Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние эритропоэтина и Т-лимфоцитов на эритропоэз в культуре эритробластических островков костного мозга полицитемичных крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние эритропоэтина и Т-лимфоцитов на эритропоэз в культуре эритробластических островков костного мозга полицитемичных крыс"

На правах рукописи

--

ФЕКЛИЧЕВА Инна Викторовна

ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА И Т-ЛИМФОЦИТОВ НА ЭРИТРОПОЭЗ В КУЛЬТУРЕ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ КОСТНОГО МОЗГА ПОЛИЦИТЕМИЧНЫХ КРЫС

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курган-2009

003482932

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социачьному развитию РФ»

Научный руководитель:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Захаров Юрий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Колпаков Виктор Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Каюмова Алия Фаритовна

Ведущая организация:

ФГУ Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агенте-России (610027 Россия, г. Киров, ул. Красноармейская д. 72)

с Защита диссертации состоится «✓¿'¿Г» /¿С-Лс /г-^ 2009 г. в часов на заседании диссертационного совей ДМ 208.079.01, созданного при Федеральном государственном учреждении «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» по адресу: г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».

Автореферат разослан « ле » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Депрессия кроветворения остается в настоящее время актуальной и во многом нерешенной задачей (Павлов А. Д., 2008). Известно, что экспериментальная модель угнетенного эритропоэза- постгрансфузионная полицитемия вызывает торможение эритропоэза, которое проявляется снижением абсолютного количества эритробластических островков (ЭО), снижением содержания пролиферирующих и повышением содержания созревающих классов ЭО в костном мозге крыс (Мельников И.Ю.,1986; Рассохин А.Г.,1990). Однако, оставалось невыясненным, как изменяется чувствительность центральных макрофагов и эритроидных клеток эршробластических островков к эритропоэтину при воспроизведении постгрансфузионной полицитемии, каковы закономерности восстановления угнетенного эритропоэза при стимуляции его гуморальными и клеточными факторами.

Установлено морфогенетическое свойство Т-лимфоцитов усиливать регенерацию тканей различных органов (Бабаева А. Г., 1972, 1995), в том числе и кроветворных (Гольдберг Е. Д. и др., 1983, Ястребов А. П., Шаравара А. А., 1991). Исследование контактов эритробластических островков с лимфоидными клетками в культуре показало, что лимфоциты контактируют только с эритроб-ластическими островками пролиферирующих классов зрелости, т. е. с ЭО первого, второго классов зрелости и реконструирующимися ЭО (Захаров Ю. М., Тишевская Н.В., 2003), что позволяет предполагать их участие в активации эритропоэза в эритробластических островках. Данных в доступной нам литературе о возможной роли Т-лимфоцитов в восстановлении эритропоэза, угнетенного в ходе развития постгрансфузионной полицитемии мы не нашли.

Изучить способность эритробластических островков костного мозга разных классов зрелости реагировать на эритропоэтин в зависимости от степени угнетения в них эритропоэза, когда действие других факторов, модулирующих его эффекты сведено к минимуму, позволяет метод культивирования эритроб-

ластических островков (Zakharov Y. M., Prenant M., 1982).

Цель исследования: изучить влияние эритропозтина и Т- лимфоцитов на эритропоэз в культуре ЭО костного мозга полицитемичных животных.

Задачи исследования

1. Исследовать, как изменяется чувствительность к эритропоэтину разных элементов костного мозга, участвующих в формировании ЭО: КОЕэ, центрального макрофага ЭО и «короны ЭО» в зависимости от глубины депрессии эритропоэза, развивающейся в ходе посттрансфузионной полицитемии.

2. Исследовать в культуре эритробластических островков влияние экспериментальной депрессии эритропоэза на способность клеток эритроидной короны эритробластических островков костного мозга отвечать на эритропоэтин возрастанием пролиферативной активности.

3. Оценить эритропоэтический эффект Т-лимфоцитов на разные классы эритробластических островков в культуре костного мозга полицитемичных животных, их способность активировать комплементацию КОЕэ с макрофагами костного мозга.

Научная новизна исследования

Впервые, при исследовании эритропоэза в культуре ЭО костного мозга полицитемичных крыс, выявлено, что способность резидуальных макрофагов к комплементации с КОЕэ под влиянием эритропозтина более подвержена инги-бирующему воздействию развивающейся депрессии эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной полицитемии, чем способность к комплементации с КОЕэ центральных макрофагов инволюцирующих ЭО.

Впервые выявлено, что способность эритроидных клеток «короны» ЭО отвечать увеличением митотической активности на внесение в культуру эритропозтина снижается по мере угнетения эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной полицитемии.

Впервые выявлено, что Т-лимфоциты, внесенные в культуры эритробластических островков костного мозга полицитемичных крыс совместно с эри-

тропоэтином, уже через 24 часа культивирования активируют в ней как формирование эритробластических островков 1 класса зрелости (при взаимодействии КОЕэ с резидуальными макрофагами), так и поддерживают формирование реконструирующихся эритробластических островков (т. е. комплементацию КОЕэ с макрофагами инволюцирующих эритробластических островков), тогда как внесение одного эритропоэтина в данные культуры активирует эритропоэз в эти же сроки только за счет образования рехонстуирующихся эритробластических островков.

Научно-практическая ценность работы и внедрение полученных результатов

Результаты работы могут быть использованы в экспериментальной гематологии, физиологии и патофизиологии, а также в программах подготовки специалистов медико-биологического профиля.

Полученные результаты внедрены в Проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики ЮУНЦ РАМН.

Положения, выносимые на защиту

1. Депрессия эритропоэза при постгрансфузионной полицитемии вызывает преимущественное торможение формирования ЭО de novo с поддержанием эритропоэза de repeto на основе комплементации инволюцирующих ЭО с КОЕэ.

2. Способность клеток эритроидной «короны» культивируемых ЭО костного мозга полицитемичных крыс отвечать на внесение эритропоэтина в культуру возрастанием пролифератитивной активности, снижается по мере углубления эритропоэза в ходе развития поспрансфузионной полицитемии.

3. Активация эритропоэза в ЭО de novo и de repeto in vitro более выражено стимулируется сочетанным действием Т- лимфоцитов и эритропоэтина по сравнению с действием одного эритропоэтина.

Апробация работы

Основные положения диссертации апробированы на VI Сибирском физиологическом съезде (г. Барнаул, 2008 г.), конференции молодых ученых (Челябинск, 2008), заседаниях кафедры нормальной физиологии совместно с ПНИЛ экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики ЮУНЦ РАМН, Всероссийской научно- практической конференции «Клеточные и нанотехнологии в биологии медицине» (г. Курган, 2008 г.), 6-м симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2009 г.)

Личный вклад автора

Все научные результаты получены автором самостоятельно. Автором лично проведены научные эксперименты, анализ экспериментального материала, обобщение, формулировка выводов, оформление диссертационной работы. Автор непосредственно участвовал подготовке научных статей (авторский вклад составляет от 20% до 50 %). Математическая обработка данных проведена при участии Центра математической и статистической поддержки медицинских исследований ЧелГМА (авторский вклад 70%).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, 2 из них в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и библиографического списка. Текст диссертационного исследования содержит 120 страниц текста, 12 таблиц, 19 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для культивирования ЭО получали у белых беспородных крыс 12- 13-недельного возраста, массой 110- 150 грамм, после воспроизведения у них по-стгрансфузионной полицитемии. Экспериментальная постгрансфузионная по-

6

лицитемия создавалась двукратным (с интервалом 24 часа) внутрибрюшинным введением животным- реципиентам 80%-ной массы трижды отмытых 0,9 % раствором хлорида натрия гомологичных эритроцитов из расчета 7 мл эритро-массы на 100 грамм массы реципиента. Донорами эритромассы служили белые беспородные крысы массой более 200 грамм. Кровь у доноров забирали из нижней полой вены с соблюдением правил асептики и антисептики. Для предотвращения свертывания крови использовали гепарин в концентрации 100 ЕД на 5 мя. У всех крыс до и после воспроизведения полицитемии определяли величину гематокрита и содержание ретикулоцитов в периферической крови. Выделение ЭО из костного мозга бедренных костей производилось по методу, разработанному Ю.М.Захаровым, А.Г. Рассохиным, И.Ю. Мельниковым, являющемуся модификацией методических приемов, предложенных Y. Le Charpentier M. Prenant. Всего использовано 227 животных обоего пола, весом 110-350гр. Культивирование ЭО проводили по методу Ю.М. Захарова и М. Прена в течении 24 часов в газопроточном культиваторе ГПИ - 01 при концентрации С02 4,5%. Среда для культивирования ЭО содержала: сыворотку эмбриональную телячью (США, HyClone- Perbio) - 30%, среду RPMI (НПП «ПанЭко» - 1640- 66%, гепарин 5000 ЕД /1мл- 2%, антибиотики пенициллин 5000 ЕД /1 мл и стрептомицин 5000 мкг/мл - 2%, глутамин- 29,6 мг/мл- 2%, меркаптоэтанол 0,01 М- 50 мкл на 1мл среды культивирования. Для изучения способности ЭО отвечать на эритропоэтин в культуру вносили эритропоэтин рекомбинантный человеческий «Эпокрин» (РАО «Биопрепарат», Россия) в дозах 0,25 ME, 0,5 ME и 1 ME на 1 мл среды культивирования. В контрольную культуру эритропоэтин не вносили («0 ME» эритропоэтина). В препаратах ЭО до культивирования (фон) и препаратах культур ЭО определялось общее количество островков, адгезировавпшхся на дне культурального сосуда и распределение их по классам зрелости, пользуясь классификацией, предложенной Ю.М. Захаровым и соавт. (1990). Для анализа кинетики эритропоэза в исследуемых культурах рассчитывали функциональные показатели эритропоэза по формулам (Воргова JI. В., Захаров Ю. М., 1990):

Показатель вовлечения КОЕэ в дифференциацию = ЭО 1+ ЭОрек

токазатель повторного вовлечения ЭОрек

макрофафгов в эритропоэз ЭОинв

ЭОЗ+ЭОинв Показатель созревания ЭО 1 +Э02+Э0рек

Для изучения способности эритроидных клеток "короны" ЭО отвечать на эритропоэтин изменением пролиферативной активности в культуру вносили эритропоэтин рекомбинантный человеческий «Эпокрин» (РАО ((Биопрепарат», Россия) в дозах 0,5 МЕ и 1 МЕ на 1 мл среды культивирования. За 4 часа до окончания эксперимента в культуральные сосуды вносили колхицин (из расчета 0,1 мкг на 1мл среды культивирования) (Мосягина Е.Н., 1976). Статмокине-тический индекс рассчитывали как количество митозов на 100 ядросодержащих и способных к делению эритроидных клеток островков 1 класса зрелости, 2 класса зрелости и реконструирующихся ЭО.

Данные показатели сравнивали с аналогичными показателями "фона"-препаратах ЭО, адгезированных на чашках Петри, исследуемых до культивирования, а также с культурой ЭО, в которую эритропоэтин не вносили («0 МЕ» эритропоэтина). Исследование проводили на 2-е и 5-е сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии. Для определения «фона» группам крыс с полицитемией за 6 часов до окончания вторых и пятых суток полицитемии вводили колхицин (из расчета 1,2 мг/кг массы тела) и определяли процент К- митозов в эритроидной короне эритробластических островков.

Для изучения влияния Т- лимфоцитов на эритропоэз, Т- лимфоциты получали из тимуса полицитемичных крыс, который измельчали и промывали в охлажденном растворе ЯРМ1- 1640. После фильтрации через марлевый фильтр клеточную суспензию центрифугировали 3 минуты при скорости 1000 оборотов в минуту (лабораторная центрифуга ОПН-3), суспендировали осадок в 20 мл охлажденного раствора ЯРМ1- 1640. Содержание клеток в растворе подсчитывали в камере Горяева, их жизнеспособность определяли по тесту с трипановым

синим.

Состояние поспрансфузионной полицитемии достигалось однократной инфузией 80% -ной взвеси эритроцитов в физрастворе в количестве 7мл на 100 гр веса животного.

Для изучения влияния Т-клеток на эритропоэз использовали культуры ЭО костного мозга полицитемичных крыс, выделенного на 5-е сутки после воспроизведения поспрансфузионной полицитемии. В данные культуры вносили эритропоэтин («Эпокрин» РАО «Биопрепарат», Россия) в дозах- 0,25, 0,5 и 1МЕ/мл культуральной среды и добавляли Т- клетки из расчета 4 клетки на один ЭО. Контролем являлись культуры ЭО костного мозга полицитемичных крыс, выделенного на 5-е сутки после воспроизведения поспрансфузионной полицитемии, в которые вносили эритропоэтин в дозах- 0,25, 0,5 и 1МЕ/мл культуральной среды, но без добавления в них Т- клеток. В препаратах подсчитывали абсолютное количество ЭО, адгезированных на 1 см2 культуралыюго сосуда, распределение ЭО по классам зрелости.

В «контроле» и «опыте» сравнивались абсолютное количество ЭО на культуральный сосуд и распределение ЭО по классам зрелости. Всего проанализировано 252 культуры.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась с использованием программ Excel 2000 и STATISTICA 6.0, STADIA 6.3 prof. (Боровиков В., 2001). Рассчитывали среднее (М), стандартную ошибку среднего (ш). Ввиду малого объема выборки для проверки гипотезы о наличии или отсутствии различий между опытными и контрольными группами использовали непараметрический метод- критерий Манна- Уитни, регрессионный анализ. Различия считались достоверными при р<0,05 (Гланц С. А., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культура ЭО без добавления эритропоэтина, также как и культура, содержащая 0,25 ME эритропоэтина в 1 мл культуральной среды, поддерживает не пролиферацию, но лишь созревание эритроидной «короны» ЭО, что выра-

жается наибольшей долей ЭОинв в этих культурах через 24 часа инкубации по сравнению с культурами ЭО, в которые вносились 0.5 и 1 МЕ эритропоэтин (рис.1).

Рис. 1. Процентное содержание ЭОинв в культурах ЭО. выделенных из костного мозга крыс на разные сроки после воспроизведения полицитемии, при добавлении в культуры ЭО разных доз эритропоэтина.

Примечания: фон - ЭО до начала культивирования: по оси абсцисс: сутки после воспроизведения полицитемии; по оси ординат: содержание ЭО исследуемого класса в культуре (в процентах). р1- достоверные отличия (р< 0,05) между ответом на дозу «0» МЕ эритропоэтина (контроль) и ответами на дозы «0,25», «0,5» и «I» МЕ эритропоэтина; р2- достоверные отличия (р< 0,05) ответов культур ЭО на дозу 0,25 МЕ/мл от ответов на дозу 0.5 МЕ/мл: рЗ- достоверные отличия (р< 0,05) ответов культур ЭО на дозу 0.5 МЕ/мл от ответов на дозу 1 МЕ/мл.

Содержание же пролиферирующих классов ЭО в данных культурах снижается по мере углубления депрессии эритропоэза (от 1 -х к 10-м суткам после воспризведения посттрансфузионной полицитемии) (рис. 2, 3).

р1,рЗ

р1,рЗ

р1р3

ю

дозы эритропоэтина в МЕ/мл

ВО Я 0,25 ПО,5

И1

Рис.2 Процентное содержание ЭО! через 24 часа культивирования ЭО, выделенных из костного мозга крыс на разные сроки после воспроизведения поли-цитемии, при добавлении в культуры ЭО разных доз эритропоэтина.

Примечания: см. рис. 1

р1,р2

р1,рЗ

й-

р1,рЗ

I

дозы эритропоэтина в МЕ/мл

□ 0

00,25 00,5 □ 1

10

Рис.3 Процентное содержание Э02 в культурах ЭО, выделенных из костного мозга крыс на разные сроки после воспроизведения полицитемии. при добавлении в культуры ЭО разных доз эритропоэтина.

Примечания: см. рис. 1

Культуры, сформированные из ЭО, полученных на 1-е, 2-е, 3-й и 4-е сутки после воспроизведения ПТП, обнаруживают увеличение содержания Э01 только в ответ на внесение в культуру 1 ME/мл эритропоэтина по сравнению с контролем (культурой, в которую эритропоэтин не вносился). При этом, по мере углубления депрессии эритропоэза в ходе развития ПТП количество Э01 снижается. На 3-й и 4-е сутки ПТП ЭО 1 класса зрелости отсутствуют в культурах без внесения эритропоэтина и культурах с добавлением 0,25 и 0,5 МЕ/мл эритропоэтина.

При внесении 1 ME/мл эритропоэтина в культуры ЭО, выделенных на 3-й и 4-е сутки ПТП Э01 регистрируются в количестве примерно в 1,8- 2,2 раза метшем, чем в культурах ЭО, выделенных на 1-е и 2-е сутки ПТП, с добавлением 1 ME/мл эритропоэтина (см. рис 2).

При углублении депрессии эритропоэза, на 5-е и 10-е сутки после воспроизведения ПТП, комплексация резидуальных макрофагов с КОЕэ отсутствует, т.к. на данных сроках ПТП ЭО 1 класса зрелости во всех исследованных культурах не обнаруживаются (см. рис 2).

Чувствительность центральных макрофагов ЭОинв к эритропоэтину оказывается менее подверженной ингибирующему воздействию ПТП: увеличение образования ЭОрек (на основе комплексации ЭОинв с КОЕэ) происходит уже в ответ на дозу 0,5 ME/мл в культурах ЭО, выделенных на 2-е, 3-й, 4-е и 10-е сутки после воспроизведения ПТП. Данный ответ усиливается при внесении дозы 1 ME/мл в культуры ЭО, выделенных на 3-й, 5-е и 10-е сутки ПТП.

Рис.4 Процентное содержание ЭОрех в культурах ЭО, выделенных из костного мозга крыс на разные сроки после воспроизведения полицитемии. при добавлении в культуры ЭО разных доз эритропоэтина.

Примечания: см. рис. 1

Для изучения кинетики эритропоэза в эритробластических островках костного мозга полицитемичных животных нами был проведен регрессионный анализ функциональных показателей эритропоэза: показателя вовлечения КОЕэ в дифференциацию (ПИКД) и показателя повторного вовлечения макрофагов в эритрпоэз (ППВМ) в культурах ЭО, выделенных на 1-е, 4-е и 10-е сутки после воспроизведения ПТП. Линия регрессии описывается уравнением а+вх. где а-значение. определяющее положение линии регрессии относительно оси ординат. в- тангенс угла наклона линии регрессии, х- доза эритропоэтина, вносимого в культуру.

«Крутизна» наклона линии регрессии тем больше, чем больше значение в в уравнении, описывающем эту линию. Сравнение линий регресии, отражающих зависимость показателя интенсивности вовлечения КОЕэ в дифференциа-

цию (ПИКД) от дозы эритропоэтина, вносимого в культуры, характеризующих формирование ЭО в ответ на внесение в культуры ЭО, полученные на 1-е, 4-е и 10-е сутки после воспроизведения ПТП, возрастающих доз эритропоэтина (от 0,06 НМ/мл* до 1 ME/мл) показывает снижение способности центральных макрофагов ЭО отвечать на внесение эритропоэтина в культуру усилением комплементации с КОЕэ по мере углубления депрессии эритропоэза от 1-х суток к 10-м после воспроизведения ПТП.

Сравнение линий регрессии, построенных на основе зависимости показателя повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз (ППВМ) от дозы эритропоэтина, вносимого в культуру ЭО, показывает, что вовлечение макрофагов ЭОинв в реконструкцию эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной по-лицитемии возрастает, причем пик данного увеличения приходится на 4-е сутки ПТП, снижаясь затем к 10-м суткам ПТП. При этом сохраняется отчетливая тенденция к усилению реконструкции эритропоэза по мере развития ПТП в ответ на увеличение дозы эритропоэтина, вносимого в культуру ЭО. Однако в количественном проявлении способность макрофагов ЭОинв к реконструкции эритропоэза под влиянием эритропоэтина снижается по мере депрессии эритропоэза, вызванной трансфузией эритроцитов. Таким образом, по мере углубления депрессии эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной полиците-мии переход ЭОинв в ЭОрек, уменьшаясь количественно, более интенсивно «реагирует» на увеличение дозы эритропоэтина, вносимого в культуру (табл.1)

Таблица 1

Значения коэффициентов «в» в уравнениях линий регрессии, отражающих зависимость ПИКД и ППВМ от дозы эригропоэтина, вносимого в культуру ЭО, выделенных на 1-е, 4-е и 10-е сутки после воспроизведения ПТП

Показатели Сутки после воспроизведения ПТП

1-е 4-е 10-е

«в» ПИКД 649,88 279,69* 125,384

«В» ППВМ 0,17 0,37* 0,26* ♦

Примечания: «в» ПИКД- значения коэффициента «в» в уравнении линии регрессии, отражающем зависимость ПИКД от дозы эритропоэтина, вносимого в культуру; «в» 111ШМ- значения коэффициента «в» в уравнении линии регрессии, отражающем зависимость ППВМ от дозы эритропоэтина, вносимого в культуру; *- достоверные показателей 4-х и 10-х суток от аналогичных показателей 1-х суток после воспроизведения Ulli (р< 0,05); достоверные отличия показателей 4-х суток от аналогичных показателей 10-х суток после воспроизведения ПТП (р< 0,05).

Таким образом, в нашей работе показано, что у полицитемичных животных, сохраняется более высокая чувствительность центральных макрофагов инволюцирующих ЭО к эритропоэтину, чем у резидуальных макрофагов, причем по мере углубления депрессии эритропоэза в ходе развития ПТП скорость повторного вовлечения центральных макрофагов ЭОинв в эритропоэз увеличивается. Причиной этого феномена, возможно, является способность эритропоэтина стимулировать центральные макрофаги инволюцирующих ЭО к клеточ-но- клеточному контакту с эритроидными клетками- предшественницами (КО-Еэ) и индуцировать развитие поддерживающих эритропоэз свойств у данных макрофагов костного мозга (Захаров Ю.М., Тишевская Н.В., 2001).

Изменения митотической активности эритробластов при внесении в культуру ЭО эритропоэтина зависело от степени угнетения эритропоэза, класса ЭО и дозы эритропоэтина, вносимого в культуру.

Внесение в культуру ЭО, выделенных на 2-е сутки после воспоизведения ПТП, 0,5 и 1 МЕ эритропоэтина вызываю увеличение статмохинетического индекса эритроидных клеток ЭО всех исследуемых классов по сравнению культурой, в которую эршропоэтин не вносился («0 МЕ») (рис. 5). Так, 0,5 МЕ эритропоэтина увеличивало процент клеток в К- митозах в «короне» Э01 класса почти в 9 раз, Э02- в 9,6 раза и ЭОрек- в 5 раз по сравнению с культурой «0 МЕ» эритропоэтина. Еще более выражено во всех исследуемых классах ЭО на 2-е сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии в культуре возрастало количество статмокинезов в ответ на дозу 1МЕ: достоверно по сравнению с дозой 0,5 МЕ эритропоэтина, вносимого в культуру процент К-

митозов в Э01 возрастал в 1,7 раза, в Э02- в 1,8 раза в ЭОрек- в 1,4 раза (см. рис. 5).

фон о 0,5 1

ОСтатмокинезы в Э01 0Статмокинезы в Э02 ОСтатмокинезы в ЭОрек

Рис. 5. Процентное содержание эритроидных клеток с К- митозами через 2.4 часа культивирования эритробластических островков костного мозга полиците-мичных крыс ( ЭО получены на 2-е сутки после воспроизведения полиците-

мии).

Примечания-. По оси абсцисс: «фон» - эритробластические островки 1, 2 и ЭОрек классов до культивирования; «0», «0.5», «1» -дозы эритропоэтина, вносимого в культуру (в МЕ/ мл); по оси ординат: количество статмокинезов в эритроидных клетках эритробластических островков (в процентах). р1 - достоверные отличия (р < 0,05) от показателей культуры, в которую эритропоэтин Цё вносился; р2- достоверные отличия (р < 0,05) показателей культур, в которые вносилось 1 МЕ/мл эритропоэтина от показателей культур, в которые вносилось 0,5 МЕ/мл эритропоэтина.

Островки, полученные на 5-е сутки после воспроизведения посттрансфу-зионной полицитемии, внесенные в культуру, не обнаруживают способности к комплексации макрофагов- резидентов с КОЕэ, на что указывает отсутствие в культуре Э01 и Э02. Однако сохраняется чувствительность ЭОинв к эритропо-этину, что проявляется возрастанием процентного содержания ЭОрек в культуре в ответ на внесение в нее эритропоэтина в дозе 1 МЕ/ мл культуральной сре-

ды, т.е. новообразование ЭО в культуре поддерживается только за счет формирования островков de repeto при комплексации с КОЕэ с макрофагами, несущими зрелую эритроидную «корону» (см. рис. 4).

Таким образом, эритробластические островки пролиферирующих классов зрелости в культурах ЭО, полученных на 5-е сутки после воспроизведения посттансфузионной полицитемии, представлены только ЭОрек. Пролифератив-ная активность клеток эритроидной «короны» ЭОрек в культуре ЭО 5-х суток после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии возрастала при внесении в культуру и 0,5, и lME/мл в 2 и 4 раза соответственно по сравнению с показателями "фона", в 3 и 4,5 раза по сравнению с показателями культуры без добавления эритропоэтина. Однако, статмокинетические индексы клеток эритроидной «короны» ЭОрек в культурах ЭО, выделенных на 5-е сутки после воспроизведения полицитемии. оказались почти в 1,5 раза ниже после внесения в культуру эритропоэтина в дозе 0,5 и 1 ME по сравнению с уровнем К- митозов культур ЭО, полученных на 2-е сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии (рис. 6).

pl,p2,p3

Í

pl,p2,p3

фон

0,5

Рис. 6. Процентное содержание эритроидных клеток с К- митозами в ЭОрек через 24 часа культивирования эритробластических островков костного мозга по-лицитемичных крыс (ЭО получены на 5-е сутки после воспроизведения полицитемии).

Примечания: По оси абсцисс: «фон» - реконструирующиеся ЭО до культивирования; «О», «0.5», «1» -дозы эритропоэтина, вносимого в культуру (вМЕ/ мл); по оси ординат: количество статмокинезов в эритроидных клетках реконструирующихся эритробластичесхих островках (в процентах).

pi- достоверные отличия (р < 0,05) от показателей культуры, в которую эритропоэтин не вносился; р2- достоверные отличия (р < 0,05) показателей культур, в которые вносилось 1 МЕ/мл эритропоэтина от показателей культур, в которые вносилось 0,5 МЕ/мл эритропоэтина; рЗ - достоверные отличия (р < 0,05) показателей культур, полученных на 5-е сутки после воспроизведения по-странсфузионной полицитемии от показателей культур, полученных на 2-е сутки после воспроизведения пострансфузионной полицитемии.

Таким образом, способность эритроидных клеток «короны» ЭО отвечать увеличением митотической активности на внесение в культуру эритропоэтина снижается по мере угнетения эритропоэза в ходе развития постгрансфузионной полицитемии.

В ходе исследования выявлено, что в культурах, содержащих эритропоэтин в дозах 0,5 и 1 МЕ/ мл культуральной среды, в которые добавлялись тимоциты, абсолютное количество эритробластических островков, исходно полученных у крыс на 5- е сутки поспрансфузионной полицитемии, через 24 часа культивирования было достоверно выше, чем в контрольных группах. Внесение тимоцитов в культуры без добавления эритропоэтина или содержащих эритропоэтин в дозе 0,25 МЕ/ мл достоверно не увеличивало в них абсолютное количество ЭО (табл.2).

Сокультивирование ЭО с тимоцитами изменяло распределение ЭО по классам зрелости по сравнению с культурами, в которые тимоциты не добавлялись. Так, в культурах ЭО костного мозга, выделенного на 5- е сутки после воспроизведения поспрансфузионной полицитемии, без добавления в них тимоцитов, отсутствуют ЭО 1 и 2-го классов зрелости. В культурах, содержащих тимоциты и эритропоэтин в дозах 0,5 и 1 МЕ/мл через 24 часа культивирования доля сформировавшихся de novo ЭО 1 составила 8,3 ±0,5 % и 12,4 ±0,6 % соответственно. В культурах с тимоцитами без добавления эритропоэтина, а также в культурах, содержащих тимоциты и эритропоэтин в дозе 0,25 МЕ/ мл Э01 отсутствовали. Э02 во всех исследованных культурах не обнаруживались.

Внесение в культуру тимоцитов изменяло и количество реконструирующихся ЭО: оно достоверно увеличивалось в культуре в присутствии тимоцитов без добавления эритропоэтина и нарастало в культурах, содержащих тимоциты

и зритропоэтин в дозах 0,5 и 1 МЕ/ мл. Количество инволюцирующих ЭО в культурах, содержащих тимоциты, меньше по сравнению с контролем, что связано с повышением комплексации КОЕэ с ЭОинв при добавлении в культуру тимоцитов, т.е. переходом инволюцирующих ЭО в реконструирующиеся (см. табл. 2).

Таблица 2

Влияние эритропоэтина я Т- лимфоцитов на абсолютное количество ЭО и распределение их по классам зрелости в культуре эритробластических островков костного мозга крыс, выделенного на 5-е сутки после воспроизведения по-спрансфузионной полицитемии (культивирование 24 часа)

Дозы эритропоэтина, вносимые культуру, МЕ/мл

0 0,25 0,5 1

-Т +Т -Т +Т -Т +Т -Т +Т

п=6 п=6 п=6 п=6 п=6 п=6 п=6 п=6

Абсолютное 763,4 726,3 728,5 722,4 758,6 853,7 876,7 1035,2

количество ±12,5 ±7,4 ±10,3 ±15,6 ±8,3 ±11,7 ±13,2 ±11,3

ЭО (на 1см2 * ♦ *

культуральн.

сосуда)

Э01, % 0 0 0 0 0 8,3± 0 12,4±

0,5* 0,6*

Э02, % 0 0 0 0 0 0 0 0

ЭОЗ,% 2,0± 1,6± 2,3± 1,3±0,8 1,5± 1,0± 3,6± 2,0±

0,7 0,5 1,0 0,02 0,04 0,02 0,03

ЭОинв,% 86,0± 72,8± 81,2± 77,4± 77,0± 60,3± 69,2± 49,4±

2,1 1,8 1,3 2,5 1,6 1,7* 2,2 ♦ 1,8*

ЭОрек,% 13,2± 27,2± 16,6± 21,6± 21,2± 30,8± 27,2± 36,2±

0,3 1,8* 2,4 1,2 1,5 1,1* 0,8 ♦ 1,4*

Примечания:

-Т- культуры, в которые Т- клетки не вносились,

+Т- культуры, в которые вносились Т- клетки.

достоверные различия между культурами без добавления Т- клеток, в которые эритропоэтин вносился в дозе 0,5 МЕ/мл и культурами без добавления Т- клеток, которые эритропоэтин вносился в дозе 1 МЕ/мл (р< 0,05);

*- достоверные различия между культурами с добавлением Т- клеток и культурами без добавления Т- клеток (р< 0,05).

Таким образом, Т- лимфоциты, внесенные совместно с эритропоэтином в культуру ЭО, восстанавливают угнетенную в ходе развития поспрансфузион-ной полицитемии способность резидуальных макрофагов костного мозга к комплементации с КОЕэ, а также повышают способность к комплементации с КОЕэ центральных макрофагов инволюцирующих ЭО.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полученные данные свидетельствуют, что постгрансфузионная полици-темия по мере ее развития снижает чувствительность резидуальных макрофагов к эритропоэтину, что препятствует формированию ЭО de novo. Макрофаги же, ранее вовлеченные в поддержку эритропоэза в ЭО, отвечают на эритропоэтин формированием ЭО de repeto, вероятно благодаря уже индуцированной в них функционирующей эритроидной «короной» способности к созданию эритропо-этического микроокружения. К понятию последнего, на основании данных нашей лаборатории, а также данных, имеющихся в литературе, можно отнести повышенную секрецию центральными макрофагами ЭО гликозаминогликанов (Захаров Ю.М., Тишевская Н.В., 1997) развертывание рецепторов к эритроид-ным клеткам (Crocker P. R. et al., 1991), секрецию эритропоэтического макрофа-гального белка (Teal Н. Е. et al., 2003). Можно полагать, что данные свойства

макрофагов ЭОинв помогают «включать» механизм положительной обратной связи, усиливающий действие на них экзогенного эритропоэтина (Захаров Ю.М., 2006).

По мере углубления депрессии эритропоэза в ходе развития постгрансфу-зионной полицитемии снижается способность клеток эритроидной «короны» ЭО отвечать на внесение эритропоэтина в культуру возрасанием пролифера-тивной активности, что объясняется накоплением в плазме крови полиците-мичных животных ингибиторов эритропоэза, таких как эритроцитарные кейло-ны (Захаров Ю.М., 2006), которые являются гликопротеинами мембран эритроцитов и задерживают переход клетки соответсвенно из G, в S- фазу (Gp кейлоны) и из Gz- в М- фазу клеточного цикла (Огкейлоны), замедляя проли-феративную активность эритроидных клеток (Неустроев Г.В., 1984), трансформирующий рост фактор р, макрофагальный воспалительный белок 1-а индуцирующие в эритропоэтинчувствительных клетках синтез ингибиторов циклинза-висимых киназ - р 16 (JNK 4а), р 15 (JNK 4Ь), тормозящие переход клеточного цикла из фазы G| в S- фазу клеточного цикла (Захаров Ю.М., 2004; Teal Н. Е. И др., 2003).

В нашей лаборатории также установлено, что после воспроизведения по-стгрансфузиошгой полицитемии в эритробластах ЭО почти в 2 раза по сравнению с интактными крысами возрастает содержание диспергированных в кариоплазме экстрануклеолярных аргентофильных гранул, ассоциированных с зонами нуклеолярной транскрипции (Куренков ЕЛ. и др. 2002), что указывает на возрастающую в них интенсивность белкового синтеза, совпадающую во времени с замедлением вхохсдения этих клеток в митоз. На основании этих данных можно допустить, что нарастание уровня ингибиторов эритропоэза в крови при поспрансфузионной полицитемии активизирует в эритроидных клетках синтез внутриклеточных белков- ингибиторов. Таким образом, выраженность угнете-

ния эритропоэза в ходе развития постгрансфузионной полицитемии связана с понижением чувствительности к эритропоэтину не только макрофагов костного мозга, что препятствует формированию новых ЭО, но и со снижением способности эритроидных клеток короны островка отвечать пролиферацией на действие эритропоэтина.

Т- лимфоциты, внесенные в культуру ЭО полицитемичных крыс, продуцируя в культуральную среду колониестимулирующий фактор эритроцитар-ный, фактор дифференцировки проэритробластов, стимулирующего дифференциацию КОЕэ в проэритробласт, возможно, индуцируют синтез веществ, способствующих созданию эритропоэтического микроокружения- гликозаминог-ликанов, стимулирующего макрофагального белка, белков- рецепторов к эрит-роидным клеткам. Таким образом, взаимодействие Т- лимфоцитов и эритропоэтина создают условия для активации эритропоэза в эритробластических островках костного мозга полицитемичных крыс.

ВЫВОДЫ

1. У крыс, подвергшихся воздействию постгрансфузионной полицитемии, также как и у интактных животных центральные макрофаги инволюци-рующих ЭО более чувствительны к эритропоэтину, чем резидуальные макрофаги костного мозга.

2. Способность резидуальных макрофагов к комплементации с КОЕэ под влиянием эритропоэтина более подвержена ингибирующему воздействию развивающейся депрессии эритропоэза в ходе развития постгрансфузионной полицитемии, чем способность к комплементации с КОЕэ центральных макрофагов инволюцирующих ЭО.

3. По мере углубления депрессии эритропоэза в ходе развития по-сгтрансфузионной полицитемии количественно снижается новообразование

Э0 de novo и de repeto, однако, чувствительность инволюцирующих ЭО к эри-тропоэтину, оцениваемая по интенсивности увеличения образования ЭО de repeto в ответ на увеличение дозы эритропоэтина, вносимого в культуру, возрастает.

4. По мере угнетения эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной полицитемии снижается способность эритроидных клеток «короны» ЭО отвечать увеличением митотической активности на внесение в культуру эритропоэтина.

5. Т-лимфоциты, внесенные совместно с эритропоэтином в культуру ЭО, восстанавливают способность резидуалышх макрофагов костного мозга к комплементации с КОЕэ, угнетенную в ходе развития посттрансфузионной полицитемии, а также повышают способность к комплементации с КОЕэ центральных макрофагов инволюцирующих ЭО.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фекличева И. В. Метод тестирования биологической активности различных веществ in vitro / Ю. M. Захаров, Е. JI. Куренков, Н. В. Тишев-ская, С. А. Шевяков, И. В. Фекличева, M. Е. Кузнецов // Материалы Всероссийской научно- практической конференции «Клеточные и нанотех-нологии в биологии и медицине».- Курган, 2007.- С. 35- 36.

2. Фекличева И. В. О чувствительности к эритропоэтину культуры эрит-робластических островков костного мозга гошщитемичных крыс / Ю. М. Захаров, И. В. Фекличева II Материалы VI итоговой научно- практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии,- Челябинск: Издательство «Челябинская государственная медицинская академия», 2008. С. 157- 158.

3. Фекличева И. В. О чувствительности к эритропоэтину культуры эрит-

робластических островков костного мозга полицитемичных крыс / Ю. М. Захаров, И. В. Фекличева // Тезисы докладов VI Сибирского физиологического съезда,- Барнаул,- 2008,- Т.1. С. 78.

4. Фекличева И. В. О влиянии Т- лимфоцитов на эритропоэз в культуре эритробластических островков костного мозга крыс с полицитемией / Ю. М. Захаров, И. В. Фекличева// Онкогематология.- 2009,- №4,- С.47-48.

5. Фекличева И. В. О влиянии эритропоэтина и Т- лимфоцитов на эритропоэз в культуре эритробластических островков костного мозга полицитемичных крыс / Ю. М. Захаров, И. В. Фекличева // Вестник Уральской Медицинской Академической Науки. - 2009.- №1.- С. 81-84.

6. Фекличева И. В. О чувствительности к эритропоэтину культуры эритробластических островков костного мозга полицитемичных крыс / Ю. М. Захаров, И. В. Фекличева // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. -2009. -Т.95, №9. - С.955-960.

Список сокращений

ЭО - эритробластический островок

301 - эритробластический островок первого класса зрелости

302 - эритробластический островок второго класса зрелости

303 - эритробластический островок третьего класса зрелости

ЭОинв - инволюцирующий эритробластический островок

ЭОрек - реконструирующийся эритробластический островок

КОЕэ _ колониеобразующая единица эритроцитарная

БОЕэ _ бурстобразующая единица эритроцитарная

МЕ ~ международная единица

ПТП ~ постгрансфузионная полицитемия

ФЕКЛИЧЕВА Инна Викторовна

ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА И Т-ЛИМФОЦИТОВ НА ЭРИТРОПОЭЗ В КУЛЬТУРЕ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ КОСТНОГО МОЗГА ПОЛИЦИТЕМИЧНЫХ КРЫС

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курган-2009

Издательский центр Южно-Уральского государственного университета Подписано в печать 19.10.09г. Формат 60x84 1/16. Печать трафаретая. Усл. печ. л. 1,44. Усл. изд.л. 1,90. Тираж 100 экз. Заказ 104/186 Отпечатано в типографии Издательского центра ЮУрГУ. 454080, г.Челябинск, пр. им. В.И.Ленина, 76.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Фёкличева, Инна Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. О ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЭРИТРОПОЭТИНУ

КУЛЬТУРЫ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ КОСТНОГО МОЗГА ПОЛИЦИТЕМИЧНЫХ

КРЫС.

ГЛАВА 4. О ВЛИЯНИИ ЭРИТРОПОЭТИНА НА

ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЭРИТРОИДНЫХ

КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ.ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ПОСТТРАНСФУЗИОННОЙ

ПОЛИЦИТЕМИИ.

ГЛАВА 5. О ВЛИЯНИИ Т- ЛИМФОЦИТОВ НА ЭРИТРОПОЭЗ В КУЛЬТУРЕ ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ КОСТНОГО МОЗГА ПОЛИЦИТЕМИЧНЫХ КРЫС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние эритропоэтина и Т-лимфоцитов на эритропоэз в культуре эритробластических островков костного мозга полицитемичных крыс"

Актуальность исследования

Депрессия кроветворения остается в настоящее время актуальной и во многом нерешенной задачей (Павлов А. Д., 2008). Известно, что экспериментальная модель угнетенного эритропоэза- посттрансфузионная полицитемия вызывает . торможение эритропоэза, которое проявляется снижением абсолютного количества эритробластических островков (ЭО), являющихся основными морфофункциональными единицами эритропоэза, в которых в эритроидную дифференциацию вовлекаются КОЕэ, осуществляются процессы размножения эритробластов и их созревание (Bessis M., 1958; Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., 1984; Захаров Ю. М., Рассохин • А. ' Г., 2002). Одновременно выявляется снижение содержания пролиферирующих и повышением содержания созревающих классов ЭО в костном мозге крыс (Мельников И.Ю.,1986; Рассохин А.Г.,1990). Центральные макрофаги пролиферирующих классов (Э01, Э02 и ЭОЗ) у полицитемичных крыс обнаруживают сниженную фагоцитарную активность по сравнению с ЭО тех же классов у интактных крыс (Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П.Д992).

Возможными причинами угнетения эритропоэза при полицитемии •являются снижение образования эритропоэтина почками (Crocker P. R., 1991), нарастанием уровня ингибиторов эритропоэза в крови (Krzymowski Т., Krzymowska H., 1962), возможно снижающих чувствительность эритробластических островков костного мозга к эритропоэтину за счет сдвига соотношения эритропоэтина и ингибиторов эритропоэза в сторону последних (Захаров Ю.М., 2006). Таюке выявлено, что введение больших доз эритропоэтина крысам в течении нескольких недель вызывает за тем состояние костного мозга, характеризуемое отсутствием ответа эритроидного ростка на эритропоэтин (Pirón M., Loo M., Gothot A., Tassin F., Fillet G., Béguin Y., 2001). Остается невыясненным, что является причиной изменения чувствительности центральных макрофагов ЭО и эритроидных клеток к эритропоэтину при воспроизведении данных моделей депрессии эритропоэза.

В условиях целого организма эритропоэтин действует на ЭО костного мозга совместно с рядом других факторов, модулирующих влияние эритропоэтина на клетки- мишени, и выделить изолированные эффекты •эритропоэтина в , опытах in vivo очень трудно. Изучить способность эритробластических островков костного мозга разных классов зрелости реагировать на эритропоэтин в зависимости от степени угнетения в них эритропоэза, когда действие других факторов, модулирующих его эффекты сведено к минимуму, позволяет метод культивирования эритробластических островков (Zakharov Y. M., Prenant M., 1982).

Введение эритропоэтина полицитемичным животным in vivo увеличивает в костном мозге абсолютное количество эритробластических островков за счет эритробластических островков 1-го, 2-го, 3-го классов, реконструирующихся эритробластических островков, а также увеличивает митотическую активность клеток эритроидной «короны» ЭО указанных классов зрелости, но снижает количество инволюцирующих эритробластических островков (Захаров Ю. М., Медяник Б. В., 1997., Рассохин А.Г., 1990). Исследований, подобных указанным выше, на культурах эритробластических островков полицитемичных животных, не проводилось.

Установлено морфогенетическое свойство Т-лимфоцитов усиливать регенерацию тканей различных органов (Бабаева А. Г., 1972, 1995), в том числе и кроветворных (Горизонтов П. Д. и др., 1980, Гольдберг Е. Д. и др., .1983, Ястребов А. П., Шаравара А. А, 1991). При острой кровопотере лимфоциты, мигрирующие в костный мозг, активно контактируют с эритробластическими островками (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002). Исследование контактов эритробластических островков с лимфоидными клетками в культуре показало, что лимфоциты контактируют только с эритробластическими островками.пролиферирующих классов зрелости, т. е. с ЭО первого, второго классов зрелости и реконструирующимися ЭО (Захаров Ю. М., Тишевская Н.В., 2003), что позволяет предполагать их участие в активации эритропоэза в эритробластических островках. Данных в доступной -нам литературе о возможной роли Т-лимфоцитов в восстановлении эритропоэза, угнетенного в ходе развития посттрансфузионной полицитемии мы не нашли.

Цель исследования:

Изучить влияние эритропоэтина и Т- лимфоцитов на эритропоэз в культуре ЭО костного мозга полицитемичных животных.

Задачи исследования:

1. Исследовать, как изменяется чувствительность к эритропоэтину разных элементов костного мозга, участвующих в формировании ЭО: КОЕэ, центрального макрофага ЭО и «короны» ЭО в зависимости от глубины депрессии эритропоэза, развивающейся в ходе посттрансфузионной полицитемии. '

2. Исследовать в культуре эритробластических островков влияние экспериментальной депрессии эритропоэза на способность клеток эритроидной короны эритробластических островков костного мозга отвечать на эритропоэтин возрастанием пролиферативной активности.

3. Оценить эритропоэтический эффект Т-лимфоцитов на разные классы эритробластических островков в культуре костного мозга полицитемичных животных, их способность активировать комплементацию КОЕэ с макрофагами костного мозга.

Научная новизна исследования:

Впервые, при исследовании эритропоэза в культуре ЭО костного мозга полицитемичных крыс, выявлено, что способность резидуальных макрофагов к комплементации с КОЕэ под влиянием эритропоэтина более подвержена ингибирующему воздействию развивающейся депрессии эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной полицитемии, чем способность к комплементации с КОЕэ центральных макрофагов инволюцирующих ЭО. На 5-е и 10-е сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии, в исследуемых культурах ЭО костного мозга полицитемичных крыс комплементация резидуальных макрофагов . с КОЕэ полностью отсутствовует, т. е. эритропоэз на' данные сроки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии, при внесении в культуры эритропоэтина в дозах 0,25, 0,5 и 1 МЕ на 1 мл культуральной среды поддерживается за счет формирования ЭО с1е гере1:о.

Впервые выявлено, что в культурах ЭО костного мозга, полученных на 2-е сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии, пролиферативная активность эритроидных клеток в ответ на внесение в культуры эритропоэтина в большей степени возрастает в ЭО 1 и 2 классов зрелости, чем в ЭО реконструирующихся (ЭОрек). В культурах ЭО костного мозга, выделенного на 5-е сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии, Э01 и Э02 отсутствуют, а пролиферативная активность эритроидных клеток ЭОрек в ответ на внесение в культуру эритропоэтина возрастает в меньшей степени, чем в ЭОрек культур ЭО костного мозга, выделенного на 2-е сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии.

Впервые выявлено, что Т-лимфоцитй, внесенные в культуры эритробластических островков костного мозга полицитемичных крыс совместно с эритропоэтином, уже через 24 часа культивирования активируют в ней как формирование эритробластических островков 1 класса зрелости (при взаимодействии КОЕэ с резидуальными макрофагами), так и поддерживают формирование реконструирующихся эритробластических островков (т. е. комплементацию КОЕэ с макрофагами инволюцирующих эритробластических островков), тогда как внесение одного эритропоэтина в данные культуры активирует эритропоэз только за счет образования реконстуирующихся эритробластических островков.

Научно-практическая ценность работы и внедрение полученных результатов

Результаты работы могут быть использованы в экспериментальной гематологии, физиологии и патофизиологии, а также в программах подготовки специалистов медико-биологического профиля.

Полученные результаты внедрены в Проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики ЮУНЦ РАМН.

Положения, выносимые на защиту

1. Депрессия эритропоэза при посттрансфузионной полицитемии вызывает преимущественное торможение формирования ЭО de novo с поддержанием сохраняющегося эритропоэза на уровне инволюцирующих и реконструирующихся ЭО, с одновременным снижением их чувствительности к эритропоэтину.

2. Способность клеток эритроидной «короны» культивируемых ЭО костного мозга полицитемичных крыс отвечать на внесение эритропоэтина в культуру возрастанием пролифератитивной активности, снижается по мере углубления эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной полицитемии.

3. Активация эритропоэза в ЭО de novo и de repeto in vitro более выраженно стимулируется сочетанным действием Т- лимфоцитов и эритропоэтина, по сравнению с действием одного эритропоэтина.

Апробация работы

Основные положения диссертации апробированы на VI Сибирском физиологическом съезде (г. Барнаул, 2008 г.), конференции молодых ученых (Челябинск, 2008), заседаниях кафедры нормальной физиологии совместно с ПНИЛ экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики ЮУНЦ РАМН, Всероссийской научно-практической конференции «Клеточные и нанотехнологии в биологии медицине» (г. Курган, 2008 г.), 6-м симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, 2 из них в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и библиографического списка. Текст диссертационного исследования содержит 120 страниц текста, 12 таблиц, 19 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Фёкличева, Инна Викторовна

ВЫВОДЫ

1. У крыс, подвергшихся • воздействию посттрансфузионной полицитемии, также как и у иитактных животных центральные макрофаги инволюцирующих ЭО более чувствительны к эритропоэтину, чем резидуальные макрофаги костного мозга.

2. ' Способность резидуальных макрофагов к комплементации с КОЕэ под влиянием эритропоэтина более подвержена ингибирующему воздействию развивающейся депрессии эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной полицитемии, чем способность к комплементации с КОЕэ центральных макрофагов инволюцирующих ЭО.

3. По мере углубления депрессии эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной полицитемии количественно снижается новообразование ЭО de novo и de repeto, однако, чувствительность инволюцирующих ЭО к эритропоэтину, оцениваемая по интенсивности увеличения образования ЭО de repeto в ответ на увеличение дозы эритропоэтина, вносимого в культуру, возрастает.

4. По мере угнетения эритропоэза в ходе развития посттрансфузионной полицитемии снижается способность эритроидных клеток «короны» ЭО отвечать увеличением митотической активности на внесение в культуру эритропоэтина.

5. Т- лимфоциты, внесенные совместно с эритропоэтином в культуру ЭО, способствуют восстанавлению способности резидуальных макрофагов костного мозга к комплементации с КОЕэ, угнетенную в ходе развития посттрансфузионной полицитемии, а также повышают способность к комплементации с КОЕэ центральных макрофагов инволюцирующих ЭО.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют, что посттрансфузионная полицитемия по мере ее развития снижает чувствительность резидуальных макрофагов к эритропоэтину, что препятствует формированию ЭО de novo. Макрофаги же, ранее вовлеченные в поддержку эритропоэза в ЭО, отвечают на эритропоэтин формированием ЭО de repeto, вероятно благодаря уже индуцированной в них функционирующей эритроидной «короной» способности к созданию эритропоэтического микроокружения. К понятию последнего, на основании данных нашей лаборатории, а также данных, имеющихся в литературе, можно отнести повышенную секрецию •центральными макрофагами ЭО гликозаминогликанов (Захаров Ю.М., Тишевская Н.В., 1997) развертывание рецепторов к эритроидным клеткам (Crocker P. R., Moms L., Gordon S., 1991), секрецию эритропоэтического макрофагального белка (Teal H. Е. и др.2003). Можно полагать, что данные свойства макрофагов ЭОинв помогают «включать» механизм положительной обратной связи, усиливающий действие на них экзогенного эритропоэтина (Захаров Ю.М., 2006).

Известно, что инъекция эритропоэтина полицитемичным животным вызывает у животных- реципиентов через 48 — 96 часов ретикулоцитарный ■криз (Zakharov Y. M., Prenant M., 1983). Из наших исследований следует, что «источником» данного ретикулоцитарного криза являются ЭОинв и ЭОрек, как структуры, на данные сроки полицитемии представленные в костном мозге. В наших опытах их ответ на эритропоэтин приводит к снижению процентного содержания ЭОинв, что указывает на созревание их короны в ретикулоциты, а рост процентного содержания ЭОрек - на реконструкцию эритропоэза в части инволюцирующих ЭО. Зрелая часть эритроидной «короны» ЭОрек также поддерживает формирование молодых эритроцитов.

Физиологический эритропоэз, протекающий в ЭО костного мозга, можно представить в виде схемы (Захаров Ю. М., 1998):

КОЕэ или проэритробласт • + макрофаг- резидент-► Э01-► Э02-► ЭОЗ-► ЭОинв-► эритроциты

Рис. 16 Физиологический эритропоэз (по Ю. М. Захарову, 1998)

В культуре ЭО костного мозга, выделенного на 5 и 10 сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии, в результате угнетения эритропоэза отсутствует комплементация КОЕэ и проэритробластов с резидуальными макрофагами костного мозга, т.е. блокируется образование ЭО 1 класса зрелости. ЭО 2 класса зрелости в этих культурах также не обнаруживаются, т. к. отсутствуют их предшественники - Э01. Эритропоэз в данных культурах поддерживается за счет образования ЭО с1е гереШ, т. е. реконструирующихся ЭО, которые формируются благодаря комплексации центральных макрофагов инволюцирующих ЭО с КОЕэ и проэритробластами. В результате пролиферации и созревания эритроидных клеток «короны» ЭО, реконструирующиеся ЭО могут преобразовываться в ЭО 3 класса зрелости, а также, теряя ретикулоциты- в инволюцирующие ЭО.

Эритропоэз, протекающий в культуре ЭО костного мозга, выделенного на 5 и 10 сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии, можно представить в виде схемы (рис 17):

1:2:4:8) (8:16) (16:32)

КОЕэ или проэритробласт + макрофаг ЭОинв

ЭОрек (1:32)

КОЕэ или проэритробласт + макрофаг- резидент--►Э01

->-302

-►ЭОЗ А

-►ЭОинв

-> эритроциты

КОЕэ или проэритробласт + макрофаг ЭОинв I

ЭОрек

Рис. 17. Эритропоэз в культуре ЭО костного мозга, выделенного на 5 и 10 сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии. Примечания:

-►- отсутствие перехода одного класса ЭО в другой

-----предполагаемый путь перехода одного класса ЭО в другой.

Под влиянием 0,5 и 1МЕ/мл эритропоэтина, вносимого в культуры ЭО костного мозга, выделенного на 5 и 10 сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии, усиливается процесс комплексации КОЕэ .и проэритробластов с центральными макрофагами инволюцирующих ЭО, в результате чего в данных культурах количество ЭОрек возрастает, а ЭОинв-уменыпается.' Образования ЭО de novo в этих культурах не наблюдается (рис. 18):

КОЕэ или проэритробласт + макрофаг- резидент-->-301--►Э02

->303 ▲

-►ЭОинв эритроциты

КОЕэ или проэритробласт + макрофаг ЭОинв I

Э0рек

Рис. 18.Эритропоэз в культуре ЭО костного мозга, выделенного на 5 и 10 сутки после воспроизведения посттрансфузионной полицитемии, при внесении эритропоэтина в дозах 0,5 и 1 МЕ/мл культуральной среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Фёкличева, Инна Викторовна, Курган

1.. Бабаева, А. Г. Иммунологические механизмы регуляции восстановительных процессов / А. Г. Бабаева.- М.: Медицина, 1972.- 152с.

2. Бабаева, А. Г. Прошлое настоящее и будущее проблемы лимфоидных клеток (обзор) / А. Г. Бабаева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1995.- Т. 120, №9. - С. 230-234.

3. Белошевский, В.А. Анемия при хронических заболеваниях / В.А.Белошевский, Э.В.Минаков. Воронеж: Изд-во Воронежского ун-та, 1995,- 96с.

4. Бернат, И. Патогенез ожоговой анемии / И.Бернат. Будапешт, 1975.-218с.

5. Боровиков, В. STATISTIC А для профессионалов / В. Боровиков. СПб.: Питер, 2001. - 650с.

6. Воргова, JLB. Об изменении эритробластических островков костного мозга у животных при сочетании тепловых и мышечных нагрузок / Л.В.Воргова, Ю.М. Захаров // Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. 1990. - Т.76, №2. - С. 200-206.

7. Гланц, С. А. Медико-биологическая статистика / С.А. Гланц.- М.: Практика, 1999.-459с.

8. Гольдберг, Е. Д. Роль лимфоцитов в регуляции гемопоэза / Е.Д. Гольдберг, А.М.Дыгай, Г.В.Карпова. Томск: Изд- во Томск, ун-та, 1983.-159с.

9. Гриффите, Б. Наращивание клеток животных в культуре / Б. Гриффит // Культура животных клеток. Методы / под ред. Р. Фрешни. М.: Мир, 1988.- С.56-107.

10. Гудим, В.И. К методике биотестирования эритропоэтина на полицитемических мышах / В.И. Гудим, B.C. Иванова // Лабораторное дело. 1977. - №7. - С.429-430.

11. Дыгай, А. М. О. способности Т- лимфоцитов in situ реализовывать свои регуляторные влияния на уровне БОЕ-Э-ДК и КОЕ-Э-ДК / А.М.Дыгай, Е.Д.Гольдберг, Г.К.Попов, В.П.Шахов // Гематология и трансфузиология.-1985.-№11.- С.33-37.

12. Дымшиц, P.A. Исследование ингибиторов эритропоэза / P.A. Дымшиц,- Ю.М. Захаров, В.И. Филимонов // Биофизика, физиология и патология эритрона: материалы съезда. — Красноярск, 1974. С.27-31.

13. Захаров, Ю.М. Достижения в экспериментальных исследованиях эритропоэза /Ю.М.Захаров // Актуальные проблемы регуляции кроветворения и неоангиогенеза. Челябинск, 1998.- С.7-18.

14. Захаров, Ю.М. Метод выделения эритробластических островков из костного мозга человека / Ю.М.Захаров, АХ.Рассохин, П.Д.Сини-цын,

15. В.П.Волкова // Лабораторное дело. 1988. - №5. - С.20-21.

16. Захаров, Ю.М. Молекулярные и клеточно-клеточные механизмы регуляции эритропоэза / Ю.М. Захаров // Вестник РАМН. 2000. - №3. - С.4-9.

17. Захаров, Ю.М. О роли нервной системы и ингибиторов кроветворения в его регуляции (обзор) / Ю.М.Захаров //Физиологический журнал им. Сеченова. 2004. - Т.90, №8. - С.987:1000.

18. Захаров, Ю.М. Роль обратных связей в регуляции эритропоэза / Ю.М.Захаров // Физиологический журнал им. Сеченова.- 2006.- Т.92, №9.-С.1033- 1045.

19. Захаров, Ю.М. О закономерностях реконструкции эритропоэза в эритробластических островках / Ю.М. Захаров, Б.В.Медяник //Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 1994. - Т.80, № З.-С.76-82.

20. Захаров, Ю.М. Экспериментальные исследования авторегуляции эритрона: автореф. дис. . д-ра мёд. наук / Ю.М.Захаров.- Свердловск, 1974.-31с.

21. Захаров, Ю.М. Эритробластический островок / Ю.М.Захаров, А.Г. Рассохин. М.: Медицина, 2002. - 280с.

22. Захаров, Ю.М. Фагоцитарная активность центрального макрофага эритробластического островка при экспериментальном торможении и стимуляции эритропоэза /Ю.М.Захаров, Л.П.Варыпаева //Гематология и трансфузиология.- 1992.- Т.37, №9.- С.21- 23.

23. Захаров, Ю.М. О пролиферативной активности эритробластов в эритробластических островках костного мозга у крыс /Ю.М.Захаров, Б.В.Медяник //Физиологический журнал им. Сеченова. -1997. Т.83, №7. - С.64- 69.

24. Захаров, Ю.М. Эритробластический островок функционально-анатомическая единица эритропоэза / Ю.М.Захаров, И.Ю.Мельников //Гематология и трансфузиология.-1984.- Т.29, №10.- С.51-56.

25. Захаров, Ю.М. О влиянии ядер клеток различных органов на эритропоэз / Ю.М.Захаров, А.Д.Табарчук, Г.П.Ефименко, В.Н.Ершов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -1973.- №3.-С.58-60.

26. Захаров, Ю.М. О взаимосвязи функциональной активности центральных' макрофагов с кинетикой эритропоэза в эритробластических островках /Ю.М.Захаров, Н.В.Тишевская // Вопросы экспериментальной физиологйи.- М.; Екатеринбург, 1997.- С.95-103.

27. Захаров, Ю.М. Влияние острой застойной спленомегалии на состояние эритрона у крыс / Ю.М.Захаров, Н.В.Тишевская, И.А.Тишевс-кой //Физиологический журнал им. Сеченова. -2001.- Т.87, №3.- С.353- 359.

28. Шапошник, A.A. Антигипоксические и протекторные свойства эритропоэтина / А.А.Шапошник, Ю.М.Захаров, Н.В.Тишевская и др. // Медицинская наука и образование Урала. -2008. №2. - С.40-43.

29. Захаров, Ю.М. О влиянии ингибиторов эритропоэза на метаболизм тканей некоторых органов / Ю.М.Захаров, В.С.Якушев // Физиологический журнал СССР им. И.М.Сеченова.-1976.- №2 С.230-235.

30. Каюмова, А.Ф. Нарушения в системе крови, вызванные гербицидом аминной солью 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты (экспериментальное исследование): дис. . д-ра мед. наук / А.Ф. Каюмова. -Уфа, 1996. - 292с.

31. Куренков, E.JI. Активность ядрышковых организаторов в клетках • культур эритробластических островков костного мозга / Е.Л.Куренков, Ю.М.Захаров, С.А.Шевяков, А.Г.Рассохин // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова.- 2002.- Т.88, №9.- С.1182-1190.

32. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. - 368с.

33. Лурия, Е.А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах / Е.А.Лурия. М.: Медицина, 1972. - 176с.

34. Моисеева, О.И. Влияние ингибиторов эритропоэза на эритрон / О.И. Моисеева // Физиология системы крови. Физиология эритропоэза: руководство по физиологии. Ленинград, 1979. - С.159-171.

35. Мосягина, E.H. Кинетика форменных элементов крови / Е.Н.Мосягина, Е.Б.Владимирская, Н.А.Торубарова, Н.В.Мызина.- М.: Медицина, 1976.- 272с.

36. Неустроев, Г.В. Об участии кейлонов в регуляции эритропоэза / Г.В.Неустроев // Успехи физиологических наук. -1984. -Т.15, №2.- С.27- 40.

37. Оленев, С.Н, Среды для культивирования / С.Н. Оленев //Руководство по культивированию нервной ткани.- М.: Медицина, 1976. -С.47-88.

38. Павлов, А. Д. Эритропоэтин: итоги и перспективы исследования / Павлов, А. Д.- Рязань; М., 2008.- 46с.

39. Рассохин, А.Г. Морфология эритробластических островков костного мозга гематологических больных / А.Г. Рассохин, Ю.М. Захаров, П.Д.Синицын, В.П. Волкова // Архив патологии.-1989.-№ 9.- С.61-67.

40. Рассохин, А.Г. Эритробластические островки костного мозга и их место в эритроне в норме и при изменении состояния эритропоэза в организме: дис. . д-ра мед. наук / А.Г. Рассохин. Челябинск, 1997.- 420с.

41. Сороковая, В.И. Стимуляция эритропоэза при кровопотере на фоне беременности с помощью микровезикул из плазмолеммы эритроцитов /

42. B.И.Сороковая, А.П.Милованов, Г.М.Никитина //Архив патологии. 1995. -Т.57, №2. - С.65-68.

43. Тартаковский., А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих /А.Д.Тартаковский // Методы культивирования клеток: сб. науч. тр. Л.: Наука, 1988. - С.44-63.

44. Ужанский, Я.Г. Физиологические механизмы регенерации крови / Я.Г.Ужанский. М.: Медицина, 1968.- 264с.

45. Филимонов, В.И. Механизмы торможения эритропоэза •ингибитором / В.И.Филимонов // Патофизиология и экспериментальная терапия.- 1972.-№5.- С.ЗЗ- 37.

46. Филимонов, В.И. Исследование в онтогенезе механизма .гуморальной регуляции эритропоэза и роли селезенки в этом процессе: автореф. дис. . д-ра мед. наук / В.И.Филимонов.- Новосибирск, 1974.-34с.

47. Халитова, Г.Г. О роли субклеточных фракций почек и селезёнки в механизмах стимуляции и ингибиции эритропоэза: автореф. дис. . канд. биол. наук / Г.Г. Халитова. Москва,-1980. — 24 с.

48. Харченко, М.Ф. Роль гликозаминогликанов и протеогликанов в гемопоэзе и физиологических функциях клеток крови / М. Ф.Харченко, Л.П.Рыбакова, Н.В.Тишевская, Ю.М.Захаров // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. -1996.-Т.82, №5-6. С.18-25.

49. Цуцаева, A.A. Влияние моноцитов-макрофагов на колониеобразующую активность нативных и криоконсервированных кроветворных клеток / A.A. Цуцаева, О.В. Кудокоцева, A.B. Щеглов // Гематология и трансфузиология. 2002. - №1. - С.22-24.

50. Юшков, Б.Г. Гликозаминогликаны и эритропоэз / Б.Г. Юшков, Г.К. Попов, М.В. Северин, А.П. Ястребов. Екатеринбург: УрОРАН, 1994. -127 с.

51. Ястребов, А.П. О роли гипоксии в механизме регенерации крови: автореф. дис:. д-ра мед. наук / А.П.Ястребов.- Свердловск, 1972.- 36с.

52. Anagnostu, A. Erythropoietin hasw a mitogenic and positive chemotactic effect on endothelial cells / A. Anagnostu, E. Lee, N. Kesmain et al. // -Proc. Natl. Acad. Sci. -1990. Vol.87. - P.59-78.

53. Andrea, A. D. Erythropoietin receptor / A. D. Andrea, I. I. Zon // J. Clin. Invest.- 1990.- Vol. 86, №3.- P; 681 -687.

54. Ben-Ishay, Z. Ultrastmctural studies of erythroblastic islands of rat bone marrow. III. Effect of sublethal irradiation / Z. Ben-Ishay, J.M. Yoffey // Lab. Invest.-1974.-Vol.30, №2. P.320-332.

55. Beru, N. Expression of the erythropoietin gene / N. Bern, J. McDonald, C.Lacombe, E. Goldwasser // Mol. Cell Biol. 1986. - Vol.6, №7. - P. 2571- 2575.

56. Bessis, M. Incorporation de granules ferrugineux par les erythroblastes observee au microscope electronique / M.Bessis, J.Breton-Gorius // C. R. Soc. Bid.- 1956.- Vol.l50.-P.1903-1905.

57. Bessis, M. Granules ferrugineux observes au microscope électronique dans les cellules de la moelle osseuse et dans les siderocytes / M. Bessis, J. Breton-Gorius // C. R. Acad. sci. - 1956. - Vol. 243. - P. 1235 - 1237

58. Bessis, M. Cellules du sang normal et pathologique / M. Bessis. -Paris, 1972.-367p.

59. Boissel, J.- P." D. Bunn Erythropoietin: mammalian seqences and scanning deletion support a four alpha- helical bundle structural model / J.-P. D.Boissel, H. F.Wen // Annals N. Y. Acad. Sci. 1994.-Vol. 718.- P. 203- 212.

60. Breton-Gorius, J. Association between leukemic erythroid progenitors and bone marrow macrophages / J. Breton-Gorius, M.N. Vuillet-Gaugler //Blood Cells. 1991. - Vol.17, №1. - P. 127-146.

61. Brisce, J. JAKs and STATs branch out Trends. / J. Brisce. // Cell Biology. 1996.-Vol.6.-P.336-340. •

62. Buemi, M. Erythropoietin and the brain: From neurodevelopment to neuroprotection. / M. Buemi, E. Cavallaro, F. Floccari et al. // Clin Sci. 2002. - Vol.103, №3. - P.275-282.

63. Cella, N. Characterization of Stat5a and Stat5b homodimers and heterodimers and their association with the glucocorticoid receptor in mammary cells / N. Cella, B. Groner, N. Hynes. // Mol.Cell. Biol. 1998. -Vol.18, №4.-P.1783-1792.

64. Chin, H. Physical and functional interactions between Stat-5 and the tyrosine-phosphorylase receptors for erythropoietin and interleukin-3 / H.Chin, N. Nakamura, R. Kamiyama et al. // Ibid. 1996. - №2. - P.4415- 4425.

65. Chodosh, L. Global regulation of erythroid gene expression by transcription factor GATA-1 / L. Chodosh, M. Weiss. // Blood. 2004. - Vol.102, N8. - P.211-223.

66. Crocker, P. R. Adhesion reseptors involved in the erythroblastic islands/ P.R.Crocker, L.Morris, S.Gordon //Blood cells.- 1991.-№17.-P.83-96.

67. Curtis, A. Adhesion of cells to polysterine surfaces / A. Curtis, J. Forrester, C. Mclnnes et al. // J.Cell. Biol. 1983. - Vol.97. - P. 1500-1506.

68. Dame, C. The biology of erythropoietin in the central nervous system and its neurotrophic und neuroprotective potential / C.Dame, S.Juul, R.Christensen. // Biol. Neonate. 2001.- Vol.79, №3-4. - P.228-235.

69. Dame, C. Molecular biology of the erythropoietin receptor in hematopoietic and nonhematopoietic tissues / C. Dame'// Erythropoietins and erythropoiesis.- Basel: Birkhauser Verlag, 2003.-P. 35-64.

70. Dexter, T. Long-term marrow culture: an overview of techniques an experience / T. Dexter, E. Spooncer, P. Simmons // Alan R. Long-term marrow culture.' New York: Liss, 1984.- P.57-96.

71. Egrie, J. Characterization and biological effects of recombinant human erythrioietin / J. Egrie, T. Strickland et al. // Immunobiol. 1986. -Vol.172.-P.213-224.

72. Egrie, J. The molecular biology of erythropoietin / J. Egrie, J. Bronine. // Erythropoietin -molecular, cellular and clinical biology The Johns Hopkins Univ.- Press.- Baltimore, 1991.- P.21-40.

73. Epstein, E.N. Physiology of renal hipoxia / E.N. Epstein, Y. Agmon, M. Brezis // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994.'- №18. - P.72-82

74. Erslev, A.J. Production and destruction of erythrocytes / A.J.Erslev, E.Beutler // Williams Hematology. fifth edition.- N.Y.: McJraw-Hill., 1995.- P. 425-441.

75. Erbayraktar, S. Erythropoietin is a multifunctional tissue-protective cytokine / S. Erbayraktar, G. Yilmaz, N. Gokmen et al. // Curr. Hematol. ep. -2003. Vol.2, N6. - P.465-470.

76. Gorlach, A. Photometric characteristics of haem proteins in • erythropoietin- producing hepatoma cells (HepG2) / A.Gorlach, G.Holtermann, WJelkmann et al // Biochem. J.-1993.-V.290, №.3.- P. 771-776.

77. Gregory, T. GATA-1 arid erythropoietin cooperate no promote erythroid cell survival by regulating Bsl-xL expression / T.Gregory // Blood.-1999.-Vol. 94, №1.- P.87-96.

78. Gutierrez, L. Hornotypic signalling regulates Gata 1 activity in the erythroblastic island / L.Gutierrez, F.Lindeboom, A. Langeveld et al // Development. Jul. 2004. - Vol.131, №13. - P.3183-3193.

79. Feldman, L. B-lymphocyte derived burst-promotion activity is pleotropic erythroid colon-stimulating factor / L.Feldman, J.J.Fraizier, A.J. Sytkowski // Exp. Hematol.-1992.-Vol.20, №10.-P.1223-1228.

80. Fisher, J.W. Adenosin A2A, and A2B receptor activation of erythropoietin' production / J.W.Fisher, J.Brookins // Am J. Physiol.-2001.-Vol.281.-P.826- 832. //Hematol.-1992.-Vol.20, №10.-P.1223-1228.

81. Fisher, J.W. Pharmacological agents and erythroid colony formation: effects of beta-adrenergic agonists and steroids / J.W. Fisher, Y.Ohno, B. Modder et al.//In vitro aspects of erythropoiesis.-New York, 1978.-P. 103-117.

82. Fisher, W. Erythropoietin: physiology and pharmacology update / W. •Fisher // Exp. Biol. Med. 2003. - Vol.228, N1. - P.l-14.

83. Fraser, J. Expression of specific high affinity binding sites for ' erythropoietin on rat and mouse megakaryocytes / J. Fraser, A. Tan, F. Lin, M.V.Berridge // Exp. Hematol.-1989.-Vol. 17, №1. P.10-16.

84. Fujii, Y. Electron microscopic study of erythroblastic islands obtained by «tissue-stamp culture» method / Y. Fujii, N. Terada, H. Ueda. // J. Electron. Microsc. (Tokyo). 1997. - Vol.46, N6. - P.477-484.

85. Ham, R.G. Media and growth requirements / R.G. Ham, W.L. McKeehan. // Methods in Enzymology.-1979.-Vol.58. P.44-93.

86. Ham, R.G. Survival and growth requirements of nontransformed cells / R.G. Ham // Handbook of experimental pharmacology. -Berlin.- 1981.- Vol.57. -P.13-88.

87. Ihle, J.N. Signal transducers and activators of transcription / J.N. Ihle // Cell.-1996.-Vol.84.-P.331-337. ■

88. Jelkmann, W. Renal erythropoietin: properties and production 7W. Jelkmann // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1986. - Vol.104. - P. 139215.

89. Juul, S.E. Why is erythropoietin present in human milk? Studies of erythropoietin receptors on enterocytes of human and rat neonates / S.E. Juul, A.E. Joyce, Y. Zhao, D.J.Ledbetter // Pediatr. Res. 1999.- Vol.46, №3.- P.263-268.

90. Kanamaru, A. Augmentation of eryhtroid burst formation by the addition of. the thymocytes and other myelo-lymphoid cells / A.Kanamaru, E.Durban, M.T.Gallagher et al // J. Cells Physiol.-1980.-Vol.104.-P.187- 197.

91. Kirby, S.L. Proliferation of multipotent hematopoietic cells ■ controlled by a truncated erythropoietin receptor transgene / S.L.Kirby, D.N.Cook,

92. W.Walton, O.Smithies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996: - Vol.93, №24.-.P.9402-9407.

93. Kouri, MJ. The molecular mechanism of erythropoietin action / M.J. • Koury, M.C. Bondurant // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol.210, N3. - P. 649-663.

94. Koury, S.T. Localization of cells producing erythropoietin in murine liver by in situ hybridization / S.T: Koury, M.C. ■ Bondurant, M.J. Koury, G.L. Semenza // Blood.-1991.-№77.- P.2497-2503.

95. Krantz, S. Specific Binding of Erythropoietin to Spleen Cells Infected with the Anemia Strain of Friend Virus / S.B. Krantz, E.Goldwasser // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - N281. - P.7574 - 7578.

96. Krzymowski, T. Studies on the erythropoiesis inhibiting faktor in the plasma of animals with transfusion polycythemia / T.Krzymowski, H.Krzymowska //Blood.-1962.-Vol.9, №l.-P.38-42.

97. Kuramochi, S. Transmembrane signaling during erythropoietin- and dimethylsulfoxide- induced erythroid cell differentiation / S. Kuramochi, Y. Sugimoto, Y. Ikawa, K. Todokoro // Eur. J. Biochem. 1990. - Vol.193, №1. -P.163-168.

98. Lai, P.H. Structural characterization of human erythropoietin / P.H. Lai, R. Everett, F.F.Wang, T.Arakawa, E.Goldwasser // J. Biol. Chem. 1986.-Vol.261, N7.-P.3116-3121.

99. Lappin, T. The cellular biology of erythropoietin receptors / T. . Lappin //0ncologist.-2003.-Vol.8, N1.- P. 15-28.

100. Li, D. Macrophage-associated erythropoiesis and lymphocytopoiesis in mouse fetal liver: ultrastructural and ISH analysis / D. Li, G. Wang, Z. Liu et al. // Cell.Biol.Ini-. 2004. - Vol.28, N6. - P.457-461.

101. Lin, C. Differential effects of an erythropoietin receptor gene disruption on primitive and definitive erythropoiesis / C. Lin, S. Lim, V. D'Agati // Genes Dev. 1996. - Vol. 10, №2. - P. 154-157.

102. Lin, F. Cloning and expression of the human erythropoietin gene / F. Lin, S. Suggs, C Lin // Proc.Natl.Acad.Sci. 1985. - Vol.82. - P.7580-7584.

103. Longmore, G. D. Redundant and selective role for erythropoietin receptor tyrosines in erythropoiesis in vivo / G. D.Longmore, Y.You, J.Molden // Blood. 1998.-Vol.91, N3. - P.870-878.

104. Matsumoto, A. CIS, a cytokine inducible SH2 protein, is a target of the jak-stat 5 pathway and modulates stat5 activation / A.Matsumoto, M.Masuhara, K.Mitsui et al //Blood.- 1997.-Vol.89, №9.-P. 3148-3154.

105. Matsuoka, K. Studies on reticuloendothelial system, and hematopoiesis, II.A study on the morphology and function of erytroblastic islet / K. Matsuoka//Acta Med. Okayama. 1965. - Vol.19, №4. - P. 161-176.

106. Middleton, S.A. Identification of a critical ligand binding determinant of the human erythropoietin receptor / S.A.Middleton, D.L Johnson, R.Jin et al'// J. Biol chem.-1996.-Vol.272 .- P. 14045-14050.

107. Mize, C. Etude in vitro de Famplification au cours de l'erythropoiese du rat / C.Mize, M.Prenant, N.Pourreau, M. Bessis // Nouv. Rev. Er. Hematol. -1977. -Vol.18, №3.- P.627-631.

108. Mohandas, N. Cell-Cell interactions and erythropoiesis / N.Mohandas //Blood cells,- 1991. Vol.17, №1. - P.59-64.

109. Mohle, R. The role of endothelium in the regulation of hematopoietic stem cell migration / R. Mohle, S. Raffii, M. Moore // Stem Cells. 1998. -Vol.16, Nl.-P.1-59-165.

110. Mufson, P. Binding and internalization of recombinant human erythropoietin in murine erythroid precursors cells / P. Mufson, T. Gesner //

111. Blood. -1987.-Vol.69. P.1485-1490.

112. Policard, A. Micropinocytosis and rhopheocytosis / A. Policard, M. ■Bessis // Nature. 1962. -Vol. 194, № 4823. - P. 110-111.

113. Ramsey, W. Surface treatments and cell attachment /W.Ramsey, W. Hertl, E.Nowlan, N.J.Binkowski // In Vitro. 1984. - Vol.20, №10,- P.802-808.

114. Rane, S. JAKs, STATs and Scr kinases in hematopoiesis / S. Rane, E. Reddy // Oncogene. 2002. -Vol.21, N.2. - P.3334-3358.

115. Recny, M.A. Structural- characterization of natural human urinary and recombinant DNA-derived erythropoietin. Identification of des-arginine 166 erythropoietin / M.A. Recny, H.A. Scoble, Y. Kim // J. Biol. Chem. 1987. -Vol.262, №35. - P.17156-17163.

116. Rich, I.N. An erythropoietic stimulating factor similar . to erythropoietin released by macrophages after treatment with silica / I.N. Rich, W. Heit, B. Kubanek //Blut. 1980. - Vol.40, N 5. - P.297-303.

117. Rich, I. Erythropoietin gene expression in vitro and in vivo detected by in situ hybridization / I. Rich, C. Vogt, S. Pentz // Blood Cells. 1988.-Vol.4, №2-3 .-P.505-520.

118. Rich, I.N. Erythropoietin production: a personal view / I.N. Rich // Exp. hematol. -1991.- Vol'. 19, №9. P.985-990.

119. Rich, I.N. Introduction: developmental biology of erythropoiesis -Molecular, cellular, and developmental biology of erythropoietin and .erythropoiesis / I.N. Rich, T.R.J. Lappin // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. -Vol.718.-P. 123-124.

120. Ruscetti, S.K. Activation of GATA-1 and Epo receptor genes by leukemia- indusing retrovirus /S.K.Ruscetti, R.E.Aurigemma //Ann. N. Y. Acad. Sci.- 1994.-Vol. 718.- P.245-254.

121. Piron, M. Cessation of intensive treatment with recombinant human erythropoietin is followed by secondary anemia /M.Piron, M.Eoo, A.Gothot // Blood.- 2001.- Vol.97, №2.- P.442-448.

122. Perrimon, N.A. Negative feedback mechanisms and their roles during pattern formation / N.A.Perrimon, A.P. Mc Mahon // Cell.-1999.-Vol.97, №1,-P.13-16.

123. Prenant, M. L1 ilot erythroblastiques contribution a 1' etude experimental de l'erythripoiese des mammiferes / M. Prenant. Paris, 1977.-132p.

124. Sato, T. Erythroid progenitors differentiate and mature in response to endogenous erythropoietin / T. Sato, T. Maekawa, S. Watanabe et al // J. Clin. Invest. 2000: - Vol. 106, №2. - P.263-270.

125. Sawada, K. Quantitation of specific binding of erythropoietin to human erythroid colony-forming cells / K. Sawada, S. Krantz, S. Sawyer, C.I. Civin //J.Cell Physiol.-1988.-Vol. 137, №2. P.337-345.

126. Sawyer, S.T. Erythropoietin stimulates 45Ca2+ uptake in Friend virus-infected erythroid cells / S.T. Sawyer, S.B. Krantz // J. Biol. Chem. 1984. -Vol. 259, №5,- P.2769-2774.

127. Sawyer, S.T. Introduction: the erythropoietin receptor and signal transduction / S.T. Sawyer//Ann. N.Y. Acad. Sci.-1994.-Vol.7I8.-P.185-190.

128. Semenza, G. L. HIF- 1 02 and 3 PHDs: hom animal cells hypoxia to the nucleus / G.L.Semenza // Cell.-2001.- Vol.107, №1.- P.l-3.

129. Sharkis, S.J. Characterization of subpopulation of thymocytes wich regulate the proliferation of erythroid progenitor cells in vitro/ S. J. Sharkis, M.Colvin, L.L.Sensenbrenner//Exp. Hématol.-1981.-Vol.9.- P.196.

130. Sharkis, S.J. Regulation of hematopoiesis: helper and suppressor influences of the thymus / S.J.Sharkis, J.L.Spivac, A.Ahmed et al // Blood.-1980.-Vol.5, №3.- P.524-527.

131. Sherwood, J. The chemistry and physiology of erythropoietin / J. Sherwood //Vitam.Horm. -1984. -Vol.41. P. 161-211.

132. Siren, A.L. Erythropoietin- and erythropoietin receptor in human ischemic/hypoxic brain /A.L.Siren, F.Knerlich, W.Poser et al // Acta Neuropathol.-2001.-Vol.101, №3. P.271-276.

133. Sorenson, G.D. Elektron microscopic observations of bone marrov from patients with sideroblastic anemia / G.D.Sorenson // Am. J. Pathol.-1962. -№40.-P.296-300.

134. Stocklin, E. Functional interactions between Stat5 and the glucocorticoid receptor / E.Stocklin, M.Wissler, F.Gouilleux // Nature.-1996.1. Vol.3 83 .-P.726-728.

135. Stopka, T. Human hematopoietic progenitors express erythropoietin/ •T.Stopka, J.H.Zivnu, P.Stopkova//Blood.- 1998.- Vol.91, №10.- P.3766-3772.

136. Tordjman, R. Erythroblasts are a source of angiogenic factors / R. Tordjman, S. Delaire. // Blood. 2001.-Vol.97, N7. - P. 1968-1974.

137. Von Lindern, M. Control of Erythropoiesis by Eiythropoietin and Stem Cell Factor: A Novel Role for-Button's Tyrosine Kinase / M. Von Lindern, U. Schmidt, H. Beug // Cell Cycle. 2004-. - Vol.26, N3. - P. 12-14.

138. Watkins, P.C. Regional assignment of the erythropoietin gene to human chromosome region 7pter-q22 / P.C.Watkins, R.Eddy, N.Hoffman et al // Cytogenet. Cell Genet.- 1986.- Vol.42, №4. P.214-218.

139. Whyatt, D.A. Cell- nonautonomous function of the retinoblastoma tumour' suppressor protein: new interpretations of old phenotypes / D.A.Whyatt, F.Grosveld // EMBORep.- 2002.- Vol.3, №2.- P.130-135.

140. Whyatt, D. An intrinsic but cell-nonautonomous defect in GATA-1-overexpressing mouse eiythroid cell / D. Whyatt, F.Tindeboom, A.Karis et al // Nature.-2000.- Vol.406.- P.519-524.

141. Yang, W. SHP-1 phosphatase C-terminus interacts with novel substrates p32/p30 during erythropoietin and interleukin-3 mitogenic responses / W. Yang, M.Tabrizi, R.Beitada // BÎood.- 1998.- Vol.91, №10,- P.3746-3755.

142. Yasukawa, H. The JAK-binding protein JAB inhidits Janus tyrosine kinase activité through binding in the activation loop / H.Yasukawa, H.Misawa, .H.Sakamoto //EMBO. J.- 1999.- Vol.18, №5.- P.1309-1320.

143. Yi, T. Haematopoietic cell phosphate associates with erythropoietin (Epo) receptor after Epo- induced receptor tyrosine phosphorilation: Idtntification of proteinal binding sites / T.Yi, J.Zhang, O.Miura // Blood. 1995. - Vol. 85, N 1. -P.87-95.

144. Yokomizo, R. Erythropoietin and erythropoietin receptor expression in human endometrium throughout the menstrual cycle / R. Yokomizo, S. Matsuzaki, S. Uehara et al. // Mol.Hum.Reprod. 2002.-Vol.8, №5.- P.441-446.

145. Yokoyama, T. Migration of erythroblastic islands toward the sinusoid as erythroid maturation proceeds in rat bone marrow / T. Yokoyama, T. Etoh, H. Kitagawa et al. // J.Vet.Med.Sci. 2003. - Vol.65, N4. - P.449-452.

146. Yoshimura, A. A novel cytokineinducible gene CIS encodes an containing protein that binds to tyrosine- phosphorylated interleukin-3 and erythropoietin receptors / A.Yoshimura, T.Ohkudo, T.Kiguchi et al // EMBO J.-1995.- Vol.14, №12.- P.2816-2826.

147. Zakharov, Y. Influence des surnageants de culture de macrophages provenant des.ilôts erythroblastiques sur l'erythropoiese du rat / Y. Zakharov, M. Prenant // Nouv. Rev. Fr. Hematol. 1983. - Vol.25, №1. - P. 17-22.

148. Zakharov, Y.M. Technique d' isolement et de culture des. ilôts erythroblastiques. Separation du macrophage central / Y.M.Zakharov, M.Prenant //Nouv. rev. Franc. Hematol.- 1982.- Vol.24, №6.- P.363-367.