Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адгезивные свойства эритробластических островков костного мозга крыс при различных функциональных состояниях эритропоэза

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Адгезивные свойства эритробластических островков костного мозга крыс при различных функциональных состояниях эритропоэза"

На правах рукописи

□03054ТВ4

Щипицын Михаил Анатольевич

АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЯХ ЭРИТРОПОЭЗА

03.00.13 — физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курган-2007

003054764

Работа выполнена

на базе кафедры нормальной физиологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ректор - член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор ИМ. Долгушин)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Рассохин Александр Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Ерохин Александр Николаевич Соловьёв Сергей Владимирович

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита диссертации состоится » 2007 г. в _часов

на заседании Диссертационного совета Д.208.079.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика ГА.Илизарова Росздрава» (640014, г.Курган, ул. М.Ульяновой, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А.Илизарова Росздрава» (640014, г.Курган, ул. М.Ульяновой, 6).

Автореферат разослан <Л@ »уХМлДД/Уа 2007г.

■П

Ученый секретарь Диссертационного совета, Г^ ^ доктор медицинских наук, профессор \ \\ ^ / А.Н. Дьячков

сделать вывод о том, что на 1-ые сутки после острой кровопотери значительно снижаются адгезивные свойства ЭО, которые постепенно увеличиваются к 14-ым суткам.

Данное изменение адгезии, по-видимому, объясняется уменьшением вовлечённости рецепторного фактора в адгезию ЭО к субстрату. В свою очередь, на экспрессию молекул адгезии могли повлиять многие факторы: выделение провоспалительных цитокинов в динамике кровопотери, изменение концентрации катехоламинов, гормонов нейрогипофиза (вазопрессина), коркового вещества надпочечников (альдостерона), а также влияние эритропоэтина, уровень которого повышается уже через 24 часа после острой кровопотери.

2.2. Адгезивные свойства при угнетении эритроноэза посттрансфузионпой полицитемией

В ходе эксперимента были получены данные, на основе которых можно сделать вывод, что гипертрансфузия эритроцитов приводит к снижению адгезии ЭО к стеклу (рис.2). Так, нами было выявлено, что при измененных состояниях эритропоэза (угнетении и стимуляции) адгезия ЭО к стеклу уменьшается по сравнению с адгезией ЭО интактных животных, причем в большей степени на 1-ые сутки острой кровопотери (стимуляция эритропоэза) и в меньшей степени на 5-ые сутки посттранфузионной полицитемии (угнетение эритропоэза). Кроме того, выраженность изменения адгезии у островков различных классов зрелости была различной. Так, адгезия островков 1-го и 2-го классов зрелости к стеклу увеличивалась на 5-ые сутки постгрансфузионной полицитемии по сравнению с адгезией ЭО этих же классов зрелости интактных животных. В то время, как адгезия ЭОЗ, ЭО рек. и ЭО инв. уменьшалась по сравнению с адгезией ЭО данных классов зрелости интактных крыс-самцов. Описанные явления изменения адгезивных свойств при полицитемии могут, вероятно, быть объяснены следующим. По данным ряда исследователей (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002) на 5-ые сутки постгрансфузионной полицитемии происходит уменьшение количества ядросодержащих клеток в "короне" эритробластическош островка по сравнению с количеством ядросодержащих клеток в "короне" ЭО интактных животных (Круглов Д.К.,1998). Уменьшение числа клеток может быть связано с уменьшением адгезии ЭО к

субстрату в связи с тем, что уменьшается число клеток, задействованных в адгезии к субстрату.

ЗС00

ш X 2500

5

о т~ 2000 -

га

I 1500

О

га

о 1000 -

о

X 500 -

0 -

1-кратный * 10-кратный 50-кратный Кратность гидродинамического воздействия

Рис. 2. Среднее количество эритробластических островков на 1 см" адгезивных препаратов, полученных из костного мозга крыс интактных и на 5-ые сутки после иолицитемии (2% от массы тела) Примечание. На гистограммах обозначен 95-процентный доверительный интервал. р1-достоверность отличий в среднем количестве ЭО между кратностью смывов, а р2- между группами (контроль и полицитемия) при данном количестве смывов, р 1, р2<0,05.

Угнетённое состояние эритропоэза. кроме того, приводит к изменению функционального состояния клеток островков, что, в конечном счёте, ведёт к изменению концентрации молекул адгезии на плазмалемме и/или их авидности к структурам субстрата. При полицитемии происходит снижение числа ретикулоцитов в периферической крови, что связано с замедлением их выхода из костного мозга в кровоток. Следовательно, рецепторы, задействованные на связь макрофага с ретикулоцитами. участвовать в адгезии к субстрату уже не могут. Кроме того, в работе Д.К.Круглова (1998) было выявлено уменьшение содержания кислых и нейтральных глюкокоиъюгатов в островках на 5-ые сутки после гипертрансфузии эритроцитов. В связи со снижением синтеза ГАГов

при угнетении - эритропоэза, вызванного посттрансфузионной полицитемией (Тишевская Н.В., 1995), уменьшается число молекул адгезии, которые потенциально могут быть вовлечены в удержание ГАГов у поверхности клеток ЭО. Описанные в нашей работе изменения в адгезивных свойствах островков различных классов, кроме того, могут быть связаны с воздействием на макрофаг и окружающие его эритроидные клетки, с одной стороны, так называемых эритроцитарных кейлонов (ингибиторов эритропоэза), активнсть которых максимальна в первые двое суток после гипертрансфузии эритроцитов.

3) Исследование некоторых механизмов, вовлечённых в адгезию эритробластических островков

3.1. Исследование влияния некоторых компонентов среды инкубации на адгезию эритробластических островков к стеклу и полистиролу

Независимо от состава используемых в работе сред инкубации количество ЭО на 1 см кв. пластикового субстрата было выше по сравнению с количеством ЭО на 1 см кв. стеклянной поверхности (таб.2). Максимальное количество ЭО на 1 см кв. наблюдалось как на пластике, так и на стекле, если инкубация ЭО производилась в среде, содержащей 33 г/л альбумина человека. Если ЭО инкубировались в среде, содержащей 71 г/л альбумина человека, то количество адгезировавшихся ЭО к стеклу и пластику было ниже, чем при использовании сред других составов. Число адгезировавшихся ЭО к пластику не значительно превышало количество ЭО, адгезировавшихся к стеклу при использовании сред, не содержащих альбумина. Таким образом, число эритробластических островков всех классов зрелости преимущественно было выше на полистироловой поверхности, чем на стеклянной. Кроме того, минимапьное количество островков всех классов зрелости на 1 см2 стекла и пластика было при использовании среды инкубации, содержащей 71 г/л альбумина человека. Обращает на себя внимание то, что при использовании физиологического раствора число островков 1-го, 2-го и 3-го классов зрелости было выше на 1 см' , чем количество островков этих же классов зрелости при использовании растворов инкубации других составов При использовании раствора инкубации, содержащей 33 г/л альбумина человека, число островков реконструирующихся и инволюцирующих было выше, чем число

островков этих классов при использовании сред инкубации других составов.

Таб. 2. Среднее количество эригробластических островков на 1 см кв. стеклянной и полистироловой поверхности препаратов костного

Общее кол-во ЭО на 1 см кв. Субстрат

Состав среды инкубации ЭО Стекло (п=8) Полистирол (п=8)

Физиологический раствор 1977 ±22 а= 63 2061 ±36 а= 102

Среда Игла 2341 ±13 а= 38 2483 ±34р1 о= 96

33,4% АЧ 3888 ±82 а = 231 6112 ±59р1 о= 168

80% АЧ 590 ±28 о= 79 910 ±36р1 а= 101

Примечание: р1 -достоверность различий между количеством ЭО на стекле и пластике (по критерию Колмогорова-Смирнова); р2 -достоверность различий количества ЭО на препаратах, подвергшихся одно-, десяти-, пятидесятикратным смывам; р1, р2 <0,05.

Адгезия ЭО к пластиковому субстрату (полистиролу) оказалась выше, чем к стеклу. Кроме того, адгезия ЭО к пластику была более выражена, если использовались среды для инкубации ЭО, содержащие альбумин. Данные работ ряда исследователей позволяют объяснить данное наблюдение тем, что сывороточные белки, в том числе альбумин, хорошо адгезируются к пластиковой поверхности, обеспечивая контакт клеток не только с самим пластиком, но и с адсорбированными на нём молекулами альбумина. Адгезия ЭО к пластику облегчается в связи с тем, что при контакте клеток с пластиковым субстратом возникает перераспределение заряда на полистироловой поверхности вследствие возникновения физико-химического взаимодействия (гидрофобных и водородных связей) молекул подложки и мембраны клетки. Альбумин, находясь в среде инкубации клеток, изменяет функциональные свойства клеток, модулирует экспрессию молекул адгезии, а также, адсорбируясъ на субстрате, влияет на адгезию к нему различных клеток и искусственных микрочастиц, с помощью которых изучается адгезия.

Результаты работ Kobhnski J.E. (2005) указывают на то, что альбумин обладает • триггерным эффектом в процессе адгезии клеток к субстрату, даже при низких концентрациях в среде адгезивных молекул (фибронектина). Вместе с тем, относительно высокие концентрации альбумина уменьшают адгезивную способность клеток.

3.2. Динамика адгезии эритробластических островков как показатель их адгезивных свойств

Общее количество ЭО на 1 см кв. препаратов взвеси костного мозга крыс увеличивалось с увеличением времени инкубации взвеси ЭО. Причем с десятой по девяностую минуты инкубации выявлено почти 4-х кратное увеличение количества ЭО, а достоверное увеличение появлялось уже с 20-й минуты. Обращает на себя внимание то, что в основном нарастание количества ЭО происходило с 10-й по 45-ю минуты инкубации, а затем общее количество -ЭО выходило на плато.

Увеличение количества ЭО пролиферирующих классов (Э01, Э02, ЭО рек) происходило в меньшей степени с увеличением времени инкубации по сравнению с увеличением количества ЭО созревающих классов (ЭОЗ, ЭО инв). По-видимому, это связано с различной функциональной активностью этих 2-х групп ЭО. Вероятно, что для активно пролиферирующих островков 1-го и 2-го классов требуется меньше времени для осуществления адгезии и фиксации на субстрате.

Таким образом, различная динамика адгезии островков пролиферирующих и созревающих классов может быть обусловлена как изменением состава и концентрации адгезивных рецепторов па клетках ЭО на разных этапах эритропоэза, так и различным характером ответа ЭО различных классов зрелости на условия инкубации.

3.3. Исследование влияния верапамила на адгезивные свойства эритробластических островков

Число ЭО на 1 см2 достоверно уменьшалось с увеличением кратности гидродинамического воздействия на препараты в контроле и при наличии в среде инкубации верапамила в дозах 10"5 моль/л, 10~4 моль/л (таб.3). Кроме того, необходимо отметить, что анализ препаратов, приготовленных при использовании среды инкубации, содержащей 10"J моль/л веропамила, показал отсутствие ЭО на

препаратах. Анализ зависимости количества ЭО на 1 см2 препарата от концентрации верапамила при однократном смыве' выявил статистически значимые различия в количестве ЭО. При этом число ЭО уменьшилось по сравнению с контролем в 1,02 раза при использовании среды инкубации с концентрацией верапамила 10"5 моль/л и в 1.32 раза, если использовалась концентрация 10"4 моль/л . Таким образом, мы наблюдали снижение количества ЭО, оставшихся на стекле после воздействия однократного смыва, с увеличением концентрации верапамила в среде инкубации ЭО. Кроме того, выраженность уменьшения количества ЭО на 1 см2 препарата с увеличением кратности смывов был различен в контроле, когда в среде инкубации" отсутствовал верапамил, и на препаратах приготовленных, если в среде инкубации содержался верапамил.

Таб. 3. Общее количество эритробластических островков на 1 см кв. препарата при различной концентрации в среде инкубации верапамила (М±т, Б О)_____________

Общее кол-во ЭО Контроль (10) Концентрация верапамила

Кратность смывов 10"5 моль/л 10"4 моль/л Достоверность

1 -кратный 2944 ±114 <7= 361 2886 ±123 о= 389 2161 ±230 о= 727 р2<0,02

10-кратный 2580 ±230 о= 728 2438 ±177 о= 559 1806 ±142 а = 448 р2<0,01

50-кратный 2164 ±104 ст= 328 1972 ±94 с= 296 1351 ±78 о- 248 р2<0,0002

р1<0,007 р1 <0,0055 р1 <0,0017

Примечание: р1 -достоверность различий (тест Крускела-Уоллиса) в количестве ЭО на препаратах, подвергшихся различному гидродинамическому воздействию (одно-, десяти- и пятидесятикратным смывам); р2 -достоверность различий количества (тест Крускела-Уоллиса) ЭО на препаратах при воздействии различной концентрации верапамила; р 1 ,р2 <0,05

Анализ динамики уменьшения ЭО на препаратах при использовании верапамила показал, что число ЭО с увеличением

кратности смывов на 1 см препаратов уменьшается в значительной степени, если в среде инкубации содержался верапамил, причем степень уменьшения была выше, если использовалась более высокая концентрация верапамила в среде инкубации. Таким образом, мы наблюдали более выраженное уменьшение устойчивости ЭО к гидродинамическому воздействию по сравнению с контролем, если ЭО инкубировались в среде, содержащей верапамил. Кроме того, увеличение концентрации верапамила в среде инкубации приводило к дозозависимому эффекту — более выраженному понижению количества ЭО на 1 см" препаратов с увеличением кратности смывов. В настоящее время предполагают, что одним из основных механизмов входа Са2' в электрически невозбудимые клетки является так называемый депозависимый, или «емкостный», вход Са' + . В соответствии с моделью «емкостного» входа Са ' вход Са~ регулируется степенью заполнения Са-депо таким образом, что опустошение депо активирует вход Са2+. Исследование механизмов передачи сигналов в фоторецепторах Drosophila позволило предположить, что белок, кодируемый геном trp (transient receptor potential), может являться компонентом депозависимого Са2+-кднала, активируемого при опустошении Са-депо, вызванном световым стимулом. Методами молекулярного клонирования показано, что trp-канал имеет поразительное сходство по аминокислотной последовательности с потенциалзависимыми Са2ь-каналами L-типа. Именно блокаду каналов L-типа вызывают дифенилалкиламины, т.е. верапамил. Мы предположили, что как на перитонеальных макрофагах костного мозга, так и на центральных макрофагах эритробластических островков присутствуют Са2'-каналы, регулируемые высвобождением Са2+ из внутренних депо (store-release-activated channel, CRAC), подобные каналами L-типа и блокируемые верапамилом.

ВЫВОДЫ

1. Эритробластические островки различных классов зрелости отличаются по своим адгезивным свойствам. Эритробластические островки пролиферирующих классов зрелости (Э01, Э02, ЭО рек.) адгезируются к стеклу быстрее, чем островки созревающих классов зрелости.

2. Стимуляция эритропоэза острой кровоиотерей сопровождается снижением адгезии эритробластических островков всех классов зрелости к стеклу. При этом более выраженное снижение адгезии к стеклу демонстрируют эритробластические островки созревающих классов зрелости (ЭО инв., ЭОЗ) по сравнению с адгезией островков пролиферирующих классов зрелости (Э01, Э02, ЭО рек.). Адгезивная способность эритробластических островков всех классов зрелости к стеклу на 14-ые сутки после острой кровопотери достигает уровня адгезии островков интактных животных. При угнетении эритропоэза посттрансфузионной полицитемией имеет место повышение адгезии Э01, Э02 и снижение адгезии ЭОЗ, ЭО инв., ЭО рек. по сравнению с адгезией эритробластических островков данных классов зрелости у ишактных крыс.

3. Содержание в среде инкубации 33 г/л альбумина человека сопровождается максимальным количеством адгезированных эритробластических островков на 1 см2 препаратов, в то время как увеличение содержания в среде инкубации альбумина приводит к понижению адгезионной способности островков. Островки лучше адгезируются к поверхности полистирола культуральных чашек Петри, чем к поверхности стекла.

4. Добавление верапамила в среду инкубации эритробластических островков приводит к дозозависимому снижению адгезивной способности островков к субстрату, что позволяет предполагать Са2 -зависимый характер механизмов рецепторного адгезивного взаимодействия эритробластических островков с субстратом. Менее выраженное снижение адгезивных свойств под влиянием верапамила имеет место у островков 1-го, 2-го классов зрелости и реконструирующихся по сравнению с островками ЭОЗ и ЭО инв

5. Эритробластическне островки костного мозга самок крыс обладают более низкой адгезионной способностью к стеклу по сравнению с эритробласгическими островками костного мозга самцов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1) Методика гидродинамического воздействия на адгезионные препараты клеток может быть использована в лабораторной практике для оценки адгезионной способности эритробластических островков.

2) Использование пластиковых чашек Петри в лабораторной практике для выделения и культивирования эритробластических островков обладает преимуществом по сравнению с использованием в качестве субстрата для адгезии ЭО стекла.

3) Наличие в среде инкубации эритробластических островков относительно низких концентраций альбумина человека обладает проадгезивным эффектом (33г/л), что может быть учтено в лабораторной практике для получения адгезивных препаратов эритробластических островков.

4) Для оценки адгезивных свойств эритробластических островков предпочтительнее использовать эритробластическне островки, выделенные из костного мозга самцов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рассохин, А.Г. Изучение адгезивных свойств эритробластических островков костного мозга / А.Г.Рассохин, М.А. Щипицын // Новые технологии и фундаментальные исследования в медицине.-Материалы Ш Российской межрегиональной конференции, посвященной 60-летнему юбилею Челябинской государственной медицинской академии: сб. пауч тр.- -Челябинск, 2002.-С.56.

2. Щипицын, М.А. Изучение адгезивных свойств самцов и самок крыс / М.А. Щипицын // Материалы П-он итоговой научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 60-летию

образования Челябинской государственной медицинской академии: сб. науч. тр.- Челябинск, 2004,- С.98-99.

3. Щипицын, М.А. Оценка времени, необходимого для запуска механизмов адгезии эритробластических островков костного мозга крыс к субстрату / М А.Щипицын И Материалы Н-ой итоговой научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 60-летию образования Челябинской государственной медицинской академии: сб науч тр. - Челябинск, 2004 - С.99-101.

4. Щипицын, М.А.Обзор методических подходов к оценке адгезивных свойств клеток / М.А.Щипицын // Материалы 11-ой итоговой научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 60-летию образования Челябинской государственной медицинской академии: сб. науч. тр. -Челябинск, 2004. - С. 101-102.

5. Щипицын, М.А. Факторы, влияющие на силу адгезионного взаимодействия клеток и неспецифических субстратов (стекло, пластик) / М.А.Щипицын // Материалы Н-ой итоговой научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 60-летию образования Челябинской государственной медицинской академии: сб. науч. тр. - Челябинск, 2004. - С. 102-104.

6. Рассохин, А.Г. Адгезивные свойства эритробластических островков / А.Г.Рассохин, М.А.Щипицын // Известия Челябинского научного центра. - Вып 3 (24), 2004.-С.146-150.

7. Щипицын, М.А. Методический подход к оценке адгезивных свойств эритробластических островков / М.А.Щипицын, А.Г.Рассохин, М.Е.Квиринг // Новые лабораторные технологиии в диагностике и лечении заболеваний человека.-Материалы конференции, посвященной 25-летию ЦНИИ ЧелГМА: сб науч. тр.-Челябинск, 2005.-С.62-65

8. Щипицын, М.А. Возможности экспериментальной модели, основанной на воздействии гидродинамического давления на препараты костного мозга, в исследовании адгезивных свойств эритробластических островков / М.А.Щипицын, А.Г Рассохин, М.Е.Квиринг // Современные наукоёмкие технологии,- 2005.-№11.-С. 98-99.

9 Щипицын, М.А. Экспериментальный метод изучения адгезивных свойств эритробластических островков / М.А.Щипицын, А.Г.Рассохин, М.Е.Квиринг// Материалы VI Международной научно-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время накоплено большое количество информации как об этапах филогенеза эритропоэза, так и о становлении эритропоэза в онтогенезе человека и животных. Кроме того, широкий спекр исследований протекания эритропоэза в составе эритробластических островков (ЭО) был проведён различными учёными (Захаров Ю.М., Рассохин А.Г.,2002; Захаров Ю.М. и др, 1988; ВеэБ^з М., Вге^п-ОогшБ 1956; УоГГеу I, Уа!Те Р, 1980; Рассохин А.Г., 1997).

Большое количество работ посвящено выявлению молекул мембран эритроидных клеток и макрофагов, участвующих в формировании эритробластических островков и регуляции эритропоэза (Ьее Б.Н., 1991; БаёаЬ^а У., е1 а!., 1988; БаёаЫга У. й а1., 1995; КоэетЫаЦ М. с! а1., 1991). Однако в настоящее время нет доступной и простой в выполнении методики, позволяющей оценить изменения адгезивных свойств ЭО как целостных образований, остаются не изученными адгезивные свойства ЭО различных классов зрелости.

Многочисленные работы посвящены исследованию широкого диапазона показателей эритрона при стимулированном и подавленном эритропоэзе (Пушкарев В.П. с соавт.. 1991; Крестьянинова О.Г., 1994; Рассохин А.Г., 1997; Тишевская Н.В. с соавт., 1998), но до сих пор не было изучено изменение адгезивных свойств ЭО при ингибиции и стимуляции эритропоэза. Кроме того, в литературе не представлены данные об изменениях адгезивных свойств эритроидных клеток и резидентных макрофагов костного мозга при различных состояниях эритропоэза. Отсутствуют сведения также о характере ответа островков различных классов зрелости на факторы, приводящие к стимуляции эритропоэза и его ингибированию.

В настоящее время интенсивно изучается роль и механизмы адгезивных взаимодействий клеток друг с другом и с молекулами экстрацеллюлярного матрикса (Земсков В.И, Субботин С.М., 1990: Пальцев М.А , Иванов Л.А., 1995; Коо Ь.У е! аЦ 2002; КоЬНпвЫ 1Е. е! а1., 2005). Несмотря на широкое и всестороннее исследование в мире механизмов адгезии и факторов, влияющих на адгезивные свойства клеток, до сих пор не проводилось изучение влияния таких

ключевых факторов, как свойства поверхности субстрата, наличие в среде, из которой происходит адгезия Ca5' и альбумина на адгезивные свойства эритробластических островков. Кроме того, не изучались адгезивные свойства ЭО различных классов зрелости при воздействии вышеперечисленных факторов

В работах ряда исследователей (Коо L.Y. et al., 2002; Арефьева ТИ., 1998; Elliot M.J. el al.,1991; Spagnuolo P.J. et al., 1988; Galbraith C.G., M.P. Sheetz, 1997; Fleit, S. A. et al.,1984; Francis, G.W. el al., 1987) были предложены методы изучения адгезивных свойств клеток и приспособления для оценки силы адгезионного взаимодействия клеток с субстратом. Однако эти методики либо не обладают достаточной точностью, либо сложны в использовании, либо для деадгезирования клеток от субстрата прикладываются воздействия, не являющиеся естественными для клеток, либо основаны на применении оригинальных и дорогостоящих приборов. Поэтому представляется актуальным внедрение в практику метода, обладающего оптимальным соотношением между простотой его применения и точностью производимой им оценки адгезивных свойств клеток и эритробластических островков. Кроме того, воздействия, прикладываемые к клеткам, должны в данной методике быть приближены к тем воздействиям, которые испытывают клетки в организме.

Таким образом, отсутствие методики, позволяющей оценить адгезивные свойства ЭО, а также отсутствие информации об адгезивных свойствах эритробластических островков различных классов зрелости, об изменении способности их адгезироваться к субстрату при различных состояниях эритропоэза, о факторах, влияющих на адгезивные свойства ЭО составляют актуальность настоящего исследования.

Цель исследования

Изучение адгезивных свойств эритробластических островков при нормальном, стимулированном и угнетённом эритропоэзе.

Задачи исследования :

1) оценить адгезию к стеклу эритробластических островков различных классов зрелости интактных самцов и самок крыс;

2) оценить изменения адгезивных свойств эритробластических островков различных классов зрелости при стимуляции и угнетении эритропоэза;

3) оценить временные параметры проявления адгезивных свойств эритробластических островков различных классов зрелости и их устойчивость к гидродинамическому воздействию;

4) оценить влияние свойств субстрата и некоторых компонентов сред инкубации на адгезивные свойства эритробластических островков;

5) выявить влияние блокатора Са2+" каналов Ь-типа (верапамила) на адгезивные свойства ЭО различных классов зрелости.

Научная новизна работы

В данной работе впервые предложена методика оценки адгезивных свойств ЭО различных классов зрелости, основанная на влиянии гидродинамического давления на ЭО костного мозга. Результаты проведенного исследования позволили впервые оценить адгезивные свойства ЭО различных классов зрелости у интактных животных, а также выявить наличие более низкой адгезионной способности ЭО самок по сравнению с ЭО самцов. Кроме того, впервые быгш оценены временные параметры проявления адгезивных свойств эригробластических островков различных классов зрелости. Так, в работе было показано, что эритробластические острэвки пролиферирующих классов зрелости адгезируются к стеклу быстрее, чем островки созревающих классов зрелости.

Впервые было показано, что как при угнетении эритропоэза, так и при его стимуляции происходит понижение адгезионной способности ЭО. Кроме того, результаты исследования свидетельствуют о более выраженном снижении адгезионной способности островков созревающих классов зрелости по сравнению с островками пролиферирующих классов.

Научную новизну работы также определяют результаты, свидетельствующие о влиянии различной концентрации альбумина в

среде инкубации ЭО на их адгезивные свойства. Так, содержание в среде инкубации ЗЗг/л альбумина человека сопровождается максимальным количеством адгезированных ЭО иа 1 см2 препаратов, в то время как повышение концентрации альбумина приводит к понижению адгезионной способности островков. Кроме того, в работе было выявлено, что островки лучше адгезируются к поверхности полистирола культуральных чашек Петри, чем к поверхности стекла.

Впервые была оценена адгезия ЭО к стеклу в присутствии в среде инкубации ЭО различных доз блокаторов Са2+ -каналов L-типа (верапамила), а также впервые выявлено влияние различных доз верапамила на адгезию островков различных классов зрелости к стеклу. В работе было выявлено, что верапамил снижает адгезионную способность островков.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработанная методика, основывающаяся на гидродинамическом воздействии жидкости на клетки и ЭО, адгезированные к поверхности препарата, позволит оценивать в экспериментальной практике адгезивные свойства клеток. Данная методика может быть использована для оценки адгезивных свойств различных клеток не только в экспериментальной, но и в клинической практике.

Результаты исследования адгезивных свойств ЭО различных классов зрелости вносят вклад в понимание функциональной гетерогенности островков, находящихся tía различных стадиях созревания, которые определяются функциональными особенностями как центрального макрофага эритробластических островков, так и окружающими его эритроидными клетками.

Выявленные особенности адгезивных свойств ЭО различных классов зрелости расширяют наши представления о протекании эритропоэза в составе ЭО. Кроме того, выявленные изменения в адгезивных свойствах ЭО при различных состояниях эритропоэза вносят вклад в понимание адаптационных механизмов, которые запускаются в ответ на стимуляцию или подавление эритропоэза.

Выявленное влияние верапамила на адгезивные свойства ЭО расширяет представление о механизмах действия этого препарата и свидетельствует, таким образом, о возможном влиянии его на

эритропоэз, протекающий в островках. Исследования, связанные с влиянием различного состава сред инкубации и субстрата на адгезивные свойства ЭО, вносят вклад в понимание тех оптимальных условий, ко торые необходимо создавать для культивирования клеток in vitro в эксперименте.

Таким образом, данные о выявленных особенностях адгезивных свойств различных классов зрелости интактных животных, самцов и самок крыс, а также выявленных изменениях адгезивных свойств ЭО при различных воздействиях in vitro и различных состояниях эритропоэза определяют направление дальнейшего исследования.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Эритробласгические островки пролнферирующих классов зрелости обладают более высокой адгезионной способностью к субстрату по сравнению с эритробластическими островками созревающих классов зрелости в условиях угнетённого и стимулированного эритропоэза.

2) Адгезия эритробластических островков является On2' -зависимым процессом, на который влияют свойства субстрата, к которому адгезируются островки, и наличие в среде инкубации альбумина.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования используются на практических занятиях и лекционном курсе на кафедрах нормальной физиологии ЧелГМА, Разработанный метод определения адгезивных свойств ЭО и клеток, основанный на влиянии гидродинамического давления жидкости на адгезивные препараты, используется в экспериментальной практике работы ОГУЗ ЦОСМП «Челябинский государственный институт лазерной хирургии/).

Апробация работы и публикации

Основные материалы диссертационной работы представлены на Второй итоговой научно-практической конференции молодых ученых, посвященной шестидесятилетию образования Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2004);

s

Юбилейной научной общероссийской конференции, посвященной десятилетию Российской академии естествознания, с международным участием (Москва, 2005); Шестой Международной на>чно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» в Российском университете Дружбы народов (Москва, 2005); заочной электронной конференции РАЕ (v.ww rae.ru) «Фундаментальные исследования», 15-20 февраля 2006г.; Четвёртой итоговой конференции молодых учёных (Челябинск, 2006).

По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них одна работа опубликована в издании, входящем в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.

Объём и структура работы

Работа изложена на 193 страницах текста, включает 30 таблиц, 9 иллюстраций, состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы, практических рекомендаций. Список литературы включает 366 источников (отечественных-82, иностранных-284).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использовано 110 беспородных крыс обоего пола

Для изучения влияния ингибирования эритропоэза у животных на адгезивную функцию ЭО однократно внутрибрюшинно вводили 80% взвесь гомологичных эритроцитов крысам-реципиентам в количестве 7,0 мл на 100 г массы тела. Периферическую кровь и костный мозг крыс-реципиентов исследовали на 5 сутки посттрансфузионной полицитемии. В качестве классической модели стимуляции эритропоэза была использована кровопотеря Кровь у животных забирали из хвостовых вен в количестве 2% от массы тела крыс. Исследования периферической крови и костного мозга проводили на 1, 3, 7, 10 и 14 сутки после кровопотери. Для вычисления в экспериментах показателей периферической крови использовали рутинные методы определения. Препараты эритробластических островков костного мозга крыс готовили по методике Захарова Ю.М и соавт., 1984, являющейся модификацией метода La Charpentier Y и

Prenant M, 1975. Подсчитывали абсолютное количество ЭО на одну бедренную кость крысы. Классы зрелости ЭО оценивали в адгезированных препаратах островков, окрашенных по Романовскому-Гимза и в соответствии с классификацией Захарова Ю.М. и соавт. (Захаров Ю.М., Рассохин А Г., 2002). Для сравнения силы адгезивного взаимодействия ЭО различных классов зрелости с субстратом нами была предложена оригинальная методика гидродинамического воздействия на препараты костного мозга. После инкубации в термостате стекла вынимали и производили смывы с областей адгезии поршневым автоматическим медицинским дозатором А-2 по 1 мл На область адгезии первой группы стекол производили 1-кратный смыв, второй группы стекол - 10-кратный, третьей группы стекол - 50-кратный. Средняя кинетическая энергия струи жидкости, подаваемой из сопла дозатора, оставалась постоянной.

Для изучения динамики адгезии эритробластические островки костного мозга выделяли по вышеуказанной методике. Разведённую взвесь помещали на квадратные предметные стёкла. Разные группы стёкол инкубировали в термостате в течение 10 мин, 20 мин., 30 мин, 45 мин., 60 мин., 90 мин. в атмосфере термостата. Затем готовили препараты.

Для исследования влияния некоторых компонентов (альбумина, Са2+) сред инкубации эритробластических островков и субстрата на адгезию ЭО. полученную из бедренных костей взвесь эритробластических островков (2 мл), разводили в средах различного состава: физиологическом растворе; среде Игла; среде Игла, содержащей альбумин человека в концентрации 33 г/л; среде Игла, содержащей альбумин человека в концентрации 71 г/л. Затем разведённую взвесь ЭО помещали на 40 мм полистироловые чашки Петри и предметные стёкла. После инкубации в термостате 45 мин. с областей адгезии препаратов производили однократный смыв. Препараты центрифугировали, высушивали, фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Механизмы адгезии клеток являются С а2' -зависимыми, поэтому мы предположили, что блокатор Са2+ каналов (L-типа), воздействуя на клетки костного мозга, вызовет изменения адгезивных свойств ЭО и эритроидных клеток. Для выявления дозозависимого эффекта б локатора Са2+-каналов мы добавляли в разведённую раствором

инкубации взвесь ЭО верапамил в различных дозах. Затем разведённую взвесь ЭО инкубировали в термостате 45 мин. и готовили препараты.

Во всех фрагментах работы осуществляли световую микроскопию препаратов (ув.х1500) для определения формулы распределения ЭО по классам зрелости, а также подсчитывали количество ЭО различных классов зрелости на 1 см кв. препарата.

При анализе данных использовали пакеты прикладных программ Statistica (StatSoft, USA), редактора электронных таблиц MS Excel 2000. Для проверки гипотезы о виде распределения пользовались критерием нормальности Колмогорова-Смирнова, и в зависимости от результатов проверки на соответствие выборочных данных гипотетическому нормальному распределению применялись параметрические и непараметрические методы статистического анализа.

Результаты и их обсуждение

1) Исследование адгезивных свойств эритробластических островков самцов и самок крыс с помощью методики гидродинамического воздействия на препараты костного мозга

При подсчете абсолютного количества ЭО на препаратах костного мозга самцов и самок было выявлено отличие в среднем количестве ЭО на 1 см2 препаратов, подвегшихся однократному гидродинамическому воздействию. Число островков самцов крыс (таб.1) было в 1,61 (р < 0,05) выше, чем среднее количество ЭО на 1 см" препаратов костного мозга крыс самок. Кроме того, с увеличением кратности смывов число ЭО достоверно снижалось, причем в большей степени на препаратах, полученных из костного мозга самок, чем самцов. В нашей работе сила адгезивного взаимодействия ЭО с субстратом косвенно оценивалась по отношению количества ЭО на препаратах, подвергнутых однократному гидродинамическому воздействию, к количеству ЭО, оставшихся на стекле после 50-кратного гидродинамического воздействия. При этом, мы предположили, что чем меньше было данное отношение, тем больше была сила адгезионного взаимодействия с субстратом.

Таб. 1. Динамика количества ЭО на адгезивных препаратах костного мозга при воздействии на них гидродинамического давления (М±т,8Р)__

Кратность смывов Самцы Самки

(п=10) (п=11)

1- 1283 798 ±29р1'р2

кратный о = 888 о= 425

10- 1212 ±48 699 ±26

кратный а= 888 о= 432

50- 1007 ±43р1'р" 606 ±23Р1.Р2

кратный с= 805 о= 378

Примечание. р1- достоверность различий между количеством ЭО на адгезивных препаратах самцов и самок крыс (по Колмогорову -Смирнову); р2- достоверность различий между количеством ЭО на адгезивных препаратах, подвергшихся различному

гидродинамическому давлению: одно- и пятидесятнкратным смывам.

В данном фрагменте нашей работы было показано, что с увеличением кратности смывов убывание количества островков различных классов зрелости на препаратах, полученных из костного мозга самок, было более выраженным, чем уменьшение количества ЭО самцов. Данный факт можно объяснить влиянием стероидных гормонов (эстрадиола) на экспрессию адгезивных молекул на клетках, а также на изменение авидности рецепторов к лиганду под влиянием этих гормонов

2) Адгезивные свойства эритробласгических островков при различных состояниях эритропоэза

2.1. Адгезивные свойства эритробластических островков в динамике постгсморрагической анемии

Сравнительная оценка общего количества ЭО на 1 см" препаратов, полученных из костного мозга крыс в динамике постгеморрагической анемии, выявила более выраженные отличия в количестве ЭО на 1 см2 препаратов, подвергшихся одно - и пятидесятикратным смывам, на первые сутки кровопотери по сравнению с контролем. Кроме того, обращает на себя внимание тот факт, что с увеличением кратности смывов уменьшение среднего числа ЭО на 1 см" препаратов, приготовленных из костного мозга крыс, выведенных из эксперимента на 1-е, 3-й, 7-е, 10-е и 14-ые сутки после острой

кровопотери, носило более выраженный характер, чем уменьшение среднего количества ЭО на 1 см2 препаратов костного мозга интактных животных (рис. 1).

8000

1 смыв

10 смывов

50 смывов

Рис. 1. Динамика количества ЭО на 1 см адгезивных препаратов костного мозга крыс после острой кровопотери (2% от массы тела) На гистограмме отмечены 95-процентные доверительные интервалы для среднего количества ЭО.

Следует отметить, что выраженность уменьшения с увеличением кратности гидродинамического воздействия числа ЭО на 1 см2 препаратов костного мозга крыс с постгеморрагической анемией приближается к таковому у интактных животных на четырнадцатые сутки после острой кровопотери (рис.1). Сравнение отношения среднего количества ЭО 1 на см препаратов, с которых был сделан однократный смыв, к среднему количеству ЭО 1 на см2 препаратов, с которых было произведено 50-кратное гидродинамическое воздействие, позволяет судить о выраженности убывания ЭО с препаратов, а следовательно, об устойчивости адгезированных ЭО к открепляющему воздействию смывов. По данному отношению косвенно можно сделать вывод о силе адгезивного взаимодействия клеток ЭО с субстратом. Так, на первые сутки это отношение было максимальным-2,66, на 3-й, 7-ые. и 10-ые сутки оно оставалось выше, чем у интактных животных (1,27). К 14-ым суткам оно приближалась к таковому у ЭО интактных животных. Следовательно, можно

практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" : сб. науч. тр.-Москва, 2005.- С. 553-554.

10. Щипицын, М.А. Роль адгезивных взаимодействий в эритропоэзе и экспериментальные методы их изучения / М.А.Щипицын, А.Г.Рассохин, М.Е.Квиринг // Материалы VI Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" : сб. науч. тр.-Москва, 2005.-С. 554-555.

11. Щипицын, М.А. Влияние разных доз верапамила на адгезивные свойства эритробластических островков in vitro / М.А.Щипицын,

И. А.Кулешова, Е.В.Андрощук, С.М.Черепенин // Фундаментальные исследования.- 2006.-№3. -С.73.

12. Щипицын, М.А. Адгезивные свойства эритробластических островков в динамике постгеморрагической анемии / М.А.Щипицын, М.С.Егорышева // Фундаментальные исследования.-2006.-№3.-С.46-47.

13. Щипицын, М.А. Исследование влияния состава сред инкубации и субстрата на адгезию эритробластических островков / М.А.Щипицын, Е.А.Дмитриева, О.В.Воропаева // Современные наукоёмкие технологии.- 2006,- №3,- С. 44-45.

14. Щипицын, М.А. Адгезивные свойства эритробластических островков при различных состояниях эритропоэза / М.А.Щипицын // Современные проблемы науки и образования.- 2006.-№3.-С. 49-51.

15. Щипицын, М.А. Изменение адгезивных свойств эритробластических островков под влиянием верапамила / М.А.Щипицын // Вестник уральской медицинской академической науки.-2006.-№> 3-2(15).-С.47-48.

Отпечатано группа компаний «ДАММИ», 640000, г. Курган, ул Пр. Машиностроителей, 13 А, тел. (3522) 53-38-39, принято в печать 23.01 07, заказ № 00255 тираж 100 экз.