Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробластических островков

Шевяков, Сергей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробластических островков
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробластических островков"

На правах рукописи

/¡дМ^/

Шевяков Сергей Александрович

Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробластических островков

03 00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Курган-2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Южно-уральском научном центре Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Захаров Юрий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Каюмова Алия Фаритовна доктор медицинских наук Ерохин Александр Николаевич

Ведущее учреждение:

Кировская государственная медицинская академия (610000, г.Киров, ул. Карла Маркса, 88).

Защита диссертации состоится июня 2005 года на заседании дис-

сертационного совета Д.208.079.01. в Федеральном государственном учреждении науки Российском научном центре «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г. А Илизарова по адресу: 640014, г.Курган, ул. М. Ульяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А Илизарова (640014, г.Курган, ул. М. Ульяновой, 6).

Автореферат разослан^?» мая 2005 года.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

'[) / А.Н. Дьячков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Дифференциация и созревание эритроидных клеток в костном мозге млекопитающих и человека протекают в эритробластических островках, представляющих собой ассоциацию клеток двух различных линий - макрофагальной и эритроидной.

Установлено, что в культуре эритробластических островков, стимулированных внесением в неё эритропоэтина, резко активируются процессы пролиферации и созревания эритроидной «короны» островков с отделением от неё в кулыуральную среду ретикулоцитов (Zakharov Y, Prenant М., 1982, 1983). Однако, остаётся невыясненным, как может влиять увеличение числа образующихся в культуре эритроцитов на эритропоэз в эритробластических островках.

Между тем показано, что в регуляции эритропоэза участвует и авто-регуляторный механизм, в котором созревающие и зрелые клетки эритро-идного ряда выполняют функцию отрицательной обратной связи, тормозя новообразование эритроцитов эритроидными клетками-предшественницами (Захаров Ю. М., 1970).

В опытах in vivo установлено, что продукты распада или метаболизма эритроцитов разной степени зрелости оказывают различные эффекты на эритропоэз: продукты распада нормальных эритроцитов стимулируют эритропоэз, а ретикулоцитов - его тормозят (Новиков Н.М., 1966; Ужанс-кийЯ.Г, 1968).

Исследований, подобных указанным выше, на культурах эритробла-стических островков, являющихся основными морфофункциональными единицами эритропоэза, в которых в эритроидную дифференциацию вовлекаются КОЕэ, осуществляются процессы размножения эритробластов и их созревание (Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., 1984; Захаров Ю. М., Рассохин А. Г., 2002), не проводилось.Культивирование эритробласти-ческих островков в отличие от экспериментов, выполняющихся in vivo, позволяет выявить дозозависимые эффекты вносимых в культуру эритроцитов на функции центральных макрофагов и развитие эритроидной «короны», а также предоставляет возможность для изучения сочетанного влияния гуморальных факторов и клеточно-клеточных взаимодействий на эритропоэз в эритробластических островках.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилось изучение возможного влияния

эритроцитов разной степени зрелости (ретикулоцитов, эритроцитов ин-тактных и полицитемичных крыс) на характер пролиферации и созревания эритроидных клеток «короны» эритробластических островков в культуре.

Задачи исследования

1. По воспроизводству ретикулоцитов в культуре эритробластических островков и функциональному состоянию центральных макрофагов эритробластических островков выбрать дозу эритропоэтина, поддерживающую близкий к физиологическому эритропоэз в культуре эритроблас-тических островков.

2. Изучить влияние эритроцитов разной степени зрелости на качественный и количественный состав культур эритробластических островков.

3. Изучить влияние эритроцитов разной степени зрелости на проли-феративную активность клеток «короны» эритробластических островков в культуре.

Научная новизна исследования

Впервые проведённое нами исследование клеточного состава культивационной среды культур эритробластических островков с использованием системы "CELLPRINT ®", позволило изучить продукцию зрелых эритроидных клеток культурой островков.

Установлено, что культура эритробластических островков является системой, в которой осуществляется эффективный эритропоэз с воспроизводством ретикулоцитов в объёме, зависящем от внесённой в культуру дозы эритропоэтина и длительности культивирования.

По воспроизводству ретикулоцитов в культуре ЭО и функциональному состоянию центральных макрофагов эритробластических островков установлено, что доза эритропоэтина в 0,5МЕ/мл, является необходимой и достаточной для поддержания эритропоэза, близкого к физиологическому, в культуре ЭО.

Используя оригинальную модель сокультивирования эритробласти-ческих островков и эритроцитов in vitro, нам впервые удалось выявить прямые эффекты эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в ЭО. Так, нами установлено, что компонентом регуляции эритропоэза в культивируемых ЭО является механизм авторегуляции на основе положительной и отрицательной обратных связей, реализующихся в зависимости от количества добавленных в культуру эритроцитов, степени их

зрелости и длительности сокультивирования.

В результате проведённых исследований выявлено, что непродолжительная сокультивация ЭО с малыми дозами эритроцитов интактных крыс и ретикулоцитов стимулирует эритропоэз, активизируя процессы реконструкции ЭО. Длительная сокультивация ЭО с возрастающими дозами эритроцитов интактных и анемизированных крыс характеризуется дозозависимым торможением эритропоэза в ЭО.

Кроме того, наши эксперименты показали, что эритроциты полици-темичных крыс уже в малых дозах ингибируют эритропоэз в ЭО. Добавление этих эритроцитов к культурам эритробластических островков уже на 24-й час вызывает усугубляющееся к 72-му часу опыта торможение как реконструкции эритропоэза в инволюцирующих островках, так и формирования островков de novo.

Обнаружено, что сокультивирование небольшого количества как молодых, так и зрелых эритроцитов с эритробластическими островками костного мозга на протяжении суток, увеличивает число находящихся в митозе эритроидных клеток «короны» эритробластических островков и уменьшает продолжительность их клеточного цикла. Более длительное, до 48 часов, сокультивирование островков с таким же количеством молодых эритроцитов или же большим их числом ингибирует эритропоэз, что

проявляется в уменьшении количества делящихся эритробластов «коро-

ны» островков и увеличении продолжительности их клеточного цикла. Наиболее выраженное торможение митотической активности эритробластов вызывает добавление в культуру эритроцитов, полученных у поли-цитемичных крыс.

Научно-практическая ценность работы и внедрение полученных результатов

Результаты работы найдут применение в экспериментальной гематологии, физиологии и патофизиологии, а также в программах подготовки специалистов медико-биологического профиля.

Полученные результаты внедрены в Проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики ЮУНЦ РАМН, в НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Положения, выносимые на защиту

1. Культура эритробластических островков костного мозга крыс обеспечивает эффективный эритропоэз в эритробластических островках, за-

канчивающийся воспроизводством ретикулоцитов в количестве, зависящем от внесённого в культуру эритропоэтина и длительности культивирования.

2. Компонентом регуляции эритропоэза в культивируемых эритроб-ластических островках является его авторегуляция на основе управления с использованием механизма положительной и отрицательной обратных связей, реализуемых в зависимости от количества, степени зрелости эритроцитов и длительности их сокультивирования с эритробластическими островками.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инжиниринг в медицине» (Челябинск, 2002), научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (Трёхгорный, 2003), III конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), международном научном симпозиуме «Югра-Гемо» (Ханты-Мансийск, 2004), международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), научной сессии «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (Челябинск, 2004), III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляцион-ная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004), межрегиональной научно - практической конференции «Актуальные вопросы патологии» (Уфа, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, пяти глав результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 183 источника (отечественных - 80, иностранных - 103). Работа иллюстрирoвана 21 рисунком и 35 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для получения культур эритробластических островков по.Ю.М. Захарову и М Прена, (1982), готовили взвесь ЭО в среде, содержащей фе-тальную сыворотку, среду РПМИ-1640, антибиотики и гепарин. Полученную взвесь островков в чашках Петри (из расчёта 104 ЭО на 1мл среды) помещали на 30 минут в газопроточный инкубатор (37°С, 4,5% СО2) для адгезии ЭО. Затем средой РПМИ-1640 смывали неадгезировавшиеся клетки. Для культивирования островков чашки Петри заполняли средой культивирования, содержащей фетальную сыворотку, среду РПМИ-1640, мер-каптоэтанол, антибиотики и эритропоэтин «Recormon», (Boehringer Mannheim, Germany). Все манипуляции с культурами производили в стерильных условиях ламинарного шкафа. Культивирование ЭО осуществляли в газопроточном инкубаторе при 37°С и содержании в атмосфере инкубатора 4,5% СО2. Контроль жизнеспособности культур производили с помощью фазово-контрастной микроскопии на инвертированном микроскопе "Биолам-П-1" (Bessis M., 1972).

Для исследования влияния эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в ЭО, использовали эритроциты интактных, полицитемичных и анемизированных фенилгидразином крыс.

Для получения полицитемичных эритроцитов забирали кровь у полицитемичных крыс на 5-е сутки полицитемии, когда гематокрит у животных составлял 70±2,1% (в исходном состоянии - 46,2±1,3%), количество ретикулоцитов - 1,0±0,3%о (в исходном состоянии - 53,2±2,4 %о).

Для получения эритромассы с высоким содержанием ретикулоцитов забирали кровь у анемизированных фенилгидразином крыс на 5-е сутки после введения гемолитика, когда количество ретикулоцитов в их крови составило 630±12,3%о а гематокрит - 40,4±1,1%, (в исходном состоянии количество ретикулоцитов - 48,2±1,3 %о, гематокрит 43,7±1,8%).

Донорами зрелых эритроцитов служили интактные крысы. Гематокрит у них составил 45,3±2,2%, количество ретикулоцитов - 51±3,2%о.

У каждой из этих трёх групп крыс кровь получали пункцией задней полой вены под эфирным наркозом, стабилизируя её гепарином. Полученную кровь центрифугировали 20 минут для отделения эритроцитов от плазмы крови. Затем эритроциты суспендировали в физрастворе и после центрифугирования удаляли его. Суспендирование и центрифугирование эритроцитов повторяли трижды с целью их отмывки от плазмы крови и гепарина.

Полученные эритроциты в количестве 30, 60 и 120 клеток на один эритробластический островок с помощью микродозатора вносили в куль-туральные сосуды с адгезированными ЭО и производили их сокультива-цию в газопроточном термостате при 37°С и содержании углекислого газа 4,5% в течение 24,48 и 72 часов. Контролем в исследованиях служили 24, 48 и 72-часовые культуры островков с добавлением эритропоэтина в дозе 0,5 МЕ /мл культивационной среды, без добавления эритроцитов.

Подсчёт формулы эритробластических островков производили, разделяя их по классам зрелости. Определение классов зрелости ЭО проводили в адгезированных препаратах и в культурах островков, согласно классификации Ю.М. Захарова и соавт. (1990). К первому классу зрелости (ЭО1) относили эритробластические островки, «корона» которых была представлена проэритробластами, эритробластами и базофильными нор-мобластами с числом клеток от 2 до 8; ко второму классу (ЭО2) - островки, «корона» которых была представлена базофильными и ранними по-лихроматофильными нормобластами с числом клеток от 9 до 16; к третьему классу (ЭОЗ) - островки с 17-32 клетками, среди которых встречались средние и поздние полихроматофильные нормобласты, оксифиль-ные нормобласты и ретикулоциты; островки с поздними полихромато-фильными, оксифильными нормобластами, ретикулоцитами в «короне» и числом ядросодержащих клеток менее 16 относили к классу инволюци-рующих островков (ЭОинв); реконструирующиеся островки (ЭОрек) представляли собой ЭОинв с присоединившимися к их «короне» молодыми способными к делению эритроидными клетками - проэритробластами, эритробластами и/или базофильными нормобластами. Для оценки характера созревания эритроидной короны эритробластических островков костного мозга подсчитывали также количество ЭОинв-1 - инволюцирую-щих островков, корона которых содержит только ретикулоциты (Захаров Ю. М., Рассохин А. Г., 2002; Веп-ЬЬау Ъ., Уойёу I. М, 1974.).

Для оценки интенсивности повторного вовлечения макрофагов в формирование эритробластических островков рассчитывали "Показатель повторного вовлечения макрофагов в формирование эритробластических островков", как отношение числа реконструирующихся островков к числу инволюцирующих (Воргова Л.В., 1989; Воргова Л.В., Захаров Ю.М., 1990).

С целью исследования клеточного состава культивационной среды культур ЭО использовалась диагностическая система "СЕЬЬРКШТ ®" (фирма-производитель - "...З11"(«Технолоджи - Трансформ - Трейдинг

ГбмХ», Германия). В наших экспериментах использовались фильтры с диаметром пор 5мкм.

Для изучения клеточного состава среды из чашек Петри, содержащих культуры ЭО, осторожно, с помощью шприца-фильтра "CELLPRINT ®", собиралась вся культуральная среда (Змл из каждой чашки), что позволяло на торце цилиндра фильтра выделить неадгезированные клетки и ЭО из культуральной среды. Клеточный материал, полученный из Змл культивационной среды с помощью прибора "CELLPRINT ®", наносили на подготовленную подложку на предметном стекле.

Клеточный препарат на предметном стекле опрыскивали реактивом CELLPRINT - FIX и фиксировали в течение 1 мин, затем окрашивали по Паппенгейму (Захаров Ю.М., 2001). В препаратах считали абсолютное количество ЭО разных классов зрелости, количество свободных макрофагов, полихроматофильных и оксифильных нормобластов, ретикулоцитов, выделенных из полного объёма культуральной среды.

Для изучения пролиферативной активности эритроидных клеток, входящих в состав «короны» эритробластических островков, за 4 часа до окончания эксперимента в культуральные сосуды микродозатором вносили раствор колхицина (из расчета 0,1 мкг на 1мл среды культивирования) (Мосягина Е.Н., 1976; Мамаева С.Е., 1988).

Статмокинетический индекс рассчитывали как количество митозов на 1000 ядросодержащих и способных к делению эритроидных клеток островков 1 класса зрелости, 2 класса зрелости и реконструирующихся островков. Продолжительность клеточного цикла (tc), включающего в себя фазы G,, S, G2 и М, определялась по формуле (Епифанова О.И., ,1973; Мосягина E.H., 1976): tc= kx ^ / si

где к - коэффициент 1000, рекомендуемый авторами для равновесной клеточной популяции; tk - время действия колхицина в часах; si -статмокинетический индекс в %о

С целью исследования влияния эритропоэтина на фагоцитарную активность ЦМЭО в культуре эритробластических островков в культу-ральную среду добавляли эритропоэтин в количестве 0,25, 0,5 и 1,0 ME/ мл среды. Для изучения фагоцитарной активности ЦМЭО за 1 час до окончания эксперимента в культуральные сосуды вносили взвесь частиц по-листирольного монодисперсного латекса диаметром 0,77 мкм (концентрация - 108 частиц в 1 мл культуральной среды, из расчета: 50 частиц латекса на 1 центральный макрофаг) (Фрейдлин И.С. с соавт., 1976; Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П., 1992).

Активность фагоцитоза рассчитывали как процентное соотношение центральных макрофагов, проявляющих фагоцитарную реакцию, к числу всех центральных макрофагов в культуре эритробластических островков. Интенсивность фагоцитоза или удельную фагоцитарную активность определяли по количеству, частиц латекса, поглощенных каждым центральным макрофагом островков различных классов зрелости (Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П., 1992).

Фагоцитарную активность макрофагов в культурах сравнивали с показателями фагоцитарной активности центральных макрофагов ЭО костного мозга интактных крыс, определенными до культивирования (контроль). Одновременно изучалась фагоцитарная активность центральных макрофагов эритробластических островков, культивированных в течение 24 часов в среде, не содержащей эритропоэтина.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась на ПЭВМ с использованием программ Excel 2000, STATISTICA 6,0. (Боровиков В., 2001). Рассчитывали среднее значение (М), стандартную ошибку (т). Ввиду малого объёма выборки для проверки гипотезы о наличии или отсутствии различий между подопытными и контрольными группами использовали непараметрические методы: критерий интегральных различий Колмогорова-Смирнова, критерий с поправкой Йейтса, точный критерий Фишера. Различия считались достоверными при 95% уровне значимости (р < 0,05) (Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С. А., 1999).

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование производительной активности культуры эритроблас-тических островков (рис. 1) показало, что через 24 часа культивирования ЭО в культивационной среде появляются свободные полихроматофиль-ные и оксифильные нормобласты, ретикулоциты. Кроме того, встречаются единичные находки ЭО1, ЭО2 и единичные свободные макрофаги. В культивационной среде, исследованной используемым методом, не удалось обнаружить ни ЭОинв., ни ЭОрек, ни ЭОЗ.

С увеличением сроков культивирования, на 48-й и 72-й часы, в культивационной среде резко увеличилось количество свободных ретикуло-цитов, оксифильных нормобластов, полихроматофильных нормобластов, а также свободных макрофагов, появлялись эритроциты. Кроме того, возросло содержание ЭО1 и ЭО2, что можно объяснить снижением способности их центральных макрофагов к адгезии; появлялись редкие находки ЭОЗ и ЭОинв.; ЭОрек. обнаружить не удалось, что говорит о высокой

адгезионйой способности центральных макрофагов островков этого класса.

Оценка суммарного количества адгезированных и деадгезированных свободных ретикулоцитов, равно как и оксифильных нормобластов, отразила резкое увеличение их числа по сравнению с исходными данными, что указывает на увеличение продукции этих клеток эритробластически-ми островками в ходе культивирования.

< 3

о о.

я s

I а

ЕГ

X о о х н 2 с; о

й а

□ полихроматофиль ные нормобласты

О оксифильные нормобласты

И ретикулоциты

И свободные макрофаги

контроль 24 часа 48 часов 72 часа

длительность культивирования

Рис. 1 Производительная активность культур эритробластических островков примечания

1 Доза эритропоэтина 0,5 МЕ/мл

2 Р - обозначены достоверные различия по сравнению с контролем, Р, - достоверные различия по сравнению с 24-часовой культурой, Р2 - достоверные различия по сравнению с 48-часовой культурой Р, Рр Р2,<0,05

Время жизни эритроцитов крыс составляет 45-68 дней (Schalm О. W. et al., 1975), а скорость созревания ретикулоцитов этих животных (определённая с помощью культивирования крови in vitro и интерпретации-кривых созревания) в среднем составляет 23,2 часа (Самардакова А.Г., Стржижовский А.Д., 1967; Самардакова А.Г., 1970), а при большой концентрации эритропоэтина этот процесс значительно ускоряется (Захаров Ю.М., 1973). Эти данные позволяют объяснить отсутствие значимых различий в продукции ретикулоцитов 48- и 72-часовымИ культурами: Те ретикулоциты, которые образовались на 48-й час культивирования к 72-му часу, созрели в нормоциты, а ретикулоциты, выявленные к концу 72-го

часа культивации представляют собой вновь образованные эритроблас-тическими островками клетки. Таким образом, наблюдающаяся на 48-й и 72-й часы культивирования интенсивная продукция ретикулоцитов культурой ЭО позволяет утверждать, что в ней последовательно осуществляются все этапы дефинитивного эритропоэза - от проэритробластов до созревания нормобластов в ретикулоциты и последних в эритроциты; выраженность этих этапов зависит от дозы внесённого в культуру эрит-ропоэтина.

Ответ культуры на внесение эритропоэтина в дозах 0,5 и 1,0МЕ/мл, оцениваемый по динамике продукции ретикулоцитов, оксифильных нормобластов, полихроматофильных нормобластов, количественно сходен, что подтверждает предыдущие наблюдения (Тишевская Н.В. с соавт., 1998) о способности данных доз эритропоэтина оказывать сходный эффект на эритропоэз в ЭО.

Результаты проведённых исследований позволяют заключить, что адгезированная к пластику культурального сосуда популяция ЭО и ЦМЭО позволяет объективно оценивать ход (этапы) эритропоэза в культуре по выраженности стимуляции эритропоэза эритропоэтином в культуре, благодаря формированию ЭО de novo (ЭО1) и de repeto (ЭОрек.), ход волны пролиферации и дифференциации в культуре от ЭО1 до ЭОинв., продукцию эритроцитов островками.

В результате исследований влияния разных доз эритропоэтина на фагоцитарную функцию центральных макрофагов ЭО (рис. 2) в течение 24-часовой инкубации, выявлен стимулирующий эффект на данный процесс этого гормона. Природа данного явления связана с активацией функций центральных макрофагов, поскольку через 24 часа от начала культивирования в «короне» островков выраженные признаки стимуляции эрит-ропоэза отмечаются лишь в культурах, получивших 1МЕ/мл и более эритропоэтина, в которых уже имеет место ускоренное созревание нормобла-стов в ретикулоциты и ядра, теряемые нормобластами, могут стимулировать фагоцитарную активность макрофагов (Тишевская Н.В. с соавт., 1998).

Однако фагоцитарная активность центральных макрофагов достоверно увеличивается в культурах с эритропоэтином, внесенным в количестве 0,25-0,5 МЕ/мл. Эти изменения оказываются равно выражены и в макрофагах, образовавших эритробластические островки de novo (ЭО1), и в макрофагах, уже имеющих развитую эритроидную «корону» (ЭОрек.). Подобное увеличение фагоцитарной активности центральных макрофагов островков всех классов зрелости было отмечено ранее в костном мозге интактных и

щ 100 -

I 80 -

£ о. 60 -

К а 40 -

о Ь

£ 20 -

О Н—--1—--1—--1——-1——-1

контроль 0 МЕ/мл 0,25 МЕ/мл 0,5 МБ'мл 1 МЕ/мл

вносимая доза эритропоэтина Рис. 2 Влияние эритропоэтина на активность фагоцитоза центральных макрофагов эритробластических островков в культуре

Примечание р - обозначены достоверные различия по сравнению с контролем, pino сравнению с культурой без внесения эритропоэтина

полицитемичных крыс при внутрибрюшинном введении эритропоэтина (Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П., 1992; 1997). Механизм стимуляции фагоцитарной активности центральных макрофагов эритропоэтином остается неясным до сих пор, поскольку в доступной нам литературе нет данных о наличии эритропоэтиновых рецепторов на мембране макрофагов. Усиление фагоцитарной активности центральных макрофагов под влиянием эрит-ропоэтина имеет большое функциональное значение, так как созревание эритроидных клеток в «короне» островков предполагает утилизацию их ядерного материала, а при неэффективном эритропоэзе - всех клеточных структур эритроидных клеток макрофагами островков. Таким образом, применение эритропоэтина в дозе 0,5МЕ/мл поддерживает фагоцитарную активность ЦМЭО в культуре и позволяет оценить функции ЦМ островков разной степени зрелости в процессе культивирования.

Опыты по сокультивации ЭО и эритроцитов разной степени зрелости показали, что после 24-часовой сокультивации эритробластических островков с малыми дозами (30 эритроцитов на островок) эритроцитар-ной взвеси, богатой ретикулоцитами, а также с эритроцитами интактных крыс (30 и 60 эритроцитов на островок) эритропоэз в культуре стимулируется, что выражается в увеличении количества реконструирующихся островков.

Таблица 1

Распределение эритробластических островков разных классов зрелости (в %) при 48- часовой сокультивации с эритроцитами разной степени

зрелости

Вносимые эритроциты ЭО1 ЭО2 ЭОЗ ЭОинв ЭОинв -1 ' ЭОрек

Контроль (без эритроцитов) 3,30+0.43 3,20+0,30 2.1,50+1,62. 46,71 + 1,60 0,48+0,02 25,33+0,61

Эритроциты анемизированных крыс 3,53±0,22 2,67+0,33 21,00+0,26 51,52+0,72 0,42+0,02 21,33+0,42

эритроциты интактных крыс 3,33+0,41 3,50+0,43 18,01 +0,61 65,20+1,11 042+0 04 10,00+0,92

Р Р

эритроциты полицитемичных крыс 1,83+0,31 1,83+0,48 7,52+0,43 81,33+0,61 Р 0,72+0,07 7,51 +0,43 Р

Р Р Р

примечания.

1. Доза вносимых эритроцитов - 60 клеток на ЭО

2. Доза эритропоэтина в культурах - 0,5МЕ/мл культивационной среды

3. р- обозначены достоверные различия по сравнению с контролем, р<0,05

Увеличение сроков сокулътивации до 48 часов и дозы вносимых эритроцитов и ретикулоцитов приводит к торможению эритропоэза (табл. 1). Сокультивация же островков с эритроцитами полицитемичных крыс в первые сутки опыта не только не оказывает стимулирующего влияния, но при сокультивации 60 и 120 эритроцитов на островок тормозит эритропоэз в культуре. Данный ингибирующий эффект эритроцитов анемизированных фенилгидразином, интактных и полицитемичных крыс на эритропоэз в культуре эритробластических островков выражается снижением процентного содержания островков пролиферирующих классов, увеличением количества инволюцирующих островков и пропорционален количеству вносимых в культуру эритроцитов. Однако, степень выраженности такого влияния эритроцитов, полученных у разных групп животных, неодинакова.

Так, эритроциты анемизированных крыс, почти на 2/3 представленные ретикулоцитами, оказывают слабо выраженный ингибирующий эффект, проявивший себя на 48-й час сокультивации лишь при внесении максимальных доз эритроцитов (120 эритроцитов на островок) уменьшением доли островков 3-го класса зрелости и увеличением процента инво-люцирующих островков, а на 72-й час - и уменьшением процентного содержания островков 1-го, 2-го классов зрелости и реконструирующихся островков. Ингибирующее влияние эритроцитов интактных крыс на

эритропоэз в островках также регистрируется с 48-го часа сокультивации эритроцитов и островков, но проявляется уже при минимальной дозе вносимых в культуру клеток - 30 на островок (в культуре уменьшается доля реконструирующихся островков).

Эритроциты же полицитемичных крыс, вносимые в культуры в дозе всего лишь 30 эритроцитов на островок, начиная с 48-го часа сокультива-ции, вызывают выраженное ингибирование эритропоэза в островках, уменьшая процентное содержание островков пролиферирующих классов и увеличивая процент инволюцирующих островков.

48-часовое культивирование эритробластических островков без внесения эритроцитов на фоне 0,5 МЕ/мл эритропоэтина сопровождается уменьшением повторного вовлечения свободных макрофагов в формирование ЭО и увеличением скорости созревания «короны» эритробластических островков по сравнению с контролем и 24-часовыми культурами, что доказывается увеличением количества зрелых островков в культурах. В 72-часовых культурах содержание зрелых ЭО в 3,5 раза превышает контроль, кроме того, возрастает количество свободно лежащих макрофагов, вероятно, высвободившихся после созревания островков.

Эритроциты интактных, полицитемичных и анемизированных фе-нилгидразином крыс, вносимые в культуру в возрастающем количестве, оказывают ингибирующий эффект на эритропоэз в ЭО, что выражается в уменьшении повторного вовлечение свободных макрофагов в формирование новых эритробластических островков, в меньшем приросте в культурах зрелых ЭО пропорционально количеству вносимых эритроцитов. Выраженность этого эффекта эритроцитов, полученных у разных групп животных, различна.

Так, эритроциты полицитемичных крыс наиболее интенсивно замедляют созревание эритроидной «короны» эритробластических островков, эритроциты анемизированных крыс, взвесь которых богата ретикулоци-тами, оказывают менее выраженный ингибирующий эритропоэз эффект, а влияние эритроцитов интактных крыс на эритропоэз в ЭО было ещё менее выражено, что наиболее отчётливо прослеживается на 72-й час сокультивации эритроцитов и островков.

Присутствие небольших количеств молодых и зрелых эритроцитов в культуре островков (30, 60 клеток на островок) на протяжении одних суток стимулирует эритропоэз, увеличивая число находящихся в митозе эритроидных клеток «короны» эритробластических островков и умень-

Таблица 2

Продолжительность клеточного цикла эритроидных клеток «короны» ЭО при 48-часовой сокультивации островков с эритроцитами разной степени

зрелости

Вносимые эритроциты продолжительность клеточного цикла (в часах)

ЭО1 ЭО2 ЭОрек.

Контроль (без эритроцитов) 14,99± 0,21 22,11 ±0,24 10,14±0,10

Эритроциты анемизи-рованных крыс 17,15±0,19 Р 24,57 ±0,36 Р 11,05±0,08 Р

эритроциты интактных крыс 18,72±0,20 Р 27,11±0,31 Р 12,84±0,22 Р

эритроциты полиците-мичных крыс 24,31±0,29 Р 40,34±1,03 Р 18,94±0,38 Р

примечания

1 Доза вносимых эритроцитов - 60 клеток на ЭО

2 Доза эритропоэтина в культурах - 0,5МЕ/мл культивационной среды

3 р- обозначены достоверные различия по сравнению с контролем, р<0,05

шая продолжительность их клеточного цикла. Более продолжительное сокультивирование островков с таким же количеством молодых и зрелых эритроцитов или же увеличение их числа оказывает ингибирующий эффект на эритропоэз в эритроидной «короне» островков, уменьшая в ней количество делящихся эритробластов и увеличивая продолжительность их клеточного цикла (табл. 2).

Ингибирующий эффект на митотическую активность клеток «короны» островков ярче всего проявляется со стороны эритроцитов, полученных у полицитемичных крыс и содержащих наибольшее число «старых» эритроцитов, что согласуется с результатами, полученными ранее в нашей лаборатории в опытах in vivo (Захаров Ю. М., Рассохин А. Г., 2002).

Так как перед внесением в культуры эритроциты были отмыты в физиологическом растворе, их ингибирующий эритропоэз эффект вероятно обусловлен выделением этими эритроцитами в культивационную среду каких-то молекул-ингибиторов, причём очевидно, что количество выделяющегося ингибитора пропорционально количеству инкубируемых эритроцитов и его количество в среде увеличивается с увеличением сроков сокультивации. В роли этих молекул-ингибиторов могут выступать

кейлоны (Gj и G2-кейлоны) - гликопротеины мембран эритроцитов (Kivilaakso E., Rytumaa Т., 1971), которые, как считается, по мере старения эритроцита отщепляются ферментной системой его мембраны и поступают в окружающую среду (Неустроев Г.В., 1984).

Постоянным компонентом близкого окружения ЭО в ткани костного мозга в физиологических условиях являются ретикулоциты, представляющие собой наиболее зрелые клетки эритроидного ряда эритробласти-ческих островков костного мозга, постоянно высвобождающиеся из «короны» ЭО. Поэтому стимулирующий и ингибирующий эритропоэз эффект ретикулоцитов, возможно, является одним из механизмов саморегуляции скорости созревания эритрокариоцитов на уровне ЭО в костном мозге, зависящий от концентрации ретикулоцитов в паренхиме костного мозга.

Стимулирующий и ингибирующий эритропоэз эффекты зрелых эритроцитов (эритроциты интактных крыс) обнаруженные в наших экспериментах при их сокультивации с ЭО, говорят о том, что стимулирующие и ингибирующие эритропоэз свойства зрелых эритроцитов также являются физиологичными для организма.

В физиологических условиях зрелые эритроциты не имеют контакта с ЭО в костном мозге, поэтому, можно предположить, что ингибирующие эритропоэз вещества выделяются эритроцитами в плазму крови. Это подтверждается в частности обнаружением кейлонов в сыворотке интактных животных (Marjama Y. et al., 1974). Поэтому можно полагать, что данные вещества с током крови достигают костного мозга, где и реализуют свой эффект на эритропоэз в ЭО.

Выделение эритроцитами молекул-ингибиторов в плазму крови может быть одним из механизмов ингибиции эритропоэза при экспериментальной посттрансфузионной полицитемии in vivo, наряду с торможением образования эритропоэтина в почках (Филимонов В.И., 1972) и стимуляцией синтеза ингибиторов эритропоэза тканью селезёнки (Krzymowski Т., Krzymowska H., 1962), что подтверждается обнаружением кейлонов в сыворотке полицитемичных животных в значительно больших количествах, чем в сыворотке интактных (Marjama Y. et al., 1974).

Наиболее сильный ингибирующий эффект эритроцитов полиците-мичных крыс, выявленный в наших экспериментах, вероятно связан с тем, что в процессе физиологического старения эритроцитов выделение ими молекул-ингибиторов становится более интенсивным.

Возможно, что смена стимулирующего влияния на ингибирующее на эритропоэз в культуре эритробластических островков, при их сокуль-тивации с эритроцитами, связана с увеличением общего количества эритроцитов в культуре, что в естественных условиях in vivo может быть следствием повышенной продукции эритроцитов эритроидными «коронами» островков. Можно предположить, что увеличение концентрации кейло-нов в культуральной среде, имеющее место при увеличении доз вносимых в культуру эритроцитов и сроков сокультивации, количественно подавляло стимулирующие эффекты, оказываемые на островки молодыми и зрелыми эритроцитами.

Отличие эффектов эритроцитов интактных, полицитемичных, и ане-мизированиых крыс, на эритропоэз in vitro от их эффектов in vivo (Ужан-ский Я.Г., 1949, 1968; Новиков Н.М., 1966) возможно связано с тем, что по представлениям лаборатории Ужанского продукты разрушения зрелых эритроцитов, введённые in vivo, активируют продукцию эритропоэтина почками (Ужанский Я.Г., Новиков Н.М., 1977; Павлов А.Д. 1987, 1991), что обусловлено, как установлено позднее, микровезикулами плазмолем-мы эритроцитов, образующимися в процессе старения этих клеток (Сороковая В.И. с соавт., 1995). Синтезируемый почками эритропоэтин, в свою очередь, вызывает стимуляцию эритропоэза in vivo.

В наших экспериментах удаётся вычленить прямые эффекты как небольших количеств эритроцитов, так и искусственно созданной "поли-цитемии" in vitro, представленной разными по степени зрелости эритроцитами, на формирование островков и эритропоэз в эритробластических островках костного мозга. Это доказывает, что физиологические регуляторы эритропоэза - как стимуляторы, так и кейлоны, могут образовываться не только в целом организме, но и в культуральной системе, причём, содержание последних нарастает при увеличении количества эритроцитов в культуре эритробластических островков.

Результаты экспериментального сокультивирования эритробластических островков с эритроцитами разной степени зрелости подтверждают предположение о возможности авторегуляции созревания и диффе-ренцировки ЭО по механизму положительной и отрицательной обратной связи: большое количество вносимых эритроцитов (в особенности эритроцитов полицитемичных крыс) замедляет эритропоэз в ЭО (отрицательная обратная связь), а малое количество зрелых, и, особенно, незрелых эритроцитов (ретикулоцитов) его стимулирует (положительная обратная связь).

Как известно, выход ретикулоцитов из костного мозга зависит от их деформабельности, которая определяется строением цитоскелета. Ранние ретикулоциты не обладают достаточной деформабельностью и задерживаются в костном мозге (Сторожок С. А. с соавт, 1997). Учитывая данный факт и результаты наших экспериментов, можно предположить, что представительство молодых, зрелых и "старых" эритроцитов в ткани костного мозга является важным фактором физиологической регуляции эритро-поэза, способным как активировать, так и тормозить новообразование эритроцитов в эритробластических островках, причём малое содержание молодых и зрелых эритроцитов стимулирует эритропоэз, а возрастание их количества или накопление «старых» эритроцитов в костном мозге его тормозит.

Выводы

1. Адгезированная к пластику культурального сосуда популяция эрит-робластических островков объективно отражает ход эритропоэза в эритробластических островках: стимуляцию эритропоэтином формирования островков de novo (ЭО1) и de repeto (ЭОрек.), ход волны пролиферации и дифференциации, проходящие в культуре от ЭО1 до ЭОинв.

2. Культура эритробластических островков способна продуцировать ретикулоциты в объёме, зависящем от внесённой в неё дозы эритропоэ-тина и длительности культивирования.

3. Доза эритропоэтина в 0,5МЕ/мл поддерживает эритропоэз в культивируемых эритробластических островках и фагоцитарную функцию их центральных макрофагов на уровне, близком к физиологическому.

4. Эритропоэз в эритробластических островках, при их сокультиви-ровании с эритроцитами, зависит от количества добавленных в культуру эритроцитов, степени их зрелости и длительности сокультивирования.

5. Непродолжительное сокультивирование эритробластических островков с малыми дозами эритроцитов интактных и анемизированных крыс оказывает стимулирующий эритропоэз эффект, проявляющийся усиленной реконструкцией эритропоэза, увеличением числа находящихся в митозе эритроидных клеток «короны» эритробластических островков про-лиферирующих классов и укорочением их клеточного цикла.

6. Длительное сокультивирование эритробластических островков с возрастающими дозами эритроцитов интактных и анемизированных крыс, а также (начиная с малых доз) с эритроцитами полицитемичных крыс ингибирует эритропоэз в эритробластических островках, что проявляет-

ся торможением реконструкции эритропоэза в инволюцирующих островках, замедленным созреванием клеток эритроидной «короны» островков, увеличением продолжительности их клеточного цикла.

Список рабог, опубликованных по теме диссертации

1. Захаров Ю.М. Влияние эритроцитов интактных, полицитемичных и анемизированных крыс на эритропоэз в культуре эритробластических островков / Ю.М. Захаров, С.А Шевяков // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова - 2004. - №1, Т.90. - С.49-58.

2. Захаров Ю.М. Влияние эритроцитов на длительность митотичес-кого цикла эритроидных клеток в культуре эритробластических островков / Ю.М. Захаров, С.А Шевяков // Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий. Материалы международной научно-практической конференции. - Курган, 2004.-С.106-108.

3. Захаров Ю.М. Влияние эритроцитов разной степени зрелости на пролиферашвную активность эритроидных клеток «короны» эритробластических островков / Ю.М. Захаров, С.А Шевяков // Российский физиологический журнал им. И М. Сеченова. - 2004. - №7,Т.9О. - С.874-881.

4. Захаров Ю.М. Культура эритробластических островков как новый метод исследования эритропоэза / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, СА Шевяков // Труды научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения». - Трёхгор-ный, 2003. - С.52-54.

5. Захаров Ю.М. Межклеточные взаимодействия в регуляции эрит-ропоэза / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, С.А Шевяков, Е.Л. Куренков / / Патофизиология крови. Экстремальные состояния, сборник работ. -Москва, 2004.-С. 103-121.

6. Захаров Ю.М. Моделирование различных состояний эритропоэза в культуре эритробластических островков / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевс-кая, С.А. Шевяков // Материалы Международного научного симпозиума «Югра-Гемо». - Ханты-Мансийск, 2004. - С.4-7.

7. Захаров Ю.М. Новые данные исследования эритропоэза в эрит-робластических островках "in vitro" / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, С.А. Шевяков // Межрегиональная научно - практическая конференция "Актуальные вопросы патологии", посвященная 70-летию кафедр патологической анатомии и патофизиологии БГМУ. - Уфа, 2004. - С.96-99.

8. Захаров Ю.М. Опыт исследования эритропоэза в культурах эрит-робластических островков / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, СА Шевя-ков // Инжиниринг в медицине. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, сборник научных трудов. -Челябинск, 2002. - С.22-26.

9. Захаров Ю.М. Современные подходы к исследованию роли межклеточных взаимодействий в регуляции эритропоэза / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, С.А Шевяков, Е.Л. Куренков // Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения. Труды научной сессии, посвященной 60-летию медицинской академии. - Челябинск, 2004. - С.10-12.

10. Захаров Ю.М. Экспериментальная дизрегуляция эритропоэза / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, СА Шевяков // Третий Российский конгресс по патофизиологии с международным участием. "Дизрегуляцион-ная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)", тезисы докладов. - Москва, 2004. - С.68.

11. Куренков Е.Л. Активность ядрышковых организаторов в клетках культур эритробластических островков костного мозга / Е.Л. Куренков, СА. Шевяков, А.Г. Рассохин, Ю.М. Захаров // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. - 2002. - №9,Т88. - С.1182-1190.

12. Куренков Е.Л. Активность ядрышковых организаторов в клетках эритробластических островков костного мозга при различных функциональных состояниях эритропоэза / Е.Л. Куренков, М.Е. Кузнецов, С.А. Шевяков, А.Г. Рассохин // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2002. -№3. - С. 13-16.

13. Тишевская Н.В. Влияние гуморальных факторов на фагоцитарную активность центральных макрофагов в культуре эритробластичес-ких островков / Н.В. Тишевская, СА Шевяков, Ю.М. Захаров // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. - 2002. - №9,Т.88. -С.1191-1198.

14. Тишевская Н.В. Влияние эритропоэтина и макрофагального ко-лониестимулирующего фактора на пролиферативную активность эритро-идных клеток в культурах эритробластических островков / Н.В. Тишевс-кая, Ю.М. Захаров, С.А Шевяков // Медицинский академический журнал. - 2003. -№3, Т.З. - С. 67-72.

15. Шевяков СА Сокультивирование эритробластических островков и эритроцитов in vitro как модель клеточно-клеточных взаимодействий в

костном мозге / С.А. Шевяков // «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». III конференция молодых учёных России с международным участием, сборник тезисов. - Москва, 2004. - С.364-365.

Шевяков Сергей Александрович

Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробластических островков

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Отпечатано в издательстве «Челябинская государственная медицинская

академия». Лицензия № 01906. Подписано к печати 17.05.05 г. Объем 1 п.л. Формат 64x84. Гарнитура «Times New Roman суг». Бумага офсетная. Тираж 100 экз.

4 ИЮЛ 2005.

1368

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Шевяков, Сергей Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Эритробластические островки костного мозга.

1.2 Роль эритропоэтина в регуляции эритропоэза.

1.3 Ингибиторы эритропоэза. а) ингибиторы эритропоэза при полицитемии. б) роль продуктов распада эритроцитов в регуляции эритропоэза. в) роль кейлонов в регуляции эритропоэза. г) цитокины, ингибирующие эритропоэз.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Лабораторные животные.

2.2 Методы исследования периферической крови.

2.3 Экспериментальные модели стимуляции и ингибирования эритропоэза in vivo, используемые для получения эритроцитов разной степени зрелости.

2.3.1 Интактные крысы.

2.3.2 Полицитемия.

2.3.3 Фенилгидразиновая анемия.

2.4 Постановка культуры эритробластических островков костного мозга крыс.

2.5 Моделирование эритропоэза в культурах эритробластических островков.

2.5.1 добавление эритропоэтина.

2.5.2 добавление эритроцитов.

2.6 Методы анализа эритропоэза в культурах эритробластических островков.

2.6.1 Классификация эритробластических островков костного мозга. Подсчёт формулы эритробластических островков.

2.6.2 Исследование продуктивной функции культуры ЭО с помощью системы "СЕЬЬРКПМТ

2.6.3 Подсчёт абсолютного количества ЭОинв.-1 и свободно лежащих макрофагов в культуре эритробластических островков.

2.6.4 Анализ отпечатков СЕЬЬРМЖ.

2.6.5 Исследование количества митозов и продолжительности клеточного цикла.

2.6.6 Исследование фагоцитарной активности центральных макрофагов эритробластических островков.

2.7 Статистическая обработка результатов исследования.

ГЛАВА 3. ПРОИЗВОДИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ КУЛЬТУРЫ

ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ.

3.1 Продукция ретикулоцитов культурой эритробластических островков.

3.2. Продукция оксифильных нормобластов культурой эритробластических островков.

3.3 Продукция полихроматофильных нормобластов культурой эритробластических островков.

3.4 Содержание свободных макрофагов в культуре эритробластических островков.

3.5 Пролиферативные процессы и созревание клеток «короны» эритробластических островков.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ФАГОЦИТАРНУЮ ФУНКЦИЮ ЦЕНТРАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ

ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ В КУЛЬТУРЕ.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЗРЕЛОСТИ НА КАЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ АДГЕЗИРОВАННОЙ ПОПУЛЯЦИИ КУЛЬТУРЫ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ.

5.1 Влияние эритропоэтина.

5.2 Влияние эритроцитов интактных крыс.

5.3 Влияние эритроцитов полицитемичных крыс.

5.4 Влияние эритроцитов анемизированных крыс.

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЗРЕЛОСТИ НА КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ АДГЕЗИРОВАННОЙ ПОПУЛЯЦИИ КУЛЬТУРЫ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ.

6.1 Влияние эритропоэтина, вносимого в дозе 0,5 МЕ/мл среды.

6.2 Влияние эритроцитов интактных крыс.

6.3 Влияние эритроцитов полицитемичных крыс.

6.4 Влияние эритроцитов анемизированных крыс.

ГЛАВА 7. ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЗРЕЛОСТИ НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЭРИТРОИДНЫХ КЛЕТОК «КОРОНЫ» ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ.

7.1 Влияние эритроцитов анемизированных крыс.

7.2 Влияние эритроцитов интактных крыс.

7.3 Влияние эритроцитов полицитемичных крыс.

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробластических островков"

Актуальность исследования

Известно, что дифференциация и созревание эритроидных клеток в костном мозге млекопитающих и человека протекают в эритробластических островках, представляющих собой ассоциацию клеток двух различных линий — макрофагальной и эритроидной. Установлено, что в культуре эритробластических островков, стимулированных внесением в неё эритропоэтина, резко активируются процессы пролиферации и созревания эритроидной «короны» островков с отделением от неё в культуральную среду ретикулоцитов (Zakharov Y., Prenant M., 1982, 1983). Однако, остаётся невыясненным, как может влиять увеличение числа образующихся в культуре эритроцитов на эритропоэз в эритробластических островках.

Между тем показано, что в регуляции эритропоэза участвует и авторегуляторный механизм, в котором созревающие и зрелые клетки эритроидного ряда выполняют функцию отрицательной обратной связи, тормозя новообразование эритроцитов эритроидными клетками-предшественницами (Захаров Ю. М., 1970). Так, тормозящие эритропоэз вещества (ингибиторы эритропоэза - кейлоны) найдены в инкубационной среде эритроцитов, в эритролизате, в крови животных с экспериментальной полицитемией (Неустроев Г.В., 1978, 1984). В переживающей культуре клеток костного мозга кейлоны замедляют клеточный цикл эритроидных клеток (Неустроев Г.В., 1980; Kivilaakso Е., Rytômaa Т., 1970, 1971).

Допускается также, что возросшая масса эритроцитов в крови, например при экспериментальной полицитемии, стимулирует образование ингибиторов эритропоэза. тканью селезёнки, раздражённой большим объёмом депонированных эритроцитов (Krzymowski T., Krzymowska H., 1962), а не только повышенным высвобождением кейлонов эритроцитами при воспроизведении данной экспериментальной модели (Неустроев Г.В;, 1978, 1984).

В опытах in vivo установлено также, что продукты распада или метаболизма эритроцитов разной степени зрелости оказывают различные эффекты на эритропоэз: продукты распада нормальных, эритроцитов' стимулируют эритропоэз, а ретикулоцитов - его тормозят (Новиков Н:М., 1966; Ужанский Я:Г., 1968).

Исследований;' подобных указанным выше, на культурах эритробластических островков, являющихся основными? морфофункциональными- единицами эритропоэза, в которых в эритроидную дифференциацию вовлекаются КОЕэ, осуществляются процессы размножения эритробластов и их созревание (Захаров Ю.М., Мельников И.Ю:, 1984; Захаров Ю: М.,. Рассохин A. F., 2002); не проводилось.

Центральные макрофаги эритробластических островков") - это пул мононуклеарных фагоцитов, секретирующих широчайший спектр регуляторных веществ; и выполняющих разнообразные функции по обеспечению костномозгового эритропоэза (Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993; Bessis М. et al., 1978; Yoffey J., Yaffe P., 1980; Bernand-J., 1991). Интенсивность формирования; эритробластических островков и развитие эритроидных клеток в их «короне» зависит от количества эритропоэтина, что было убедительно доказано в нашей лаборатории при изучении эритробластических островков, in vivo и in vitro* (Рассохин А.Г., 1997; Тишевская II.В. с соавт., 1998). Однако нельзя исключить возможность изменения,темпа развития эритроидной «короны» в, эритробластических островках при клеточно-клеточных взаимодействиях эритроцитов разной степени зрелости и центральных, макрофагов островков. Культивирование эритробластических островков в отличие от экспериментов, выполняющихся in vivo, позволяет выявить дозозависимые эффекты вносимых в культуру эритроцитов на функции центральных макрофагов и развитие эритроидной «короны», а также предоставляет возможность для изучения сочетанного влияния гуморальных факторов и клеточно-клеточных взаимодействий на эритропоэз в эритробластических островках. Цель исследования

Целью настоящей работы явилось изучение возможного влияния эритроцитов разной степени зрелости (ретикулоцитов, эритроцитов интактных и полицитемичных крыс) на характер пролиферации и созревания эритроидных клеток «короны» эритробластических островков в культуре.

Задачи исследования

3. Изучить влияние эритроцитов разной степени зрелости на пролиферативную активность клеток «короны» эритробластических островков в культуре.

Научная новизна исследования

Впервые проведённое нами исследование, с использованием системы "СЕЬЬРЫШТ клеточного состава культивационной среды культур эритробластических островков, позволило изучить продукцию зрелых эритроидных клеток культурой островков.

Установлено, что культура эритробластических островков является системой, в которой осуществляется эффективный эритропоэз с воспроизводством' ретикулоцитов в объёме, зависящем от внесённой в культуру дозы эритропоэтина и длительности культивирования. В результате выполненных исследований установлено, что эритропоэтин, вносимый в культуру ЭО в количестве 0;25-1,0 МЕ/мл среды стимулирует фагоцитарную функцию центральных макрофагов ЭО.

По воспроизводству ретикулоцитов в культуре ЭО и функциональному состоянию центральных макрофагов эритробластических островков установлено, что доза эритропоэтина в 0,5МЕ/мл, является- необходимой и достаточной- для поддержания эритропоэза, близкого к физиологическому, в культуре ЭО.

Используя оригинальную модель сокультивирования эритробластических островков и эритроцитов in vitro, нам впервые удалось выявить прямые эффекты эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в ЭО.

Так, нами установлено, что компонентом регуляции эритропоэза в культивируемых ЭО является, механизм авторегуляции на основе положительной и отрицательной обратных связей, реализующихся в зависимости от количества добавленных в культуру эритроцитов, степени их зрелости и длительности сокультивирования.

Кроме того, наши эксперименты показали, что эритроциты полицитемичных крыс уже в малых дозах ингибируют эритропоэз в ЭО. Добавление этих эритроцитов к культурам эритробластических островков уже на 24-й час вызывает усугубляющееся к 72-му часу опыта торможение как реконструкции эритропоэза в инволюцирующих островках, так и формирования островков de novo.

Обнаружено, что сокультивирование небольших количеств как молодых, так и зрелых эритроцитов с эритробластическими островками костного мозга на протяжении суток, увеличивает число находящихся в митозе эритроидных клеток «короны» эритробластических островков и уменьшает продолжительность их клеточного цикла. Более длительное, до 48 часов, сокультивирование островков с таким же количеством молодых эритроцитов или же большим их числом ингибирует эритропоэз, что проявляется в уменьшении количества делящихся эритробластов «короны» островков и увеличении продолжительности их клеточного цикла. Наиболее выраженное торможение митотической активности эритробластов вызывает добавление в культуру эритроцитов, полученных у полицитемичных крыс.

Научно-практическая ценность работы и внедрение полученных результатов

Положения, выносимые на защиту

1. Культура эритробластических островков костного мозга крыс обеспечивает эффективный эритропоэз в эритробластических островках, заканчивающийся воспроизводством ретикулоцитов в количестве, зависящем от внесённого в культуру эритропоэтина и длительности культивирования.

2. Компонентом регуляции эритропоэза в культивируемых эритробластических островках является его авторегуляция на основе управления с использованием механизма положительной и отрицательной обратных связей, реализуемых в зависимости от количества, степени зрелости эритроцитов и длительности их сокультивирования с эритробластическими островками.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инжиниринг в медицине» (Челябинск, 2002), научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (Трёхгорный, 2003), III конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), международном научном симпозиуме «Югра-Гемо» (Ханты-Мансийск, 2004), международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), научной сессии «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (Челябинск, 2004), III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004), межрегиональной научно практической конференции «Актуальные вопросы патологии» (Уфа, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Объём и структура работы

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, пяти глав результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 183 источника (отечественных - 80, иностранных - 103). Работа иллюстрирована 21 рисунком и 35 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Шевяков, Сергей Александрович

ВЫВОДЫ:

1. Адгезированная к пластику культурального сосуда популяция эритробластических островков объективно отражает ход эритропоэза в эритробластических островках: стимуляцию эритропоэтином формирования островков de novo (Э01) и de repeto (ЭОрек.), ход волны пролиферации и дифференциации, проходящие в культуре от Э01 до ЭОинв.

2. Культура эритробластических островков способна продуцировать ретикулоциты в объёме, зависящем от внесённой в неё дозы эритропоэтина и длительности культивирования.

4. Эритропоэз в эритробластических островках, при их сокультивировании с эритроцитами, зависит от количества добавленных в культуру эритроцитов, степени их зрелости и длительности сокультивирования.

5. Непродолжительное сокультивирование эритробластических островков с малыми дозами эритроцитов интактных и анемизированных крыс оказывает стимулирующий эритропоэз эффект, проявляющийся усиленной реконструкцией эритропоэза, увеличением числа находящихся в митозе эритроидных клеток «короны» эритробластических островков пролиферирующих классов и укорочением их клеточного цикла.

Ill проявляется торможением реконструкции эритропоэза в инволюцирующих островках, замедленным созреванием клеток эритроидной «короны», увеличением продолжительности их клеточного цикла.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шевяков, Сергей Александрович, Курган

1. Бала Ю.М. Кейлоно — антикейлонная система при некоторых нарушениях кроветворения / Ю.М. Бала, В.М.Лифшиц, В.И. Сидельникова // Гематология и трансфузиология. 1985. - №9. — С.18-20.

2. Безруков Н.В. К вопросу о влиянии продуктов распада эритроцитов на эритропоэз / Н.В. Безруков // Вопросы патофизиологии регенерации крови : сб. науч. тр. Свердловск, 1968. - С. 33-37.

3. Бернат И. Патогенез ожоговой анемии / И.Бернат. Будапешт, 1975. -218 с.

4. Боровиков В. STATISTICA для профессионалов / В. Боровиков. -Санкт-Петербург: Питер, 2001. 650с.

5. Волжская A.M. К вопросу об ингибиторе эритропоэза при экспериментальной посттрансфузионной полицитемии / A.M. Волжская // Материалы симпозиума гуморальной регуляции кроветворения. Ереван, 1972. - С.23-30.

6. Воргова JI.B. О состоянии порфиринового обмена в эритроне у животных в условиях сочетанной физической нагрузки и теплового воздействия : дис. .канд. мед. наук / J1.B. Воргова. Челябинск, 1989. - 182с.

7. Воргова JI.B. Об изменении эритробластических островков костного мозга у животных при сочетании тепловых и мышечных нагрузок / Л.В.Воргова, Ю.М. Захаров // Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. 1990. - Т.76, №2. - С.200-206.

8. Гланц С. А. Медико-биологическая статистика / С.А. Гланц. Москва: Практика, 1999.-459с.

9. Гудим В.И. Ингибитор эритропоэза в условиях экспериментальной посттрансфузионной полицитемии у крыс / В.И. Гудим, Г.П. Москалёва // Патологическая физиология. 1976. - №2. - С.47.

10. Ю.Гудим В.И. К методике биотестирования эритропоэтина на полицитемических мышах / В.И. Гудим, B.C. Иванова // Лабораторное дело. 1977. - №7. - С.429-430.

11. П.Дымшиц P.A. Исследование ингибиторов эритропоэза / P.A. Дымшиц, Ю.М. Захаров, В.И. Филимонов // Биофизика, физиология и патология эритрона: материалы съезда. Красноярск, 1974. - С.27-31.

12. Епифанова О.И. Клеточный цикл / О.И. Епифанова. Москва: Наука, 1973.- 115с.

13. Захаров Ю.М. О факторах, регулирующих эритроцитарную картину крови / Ю.М. Захаров // Бюллетень экспериментальной биологии. — 1970. — №11. -С.40-43.

14. Захаров Ю.М. Эритробластический островок функционально-анатомическая единица эритропоэза / Ю.М. Захаров, И.Ю. Мельников // Гематология и трансфузиология. - 1984. - Т.29, № 10. - С.51 -56.

15. Захаров Ю.М. Метод выделения эритробластических островков из костного мозга человека / Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин, П.Д. Синицын, В.П. Волкова // Лабораторное дело. 1988. - № 5. - С.20-21.

16. Захаров Ю.М. Классификация эритробластических островков с учётом изменения их клеточного состава / Ю.М. Захаров, И.Ю. Мельников, А.Г. Рассохин // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1990. -Т.98, №5. - С.38-42.

17. Захаров Ю.М. Молекулярные и клеточно-клеточные механизмы регуляции эритропоэза / Ю.М. Захаров // Вестник РАМН. 2000. - № 3.- С.4-9.

18. Захаров Ю.М. Система "СЕЬЬРЫШТ ©": руководство по применению / Ю.М. Захаров. Челябинск, 2001. - 20с.

19. Захаров Ю.М. Эритробластический островок / Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин. М. : Медицина, 2002. - 280 с.

20. Захаров Ю.М. О роли нервной системы и ингибиторов кроветворения в его регуляции / Ю.М. Захаров // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2004. - Т.90, №8. - С.987-1000.

21. Захаров Ю.М. Реакция эритропоэза на стрессорные нагрузки / Ю.М.

22. Захаров // Захаров Ю.М. Руководство по реабилитации лиц, подвергшихся стрессорным нагрузкам / Ю.М. Захаров ; под ред.

23. B.И.Покровского. -М. : Медицина, 2004. С. 182-193.

24. Иванова B.C. Роль эритропоэтина и ингибитора эритропоэза в патогенезе анемии при острой почечной недостаточности : автореф. дис, . канд. биол. наук / B.C. Иванова. М., 1987. - 25с.

25. C.А. Кетлинский // Архив патологии. 1978. - №3. - С.З.

26. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - 368с.

27. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. Москва: Высшая школа, 1980. -295 с.

28. Мамаева С.Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток / С.Е. Мамаева // Методы культивирования клеток : сб. науч. тр. -Ленинград: Наука, 1988. С.78-98.

29. Маянский А.Н. Клинические аспекты фагоцитоза / А.Н. Маянский, О.И. Пикуза. Казань: Магариф, 1993. - 110с.

30. Моисеева О.И. Влияние ингибиторов эритропоэза на эритрон / О.И. Моисеева // Физиология системы крови. Физиология эритропоэза: руководство по физиологии. — Ленинград, 1979. — С.159-171.

31. Мосягина E.H. Эритропоэз / E.H. Мосягина, H.A. Федоров, В.И.

32. Гудим, H.A. Горбунова, М.О. Раушенбах // Нормальное кроветворение и его регуляция. М.: Медицина, 1976. - С.341-457.

33. Мосягина E.H. Кинетика форменных элементов крови / E.H. Мосягина. Москва: Медицина, 1976. - 115с.

34. Недоспасов В.О. О патогенезе анемии после удаления селезёнки в эксперименте : автореф. дис. . канд. мед. наук / В.О. Недоспасов. -Челябинск, 1971.- 18с.

35. Hey строев Г.В. Влияние гемолизата и сыворотки животных с полицитемией на пролиферативную активность клеток костного мозга крыс / Г.В. Неустроев // Проблемы гематологии. 1976. - Т.21, №10. С.40-44.

36. Неустроев Г.В. Влияние различных фракций гемолизата полицитемичных животных на пролиферативную активность клеток костного мозга крыс / Г.В. Неустроев // Патологическая физиология. -1977.-№4. С.61-65.

37. Неустроев Г.В. К механизму образования эритроцитарного кейлона при полицитемии in vitro / Г.В. Неустроев // Механизмы регуляции в системе крови : сб. науч. тр. Красноярск, 1978. - С.130-133.

38. Неустроев Г.В. Роль эритроцитарных белков в регуляции клеточного деления эритрона / Г.В. Неустроев // Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. 1978. -Т.36, №1. -С.44-48.

39. Неустроев Г.В. Об источниках и природе эритроцитарного ингибитора при полицитемии in vitro / Г.В. Неустроев // Патологическая физиология. 1979. - №4. - С.54-57.

40. Неустроев Г.В. Влияние очищенного эритроцитарного кейлона на пролиферирующие клетки эритрона мышей / Г.В. Неустроев // Физиологический журнал СССР. 1980. - Т.67, №6. - С.846-850.

41. Неустроев Г.В. О роли эритроцитарного кейлона в регуляции эритропоэза / Г.В. Неустроев // Успехи физиологических наук. 1981. -Т.12, №2. - С.131-148.

42. Hey строев Г.В. Об участии кейлонов в регуляции эритропоэза / Г.В. Неустроев // Успехи физиологических наук. 1984 - Т. 15, №2. - С.27-40.

43. Неустроев Г.В. Иммунологический анализ содержания в крови эритроцитарных кейлонных факторов при некоторых видах патологии / Г.В. Неустроев, A.JI. Меликян, Л.Г. Ковалева, О.Б. Блажко // Гематология и трансфузиология. 1985. - №9. - С.21-26.

44. Новиков Н.М. Влияние продуктов распада эритроцитов на эритропоэз / Н.М. Новиков // Вопросы гематологии в эксперименте и клинике : труды кафедр патологической физиологии и пропедевтики внутренних болезней. Свердловск, 1966.-С. 14-20.

45. Новиков Н.М. К вопросу о роли продуктов распада эритроцитов в механизме регенерации крови : автореф. дис. . канд. мед. наук / Н.М. Новиков. Свердловск, 1966. - 21с.

46. Новиков Н.М. О влиянии продуктов распада эритроцитов на активность эритрогенина / Н.М. Новиков // Патофизиология и экспериментальная терапия. 1976. — Т.32, №5. - С.33-36.

47. Павлов А.Д. Регуляция эритропоэза: физиологические и клинические аспекты / А.Д. Павлов. М. : Медицина, 1987. - 271с.

48. Павлов А.Д. Регуляция эритропоэза при анемиях и полицитемиях / А.Д. Павлов // Патофизиология и экспериментальная терапия. — 1991. — Т.54, №4. С.57-59.

49. Покровский A.A. Лизосомы / A.A. Покровский, В.А. Тутельян. М. : Наука, 1976.- 123с.

50. Рассохин А.Г. Морфология эритробластических островков костного мозга гематологических больных / А.Г. Рассохин, Ю.М. Захаров, П.Д. Синицын, В.П. Волкова// Архив патологии. 1989. — № 9. — С.61-67.

51. Рассохин А.Г. Эритробластические островки костного мозга и их место в эритроне в норме и при изменении состояния эритропоэза в организме : дис. . д-ра мед. наук / А.Г. Рассохин. Челябинск, 1997.420 с.

52. Самардакова АГ. О продолжительности созревания ретикулоцитов крысы при культивировании in vitro / А.Г. Самардакова, А.Д. Стржижовский // Лабораторное дело. 1967. - №5 . - С. 160-162.

53. Самардакова А.Г. Изучение процесса созревания ретикулоцитов и особенностей его протекания в условиях гипоксии и воздействия ионизирующей радиации : автореф. дис. . канд. мед. наук / А.Г. Самардакова. Москва, 1970. - 20с.

54. Серебряная Б.А. Влияние продуктов гемолиза на образование эритропоэтинаи гемопоэз у собак после острой кровопотери / Б.А. Серебряная, Г.П. Москалёва, H.A. Горбунова // Проблемы гематологии. 1969. -№11.- С.24-28.

55. Сороковая В.И. Стимуляция эритропоэза при кровопотере на фоне беременности с помощью микровезикул из плазмолеммы эритроцитов / В.И. Сороковая, А.П. Милованов, Г.М. Никитина и др. // Архив патологии. 1995. - Т.57, №2. - С.65-68.

56. Сторожок С.А. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства / С.А. Сторожок, А.Г. Санников, Ю.М. Захаров. — Тюмень: Издательство Тюменского государственного ун-та, 1997. — 139с.

57. Твердохлеб В.П. Некоторые вопросы патофизиологии и биохимии ингибитора эритропоэза : автореф. дис. . канд. мед. наук / В.П. Твердохлеб. Челябинск, 1971. - 20с.

58. Тишевская Н.В. Влияние эритропоэтина в различных концентрациях на культуру эритробластических островков / Н.В. Тишевская, Ю.М. Захаров, И.А. Тишевский // Российский физиол. журнал им. И.М. Сеченова. 1998. - Т.84, №12. - С.1412-1419.

59. Ужанский Я.Г. Роль разрушения эритроцитов в механизме регенерации крови/Я.Г. Ужанский. -М. : Медицина, 1949. 184с.

60. Ужанский Я.Г. К вопросу о механизме образования эритропоэтинов / Я.Г. Ужанский // Патофизиология эритропоэза (симпозиум по эритропоэтинам). — Свердловск, 1965. — С. 17-23.

61. Ужанский Я.Г. Физиологические механизмы регенерации крови / Я.Г. Ужанский. -М. : Медицина, 1968. 134 с.

62. Фёдоров H.A. Эритропоэтин / H.A. Фёдоров, М.Г. Кахетелидзе. М. : Медицина, 1973.- 153 с.

63. Филимонов В.И. О патогенезе анемии у больных острой почечной недостаточностью, со спленомегалией у собак : автореф. дис. . канд. мед. наук / В.И. Филимонов. Челябинск, 1968. - 23с.

64. Филимонов В.И. Механизмы торможения эритропоэза ингибитором / В.И. Филимонов // Патофизиология и экспериментальная терапия. 1972. Т.38, №5. - С.33-37.

65. Филимонов В.И. Об ингибиторе эритропоэза при посттрансфузионной полиглобулии / В.И. Филимонов // Механизмы регуляции в системе крови : сб. трудов. Красноярск, 1978. - С.129.

66. Халитова Г.Г. О роли субклеточных фракций почек и селезёнки в механизмах стимуляции и ингибиции эритропоэза : автореф. дис. . канд. биол. наук / Г.Г. Халитова. Москва, 1980. - 24с.

67. Чертков И.Л. Современные представления о кроветворении / И.Л. Чертков, А.И. Воробьёв, М.Д. Бриллиант // Новое в гематологии : сб. науч. тр. М.: Медицина, 1974. - С.7-36.

68. Чертков И.Л. Стволовая кроветворная клетка и её микроокружение / И.Л. Чертков, О.А. Гуревич. М. : Медицина, 1984. - 240 с.

69. Шехтер С.Ю. О возможности образования ингибиторов эритропоэза при железодефицитных анемиях / С.Ю. Шехтер // Проблемы гематологии. 1972. -№17. -С.31-35.

70. Яковлев А.Ю. Моделирование гуморальной регуляции клеточной пролиферации в тканях взрослых животных / А.Ю. Яковлев // Цитология. 1972. - Т. 14, №6. - С.685-698.

71. Ярошевский А.Я. О взаимоотношении стимулирующих и тормозящих эритропоэз факторов / А.Я. Ярошевский, О.И. Моисеева, С.Ю. Шехтер // Патофизиология эритропоэза (симпозиум по эритропоэтинам) : сб. науч. тр. Свердловск, 1965. — С. 9-15.

72. Andrea A.D. Erythropoietin receptor / A.D. Andrea, I.I. Zon // J. Clin. Invest. 1990. - Vol.86, №3. - P.681-687.

73. Attalah A.M. Lymphocyte chaline concentrates and their effekts upon leukemic cells in vitro / A.M. Attalah, J.C. Houck // Boll. ist. sieroterap. Milan. 1975. - Vol.54. - P.227-230.

74. Bateman Ä. Gell specifiti of chalohe-type inhibitors of DNA synthesis released by blood leukocytes and erythrocytes / A. Bateman// Cell. Tissue kinet. 1974. - Vol.7, №5. - P. 451 -461.

75. Bateman A.E. An inhibitor of DNA synthesis in erythrocyte conditioned medium andits separation from haemoglobin / A.E. Bateman; B:0. Goodwin//Biomed. Express. - 1976.- Vol.25. - P:77-80.

76. Bateman A. Effekts of erythrocyte lisate and erythrocyte conditioned-medium on erythroid cells in vitro / A. Bateman, K. Pollokk // Virch. arch. Abt. Cellpath. - 1977. - Vol.25. - P. 171-174. '

77. Ben-Ishay Z. Ultrastructural studies of erythroblastic islands of rat bone marrow. III. Effect of sublethal irradiation / Z. Ben-Ishay, J.M. Yoffey // Lab. Invest.-1974. Vol.30, №2. - P.320-332:

78. Bernand J. The erythroblastic island: past and future / J: Bernand // Blood cells.- 1991. Vol.17. - P: 5-Î4.89: Bern N. Expression of the erythropoietin gene / N. Beru, J. McDonald, C.

79. Lacombe, E. Goldwasser // Moh Cell Biol. 1986. - Vol.6, №7: - P. 25712575:

80. Bessis M. Granules ferrugineux observes^ au microscope electronique dans les cellules de la moelle osseuse et dans les siderocytes / M. Bessis, J. Breton-Gorius // G. R. Acad. sei. - 1956. - Vol. 243. - P. 1235 -1237.

81. Bessis M. L'ilot eruthroblastique unité fonctionelle de la moelle osseuse / M. Bessis //Rev. hematol. 1958: - Vol. 13. - P. 8-11.

82. Bessis M; Cellules du sang normal: et pathologique / M. Bessis. Paris, 1972.-232p.93 .Bessis M. Erythropoiesis: comparison of in vivo and in vitro amplification / M. Bessis, G. Mize,M. Prenant//Blood cells. 1978.-№4.-P. 155-168;

83. Bessis M. Morphology of the erythron / M. Bessis, E. Lessin, E. Beutler// Hematology. New York., 1986. - P. 257-279.

84. Blunt W. Erythropoietic inhibiting factor in red blood cells / W. Blunt, M.

85. Berg // Fed. Proc. Soc. 1960. - Vol. 19. - P.66-70.

86. Breton-Gorius J. Association between leukemic erythroid progenitors and bone marrow macrophages / J. Breton-Gorius, M.N. Vuillet-Gaugler // Blood Cells. 1991. - Vol.17. -P. 127-146.

87. Bruckner V. Blut bildung durch zwei Faktoren / V. Bruckner, F. Zuwietz // Umschau. 1973. - Vol.73. - P.766-770.

88. Chin H. Physical and functional interactions between Stat-5 and the tyrosine-phosphorylase receptors for erythropoietin and interleukin-3 / H. Chin, N. Nakamura, R. Kamiyama et al. // Ibid. 1996. - №12. - P.4415-4425.

89. Crocker P.R. Adhesion receptors involved in the erythroblastic islands / P.R. Crocker, L. Morris, S. Gordon // Blood cells. 1991. - Vol. 17. - P. 83 - 96.

90. Cronkite E.P. Haemopoietic stem cells: concepts and definitions / E.P. Cronkite // Blood Cells. 1979. - Vol.5, №3. - P. 457-459.

91. Epstein E.N. Physiology of renal hipoxia / E.N. Epstein, Y. Agmon, M. Brezis // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. - №718. - P.72-82.

92. Ewen M.E. TGF-pi inhibition of Cdk4 synthesis is linked to cell cycle arrest / M.E. Ewen, H.K. Sluss, L.L. Whitehouse // Cell. 1993. - №74. -P. 1009-1015.

93. Fischer J. Effect of testosterone, cobalt end hypoxia on erythropoietin production in the isolated dog kidney / J. Fischer, J. Langston // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1968. - Vol. 149. - P.75-78.

94. Goldberg M.A. The regulated expression of erythropoietin by two human cell lines / M.A. Goldberg, G.A. Glass et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - №84. - P. 7972-7976.

95. Graham G.J. Identification and characterisation of an inhibitor of hematopoietic stem cell proliferation / G.J. Graham, E.Y. Whicht, R. Heiwick // Nature. 1990. - №344. - P. 442-444.

96. Ihle J.N. Signal transducers and activators of transcription / J.N. Ihle // Cell. 1996.-№84.-P. 331-337.

97. Johnson H.V. Isolation and characteristics of Hela surface proteins / H.V. Johnson, M.J. Griffin // Exptl. Cell Res. 1977. - Vol.109. - P.223-227.

98. Khelif A. Remission of acguired pure red cell aplasia following plasma exchange / A. Khelif, H.V. Van, J.P. Tremisi et al. // Scand. J. Haematol. -1985.-Vol.34, p.13-15.

99. Kiger N. Further purification of the lymphocyte inhibiting extrakt from the thymus / N. Kiger, J. Florentin, G. Mathe // Boll. ist. sieroterap. Milan. -1975. Vol.54. - P.224-228.

100. Kirby S.L. Proliferation of multipotent hematopoietic cells controlled by a truncated erythropoietin receptor transgene / S.L. Kirby, D.N. Cook, W.Walton, O. Smithies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol.93, №18. -P.9402- 9407.

101. Kivalaakso S. The effect of polycythaemic serum on the proliferation of rat bone marrow cells in vitro / S. Kivalaakso, T. Rytomaa // Cell. Tiss. Kinet. 1970. - Vol.3. - P.385-389.

102. Kivilaakso E. The response of RNA synthesis to mitotic regulation in the erythron / E. Kivilaakso // Acta physiol. Scand. 1970. - Vol.80. - P.436-439.

103. Kivalaakso S. Erythrocytic chalone, a tissue specific inhibitor cell proliferation in the erythron / S. Kivalaakso, T. Rytomaa // Cell. Tiss. Kinet. -1971.-Vol.4.-P.l-5.

104. Kivilaakso E. Erythrocytik chalone, a tissue-specific inhibitor of cell proliferation in the erythron / E. Kivilaakso, T. Rytomaa // Cell: Tissue Kinet. 1971.-№4.-P. 1-9.

105. Koff A. Negative regulation of Gi in mammalian cells: Inhibition of cyclin E-dependent kinase by TGF- pi / A. Koff, M. Ohtsuki, K. Polyak // Science. 1993. -№260. - P.536-541.

106. Koury S.T. Localization of cells producing erythropoietin in murine liver by in situ hybridization / S.T. Koury, M.C. Bondurant, M.J. Koury, G.L. Semenza // Blood. -1991.- №77. P. 2497-2503.

107. Kouri M.J. The molecular mechanism of erythropoietin action / M.J. Koury, M.C. Bondurant // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol.210, №3. - P. 649-663.

108. Krantz S. Specific Binding of Erythropoietin to Spleen Cells Infected, with the Anemia Strain of Friend Virus / S. B. Krantz, E. Goldwasser // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. -№81. - P. 7574 - 7578.

109. Krizsa F. Karositott torzsazonos thrombocytak thrombocytopoesist gallo fajlagos hatasa eger kiserletben / F. Krizsa, E. Kelemen, J. Czerhati et al. // Kiserl. Orvostud.- 1977. -Vol.29. -P.512-515.

110. Krzymowski T. Neural and humoral1 regulation of hemopoietic processes in animals. II. Studies on erythropoietic factor obtained from serum in experimental anemia in sheep / T. Krzymowski, H. Krzymowska // Acta Physiol. Pol. 1959. - №10. -P.349-363.

111. Krzymowski T. Studies on the erythropoiesis inhibitory faktor in the plasma of animals with transfusion polycythemia / T. Krzymowski, H. Krzymowska // Blood. 1962. - Vol. 19. - P.38-41.

112. Krzymowski T. The erythropoiesis inhibiting factor and erythropoietin in the regulation of red cell production / T. Krzymowski // Simposium onthe physiology of the hemopoietic system. Olsztyn, 1968. - P.11-15.

113. Krzymowski T. Participation of the erythropoiesis inhibiting factor and erythropoietin in regulation of erythrocytes production / T. Krzymowski // Acta Physiol. Pol. - 1971. - Vol.22. - P.881-885.

114. Kuramochi S. Transmembrane signaling during erythropoietin- and dimethylsulfoxide- induced erythroid cell differentiation / S. Kuramochi, Y. Sugimoto, Y. Ikawa, K. Todokoro // J. Mol. Biol. 1990. - Vol.216, №3.' -P.567-572.

115. Kuramochi S. Transmembrane signaling during erythropoietin- and dimethylsulfoxide- induced erythroid cell differentiation / S. Kuramochi, Y. Sugimoto, Y. Ikawa, K. Todokoro // Eur. J. Biochem. 1990. - Vol.193, № 1. - P. 163 -168.

116. Kuratowska Z. La nature et le mode d'action de l'erythropoietine / Z. Kuratowska // Path. Biol. 1967. - Vol.15. - P.671-675.

117. Kuratowska Z. The renal mechanism of the formation and inactivation of erythropoietin / Z. Kuratowska // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1968. - Vol.149. -P.128-132.

118. Lai P.H. Structural characterization of human erythropoietin / P.H. Lai, R. Everett, F.F. Wang, T. Arakawa, E. Goldwasser // J. Biol. Chem. 1986. -Vol.261, №7.-P. 3116-3121.

119. Lindeman R. Urinary erythropoietic inhibiting factor / R. Lindeman // Lancet. 1970.-Vol.1.-P.781-786.

120. Lindeman R. Erythropoiesis inhibiting factor (EIF). I.Fractionation and demonstration of urinary EIF / R. Lindeman // Brit. J. Haemat. — 1971. -Vol.21.-P.623-630.

121. Lindeman R. Erythropoiesis inhibiting factor in intact and haemolyzed red blood cells / R. Lindeman // Scand. J. Haematol. 1975. - Vol.15.1. P.216-220.

122. Lindemann R. Erythropoiesis inhibiting factors: methodologic studies / R. Lindemann // Blood. - 1978. - Vol.47. - P. 155-163.

123. Lord B.I. Isolation of haemopoietic spleen colony forming cells / B.I. Lord, E. Spooner // Lymphokine Res. 1986. - Vol.5. - P.59-72.

124. Marjama Y. Studies on an inhibitor of erythropoiesis / Y. Marjama, J. Lertora, J. Fisher // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1974. - Vol.l47,№3. - P. 740-743.

125. Marks F.S. Epidermal growth control mechanisms, hyperplasia and tumor promotion in the skin / F.S. Marks // Cancer Res. 1976. - Vol.36, №7. - P.2636-2643.

126. Markson J.L. The anemia of chronic renal insufflsuency: autoradiographic studies in normoblasts cultivated in uremic serum / J.L. Markson, J.M. Moore//Brit. J. Haemat. 1962. - Vol.8. -P.414-418.

127. Matsuoka K. Studies on reticuloendothelial system and hematopoiesis. II.A study on the morphology and function of erytroblastic islet / K. Matsuoka//Acta Med. Okayama. 1965.-Vol.19.-P. 161-176.

128. Means R.T. Inhibition of murine erythroid colony formation in vitro interferon gamma and correction by interferon receptor immunoadhesion / R.T. Means, S.B. Krantz, G. Lina // Blood. 1994. - №83. - P.911-920.

129. Mize C. Etude in vitro de Tamplification au cours de l'erythropoiese du rat / C. Mize, M. Prenant, N. Pourreau, M. Bessis // Nouv. Rev. Er. Hematol. 1977. - Vol. 18, №3. - P. 627 - 631.

130. Mohandas N. Cell-Cell interactions and erythropoiesis / N. Mohandas // Blood cells.-1991.-Vol. 17.-P. 59-64.

131. Moriyama Y. The mechanism and site of action of erythropoietic inhibiting factir in uremia / Y. Moriyama // Israel. J. Med. Sci. 1971. -Vol.7.-P.1012-1018.

132. Parish W.R. The effect on proteins and glycoproteins of Dictyostelium discoideum plasma membranes / W.R. Parish, V. Schmidlin, U. Muller // Exptl. Cell Res. 1977.-Vol.110.-P.267-270.•■■"'■•• 127

133. Paukovits W.R. Mechanism action of granulopoiesis inhibiting factor (chalone) / W.R. Paukovits, J.B. Paukovits // Exptl. Path. 1975. - Vol.10.- P.348-354.

134. Paukovits W.R. Separation, identification: and; mechanisms of action of the granulocytic chalone / W.R. Paukovits, J.B. Paukovits // Boll. ist. sieroterap. Milan. 1975. - Vol.54. - P. 177-182.

135. Policard A. Micropinocytosis and rhopheocytosis / A. Policard, M. Besis // Nature. 1962. - Vol. 194, №4823. - P. 110-111.

136. Rameshwar P. Systemic transforming growth factor-beta in patients with bone marrow fibrosis pathophysiological implications / P. Rameshwar; V.T. Ghang, U.F. Thacker // Amer;'J1 Hemat. - 1998. - №59h-P;163-142:

137. Recny M.A. Structural characterization of natural human urinary and recombinant DNA-derived erythropoietin. Identification of des-arginine 166 erythropoietin / M:A. Recny, H.A. Scoble, Y. Kim II J. Biol. Chem. 1987.- VoL262, №35. P. 17156-17163.

138. Reynafarje G. Humoral regulation of the erythropoietic depression of high altitude polycythemic subjects after return tu sea level / C. Reynafarje //Ann. N;Y. Acad. Sci. 1968. - Vol.149. - P.472-477.

139. Rich; LN. An erythropoietic stimulating factor: similar to, erythropoietin released by macrophages after treatment with silica / I.N. Rich, W. Heit, B; Kubanek // Blut. 1980. - Voll40^ №5. - P.297-303:

140. Rich I.N. The effect of 5-fluoracil on erythropoiesis /I.N. Rich// Ibid. -1989.-№77.-P. 1164-1170.

141. Rich .I;N: Erythropoietin production: a personal view / I.N. Rich // Exp: hematok 1991.- Vol: 19;- P; 985-990.

142. Rich I.N. Introduction: developmental biology of erythropoiesis -Molecular, cellular, and developmental biology of erythropoietin and erythropoiesis / I.N. Rich, T.R.J. Lappin // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. -Vol. 718.-P. 123 - 124.

143. Rogy M.A. Persistently elevated soluble tumor necrosis factor receptor / M.A. Rogy, S.M. Coyle, H.S. Oldenburg // J. Amer. Coll. Surg. 1994. -№178.-P. 132-140.

144. Rytomaa T. Control granulocyte produktion / T. Rytomaa, K. Kiviniemi // Cell Tissue Kinet. 1968. - №1. - P.341-346.

145. Rytomaa T. Role of chalone in granulopoiesis / T. Rytomaa // Brit. J. Haemat. 1973. - Vol:24. - P. 141-146.

146. Rytomaa T. Biology of the granulocyte chalone / T. Rytomaa // Boll. ist. sieroterap. Milan. 1975. - Vol.54. - P. 105-110.

147. Saetren H. A principle of autoregulation of growth production of organs specific mitose-inhibitor in kidney / H. Saetren // Exp. Cell. Res. — 1965. -Vol.11.-P.229-233.

148. Sato T. Erythroid progenitors differentiate and mature in response to endogenous erythropoietin / T. Sato, T. Maekawa, S. Watanabe, K. Tsuji, T. Nakahata // J. Clin. Invest. 2000. - Vol.106, №2. - P.263-270.

149. Sawyer S.T. Erythropoietin stimulates 45Ca2+ uptake in Friend virus-infected erythroid cells / S.T. Sawyer, S.B. Krantz // J. Biol. Chem. 1984. -Vol.259.-P. 2769- 2774.

150. Sawyer S.T. Introduction: the erythropoietin receptor and signal transduction / S.T. Sawyer // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. - №718: -P.185-190.

151. Schalm O.W. Normal values in blood of laboratory, fur-bearing, andmiscellaneous zoo and wild animals / O.W. Schalm, N.C. Jain, E.I. Carroll // Veterinary Hematology. Philadelphia : Lea & Febiger, 1975. - P.235-240.

152. Seip M. Erythropoietic inhibiting factor an erythrocytic chalone / M. Seip // Ann. Clin. Res. - 1971. - Vol.3. - P.3-6.

153. Sitnicka E. Transforming growth factor pi directly and reversibly inhibits the initial cell divisions of long-term repopulating hematopoietic stem cells / E. Sitnicka, F.W. Ruscetti, G.V. Priestley // Blood. 1996. -Vol.88, №l.-P.82-88.

154. Skjaelaaen P. Inhibition of erythropoiesis by plasma from newborn infants / P. Skjaelaaen, S. Halvorsen // Acta paediat. Scand. 1971. -Vol.60.-P.301-306.

155. Sorenson G.D. Elektron microscopic observations of bone marrov from patients with sideroblastic anemia / G.D. Sorenson // Am. J. Pathol. 1962. - №40. - P.296-300.

156. Steck T.L. The organization of proteins in the Human Red Blood Cell Membrane / T.L. Steck // J. Cell. Biol. 1974. - Vol.62, №1. - P. 1-19.

157. Weiss L. Microenvironments in haemopoietic and lymphoid differentiation / L. Weiss. London, 1981. - 215p.

158. Whitcomb W.H. The physiological sugnificance factor appearing in plasma subseguent to hypertransfusion / W.H. Whitcomb, M.Z. Moore // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1968. - Vol.149. - P.462-468.

159. Whitcomb W.H. Influence of polycythemic and anemic plasma on erythrocyte iron incorporation in the plethoric hypoxic mouse / W.H. Whitcomb, M.Z. Moore, J.P. Rhoads // J. Lab. Clin. Med. 1969. - Vol.73. -P.584-589.

160. Whitcomb W.H. Erythropoietic inhibition in polycythemic plasma ' following transfusion or hypoxia / J.W. Fisher, W.H. Whitcomb // Kidneyhormones. London, 1971. - P.461-470.

161. Yang W. SHP-l-phosphotase C-terminus interacts with novel substrates p /p during erythropoietin and interleukin-3 mitogenic responses / W. Yang, M. Tabrizi, K. Berrada et al. // Ibid. 1998. - Vol.91, №10. - P. 3746-3755.

162. Yoffey J. The phagocytic central reticular cell of the erythroblastic island in rat bone marrow: changes in hypoxia and rebound / J. Yoffey, P. Yaffe // J. Reticuloend. Soc. 1980. - Vol.28, №1. - P.37-47.

163. Yoon S.Y. Cellular distribution of platelet-derived growth factor, transforming growth factor-P, basic fibroblast growth factor, and their receptors in normal bone marrow / S.Y. Yoon, A. Tefferi, C.Y. Li // Acta Haematol. 2000. - № 104. - P. 151 -157.

164. Zakharov Y. Technique d'isolement et de culture des îlots erythroblastiques separation du macrophage central / Y. Zakharov, M. Prenant // Nouv. Rev. Fr. Hematol. 1982. - Vol.24, №3. - P. 363-367.

165. Zakharov Y. Influence des surnageants de culture de macrophages provenant des ilôts erythroblastiques sur l'erythropoiese du rat / Y. Zakharov, M. Prenant // Nouv. Rev. Fr. Hematol. 1983. - Vol.25, №1. -P. 17-22.

166. Zhang Y. Tumor necrosis factor (TNF) is a physiologie regulator of hematopoietic progenitor cell / Y. Zhang, A. Harada, H. Bluethmann // Blood. 1995. - Vol.86, №8. - P. 2930-2938.

Информация о работе

Шевяков, Сергей Александрович
кандидата медицинских наук
Курган, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробластических островков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы