов в дозе 8 Гр.

Умакс у

12-й день после облучения

A(v)

Vmhk

-5 -JO

Умакс v 3-й день после облучения

Умакс V 17-Я день после ! облучения |

значительна изменения функции А( V), которые в области макро- и мик-ропнтов имеют противоположную направленность. Эти изменения достигают максимального значения на 5-6 и исчезают на 10-12 день после облучения. При сублетальной дозе 6.0 Гр (Рис.8) максимальные изменения фиксируют-

ся на 2-4, а признаки реконвалисиеншш - на 5-6 день. Вместе о этим амплитуда изменения функтш А(У ) при облучении в дозе 6.0 £р значительно меньше, чем при 8.0 Гр. Отсвда следует, что данные изменения носят выраженный дозозависиный характер. Уменьшение значения А( V ) в области ыакропитов с достоверностью можно идентифицировать как исчезновение из кровяного русла молодых форм эритроцитов за счет подав-

сроки после облучения.

-5' Умаис V

До облучения

А(у)

Ю- у

5- УМИН / (

Умакс V

•5-Ю Сразу после облучения

А(у)

Ю у

Умии —

-5 Умаис V

-Ю 1- и день после облучения

-5- Умаис У

3-й день после

-ю- облучения

А(у)| Ю-

5 Умин

I Умаис у

-5" ¿■Я дан» после

■ю- облучения

А(у)

ю- /

Умин ^

Умам у

•5 Ю-й день после

•Ю облучения

,Рис.8. Динамика изменений функции А(У ) на различных этапах после общего облучения кроликов в дозе 6.0 Гр.

Характер изменений функции А(у) в области микрошггов трудно идентифицировать как популяшганные изменения. Вероятнее воего, оно отражает процесо паражения отарых эритроцитов, приводящее к их ускоренной элиминации, что наряду о подавлением эритропоэтической функции может бить оововнай причиной- развивающейся в определенные сроки цоотлучевого периода анемии. Приведенные выше экспериментальные результата не противоречат современным представлениям о пропеооах, индуцируемых ионизирующей радиацией в оистеме красное крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведены доследования для выяснения механизма радиационного поражения эритроцитов и выявления особенностей радиационного поражения эритроцитов разных возрастных групп. С этой иельв разработана методика дпфференпироваиного исследования эритроцитов разных возрастных групп. На первом этапе исследования проводились опыты с целью идентификации радиационного набухания эритроцитов. Были рассмотрены различные вероятные механизмы в качестве воз.чокных причин радиационного набухания. В проведенных опытах путем исключения установлено, что причиной радиационного набухания яатшется нарушение пространственной организации эритроиитарных мембран. На второй этапе исследовании экспериментально доказано, что начальными реакциями, причинно связанными с конечным радиобиологическим эффектом являются индуцированные ионизирующей радиацией реакшш ПОЛ. Установлено, что скорость затухания этих реакций в микроиитах выке, чем в макропитах, что является одной из причин сравнительно высокой радиорезистентности старых эритроцитов по сравнению с молодыми. Экспериментально установлено, что развитие деструктивных явлений связано с накоплением вторичных продуктов ПОЛ. Разработанную методику применили для исследования динамики популяпионного состава ЭПК кроликов.'В качестве теста на при-надлеяпость эрлтротггов к определенной возрастной популяции использовали различие в степени гиперосчотического сяагия эритроцитов разных возрастных групп. Выявлены колебания среднего для всей популяции эритроцитов значения гиперосмотического скатия экзогенного происхождения с периодом около 25 дней. Предполагается, что оно связано с колебаниями осмотических свойств плазмы крови.

В рамках предложенного подхода, с целью его апробации были исследована изменения функционального состояния системы красной крови у кроликов, облученных в летальных и сублетальных дозах. Полученные

данные не противоречат современным представлениям о процессах, индуцированных радиацией в системе красной крови. Следовательно, предложенная методика позволяет адекватно описывать изменения соотояния динамического равновесия системы красной крови и монет быть использована в качестве диагностического и прогностического критерия, а также ддя оценки эффективности проводимых лечебных мероприятий при лучевых поражениях, и, возможно, других патологических процессах. Однако, патологическая специфичность выявленных сдвигов требует дальнейшего изучения.

• основные вывода

1. Разработана, реализована и апробирована в эксперименте оригинальная методика дифференцированного исследования эритроцитов разных популяоионных групп.

2. Доказано, что причиной радиационного набухания облученных эрит-ропитов являются структурные изменения иитоплазматической мембраны, приводящие к нарушению ее пространственной организации.

3. Установлено, что старые эритроциты, по сравнению с молодыми, являются более радиорезистентными.

4. Установлено, что начальными реакциями, причинно связанными с конечным радиобиологическим эффектом, являются индуцированные радиа- / пией непные, овободнорадикальные реакции ПОЛ, и что основными поражающими факторами являются вторичные продукты ПОЛ. Показано, что при комнатной температуре процессы перекисного окисления в пострадиапион-.; > ный период в зависимости от дозы облучения постепенно затухают в течение 15-20 минут. Установлено, что атепень затухания реакций ли-попероксидашш в молодых эритроцитах Солее низкая,'чем в старых,

что может служить одной из причин высокой радиорезистентности старых эритроцитов по сравнению о молодыми.

5. Подтверждено обнаруженное ранее различие в степени гипероомо-

тичесного сжатия в эритроцитах разных популяций. Данное различие применено в качестве теста для определения популяционного спектра Э1Ь кролика. Выявлено, что распределение эритроцитов по степени гиперос-ыотического скатил зависит как от популяционного состава эритроцитов, так и от физико-химических свойств плазмы крови.

6. Зафиксированы колебания экзогенного происхождения с периодом в 25. дней степени пшеросыотического сжатии всей популяции ЭДК.

7. Установлено, что картина радиационного поражения системы красной крови при разных дозах облучения, получаемая в координатах исследуемого в предложенной методике параметра распределения эритроцитов по гиперосмотическому сжатию, совпадает о современными представлениями об изменениях, происходящих в системе красной крови в разные сроки пострадиационного периода. Вместе с этим выявлены не известные до настоящего времени одвиги в системе красной крови в разные орет] ки пострадиационного периода, в частности:

а) в первые часы после облучения зафиксировано увеличение степени гиперосмотического сжатия макропитов, отражающее изменение популяционного состава ЭПК, вследствие поступления в кровяное русло менее плотных эритроцитов. Эти изменения иочезают через 10-12 часов после облучения;

б) начиная со второго дня после облучения выявлено дозозависимое увеличение степени гиперосмотического сжатия михроцитов. Этот эффект на данном этапе исследования не поддается однозначной интерпретации.

Список публикаций по теме диссертации.

I. 01ыоцадзе Г.Л. Метод вычисления истинного распределения эритроцитов по объемам из распределения по сопротивлениям, полученного эритро-• метрическим путем//Вопросы биологичеокой и медицинской техники. -Т. 71. - 1984.

2. Орыоиадзе Г.Л., Гвасалия Д.Г. Метод дифференцированного исследования эритроцитов разных объемов//Вопрооы биологической и медицинской техники. - Т. УП. - 1985.

3. Орыоцадзе Г.Л., Гвасалия Д.Г. Влияние рН на динамику набуха1шя эритроцитов разных объемов/// Мекуниверситетская конференция "Бшлогая клетки".:Тезисы. - Тбшшои, 1987.

4. Орыоиадзе Г.Л. .Математическая модель процессов, поддерживающих кислотно-ооновной баланс в эритроцитах и обеспечивающих транспорт СО^/Вопрооы биологачеокой и медицинской техники. - Серия биологи. ческал, Приложение, 1988.

5. Ормиадзе Г.Д. Влияние ионизирующей радиации на эритроциты разных объемов//Ьастшш АН ГССР. - Т. 135, - й I. - 1989.

6. Орыоцадзе Г.Л. О механизмах радиационного поражения эритроцитов //Радиационные исследования. - Т. 5. - 1989.

7. Орыоцадзе Г.Л., Надарейшвиди К.Ш., Гвасалия Д.Г. Популяционнып анализ эритроцитов периферической крови кроликов/ЛЗопросы биологачеокой и медицинской техники. - Т. И. - 1989.

8. Орноцадзе Г.Л., Надарейившш К.Ш., Гваоалия Д.Г. Влияние ионизи- -рующей радиации на популяцию эритроцитов периферической крови кродика//Извеотия АН ГССР. - Серия биологичеокая. - Т. 16. -

. » I. - 1990.

9. Орыоцадзе Г.Л., Иадарейшвазш К.Ш. 0 механизмах радиационного поражения 8ратрошгаов//Сообщения АН ГССР. - Т. 138. - й I. - 1990.

и.