Экспериментальные исследования регуляции эритропоэза в культуре эритробластических островков

Тишевская, Наталья Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальные исследования регуляции эритропоэза в культуре эритробластических островков
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальные исследования регуляции эритропоэза в культуре эритробластических островков"

На правах рукописи

Тишевская Наталья Викторовна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГУЛЯЦИИ ЭРИТРОПОЭЗА В КУЛЬТУРЕ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ

03.00.13. - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени, доктора медицинских наук

Курган-2005

Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации» и Южно-Уральском научном центре Российской академии медицинских наук.

Научный консультант: Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Захаров Юрий Михайлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Каюмова Алия Фаритовна доктор медицинских наук, профессор Соловьев Владимир Сергеевич доктор медицинских наук, профессор Тхоревский Виталий Иванович

Ведущее учреждение: Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук (125167, г.Москва, Новозыковский проезд, 4а).

Защита диссертации состоится » июня 2005 года на заседании диссертационного совета Д.208.079.01. в Федеральном государственном учреждении науки Российском научном центре «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А. Илизарова по адресу: 640014, г.Курган, ул. М.Ульяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А. Илизарова (640014, г.Курган, ул. М.Ульяновой, 6).

Автореферат разослан «Л 0» мая 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

А.Н. Дьячков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

В последние десятилетия большая роль в регуляции эритропоэза отводится межклеточным взаимодействиям, которые обеспечивают адгезию эрит-роидных клеток к экстрацеллюлярному матриксу, облегчают дифференциацию и созревание клеток эритроидной линии, способствуют связыванию сигнальных молекул со специфическими рецепторами на клеточной поверхности. В то же время подавляющее большинство работ в области экспериментальной гематологии направлено на изучение регуляции самых ранних этапов развития кроветворной ткани - стволовых и полустволовых кроветворных клеток, а также поли- и бипотентных клеток-предшественниц. Однако синтез гемоглобина, функциональная перестройка ферментных систем, характерная для зрелых эритроидных клеток, процесс денуклеации нормобластов происходят в терминальной стадии эритропоэза. Нарушения процессов дифференциации и созревания эритроидных элементов на отрезке «колониеобразующая единица эритроцитарная-ретикулоциты» могут привести к возникновению ряда гематологических заболеваний. Так, высокая активность гемоксигеназы в КОЕэ препятствует гемоглобинезации клеток и замедляет образование эритробла-стов, что является одной из причин развития сидеробластной анемии (Ibraham N.G., 1985), ускорение созревания эритробластов приводит к формированию вторичных эритроцитозов, а замедление дифференциации базофильных эритробластов в полихроматофильные в ЭО является одним из механизмов патогенеза апластической анемии (Коробкин A.B., 1988). В связи с этим, изучение механизмов регуляции финальных этапов эритропоэза представляется чрезвычайно актуальным, так как расширит наши представления о патогенезах болезней системы кроветворения, сопровождающихся как депрессией эритро-идного ростка в костном мозге, так и его активацией.

На современном этапе развития экспериментальной гематологии особенно актуальным и перспективным является создание и внедрение в практи-

- эти

ку изучения кроветворения методов культуры нлМОс КДЦЮ)г*ЛШ|

I SHMHOTEM 1

• о»

разработки позволяют перевести фундаментальные исследования воздействия гуморальных регуляторов гемопоэза на качественно новый уровень, так как дают возможность изучения непосредственного влияния биологически активных веществ на кроветворные клетки, а также роли межклеточных взаимодействий в кроветворении. При изучении развивающихся клеток конкретного кроветворного ряда наиболее предпочтительным является культивирование уже коммитированных клеток-предшественниц, которые при адекватной стимуляции сформируют все пролиферирукицие и созревающие элементы клеточной линии. Такая система была создана Ю. Захаровым и М. Прена, разработавшими в лаборатории М. Бессиса технику культивирования эритробла-стических островков костного мозга (Zakharov Y.M., Prenant M., 1982, 1983). Предварительное выделение ЭО из ткани костного мозга и адгезия их на поверхности культурального сосуда позволяет получить совокупность эритроидных клеток, ассоциированных с макрофагами, в монослое, лишенном стромальных элементов, что исключает возможное зритропоэзиндуцирующее или ингибирующее действие фибронектина, коллагена, фибробластов, адипоцитов и т.д. При сравнительном анализе качественного состава ЭО была установлена идентичность распределения островков по классам зрелости в костном мозге здоровых людей и интактных лабораторных животных (белых беспородных крыс и крыс линии Вистар): большую часть популяции ЭО костного мозга человека и указанных лабораторных животных составляют островки, имеющие зрелую эршроидную «корону», а также реконструирующиеся ЭО, обеспечивающие поддержание должного уровня эритроцитов в крови за счет развития новой волны эритропоэза в «короне» инволюцирующих островков (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002). В связи с этим, изучение закономерностей межклеточных взаимодействий в ЭО, интенсивности пролиферации, дифференциации и созревания эритроидных клеток в них позволит раскрыть ранее неизвестные стороны регуляции костномозгового эритропоэза, а также выявить природу нарушений развития эритроидного ростка кроветворения, что является важной и актуальной проблемой современной экспериментальной и клинической гематологии.,, , , ,*

Цель исследования: определение закономерностей течения эритропоэза в культуре эритробластических островков, создание модели физиологического и компенсационного эритропоэза in vitro, изучение значения межклеточных взаимодействий в эритробластических островках для регуляции развития эритроидных клеток.

Задачи исследования:

1. Изучить характер зависимости состояния эритропоэза в культуре ЭО от количества эритропоэтина в культуральной среде и длительности культивирования островков. Определить дозы эритропоэтина, необходимые для поддержания эритропоэза в культуре ЭО на физиологическом уровне и дозы, стимулирующие эритропоэз in vitro на уровне компенсационного.

2. По продолжительности митотического цикла и интенсивности созревания эритроидных клеток в «короне» ЭО, изменению фагоцитарной активности центральных макрофагов островков выявить закономерности развития ЭО, культивируемых в присутствии разных доз эритропоэтина.

3. Исследовать динамику количественного и качественного состава культур ЭО, а также изменения продолжительности митотического цикла эритроидных клеток «короны» островков при дозозависимой стимуляции функций центральных макрофагов островков макрофагальным колониестимулирую-щим фактором.

4. Оценить возможный характер регуляторных воздействий катехоламинов на эритропоэз в культуре ЭО по изменению клеточного состава эритроидной «короны» ЭО, динамике пролиферативной активности эритробластов и изменению фагоцитарной функции центральных макрофагов ЭО.

5. Изучить закономерности взаимодействий культивируемых ЭО с клетками других гемопоэтических линий, проанализировать изменения клеточного состава ЭО при стимуляции и угнетении эритропоэза в культуре островков.

6. Исследовать в культуре ЭО дозозависимое действие фракций «средних молекул», выделенных из плазмы интактных и обожженных животных, на

процессы пролиферации эритроидных клеток и характер межклеточных взаимодействий в «короне» островков.

7. Создать математические модели эритропоэза in vitro.

Научная новизна. Впервые in vitro изучены закономерности развития эритробластических островков различных классов зрелости при культивировании ЭО костного мозга интактных животных в присутствии эритропоэтина в культуральной среде в дозах от 0,06 до 1,5 МЕ/мл. Установлено, что культура ЭО - это оригинальный способ моделирования физиологического и компенсационного эритропоэза. Добавление в культуральную среду 0,25-0,5 МЕ/мл эритропоэтина приводит к формированию новых ЭО в культуре как на базе контакта КОЕэ с резидуальными макрофагами, так и на основе взаимодействия КОЕэ с «короной» инволюциругощих островков в объемах, соответствующих физиологическому уровню развития ЭО в костном мозге. Увеличение количества эритропоэтина в культуральной среде до 1-1,5 МЕ/мл приводит к резкому всплеску пролиферативных процессов в «короне» ЭО в первые 48 часов культивирования, что соответствует картине ответа эритроидной ткани при компенсационном эритропоэзе.

Впервые при изучении эритропоэза in vitro для эритроидных клеток «короны» ЭО пролиферирующих классов (ЭО 1, 2 классов зрелости и реконструирующихся ЭО) рассчитана продолжительность митотического цикла (tc), включающего в себя фазы Gb S, G; и М, а также получены данные об изменении генерационного времени способных к делению эритроидных клеток при стимуляции эритропоэза в культуре эритропоэтином и модуляции процесса развития эритроидной «короны» ЭО колониестимулирующим фактором мак-рофагальным, катехоламинами, фракциями «средних молекул», выделенными из плазмы интактных и обожженных животных.

тропоэза in vitro. Впервые с целью оптимизации работы по изучению интенсивности пролиферативного ответа культур ЭО на действие эритропоэзинду-цирующих и ингибирующих развитие эритроидного ростка кроветворения факторов в ходе экспериментального исследования применен последовательный критерий отношения правдоподобия (критерий Вальда).

Получены новые данные об изменении фагоцитарной способности центральных макрофагов культивируемых ЭО под влиянием возрастающих концентраций эритропоэтина в культуральной среде. Доказано, что при стимуляции эритропоэза активность и интенсивность фагоцитарной реакции центральных макрофагов островков увеличивается на этапе образования ассоциации «макрофаг+КОЕэ», а не только в ЭО, имеющих зрелую эритроидную «корону», как было показано ранее при исследовании фагоцитарной способности центральных макрофагов ЭО костного мозга, выполненном в условиях стимулированного эритропоэза (Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П., 1992,1997).

Впервые установлено, что специфическая стимуляция функций центральных макрофагов ЭО макрофагальным колониестимулирующим фактором сопровождается торможением пролиферативной активности и удлинне-нием продолжительности митотического цикла эритроидных клеток их «короны».

Впервые показано, что терминальные стадии эритропоэза, происходящие в эритробластических островках, контролируются медиаторами симпатического отдела вегетативной нервной системы. Введение в культуральную среду норадреналина вызывает выраженную активацию пролиферативных процессов в ЭО в первые сутки культивирования, а эритропоэзстимулирую-гций эффект адреналина начинает проявлять себя только через 72 часа.

Получены новые данные о влиянии веществ полиэлектролитной природы с молекулярной массой от 0,5-1,5 кДа на эритропоэз. Установлено, что бы-строэлюируемые фракции «средних молекул», выделенные из крови интакт-ных животных, обладают разнонаправленным действием на процессы дифференциации, пролиферации и созревания эритроидных клеток в ЭО, что по-

видимому, создает определенный баланс между эритропоэз-стимулирующим и эритропоэзтормозящим действием среднемолекулярных веществ полиэлектролитной природы. Фракции «средних молекул», выделенные из крови обожженных животных и обладающие выраженными проксидантными свойствами, угнетают развитие эритроидных клеток, а к 72 часу культивирования вызывают полный лизис культур.

Впервые при исследовании культуры ЭО получены данные о характере изменений состава лейкоцитарных клеток, взаимодействующих с «короной» островков. Показано, что лимфоидные клетки вступают в контакт исключительно с ЭО пролиферирующих классов зрелости. При стимуляции эритропо-эза частота контактов молодых ЭО с лимфоидными клетками увеличивается, при торможении пролиферативных процессов в культуре - уменьшается. Присутствие лимфоидных клеток в «короне» культивируемых ЭО, морфологически неотличимых от КОЕэ, объясняет факт самообновления культуры, так как только при наличии колониеобразующих единиц, дающих начало эритро-идному ростку, происходит процесс новообразования островков. Показано также, что по мере созревания эритроидных клеток увеличивается частота контактов «короны» ЭО с нейтрофильными и эозинофильными гранулоцита-ми.

Практическая значимость работы. Метод исследования эритропоэза в культуре ЭО представляет собой тест-систему, позволяющую моделировать различные физиологические и патологические состояния центрального звена эритрона вне организма при дозированном изменении исходных параметров в культуре ЭО, а также при введении в культуральную среду различных гормонов, цитокинов, ростовых факторов, лекарственных веществ. Использование математической модели развитая эритропоэза в культуре ЭО значительно сокращает трудоемкость предварительных этапов экспериментов, а также материальные затраты на них. На примере тестирования эритропоэтина, произведенного двумя различными фирмами, в работе продемонстрированы возмож-

ности исследования эффективности действия цитокинов на эритропоэз в культуре ЭО.

Данные об ингибирующем влиянии фракций «средних молекул», выделенных из крови обожженных животных, на эритроидную ткань раскрыли новые механизмы возникновения ожоговой анемии, упорный характер течения которой часто осложняет период реабилитации больных с обширными термическими поражениями.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Культура ЭО представляет собой экспериментальную модель физиологического и компенсационного эритропоэза. Эритропоэз в культуре ЭО, подобно костномозговому эритропоэзу in vivo, сохраняет чувствительность к нервной и гуморальной регуляции, что свидетельствует о сохранности рецеп-торных и секреторных свойств у центральных макрофагов островков и эрит-роидных клеток их «короны», а также пролиферативного потенциала эритро-идных клеток-предшественниц.

2. Модуляция поддерживающих эритропоэз свойств центральных макрофагов ЭО макрофагальным колониестимулирующим фактором сопровождается угнетением пролиферативных процессов в эритроидных клетках «короны» эритробластических островков. Катехоламины стимулируют пролифератив-ную активность эритроидных клеток и уменьшают продолжительность их ми-тотического цикла. Фракции «средних молекул», выделенные из плазмы обожженных животных, угнетают эритропоэз в ЭО, что подтверждает их важную роль в патогенезе ожоговой анемии.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на XVII и XIX съездах физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998; Екатеринбург, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения академика И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999), международной научной конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Челябинск,2001), III Всероссийской научно-

практической конференции с международным участием «Инжиниринг в медицине» (Челябинск,2002), научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (г.Трехгорный, 2003), международном научном симпозиуме "Югра-ГЕМО" (Ханты-Мансийск,2004), научной сессии, посвященной 60-летию Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск,2004), III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуля-ционная патология органов и систем» (Москва,2004), межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные вопросы патологии", посвящён-ной 70-летию кафедр патологической анатомии и патофизиологии Башкирского государственного медицинского университета (Уфа,2004), международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), неоднократно доложены на заседаниях Челябинского отделения Всероссийского физиологического общества им. академика И.П. Павлова и кафедры нормальной физиологии Челябинской государственной медицинской академии.

Основные положения работы освещены в 24 научных публикациях. С 2001 по 2003 гг. исследования проводились при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (р2001 урчел - 0417: «Молекулярные и клеточно-клеточные механизмы регуляции эритропоэза в эритроб-ластических островках костного мозга).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 286 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследования, 5 глав результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы, включающего 457 источников (отечественных - 124, иностранных - 333). Работа иллюстрирована 72 таблицами и 39 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы я методы исследования.

Выделение ЭО из костного мозга бедренных костей производилось по методике, предложенной Ю.М. Захаровым, А.Г. Рассохиным, И.Ю. Мельниковым (1984) и являющейся модификацией методических приемов, впервые разработанных в 1975г. У.Ье СЬагрепйег и М.Ргепагй. Культивирование ЭО проводили по методу Ю.М. Захарова и М. Прена (1982). С этой целью костномозговую взвесь, содержащую ЭО и полученную в результате промывания канала бедренной кости 1,5 мл препаративной среды, с помощью дозатора размещали на поверхностях чашек Петри. После 30-минутной инкубации костномозговой взвеси в газопроточном термостате при температуре 37°С, относительной влажности 95% и содержании СОг - 4,5% монослой адгезировав-шихся ЭО отмывали средой ЯРМ1-1640 или Р-12. Далее чашки Петри заполняли кулыуральной средой, с помощью микродозатора в них добавляли исследуемые биологически активные вещества и помещали в газопроточный термостат, работающий в указанном выше режиме. В состав культуральной среды входили: среда 11РМ1-1640, эмбриональная телячья сыворотка, гепарин, антибиотики, 2-меркаптоэтанол, Ь-глютамин, бикарбонат натрия. В зависимости от задач эксперимента культивирование ЭО производилось в течение 24120 часов. Для текущего контроля жизнеспособности культуры с помощью фазово-контрастной микроскопии (по М. Ве8Б18, 1976) использовался инвертированный микроскоп «Биолам П-1».

В препаратах культур ЭО определяли общее количество островков на 1 см2 поверхности культурального сосуда и распределение их по классам зрелости, пользуясь классификацией, предложенной Ю.М. Захаровым и соавт. (1990). К 1-му классу зрелости относили островки, «корона» которых была представлена проэритробластами, эритробластами и базофильными нормобластами с числом клеток от 2 до 8; к 2-му классу - ЭО, "корона" которых была представлена базофильными и ранними полихроматофильными нормобластами с числом

клеток от 9 до 16; к 3-му классу - островки с 17-32 клетками, среди которых встречались средние и поздние полихроматофильные нормобласты, оксифильные нормобласты и ретикулоциты; островки с поздними полихроматофильными, ок-сифильными нормобластами, ретикулоцитами в «короне» и числом ядросодер-жащих клеток менее 16 относили к классу инволюцирующих ЭО; реконструирующиеся островки представляли собой инволюцирующие ЭО с присоединившими к их "короне" молодыми способными к делению эритроидными клетками, - проэритробластами, эритробластами и/или базофильными нормобластами. Помимо элементов эритроидного ряда оценивалось число клеток других гемопо-этических линий, взаимодействующих с «короной» ЭО: лимфоидных, клеток нейтрофильного ряда и эозинофильных гранулоцитов. Частота контактов «короны» ЭО с указанными клетками выражалась в процентном количестве островков, имеющих подобные взаимодействия, или количеством клеток неэрит-роидных линий, находящихся в составе «короны» ЭО.

Для изучения пролиферативной активности эритроидных клеток, входящих в состав «короны» эритробластических островков, за 4 часа до окончания эксперимента в культуральные сосуды вносили колхицин (из расчета 0,1 мкг на 1 мл среды культивирования) (Мамаева С.Е., 1988; Мосягина E.H., 1976). Статмокинетический индекс рассчитывали как количество митозов на 1000 ядросодержащих и способных к делению эритроидных клеток островков 1 класса зрелости, 2 класса зрелости и реконструирующихся островков. Продолжительность митотического цикла (tc), включающего в себя фазы Gj, S, G2 и М, определялась по формуле (Епифанова О.И., 1973; Мосягина Е.Н., 1976; Козинец Г.И., 1982):

tc = kx tk/si,

где к - коэффициент 1000, рекомендуемый авторами для равновесной клеточной популяции;

tfc- время действия колхицина в часах; si - статмокинетический индекс в °/оо

Для изучения фагоцитарной активности центральных макрофагов эритробластических островков за 1 час до окончания эксперимента в культу-ральные сосуды вносили взвесь частиц полистирольного монодисперсного латекса диаметром 0,77 мкм (концентрация - 10® частиц в 1 мл культуральной среды, из расчета 50 частиц латекса на 1 центральный макрофаг) (Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П., 1992,1997). Активность фагоцитоза рассчитывали как процентное отношение центральных макрофагов, проявляющих фагоцитарную реакцию, к числу всех центральных макрофагов в культуре эритробластических островков. Интенсивность фагоцитоза или удельную фагоцитарную активность определяли по количеству частиц латекса, поглощенных каждым центральным макрофагом островков различных классов зрелости.

При статистической обработке полученных результатов использовались: последовательный критерий отношения правдоподобия (критерий Вальда), критерий Колмогорова-Смирнова как метод оценки интегральных различий между опытными и контрольными группами исследуемых показателей; одно-факторный дисперсионный анализ (критерий Джонкхиера) и одномерный двухфакторный дисперсионный анализ на основе обобщенной линейной модели неполного ранга (множественный классификационный анализ); для построения математических моделей был применен метод многомерной нелинейной регрессии. Все статистические расчеты были выполнены с помощью лицензионных статистических пакетов программ: SPSS 12.1, STATISTTCA for Windows 5.5, STADIA 6.3 prof, в Центре математической и статистической поддержки медицинских исследований при ЧелГМА (зав. Центром - доцент ЧелГМА, к.т.н. А.А. Болотов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На основании результатов описательной статистики нами были построены дозозависимые кривые, иллюстрирующие длительность сохранения параметров эритропоэза в культуре на уровне, близком к исходному, то есть к

состоянию развития эритроидных клеток в ЭО костного мозга интактных животных. Сравнивая показатели общего количества ЭО на поверхности куль-турального сосуда (рис.1), можно утверждать, что минимальные концентрации эритропоэтина (0,06 и 0,12 МЕ/мл) увеличивали срок переживания ЭО по сравнению с культурой, лишенной эритропоэтина, на 24 часа. Добавление 0,25 МЕ/мл эритропоэтина в культуральную среду способствовало сохранению общего числа ЭО в культуре более 1000/см2 в течение 72 часов. Однако, наилучшие, т.е. стабильно близкие к физиологическим условиям, показатели регистрировались в культурах, содержащих 0,5 и более МЕ/мл эритропоэтина. Использование в эксперименте 0,5, 1 и 1,5 МЕ\мл этого стимулирующего развитие эритроидных клеток гормона позволило получить устойчивую популяцию культивируемых ЭО, количество которых к 120 часу исследования составляло 90% от исходного уровня.

-ОМЕ/мл --0,06 МЕ/мл -0,12 МЕ/мл - - - 0,25 МЕ/мл

-0,5 МЕ/мл — - 1 МЕ/мл 1,5 МЕ/мл

Рис. 1. Влияние эритропоэтина на динамику общего количества ЭО в культуре

Минимальная доза эритропоэтина в культуральной среде (0,06 МЕ/мл) не возбуждала пролиферативных процессов в ЭО, и созревание эритробластов в них происходило в течение 2-3 суток.Эритропоэтин в количестве 0,12 МЕ/мл слабо воздействовал на комплексацию КОЕэ с резидуальными макрофагами, но более интенсивно стимулировал этот процесс в отношении центральных макрофагов инволюцирующих островков. Формирование ЭО на основе контакта КОЕэ с резидуальными макрофагами костного мозга отчетливо начиналось с применения эритропоэтина в дозе 0,25 МЕ/мл и достигало значений, близких к физиологическим, при использовании дозы 0,5 МЕ/мл.

Важно отметить, что эритропоэз в культуре, получившей 0,5 МЕ/мл эритропоэтина, по совокупности всех показателей менее всего отличается от эритропоэза, протекающего в физиологических условиях in vivo. Дальнейшее увеличение дозы эритропоэтина, добавляемого в культуральную среду непосредственно перед культивированием, вызывает всплеск пролиферативных процессов в «короне» островков, происходящий уже в первые сутки. Если в культурах, имеющих менее 1 МЕ/мл эритропоэтина, прирост числа островков пролиферирующих классов обеспечивается, в основном, реконструкцией эритропоэза в инволюцирующих островках, то использование 1 и 1,5 МЕ/мл в течение 24 часов не только стимулирует процессы реконструкции, но и достаточно активно возбуждает в культуре эритропоэз de novo. Однако после 48 часов культивирования с 1 и 1,5 МЕ/мл эритропоэтина интенсивная пролиферация эритроидных клеток в ЭО сменяется терминальной дифференциацией и созреванием эритробластов.

Вопрос о преимущественном влиянии дозы эритропоэтина или длительности культивирования на развитие островков в культуре был решен посредством множественного классификационного анализа. Было установлено, что изменение общего количества ЭО и числа инволюцирующих островков в культуре от дозы эритропоэтина зависит больше, чем от длительности культивирования. В то же время на интенсивность развития ЭО 2 и 3 классов в большей степени влияет время роста культуры, а для успешного осуществле-

ния процесса реконструкции эритропоэза одинаково значимы и концентрация эритропоэтина, внесенного в культуральную среду, и длительность культивирования.

В результате проведенных нами исследований по изучению влияния возрастающих концентраций эритропоэтина на интенсивность течения эритропоэза в культуре ЭО было установлено, что центральные макрофаги инво-люцирующих островков способны формировать новые ЭО в присутствии небольших доз этого специфического для эритроидных клеток гормона (0,12 и 0,25 МЕ/мл) на протяжении 72-96 часов культивирования ЭО. Данный факт свидетельствует о том, что субпопуляция макрофагов, ранее взаимодействовавших с эритроидной тканью, более чувствительна к эритропоэтическому стимулу, чем резидуальные макрофаги костного мозга, фенотипически также способные к созданию эритропоэтического микроокружения. Поэтому можно полагать, что поддерживающие эритропоэз свойства субпопуляции макрофагов костного мозга, обладающих избирательно высоким сродством к клеткам эритроидной линии, развиваются по мере их вовлечения в клеточно-клеточный контакт с эритроидными клетками-предшественницами. Возможно, это является следствием продолжающейся дифференциации моноцитов-макрофагов после их взаимодействия с КОЕэ и эритроидными клетками, ориентированной на создание эритропоэтического микроокружения в костном мозге. Подобная картина наблюдается в костном мозге животных и человека в условиях нормально протекающего эритропоэза, когда при небольшой физиологической концентрации эритропоэтина поддержание уровня эритроцитов в периферической крови обеспечивается, в основном, продуктивной функцией реконструирующихся ЭО (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002).

(табл.1) и меньшая продолжительность митотического цикла (табл.2) эритро-идньпс клеток «короны» эритробластических островков 1 класса зрелости, по сравнению с островками 2 класса зрелости, отчетливо отражают особенность клеточного состава корон этих классов ЭО.

Таблица 1.

Статмокинетические индексы (в %о) эритроидных клеток в «короне» ЭО при добавлении в культуры эритропоэтина

Фон 0,25 МЕ/мл 0,5 МЕ/мл 1,0 МЕ/мл

ЭО 1 класса 187,9 ±4,2 200,0 ±3,4 264,0 ±6,7 354,7 ±11,6

р=0,1344 р=0,0331 р=0,0075

ЭО 2 класса 94,0 ±3,6 101,2 ±3,5 142,7 ±2,8 129,2 ±4,4

р=0,7513 р=0,0273 р=0,0316

ЭО рек. 207,5 ± 4,4 273,4 ±3,3 304,0 ± 4,9 441,3 ±8,1

р=0,0157 р=0,0084 р=0,0020

Примечание: р - уровень значимости критерия Колмогорова-Смирнова; р<0,05 означает наличие различий между количеством ЭО в костном мозге интактных животных (фон) и количеством ЭО в культуре.

Таблица 2.

Влияние эритропоэтина на продолжительность митотического цикла (в часах) эритроидных клеток «короны» ЭО

Фон 0,25 МЕ/мл 0,5 МЕ/мл 1,0 МЕ/мл

ЭО 1 класса 21,36 ±0,47 20,05 ± 0,33 15,24 ±0,38 11,4 ±0,44

р=0,8344 р=0,0423 р=0,0234

ЭО 2 класса 43,09 ± 1,58 39,75 ± 1,02 28,13 ±0,56 31,32 ±1,18

р=0,0512 р=0,0267 р=0,0364

ЭОрек. 19,35 ± 0,41 14,65 ±0,18 13,19 ±0,22 9,09 ±0,17

р=0,0368 р=0,0307 р=0,0175

Примечание: см. табл. 1.

Эритроидные клетки, входящие в состав ЭО 1 класса, представлены преимущественно проэритробластами и базофильными эритробластами, имеющими меньшую продолжительность митотического цикла в сравнении с клетками «короны» ЭО 2 класса (ранними полихроматофильными эритробластами), величина статмокинетического индекса которых меньше, чем у более молодых эритроидных клеток.Наиболыная митотическая активность эритроидных клеток отмечалась в реконструирующихся ЭО, укорочение продолжительности митотического цикла и нарастание числа митозов в «короне» которых наблюдалось при культивировании островков с 0,25 МЕ/мл эритропоэтина, тогда как эритроидные клетки островков 1 и 2 классов зрелости реагировали повышением пролиферативной активности только в ответ на присутствие в культу-ральной среде 0,5 и 1 МЕ/мл эритропоэтина. Это также подтверждает наш тезис о том, что центральные макрофаги ЭО рек. создают более активное в отношении развития эритроидных клеток индуцирующее микроокружение. Большие значения статмокинетического индекса и меньшая продолжительность митотического цикла в эритроидных клетках «короны» реконструирующихся островков, по сравнению с клетками «короны» ЭО 1 класса зрелости, может иметь следующее объяснение: во-первых, в течение 24 часов культивирования реконструкция эритропоэза на базе инволюцирующих островков успевает осуществляться в ходе первых «волн» удвоения и дифференциации клеток, возникающих после комплексации КОЕэ к «короне» инволюцирующих островков: проэритробласт —> эритробласт, имеющих наиболее «скоростные» характеристики пролиферативного цикла. В то же время базофильные эритробласты, также входящие в состав «короны» эритробластических островков 1 класса зрелости, имеют ббльшую продолжительность митотического цикла по сравнению с проэритробластами реконструирующихся ЭО. Во-вторых, центральные макрофаги реконструирующихся островков обладают более выраженными эритропоэтаческими свойствами по сравнению с центральными макрофагами ЭО 1 класса зрелости за счет секреции сульфатиро-ванных гликозаминогликанов (хондроитинсульфата, гепарансульфата) (Хар-

ченко М.Ф., 1994,1995,1996) и эритропоэтина (гаИишу У.М., Ргепагй. М., 1983), что усиливает эффект внесенного в культуру эритропоэтина на пролиферацию клеток в «короне» ЭО.

Поскольку развитие клеток эритроидной линии в островках поддерживается регуляторными влияниями центральных макрофагов, эритропоэтиче-ская стимуляция культур ЭО отразилась и на функциональной активности этого центрального звена островкового эритропоэза: эритропоэтин дозозави-симо стимулировал фагоцитарную способность центральных макрофагов ЭО

при 24-часовом культивировании (рис.2, табл.3). %

100

количество эритропоэтина (МЕ/мл)

Рис. 2. Влияние эритропоэтина на активность фагоцитоза частиц латекса центральными макрофагами в культуре ЭО * - достоверность различий между фоновыми и опытными показателями (по критерию Колмогорова-Смирнова)

Природа этого явления, несомненно, связана со значительной перестройкой функций центральных макрофагов, так как через 24 часа от начала культивирования в «короне» островков отмечались выраженные признаки интенсификации эритропоэза в «короне» ЭО, закономерно сопровождающиеся усиленной денуклеацией ядер нормобластов. Однако изменение фагоцитарной активности оказывается равновыраженным и в макрофагах, образовавших эритробластические островки de novo (островки 1 класса зрелости), и в мак-

рофагах, уже имеющих эритроидную развитую «корону» (ЭО 3 класса, инво-люцирующие ЭО и реконструирующиеся островки). Подобное увеличение фагоцитарной активности центральных макрофагов островков всех классов зрелости было отмечено ранее в костном мозге интактных и полицитемичных крыс при внутрибрюшинном введении эритропоэтина (Захаров Ю.М., Вары-паеваЛЛ., 1992,1997).

Таблица 3.

Влияние эритропоэтина на интенсивность фагоцитоза частиц латекса центральными макрофагами ЭО

Интенсивность фагоцитоза

ЭО 1 класса ЭО 2 класса ЭО 3 класса ЭО инв. ЭО рек.

фон 0,8±0,2 1,2±0,2 2,2±0,1 1,3±0,1 0,6±0,2

ОМЕ/мл 1,3±0,4 2,5±0,6 4,6±0,8 3,3±0,5 3,4+0,6

р=0,0794 р=0,0932 р=0,0304 р=0,0271 р=0,01 10

0,25 МЕ/мл 2,2±0,6 3,4±0,6 3,9±0,4 3,9±0,7 2,9±0,5

р=0,0205 р=0,0331 р=0,0227 р=0,0216 р=0,0302

0,5 МЕ/мл 4,1 ±0,6 6,1±0,7 12,7±1,4 10,4±1,6 13,6±1,9

р=0,0118 р=0,0209 р=0,0013 р=0,0144 р=0,0026

1 МЕ/мл 8,2+0,7 7,9±0,5 16,0±1,0 13,6±1,9 9,1+0,9

р=0,0082 р=0,0065 р=0,0014 р=0,0055 р=0,0074

Усиление фагоцитарной активности центральных макрофагов под влиянием эритропоэтина имеет большое функциональное значение, так как созревание эритроидных клеток в «короне» островков предполагает утилизацию их ядерного материала, а при неэффективном эритропоэзе - всех клеточных структур островков, и наши исследования показали, что в культуре ЭО этот процесс начинает интенсифицироваться сразу после образования клеточных ассоциаций «макрофаг + КОЕэ».

При исследовании ЭО костного мозга интактных животных было обнаружено, что «корона» 9,2±0,7 % из них содержит лимфоидные клетки, 27,8±2,2% - нейтрофильные гранулоциты, 30,4±2,5% - эозинофильные грану-лоциты. Нами не ставилась задача точного подсчета количества клеток «белого» ряда, содержащихся в каждом островке, но необходимо отметить, что та-

кие ЭО имели в составе своей «короны», как правило, 1-2 лимфодные клетки, или 1-2 эозинофильных гранулоцита, и/или от 2 до 6 клеток нейтрофильного ряда (миелоциты, метамиелоциты, палочко- и сегментоядерные нейтрофилы), т.е. часть ЭО имела в своей «короне» как эозинофильные, так и нейтрофиль-ные гранулоциты. Такие же клетки «белого» ряда обнаруживались в полях зрения и вне островков. Изучение распределения островков по классам зрелости показало, что среди ЭО всех классов чаще всего с лимфоидными клетками контактировали островки 1 -го класса и реконструирующиеся ЭО (табл.4).

Таблица 4.

Процентное содержание ЭО с неэритроидными клетками в «короне» в костном мозге интактных животных

С лимфоидными С нейтрофильными С эозинофильны-

клетками в «ко- гранулоцитами в ми гранулоцита-

роне» «короне» ми в «короне»

ЭО 1 класса 33,2 ±1,3 0 0

ЭО 2 класса 11,8 ±1,2 0 0

ЭО 3 класса 0 7,4±1,1 23,6±2,8

ЭО инв. 0 52,3±4,3 46,4±3,2

ЭО рек. 25,1 ±2,3 12,4±1,5 5,7±0,9

Примечание: За 100% принято все количество ЭО указанного класса зрелости

Островки 2-го класса с лимфоидными клетками в «короне» встречались в 2-3 раза реже, чем ЭО 1 класса и ЭО рек., также содержащие лимфоидные клетки. Важно отметить, что лимфоидные клетки никогда не встречались в составе «короны» зрелых островков (ЭО 3 класса и ЭО инв.) костного мозга интактных животных. Эозинофильные и нейтрофильные гранулоциты, напротив, чаще всего встречались в инволюцируюгцих островках и островках 3 класса. Кроме того, и некоторое количество реконструирующихся островков содержало в своей «короне» нейтрофильные и эозинофильные гранулоциты. Через 24 часа культивирования ЭО в присутствии разных доз эритропоэтина во всех

культурах достоверно увеличилось процентное содержание островков, контактирующих с лимфоидными клетками (табл.5).

Таблица 5.

Влияние эритропоэтина на процентное количество ЭО, содержащих лимфоидные клетки в «короне»

Количество эритропоэтина 0,25 МЕ/мл 0,5 МЕ/мл 1 МЕ/мл

24 часа культивирования

ЭО 1 класса 26,4 ± 3,1 28,3 ± 1,6 27,6 ± 2,4

ЭО 2 класса 12,2 ± 1,2 14,3 ± 0,9 13,5 ± 1,6

ЭО 3 класса 9,2 ±1,1 13,1 ± 1,7 12,8 ±0,8

ЭО инв. 1,2 ±0,1 2,0 ± 0,3 2,2 ± 0,5

ЭО рек. 37,1 ± 1,4* 41,4 ±2,5* 40,0 + 3,1*

72 часа культивирования

ЭО 1 класса 39,9 ± 2,3* 43,6 ± 4,7* + 44,9 ±2,1* +

ЭО 2 класса 10,8 ±1,7 16,6 ± 1,8 17,2 ±2,4

ЭО 3 класса 8,4 ± 0,9 15,5 ±2,2 16,5 ± 3,3

ЭО инв. 2,1 ±0,3 6,9 ± 0,8 + 5,8 ± 0,7 +

ЭО рек. 36,6 ± 1,9* 42,3 ± 3,3* 51,1 ±3,8* +

Примечание к табл 5' «*» - наличие интегральных различий между показателями интакт-ных животных и опытными показателями в культуре, «+» - между показателями 24-часовой и 72-часовой культур (р<0,05).

Важно отметить, что прирост данного показателя был связан с появлением лимфоидных клеток в островках 3-го класса и инволюцирующих островках (чего не наблюдалось при физиологическом течении эритропоэза в островках интактных животных). Кроме того, присутствие эритропоэтина в культураль-ной среде приводило к достоверному увеличению количества реконструирующихся ЭО с лимфоидными клетками в «короне».

Феномен связи макрофагов эритромиелоидных гемопоэтических островков с лимфоидными клетками ранее был отмечен при стимуляции костномозгового кроветворения (Шахов В.П., 1999), что объяснялось авторами как способность Т-лимфоцитов активировать развитие эритроидных клеток (Ястребов А.П., 1979, 1988). Однако нельзя исключить, что среди лимфоидных

клеток в «короне» эритробластических островков могут присутствовать также КОЕэ, морфологически сходные с малым лимфоцитом (Facker М., 1990; Захаров Ю.М., 1988). В этом случае наблюдаемое нами при стимуляции эритропо-эза в культуре увеличение количества эритробластических островков, контактирующих с лимфоидными клетками, подтверждает возможность присоединения присутствующих в культуре КОЕэ к «короне» инволюцирующих островков и островков 3 класса зрелости, что при развитии компенсационного эритропоэза обеспечивает реконструкцию в ЭО костного мозга.

При анализе количества ЭО, содержащих в своей «короне» эозинофиль-ные гранулоциты, было выявлено увеличение этих ассоциаций среди инволюцирующих островков и одновременное уменьшение среди реконструирующихся. Подобная тенденция отмечалась в 24-часовых культурах с 1 МЕ/мл эритропоэтина и в 72-часовых культурах с 0,5 и 1 ME/мл эритропоэтина. Что касается островков, содержащих нейтрофильные гранулоциты, то изменения в их количестве были отмечены только среди реконструирующихся ЭО: через 24 часа доля таких островков снижалась в культурах с 1 ME/мл эритропоэтина, а через 72 часа - во всех культурах. Таким образом, центральные макрофаги зрелых островков (островков 3-го класса и, особенно, инволюцирующих ЭО) обладают бблыними возможностями для контакта с эозинофильными и нейтрофильными гранулоцитами. Возможно, что такая выраженная тропность клеток гранулоцитарного ряда к «короне» зрелых островков связана с микроповреждениями мембраны центральных макрофагов, развивающимися вследствие отделения от нее ретикулоцитов и нормоцитов, а также усиленного фагоцитоза ядерного материала, что подтверждается и другими исследователями (Ben-Ishay Z., 1974; Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П., 1997). Поскольку секрета-руемые макрофагами цитокины Г-КСФ и ГМ-КСФ (Freund М., 1994; Пальцев М., 1995; Захаров Ю.М., 2002; Симбирцев А., 2004; Козлов В., 2004) являются мощными хемоатрактантами для нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов, контакт этих клеток с эритробластическими островками, несомненно, представляет собой процесс адгезии, провоцированный либо изменением физиче-

ского состояния мембраны макрофага (микротравма мембраны, изменение плотности электроотрицательного заряда), либо изменением распределения на поверхности мембраны сиаловых кислот, кислых гликозаминоглгасанов и адгезивных молекул. Известно, что эозинофилы периферической крови, главным образом, участвуют в противопаразитарных и аллергических реакциях, а также в поддержании реакции воспаления (Гриншпун Л.Д., 1982). В гранулах эозинофи-лов локализованы главный основный белок МВР (от анг. major basic protein), катионный белок, арилсульфатаза В, фосфолипаза D, гистаминаза, лейкотриен С4, простагландин Ег Цитотоксический эффект эозинофильных гранулоцитов связан с формированием так называемых JIMK (лизирующих мембрану комплексов). Эти своеобразные литические «зонды», помимо образования пор в мембранном бислое, стимулируют в макрофагах и Т-лимфоцитах окислительный метаболизм и секрецию цитокинов. Поскольку нами было обнаружено, что эозинофильные гранулоциты встречаются исключительно в «короне» зрелых островков, вполне возможно, что мембранодеструктивная функция эози-нофилов облегчает процесс фагоцитоза ядер нормобластов центральными макрофагами ЭО. Нельзя также исключить, что зрелые формы нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов могут сами являться объектами фагоцитоза со стороны центральных макрофагов эритробластических островков. На это указывают находки фрагментов нейтрофильных клеток в фагосомах центральных макрофагов (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002). Полученые нами данные о высокой частоте контактов нейтрофильных гранулоцитов с «короной» ЭО 3 класса зрелости и инволюцирующих островков подтверждают предположение авторов, исследовавших влияние нейтрофилокинов на эритропоэз в ЭО (Волков A.B., 1994), о том, что продукты секреции нейтрофилов, активированных частицами латекса, усиливают в центральных макрофагах ЭО синтез веществ, способствующих ускоренному созреванию эритроидных клеток в «короне» островков. Кроме того, не исключено, что центральные макрофаги и нейтрофильные лейкоциты могут выполнять согласованные функции по отношению к фагоцитируемым объектам (например, эритроцитам, завершившим свой жизненный цикл).

Для математического описания зависимостей развития общего количества эритробластических островков в культуре, а также островков пролифери-рующих классов, формирующихся на базе контактов КОЕэ с резидуальными макрофагами (ЭО 1 класса) или макрофагами инволюцирующих ЭО (ЭО рек.) от концентрации эритропоэтина в культуральной среде и длительности культивирования были определены коэффициенты регрессии, параметры стандартного отклонения, уровень значимости и доверительные интервалы (табл. 6). С помощью коэффициентов регрессии были построены уравнения математических моделей общего количества ЭО, количества ЭО 1 класса и ЭО рек. при культивировании с различными дозами эритропоэтина:

ЭО= 1441,187-9,345-Т-0,023-Т2+ 1037,953-К-812,485-К2 + 9,631-Т-К, ЭО 1 = 113,978-2,101-Т + 0,009-Т2 + 92,142-К-43,155-К2-0,171-Т-К, ЭО рек. = 138,54 - 1,37-Т + 0,0007-Т2 + 203,079-К - 98,533-К2 - 0,276-Т-К, где Т - время культивирования в часах, К - концентрация эритропоэтина.

Построенная регрессионная модель с достаточной точностью (р = 0,018785) позволила прогнозировать развитие культуры ЭО при заданной концентрации эритропоэтина, внесенного в культуральную среду. Наиболее наглядно результаты регрессионного моделирования спроецировались на квадратично сглаженные трехмерные диаграммы рассеяния, аппроксимированные полиномом второй степени (рис.3,4,5). Математическое моделирование развития культуры эритробластических островков позволило нам приблизиться к решению проблемы создания тест-системы эритропоэза, позволяющей исследовать влияния цитокинов и других биологически активных веществ на темпы пролиферации, дифференциации и созревания эритроидных клеток. Предсказывающие свойства построенной регрессионной модели значительно упрощают выбор срока культивирования и исходной концентрации эритропоэтина, добавляемого в культуральную среду, так как для получения необходимого общего количества эритробластических островков на поверх-

ности культурального сосуда и качественных характеристик популяции островков достаточно свериться с данными модели.

Рис.3. Контурная проекция регрессионной поверхности модели для расчета общего количества культивируемых ЭО.

Время культивирования (часы) Рис.4. Контурная проекция регрессионной поверхности модели для расчета количества культивируемых ЭО 1 класса зрелости

I I 80

Э 120

200 160

ВО

100

120

140

Время культивирования (часы)

Рис.5. Контурная проекция регрессионной поверхности модели для расчета количества культивируемых ЭО рек.

Для принятия решения о границах применения полученной модели был произведен анализ ее свойств. Информативность модели была оценена по величине множественного коэффициента корреляции И (коэффициент корреляции между экспериментальным значением отклика и значением отклика, рассчитанного по модели) и величине расчетного значения Б-отношения для коэффициента корреляции, адекватность - по критерию Фишера. Полученная нами математическая модель обладает хорошими предсказывающими свойствами, так как распределение остатков регрессии согласовано с нормальным распределением.

Таким образом, и морфологический анализ культур ЭО, и построенная нами математическая модель эритропоэза свидетельствуют о том, что присутствие 0,25-0,5 МЕ/мл эритропоэтина в культуральной среде обеспечивает развитие эритроидных клеток в ЭО на физиологическом уровне, а использование эритропоэтина в концентрациях 1-1,5 МЕ/мл в течение 48 часов культивирования позволяет создать модель компенсационного эритропоэза в ЭО.

Несмотря на то, что за 20 с лишним лет работы в нашей лаборатории были накоплены обширные сведения о роли костномозговых макрофагов в эритропоэзе, для нас оставалось неясным, как дозированная специфическая стимуляция функций центральных макрофагов ЭО макрофагальным колоние-стимулирующим фактором отразится на их поддерживающих эритропоэз свойствах. Исследование влияния М-КСФ на развитие культуры ЭО показало, что цитокиновая активация функций центральных макрофагов островков не всегда сопровождается стимуляцией развития их эритроидной «короны». Введение М-КСФ в культуральную среду на фоне 0,5 МЕ/мл эритропоэтина, вызывая выраженную активацию фагоцитарной способности центральных макрофагов ЭО (рис.6, табл.6), уже в первые сутки привело к угнетению процесса формирования островков в культуре (табл 7, рис.7) и уменьшению пролифе-ративной активности эритроидных клеток со значительным увеличением продолжительности их митотического цикла.

Количество М-КСФ (МЕ/мл)

Рис.6. Изменение активности фагоцитоза частиц латекса центральными макрофагами ЭО в культуре под влиянием М-КСФ.

Примечания: К - контрольное значение активности фагоцитоза, определенное в культуре с

0,5 МЕ/мл эритропоэтина; «*» обозначено наличие интегральных различий между показателями опытных и контрольной групп.

i i

Таблица 6.

Влияние М-КСФ на интенсивность фагоцитоза частиц латекса центральными макрофагами ЭО в культуре

Интенсивность фагоцитоза

ЭО 1 класса ЭО 2 класса ЭО 3 класса ЭО инв. ЭО рек.

Контроль 3,6±0,7 5,9±0,5 13,5±1,3 15,0±1,6 7,7±0,7

1 МЕ/мл 3,4±0,5 5,6±0,3 13,6±1,0 13,7±1,2 6,3±0,5

р=0,1532 р=0,0964 р=0,9733 р=0,0672 р=0,0748

2 МЕ/мл 2,8+0,5 5,6±0,3 13,6±0,9 13,7±1,0 5,9±0,6

р=0,0563 р=0,7881 р=0,8903 р=0,0523 р=0,0607

3 МЕ/мл 2,9±0,7 4,9±0,5 20,2±1,3 18,9±0,8 6,9±0,4

р=0,0551 р=0,0675 р=0,0143 р=0,0595 р=0,0772

4 МЕ/мл 1,4±0,3 2,3±0,4 19,8±1,4 24,5±1,5 6,1±0,5

р=0,0133 р=0,0117 р=0,0204 р=0,0118 р=0,0675

5 МЕ/мл 1,2±0,2 2,8±0,3 23,6±1,7 25,0±2,6 6,7±0,8

р=0,0108 р=0,0206 р=0,0173 р=0,0125 р=0,0759

6 МЕ/мл 1,4+0,4 2,1±0,2 22,8±2,1 25,7±2,3 7,2±0,6

р=0,0213 р=0,0144 р=0,0165 р=0,128 р=0,853

Тормозной эффект М-КСФ преимущественно проявлялся в отношении формирования островков de novo и de répété, что подтвердили расчетные показатели интенсивности эритропоэза в культуре. Так, «показатель вовлечения КОЕэ в дифференциацию в эритробластические островки» и «показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз» при культивировании ЭО с М-КСФ уменьшались в 2-4 раза по сравнению с контрольными значениями, а показатель созревания эритробластов увеличивался пропорционально дозе исследуемого цитокина. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в присутствии М-КСФ одновременно с торможением пролиферации стимулируется созревание эритроидных клеток и их дифференциация в зрелые формы.

Таблица 7.

Влияние М-КСФ на количество ЭО/см2 различных классов зрелости (24 часа культивирования)

ЭО ЭО ЭО ЭО инв. ЭО рек.

1 класса 2 класса 3 класса

Контроль 81,6±2,8 95,2±3,3 359,8±4,3 736,8±9,7 164,4±4,2

1 МЕ/мл 75,0±2,2 89,2±2,2 367,0±4,2 753,6±6,1 154,0±2,1

р=0,3294 р=0,4531 р=0,3374 р=0,0853 р=0,5755

2 МЕ/мл 58,6±3,4 77,4±2,7 388,8±3,3 768,6±6,7 134,8±2,0

р=0,0133 рЮ,0125 р=0,0312 р=0,0946 р=0,0115

3 МЕ/мл 40,8±1,8 60,6±3,5 385,0±2,9 786,2±3,6 126,6±3,5

р=0,0224 р=0,0118 р=0,0137 р=0,0421 р=0,0157

4 МЕ/мл 35,2±2,4 45,4±2,7 394,8±4,0 776,8±4,9 100,2±2,7

р=0,0095 р=0,0232 р=0,0396 р=0,0761 р=0,0141

5 МЕ/мл 35,8±2,9 43,6±2,7 414,2±4,9 747,8±10,7 91,4±3,2

р=0,0107 р=0,0210 р=0,0334 р=0,1548 р=0,0168

6 МЕ/мл 28,6±3,0 42,4±4,2 421,8±4,1 745у2±8,8 74,0±3,8

р=0,0086 р=0,0133 р=0,0248 р=0,3294 р=0,0132

Эти изменения в культуре ЭО носили явный дозозависимый характер и были наиболее выражены при внесении в культуру ЭО 4-6 МЕ/мл М-КСФ. В культурах ЭО, содержащих 5 и 6 МЕ/мл М-КСФ, статмокинетические индексы достоверно снижались в островках всех исследуемых классов зрелости, причем присутствие М-КСФ в культуральной среде в дозе 5 МЕ/мл достоверно уменьшало число колхициновых митозов в среднем на 25% по сравнению с контрольными значениями, а добавление 6 МЕ/мл М-КСФ приводило к снижению статмокинетических индексов на 39-44% по сравнению с контрольными показателями. Эритроидные клетки «короны» реконструирующихся ЭО оказались наиболее чувствительными к действию М-КСФ - продолжительность их митотического цикла достоверно увеличивалась во всех культурах, имеющих в составе среды исследуемый цитокин: добавление 4 МЕ/мл М-КСФ изменяло ^ на 21%, добавление 6 МЕ/мл - на 78%.

0,5 МЕ/мл эритропоэтина 6 МЕ/мл М-КСФ (на фоне 0,5 МЕ/мл эритропоэтина)

24 часа куль гивирования

48 часов культивирования

72 часа культивирования

Рис. 7. Влияние М-КСФ на формулу ЭО в культуре: изменение соотношений между островками пролиферирующих классов (отмечены на диаграмме светло-серым цветом) и зрелыми формами ЭО (отмечены темно-серым цветом).

Кроме того, М-КСФ, тормозя пролиферативные процессы в эритроид-ных клетках в культуре ЭО, вызывал уменьшение числа островков, контактирующих с лимфоидными клетками, и увеличивал количество контактов «короны» зрелых островков с нейтрофильными и эозинофильными гранулоцита-ми. Исчезновение лимфоидных клеток из «короны» ЭО при отмеченном ранее

угнетающем воздействии М-КСФ на процессы образования островков «de novo» и реконструкцию эритропоэза в культуре лишний раз подтверждало наше предположение о том, что среди лимфоидных клеток культуры могут находиться КОЕэ, отсутствие вовлечения которых в формирование новых островков приводит к прекращению эритропоэза in vitro. Результаты исследования влияния М-КСФ на эритропоэз в ЭО позволяют предположить, что одним из механизмов ранее обнаруженного угнетения эритропоэза у больных с активированным моноцитарным звеном в костном мозге или же при создании больших концентраций моноцитов в культурах костного мозга (Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., 1984) является секреция моноцитарно-макрофагальных факторов, тормозящих эритропоэз и/или снижающих эритропоэтические свойства микроокружения в ЭО.

Таблица 8.

Динамика количества ЭО различных классов зрелости при добавлении в культуры норадреналина гидротартрата

ЭО 1 класса ЭО 2 класса ЭО 3 класса ЭО инв. ЭО рек.

24 часа культивирования

Контроль 64,5 ± 2,5 84,2 ± 5,4 344,9 ± 3,6 771,4±3,2 192,9 ±4,8

Ю^М 84,8±1,6 95,7 ± 8,2 354,3 ± 9,8 720,2±2,8 232,4±4,8

р=0,0136 р=0,0879 р=0,1072 р=0,0263 р=0,0115

10"9М 73,3 ± 2,1 84,2 ± 9,6 363,9 ±4,3 740,5 ±11,7 227,9±3,2

р=0,0677 р=0,8125 р=0,0804 р=0,0581 р=0,0240

10'12М 60,6 ± 1,5 82,2± 5,6 359,1 ±4,3 740,0±12,9 195,6 ±3,3

р=0,1845 _р=0,7128 р=0,0831 р=0,0663 р=0,7534

72 часа культивирования

Контроль 37,8±3,1 63,4± 2,5 245,9±7,7 881,5±11,1 165,2 ±6,1

10"6М 33,8±2,3 86,8±2,7 278,3± 1,7 847,0±13,7 176,0±3,9

р=0,1631 р=0,0226 р=0,0333 р=0,1063 р=0,1325

10"9М 34,6±3,1 68,7± 3,3 253,6 ±6,1 870,5 ± 8,8 178,5±2,7

р=0,3115 р=0,2076 р=0,1272 р=0,2148 р=0,1872

Ю',2М 37,7±2,4 60,5 ± 3,2 251,6± 7,4 880,8 ± 5,3 155,1±2,6

р=0,9113 р=0,7024 р=0,1721 р=0,8993 р=0,0871

Различия во времени развития стимулирующих эритропоэз эффектов адреналина и норадреналина могут объясняться различиями их преимущественной активации а- и ß-адренорецепторов. Существуют данные о том, что плотность ß-адренорецепторов на мембранах гемопоэтических клеток постоянна и не зависит от фазы клеточного цикла, а экспрессия а-адренорецепторов минимальна в фазы Go и Gi и достигает максимума в фазы S, G2 и М (Johnson М., 2001; Feiten D.L., 1987). Кроме того, в работах с культурой клеток куриного эмбриона было показано, что увеличение количества адреналина в среде культивирования в первые часы исследования угнетает процессы транскрипции и снижает количество цитоплазматической

_ - ___________^тивация а-

БИБЛИЭТЕКА С. Петербург Ä 0> М кг J

адренорецепторов посредством введения норадреналина сопровождается немедленной стимуляцией транскрипции и увеличением синтеза РНК (Божко Г.Х., 1984).

Таблица 9.

Динамика количества ЭО различных классов зрелости при добавлении в культуры адреналина гидрохлорида

ЭО ЭО ЭО ЭО инв. ЭО рек.

1 класса 2 класса 3 класса

24 часа культивирования

Контроль 64,7±2,7 92,6±3,3 344,7±10,3 763,5±7,1 193,9±4,7

Ю^М 60,1 ±2,4 92,3±3,7 328,8±5,9 764,7±9,1 203,3±2,9

Р=0,0672 р)=0,9451 р=0,0663 р=0,8905 р=0,09910

10-9М 58,7±3,0 91,9±3,3 334,7±8,1 769,0±6,5 193,1±5,3

р=0,0604 р=0,7955 р=0,7789 Р=0,1262 р=0,9063

10"12М 61,9±2,5 84,9±6,2 321,4±9,9 792,6±12,2 184,6±8,8

р=0,4116 р=0,0872 р=0,0559 р=0,0515 р=0,0813

72 часа культивирования

Контроль 35,8±1,8 62,1±3,3 268,6±5,1 856,6±6,9 166,9±5,4

Ю^М 52,1±2,5 78,3±1,5 280,2±7,8 801,1±9,1 195Д±2,8

р=0,0312 р=0,0461 р=0,0785 р=0,0П4 р=0,0236

10"9М 48,9±2,8 68,9±3,9 268,3±4,3 803,9±5,2 201,5±4,5

р=0,0331 р=0,1271 р=0,8793 р=0,0185 р=0,0107

10",2М 42,1±5,7 71,1±2,8 271,3*4,7 841,6 ±3,5 171,4±2,3

р=0,0693 р=0,0705 р=0,4774 р=0,0852 р=0,0756

ткани и гранулоцитарного ростка кроветворения (Галактионов С.Г., 1984; Scribner В.Н., 1975). В наших исследованиях были получены данные о противоположном действии двух различных фракций «средних молекул», выделенных из крови интактных животных. Антипролиферативным в отношении эритроидных клеток действием обладала фракция 3, обладающая выраженными прооксидантными и иммуносупрессорными свойствами (Волчегорский И.А., 1995), а наиболее быстроэлюируемая фракция 2, проявляющая иммуностимулирующую активность и не имеющая прооксидантных свойств, напротив, стимулировала развитие эритроидной «короны» ЭО в культуре и достоверно уменьшала продолжительность митотического цикла молодых эритроидных клеток. Вероятно, в условиях физиологического эритропоэза эти две фракции «средних молекул» находятся в реципрокных взамоотношениях -ингибиторный эффект фракции 3 компенсируется стимулирующим эритропо-эз действием фракции 2.

Нами было установлено, что указанные фракции, выделенные из крови обожженных животных, оказывают выраженное однонаправленное негативное действие на эритропоэз (табл.10). При культивировании ЭО с фракциями 2 и 3 «средних молекул», выделенными из крови обожженных животных, наблюдалось не только угнетение развития эритроидных клеток (пролиферация и дифференциация эритробластов прекращалась уже через 24 часа эксперимента), но и явный цитолитический эффект указанных фракций на все клетки культуры. Ранее было показано, что фракции «средних молекул», выделенные из крови животных с термическим ожогом 25% поверхности тела, помимо прооксидантного действия, увеличивают выраженность детергентиндуциро-ванного гемолиза эритроцитов (Волчегорский И.А., 1995). Многие исследователи, занимающиеся проблемой патогенеза и лечения ожоговой анемии, высказывали предположения о существовании в крови обожженных людей и животных веществ, ингибирующих эритропоэз. Так, в работе Б. Deitch и К. Sitting (1993) было установлено, что стойкая ингибиция эритропоэза у больных с ожогом более 20% поверхности тела развивается на фоне нормального

или повышенного количества эритропоэтина в плазме, что объясняется ими как появление в крови веществ, снижающих чувствительность эритроидных клеток к эритропоэтину. Основываясь на результатах наших исследований, мы можем утверждать, что такими ингибирующими эритропоэз веществами могут являться фракции 2 и 3 «средних молекул», продуцируемые фагоцитирующими мононуклеарами воспалительного очага и, следовательно, играющие важную роль в патогенезе ожоговой анемии.

Таблица 10.

Изменение продолжительности митотического цикла (в часах) эритроидных клеток «короны» ЭО при добавлении в культуры 1Ы концентраций фракций «средних молекул»

ЭО 1 класса ЭО 2 класса ЭО рек.

контроль 16,04 ± 0,73 27,52 ± 0,68 14,16 ±0,32

фракция 2 «норма» 11,82 ±0,53 21,21 ±0,46 9,13 ± 0,35

р=0,0378 р=0,0580 р=0,0249

фракция 2 «ожог» 21,79 ±0,41 36,42 ±0,92 20,12 ±0,55

р=0,0335 j р=0,0214 р=С,0322

фракция 3 «норма» 29,27 ± 0,73 38,81 ± 1,12 34,35 ± 0,77

р=0,0109 р=0,0308 р=0,0121

присутствии эритропоэтииа качественный состав эритробластических островков постоянно обновляется за счет образования новых ЭО как на базе свободно лежащих в культуре макрофагов, так и на основе реконструкции эритропоэза в инволюцирующих ЭО. Это означает, что среди лимфоидных клеток, часто встречающихся в составе «короны» островков пролиферирующих классов, есть КОЕэ, вступающие в митотический цикл под влиянием специфического стимулятора развития клеток эритроидного ряда - эритропоэтииа.

Культура ЭО по ряду параметров оказалась более удачной моделью для изучения эритропоэза по сравнению с исследованиями, проводимыми in vivo на лабораторных животных, так как, во-первых, она позволяет изучать не завуалированные эндогенными продуктами секреции эффекты биологически активных соединений на эритропоэз, а во-вторых, позволяет значительно сократить как количество животных, необходимых для проведения исследования регуляторного воздействия цитокинов, медиаторов, лекарственных препаратов и т.п., так и количество самих тестируемых в эксперименте веществ. Эритропоэз в культуре ЭО, подобно костномозговому эритропоэзу in vivo, сохраняет чувствительность к нервной и гуморальной регуляции, что свидетельствует о сохранности рецепторных и секреторных свойств у центральных макрофагов островков и эритроидных клеток их «короны», а также пролифе-ративного потенциала эритроидных клеток-предшественниц. Правильно подобранные режим культивирования и состав культуральной среды дают возможность моделировать и физиологический, и компенсационный эритропоэз в ЭО, а также механизмы развития нарушений эритрона при различных патологических состояниях.

ВЫВОДЫ:

1. Культура эритробластических островков - это новый перспективный метод исследования эритропоэза в экспериментальной гематологии. Культура ЭО выгодно отличается от модельных экспериментов, проводимых in vivo, возможностью экономичного воссоздания физиологического уровня разви-

тия эритроидной ткани и различных процессов, сопровождающихся изменением функций ЭО.

2. Культивирование эритробластических островков в присутствии эритропо-этина в дозах 0,25 - 0,5 МЕ/мл позволяет поддерживать темп развития эритроидных клеток в «короне» ЭО на физиологическом уровне, присутствие 1-1,5 МЕ/мл эритропоэтина в культуральной среде вызывает изменения качественного состава ЭО, аналогичные происходящим в кроветворной ткани при компенсационном эритропоэзе.

3. Популяция костномозговых макрофагов, ранее участвовавших в поддержании развития эритроидных клеток в ЭО, является наиболее чувствительной к малым дозам эритропоэтина в культуральной среде, что обеспечивает поддержание развития эритроидной ткани в культуре за счет реконструкции эритропоэза в островках, заканчивающейся формированием зрелой эритроидной «короны».

4. В экспериментальной модели эритропоэза in vitro получены данные о том, что дозозависимое увеличение активности и интенсивности фагоцитарной реакции центральных макрофагов ЭО под влиянием эритропоэтина начинается сразу после образования клеточной ассоциации «макрофаг + КОЕэ/проэритробласты».

5. Специфическая стимуляция активности центральных макрофагов ЭО в культуре макрофагальным колониестимулирующим фактором приводит к дозозависимому увеличению фагоцитарной способности этих клеток и одновременному угнетению пролиферации их эритроидной «короны», что свидетельствует о возможности модуляции функций центральных макрофагов ЭО при изменении направленности гемопоэза в костном мозге, вызываемом М-КСФ.

сутки культивирования, а преимущественная p-адреностимуляция рецепторов клеток островков адреналином вызывает аналогичные изменения в культуре ЭО через 72 часа культивирования.

7. Вещества полиэлектролитной природы с молекулярной массой от 0,5 до 1,5 кДа, выделенные из плазмы обожженных животных, обладают ингиби-рующим и цитолитическим действием в отношении эритроидных клеток «короны» ЭО.

8. Получены доказательства того, что среди лимфоидных клеток, обнаруживаемых в «короне» островков пролиферирующих классов, присутствуют КОЕэ, адгезия которых к резидуальным макрофагам или макрофагам зрелых островков способствует развитию эритропоэза de novo и процессу реконструкции при стимуляции культуры ЭО эритропоэтином.

9. Нелинейная двумерная регрессионная модель эритропоэза in vitro позволяет значительно упростить выбор сроков культивирования ЭО и подбор дозы эритропоэтина при планировании и проведении экспериментов, направленных на изучение влияния биологически активных веществ на развитие эритроидных клеток и межклеточных взаимодействий в ЭО.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Харченко М.Ф. Роль гликозаминогликанов и протеогликанов в гемопо-эзе и физиологических функциях клеток крови / М.Ф. Харченко, Л.П. Рыбакова, Н.В. Тишевская, Ю.М. Захаров // Физиологический журнал им. Сеченова. - 1996. - Т.82, №5-6. - С. 18-25.

2. Захаров Ю.М. О взаимосвязи функциональной активности макрофагов с кинетикой эритропоэза в эритробластических островках / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская // Вопросы экспериментальной физиогии. - Екатеринбург, 1997.-С. 95-103.

3. Захаров Ю.М. Межклеточные эритропоэтические взаимодействия в костном мозге / Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин, Н.В. Тишевская, Б.В. Медя-

ник // Материалы ХУЛ съезда физиологов России. - Ростов-на-Дону,1998.-С. 160-161.

4. Тишевская Н.В. Влияние эритропоэтина в различных концентрациях на культуру эритробластических островков / Н.В. Тишевская, Ю.М. Захаров, И.А. Тишевской // Российский физиол. журнал им. И.М. Сеченова. - 1998. - Т.84, №12,- С. 1412-1419.

5. Тишевская Н.В. Роль компонентов микроокружения в поддержании эритропоэза в эритробластических островках костного мозга / Н.В. Тишевская // Материалы научной конференции, посвященной 100-летию профессора P.A. Дымшица «Актуальные проблемы регуляции кроветворения и неоангиогенеза». Челябинск, 1998. с. 30-36.

6. Захаров Ю.М. Молекулярно-клеточные механизмы регуляции эритропоэза / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская // Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения академика И.П. Павлова. - Санкт-Петербург, 1999.-С. 25-26.

7. Захаров Ю.М. О клеточно-клеточных взаимодействиях различных линий костного мозга в эритробластических островках / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии». - Челябинск, 2001.-С. 5-10.

8. Захаров Ю.М. Динамика клеточного состава эритробластических островков при культивировании in vitro / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская // Российский физиол. журнал им. И.М. Сеченова. - Т. 2001. - Т.87, №1. -С. 84-89.

9. Тишевская Н.В .Влияние гуморальных факторов на фагоцитарную активность центральных макрофагов в культуре эритробластических островков / Н.В. Тишевская, Ю.М. Захаров, С.А. Шевяков // Российский физиол. журнал им. И.М. Сеченова. - 2002. - Т.88, №9. - С. 1191-1198.

Ю.Захаров Ю.М., Тишевская Н.В. Стимуляция эритропоэза в эритробластических островках введением эритропоэтина in vitro / в кн.: Эритроб-ластический островок. -М.: Медицина, 2002. - С. 142-152.

П.Захаров Ю.М. Опыт исследования эритропоэза в культурах эритробластических островков / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская // Труды Ш Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инжиниринг в медицине». - Челябинск, 2002. - С. 22-26.

12.Волчегорский И.А. Влияние «средних молекул», выделенных из плазмы крови интактных и обожженных животных, на клеточный состав культур эритробластических островков костного мозга / И.А. Волчегорский, Н.В. Тишевская, Д.А. Кузнецов // Вестник РАМН. - 2002. - №2. - С. 3036.

13.3ахаров Ю.М. Культура эритробластических островков как новый метод исследования эритропоэза // Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, С.А. Шевя-ков // Труды научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения». - Трехгорный, 2003. - С. 52-54.

14.3ахаров Ю.М. Об особенностях ассоциации клеток моноцитарной, эрит-роидной и гранулоцитарной линий в кроветворной ткани / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская // Медицинский академический журнал. - 2003. -Т.З, № 2. - С. 11-18.

15.Тишевская Н.В. Влияние эритропоэтина и макрофагального колоние-стимулирукмцего фактора на пролиферативную активность эритроид-ных клеток в культурах эритробластических островков / Н.В. Тишевская, С.А. Шевяков, Ю.М. Захаров // Медицинский академический журнал. - 2003. - Т. 3, № 3. - С. 67 - 72.

16.3ахаров Ю.М. Культура эритробластических островков - новый инструмент для исследования эритропоэза / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2003. - №1. -С. 65-68.

17.3ахаров Ю.М. Гуморальные и межклеточные взаимодействия, регулирующие эритропоэз / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская // Российский фи-зиол. журнал им. И.М. Сеченова. - 2004. - Т.90,№8. - С. 136-137.

18.Захаров Ю.М. Моделирование различных состояний эритропоэза в культуре эритробластических островков / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, С.А. Шевяков // Материалы международного научного симпозиума "Югра-ГЕМО". - Ханты-Мансийск, 2004. - С. 4-7.

19.3ахаров Ю.М. Современные подходы к исследованию роли межклеточных взаимодействий в регуляции эритропоэза / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, С.А. Шевяков, E.JI. Куренков // Труды научной сессии, посвященной 60-летию Челябинской государственной медицинской академии «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения». - 2004. - С. 10-12.

20.3ахаров Ю.М. Межклеточные взаимодействия в регуляции эритропоэза / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, С.А. Шевяков, E.JI. Куренков // Сб. научных работ под ред. акад. А.И. Воробьева «Патофизиология крови». -М., 2004.-С. 103-121.

21.Захаров Ю.М. Экспериментальная дизрегуляция эритропоэза / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская, С.А. Шевяков // Материалы III Российского конгресса по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляци-онная патология органов и систем». - М., 2004. С. 22-23.

22.3ахаров Ю.М. Новые данные исследования эритропоэза в эритробла-стических островках "in vitro" / Ю.М. Захаров, H.B. Тишевская, С.А. Шевяков // Материалы межрегиональной научно - практической конференции "Актуальные вопросы патологии", посвященной 70-летию кафедр патологической анатомии и патофизиологии БГМУ. - Уфа, 2004. -С. 29-32.

23.Тишевская Н.В. Влияние катехоламинов на эритропоэз в культуре эрит-робластических островков / Н.В. Тишевская // Известия Челябинского научного центра РАН. - 25-й специальный выпуск. - С. 100-103.

24.3ахаров Ю.М. Морфо-функциональная организация эритропоэза в кроветворной ткани человека и животных / Ю.М. Захаров, Н.В. Тишевская //Материалы международной научно-практической конференции «Мор-фофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифферен-цировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий». - Курган, 2004. - С. 104-106.

Тишевская Наталья Викторовна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГУЛЯЦИИ ЭРИТРОПОЭЗА В КУЛЬТУРЕ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ

03.00.13. - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Подписано в печать 18.04.05. Формат 60x90,1/16. Объем 2.85 п.л. Заказ № 250. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии ООО «Урал-Диалог» Лицензия № 197 от 18 апреля 1998 г. 454080, г Челябинск, пр. Ленина, 79

*10734

РНБ Русский фонд

2006-4 9258

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Тишевская, Наталья Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления об эритропоэзе и структуре эритрона.

1.1.1. Стволовая кроветворная клетка и ее пролиферативный потенциал.

1.1.2. Особенности пролиферации и дифференциации поли- и бипотентных коммутированных клеток-предшественниц.

1.1.3. Транскрипционные факторы, определяющие фенотип ■ -эритроидных клеток.

1.2. Современный взгляд на гуморальную регуляцию эритропоэза

1.2.1.Механизмы действия цитокинов и их значение в регуляции развития эритроидных клеток.

1.2.2. Эритропоэтинпродуцирующие клетки и регуляция их функции.

1.2.3. Биохимическая структура молекулы эритропоэтина.- , , Характеристика гена эритропоэтина.

1.2.4. Характеристика эритропоэтинчувствительных клеток. Функции эритропоэтина.

1.2.5. Особенности рецепции эритропоэтина клетками-мишенями.

1.3. Роль гемопоэтического микроокружения и межклеточных взаимодействий в регуляции эритропоэза.

1.3.1.Гликозаминогликаны и протеогликаны.

1.3.2.Структурные фибриллярные белки (коллаген, эластин).

1.3.3.Адгезивные белки (фибронектин, хемонектин, ламинин, тромбоспондин, CD44).

1.4. Эритробластический островок — функционально-анатомическая единица эритрона.

Глава 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 .Техника культивирования эритробластических островков костного мозга крысы.

2.1.1. Оборудование.

2.1.2. Состав культуральной среды.

2.1.3. Характеристика лабораторных животных, костный мозг которых использовался в качестве источника ЭО.

2.1.4. Выделение ЭО из костного мозга бедренных костей крысы и получение материала для культивирования:.

2.2. Морфологическая оценка клеток в культуре ЭО.'.и.85,

2.3. Оценка пролиферативной активности*эритроидных клеток,в культуре,. ЭО.

2.4. Исследование фагоцитарной активности центральных макрофагов в , культуре ЭО.'.

2.5. Метод выделения фракций «средних молекул» из плазмы интактных -и обожженных животных.

2.6. Статистические методы, примененные для анализа полученных экспериментальных данных.

2.6.1. Последовательный критерий отношения правдоподобия (критерий Вальда).

2.6.2. Метод оценки интегральных различий между опытными и контрольными группами исследуемых показателей.

2.6.3. Однофакторный диверсионный анализ.

2.6.4. Одномерный двухфакторный дисперсионный анализ.

2.6.5. Построение нелинейных двумерных математических моделей эритропоэза in vitro.

Глава 3. ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА РАЗВИТИЕ КУЛЬТУРЫ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ

3.1. Морфологический анализ эритробластических островков, культивируемых в присутствии различных концентраций рекомбинантного эритропоэтина человека.

3.2. Дозозависимые кривые развития эритробластических островков в культуре.

3.3. Сравнительный анализ эффективности влияния эритропоэтина разных фирм-производителей на развитие культуры ЭО.

3.4. Исследование влияния эритропоэтина на пролиферативную активность эритроидных клеток в культуре ЭО:.

3.5. Исследование влияния эритропоэтина на фагоцитарную активность центральных макрофагов в культуре ЭО.

3.6. Изучение влияния эритропоэтина на адгезию клеток неэритроидных линий к «короне» ЭО.:.

Глава 4. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭРИТРОПОЭЗА В КУЛЬТУРЕ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ.

Глава 5. ВЛИЯНИЕ МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА НА КУЛЬТУРУ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ

5.1. Морфологический анализ эритробластических островков, культивируемых в присутствии различных концентраций М-КСФ.

5.2. Изменение пролиферативной активности эритроидных клеток в культуре ЭО под влиянием М-КСФ.

5.3. Влияние М-КСФ на фагоцитарную активность центральных макрофагов ЭО в культуре.

5.4. Изучение влияния М-КСФ на адгезию клеток неэритроидных линий к «короне» ЭО.

Глава 6. ВЛИНИЕ КАТЕХОЛАМИНОВ НА ЭРИТРОПОЭЗ В КУЛЬТУРЕ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ.

6.1. Морфологический анализ эритробластических островков, культивируемых в присутствии различных концентраций катехоламинов.

6.2. Влияние катехоламинов на пролиферативную активность эритроидных клеток в культуре ЭО.

6.3. Изучение влияния катехоламинов на адгезию клеток неэритроидных линий к «короне» ЭО.

Глава 7. ВЛИЯНИЕ ФРАКЦИЙ «СРЕДНИХ МОЛЕКУЛ» НА ЭРИТРОПОЭЗ В КУЛЬТУРЕ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ.

7.1. Морфологический анализ эритробластических островков, культивируемых в присутствии различных концентраций фракций «средних молекул».

7.2. Влияние фракций «средних молекул» на пролиферативную активность эритроидных клеток в культуре ЭО.

7.3. Изучение влияния фракций «средних молекул» на адгезию клеток неэритроидных линий к «короне» ЭО.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментальные исследования регуляции эритропоэза в культуре эритробластических островков"

Актуальность проблемы.

Механизм образования эритроцитов в организме подвержен сложному позитивному и негативному контролю со стороны ростовых факторов, эндокринной системы, элементов гемопоэтического микроокружения, цитокинов, и медиаторов вегетативной нервной системы. Детальное описание схемы развития эритроидных элементов включает в себя как факторы, запускающие процесс пролиферации ранних клеток-предшественниц эритропоэза, так и биологически активные вещества, регулирующие деление коммитированных эритроидных клеток, процессы терминального созревания эритробластов, а также механизмы выхода ретикулоцитов в циркуляторное русло. В последние десятилетия большая роль в регуляции эритропоэза отводится межклеточным взаимодействиям, обеспечивающим адгезию эритроидных клеток к экстрацеллюлярному матриксу, облегчающим дифференциацию и созревание клеток эритроидной линии, способствующим связыванию сигнальных молекул со специфическими рецепторами на клеточной поверхности. В то же время подавляющее большинство работ в области экспериментальной гематологии направлено на изучение регуляции самых ранних этапов развития кроветворной ткани - стволовых и полустволовых кроветворных клеток, а также поли- и бипотентных клеток-предшественниц. Даже специфическому для эритроидного ростка кроветворения гормону эритропоэтину при рассмотрении заключительных стадий развития красных клеток крови зачастую отводится роль исключительно фактора выживания, препятствующего лишь программированной клеточной смерти, т.е. апоптозу (Владимирская Е.Б., 2000). Однако синтез гемоглобина, функциональная перестройка ферментных систем, характерная для зрелых эритроидных клеток, процесс денуклеации нормобластов происходят в терминальной стадии эритропоэза, а при исследовании количества сайтов связывания эритропоэтина на дифференцирующихся эритроидных клетках было установлено, что наибольшая плотность рецепторов к эритропоэтину обнаруживается на мембранах проэритробластов и ранних полихроматофильных эритробластов (Bacis J., 1985), причем в условиях индуцированной анемии число сайтов связывания эритропоэтина на указанных клетках возрастает (Akahane К., 1989). Нарушения процессов дифференциации и созревания эритроидных элементов на отрезке «колониеобразующая единица эритроцитарная — ретикулоциты» могут привести к возникновению ряда гематологических заболеваний. Так, высокая активность гемоксигеназы в КОЕэ препятствует гемоглобинезации клеток и замедляет образование эритробластов, что является одной из причин развития сидеробластной анемии (Ibraham N.G., 1985), ускорение созревания эритробластов приводит к формированию вторичных эритроцитозов, а замедление дифференциации базофильных эритробластов в полихроматофильные в эритробластических островках является одним из механизмов патогенеза апластической анемии (Коробкин А.В., 1988). В связи с этим, изучение механизмов регуляции финальных этапов эритропоэза представляется чрезвычайно актуальным, так как расширит наши представления о патогенезах болезней системы кроветворения, сопровождающихся как депрессией эритроидного ростка в костном мозге, так и его активацией.

Установлено, что терминальные стадии эритропоэза протекают в эритробластических островках (ЭО), представляющих собой ассоциации костномозговых макрофагов с эритроидными клетками разной степени дифференцированности - от проэритробластов до ретикулоцитов (Захаров Ю.М., 1982-2004; Bessis М.и Breton-Gorius J., 1956; Allen Т., 1982, 1991; Bentley S., 1982; Crocker P., 1985; Deimann W., 1991; Koury S. 1988, 1989; Lee S., 1991; Simmons P., 1984; Sadahira Y.1999; Bernard J.,

1991). При изучении динамики развития эритропоэза в эритробластических островках, выделенных из костного мозга больных с апластической анемией, истинной полицитемией и вторичными эритроцитозами, а также из костного мозга интактных животных, животных со стимулированным введением эритропоэтина или кровопотерей эритропоэзом, в экспериментах, моделирующих угнетение красного ростка кроветворения (посттрансфузионная полицитемия, экспериментальная спленомегалия, длительное тепловое воздействие и т.д.) были получены данные о том, что от функционального состояния центральных макрофагов островков зависит интенсивность развития их эритроидной «короны» (Воргова JI.B., 1990; Волков А.В., 1994; Захаров Ю.М., 1984-2004; Коробкин А.В., 1988; Мельников И.Ю., 1987; Пушкарев В.П., 1991; Рассохин А.Г., 1989-2002). Однако в условиях целостного организма выраженность ответной реакции эритроидной ткани на воздействие патогенных факторов или экзогенно вводимых регуляторов эритропоэза всегда сочетается с эффектами эндогенных гормонов, медиаторов и биологически активных веществ. Кроме того, в экспериментах, проводимых in vivo, или при отборе группы больных сложно стандартизировать условия окружающей среды и состояние висцеральных систем организма, а также в ряде случаев получить достаточное количество клеточного материала кроветворной ткани для исследования. На настоящем этапе развития экспериментальной гематологии особенно актуальным и перспективным является создание и внедрение в практику изучения кроветворения методов культуры клеток костного мозга — эти разработки позволяют перевести фундаментальные исследования воздействия гуморальных регуляторов гемопоэза на качественно новый уровень, так как дают возможность изучения влияния биологически активных веществ непосредственно на кроветворные клетки, и позволяют оценить роль кроветворных и стромальных межклеточных взаимодействий в кроветворении.

Среди большого количества живых клеток, которые возможно выращивать in vitro, гемопоэтические клетки составляют отдельную категорию, так как воссоздание функционирующей кроветворной ткани редко предполагает получение логарифмического роста культуры. В связи с этим клетки-предшественницы различных гемопоэтических линий никогда не культивируются в чистом виде, а только в виде гистиотипических культур, в которых сохраняются межклеточные взаимодействия и связи с экстрацеллюлярным матриксом. Для решения задач, связанных с изучением регуляции развития кроветворных клеток-предшественниц (за исключением стволовых кроветворных клеток), как правило, используют первичные гетерогенные культуры, поскольку неоднократное субкультивирование приводит к потере дифференцировочных признаков, хромосомным перестройкам или точечным мутациям (Адаме Р., 1983; Дьяконов Л.П., 1988; Лурия Е.А., 1972).

Большинство экспериментов по культивированию коммитированных клеток-предшественниц гемопоэза были проведены с использованием техники постановки культур в полутвердых средах: плазменном сгустке, агаровом, коллагеновом или метилцеллюлозном геле (Захаров Ю.М., 1988; Гольдберг Е.Д., 1992). Однако каждый из этих методов не лишен недостатков. Так, плазменный сгусток, несмотря на хорошую способность к поддержанию роста колоний, довольно быстро разжижается в местах скопления клеток, в результате чего клетки оказываются погруженными в жидкость, что приводит к гипоксии клеток и нарушает структуру межклеточных контактов. Кроме того, из-за сложного белкового состава субстрата в культуре на плазменном сгустке и в коллагеновом геле невозможно провести биохимические исследования и тестирование биологически активных веществ. Метод культивирования в агаровом геле не получил широкого распространения из-за своей статичности, так как твердое состояние агара не позволяет добавлять компоненты или обновлять состав среды в процессе культивирования.

Другим направлением в развитии экспериментальной гематологии явилось культивирование гемопоэтических клеток совместно с элементами стромы, техника которого была разработана Т. Dexter (1979, 1984). Большое достоинство этой культуральной системы — ее двухфазность, благодаря которой кроветворные элементы остаются доступными для всестороннего исследования без повреждения адгезивного слоя в течение длительного времени. Правильно установленная система по Декстеру способна поддерживать развитие морфологически распознаваемых кроветворных линий в течение 9-18 недель, за что этот метод получил название долговременных жидких культур костного мозга (Dexter Т., 1979). Развивающаяся стромальная подложка представляет собой многослойную структуру, состоящую из фибробластов, ретикулярных и эндотелиальных клеток, макрофагов и адипоцитов (Фриденштейн А.Я. 1980, 1988; Кузнецов С.А., 1988). Однако, несмотря на успешное функционирование созданной Декстером многокомпонентной модели костного мозга, ввиду гетерогенности клеточных популяций и продукции клетками гемопоэзиндуцирующих соединений она не позволяет исследовать влияние внесенного в культуру цитокина на развитие представителей определенной клеточной линии или же механизмы сигнальных взаимодействий клеток одной кроветворной линии с элементами другой. Кроме того, интенсивная пролиферация и частичная дифференциация клеток-предшественниц гемопоэза в долговременных жидких культурах костного мозга отнюдь не сопровождается появлением зрелых клеток всех гемопоэтических ростков, более того, уже после первой недели в культурах не остается ни морфологически различимых эритробластов, ни лимфоцитов — на поверхности культурального сосуда обнаруживаются только нейтрофильные гранулоциты, макрофаги и мегакариоциты (Dexter Т., 1979, Moore М., 1979). С этой точки зрения наиболее предпочтительным является культивирование уже коммитированных клетокпредшественниц, которые при адекватной стимуляции сформируют все пролиферирующие и созревающие элементы клеточной линии. Такая система была создана Ю. Захаровым и М. Прена, разработавшими в лаборатории М. Бессиса технику культивирования эритробластических островков костного мозга (Zakharov Y.M., Prenant М., 1982, 1983). В процессе исследования культур эритробластических островков Ю.М. Захаровым и Т. Алленом производилась непрерывная видеосъемка, позволяющая наблюдать и регистрировать во времени удвоение эритроидных клеток в "короне" островка, контакты центральных макрофагов с эритроидными клетками, локомоторные ответы макрофагов островков на внесение в культуральную среду эритропоэтина и других биологически активных веществ. Предварительное выделение эритробластических островков из ткани костного мозга и адгезия их на поверхности культурального сосуда позволяет получить совокупность эритроидных клеток, ассоциированных с макрофагами, в монослое, лишенном стромальных элементов, что исключает возможное эритропоэзиндуцирующее или ингибирующее действие фибронектина, коллагена, фибробластов, адипоцитов и т.д. При сравнительном анализе качественного состава ЭО была установлена идентичность распределения островков по классам зрелости в костном мозге здоровых людей и интактных лабораторных животных (белых беспородных крыс и крыс линии Вистар): большую часть популяции ЭО костного мозга человека и указанных лабораторных животных составляют островки, имеющие зрелую эритроидную «корону», а также реконструирующиеся ЭО, обеспечивающие поддержание должного уровня эритроцитов в крови за счет развития новой волны эритропоэза в «короне» инволюцирующих островков (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002; Коробкин А.В., 1988). В связи с этим, развивающиеся в условиях in vitro эритробластические островки костного мозга лабораторных животных представляют собой адекватную модель эритропоэза, протекающего в человеческом организме, и изучение закономерностей межклеточных взаимодействий в ЭО, интенсивности пролиферации, дифференциации и созревания эритроидных клеток в них позволит раскрыть ранее неизвестные стороны регуляции костномозгового эритропоэза, а также выявить природу нарушений развития эритроидного ростка кроветворения, что является важной и актуальной проблемой современной экспериментальной и клинической гематологии.

Задачи исследования:

6. Исследовать в культуре ЭО дозозависимое действие фракций «средних молекул», выделенных из плазмы интактных и обожженных животных, на процессы пролиферации эритроидных клеток и характер межклеточных взаимодействий в «короне» островков.

7. Создать математические модели эритропоэза in vitro.

Научная новизна: Впервые in vitro изучены закономерности развития эритробластических островков различных классов зрелости при культивировании ЭО костного мозга интактных животных в присутствии эритропоэтина в культуральной среде в дозах от 0,06 до 1,5 МЕ/мл. Установлено, что культура ЭО — это оригинальный способ моделирования физиологического и компенсационного эритропоэза. Добавление в культуральную среду 0,25-0,5 МЕ/мл эритропоэтина приводит к формированию новых ЭО в культуре как на базе контакта КОЕэ с резидуальными макрофагами, так и на основе взаимодействия КОЕэ с «короной» инволюцирующих островков в объемах, соответствующих физиологическому уровню развития ЭО в костном мозге. Увеличение количества эритропоэтина в культуральной среде до 1-1,5 МЕ/мл приводит к резкому всплеску пролиферативных процессов в «короне» ЭО в первые 48 часов культивирования, что соответствует картине раннего ответа эритроидной ткани при компенсационном эритропоэзе.

Впервые при изучении эритропоэза in vitro для эритроидных клеток «короны» ЭО пролиферирующих классов (ЭО 1, 2 классов зрелости и реконструирующихся ЭО) рассчитана продолжительность митотического цикла (tc), включающего в себя фазы Gi, S, G2 и М, а также получены данные об изменении генерационного времени способных к делению эритроидных клеток при стимуляции эритропоэза в культуре эритропоэтином и модуляции процесса развития эритроидной «короны» ЭО колониестимулирующим фактором макрофагальным, катехоламинами, фракциями «средних молекул», выделенными из плазмы интактных и обожженных животных.

На основе данных о зависимости общего количества ЭО в культуре и числа островков пролиферирующих классов от дозы эритропоэтина и длительности культивирования построена математическая модель развития эритропоэза in vitro. Впервые с целью оптимизации работы по изучению интенсивности пролиферативного ответа культур ЭО на действие эритропоэзиндуцирующих и ингибирующих развитие эритроидного ростка кроветворения факторов в ходе экспериментального исследования применен последовательный критерий отношения правдоподобия (критерий Вальда).

Впервые установлено, что специфическая стимуляция функций центральных макрофагов ЭО макрофагальным колониестимулирующим фактором сопровождается торможением пролиферативной активности эритроидных клеток их «короны», что свидетельствует о возможном изменении роли центральных макрофагов ЭО по отношению к развивающимся в их «короне» эритроидным клеткам.

Впервые показано, что терминальные стадии эритропоэза, происходящие в эритробластических островках, контролируются медиаторами симпатического отдела вегетативной нервной системы. Введение в культуральную среду норадреналина вызывает выраженную активацию пролиферативных процессов в ЭО в первые сутки культивирования, а эритропоэзстимулирующий эффект адреналина начинает проявлять себя только через 72 часа.

Получены новые данные о влиянии веществ полиэлектролитной природы с молекулярной массой от 0,5-1,5 кДа на эритропоэз. Установлено, что быстроэлюируемые фракции «средних молекул», выделенные из крови интактных животных, обладают разнонаправленным действием на процессы дифференциации, пролиферации и созревания эритроидных клеток в ЭО, что по-видимому, создает определенный баланс между эритропоэз-стимулирующим и эритропоэзтормозящим действием среднемолекулярных веществ полиэлектролитной природы. Фракции «средних молекул», выделенные из крови обожженных животных и обладающие выраженными проксидантными свойствами, угнетают развитие эритроидных клеток, а к 72 часу культивирования вызывают полный лизис культур.

Впервые при исследовании культуры ЭО получены данные о характере изменений состава лейкоцитарных клеток, взаимодействующих с «короной» островков. Показано, что лимфоидные клетки вступают в контакт исключительно с ЭО пролиферирующих классов зрелости. При стимуляции эритропоэза частота контактов молодых ЭО с лимфоидными клетками увеличивается, при торможении пролиферативных процессов в культуре - уменьшается. Присутствие лимфоидных клеток в «короне» культивируемых ЭО, морфологически неотличимых от КОЕэ, объясняет факт самообновления культуры, так как только при наличии колониеобразующих единиц, дающих начало эритроидному ростку, происходит процесс новообразования островков. Показано также, что по мере созревания эритроидных клеток увеличивается частота контактов «короны» ЭО с нейтрофильными и эозинофильными гранулоцитами.

Практическая значимость работы. Метод исследования эритропоэза в культуре ЭО представляет собой тест-систему, позволяющую моделировать различные физиологические и патологические состояния организма при дозированном изменении исходных параметров в культуре ЭО, а также введении в культуральную среду различных гормонов, цитокинов, ростовых факторов, лекарственных веществ. Использование математической модели развития эритропоэза в культуре ЭО значительно сокращает трудоемкость предварительных этапов экспериментов, а также материальные затраты на них. На примере тестирования эритропоэтина, произведенного двумя различными фирмами, в работе продемонстрированы возможности исследования эффективности действия цитокинов на эритропоэз в культуре ЭО.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Культура ЭО представляет собой экспериментальную модель физиологического и компенсационного эритропоэза. Эритропоэз в культуре ЭО, подобно костномозговому эритропоэзу in vivo, сохраняет чувствительность к нервной и гуморальной регуляции, что свидетельствует о сохранности рецепторных и секреторных свойств у центральных макрофагов островков и эритроидных клеток их «короны», а также пролиферативного потенциала эритроидных клеток-предшественниц.

2. Модуляция поддерживающих эритропоэз свойств центральных макрофагов ЭО макрофагальным колониестимулирующим фактором сопровождается угнетением пролиферативных процессов в эритроидных клетках «короны» эритробластических островков. Катехоламины стимулируют пролиферативную активность эритроидных клеток и уменьшают продолжительность их митотического цикла. Фракции «средних молекул», выделенные из плазмы обожженных животных, угнетают эритропоэз в ЭО, что подтверждает их важную роль в патогенезе ожоговой анемии.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на XVII и XIX съездах физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998; Екатеринбург, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения академика И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999), международной научной конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Челябинск, 2001), III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инжиниринг в медицине» (Челябинск,

2002), научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (г.Трехгорный,

2003), международном научном симпозиуме "Югра-ГЕМО" (Ханты-Мансийск, 2004), научной сессии, посвященной 60-летию Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2004), III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные вопросы патологии", посвящённой 70-летию кафедр патологической анатомии и патофизиологии Башкирского государственного медицинского университета (Уфа, 2004), международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004), неоднократно доложены на заседаниях Челябинского отделения Всероссийского физиологического общества им. академика И.П. Павлова и кафедры нормальной физиологии Челябинской государственной медицинской академии.

Основные положения работы освещены в 24 научных публикациях.

Работа выполнена на базе проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики Южно-Уральского научного, центра РАМН (руководитель лаборатории - заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН Ю.М. Захаров) и кафедры нормальной физиологии ЧелГМА (зав. кафедрой — заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН Ю.М. Захаров) при содействии центра математической и статистической поддержки медицинских исследований при ЧелГМА (руководитель центра - доцент ЧелГМА, к.т.н. А.А. Болотов).

Автор искренне благодарит всех сотрудников лаборатории ЮУНЦ РАМН и кафедры нормальной физиологии ЧелГМА, оказавших помощь в выполнении работы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Тишевская, Наталья Викторовна

237 Выводы:

1. Культура эритробластических островков — это новый перспективный метод исследования эритропоэза в экспериментальной гематологии. Культура ЭО выгодно отличается от модельных экспериментов, проводимых in vivo, возможностью экономичного воссоздания физиологического уровня развития эритроидной ткани и различных процессов, сопровождающихся изменением функций ЭО.

2. Культивирование эритробластических островков в присутствии эритропоэтина в дозах 0,25 - 0,5 МЕ/мл позволяет поддерживать темп развития эритроидных клеток в «короне» ЭО на физиологическом уровне, присутствие 1-1,5 МЕ/мл эритропоэтина в культуральной среде вызывает изменения качественного состава ЭО, аналогичные происходящим в кроветворной ткани при компенсационном эритропоэзе.

6. Установлено, что катехоламины регулируют не только развитие ранних эритроидных клеток-предшественниц, но и терминальные стадии эритропоэза. Преимущественная активация а-адренорецепторов норадреналином приводит к всплеску пролиферативной активности эритробластов в первые сутки культивирования, а преимущественная (3-адреностимуляция рецепторов клеток островков адреналином вызывает аналогичные изменения в культуре ЭО через 72 часа культивирования.

7. Вещества полиэлектролитной природы с молекулярной массой от 0,5 до 1,5 кДа, выделенные из плазмы обожженных животных, обладают ингибирующим и цитолитическим действием в отношении эритроидных клеток «короны» ЭО.

Заключение

Исследование эритропоэза в культуре эритробластических островков явилось новым подходом к решению вопросов, связанных с изучением влияния цитокинов и других биологически активных веществ на процессы пролиферации, дифференциации и созревания эритроидных клеток, а также на межклеточные взаимодействия, играющие важную роль в развитии эритроидной ткани. В условиях целостного организма стимуляторы и ингибиторы эритропоэза зачастую находятся в реципрокных взаимоотношениях, и реакция эритроидного ростка на изменение показателей гомеостаза всегда зависит от преобладающего влияния тех или иных факторов гемопоэзиндуцирующего микроокружения, цитокинов, от функции эндокринных желез. Эксперименты, проводимые в условиях in vivo, не позволяют в полной мере оценить ответ клеток на конкретный раздражитель при его малой силе (концентрации), или же ответная реакция клеток изменяется из-за присутствия других биологически активных веществ, конкурирующих с исследуемым веществом на уровне рецепторов. В этом плане своеобразная «изоляция» объекта исследования (ЭО) от других дистантных и контактных регуляторов в экспериментах in vitro дает большие возможности для детального изучения механизмов воздействия исследуемого вещества на процессы жизнедеятельности эритроидных клеток и центральных макрофагов ЭО. При культивировании ЭО в монослое мы наблюдаем сохранение общего числа островков на поверхности культурального сосуда в количестве, равном исходному уровню, в течение 96 часов, несмотря на созревание части из них, что происходит благодаря вновь образующимся ЭО. Такое поддержание эритропоэза на физиологическом уровне, а также увеличение числа ЭО в культуре, вызванное стимуляцией эритропоэза, свидетельствует о том, что исходно в культуре присутствуют КОЕэ, контакт которых с резидуальными макрофагами или макрофагами, ранее участвовавшими в эритропоэзе, и приводит к формированию ЭО 1 класса зрелости и реконструирующихся ЭО.

В результате проведенных нами исследований по изучению влияния возрастающих концентраций эритропоэтина на интенсивность течения эритропоэза в культуре ЭО было установлено, что центральные макрофаги инволюцирующих островков способны формировать новые ЭО в присутствии небольших доз этого специфического для эритроидных клеток гормона (0,12 и 0,25 МЕ/мл) на протяжении 72-96 часов культивирования ЭО. Данный факт свидетельствует о том, что субпопуляция макрофагов, ранее взаимодействовавших с эритроидной тканью, более чувствительна к эритропоэтическому стимулу, чем резидуальные макрофаги костного мозга, фенотипически также способные к созданию эритропоэтического микроокружения. Поэтому можно полагать, что поддерживающие эритропоэз свойства субпопуляции макрофагов костного мозга, обладающих избирательно высоким сродством к клеткам эритроидной линии, развиваются по мере их вовлечения в клеточно-клеточный контакт с эритроидными клетками-предшественницами. Возможно, это является следствием продолжающейся дифференциации моноцитов-макрофагов после их взаимодействия с КОЕэ и эритроидными клетками, ориентированной на создание эритропоэтического микроокружения в костном мозге. Подобная картина наблюдается в костном мозге животных и человека в условиях нормально протекающего эритропоэза, когда при небольшой физиологической концентрации эритропоэтина поддержание уровня эритроцитов в периферической крови обеспечивается, в основном, продуктивной функцией реконструирующихся ЭО (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002).

При исследовании развития культур ЭО нами были получены данные о том, что количественное выражение стимулирующего эритропоэз в культуре ЭО действия 0,25-1,5 МЕ/мл эритропоэтина сопровождается качественными изменениями самих эритроидных клетках, а именно увеличением их пролиферативной активности. Большие величины статмокинетических индексов и меньшая продолжительность митотического цикла эритроидных клеток «короны» эритробластических островков 1 класса зрелости, по сравнению с островками 2 класса зрелости, отчетливо отражают особенность клеточного состава корон этих классов ЭО. Эритроидные клетки, входящие в состав ЭО 1 класса, представлены преимущественно проэритр об ластами и базофильными эритробластами, имеющими меньшую продолжительность митотического цикла в сравнении с клетками «короны» ЭО 2 класса (ранними полихроматофильными эритробластами), величина статмокинетического индекса которых меньше, чем у более молодых эритроидных клеток. Наибольшая митотическая активность эритроидных клеток отмечалась в реконструирующихся ЭО, укорочение продолжительности митотического цикла и нарастание числа митозов в «короне» которых наблюдалось при культивировании островков с 0,25 МЕ/мл эритропоэтина, тогда как эритроидные клетки островков 1 и 2 классов зрелости реагировали повышением пролиферативной активности только в ответ на присутствие в культуральной среде 0,5 и 1 МЕ/мл эритропоэтина. Это также подтверждает наш тезис о том, что центральные макрофаги ЭО рек. создают более активное в отношении развития эритроидных клеток индуцирующее микроокружение. Большие значения статмокинетического индекса и меньшая продолжительность митотического цикла в эритроидных клетках «короны» реконструирующихся островков, по сравнению с клетками «короны» ЭО 1 класса зрелости, может иметь следующее объяснение: во-первых, в течение 24 часов культивирования реконструкция эритропоэза на базе инволюцирующих островков успевает осуществляться в ходе первых «волн» удвоения и дифференциации клеток, возникающих после комплексации КОЕэ к «короне» инволюцирующих островков: проэритробласт —> эритробласт, имеющих наиболее «скоростные» характеристики пролиферативного цикла. В то же время базофильные эритробласты, также входящие в состав «короны» эритробластических островков 1 класса зрелости, имеют большую продолжительность митотического цикла по сравнению с проэритробластами реконструирующихся ЭО. Во-вторых, центральные макрофаги реконструирующихся островков обладают более выраженными эритропоэтическими свойствами по сравнению с центральными макрофагами ЭО 1 класса зрелости за счет секреции сульфатированных гликозаминогликанов (хондроитинсульфата, гепарансульфата) (Харченко М.Ф., 1994,1995,1996) и эритропоэтина (Zakharov Y.M., Prenant. М., 1983), что усиливает эффект внесенного в культуру эритропоэтина на пролиферацию клеток в «короне» ЭО.

Поскольку развитие клеток эритроидной линии в островках поддерживается регуляторными влияниями центральных макрофагов, эритропоэтическая стимуляция культур ЭО отразилась и на функциональной активности этого центрального звена островкового эритропоэза: эритропоэтин дозозависимо стимулировал фагоцитарную способность центральных макрофагов ЭО при 24-часовом культивировании. Природа этого явления, несомненно, связана со значительной перестройкой функций центральных макрофагов, так как через 24 часа от начала культивирования в «короне» островков отмечались выраженные признаки интенсификации эритропоэза в «короне» ЭО, закономерно сопровождающиеся усиленной денуклеацией ядер нормобластов. Однако изменение фагоцитарной активности оказывается равновыраженным и в макрофагах, образовавших эритробластические островки de novo (островки 1 класса зрелости), и в макрофагах, уже имеющих эритроидную развитую «корону» (ЭО 3 класса, инволюцирующие ЭО и реконструирующиеся островки).

Подобное увеличение фагоцитарной активности центральных макрофагов островков всех классов зрелости было отмечено ранее в костном мозге интактных и полицитемичных крыс при внутрибрюшинном введении эритропоэтина (Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П., 1992,1997). Усиление фагоцитарной активности центральных макрофагов под влиянием эритропоэтина имеет большое функциональное значение, так как созревание эритроидных клеток в «короне» островков предполагает утилизацию их ядерного материала, а при неэффективном эритропоэзе - всех клеточных структур островков, и наши исследования показали, что в культуре ЭО этот процесс начинает интенсифицироваться сразу после образования клеточных ассоциаций «макрофаг + КОЕэ».

Очевидно, что помимо изменения своей фагоцитарной активности, центральные макрофаги островков изменяли аффинитет к клеткам белого ряда в зависимости от интенсивности эритропоэтического стимула в культуре. Так, если в условиях физиологического эритропоэза лимфоидные клетки обнаруживались только в островках пролиферирующих классов, то при культивировании с эритропоэтином в контакт с лимфоидными клетками начинали вступать и зрелые островки. Основой для таких клеточно-клеточных взаимодействий может быть увеличение секреции сульфатированных гликозаминогликанов активированными центральными макрофагами островков (Харченко М.Ф., 1996), так как в экстрацеллюлярном матриксе эти соединения выполняют роль адгезивных молекул, поддерживающих межклеточные контакты (Clark Е., 1995). Феномен связи макрофагов эритромиелоидных гемопоэтических островков с лимфоидными клетками ранее был отмечен при стимуляции костномозгового кроветворения (Шахов В.П., 1999), что объяснялось авторами как способность Т-лимфоцитов активировать развитие эритроидных клеток (Ястребов А.П., 1979, 1988). Так, при иммобилизационном стрессе, стимулировавшем гемопоэз у мышей, в составе эритромиелоидных гемопоэтических островков обнаруживались Thy-1.2-лимфоциты, причем предварительное удаление Т-клеток с помощью моноклональных антител значительно тормозило рост числа эритромиелоидных островков при стрессе (Шахов В.П., 1999). Однако нельзя исключить, что среди лимфоидных клеток в «короне» эритробластических островков могут присутствовать также КОЕэ, морфологически сходные с малым лимфоцитом (Facker М., 1990; Захаров Ю.М., 1988). В этом случае наблюдаемое нами при стимуляции эритропоэза в культуре увеличение количества эритробластических островков, контактирующих с лимфоидными клетками, подтверждает возможность присоединения присутствующих в культуре КОЕэ к «короне» инволюцирующих островков и островков 3 класса зрелости, что при развитии компенсационного эритропоэза обеспечивает реконструкцию в ЭО костного мозга.

Большой интерес вызывает количественно изменяющееся присутствие нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов в «короне» ЭО как при моделировании физиологического эритропоэза, так и при выраженной стимуляции развития культуры ЭО высокими дозами эритропоэтина. Известно, что эозинофилы периферической крови, главным образом, участвуют в противопаразитарных и аллергических реакциях, а также в поддержании реакции воспаления (Гриншпун Л.Д., 1982). В гранулах эозинофилов локализованы главный основный белок МВР (от анг. major basic protein), катионный белок, арилсульфатаза В, фосфолипаза D, гистаминаза, лейкотриен С4, простагландин Е2. Цитотоксический эффект эозинофильных гранулоцитов связан с формированием так называемых JIMK (лизирующих мембрану комплексов). Эти своеобразные литические «зонды», помимо образования пор в мембранном бислое, стимулируют в макрофагах и Т-лимфоцитах окислительный метаболизм и секрецию цитокинов.

Поскольку нами было обнаружено, что эозинофильные гранулоциты встречаются исключительно в «короне» зрелых островков, вполне возможно, что мембранодеструктивная функция эозинофилов облегчает процесс фагоцитоза ядер нормобластов центральными макрофагами ЭО. Нельзя также исключить, что зрелые формы нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов могут сами являться объектами фагоцитоза со стороны центральных макрофагов эритробластических островков. На это указывают находки фрагментов нейтрофильных клеток в фагосомах центральных макрофагов (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002).

Феномен влияния продуктов секреции нейтрофилов на эритропоэз в ЭО ранее исследовался в нашей лаборатории в экспериментах in vivo. Так, было установлено, что внутрибрюшинное введение интактным крысам секреторных продуктов активированных нейтрофилов (нейтрофилокинов) увеличивает количество зрелых островков в костном мозге этих животных, что сопровождается закономерным повышением «показателя созревания эритробластов в ЭО» (Волков А.В., 1994). Полученые нами данные о высокой частоте контактов нейтрофильных гранулоцитов с «короной» ЭО 3 класса зрелости и инволюцирующих островков подтверждают предположение авторов, исследовавших влияние нейтрофилокинов на эритропоэз в ЭО, о том, что продукты секреции нейтрофилов, активированных частицами латекса, усиливают в центральных макрофагах ЭО синтез веществ, способствующих ускоренному созреванию эритроидных клеток в «короне» островков. Кроме того, не исключено, что центральные макрофаги и нейтрофильные.лейкоциты могут выполнять согласованные функции по отношению к фагоцитируемым объектам (например, эритроцитам, завершившим свой жизненный цикл).

Наблюдаемое нами изменение аффинитета лимфоидных клеток, нейтрофилов и эозинофилов к эритробластическим островкам позволило нам сделать вывод о правомочности введения в экспериментальную гематологию понятия «смешанного островка». В ряде работ указывается на существование в кроветворной ткани "смешанных" эритро-гранулоцитарных островков (Bentley S.A., 1982; Lee S., 1991; Simmons P., 1984). Однако, полученные нами результаты не дают нам основания называть эритробластические островки, контактирующие с единичными лейкоцитами, "смешанными" островками. К "смешанным" (эритро-гранулоцитарным) островкам, на наш взгляд, правомочно относить островки, в которых имеет место одновременное развитие в контакте с макрофагом клеток эритроидной и гранулоцитарной линий, и развитие гранулоцитарной ткани в этом случае должно быть представлено как способными к пролиферации элементами, так и синхронизированными в развитии неделящимися формами гранулоцитов. Против названия ЭО с гранулоцитами в «короне» «смешанными» островками возражал и М. Бессис, используя образный термин «загрязнение эритробластических островков». Он утверждал, что находки отдельных лейкоцитов в «короне» ЭО есть следствие их адгезии к цитоплазме центральных макрофагов островков (Bessis М., 1978,1991). По нашему мнению, частота взаимодействия нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов с "короной" зрелых эритробластических островков может быть связана с повышенной хемоаттрактацией этих форм лейкоцитов к ЭО и, возможно, вызвана появлением микроповреждений в мембране макрофагов, возникающих после отсоединения ретикулоцитов от «короны» центральных макрофагов ЭО. Поскольку секретируемые макрофагами цитокины Г-КСФ и ГМ-КСФ (Freund М., 1994; Пальцев М., 1995; Захаров Ю.М., 2002; Симбирцев А., 2004; Козлов В., 2004) являются мощными хемоатрактантами для нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов, контакт этих клеток с эритробластическими островками, несомненно, представляет собой процесс адгезии, провоцированный либо изменением физического состояния мембраны макрофага (микротравма мембраны, изменение плотности электроотрицательного заряда), либо изменением распределения на поверхности мембраны сиаловых кислот, кислых гликозаминогликанов и адгезивных молекул.

Математическое моделирование развития культуры эритробластических островков позволило нам приблизиться к решению проблемы создания тест-системы эритропоэза, позволяющей исследовать влияния цитокинов и других биологически активных веществ на темпы пролиферации, дифференциации и созревания эритроидных клеток. Предсказывающие свойства построенной регрессионной модели значительно упрощают выбор срока культивирования и исходной концентрации эритропоэтина, добавляемого в культуральную среду, так как для получения необходимого общего количества эритробластических островков на поверхности культурального сосуда и качественных характеристик популяции островков достаточно свериться с данными модели. К примеру, влияние веществ, обладающих известными эритропоэзингибирующими свойствами, наиболее отчетливо будет проявлять себя в условиях интенсивной исходной пролиферации эритроидных клеток в культуре — активно протекающего процесса формирования ЭО de novo (на базе комплексации КОЕэ с резидуальными макрофагами) и реконструкции эритропоэза на основе присоединения КОЕэ к центральным макрофагам инволюцирующих островков. Согласно данным регрессионной модели, сочетание максимального количества ЭО 1 класса зрелости и ЭО рек. в культуре будет наблюдаться при использовании 0,8-1,2 МЕ/мл эритропоэтина и только в течение первых 24 часов культивирования. Однако при необходимости исследования действия ингибиторов исключительно на процесс реконструкции эритропоэза диапазон «подходящих» концентраций эритропоэтина шире - от 0,6 до 1,4 МЕ/мл, и длительность роста культуры может быть увеличена до 36 часов. В случае тестирования веществ, стимулирующих развитие эритроидных клеток, необходима культура ЭО с сохранным пролиферативным потенциалом, но слабо выраженной эритропоэтиновой стимуляцией, поскольку влияние этого специфического активатора эритропоэза может завуалировать действие тестируемого вещества. Этим условиям отвечает культура ЭО, содержащая либо менее 0,4 МЕ/мл эритропоэтина, либо культура ЭО с исходной концентрацией эритропоэтина от 0,5 до 1,5 МЕ/мл после 70 часов развития. Таким образом, построенная нами регрессионная модель развития эритропоэза in vitro позволяет, не проводя предварительных экспериментов, сразу приступить к изучению влияния биологически активных веществ на интенсивность развития эритроидной «короны» островков и межклеточные взаимодействия в культуре ЭО.

Несмотря на то, что за 20 с лишним лет работы в нашей лаборатории были накоплены обширные сведения о роли костномозговых макрофагов в эритропоэзе, для нас оставалось неясным, как дозированная специфическая стимуляция функций центральных макрофагов ЭО макрофагальным колониестимулирующим фактором отразится на их поддерживающих эритропоэз свойствах. Исследование влияния М-КСФ на развитие культуры ЭО показало, что цитокиновая активация функций центральных макрофагов островков не всегда сопровождается стимуляцией развития их эритроидной «короны». Так, введение М-КСФ в культуральную среду, вызывая выраженную активацию фагоцитарной способности центральных макрофагов ЭО, привело к угнетению процесса формирования островков в культуре и уменьшению пролиферативной активности эритроидных клеток со значительным удлинением продолжительности их митотического цикла. Как специфический стимулятор функций макрофагов, усиливающий продукцию этими клетками компонентов экстрацеллюлярного матрикса (Cavallo М., 1994; Thomson А., 1992; Freund М., 1994; Пальцев М.А., 1995; Захаров Ю.М., 2002; Симбирцев А., 2004; Козлов В.В., 2004;

Фрейдлин И.С., 1995), М-КСФ способствует усилению продукции центральными макрофагами ЭО гликозаминогликанов и протеогликанов, которые повышают эритропоэтические свойства ЭО, так как способны связывать ростковые факторы и создавать большую концентрацию цитокинов вокруг эритропоэтинчувствительных клеток. Ранее в наших исследованиях было показано, что стимуляция эритропоэза кровопотерей или введением эритропоэтина сопровождается увеличением секреции центральными макрофагами эритробластических островков гликозаминогликанов, в частности гепарансульфата и хондроитинсульфата (Харченко М.Ф., 1994-1996), которые являются важным звеном в представлении цитокинов клеткам-мишеням. Есть данные о том, что стимуляция моноцитов в течение 1 суток макрофаг-активирующим агентом (phorbol-12-myristat,13-acetat) приводит к синтезу хондроитинсульфата этими клетками. Высвобождаясь из макрофагов, хондроитинсульфат связывает колониестимулирующие факторы, образуя сверхсульфатированные связи с очень высоким аффинитетом к гемопоэтическим клеткам (Kolset S.T., 1990). В свете этих данных и возник вопрос, почему КСФ-М, активируя фагоцитарную функцию макрофагов островков, подавляет развитие их эритроидной «короны» и уменьшает процесс формирования островков de novo, то есть тормозит действие эритропоэтина? По-видимому, КСФ-М, как специфический регулятор функции центральных макрофагов эритробластических островков, не только активирует фагоцитоз, но и способен индуцировать их ингибиторный эффект в отношении эритропоэза, вероятно, через секрецию повышающих резистентность организма к инфекциям и другим раздражителям тормозящих эритропоэз соединений (ОНФ-а, ИЛ-1, интерферона у, метаболитов ядер нормобластов, фагоцитируемых макрофагами). Эритропоэтин же, повышая фагоцитарную активность центральных макрофагов, не вызывает столь мощную секрецию указанных тормозных соединений в макрофагах островков, но усиливает эритропоэтическое микроокружение для эритроидной «короны» островков и стимулирует синтез эритропоэтина в центральных макрофагах ЭО (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002). Полученные данные позволяют предположить, что одним из механизмов ранее обнаруженного угнетения эритропоэза у больных с активированным моноцитарным звеном в костном мозге или же при создании больших концентраций моноцитов в культурах костного мозга (Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., 1984) является секреция моноцитарно-макрофагальных факторов, тормозящих эритропоэз и/или снижающих эритропоэтические свойства микроокружения в эритробластических островках. Результаты исследования, на наш взгляд, поддерживают высказанную гипотезу о способности центральных макрофагов ЭО регулировать эритропоэз, ориентируя секрецию стимулирующих и угнетающих эритропоэз соединений на кислородный запрос в организме.

Особого внимания заслуживают результаты экспериментов по культивированию ЭО в присутствии катехоламинов, поскольку исследованию механизмов вегетативной регуляции гемопоэза посвящено множество работ, выполненных in vivo (Гольдберг Е.Д., 1997,2004; Моисеева О.И., 1983; Cosentino М., 1999; Johnson D.M., 2002; Павлов А.Д., 2002; Судаков К.В., 2002). Изучение ультраструктурной организации и пространственного расположения эфферентных нервных волокон в костном мозге мышей показало, что по крайней мере 5,2% нервных окончаний находится в гемопоэтической ткани (Yamazaki К., 1990), обеспечивая вегетативный контроль функций кроветворных и стромальных клеток. Существуют данные о том, что катехоламины секретируются не только окончаниями адренергических нервов, но и самими гемопоэтическими клетками. Наболее доказательными в этом плане являются данные о появлении норадреналина и дофамина в супернатантах кратковременных и долговременных культур костного мозга (Maestroni G.J., 1998). Однако прежние знания о роли медиаторов вегетативной нервной системы в развитии кроветворной ткани были ориентированы на модуляцию функций ранних клеток-предшественниц, а данные наших экспериментов показали, что и терминальные стадии эритропоэза подвержены катехоламиновой регуляции. Активация развития эритроидных клеток в культуре ЭО в присутствии адреналина или норадреналина, закономерна, так как in vivo катехоламины повышают кислородный запрос в организме через адренозависимую стимуляцию ключевых дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, что в конечном итоге приводит к интенсификации эритропоэза в костном мозге. Различия во времени развития стимулирующих эритропоэз эффектов адреналина и норадреналина могут объясняться их неоднозначным воздействием на а- и Р-адренорецепторы. Есть данные о том, что плотность Р-адренорецепторов на мембранах гемопоэтических клеток постоянна и не зависит от фазы клеточного цикла, а экспрессия а-адренорецепторов минимальна в фазы Go и G] и достигает максимума в фазы S, G2 и М (Johnson М., 2001; Felten D.L., 1987). Кроме того, в работах с культурой клеток куриного эмбриона было показано, что увеличение количества адреналина в среде культивирования в первые часы исследования угнетает процессы транскрипции и снижает количество цитоплазматической РНК, в то время как активация а-адренорецепторов посредством введения норадреналина сопровождается немедленной стимуляцией транскрипции и увеличением синтеза РНК (Божко Г.Х., 1984).

Анализ влияния фракций «средних молекул» на эритропоэз in vitro позволил дополнить представления о возможностях модуляции процесса кроветворения в костном мозге неспецифическими веществами полиэлектролитной природы, а также определить значение «средних молекул» в механизмах развития анемии при тяжелых ожогах. Традиционно «средние молекулы» рассматриваются как субстрат так называемого «синдрома эндогенной интоксикации», поскольку они обладают выраженным мембранодеструктивным эффектом в отношении клеток миокарда, нервной ткани и гранулоцитарного ростка кроветворения (Галактионов С.Г., 1984; Scribner В.Н., 1975). Однако в наших исследованиях были получены данные о противоположном действии двух различных фракций «средних молекул», выделенных из крови интактных животных. Антипролиферативным в отношении эритроидных клеток действием обладала фракция 3, обладающая выраженными прооксидантными и иммуносупрессорными свойствами (Волчегорский И.А., 1995), а самая быстроэлюируемая фракция 2, проявляющая иммуностимулирующую активность и не имеющая про оксид антных свойств, напротив, стимулировала развитие эритроидной «короны» ЭО в культуре и достоверно уменьшала продолжительность митотического цикла молодых эритроидных клеток. Вероятно, в условиях физиологического эритропоэза эти две фракции «средних молекул» находятся в реципрокных взамоотношениях — ингибиторный эффект фракции 3 компенсируется стимулирующим эритропоэз действием фракции 2.

Нами было установлено, что указанные фракции, выделенные из крови обожженных животных, оказывают выраженное однонаправленное негативное действие на эритропоэз. При культивировании ЭО с фракциями 2 и 3 «средних молекул», выделенными из крови обожженных животных, наблюдалось не только угнетение развития эритроидных клеток (пррлиферация и дифференциация эритробластов прекращалась уже через 24 часа эксперимента), но и явный цитолитический эффект указанных фракций на все клетки культуры. Ранее было показано, что фракции «средних молекул», выделенные из крови животных с термическим ожогом 25% поверхности тела, помимо прооксидантного действия, увеличивают выраженность детергентиндуцированного гемолиза эритроцитов

Волчегорский И.А., 1995). Многие исследователи, занимающиеся проблемой патогенеза и лечения ожоговой анемии, высказывали предположения о существовании в крови обожженных людей и животных веществ, ингибирующих эритропоэз.Так, в работе Е. Deitch и К. Sitting (1993) было показано, что стойкая ингибиция эритропоэза у больных с ожогом более 20% поверхности тела развивается на фоне нормального или повышенного количества эритропоэтина в плазме, что объясняется ими как появление в крови веществ, снижающих чувствительность эритроидных клеток к эритропоэтину. Основываясь на результатах наших исследований, мы можем утверждать, что такими ингибирующими эритропоэз веществами могут являться фракции 2 и 3 «средних молекул», продуцируемые фагоцитирующими мононуклеарами воспалительного очага и, следовательно, играющие важную роль в патогенезе ожоговой анемии.

Таким образом, в механизмах регуляции эритропоэза in vitro отчетливо проявляются те же закономерности, которые существуют в костном мозге в физиологических условиях и при изменении кислородного запроса в организме. Также, как и в условиях костномозгового кроветворения, эритропоэз in vitro протекает в эритробластических островках. Межклеточные взаимоотношения в «короне» культивируемых ЭО полностью сохраняются в течение 120 часов, и центральные макрофаги островков осуществляют свои поддерживающие развитие эритроидных клеток функции на уровне, способном обеспечить пролиферацию, дифференциацию и созревание клеток эритроидного ряда от проэритробластов до ретикулоцитов. Культура ЭО представляет собой не только переживающую популяцию клеточных ассоциаций, напротив, в присутствии эритропоэтина качественный и количественный состав эритробластических островков постоянно обновляется за счет образования новых ЭО как на базе свободно лежащих в культуре макрофагов, так и на основе реконструкции эритропоэза. Это означает, что среди лимфоидных клеток, часто встречающихся в составе «короны» островков пролиферирующих классов, есть КОЕэ, вступающие в митотический цикл под влиянием специфического стимулятора развития клеток эритроидного ряда - эритропоэтина.

Культура ЭО по ряду параметров оказалась более удачной моделью для исследования эритропоэза, чем лабораторные животные, так как, во-первых, она позволяет изучать не завуалированные эндогенными продуктами секреции эффекты биологически активных соединений на эритропоэз, а во-вторых, позволяет значительно сократить как количество животных, необходимых для проведения исследования регуляторного воздействия цитокинов, медиаторов, лекарственных препаратов и т.п., так и количество самих тестируемых в эксперименте веществ. К примеру, при исследовании in vivo дозозависимого влияния эритропоэтина на ЭО костного мозга для получения статистически достоверных результатов каждая исследуемая доза эритропоэтина должна вводится 5 животным, и в случае тестирования 6-ти концентраций гормона на это потребуется 30 однополых и одновозрастных крыс. Поскольку при изучении влияния эритропоэтина на эритропоэз в ЭО важны динамические изменения функционального состояния центральных макрофагов и пролиферативного ответа их эритроидной «короны», забой животных пришлось бы проводить ежедневно в течение 5 суток (30 х 5 = 150 крыс). Для создания динамического контроля потребуется еще 25 животных (150 + 25 = 175 крыс). Если учесть тот факт, что у здорового животного достаточно трудно добиться стимуляции эритропоэза только путем введения эритропоэтина, необходимо иметь в виду, что у всех 150 опытных крыс должна быть предварительно воспроизведена посттрансфузионная полицитемия, поскольку лишь на фоне исходного угнетения красного ростка кроветворения эффект экзогенного эритропоэтина станет заметен. Для получения эритромассы в количествах, достаточных для создания модели полицитемии у одной крысы массой 130-150г, необходима кровь 3-х крыс-доноров массой не менее 250г. Итого: общее количество животных в эксперименте in vivo составило бы 625 крыс. На сегодняшний момент стоимость одной белой беспородной крысы 3-х месячного возраста составляет 35 рублей (625 х 35 руб. = 21875 руб.). Для изучения дозозависимого влияния эритропоэтина на культуру ЭО исходно нами планировалось ввести в эксперимент 60 крыс (суспензия костного мозга 1 крысы равномерно делится на 6 чашек Петри, одна из которых контрольная, остальные 5 — опытные), однако применение последовательного критерия Вальда позволило на этом этапе работы сократить количество экспериментальных животных вдвое (30 х 35 руб. = 1050 руб.). Для изучения влияния различных доз эритропоэтина на эритропоэз в ЭО in vivo потребовалось бы не менее 500 ME цитокина (дозы от 0,6 МЕ/100г массы тела до 15 МЕ/100г массы тела), в то время как на решение этой задачи с помощью культуры ЭО было израсходовано 100 ME эритропоэтина. Однако не только сокращение материальных затрат подвигло нас к изучению эритропоэза в ЭО in vitro. Эритропоэз в культуре ЭО, подобно костномозговому эритропоэзу in vivo, сохраняет чувствительность к нервной и гуморальной регуляции, что свидетельствует о сохранности рецепторных и секреторных свойств у центральных макрофагов островков и эритроидных клеток их «короны», а также пролиферативного потенциала эритроидных клеток-предшественниц. Правильно подобранные режим культивирования и состав культуральной среды дают возможность моделировать и физиологический, и компенсационный эритропоэз в ЭО, а также механизмы развития нарушений эритрона при различных патологических состояниях.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Тишевская, Наталья Викторовна, Курган

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме М.: Мир, 1983.-263 с.

2. Аполлонова JI.A. Эритроцитарные и метаболические сдвиги при длительной экспериментальной гиперкатехоламинемии / JI.A. Аполлонова//Бюлл. экспер. биол. и мед. 1987. - №2.— С. 148-151.

3. Бабская Ю.Е. Интенсивность свободнорадикального окисления липидов в острый период ожоговой болезни / Ю.Е.Бабская, В.А.Лавров, И.А.Омонина // Хирургия.- 1985.- №11С. 95-97.

4. Бернат И. Патогенез ожоговой анемии: (Пер. с венг.).- Будапешт: Изд-во АН Венгрии, 1975.-412 с.

5. Божко Г.Х. Влияние катехоламинов на синтез белков и нуклеиновых кислот / Г.Х. Божко // Пробл. эндокринол. 1984. - №2. - С.3-8.

6. Бычков С. Протегликаны и клетки / С. Бычков, С. Кузьмина // Бюл. экспер. биол. и мед. 1994. - № 2. - С. 124-127.

7. Бююль A. SPSS: искусство обработки информации. Анализ статистических данных и восстановление скрытых закономерностей: Пер. с нем./ А. Бююль, П. Цефель. СПб.: ООО «ДиаСофтЮП», 2002.- 608с.

8. Ветра Я.Я. Цитокины / Я.Я. Ветра, JI.B. Иванова, И.Э. Крейле // Гематология и трансфузиология. 2000. - № 4. - С.42-45.

9. Владимирская Е.Б. Роль ростовых факторов в регуляции кроветворения / Е.Б. Владимирская, А.Г. Румянцев // Гематология и трансфузиология.- 2000. №6. - С.4-8.

10. Бюл. экспер. Биологии и медицины. 1995. - №2. - С.159-162.

11. Воргова JI.B. Об изменении эритробластических островков костного мозга у животных при сочетании тепловых и мышечных нагрузок / JT.B. Воргова, Ю.М. Захаров // Физиол. журнал СССР им. И.М. Сеченова. 1990. Т.76, №2. - С.200-206.

12. Галактионов С.Г. Пептиды группы «средних молекул» / С.Г. Галактионов, В.М. Цейтин, В.И. Леонова и др. // Биоорган. Химия.-1984.-№1.-С.5-17.

13. Гималов Ф.Р. Фактор некроза опухолей и его рецепторы: современное состояние исследований и клиническое применение / Ф.Р. Гималов, А.В. Чемерис, В.А. Вахитов // Успехи совр. биологии. — 2004. Т. 124, № 2. - С.185-196.

14. Гольдберг Е.Д. Роль вегетативной нервной системы в регуляции гемопоэза / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, И.А. Хлусов. Томск: «Изд-во ТГУ», 1997.- 168 с.

15. Гольдберг Е.Д. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов. Томск. 1999. - 128 с.

16. Гольдберг Е.Д. Методы культуры тканей в гематологии / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.П. Шахов. Томск. 1992. - 272 с.

17. Гольдберг Е.Д. Роль нервной системы в регуляции кроветворения. / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, Н.В. Провалова. Томск: «Изд-во ТГУ», 2004.- 186 с.

18. Гриффитс Б. Наращивание клеток животных в культуре / Б. Гриффите // Культура животных клеток. Методы; под ред. Р. Фрешни. М. «Мир», 1988.-С.56-107.

19. Гриншпун Л.Д., Виноградова Ю.Е. Эозинофилы и эозинофилии. / Л.Д. Гриншпун, Ю.Е. Виноградова. М.: Науч. Обзор, 1982. — 184 с.

20. Дерюгина Е.И. / Е.И. Дерюгина, Н.И. Дризе, Н.И. Оловникова, Е.Ю. Садовникова, И.Л. Чертков // Онтогенез. — 1991. Т.22. — С.125-132.

21. Дризе Н.И. Индуцированный облучением ростовой фактор клеток кроветворной стромы: определение в культуре/ Н.И. Дризе, М.А. Эршлер, И.JI. Чертков // Бюл. экперим. биологии и медицины. — 2001. — Т.132, №12.-С.698-700.

22. Дьяконов Л. П. Культивирование клеток и тканей животных / Л. П. Дьяконов, В.Ф. Глухов, А.А. Поздняков, Г.Ф. Денисенко, Т. П. Калмыкова. — Ставрополь, 1988. 91 с.

23. Дыгай A.M. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза / A.M. Дыгай, В.П. Шахов. Томск: Томский государственный университет, - 1989. - 224 с.

24. Егоров В.В. Стволовые клетки человека /В.В. Егоров, А.А. Иванов, М.А. Пальцев // Молекулярная медицина. 2003. - №2. - С.3-13.

25. Епифанова О.И. Клеточный цикл / О.И. Епифанова. М.: Наука, 1973. -191 с.

26. Жданов В.В. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции кроветворения на модели цитостатической миелосупрессии / В.В. Жданов, Е.В. Удут, Л.А. Гурьянцева и др. // Бюл. экперим. биологии и медицины.-2001.-Т.132, №8. с.156-161.

27. Жегалов В.А. Ожоговая анемия патогенез, профилактика и лечение в свете современных требований к переливанию крови / В.А. Жегалов,

28. Д.Я.Алейник, О.Н.Демидова // Вестник интенсивной терапии. — 2003. -№ 3. С. 1-9.

29. Животная клетка в культуре/ под. ред. Л. П. Дьяконова, В. И.

30. Захаров Ю.М. Фагоцитарная активность центрального макрофага эритробластического островка при экспериментальном торможении и стимуляции эритропоэза. / Ю.М. Захаров, Л.П. Варыпаева // Гематология и трансфузиология. 1992. -Т.37, №9. - С.21 -23.

31. Захаров Ю.М. Эффект эритропоэтина на фагоцитарную активность центрального макрофага эритробластического островка у крыс / Ю.М. Захаров, Л.П. Варыпаева // Рос. физиол. журнал им. И.М.Сеченова. 1997. -Т.83, №4. С.86-91.

32. Захаров Ю.М. Кроветворение и возможные механизмы его токсических поражений / Ю.М. Захаров, А.Ф. Каюмова, Ф.Х. Камилов // Здравоохранение Башкортостана. 1994. - № 4. - С.67-81.

33. Захаров Ю.М. О закономерностях реконструкции эритропоэза в эритробластических островках / Ю.М. Захаров, Б.В. Медяник // Физиол. журнал им. И.М.Сеченова. 1994. - Т.80, №3. - С.76-82.

34. Захаров Ю.М. О пролиферативной активности эритробластов в эритробластических островках костного мозга у крыс / Ю.М. Захаров, Б.В. Медяник // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 1997. - Т.83, №7. — С.32-37.

35. Захаров Ю.М. Классификация эритробластических островков костного мозга с учетом изменения их клеточного состава / Ю.М. Захаров, И.Ю. Мельников, А.Г. Рассохин. // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии . 1990. №5. -С.38-42.

36. Захаров Ю.М., Рассохин А.Г. Эритробластический островок. / Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин. // М.:Медицина., 2002. 280 с.

37. Захаров Ю.М. О роли макрофагов костного мозга в регуляции эритропоэза при различных состояниях эритрона / Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин, О.Г. Крестьянинова, Г.П. Ефименко. // Пат. физиол. и эксперимент, терапия . -1991. ТЗ, №3. — С.36-38.

38. Захаров Ю.М. Метод выделения эритробластических островков из костного мозга человека. / Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин, П.Д. Синицын, В.П. Волкова. // Лаб. дело. -1988. №5. С.20-21.

39. Захаров Ю.М. Прогресс в изучении эритропоэза in vitro / Ю.М. Захаров. // Гематол. и трансфузиол. 1988. - №12. - С.25-33.

40. Ивахненко А.Г. Самоорганизация прогнозирующих моделей / А.Г. Ивахненко, Й.А. Мюллер. К.: Техшка, 1984; Берлин: ФЕБ Ферлаб Техник, 1984.-223 с.

41. Игнатов С.В.Система эритрона при ожогах / С.В. Игнатов // Гематология и трансфузиология.- 1990.- Т.35, №3.- С.22-26.

42. Канторова В.И. Пространственно-временная организация внеклеточного матрикса / В.И. Канторова // Онтогенез. 1994. - Т.25,№1. С.14-30.

43. Кетлинский С.А. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции воспаления и иммунитета / С.А. Кетлинский, Н.М. Калинина. // Иммунология. 1995. №3. - С.30-44.

44. Кетлинский С.А. Эндогенные иммуномодуляторы / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев, А.А. Воробьев. СПб: Гиппократ, 1992. - 256с.

45. Кинетические аспекты гемопоэза / под ред. Г.И. Козинца, Е.Д. Гольдберга. Томск: Изд-во Томск, ун-та, 1982. - 311с.

46. Козлов С.А. Костно-мозговое кроветворение при ожоге, кровопотере и их комбинации / С.А.Козлов, Н.И.Атясов, А.Н.Беляев и др.// Междунар. конгресс "Комбустиология на рубеже веков".- М., 2000.- С. 50-51.

47. Козлов В.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор: физиологическая активность, патофизиологические и терапевтические проблемы / В.А. Козлов // Цитокины и воспаление. 2004. - Т.З, №2. — С.3-15.

48. Корнилова Н.В. О возможной роли кислых гликозаминогликанов в поддержании эритропоэза в эритробластических островках костного мозга / Н.В. Корнилова, Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин. // Физиол. журнал им. ИМ.Сеченова. 1994. - №3. - С.83-87.

49. Коробкин А.В. Состояние эритробластических островков костного мозга и моноцитов периферической крови у больных с гипоплазией кроветворения и эритромией / А.В. Коробкин, Ю.М. Захаров, П.Д. Синицын. // Гематол. и трансфузиол. 1988. - №6. - С.52-55.

50. Кузнецов С.А. Поддержание кроветворения и лимфопоэза в культурах на стромальных подложках / С.А. Кузнецов // Методы культивирования клеток: сб.науч.тр. JL: Наука, 1988. — С.265-276.

51. Кулаичев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. STADIA. / А.П. Кулаичев. М.: Информатика и компьютеры, 1999. -341с.

52. Куренков E.JI. Активность ядрышковых организаторов в клетках культур эритробластических островков костного мозга / E.JI. Куренков, С.А. Шевяков, Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин // Рос. физиол. журнал им. И.М.Сеченова. -2002. Т.88, №9. - С. 1182-1190.

53. Лапач С.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях. / С.Н. Лапач, А.В. Чубенко, П.Н. Бабич. — К.: Морион, 2000. 320 с.

54. Лурия Е.А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах / Е.А. Лурия. М.: Медицина, 1972. - 176 с.

55. Мамаева С.Е. Методы анализа культивируемых клеток / С.Е. Мамаева // Методы культивирования клеток: сб.науч.тр. Л.: Наука, 1988. -С.265-276.

56. Мельников И.Ю. Исследование эритробластических островков костного мозга при различных функциональных состояниях эритропоэза: дис. . канд. мед. наук. / И.Ю. Мельников. Челябинск, 1987.-200с.

57. Мисюк Н.С. Корреляционно-регрессионный анализ в клинической медицине / Н.С. Мисюк, А.С. Мастыркин, Г.П. Кузнецов. М.: Медицина, 1975.- 192 с.

58. Моисеева О.И. Нейрогуморальная регуляция эритропоэза. Управление деятельностью висцеральных систем. / О.И. Моисеева. Л.: Наука, 1983.-235 с.

59. Молекулярные аспекты регуляции эритропоэза / под ред. А.Д. Павлова. -Рязань, 1974. 155с.

60. Мосягина Е.Н. Кинетика форменных элементов крови / Е.Н. Мосягина, Е.Б. Владимирская и др. М.:Медицина, 1976. - 281с.

61. Насонов Е.Л. Интерлейкин 1 и его роль в патологии человека / Е.Л. Насонов // Терапевт. Архив. 1987. - №12. - С.112-117.

62. Николаев А. Ю. Сравнение эффективности различных препаратов рекомбинантного эритропоэтина при лечении почечной анемии / А.Ю. Николаев, П.В. Клепиков, С.В. Лашутин. // Клин, фармакология и терапия. 1993. - N 3. - С.30-33.

63. Павлов А.Д. Эритропоэтин: биологические свойства, биосинтез, клиническое применение / А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова, А.Г. Румянцев. -М.Медицина, 2000. 290с.

64. Пальцев М.А. Межклеточные взаимодействия / М.А. Пальцев, А.А. Иванов. М. : Медицина, 1995. - 224с.

65. Парамонов Б.А. Ожоги: Руководство для врачей./ Б.А.Парамонов, Я.О.Порембский, В.Г.Яблонский. СПб.: СпецЛит, 2000.- 480 с.

66. Плис А.И. Практикум по прикладной статистике в среде SPSS: учеб. пособие / А.И. Плис, Н.А. Сливина. М.: Финансы и статистика, 2004. -288с.

67. Повещенко А.Ф. Экспрессия генов цитокинов в костном мозге и экзогенное колониеобразование у мышей (СВА S C57BL)F1 / А.Ф. Повещенко, Е.В. Якушенко, Н.А. Короткова и др. // Гематология и трансфузиология. 2002. - №2. — С.23-24.

68. Повещенко А.Ф. Биология эритропоэтина и его функции в лимфоидной и нервной ткани / А.Ф. Повещенко, В.В. Абрамов, В.А. Козлов // Успехи совр. биологии. -2002. Т.122, № 5. - С.480-488.

69. Пушкарев В.П. Об изменении эритропоэза в эритробластических островках костного мозга крыс после однократной кровопотери / В.П. Пушкарев, Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин // Физиол. журнал им. И.М.Сеченова. 1991. - Т.77, №4. - С. 16-23.

70. Рассохин А.Г. Морфология эритробластических островков костного мозга гематологических больных / А.Г. Рассохин, Ю.М. Захаров, П.Д. Синицын, В.П. Волкова // Архив анатом., гистол. и эмбриол. 1989. - №9. — С.61-67.

71. Рассохин А.Г. О некоторых механизмах комплементарносги клеток в эритробластических островках костного мозга / А.Г. Рассохин, Ю.М. Захаров, О.Г. Крестъянинова. // Физиол. журнал им. И.М.Сеченова. 1991. - Т.77, №1. — С.62-67.

72. Рассохин А.Г. Эритробластические островки костного мозга и их место в эритроне в норме и при изменении состояния эритропоэза в организме: дис. . д-ра мед. наук / А.Г. Рассохин. — Челябинск., 1997. — 420с.

73. Рассохин А.Г. Состояние эритропоэза и функциональные характеристики эритробластических островков костного мозга при стимуляции и ингибиции эритропоэза / А.Г. Рассохин, Д.Г. Круглов, Ю.М. Захаров // Вестник РАМН. -2000.- №2.-С.9-14.

74. Рассохин А.Г. Закономерности становления гемопоэтической функции эритробластических островков костного мозга в раннем онтогенезе / А.Г.

75. Рассохин. II Вестник РАМН. 2002. - №3. С.7-16.

76. Ровенский Ю.А. Клеточные и молекулярные механизмы опухолевой инвазии /Ю.А. Ровенский//Биохимия. 1998. Т.63, №9. С.1204-1221.

77. Ругаль В.И. Ультраструктурная организация кроветворного микроокружения костного мозга человека / В.И. Ругаль, Т.С. Блинова,

78. B.М. Пономаренко и др. // Гематол. и трансфузиол. 1991. - Т.36, №3. —1. C.11-15.

79. Румянцев А.Г. Эритропоэтин в диагностике, профилактике и лечении анемий / А.Г. Румянцев, Е.Ф. Морщакова, А.Д. Павлов. // М. : Медицина . 2003. - 448с.

80. Румянцев С.А. Механизмы Г-КСФ-индуцированной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток / С.А. Румянцев, Е.Б. Владимирская, А.Г. Румянцев. // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2003. - Т.2, № 4. - С.5-9.

81. Рябов С.И. Эритрон и почка / С.И. Рябов, Г.Д. Шостка М.: Медицина, 1985.- 170с.

82. Сарычева Т. Г. Морфофункциональная характеристика эритрона в норме / Т.Г. Сарычева, Г.И. Козинец // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. - №5. - С.3-8.

83. Сенников С. Эритропоэтин как модулятор цитокинсинтезирующей активности клеток эритроидного ряда / С. Сенников, Т. Инжелевская Т., С. Крысов, В. Козлов. // Цитокины и воспаление. 2002.- №1. — С.12-18.

84. Сенюков В.В. Растворимый фактор и межклеточное контактное взаимодействие в цитостазисе, осуществляемом клетками костного мозга / В.В. Сенюков, В.И Селедцов, О.В. Повещенко и др. //

85. Бюллетень эксперим. биол. и медицины. 2000. - Т. 130, № 6. - С.559-563.

86. Симбирцев А.С. Цитокины: классификация и биологические функции / А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. 2004. - Т.З, №2. - С. 16-22.

87. Скобин В.Б. Патофизиология и фармакология эритропоэтина и других гемопоэтических ростовых факторов / В.Б. Скобин, А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова // Гематология и трансфузиология. — 2001. №1. - С.43-44.

88. Судаков К.В. Функциональная система, определяющая оптимальный уровень эритроцитов в организме. / К.В. Судаков, Ю.М. Захаров. // Клин. Медицина. 2002. - Т.80, №4. - С.4-11.

89. Тартаковский А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих./ А.Д. Тартаковский // Методы культивирования клеток: сб.науч.тр. JL: Наука, 1988. — С.44-63.

90. Тотолян В. Роль хемокинов и их рецепторов в иммунорегуляции / В. Тотолян //Иммунология. 2001. - № 5. - С.7-15.

91. Тупицын Н. Н. В. Роль рецептора цитокйнов GP130 в росте и дифференцировке нормальных и опухолевых гемопоэтических клеток / Н.Н. Тупицын, Л.Ю. Андреева, Ю.И. Вульфова // Гематология и трансфузиология. 2002. - №2. - С.3-12

92. ЮЗ.Фрейдлин И.С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиновой регуляторной сети / И.С. Фрейдлин // Иммунология. 1995. - № 3. -С.44-48.

93. Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции / И.С. Фрейдлин // Иммунология. 2001. - № 5. -С.4-6.

94. Фриденштейн А.Я. Клонирование стромальных клеток-предшественниц / А .Я. Фриденштейн // Методы культивирования клеток: сб.науч.тр. Л.: Наука, 1988. - С.257-265.

95. Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворного микроокружения / А.Я. Фриденштейн, Е.А Лурия. М.: Медицина, 1980. - 214с.

96. Харченко М.Ф. Гликозаминогликаны эритробластических островков при угнетении и последующей стимуляции эритропоэза / М.Ф. Харченко, Ю.М. Захаров, Н.В. Корнилова. // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. -1995. Т.81,№7.-С.141-144.

97. Харченко М.Ф. Гликозаминогликаны эритробластических островков костного мозга / М.Ф. Харченко, Ю.М. Захаров, Н.В. Корнилова, Е.С. Битюкова. // Физиол. журнал им. И.М.Сеченова. 1994. - №11. - С.32-36.

98. Харченко М.Ф. Роль гликозаминогликанов в гемопоэзе и физиологических функциях клеток крови / М.Ф. Харченко, А.П. Рыбакова, Н.В. Корнилова // Физиол. журнал им. И.М.Сеченова. 1996. -Т.82, №3.-С. 21-27.

99. Хилько А.С. Морфологические изменения в кроветворных органах крыс под влиянием адреналина / А.С. Хилько, Б.А. Каменев. // Физиол. журнал им. И.М. Сеченова. -1982. №1. - С. 40-45.

100. Холлендер М. Непараметрические методы статистики: пер. с нем. / М. Холлендер, Д. Вульф. — М.: Финансы и статистика, 1983. — 224с.

101. Цуцаева А.А. Влияние моноцитов-макрофагов на колониеобразующую активность нативных и криоконсервированных кроветворных клеток / А.А. Цуцаева, О.В. Кудокоцева, А.В. Щеглов // Гематология и трансфузиология. 2002. - №1. - С.22-24

102. Чертков И.Л. Клеточные основы кроветворения / И.Л. Чертков, А.Я. Фриденштейн. -М.: Медицина, 1977. 131с.

103. Чертков И.Л. Стволовая кроветворная клетка: дифференцировочный и пролиферативный потенциал / И.Л. Чертков, Е.И. Дерюгина, Н.Г. Абрахам, Р.Д. Левир //Успехи соврем, биол. 1991. - Т. 111, № 6. - С. 905-922.

104. Чертков И.Л. Клональное кроветворение у мышей: изучение с помощью генетически маркированных стволовых клеток / И.Л. Чертков, Н.И. Дризе // Пробл. гематол. перелив, крови. 1996. - № 2. -С. 19-29.

105. Чертков И.JI. Принципы организации стволового отдела кроветворной системы / И.Л. Чертков, Н.И. Дризе // Гематология и трансфузиология. -2000. -№4. -С.38-42.

106. Шахов В.П. Феномен трехклеточной кооперации макрофаг-Т-лимфоцит-кроветворная клетка в гемопоэтическом островке костного мозга при стрессе / В.П. Шахов, Б.Ю. Гумилевский, С.С. Шахова и др. // Иммунология. 1999. - №3. - С.25-27.

107. Шхинек Э.К. Интерлейкин-1 в реализации иммунонейроэндокринных взаимосвязей / Э.К. Шхинек, Е.А. Корнева, Е.Г. Рыбакина // Успехи совр. биол. 1993. - Т. 113, №1. - С.95-106.

108. Элементарные основы теории вероятностей и математической статистики : уч.-мет. пособие для студентов и аспирантов мед. вузов /

109. B.М. Блинов, А.А. Болотов, В.В. Аксенов и др. Челябинск : ЧелГМА, 1999.- 114с.

110. Юшков Б.Г. Система крови и экстремальные воздействия на организм / Б.Г. Юшков, В.Г. Климин, М.В. Северин. Екатеринбург: УрО РАН, 1999.-202 с.

111. Юшков Б.Г. Гликозаминогликаны и эритропоэз / Б.Г. Юшков, Г.К. Попов, М.В. Северин, А.П. Ястребов. Екатеринбург: УрОРАН, 1994. -127с.

112. Юшков Б.Г. Сосуды костного мозга и регуляция кроветворения / Б.Г. Юшков, В.Г. Климин, А.И. Кузьмин. Екатеринбург, 2004. - 150 с.

113. Ястребов А.П. Механизмы адаптации кроветворной ткани к гипоксии / А.П. Ястребов, М.В. Попугайло, О.Г. Макеев // Специальная и клиническая физиология гипоксических состояний. Киев. - 1979. —1. C.185-188.

114. Ястребов А.П. Регуляция гемопоэза при воздействии на организм экстремальных факторов / А.П. Ястребов, Б.Г. Юшков, В.Н. Большаков. Свердловск, 1988. - 152с.

115. Abkovitz J.L., Linenberger M.L., Persik M., Newton N.L., Guttorp P. Blood, 1993. 82:2096-2103.

116. Adamcon J. Analysis of erythropoiesis by erythroid colony formation in culture / J. Adamcon, B. Torok-Storb, N. Lin // Blood. 1978. - Vol.4. -P.89-103.

117. Akahane K. Binding of iodinated erythroppoietin to rat bone marrow cells under nirmal and anemic conditions. / K. Akahane, A. Tojo, H. Fucamachi. // Exp.Hematol. 1989. - Vol.17. - P. 177-182.

118. Albelda S. Integrins and other cell adhesion molecules. / S. Albelda, C. Busk. // FASEB J. 1990. - Vol.4. - P.2868-2880.

119. Allen T. Ultrastructural aspects of erythropoietic differentiation in long-term bone marrow culture. / T. Allen, T. Dexter. // Differentiation. 1982. - Vol.21. — P.87-94.

120. Allen T. Cellular interactions in erythblastic islands in long-term bone marrow culture, as studied by time-lapse video. / T. Allen, N. Testa. // Blood cells. 1991. — Vol.213, N 6.-P.29-43.

121. Allison A. Co-ordinate inhibition of the production of TNF, IL-1, IL-6 by small molecules. / A. Allison, E. Eugui. // Ann.N.Y.A.S. 1995. - Vol.762. -P.331-342.

122. Anagnostu A. Erythropoietin hasw a mitogenic and positive chemotactic effect on endothelial cells. / A. Anagnostu, E. lee, N. Kesmain et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. - Vol.87. - P.5978.

123. Anderson D.M. Molecular cloning of mast cell growth factor, a hematopoietin that is active in both membrane bound and soluble forms. / D.M. Anderson, S.D. Lyman, A. Baird et al. // Cell. 1990. - Vol.63. -P.235.

124. Arai K. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. / K. Arai, F. Lee, A. Miyajima A. et al. // S.Annu Rev Biochem. 1990. -Vol.59.-P.783

125. Armitage J.О. Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (sargramostim). / J.O. Armitage // Blood. 1998. - Vol.92. - P.4491-4508.

126. Aruffo A. CD44 is the principal cell surface receptor fpr hyaluronate. / A. Aruffo, I. Staminkovic, M. Melnik et al. // Cell. 1990. Vol.61. - P.1303-1311.

127. Asch A.S. Isolation of the thrombospondin domens and membrane receptor. / A.S. Asch, J. Barnwell, R.L. Silverstein et al. // Clin. Invest. 1987. -Vol.79. -P.1054-1067.

128. Axelrad A. Properties of cells that produce erythrocytic colonies in vitro. / A. Axelrad, D. McLeod, M. Shreeve. // US Goverment Printing Office, 1974,-P.226-234.

129. Baraldi-Junkins C. Hematopoiesis and cytokines. / C. Baraldi-Junkins, A. Beck, G. Rothstein // Hematology/oncology Clinics of North America. -2000.-Vol.14, Nl.-P.7-18.

130. Baron M.H., Farrington S.M. // Mol. Cell. Biol. 1994. - Vol.14. - P.3108-3114.

131. Basic J. Erythropoietin binding to the red cell membrane. / J. Basic, L. Ivanov, T. Pavel. // Physiologie. 1985. - Vol.22. -P.227-231.

132. Beck I. Enhancer element at the 3 flanking region controls transcriptional response to hypoxia in the human erythropoietin gene. /1. Beck, S. Ramirez, R. Weinmann et al. //Biol. Chem. 1991. - Vol.266. - P. 15563-15566.

133. Becker A. Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. / A. Becker, E. McCulloch, J. Till. // J. Nature. 1963. - Vol.197. - P.452-454.

134. Becker S. Three-dimentional structure of the Stat3b homodimer bound to DNA. / S. Becker, B. Groner, C. Muller. // Nature. 1998. - Vol.394. -P. 145 - 151.

135. Beckman В. The action of erythropoietin is mediated by lipoxygenase metabolits in murine fetal liver cells. / B. Beckman, M. Mason, L. Nystien et al. // BBRC. 1987.-Vol.147.-P.392-397.

136. Beng H. Hormon-dependent terminal differentiation in vitro of chiken erythroleukemia cells transformed by ts mutants of avan erythroblastosis virus ( AEV ). / H. Beng, S. Palmicri. // Cell. 1982. - Vol.28. - P.907-919.

137. Ben-Ishay Z. Ultrastructural studies of erythroblastic islands of rat bone marrow / Z/ Ben-Ishay, J.M. Yoffey. // Lab.Invest. 1974. - Vol.30, N3. -P.320-322.

138. Bentley S.A. Bone marrow connective tissue and the haemopoietic microenvironment. / S.A. Bentley // Brit. J. Haematol. 1982. - Vol.50, N1. - P.l-4.

139. Bentley S.A. Some properties of marrow derived adherent cells in tissue culture. / S.A. Bentley, J.M. Foidart. // Blood. 1981. - Vol.66. - P. 10021006.

140. Bentley S.A. Fibronectin-mediated attrachment of hematopoietic cells to stromal elements in continuous bone marrow cultures. / S.A. Bentley, T.S. Tralka. //Exp Hematol. 1983. - Vol.11. -P.129-136.

141. Bernard J. The erythroblastic island: past and future. / J. Bernard. // Blood Cells. 1991. - Vol.17. - P.5-14.

142. Bessis M. Granules ferrugineux observes au microscope electronique dans les cellules de Ia moelle osseuse et dans les siderocytes. / M. Bessis, J. Breton-Gorius // J.C.R. Acad. Sci. 1956. - Vol.243. - P. 1235-1237.

143. Bessis M. Incorporation de granules ferrugineux par les erythroblasts observee au microscope electronique. / M. Bessis, J. Breton-Gorius. // C.R. Soc. Bid. 1956. - Vol.150. -P.1903-1905.

144. Bessis M., Mize С., Prenant M. Erythropoiesis: Comparison of in vivo and in vitro amplification. / M. Bessis, C. Mize, M. Prenant. // Blood cells. 1978. - Vol.4. -P.155-168.

145. Bessis M. Discussion from lecture W. Deimann and E. Strobel. / M. Bessis. // Blood cells. -1991.-Vol. 17.-P. 97-103.

146. Bhatia M. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. / M. Bhatia, J. Wang, U. Kapp et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol.94. - P.5320-5327.

147. Boggs D.R. Hematopoietic stem cells with high proliferative potential. / D.R. Boggs, D.F. Saxe, S.S. Boggs. // J. Clin. Invest. 1982. - Vol.70. -P.242-251.

148. Boissel J. Erythropoietin: mammalian sequences and scanning deletion support a four alpha-helical bundle structural model. / J. Boissel, H. Wen // Annals N.Y. Acad.Sci. 1994. - Vol.718. - P.203-212.

149. Bonanov-Tzedaki S. Stimulation of adenilate cyclase activity of rabbit bion marrow immature erythroblast by erythropoietin and haemin. / S. Bonanov-Tzedaki, M. Setchenska. // Eur.J.Biochem. 1986. - Vol.155. - P.363-370.

150. Boudurant M. Anemia induces accumulation of erythropoietin mRNA in the kidney and liver. / M. Boudurant, M. Koury. // Mol.Cell Biol. 1986. -Vol.6.-P.2731-2733.

151. Brecher G./ G. Brecher, N. Bookstein, W. Redfeam et al. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1993. - Vol.90. - P.6028-6031.

152. Brisce J. JAKs and STATs branch out Trends. / J. Brisce. // Cell Biology. -1996. -Vol.6. -P.336- 340.

153. Buemi M. Erythropoietin and the brain: From neurodevelopment to neuroprotection. / M. Buemi, E. Cavallaro, F. Floccari et al. // Clin Sci. — 2002. Vol.103. - P.275-82.

154. Campbell A. Haemonectin, a bone marrow adhesion protein specific for cells of granulocyte lineage. / A. Campbell, M. Long, M. Wicha. // Nature. -1987. Vol.329. - P.744-746.

155. Campbell A. Developmental regulation of hemonectin binding in hematopoietic cells. / A. Campbell, M. Long, M. Wicha. // Blood. 1990. -V. 76. - P.1758-1766.

156. Caro J. Biological and immunologic erythropoietin in extract from hypoxic rat kidney and in their glomerular and tubular fractions. / J. Caro, A. Erslev //J.Lab.Clin.Med. 1984. - Vol.103. -P.922-931.

157. Castle W. Pathologic physiology and clinical description of the anemia. / W. Castle, G. Minot. // Oxford University Press. N.Y., 1936. 132p.

158. Castro-Malaspina H. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells and their progeny. / H. Castro-Malaspina, R. Gay, G. Resnick et al. // Blood. 1980. - Vol.56. - P.286-289.

159. Cavallo M. Cytokines and autoimmunity / M. Cavallo, P. Rozzilli, R. Thorpe. //Clin.Exp.Immunol. 1994. -Vol.96, N1,- P. 1-7.

160. Cella N. Characterization of Stat5a and Stat5b homodimers and heterodimers and their association with the glucocorticoid receptor in mammary cells / N. Cella, B. Groner, N. Hynes. // Mol.Cell. Biol. 1998. -Vol.18. — P.1783-1792. '

161. Chodosh L. Global regulation of erythroid gene expression by transcription factor GATA-1 / L. Chodosh, M. Weiss. // Blood. 2004. - Vol.102, N8. -P.211-223.

162. Clarke B. Characterization of an erythroid precursor cell of high proliferative capacity on normal human peripheral blood / B. Clarke, D. Housman. // Proc.Nath.Acad.Sci.USA. 1977. - Vol.74. - P. 1105-1109.

163. Clark E. Immune accessory molecules and signal transduction / E. Clark. // Hematology; Ed. Williams. (Fifth edition). N.Y.:MacCrow Hill, 1995. -P.946-959.

164. Cooper A.C. Poor response to recombinant erythropoietin is associated with loss of T lymphocyte CD28 expression and altered interleukin-10 production / A.C. Cooper, C.P. Breen, D. Vyas et al. // Nephrol. Dial. Transplant. -2002. Vol.18. - P.133—140.

165. Copeland N.G. Mast cell growth factor maos near the steel locus on mouse chromosome 10 and is deleted in a number of steel alleles / N.G. Copeland, D.J. Gilbert, B.C. Cho et al. // Cell. 1990. Vol.12. P.63-175.

166. Cosentino M. Endogenous catecholamine synthesis, metabolism, storage and uptake in human neutrophils. / M. Cosentino, F. Marino, R. Bombelli. // Life Sci. 1999. - Vol.64, N11. - P.975-981.

167. Coulombel L. Lineage- and stage-specific adhesion of human hematopoietic progenitor cells to extracellular matrices from marrow fibroblasts / L. Coulombel, M. Vuillet, G. Tchernia. // Blood. 1988. - Vol.71. - P.329-340.

168. Crocker P. Isolation and characterization of resident stromal macrophages and hematopoietic cell clasters from mouse bone marrow / P. Crocker, S. Gordon. // J. Exp.Med. 1985.-Vol.162, N9.-P.993-1014.

169. Crocker P. Properties and distribution of a lectin-like hemagglutinin differentially expressed by murine stromal tissue macrophages / P. Crocker, S. Gordon.// J. Exp. Med. 1986. - Vol.164. - P. 1862.

170. Crocker P. Ultrastructural localization of a macrophage-restricted sialic acid binding hemagglutinin, SER, in macrophage-hematopoietic cell clusters / P. Crocker, Z. Werb, S. Gordon. // Blood. 1990. Vol.76. - P. 1131.

171. Crocker P. Purification and properties of sialoadhesin, a sialic acid-binding receptor of murine tissue macrophages / P. Crocker, S. Kelm, C. Dubois et al.//EMBO J. 1991.-Vol.10.-P.1661.

172. Crocker P. Sialoadhesin, a macrophage sialic acid-binding receptor for haemopoietic cells with 17 immunoglobulin-like domains / P. Crocker, S. Mucklow, V. Bouckson et al. // EMBO J. 1994. - Vol.13. - P.4490.

173. Curtis A. Adhesion of cells to polysterine surfaces / A. Curtis, J. Forrester, C. Mclnnes et al. // J.Cell. Biol. 1983. - Vol.97. - P.1500-1506.

174. Dame С. The biology of erythropoietin in the central nervous system and its neurotrophic und neuroprotective potential / C. Dame, S. Juul, R. Christensen. // Biol. Neonate. 2001. Vol.79. - P.228-235.

175. Dame C. Molecular biology of the erythropoietin receptor in hematopoietic and nonhematopoietic tissues. / C. Dame. // Erythropoietins and erythropoiesis. Basel: Birkhauser Verlag, 2003. -P.35-64.

176. D'Andrea A. Expression cloning of the murine erythropoietin receptor / A. D'Andrea, H. Lodish, G. Wong. // Cell. 1989. - Vol.57. -P.277-285.

177. Daniels G. Expression of red cell surface antigens during erythropoiesis / G. Daniels, C. Green. //Vox Sang. -2000. Vol.78, N2. - P. 149-153.

178. Daniels G. STATs and gene regulation / G. Daniels, C. Green.// Science. — 1997. Vol.277. - P. 1630-1635.

179. Debili N. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow / N. Debili, L. Coulombel, L. Croisille et al. // Blood. 1996. - Vol.88. - P.1284.

180. Deimann W. Activated macrophages induce hemopoietic islands in the adult rat liver/W. Deimann, E. Strobel.//Bloodcells. 1991.- Vol.17,N1. -P.97-103.

181. Deitch E.A. A serial study of the erythropoietic response to thermal injuiy / E.A. Deitch, K.M. Sitting//Annals of surgery. 1993. - Vol. 217, N3. -P. 293-299.

182. De la Chapelle A. Familial erythrocytosis genetically linked to erythropoietin receptor gene / A. De la Chapelle, P. Sistonen, H. Lehvaslaiho et al. // Lancet. 1993. - Vol.341. - P.82-84.

183. Dexter T. Cell interaction in vitro / T. Dexter. // Clin. Haematol. 1979. -Vol.8. - P.453-468.

184. Dexter T. Haemopoiesis in long-term bone marrow cultures / T. Dexter. // Acta haematol. 1979. - Vol.62. - P.299-305.

185. Dexter T. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro / T. Dexter, T. Allen, L. Lajtha. // J. Cell. Physiol. 1977. - V.91. -P.335-344.

186. Dexter Т. Long-term marrow culture: an overview of techniques and experience / T. Dexter, E. Spooncer, P. Simmons // Alan R. Long-term marrow culture. Liss.: New York, 1984. - P.57-96.

187. Digicaylioglu M. Erythropoietin and its receptor in the mouse brain / M. Digicaylioglu, S. Bichet, H. Marti et al. // Experimentia. 1996. Suppl. 52. -P.18.

188. Dinarello C. Biologic basis for interleukin-1 in disease / C. Dinarello. // Blood. -1996. Vol.87. - P.2095-2147.

189. Dordal M. The role of carbohydrate in erythropoietin action / M. Dordal, F. Wang, E. Goldwasser. // Endocrinol. 1985. - Vol.116. - P.2293-2299.

190. Drize N.J. Long-term maintenance of hematopoiesis in irradiated mice by retrovirally transduced peripheral blood stem cells / N.J. Drize, I.L. Chertkov, E. Sadovnikova et al. // Blood. 1997. - V.89, №5. - P. 125-131.

191. Drize N.J. Local clonal analysis of the hematopoietic system shows that multiple small short-living clones maintain life-long hematopoiesis in reconstituted mice / N.J. Drize, J.R. Keller, I.L. Chertkov. // Blood. 1996. -V.88, № 8. - P.2927- 2938.

192. Eaves С. / C. Eaves, H. Sutherland, C. Udomsakdi. // Blood Cells. 1992. -Vol.18.-P.301-307.

193. Ebihara Y. Exclusive expression of G-CSF receptor on myeloid progenitors in bone marrow CD34+-cells / Y. Ebihara, M. Xu, A. Manabe et al. // Br. J. Haematol. 2000. - Vol. 109. - P. 153-161.

194. Egrie J. The molecular biology of erythropoietin. In book: Erythropoietin -molecular, cellular and clinical biology / J. Egrie, J. Bronine. The Johns Hopkins Univ. Press. Baltimore. 1991. - P.21-40.

195. Egrie J. Characterization and biological effects of recombinant human erythrioietin / J. Egrie, T. Strickland et al. // Immunobiol. 1986. - Vol.172. — P.213-224.

196. Epstein E. Bresiz Physiology of renal hypoxia / E. Epstein, Y. Agmon. // Annals N.Y.Acad.Sci. 1994. - Vol.718. - P.72-82.

197. Ellman G.L. The biuret reaction: Changes in the ultraviolet obsorbtion spectra and its application to the determination of peptide bonds / G.L. Ellman // Analit. Biochem. 1962. - Vol.3, № 1. - P.40-48.

198. Erslev A.J. Humoral regulation of red cell production / A.J. Erslev. // Blood.- 1953.-Vol.8.-P.349-357.

199. Eubank T. M-CSF induced vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes / T. Eubank, M. Galloway, C. Montague. // J.Immunol. 2003. - Vol.171, N5. - P.2637-2643.

200. Facker M. Lymphohematopoiesis role of growth factor in leukemogenesis and therapy / M. Facker, L. Stouss. // Hematol.Oncol.Clinics North Amer. -1990. Vol.4, N4. - P.849-865.

201. Fang F. Cycline E-Cdk2 and cell proliferation / F. Fang, G. Orend, N. Watanabe// Science. 1996. - Vol.271. -P.499-502.

202. Feldman L. B-limphocyte-derived burst-promoting activity in pleiotropic erythroid colony-stimulating factor, E-CSF / L. Feldman, J. Fraizier, A. Sytkowski. // Exp.Hematol. 1992. - Vol.20, N10. - P.1223-1228.

203. Felten D.L. Noradrenergic sympathetic neural interactions with the immune system: structure and function./ D.L. Felten, S.Y. Felten, D.L. Bellinger et al. //Immunol. Rev. 1987. -N. 100. -P.225-232.

204. Fisher J.W. Pharmacological agents and erythroid colony formation: effects of beta-adrenergic agonists and steroids / J.W. Fisher, Y. Ohno, B. Modder et al. // New York. 1978. - P. 103-117.

205. Fisher W. Erythropoietin: physiology and pharmacology update / W. Fisher. // Exp. Biol. Med. 2003. - Vol.228, N1. - P. 1-14.

206. Flanagan J.G. Transmembrane form of the kit ligand growth factor is determined by alternative spiling and is missing in the Sid mutant / J.G. Flanagan, D.C. Chan, P. Leder. // Cell. 1991. - Vol.64. - P. 1025.

207. Fraser J. Expression of specific high affinity binding sites for erythropoietin on rat and mouse megakaryocytes / J. Fraser, A. Tan, F. Lin et al. // Exp. Hematol. 1989. - Vol.71. - P. 10.

208. Freund M. Cytokines in hemopoesis, oncology and immunology / M. Freund, H. Link, R. Schmidt. Berlin: Springer-Verlag, 1994. 711 p.

209. Friend C. Cell-free transmission in adult swiss mices: a desease having the character of a leukemia / C. Friend // J.Exp. Med. 1957. - Vol.105. - P.307-318.

210. Fujii Y. Electron microscopic study of erythroblastic islands obtained by «tissue-stamp culture» method / Y. Fujii, N. Terada, H. Ueda. // J. Electron. Microsc. (Tokyo). 1997. - Vol.46, N6. -P.477-84.

211. Funk P. Native association of early hematopoietic stem cells and stromal cells isolated in bone marrow cell aggregates / P. Funk, P. Kincade, P. Witte. // Blood. 1994. - Vol.83, N2. - P.361-369.

212. Gallagher J.T. Role of the cellular matrix in haemopoiesis. I. Synthesis of glycosaminoglycans by mouse bone marrow cell cultures / J.T. Gallagher, E. Spooncer, T.M. Dexter. //J. Cell. Sci. 1983. - Vol.63. - P.155-172.

213. Gasson J.C. Molecular physiology of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor / J.C. Gasson. // Blood. 1991. - Vol.77. - P.l 131.

214. Ghaffari S. Erythropoietin receptor signaling processes / S. Ghaffari, L. Huang, J. Zhang J. et al. // G.Molineux. Erythropoietins and erythropoiesis. Basel: Birkhauser Verlag, 2003. P.65-85.

215. Ghysdael J. Erythroid cell development and leukemic transformation: interplay between signal transduction, cell cycle control and oncogenes / J. Ghysdael, C. Tran Quang, E. Deiner / Pathol. Biol. 2000. - Vol.48, N3. -P.211-26.

216. Giebel B. Segregation of lipid raft markers including CD133 in polarized human hematopoietic stem and progenitor cells / B. Giebel, D. Corbeil, J. Beckmann et al. // Blood. 2004. - Vol. 104. - P. 2332 - 2338.

217. Goldwasser E. Erythropoietin and differentiation of red blood cells / E. Goldwasser // Feder. Proc. 1975. - Vol.34. - P.2285-2292.

218. Gordon M.Y. Characterisation of stroma-dependent blast colony-forming cells in human marrow / M.Y. Gordon, C.R. Dowding, G.P. Riley. // J.Cell. Physiol. 1987. - Vol.36. - P.130-150.

219. Goff J.P. Effects of recombinant cytokines on colony formation by irradiated human cord blood CD34+ hematopoietic progenitor cells / J.P. Goff, D.S. Shields, S.S. Boggs et al. // Radiat. Res. 1997. - Vol.147. - P.61.

220. Graham G. Identification and characterization of an inhibitor of hematopoietic stem cell proliferation / G. Graham, E. Whicht. // Nature. -1990. Vol.344. - P.442-444.

221. Greenberger J. Expansion of hematopoietic stem cells in vitro as a model system for human tissue engineering / J. Greenberger, J. Goff, J. Bush et al. // Orthopedic CI. of North America. 2000. - Vol.31, N3. - P.42-59.

222. Gregory C. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture / C. Gregory // J.Cell Physiol. 1976. - Vol.89. - P.289-302.

223. Gyger M. Immunology of allogeneic peripheral blood mononuclear cells mobilized with granulocyte-colony stimulating factor / M. Gyger, R. Stuart, C. Perreault. // Bone Marrow Transplant. 2000. - Vol.26. - P. 1-16.

224. Halstenson C. Comparative pharmacodynamics of epoetin alfa and epoetin beta / C. Halstenson, M. Macres, S. Katz et al. // Clin. Pharmacol. 1991. -Vol.50.-P.702-712.

225. Ham R.G. Media and growth requirements / R.G. Ham, W.L. McKeehan. // Methods in Enzymology. Academic Press. N.Y. 1979. - Vol.58. - P.44-93.

226. Ham R.G. Survival and growth requirements of nontransformed cells. / R.G. Ham // Handbook of experimental pharmacology. Berlin. 1981. Vol.57. -P.13-88.

227. Ham R.G. Selective media / R.G. Ham // Cell separation. N.Y. 1984. -Vol.3.-P.209-236.

228. Ham R.G. The importance of matching the culture milieu to the cellular model system / R.G. Ham // Cell cultures. N.Y. 1984. - P.71-79.

229. Hampson J. Inhibition of hematopoietic colony-forming cells: normal bone marrow extract versus transforming growth factor-(31 in regulation of hematopoiesis / J. Hampson, B. Lord, S. Redmond. // Ann.N.Y.A.S. 1991. - Vol.628. P.44-52.

230. Hao Q-L. In vitro identification of single CD34+ CD38-cells with both lymphoid and myeloid potential / Q-L Hao, E.M. Smogorzewska, L.W. Barsky. // Blood. 1998. - Vol.91. P.4145.

231. Harmenberg J. G- and GM-CSF in oncology and oncological haematology / J. Harmenberg. // Eur. J. Haematol. 1994. - Vol.52, N55. - P. 1-28.

232. Harrison D.E. / D.E. Harrison, C.M. Astle, J.A. Delaittre. // J.Exp.Med., 1978. Vol. 147. - P. 1526-1531.

233. Harrison P. In situ localization of globin messenger RNA formation / P. Harrison, D. Concia. // J.Cell. Biol. 1984. - Vol.63. - P.402-413.

234. Hattori K. The regulation of hematopoietic stem cell and progenitor mobilization by chemokine SDF-1 / K. Hattori. // Leuk. Lymphoma. 2003. -Vol.44, N4.-P.575-582.

235. Hermine O. An autocrine role for erythropoietin in mouse hematopoietic cell differentiation / O. Hermine, N. Beru, N. Pech. // Blood. 1992. - V.79, N12. — P.3397-3412.

236. Hess D. Functional characterization of highly purified human hematopoietic repopulating cells isolated according to aldehyde dehydrogenase activity / D. Hess, Т. E. Meyerrose, L. Wirthlin et al. // Blood. 2004. - Vol. 104. - P. 1648- 1655.

237. Hirano T. Biological and clinical aspects of interleukin- 6 / T. Hirano, S. Abira, T. Taga et al. // Immunol.Today. 1990. - Vol.11. - P.443-449.

238. Hitomi K. Erythropoietin receptor of a human leukemic cell line with erythroid characteristics / K. Hitomi, K. Eujita, R. Sasaki et al. // BBRC. -1988. Vol.154. - P.902-909.

239. Holly J.M. Insulin-like growth factors; autocrine, paracrine or endocrine? New perspectives of the somatomedin hypothesis in the light of recentdevelopments / J.M. Holly, J.A. Wass J.A. // J. Endocrinol. 1989. -Vol.122/-P.611-618.

240. Horvath C.M. The state of the STATs: recent developments in the study of signal transduction to the nucleus / C.M. Horvath, J.E. Darnell. // Curr.Opin.Cell.Biol. 1997. - Vol.9. - P.233-239.

241. Huang W.H. Bone marrow granulopoietic responces to scolds and wound infection in mice / W.H. Huang, G.S. Wu, Z.X. Hu et al. // Burns. 1988. -Vol.14, № 4.-P.292-296.

242. Hulmes D.J. Structure of collagens / D.J. Hulmes.// Essays Biochem. — 1992,-Vol.27.-P.49-67.

243. Jacobson L.O. Role of the kidney in erythropoiesis / L.O. Jacobson, E. Golgwasser, W. Fried. // Nature. 1957. - Vol.179. - P.633-634.

244. Jelkmann W. Renal erythropoietin: properties and production / W. Jelkmann. // Rev. Physiol. Biochem.Pharmacol. 1986. - Vol.104. - P.139-217.

245. Jelkmann W. Demonstration of high level of erythropoietin in rat kidney following hypoxic hypoxia / W. Jelkmann, C. Baner. // Pflulgers Arch. -1981.- Vol.392. -P.34-39.

246. Johnson M. p2-adrenoceptors: mechanisms of action of beta2-agonists / M. Johnson // Paediatric Resp.Rev. 2001. -N.2. - P.57-62.

247. Johnson D.M. Effects of beta2-agonists on resident and infiltrating inflammatory cells. / D.M. Johnson. // J.Allergy Clin.Immunol. 2002. — Vol.110, N6.-P.282-290.

248. Juul S.E., Joyce A.E., Zhao Y., Ledbetter D.J. Why is erythropoietin present in human milk? Studies of erythropoietin receptors on enterocytes of human and rat neonates / S.E. Juul, A.E. Joyce, Y. Zhao. // Pediatr. Res. — 1999. — Vol.46.-P.263-268.

249. Калайджиева В.Ц. Хуморални и междуклетьчни взаимодействия в регуляцията на еритропоезата : автореф. дис. . докт. наук./ В.Ц. Калайджиева. София, 1996. - 40 с.

250. Kamps A. Role of macrophage colony-stimulating factor in the differentiation and expansion of monocytes and dendritic cells from CD34+ progenitor cells / A. Kamps. // Med. Oncology. 1999. - Vol.16, N1. -P.46-52.

251. Katschinski D.M. Influence of circadian rhythm on 41.8 degrees С whole body hyperthermia induction of haematopoietic growth factors / D.M. Katschinski, G.J. Wiedemann. // Int.J. Hyperthermia. 1997. - Vol.13, N6. -P.571-576.

252. Kie J. Ultrastructural and phenotypic analysis of in vitro erythropoiesis from human cord blood CD34+ cells / J. Kie, Y. Jung, S. Woo et al. // Ann Hematol. 2003. - Vol.82, N5. - P.278-283.

253. Kindler V. Stimulation of hematopoiesis in vivo by recombinant bacterial murine interleukin 3 / V. Kindler, B. Thorens, S. de Kossodo et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol.83. -P.1001-1005.

254. Kirby S.L. Proteoglycan synthesis in two murine bone marrow stromal cell lines / S.L. Kirby, S.A. Bentley. // Blood. 1987. - Vol.70. - P. 1777-1793.

255. Kishimoto T. The biology on interleukin 6 / T. Kishimoto. // Blood. 1989. -Vol.74.-P.l-10.

256. Kishimoto T. Cytokine signal transduction / T. Kishimoto, T. Taga, S. Akira. // Cell. 1994. - Vol.76. -P.253-262.

257. Kisseleva T. Signaling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges / T. Kisseleva, S. Bhattacharya, J. Braunstein et al. // Gene. 2002. - Vol.285, N1-2. - P. 1-24.

258. Klingmuller U. Specific recruitment of SH=PTP1 to the erythropoietin receptor causes inactivation of JAK2 and termination of proliferative signals / U. Klingmuller, U. Lorenz, L. Cantley et al. // Cell. 1995. - Vol.80. -P.729-738.

259. Klinker S. In vitro-derived leukemic erythroid cell lines induced by a raf-and myc-containing retrovirus differentiate in response to erythropoietin / S. Klinker, N. Nicola, G. Johnson. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1988. -Vol.85.-P.8506-8510.

260. Kobajashi M. Recombinant human thrombopoietin (Mpl ligand) enhances proliferation of erythroid progenitors / M. Kobajashi, J.H. Laver, T. Kato et al. // Blood. 1995. - Vol.86. - P.2494-2499.

261. Kollet O. Rapid and efficient homing of human CD34(+)CD38(-/low)CXCR4(+) stem and progenitor cells to the bone marrow and spleen of NOD/SCID and NOD/SCID/B2m(null) mice / O. Kollet. // Blood. 2001. -Vol.97.-P.3283-3291.

262. Kolset S.T. Proteoglycans in hematopoietic cells / S.T. Kolset, J.T. Gallagher. // Biochim.Biophys.Acta. 1990. - Vol.1032.-P. 191-211.

263. Koury M. Erythropoietin cintrol of terminal eyrthroid differentiation : maintance of cell viability, production of hemoglobin and development of the erythrocyte membrane / M. Koury, M. Boudurant, J. Atkinson. // Blood Cells. 1987,-Vol.13.-P.217-226.

264. Koury M. Specific differentiation events induced by erythropoietin in cells infected in vitro with anemia strain of Friend virus / M. Koury, M. Boudurant, D. Duncan. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1982. - Vol.79. -P.635-639.

265. Koury S. Localization of erythropoietin synthesising cells in murine kidneys by in situ hybridization / S. Koury, M. Bondurant. // Blood. 1988. -Vol.71. -P.524-527.

266. Koury S. Quantitation of erythropoietin-producing cells in kidneys of mice by in situ hybridization: erythropoietin mRNA and serum erythropoietin concentration / S. Koury, M. Koury, M. Bondurant. // Blood. 1989. -Vol.74. P.645-651.

267. Koury S.T. Morphological changes in erythroblasts during erythropoietin-induced terminal differentiation in vitro / S.T. Koury, M.J. Koury, M.C. Bondurant. //Exp.Hematol. 1988. - Vol.16. -P.758.

268. Koury S.T. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts / S.T. Koury, M.J. Koury, M.C. Bondurant. //J.Cell.Biol. Vol.109. -P.3005.

269. Kost T. Mature erythroid burst-forming units are target cells for Friend virus-induced erythroid burst / T. Kost, M. Koury, S. Krantz. // Virology. -1981.-Vol.108. P.309-317.

270. Kralovics R. Two new Epo receptors are most frequently asociated with primary familial and congenital polycythemias / R. Kralovics, K. Indrak, T. Stopka et al. // Blood. 1997. - Vol.90. - P.2057-2061.

271. Krantz S. Specefic binding of erythropoietin to spleen cells infected with anemia strain of Friend virus / S. Krantz, E. Goldwasser. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1984. - Vol.81. - P.7574-7578.

272. Kranz S. Eiythropoietin / S. Kranz. //Blood. 1991. - Vol.77. -P.419-434.

273. Kronenwett R. The role of cytokines and adhesion molecules for mobilization of peripheral blood stem cells / R. Kronenwett, S. Martin, R. Haas. // Stem Cells. 2000. - Vol.18, N5. - P.320-330.

274. K.U91 S. Identification of a novel class of human adherent CD34~~ stem cells that give rise to SCID-repopulating cells / S. Ku<?i, J. Wessels, H. Btihring et al. // Blood. 2003. - Vol. 101. - P. 869 - 876.

275. Kurtz S. Renal mesangial cell cultures as a model for study of erythropoietin production / S. Kurtz, W. Jelkmann, F. Sinowatz. // Proc.Natl.Acad.Sci. -1983. Vol.80. - P.4008-4011.

276. Lacombe C. Peritubular cappilar cells are the site of erythropoietin synthesis in the murine hypoxic kidney / C. Lacombe, J. Da Silva, P. Bruneval. // J.Clin.Invest. 1988. - Vol.81. -P.620-627.

277. Lajtha L. Haemopoiesis / L. Lajtha, P. Oliver / ed. by G. Wolstenholme. — London, 1960. 289 p.

278. Lappin T. The cellular biology of erythropoietin receptors / T. Lappin. // Oncologist. -2003.-Vol.8, N1.-P. 15-28.

279. Larochelle A. Identification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating NOD/SCID mouse bone marrow: implications for gene therapy / A. Larochelle, J. Vormoore, H. Hanenberg et al. // Nature Medicine. 1996. - Vol.2. - P.l329.

280. Lee S. Phenotypic analysis of human bone marrow macrophages / S. Lee. // Blood cells. 1991.-Vol.17.-P.45-58.

281. Lee-Huang S. Cloning and expression of human erythropoietin cDNA in E.coli / S. Lee-Huang. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1984. - Vol.81. - P.2708-2712.

282. Leonard W.J. Jaks and STATs: biological implications / W.J. Leonard, J.J. O'Shea. // Annu. Rev.Immunol. 1998. - Vol.16. - P.293-322.

283. Levesque J.P. Cytokines increase human hemopoietic cell adhesiveness by activation of very late antigen (VLA)-4 and VLA-5 integrins / J.P. Levesque, D.I. Leavesley, S. Niutta et al. // J.Exp.Med. 1995. - Vol.181. -P.1805—1815.

284. Levesque J.P. Disruption of the CXCR4/CXCL12 chemotactic interaction during hematopoietic stem cell mobilization induced by GCSF orcyclophosphamide / J.P. Levesque. // J.Clin.Invest. 2003. - Vol.lll. -P. 187-196.

285. Li D. Macrophage-associated erythropoiesis and lymphocytopoiesis in mouse fetal liver: ultrastructural and ISH analysis / D. Li, G. Wang, Z. Liu et al. // Cell.Biol.Int. 2004. - Vol.28, N6. - P.457-461.

286. Lin F. Cloning and expression of the human erythropoietin gene / F. Lin, S. Suggs, C. Lin. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1985. - Vol.82. - P.7580-7584.

287. Lin C. Differential effects of an erythropoietin receptor gene disruption on primitive and definitive erythropoiesis / C. Lin, S. Lim, V. D'Agati. // Genes Dev.- 1996.-Vol.10.-P.154-157.

288. Logan A. Intracrine regulation at the nucleus a further mechanism growth factor activity?/ A. Logan. // J. Endocrin. - 1990. - Vol.125. - P.339-343.

289. Carnot P. / P. Carnot, C. Deflandre, C. Hebd. // Seances Acad. Sci. Ser M3, 1906. -P.384-387.

290. Long M.W. Thrombospondin functions as a cytoadhesion molecule for human hemstopoietic progenitor cells / M. W. Long, Y. M. Dixit. // Blood. -1990. Vol. 75. - P.2311 -2319.

291. Lord B.I. Proliferation regulators in haemopoiesis / B.I. Lord. // Clin.Hematol. 1979. - Vol.8, N2. -P.435-451.

292. Luikart S.D. A heparan sulfate fraction of bone marrow induces maturation of HL60 cells in vitro / S. D. Luikart, L.T. Manglia, J.B. Furch. // Cancer Res. 1990. - Vol.50.-P.3781-3791.

293. Luikart S.D. Bone marrow matrix modilation of HL-60 phenotype / S.D. Luikart, J.L. Sackrison, C.A. Manglia. // Blood. 1987. -r Vol.70. - P. 11191126.

294. Maestroni G.J. Neural and endogenous catecholamines in the bone marrow / G.J. Maestroni, M. Cosentino, F. Marino. // Exp.Hematol.Nov. 1998. -Vol.26, N. 12.-P. 1172-1177.

295. Malik P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells / P. Malik, T. Fisher, L. Barsky. // Blood. — 1998. Vol.91, N.8. - P.2664-2671.

296. Maroudas N. Adhesion and spreading of cells on charged surfaces / N. Maroudas. //J. Teor.Biol. 1975. - Vol.49. -P.417-424.

297. Marshall C. Tumor suppressor genes / C. Marshall. // Cell. 1991. - Vol.64. - P.313-326.

298. Maxwell A. Erythropoietin production in kidney tubular cells / A. Maxwell, T. Lappin, C. Johnson et al. // Br.J.Haematol. 1990. - Vol.74. - P.535.

299. Mc Leod D. Improved plasma culture system for production of erythrocytic colonies in vitro: quantitative assay method for CFU-E / D. Mc Leod, M. Shreeve, A. Axelred. // Blood. 1974. - Vol.44. -P.517-534.

300. Means R. Inhibition of human erythroid colony-forming units by tumor necrosis factor requires beta interferon / R. Means, S. Krantz. // J.Clin.Invest. 1993. - Vol.91.-P.416-419.

301. Metcalf D. / D. Metcalf. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1991. - Vol.88. - P. 1131011314.

302. Metcalf D. The granulocyte-macrophage colony stimulating factors / D. Metcalf // Cell. - 1985. - Vol.43. -P.5-6.

303. Metcalf D. The hemopoietic colony stimulating factors / D. Metcalf. — New York:Elsevier, 1984.

304. Miller B. Erythropoietin stimulates a rise in intracellular free calcium concentration in single BFU-E derived erythroblasts at specific staged of differentiation / B. Miller, J. Cheung, D. Tillotson. // Blood. 1989. -Vol.73.-P.l 188-1194.

305. Minguell J.J. Proteoglycan synthesis by hematopoietic progenitor cells / J.J. Minguell, M. Tavassoli. //Blood. 1989. - Vol.73. - P. 1821-1830.

306. Miyake K. Monoclonal antibodies to Pgr-1/Cd44 block lympho-hemopoiesis in long- term bone marrow cultures / K. Miyake, K. Media, S. Hayashi et al. // Exp.Med. 1990. - Vol.171. - P.477-485.

307. Miyake T. Purification of human erythropoietin / T. Miyake, C. Kung, E. Goldwasser. // J.Biol.Chem. 1977. - Vol.252. - P.5558-5564.

308. Moffat F.L. / F.L. Moffat, T. Han, Z. Li et al. // Cell. Physiol. 1996. -Vol.168.-P.638-647.

309. Mohle R. Transendothelial migration of CD34+ and mature hematopoietic cells: an in vitro study using a human bone marrow endothelial cell line / R. Mohle, M.A. Moore, R.L. Nachman et al. // Blood 1997. - Vol.89. - P.72-80.

310. Mohle R. The role of endothelium in the regulation of hematopoietic stem cell migration / R. Mohle, S. Raffii, M. Moore. // Stem Cells. 1998. -Vol.16, N1.-P.159-165.

311. Moore M. Prolonged hematopoiesis in a primate bone marrow culture system: characteristics of stem cell production and the hematopoietic microenvironment / M. Moore, A. Sheridan, T. Allen et al. // Blood. 1979. - Vol.54.-P.775-793.

312. Morris L. Expression of a divalent cation-dependent erythroblast adhesion receptor by stromal macrophages from murine bone marrow / L. Morris, P. Crocker, I. Fraser et al. // J.Cell.Sci. 1991. - Vol.99. - P. 141.

313. Morrison S. Regulatory mechanisms in stem cell biology / S. Morrison, N. Shah, D. Anderson. // Cell. 1997. - Vol.88. - P.287-299.

314. Mucenski M./ M. Mucenski, K. McLain, A. Kier et al. // Cell. 1991. -Vol.65. - P.677-689

315. Mufson P. Binding and internalization of recombinant human erythropoietin in murine erythroid precursors cells / P. Mufson, T. Gesner. // Blood. — 1987. Vol.69. - P.1485-1490.

316. Muta К. Stem cell factor retards differentiation of normal human erythroid progenitor cells while stimulating proliferation / K. Muta, S. Krantz, M. Bondurant et al. // Blood. 1995. - Vol.86. - P.572.

317. Nakahata Т. / T. Nakahata, A J. Gross, M. Ogawa. // J.Cell.Physiol. 1982. -Vol.13. -P.455-458.

318. Neuz В. / B. Neuz, D. Michalovich, A. Bygrave et al. // Nature. 1995. -Vol.375.-P.316-318.

319. Nerlov C. GATA-1 interacts with the myeloid PU.l transcription factor and represses PU. 1-dependent transcription / C. Nerlov, E. Querfurth, H. Kulessa et al. // Blood. 2000. - Vol.95. - P.2543-2551.

320. Nerlov C. Regulatory interactions between transcription factors and their role in lineage determination / C. Nerlov, D. Tenen, T. Graf. -Hematopoiesis. Oxford: Oxford University Press, 2001. - P.363-367.

321. Neta R. The cytokine concept: historical perspectives and current status of the cloned cytokines / R. Neta, J.J. Oppenheim, S.K. Durum. // Cohen S. Lymphokines and the Immune Response. Boca Raton. EL: CRC Press Inc., 1990. - P.29-42.

322. Olweus G. Expression and function of receptors for stem cell factor and erythropoietin during lineage commitment of human hematopoietic progenitor cell / G. Olweus, L. Terstappen, P. Thompson. //Blood. 1996. — Vol.88, N5. - P.1594-1607.

323. Papayannopoulou T. Anti-VLA4/VCAM-1-induced mobilization requires cooperative signaling through the kit/mkit ligand pathway / T. Papayannopoulou, G.V. Priestley, B. Nakamoto. //Blood. 1998. - Vol.91. -P.2231-2239.

324. Patel V.P. Mammalian reticulocytes lose adhesion to fibronectin during maturation to erythrocytes / V.P. Patel, A. Ciechanover, O. Piatt et al. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1985. - Vol.82. - P.440-448.

325. Patel V.P. Loss of adhesion of murine erythroleukemia cells to fibronectin during erythroid differentiation / V.P. Patel, H.F. Lodish. // Science. 1984. - Vol.224.-P.996-1008.

326. Paul W., Seder R. Lymphocyte response and Cytokines / W. Paul, R. Seder. //Cell. 1994. - Vol.76. -P.241-251.

327. Perkins A.C. / A.C. Perkins, A.H. Shape, S.H. Orkin. // Nature. 1995. -Vol.375.-P.318-322

328. Perrine S. MB-02 cells undergo fetal to adult globin gene switching in response to erythropoietin / S. Perrine, B. Miller, D. Morgan. // BBRC. -1989. Vol.164. - P.857-862.

329. Peschel C. Changes of the phenotype of erythroid progenitor cells and their progenies during early steos of differentiation / C. Peschel. // Brit J.Haematol. 1987.-Vol.65. - P.131-135.

330. Peters C. Expression of hemonectin: an extracellular matrix hematopoietic cytoadhesion molecule / C. Peters, K.S. O'Shea, A.D. Campbell et al. // Blood. 1990. - Vol.75. -P.357-368.

331. Pollycove M. The erythroblastic island: exocytosis of erythro'blast ferritin during erythropoiesis / M. Pollycove. // Blood cells. 1991. - Vol.17. -P.147-156.

332. Prosper F. Mobilization and homing of peripheral blood progenitors is related to reversible downregulation of alpha4 betal integrin expression and function / F. Prosper, D. Stroncek, J.B. McCarthy et al. // J.Clin.Invest. -1998.-Vol.101.-P.2456-2467.

333. Qiu L. Extruded erythroblast nuclei are bound and phagocytosed by a novel macrophage receptor / L. Qiu, H. Dickson, M. Hajibagheri et al. // Blood. -1995. Vol.85,N6. - P.1630-1639.

334. Ramsey W. Surface treatments and cell attachment / W. Ramsey, W. Hertl, E. Nowlan et al. // In Vitro. 1984. - Vol.20. - P.802-808.

335. Randall T.D. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: Resting stem cells or mystery population? / T.D. Randall, I.L. Weissman. // Stem Cells. 1998. — Vol.16. -P.38.

336. Rane S. JAKs, STATs and Scr kinases in hematopoiesis / S. Rane, E. Reddy. // Oncogene. 2002. - Vol.21,N.2. - P.3334-3358.

337. Ratajczak J. Biological significance of the different erythropoietic factors secreted by normal human early erythroid cells / J. Ratajczak, J. Kijowski, M. Majka et al. // Leuk.Lymphoma. 2003. - Vol.44, N5. - P.767-774.

338. Rausch O. Tyrosine 763 of murine granulocyte colony-stimulating factor receptor mediates Ras-dependent activation of JNK/SAPK mitogen-activated protein kinase pathway / O. Rausch, C. Marshall. // Mol.Cell.Biol. 1997. - Vol.l7,N3.-P.l 170-1179.

339. Rich I. Extrarenal erythropoietin production by macrophages / I. Rich, W. Heit, B. Kubanek.//Blood. 1982. - Vol.60. - P. 1007-1018.

340. Rich I. Erythropoietin gene expression in vitro and in vivo detected by in situ hybridization / I. Rich, C. Vogt, S. Pentz. // Blood Cells. 1988. -Vol.14. -P.505-520.

341. Roberts R. Heparan sulphate bound growth factors: a mechanism for stromal cell mediated haemopoiesis / R. Roberts, J. Gallagher, E. Spooncer et al. // Nature. 1988. - Vol.69. - P.332-376.

342. Rusten L. Bifunctional effect of TNF-a on the growth of mature and primitive human hematopoietic progenitor cells / L. Rusten, F. Jacobsen, W. Lesslauer. // Blood. 1994. - Vol.83. - P.3152-3162.

343. Sadahira Y. Role of the macrophage in erythropoiesis / Y. Sadahira, M. Mori. // Pathol. International. 1999. - Vol. 49, N10. -P.841-849.

344. Sakaguchi M. The expression of functional erythropoietin receptor on an IL-3 dependent cell line / M. Sakaguchi, Y. Koishiohara, H. Tsuda et al. // BBRC. 1987. - Vol.146. - P.7-12.

345. Salven P. VEGFR-3 and CD133 identify a population of CD34+ lymphatic/vascular endothelial precursor cells / P. Salven, S. Mustjoki, R. Alitalo etal.//Blood.-2003.-Vol. 101.-P. 168 172.

346. Sawada K. Quantitation of specific binding of erythropoietin to human erythroid colony-forming cells / K. Sawada, S. Krantz, S. Sawyer et al. // J.Cell Physiol. 1988. - Vol.137. - P.337-345.

347. Sawyer S. Erythropoietin stimulates Ca uptake in Friend Virus-infected eyrhtroid cells / S. Sawyer, S. Krantz. // J.Biol.Chem. 1984. - Vol.259. -P. 1769-1774.

348. Sawyer S. Identification of receptor for erythropoietin by cross-binding to Friend virus-infected erythroid cells / S. Sawyer, S. Krantz, S. Luka. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1987. - Vol.84. -P.3690-3694.

349. Sawyer S. Receptors for erythropoietin in mouse and human erythroid cell and placenta / S. Sawyer, S. Krantz, K. Sawada. // Blood. 1989. - Vol.74. -P.103.

350. Schlag G. Pathophysiology of shock, sepsis, and organ failure / G. Schlag, H. Redl. Berlin: Springer-Verlag, 1993. - 1165 pp.

351. Schuster J. Physiologic regulation and tissue localization of renal erythropoietin mRNA / J. Schuster, J. Wilson, A. Erslev. // Blood. 1987. -Vol.70.-P.316-319.

352. Scribner B.H. Evidence for toxins of «middle molecular» weight / B.H. Scribner, A.L. Babb // Kidney Int. 1975. - Vol. 7. - P.349-351.

353. Sehgal P. Regulation of IL6 gene expression / P. Sehgal. // Res.Immunol. -1992.- Vol.143. P.724-734.

354. Selleri C. Interferon-gamma constitutively expressed in the stromal microenvironment of human marrow cultures mediates potent hematopoietic inhibition / C. Selleri, J. Maciejewski, T. Sato. // Blood. 1996. - Vol.87. -P.4149-4157.

355. Semenza G. Human eyrhropoietin gene expression in transgenic mice: multiple transcription initiation sites and cis-acting regulatory elements / G. Semenza, R. Durera, M. Traystman. // Mol.Cell Biol. 1990. - Vol.10. -P.930-938.

356. Semenza G. Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3' to the human erythropoietin gene / G. Semenza, M. Nejfelt, S. Chi et al. // Proc.Nat.Acad.Sci USA. 1991.-Vol.88.-P.5680-5684.

357. Semenza G. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis bind to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation / G. Semenza, G. Wang. // Mol.Cell.Biol.-1992. Vol. 12. - P.5447-5454.

358. Seshasayee D. GATA-1 dominantly activates a program of erythroid gene expression in factor-dependent myeloid FDCW2 cells / D. Seshasayee, P.

359. Gaines, D.M. Wojchowski. // Mol.Cell.Biol. 1998. - Vol.18. - P.3278-3288.

360. Shanks J. Localization of erythropoietin gene expression in proximal renal tubular cells detected by digoxigenin-labelled oligonucleotide probes / J. Shanks, C. Hill, T. Lappin. // J.Pathol. 1996. - Vol.179. - P.283-287.

361. Shivdasani R.A. Erythropoiesis and globin gene expression in mice lacking the transcription factor NF-E2 / R.A. Shivdasani, S.H. Orkin. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1995. - Vol.92. - P.8690-8694.

362. Sieff C. Dependence of higly enriched human bone marrow progenitors on hemopoietic growth factors and their response to recombinant erythropoietin / C. Sieff, S. Emerson, A. Mufson et al. // J.Clin.Invest. 1986. - Vol.77. -P.74-81.

363. Simmons P. Cellular interactions in vitro haemopoiesis: Thesis of Doctor of Phylosophy / P. Simmons. Manchester, 1984. - 230p.

364. Siren A.L. Erythropoietin and erythropoietin receptor in human ischemic/hypoxic brain / A.L. Siren, F. Knerlich, W. Poser et al. // Acta Neuropathol. 2001. - Vol.101. - P.271-276.

365. Slater N. The human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor receptor a2 isoform influences haemopoietic lineage commitment and divergence / N. Slater, M. Yamaguchi, D. Rothwell et al. // Brit.J.Haematol. -2003. Vol.122, N.1.-P.150.

366. Smith D.M. Peripheral Blood Stem Cells / D.M. Smith, R.A. Sacher. -Washington, 1993.

367. Sokol L. Primary familial polycythemia: a frameshift mutation in the erythropoietin receptor gene and increased sensitivity of erythroid progenitors to erythropoietin / L. Sokol, M. Luhovy, Y. Guan et al. // Blood. 1995.-Vol.86.-P.15-22.

368. Spooncer F. Regulation of haemopoiesis in long-term bone marrow cultures. IV. Glycosaminoglycann synthesis and the stimulation of haemopoiesis by beta-D-xylosides / F. Spooncer, J.T. Gallagher, F. Krizsa. // J.Cell.Biol. -1983.-Vol.96.-P.510-524.

369. Stamatoyannopoulos G. The molecular basis of blood diesease / G. Stamatoyannopoulos, A.W. Nienhuis. Philadelhpia: WB Saunders, 1994. -P.107-136.

370. Stamencovic I. A lympocyte molecule implicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family /1. Stamencovic, M. Amiot, J.M. Pesando.//Cell. 1989.-Vol.56.-P. 1057-1065.

371. Starr R. A family of cytokine-inducible inhibitors of signalling / R. Starr, T.A. Willson, E.M. Viney et al. // Nature 1997. - Vol.387. - P.917-921.

372. Steven L. Genetic regulation of osteoclast development and function / L. Steven. // Nat.Rev.Genetics. 2003. - Vol.4, N8. - P.638-649.

373. Stocklin E. Functional interactions between Stat5 and the glucocorticoid receptor / E. Stocklin, M. Wissler, F. Gouilleux. // Nature. 1996. -Vol.383.-P.726-728.

374. Stopka T. Human hematopoietic progenitors express erythropoietin / T. Stopka, J. Zivny, P. Stopkova et al. // Blood. 1998. - Vol.91, N10. -P.3766-3772. '

375. Starring P.L. Epoetin aifa and beta differ in their erythropoietin isoform compositions and biological properties / P.L. Storring, R.J. Tiplady, R.E. Gaines Das et al. // Br.J.Haematol. 1998. - Vol.100. - P.79-89.

376. Strobel E. Adhesion and migration are differentially regulated in hematopoietic progenitor cells by cytokines and extracellular matrix / E.

377. Strobel, S. Kleist, M. Dangel. // Blood. 1997. - Vol.90, N.9. - P.3524-3532.

378. Suda Т. / T. Suda, J. Suda, M. Ogawa. // J.Cell.Physiol. 1983. - Vol.l 17. -P.308-317.

379. Takahashi T. Inhibitory interaction of c-Myb and GATA-1 via transcriptional co-activator СВР / Т. Takahashi, N. Suwabe, P. Dai. // Oncogene. 2000. - Vol. 19. - P. 134-140.

380. Thomson A.M. Cytokines handbook / A.M. Thomson. London ect: Acad Press, 1992.-425 pp.

381. Todokoro K. Characterization of erythropoietin receptor on erythropoietin-responsive mouse erythroleukemia cells / K. Todokoro, S. Kahazawa, H. Amanuma et al. // Biochim.Biophys.Acta. 1988. - Vol.943. - P.326-337.

382. Todokoro K. Specific binding of erythropoietin to its receptor on responsive mouse erythroleukemia cells / K. Todokoro, S. Kahazawa, H. Amanuma et al. // Proc.Natl.Acad.Sci. 1987. - Vol.84. - P.4126-4130.

383. Tordjman R. Erythroblasts are a source of angiogenic factors / R. Tordjman, S. Delaire. // Blood. 2001. - Vol.97, N7. - P. 1968-1974.

384. Tracey K.J. Tumot necrosis factor: a pleiotropic cytokine and therapeutic agent / K.J. Tracey, A. Cerami. // Ann.Rev.Immunol. 1994. — Vol.45. -P.491-503.

385. Trainor C.C. / C.C. Trainor, J.G. Omichinski, T.L. Vandergon // Mol.Cell.Biol. 1996,- Vol.16. - P.2238-2247.

386. Trevisan M. Cycle initiation and colony formation in culture by murine marrow cells with long-term reconstituting potential in vivo / M. Trevisan, X-Q. Yan, N.N. Iscove. //Blood. 1996. - Vol.88. -P.4149.

387. True D.D. Requirement for sialic acid on the endothelial ligand of a lymphocyte homing receptor / D.D. True, M.S. Singer, L.A. Lasky. // J.Cell.Biol. 1990. - Vol.111. - P.2757.

388. Tsai F. / F. Tsai, G. Keller, F. Kuo. // Nature. 1994. - Vol.371. - P.221-226.

389. Tsai S. Differential binding of erythroid and myeloid progenitors to fibroblasts and fibronectin / S. Tsai, V. Patel, E. Beaumont. // Blood. 1987. -Vol.69. -P.1587-1599.

390. Tsai S. Stromal cell-associated erythropoiesis / S. Tsai, C.A. Sieff, D.G. Nathan. // Blood. 1986. - Vol.67. - P. 1418-1427.

391. Tsuji K. Expression of G-CSF receptor on myeloid progenitors / K. Tsuji, Y. Ebihara. //Leuk.Lymphoma. 2001. - Vol.42, N6. - P.1351-1357.

392. Van den Akker E. Tyrosine kinase receptor RON functions downstream of the erythropoietin receptor to induce expansion of erythroid progenitors / E. Van den Akker, T. Dijk, M. Amelsvoort. // Blood.- 2004. Vol.103, N12. -P.4457-4465.

393. Von Lindern M. Control of Erythropoiesis by Erythropoietin and Stem Cell Factor: A Novel Role for Bruton's Tyrosine Kinase / M. Von Lindern, U. Schmidt, H. Beug. // Cell Cycle. 2004. - Vol.26, N3. - P. 12-14.

394. Voura E.B. Expression mapping of adhesion receptor genes during differentiation of individual hematopoietic precursors / E.B. Voura, F. Billia, N.N. Iscove et al. // Exp.Hematol. 1997. - Vol.25. - P.l 172.

395. Wagner W. Molecular evidence for stem cell function of the slow-dividing fraction among human hematopoietic progenitor cells by genome-wide analysis / W. Wagner, A. Ansorge, U. Wirkner et al. // Blood. 2004. - Vol. 104.-P. 675 -686.

396. Ward A. The Jak-Stat pathway in normal and perturbed hematopoiesis / A. Ward, I. Touw, A. Yoshimura. // Blood. 2000. - Vol.95, N.l. - P. 19-29.

397. Warren A.J. / A.J. Warren, W. H. Colledge, M.L. Carlton et al. // Cell. -1994.-Vol.78.-P.45-57.

398. Waterhouse E.J. Collagen synthesis by murine bone marrow cell culture / E.J. Waterhouse, P.J. Quesenberry, G. Balian. // J.Cell.Physiol. 1986. -Vol.43.-P. 127-397.

399. Weber M. Basement membrane proteins / M. Weber. // Kidney Int. 1992. -Vol.41.-P.620-628.

400. Weiss M.J. / M.J. Weiss, G. Keller, S.H. Orkin. // Genes Development. -1994.-Vol.8.-P.l 184-1197.

401. Weiss M.J. / M.J. Weiss, S.H. Orkin. // Exp.Hematol. 1995. - Vol.23. -P.99-107.

402. Wight T.N. Proteoglycans in human long-term bone marrow cultures: biochemical and ultrastructural analyses / T.N. Wight, M.G. Kinsella, A. Keating.//Blood. 1986.-Vol.67.-P.1333-1345.

403. Williams D.E. Identification of a ligand for the c-kit proto-oncogene / D.E. Williams, J. Eisenman, A. Baird et al. // Cell. 1990. - Vol.63. - P. 167.•м

404. Wisnewski D. Enrichment of hematopoietic progenitor cells (CFU-E and BFU-E) from human peripheral blood / D. Wisnewski, C. Platsoncos, A. Strife et al. // Blood. 1988. - Vol.70. -P.817-825.

405. Wojchowski D. Active human erythropoietin expressed in insect cells using a baculovirus vector: a role for N-linked oligosacharide / D. Wojchowski, S. Orkin, A. Sytkowski. // BBA. 1987. - Vol.910. - P.224-232.

406. Wu H. Generation of commited erythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require erythropoietin or erythropoietin receptor / H. Wu, X. Lui, R. Jaenisch. // Cell. 1995. - Vol.83. - P.59-67.

407. Yamaguchi M. Different adhesive characteristics and VLA-4 expression of CD34(+) progenitors in G0/G1 versus S+G2/M phases of the cell cycle / M. Yamaguchi, K. Ikebuchi, F. Hirayama et al. // Blood. 1998. - Vol.92, N3. -P.842-848.

408. Yano M. Expression and function of murine receptor tyrosine kinases, TIE and ТЕК in hematopoietic stem cells / M. Yano, A. Iwama, H. Nishio et al. // Blood. 1997. - Vol.89. - P.4317.

409. Yasufuku-Takano J. Signal transduction mechanisms of hormones through membrane receptors / J. Yasufuku-Takano, K. Takano. // Nippon.Rinsho. -2002. Vol.60, N2. - P.222-229.

410. Yoder M.C. Matrix molecule interactions with hematopoietic stem cells / M.C. Yoder, D.A. Williams. // Exp.Hematol. 1995. - Vol.23. -P.961.

411. Yoffey J.M. The phagocytic central reticular cell of the erythroblastic island in rat bone marrow: Changes in hypoxia and rebound / J.M. Yoffey, P. Yaffe. // J.Reticuloend.Soc. 1980. - Vol.28. - P.37.

412. Yokomizo R. Erythropoietin and erythropoietin receptor expression in human endometrium throughout the menstrual cycle / R. Yokomizo, S.

413. Matsuzaki, S. Uehara et al. // Mol.Hum.Reprod. 2002. - Vol.8. - P.441-446.

414. Yokoyama T. Migration of erythroblastic islands toward the sinusoid as erythroid maturation proceeds in rat bone marrow / T. Yokoyama, T. Etoh,H. Kitagawa et al. // J.Vet.Med.Sci. 2003. - Vol.65, N4. - P.449-452.

415. Youssoufian H. Structure, function and activation of the erythropoietin receptor / H. Youssoufian, G. Longmore, D. Newmann et al. // Blood. -1993,-Vol.81.-P.2229-2236.

416. Zakharov Y. M. Influence des surnageants de culture de macrophages provenant des llots eiythroblastiques sur l'eiythropoilese du rat / Y.M. Zakharov, M. Prenant. // Nouv. Rev. Franc. Hematol. 1983. - Vol.25, N1. - P. 17-22.

417. Zakharov Y.M. Technique d'isolement et de culture des llots erytroblastiques. Separation du macrophage central / Y.M. Zakharov, M. Prenant. // Nouv. Rev.Franc.Hematol. 1982. - Vol.24, N6. - P. 154-162.

418. Zandstra P.W. Cytokine manipulation of primitive human hematopoietic cell self-renewal / P.W. Zandstra, E. Conneally, A.L. Petzer et al. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1997. - Vol.94. - P.4698.

419. Zhang X. Tumor necrosis factor is a physiologic regulator of hematopoietic progenitor cells / X. Zhang, A. Harada, H. Bluethmann. // Blood. 1995. -Vol.86, N8.-P.2930-2938.

420. Zhang P. PU.l inhibits GATA-1 function and erythroid differentiation by blocking GATA-1 DNA binding / P. Zhang, X. Zhang, A. Iwama et al. // Blood. 2000. - Vol.96. - P.2641-2648.

421. Zhdanov V.V. Role of cell-cell interactions in the regulation of hemopoiesis during cytostatic-induced myelosuppression / V.V. Zhdanov. // Bull.Exp.Biol.Med. 2001. - Vol. 132, N2. - p.744-747.

422. Zsebo K.M. Stem cell factor is encoded at the SI locus of lite mouse and is the ligand for the c-kit tyrosine kinase receptor / K.M. Zsebo, D.A. Williams, E.N. Geissler et al. // Cell. 1990. - Vol.63. - P.213.

423. Zucherman K.S. Extracellular matrix production by the adherent cells of long-term murine bone marrow cultures / K.S. Zucherman, M.S. Wicha. // Blood.- 1983. -Vol.61.-P.540-554.1.T

Информация о работе

Тишевская, Наталья Викторовна
доктора медицинских наук
Курган, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Экспериментальные исследования регуляции эритропоэза в культуре эритробластических островков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы