Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ca2+-связывающие свойства пальмитиновой и стеариновой кислот и роль комплекса этих кислот с Ca2+ в регуляции проницаемости митохондриальной мембраны

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ca2+-связывающие свойства пальмитиновой и стеариновой кислот и роль комплекса этих кислот с Ca2+ в регуляции проницаемости митохондриальной мембраны"

На правах рукописи

ЛИМАРЕНКО Елена Анатольевна

Са2+- СВЯЗЫВАЮЩИЕ СВОЙСТВА ПАЛЬМИТИНОВОЙ И СТЕАРИНОВОЙ КИСЛОТ И РОЛЬ КОМПЛЕКСА ЭТИХ КИСЛОТ С Са2+ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОНИЦАЕМОСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ.

03.00.02. - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2003

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Г. Д. Миронова кандидат биологических наук A.B. Лазарева

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Д.М. Харакоз

доктор биологических наук Е.Г. Новосёлова

Ведущая организация:

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ, г. Москва

Защита состоится " г. /3 ——

на заседании диссертационного/совета Д002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290 г. Пущино, Московской обл., ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН. Автореферат разослан " кЗ " УСОсЛЪ _2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук Н.Ф. Ланина

i я характеристика работы.

Актуальность проблемы. Биологические мембраны играют ключевую роль в процессах регуляции и, в частности, в регуляции ионного гомеостаза клеток. Поддержание ионного гомеостаза является необходимым условием выживания клеток. В связи с этим, изучение механизма регуляции целостности одного из типов мембран клеток, а именно митохондриалыюй, является актуальной задачей.

Известно, что ионы Са2+ являются наиболее активными регуляторами биологических процессов в организме. Они выступают в качестве сопрягающего фактора между возбуждением и сокращением в мышцах, участвуют в тромбообразовании, выбросе нейротрансмиттеров, образовании микротрубочек, в гормональных ответах, делении клеток, адгезии, росте и апоптозе клеток. Уровень кальция в цитоплазме контролируется работой Са^-транспортирухощих систем, локализованных в плазматической мембране и в мембранах клеточных органелл. Митохондрии являются органеллами способными аккумулировать избыточный кальций цитоплазмы, что в свою очередь, активирует Са2+-чувствительные ферменты их матрикса.

В последнее время большое внимание стали уделять изучению Са2+-зависимой митохондриалыюй поры, так как она активируется при ряде патологий: ишемия, болезнь Рефсума (Schonfeld, Struy, 1999), ожирение (Shimabukuro et al., 1998; Perez et al., 1997; Zhou et al., 2000), диабет (Shimabukuro et ai., 1998; Gremlich et al., 1997) и тиреотоксикозе (Sliepchevich et al., 1973; Turakulov et al., 1973). Эта пора чувствительна к циклоспорину A (Kimberly et al., 1989; Zoratti, Szabo, 1995) и ее появление в мембране связывают с Са^-зависимым изменением конформации различных мигохондриальных белков (На les trap et al., 2002).

В настоящее время, уже в процессе выполнения работы, появились данные о существовании в митохондриях другой Са~+-активируемой поры, так называемой, циклоспорин-нечувствительной митохондриальной поры (Sultan and Sokolove, 2001). Предполагается, что ее образование не связано с формированием белковой поры. Механизм образования циклоспорин-нечувствительной поры до сих пор не ясен, поэтому выяснение природы, обнаруженного в нашей лаборатории низкомолекулярного гидрофобного компонента, небелковой природы (Mironova et al., 1997), который связывает Са2+ с высоким сродством, увеличивая при этом проницаемость бислойной липидной мембраны, может пролить свет в понимании молекулярного механизма образования этой Са2+-зависимой поры.

Целью настоящей работы являлась очистка, обнаруженного ранее гидрофобного низкомолекулярного Са2+-связывающего и ион-транс п о рти ру ю щ его компонента, выяснение его химической природы и локализации в мембране, изучение параметров его Са"'-связывающих

на международных конференциях «Frontiers of mitochondrial research» (Rensselaerville (USA), 1998, Albany (USA), 2000), на VIII Международной конференции «Математика, компьютер, образование» (Пущино, 2001), на всероссийском рабочем совещании «Митохондрии в патологии» (Пущино, 2001), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на XIV International Biophysics Congress (Argentina, 2002), на 7-ой Пущинской конференции молодых ученных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, включая 7 таблиц и 20 рисунков.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пятнадцать печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В исследованиях использовались митохондрии печени крыс, выделенные стандартным методом дифференциального центрифугирования. Митопласты получали путем обработки митохондрий гипотоническим раствором 0.01 М Трис-HCl, рН 7.4, с последующим центрифугированием. Концентрацию белка суспензии митохондрий и митопластов определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Внутренние мембраны митохондрий и межмембранные контактные участки получали по методу (Ardail et al., 1990), с использованием цитохром с оксидазы (ЕС 1.9.3.1.) в качестве маркера на внутренние мембраны митохондрий и моноаминоксидазы (ЕС 1.4.3.4.) - на внешние мембраны митохондрий (Wharton and Tzagoloff, 1967; Caman et al., 1965).

Экстракцию липидов из мембраны митопластов проводили на холоду 66%-ным этиловым спиртом (-20°С) из расчета 10 мл охлажденного этанола на 1 мл фракции митопластов содержащих 44 мг белка в 1 мл при 4°С и постоянном перемешивании в течение 30 мин. Экстракт центрифугировали в течение 20 мин при 5500 g. Супернатант концентрировали под вакуумом на роторном испарителе при температуре не выше 30°С до 1/10 исходного объема спиртового экстракта.

Для разделения гидрофобных и гидрофильных компонентов в спиртовом экстракте использовали модифицированный нами метод Фолча (Mironova et al., 1997).

Первоначальная очистка изучаемого компонента, находящегося в гидрофобном экстракте, проводилась на колонке с кремниевой кислотой. Исходный гидрофобный экстракт, полученный из 200 мг митопластов и растворенный в 1 мл хлороформа, наносили на колонку (2 г кремниевой кислоты), предварительно промыв ее 20 мл хлороформа. Элюированиё проводили при постепенном повышении гидрофильности растворов: хлороформ - 20 мл, хлороформ - метанол (9:1) - 20 мл, хлороформ - метанол (4:1) - 10 мл, хлороформ -метанол (2:1) - 10 мл, хлороформ -метанол (1:1)- 10 мл, хлороформ -метанол -вода (30:60:20)-10 мл.

Тонкослойная хроматография частично очищенного препарата проводилась на стеклянных пластинках с использованием силикагеля G60 в качестве носителя. Восходящую хроматографию проводили в герметичной камере в системе растворителей хлороформ - метанол -вода (65:25:4). После проведения хроматографии пластинку или ее часть окрашивали ацетатом меди. Затем пластинку прогревали 7-10 мин в термостате при температуре 140°С. При этом проявлялись такие компоненты как холестерин, в виде фиолетового пятна, жирные кислоты и фосфолипиды - коричневые пятна. Для проявления гидрофобного Са2+-связывающего компонента пластинку после обработки ацетатом меди опрыскивали бидистиллированной водой и слегка подсушивали, Са2+-связывающий компонент проявлялся в виде белого несмачиваемого пятна. В некоторых экспериментах гидрофобный компонент идентифицировали раствором родамина Б по люминесценции хроматограммы в ультрафиолете, либо парами йода. При проведении препаративной хроматографии экстрагирование вещества с носителя проводили смесью хлороформ - метанол - вода (90:10:0.5).

Са2+-связывающие свойства гидрофобного компонента и различных липидов изучались с использованием радиоактивного изотопа кальция (45Са) (Amersham Radiochemical Co., U.K.) по разработанному в лаборатории совместно с Лионским Университетом методу и мембраны дифторполивинилидена (PVDP) (Immobilon-P, Millipore) в качестве носителя. Радиоактивность связавшейся метки подсчитывали на сцинцилляционном счетчике LS-6500 (Beckman). Анализ и расчет параметров связывания (Кд и Вмакс) кальция с изучаемым веществом проводился с использованием программы SlideWrite 2.0 по методу описанному в "The GraphPad Guide to Analyzing Radioligand Binding Data" (Motulsky H, 1995).

Разделение митохондриальных липидов на классы проводили на аминопропилсиликагелевой колонке (Pietsch and Lorenz, 1993).

Ион-транспортирующая активность изучалась путем измерения электрических характеристик бислойной липидной мембраны, модифицированной исследуемым соединением. Бислойные липидные

мембраны формировали методом Мюллера (Mueller et al., 1964). Регистрация тока на выходе усилителя осуществлялась с помощью компьютера IBM PC/AT 486, соединенного с экспериментальной установкой через аналого-цифровой преобразователь. Опыты проводили при температуре 20°С - 22°С. Экспериментальная кювета содержала по 3 мл 20 мМ трис-HCl буфера, рН 7.4, в обоих отсеках кюветы. Пересчет регистрируемого тока в проводимость осуществлялся по оригинальной программе, разработанной в лаборатории.

Определение химической природы выделенного из митохондрий гидрофобного компонента проводили методами УФ-, ИК-, 'Н-ЯМР-спектроскопии и методом газожидкостной хроматографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Ранее в нашей лаборатории было обнаружено два гидрофобных Са2+~ связывающих компонента, выделенных из внутренней митохондриальной мембраны, один из которых шел с фронтом ионов на электрофорезе в 14% полиакриламидном геле, а другой несколько отступая от фронта ионов. Фракция, содержащая эти компоненты, обладала способностью при реконструкции в бислойную липидную мембрану транспортировать ионы в присутствии Са2+. Было предположено, что более высокомолекулярный компонент является субъединицей с Н+-АТФазы митохондрий, поскольку содержащая его фракция, также как и субъединица с способна формировать в искусственной мембране регулярно осциллирующих во времени каналов проводимости (Mironova, 2003).

1. Очистка митохондриалыюго низкомолекулярного гидрофобного

Са2+ -связывающего компонента.

Очистку Са2+-связывающего компонента обнаруженного в гидрофобной фракции митопластов проводили в несколько этапов. Для разделения неполярных компонентов от фосфолипидов гидрофобную фазу наносили на колонку с кремниевой кислотой (Biorad). Элюция проводилась хлороформом со скоростью 60 мл/час с постепенным повышением гидрофильности элюирущего раствора путём увеличения в нём доли метанола, а затем воды. Полученные фракции анализировали на аналитической тонкослойной хроматографии в присутствии метчиков. Параллельно полученные фракции тестировали на способность связывать Са2+. Оказалось, что способностью связывать Са2+ обладает фракция, содержащая холестерин, жирные кислоты и один неидентифицированный компонент. Эта фракция и являлась предметом настоящего исследования.

Для дальнейшей очистки фракцию, повторно наносили на колонку с кремниевой кислотой и элюировали хлороформом со скоростью 20 мл/час, в результате были собраны три фракции, чистота, которых

анализировалась с помощью аналитической тонкослойной

_ 2+

хроматографии и которые, также тестировали на проявление Са -связывающих и ион-транспортирующих свойств. Было обнаружено, что Са2+-связывающей и каналообразующей способностью обладали две фракции: № 3 и № 4 (рис. 1). Следует отметить, что в этих фракциях содержался компонент, который не окрашивался ни анисовым альдегидом, ни ацетатом меди. Этот компонент локализовался ниже полосы жирных кислот и проявлялся в виде белого несмачиваемого пятна при опрыскивании бидистиллированной водой, а также давал флуоресценцию в ультрафиолете с родамином Б и окрашивался парами йода.

Для отделения этого компонента от жирных кислот использовали аналогичную колонку с кремниевой кислотой, однако элюцию проводили при пониженной температуре (4°С). Способностью связывать Са2+ обладала только одна фракция № 7 (рис. 1), которая содержала Са2+-связывающий гидрофобный компонент и ненасыщенные жирные кислоты. Этот компонент давал флуоресценцию в ультрафиолете с родамином Б (рис. 1, фр. 7) и окрашивался парами йода (рис. 1, фр. 8).

1 - фракция № 1, снятая с первой колонки;

. 2 - 4 - фракции № 1-3 полученные после

9 ** повторной колонки; 5 - 7 - фракции № 1-3,

т #н ~ «» —: ш полученные после трехкратной очистки

гидрофобного компонента на колонке с кремниевой кислотой; 1-7 проявленные ацетатом меди; 7 -после - ■ • • проявления ацетатом меди дополнительно 1 г з < 5 с 7 в проявленная родамином Б; 8 -проявленные

парами йода.

Рис. 1. Аналитическая тонкослойная хроматограмма фракций, полученных после колонок с кремниевой кислотой.

Последний этап очистки низкомолекулярного гидрофобного Са2+-связывающего компонента до хроматографически гомогенного состояния включал использование метода препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле, что позволило очистить его от примеси ненасыщенных жирных кислот (рис. 2). Аналитическая тонкослойная хроматография, показала, что изучаемый компонент не окрашивается ацетатом меди, который окрашивает липиды, включая, ненасыщенные жирные кислоты и не способен окрашивать насыщенные жирные кислоты. Однако, Са2+-связывающий компонент окрашивался бромкрезоловым зеленым и парами йода, реагентами на кислоты и как кислота окрашивался в желтый цвет.

1 и 2 - маркеры (холестерин и жирные кислоты соответственно); 3 - Са2+-связывающая фракция, полученная после трехкратной очистки гидрофобного компонента на колонке с кремниевой кислотой; 4 - фракция ненасыщенных свободных жирных кислот; 5 - Са2+-связывающий компонент. Фракции окрашены ацетатом меди и в дальнейшем смоченная водой. Пунктиром указаны несмачиваемые пятна.

Рис. 2. Аналитическая тонкослойная хроматограмма фракций, полученных с помощью препаративной тонкослойной хроматографии.

2. Со2*-связывающие параметры изучаемого компонента.

Изучение зависимости параметров связывания кальция хроматографически чистым компонентом от рН среды инкубации представляет интерес не только с точки зрения подбора оптимальных условий, для изучения этих параметров, но и для выяснения условий при которых в митохондриях возможно образование комплекса этого вещества с кальцием. В результате проведенных исследований были определены: константа диссоциации (Кд) и число мест связывания.

Измерения проводились при двух различных концентрациях ионов кальция в среде (5 мкМ и 30 мкМ) в диапазоне рН от 6.0 до 9.5. Было установлено, что изучаемый компонент способен связывать кальций только при нейтральных и слабощелочных рН, а при рН 6.2 это свойство практически отсутствует.

Полученные данные подтверждаются непосредственным измерением констант диссоциации при двух различных значениях рН. Обнаружено, что при рН 7.4 константа диссоциации компонента равна 90 мкМ, а при рН 8.5, Кд составила 8 мкМ. На основании данного наблюдения был сделан вывод, что при слабощелочных рН связывание кальция гидрофобным компонентом существенно выше, чем при нейтральных, а при слабокислых оно вообще отсутствует.

Известно, что при защелачивании митохондриального матрикса увеличивается вероятность открытия Са2+-зависимой поры, тогда как при кислых рН открытие поры ингибируется (На1ез1:гар, 1994). Таким образом, полученные данные дают основание предположить, что изучаемый низкомолекулярный гидрофобный Са2+-связывающий компонент может принимать участие в формировании митохондриальной поры.

3. Локализация гидрофобного Са2*-связывающего компонента в

митохондриях.

Для определения локализации гидрофобного Са2+-связывающего компонента, из митохондрий, по разработанному ранее методу, были выделены две мембранные фракции: фракция, которая обогащена контактными участками и проявляет моноаминаксидазную активность, и фракция проявляющая цитохром с оксидазную активность и, следовательно, содержащая внутреннюю мембрану. Исследования показали, что Са2+-связывающий компонент локализован, преимущественно, в контактных участках (табл. 1).

Таблица 1. Локализация гидрофобного Са -связывающего компонента в митохондриальной мембране.

Контактные сайты в митохондриях Внутренняя мембрана митохондрий

Активность моноаминооксидазы 81.5 18.5

Активность цитохром с оксидазы 21.6 78.4

Содержание холестерина (мкг/мг белка) 6.54 2.85

Связывание Са2+ с гидрофобным компонентом (от общего связывания в %) 86 14

в % от суммарной активности

4. Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са2+-связывшощего компонента.

Установлено, что реконструированный в бислойную липидную мембрану компонент в присутствии 0.5 - 5 мМ Са2+ формирует каналы проводимости (рис. 3).

В отсутствии кальция проводимость мембраны не отличалась от контроля. Проводимость так же не наблюдалась при добавлении в среду ионов К+ в отсутствии ионов кальция. С другой стороны, внесение в среду, содержащую кальций, К+ вызывало увеличение проводимости мембраны в несколько раз (рис. 4).

20 с

Дм

8 пА

■д.....м........у,.,............—V........... Ули 0 мВ

Рис. 3. Ион-транспортирующая активность гидрофобного Са2+-связывающего компонента, реконструированного в бислойную липидную мембрану.

Раствор, омывающий мембрану содержал 20 мМ Трис-ИС1 рН 7.4, 1 мМ СаС12. Подаваемый на мембране потенциал равен 40 мВ.

Рис. 4. Увеличение проводимости бислойной липидной мембраны, модифицированной гидрофобным Са2+-связывающим компонентом при добавлении КС1. Условия как на рис. 3.

Проведенные эксперименты показали, что проводимость, формируемая в БЛМ гидрофобным компонентом, является неселективной. Отсутствие селективности не позволяет отнести изучаемую систему транспорта ионов к чрезвычайно селективным системам, таким как, унипортер, Н+/Са2+ и Ыа+/Са2+ обменники.

5. Определение химической природы Са3+-связывающего компонента.

Изучение химической структуры митохондриального Са2+-связывающего компонента, очищенного до гомогенного состояния, проводили с помощью УФ-, ИК-, 'НЧЯМР- и масс- спектроскопии, а также методом газожидкостной хроматографии.

Исследование спектральных характеристик изучаемого хроматографически чистого компонента, показало, что в УФ области (260-280 нм) отсутствуют максимумы поглощения. Этот факт свидетельствует в пользу того, что данный компонент не содержит

100 мМ КГ

10 пА |

I-м

Юс

нуклеотидов и пептидов, имеющих, обычно, ароматические аминокислоты.

ИК-спектроскопия гомогенного препарата проводилась в гидрофобном растворителе. Наиболее интенсивные полосы ИК-спектра в районе 2800 - 3000 см"!, относящиеся к валентным колебаниям метальных и метиленовых групп, и характерный триплет в районе 1450 - 1400 см-1 говорит о существовании в компоненте длинных алифатических цепей. Полоса 1700 см"1 отнесена к валентным колебаниям карбонила, входящего в состав карбоксильных групп.

При взаимодействии с СаС12 (рис. 5) не наблюдается низкочастотного сдвига полосы валентных колебаний карбонила (1700 см"1), что свидетельствует о том, что не происходит переход карбоксила в форму карбоксилат аниона. Это исключает образование комплекса с Са2+ по типу солевой связи.

Рис. 5. РЖ-спектры гидрофобного Са2+-связывающего компонента в хлороформе в отсутствии кальция (А) и присутствии кальция (Б).

Следовательно, образование комплекса с Са2+ происходит по типу координационного соединения в дегидратированной структуре. В области 1184 см пик практически исчезает, что говорит об участии -ОН групп в образовании координационного соединения. Общее

уменьшение числа полос, например, в области 1429, 1184, 909, 802, 694 сми сужение полосы 728 говорит об увеличении жесткости структуры при образовании координационного соединения с ионом Са2+.

Исследования, проведенные с использованием ^-ЯМР-спектроскопии, показали, что ' Н-ЯМР спектры, в полном соответствии с ИК-спектрами, указывают на наличие углеводородных цепочек, а также карбонильных групп.

Проведенная газожидкостная хроматография очищенного Са2+-связывающего компонента (рис. 6 А) показала наличие двух пиков, соответствующих пальмитиновой (С 16:0) (ПК) и стеариновой кислотам (С18:0) (СК).

2 А Б

2

4

Время (мин) Время (мин)

Рис. 6. Газожидкостная хроматограмма очищенного Са2+-связывающего компонента (А) и этанольного экстракта из 20 мг митохондрий (Б). Идентификация пиков: 1 - €14:0; 2 - С16:0; 3 - С1б:1; 4 - С18:0; 5 - 018:1; 6 - С18:2

Таким образом, совокупность полученных данных указывает на то, что гидрофобный Са2+-связывающий компонент представляет из себя смесь ПК и СК. Анализ свободных жирных кислот, выделенных из целых митохондрий (рис 6 Б), показал, что ПК составляет основную часть свободных жирных кислот в митохондриях.

6. Определение Ca2'h -связывающих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот.

После определения химическои природы Са -связывающего компонента были изучены Са2+ -связывающие свойства коммерческих препаратов пальмитиновой и стеариновой кислот (Sigma). Связывание Са2+ этими кислотами проявляет выраженную рН зависимость. Максимальное связывание Са2+ с ПК наблюдалось при слабощелочных значениях рН (рис. 7), в то время как при кислых значениях рН 6.2 связывание Са2+ практически отсутствует. Сходные результаты были

получены и для СК. Обнаруженные Са2+- связывающие свойства полностью совпадают со свойствами выделенного из митохондрий гидрофобного компонента.

рН

Рис. 6. рН-зависимость связывания Са2+ с пальмитиновой кислотой. 5 мкл 2 мМ пальмитиновой кислоты помещали на мембрану РУББ и проводили кальций-связывание в присутствии 3 мкМ 45СаС12.

Вычисленная Ка для ПК равна 5 мкМ при рН 8.5 и 15 мкМ при рН 7.5, а Втах = 0.48±0.08 ммоль Са2+/г ПК при обоих рН (рис. 7). Оценка параметров связывания Са2+ с ПК, показала, что в наших условиях соотношение между количеством связанного Са2+ и ПК равно 1:8.

2+

Рис. 7. Связывание Са пальмитиновой кислотой при рН 7.5 (А) и рН 8.5 (•).

Известно, что транспорт Са2+ в митохондриях сопровождается защелачиванием матрикса (Saris, 1963). Повышение рН в свою очередь активирует действие фосфолипаз и лизофосфолипаз высвобождающих жирные кислоты. В тоже время, как показано в настоящих исследованиях, увеличение рН усиливает связывание кальция с ПК и СК. Таким образом, в клетке может реализоваться образование наблюдаемых нами каналов, образованных пальмитиновой и стеариновой жирными кислотами.

Изучение влияния основных физиологически значимых катионов на связывание кальция пальмитиновой кислотой показало, что добавление MgCl2 в концентрации 0.1 - 1 мМ приводит к ингибированию связывания кальция. Подобные результаты были получены и в исследованиях со стеариновой кислотой. Поскольку используемые концентрации Mg2+ являются физиологическими, ингибирующий эффект магния может иметь функциональную значимость в митохондриях. С другой стороны, основной катион цитозоля и матрикса К+ в концентрации 50 - 500 мМ не оказывает влияния на связывание Са2+ пальмитиновой или стеариновой жирными кислотами.

7. Ион-транспортирующие свойства пальмитиновой и стеариновой кислот.

В работе получены результаты показывающие, что Са2+-связывающие свойства ПК и СК существенны для проявления этими кислотами ион-транспортирующих свойств при их встраивании в искусственные мембраны. Оказалось, что так же как и гидрофобный компонент данные кислоты способны индуцировать неспецифическую проводимость бислойных липидных мембран в присутствии кальция. Последующее добавление одновалентных катионов также как и в случае с гидрофобным компонентом вызывало увеличение проницаемости мембраны. Полученные результаты указывают на то, что Са2+-связывающие свойства гидрофобного компонента обусловлены присутствием в нем пальмитиновой и стеариновой кислот.

8. Сравнение Со2*-связывающих свойств различных липидов.

Для проведения сравнительных исследований Са2+-связывающих свойств различных липидов были использованы коммерческие препараты индивидуальных липидов относящихся к различным классам (Sigma). Данные этих исследований представлены в таблице 2. Результаты демонстрируют, что длинноцепочечные насыщенные жирные кислоты: пальмитиновая и стеариновая обладают способностью связывать кальций с высоким сродством. Насыщенные жирные кислоты с короткой и длиной алифатической цепью свыше С22, все ненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды, включая кардиолипин,

лизофосфолипиды, холестерин, сфинголилиды и другие практически не обладают этим свойством.

Таблица 2. Связывание Са 2+различными липидами

Липиды

Связывание Са'

2+

Лауриновая кислота (12:0)

Миристиновая кислота (14:0)

Пальмитиновая кислота (16:0)

Стеариновая кислота (18:0)

Арахиновая кислота (20:0)

Докозановая кислота (22:0)

Лигноцериновая кислота (24:0)

Пальмитолеиновая кислота (16:1)

Олеиновая кислота (18:1)

Линолевая кислота (18:2)

Линоленовая кислота (18:3)

Арахидоновая кислота (20:4)

1 -Пальмитоил-лизофосфатидилхолин

1 -Стеароил-лизофосфатидилхолин

1-Лауроил-лизофосфатидилхолин

Лизофосфатидилсерин

1,2-Дипальмитоил-5и-глицеро-3 -

фосфатидилхолин

1,2-Дипальмитоил-5л-глицеро-3-

фосатидилэтаноламин

1 -Пальмитоил-5л-глицеро-1 -3-

фосфатидилэтаноламин

Пальмитоил-КоА

Кардиолипин

Ь-а фосфатидная кислота

Холестерин

Цереброзиды

Сфингомиелин

0.50 ± .03 7.30 + 0.25 83.00 ± 0.75 100.00 73.00 ± 2.5 44.00 ± 1.2 15.00 ±0.35 1.90 ±0.08 5.70 ±0.12 0.65 ± 0.04 0.87 ±0.05 1.10 ±0.05 0.43 ±0.02 0.47 + 0.02 0.43 ± 0.01 0.54 ± 0.03 0.40 ± 0.2

0.22 ± 0.01

0.76 ±0.03

0.43+0.02 0.60 ± 0.03 19.50 ±0.8 0.33 ±0.01 0.20 ±0.01 0.30 ±0.01

в % от связывания Са2+ со стеариновой кислотой 5 мкл 2 мМ раствора каждого липида были нанесены на кальция проводилось при рН 8.5 в присутствии 5 мкМ Данные получены из 4-х экспериментов.

РУОБ мембрану. Связывание 45СаСЬ и измерялось в срм..

Подтверждение того, что Са2+-связывающие свойства митохондриальных липидов определяется в основном жирными кислотами было получено в экспериментах по разделению

»

митохондриальных литшдов на классы и определению их Са2+-связывающих свойств. Установлено, что фракция, содержащая свободные жирные кислоты, имеет более высокое сродство к Са2+, по сравнению с другими митохондриальными фракциями содержащими фосфолипиды, холестерин и нейтральные липиды (табл. 3).

Таблица 3. Связывание Са2+ фракциями митохондриальных липидов, полученных с аминоиропилсиликагельной колонки (Sep-PAK, Waters).

Фракция. * Связывание Са2+

1 Нейтральные липиды - хлестерин 5.0 ±0.08

2 Свободные жирные кислоты 100.0

3 Фосфатидилхолин 1.5 ±0.05

4 Фосфатидилэтаноламин 0

5 Фосфатидилсерин 15.0 ±0.09

6 Фосфатидилинозитол 5.0 ±0.06

--

в % от количества Ca , связанного с фракцией свободных жирных кислот

9. Влияние и ингибитора фосфолипазы А2 - аристолоховой кислоты на содержание пальмитиновой и стеариновой кислот в митохондриях.

Известно, что добавление Са2+ к митохондриям активирует фосфолипазу А2, что приводит к высвобождению свободных жирных кислот (Pfeiffer et al., 1979). В работе были проведены эксперименты по определению содержания ПК и CK в митохондриях в условиях активации фосфолипазы А2 кальцием, а также в присутствии ингибитора фосфолипазы А2 - аристолоховой кислоты.

Было обнаружено, что преинкубация митохондрий в среде, содержащей 83 нМ СаС12/мг белка, приводит двукратному увеличению содержания пальмитиновой кислоты. Отмечено также, некоторое увеличение содержания и стеариновой кислоты. В то же время, в присутствии ингибитора фосфолипазы А2 и Са2+ содержание этих кислот в митохондриях оставалось на уровне контроля (таб. 4).

Таблица. 4. Влияние Са2+ и ингибитора фосфолипазы А2 на содержание пальмитиновой и стеариновой кислот в митохондриях печени крыс.

Условия инкубации (Юмин) мкг С1б:0/мг белка мкг С18:0/мг белка

Контроль 1.10 0.30

+82 нмоль СаС12/мг белка 2.20 0.46

+82 нмоль СаС12/ мг белка+ 1.22 0.30

10 мкМ аристолоховая кислота

Таким образом, было установлено, что добавления Са2+ к митохондриям приводит к активации фосфолипазы А2 и увеличивает содержание пальмитиновой и стеариновой кислот в митохондриальной мембране, которые, в свою очередь, могут являться причиной возникновения неспецифической проницаемости мембраны.

Свойство комплекса, пальмитиновой кислоты с кальцием, активировать неспецифическую проницаемость мембраны может играть основную роль в механизме проапоптотического действия ПК, так как, в последнее время, показано, что ПК и СК являются природными активаторами апоптоза (Kong and Rabkin, 2000) и их эффект опосредован через митохондрии (Sparagna et al., 2000).

ВЫВОДЫ.

1. Проведена очистка и идентификация низкомолекулярного гидрофобного Са2+-связывающего компонента внутренней мембраны митохондрий. Показано, что данный компонент состоит из длинноцепочечных насыщенных жирных кислот, преимущественно пальмитиновой, стеариновой и локализован в контактных участках между внутренней и наружной мембраной митохондрий.

2. Показано, что пальмитиновая и стеариновая кислоты связывают Са2+ с высоким сродством (Кд = 5 мкМ, при рН 8.5) и в условиях образования в мембране комплекса, этих кислот с Са2+, в БЛМ формируются неселективные ионные каналы.

3. Сравнительный анализ параметров связывания Са2+ различными липидами (как коммерческими препаратами, так и выделенными из митохондрий) и жирными кислотами показал, что способностью связывать Са2+ с высоким сродством обладают только насыщенные жирные кислоты с длиной цепи от 16 до 22 атомов углерода.

4. Показано, что увеличение содержание пальмитиновой и стеариновой кислот в митохондриях может быть следствием активации в них Са2+-зависимой фосфолипазы

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

1. Лимаренко Е.А., Павлов Е.В., Ванина В.И. "Са2+-связывающие свойства гидрофобной компоненты митохондриальной мембраны, формирующей в БЛМ Са2+-активируемые каналы проводимости". П1 Городская научная конференция молодых ученых, тезисы доклада, Пущино, 1998, с. 159.

2. О. Gateau-Roesch, Е. Pavlov, A. Lazareva, Е. Limarenko, С. Levrat, N- Е. Saris, P. Louisot, G. Mironova. "Localisation Mitochondria and Ca-binding of a Channel-Forming Hydrophobic Component". Frontiers of Mitochondria Research, Rensselaerville, USA, 1998, pp. 24-27.

3. Лимаренко E.A., Павлов E.B., Лазарева А.В. "Изучение функциональной роли Са2+-связывающего липида выделенного из внутренней мембраны митохондрий". IV Городская научная конференция молодых ученых, тезисы доклада, Пущино, 1999, с. 39.

4. О. Gateau-Roesch, Е. Pavlov, A. Lazareva, Е. Limarenko, С. Levrat, N- Е. Saris, P. Louisot, G. Mironova Са- binding Properties of the Mitochondrial Channel-Forming Hydrophobic Componen. // J. Bioenerg. Biomembr., 2000, V. 32, pp. 105-110.

5. Лазарева A.B., Лимаренко E.A., Грш{енко E.H., Павлов Е.В., Миронова Г.Д. "Роль пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в митохондриальной мембране и их способность связывания кальция с высоким сродством". Международная конференция «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода», тезисы доклада, Пущино, 2000, с. 88-100.

6. G. Mironova, О. Gateau-Roesch, С. Levrat, Е. Pavlov, A. Lazareva, Е. Limarenko, С. Rey, N-E. Saris "Са2+- binding properties of long-chain saturated fatty acid and their possible role in mitochondria". In: Frontiers of mitochondrial research, Albany (USA), 2000, p. 44.

7. Лимаренко E.A., Павлов E., Лазарева A.B., Гриценко E.H., О. Gateau-Roesch, С. Rey, P.Louisot, N-E. Saris, Агафонов A.B., Миронова Г.Д. "Модель Са2+ -активируемой поры в митохондриях: роль комплексов Са2+ с пальмитиновой кислотой". VIII Международная конференция "Математика, компьютер, образование", тезисы доклада, Пущино, 2001, с. 297.

8. G. Mironova, О. Gateau-Roesch, С. Levrat, Е. Gritsenko, Е. Pavlov, А. Lazareva, Е .Limarenko, С. Rey, P. Louisot and N.-E. Sairis A model of mitochondrial permeability transition pore: a possible role of palmitic acid/calcium complexes. // В сб. научных трудов "Математика, компьютер, образование", Москва, Прогресс-Традиция, 2001, с. 531-537.

9. Гриценко Е.Н., Лимаренко Е.А., Павлов Е., Лазарева А.В., О. Gateau-Roesch, С. Levrat, С. Rey, P. Louisot, N-E. Saris "Действие природных активаторов апоптоза - пальмитиновой и стеариновой жирных кислот на проницаемость модельной и митохондриальной мембраны". Материалы всероссийского рабочего совещания «Митохондрии в патологии», Пущино, 2001, с. 254-246.

10. G. Mironova, О. Gateau-Roesch, С. Levrat, Е. Gritsenko, Е, Pavlov, A. Lazareva, Е. Limarenko, С, Rey, P. Louisot and N-E, Sairis. Palmitic and stearic acids bind Ca2+ with high affinity and form nonspecific channel in clack-lipid membranes. Possible relation to Ca2+-activated mitochondrial pores. // J. Bioenerg. Biomembr., 2001, V. 33, pp. 319-331.

11. G. Mironova, A. Lasareva, E. Limarenko, A. Agafonov, E. Gritsenko, K. Belosludtsev, O. Gateau-Roesch, N-E. Sairis. "Calcium-binding properties of palmitic and stearic acids in relation to the membrane permeabilization". XIV International Biophysics Congress (Argentina), 2002, p. 31.

12. Миронова Г.Д., Лимаренко E.A., Гриценко E.H., Агафонов А.В., Белослудцев К.Н., Лазарева А.В. "Са2+- связывающие и порообразующие свойства пальмитиновой кислоты и их роль в открытии митохондриальной Са2+-зависимой циклоспорин А - нечувствительной поры". III съезд биохимического общества, тезисы доклада, Санкт-Петербург, 2002, с. 253.

13. Белослудцев К.Н., Лимаренко Е.А. "Свободные жирные кислоты как индикаторы CsA-нечувствительной митохондриальной поры". 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», тезисы доклада, Пущино, 2003, с. 54.

14. Гриценко Е.Н., Лимаренко Е.А., Белослудцев КН., Лазарева А.В. "Сравнение Са2+-связывающих и порообразующих свойств пальмитиновой и 2-бромпальмитиновой кислоты". 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», тезисы доклада, Пущино, 2003, с. 59.

15, Миронова Г.Д., Гриценко Е.Н., Агафонов А.В., Белослудцев К.Н., Лимаренко Е.А., Лазарева А.В. "Возможный механизм апоптоза -активирующего действия пальмитиновой кислоты". Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», тезисы доклада, Пущино, 2003, с. 257-259

Диссертационная работа была выполнена при поддержки грантов Российского Фонда Фундаментальных Исследований № 98-04-48210 и № 01-04-48551, 1998-2003 год, а также грантов INSERM, РЕСО Института здоровья Франция, 2000 год.

Научное издание

Автореферат

Е.А.Лимаренко

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции СЖ-005-93, том 2; 953000 - книги и брошюры.

Подписано в печать 22.10.03 г. Заказ 9928Р. Тираж 100 экз. Усл.печ.л. 1,25.

Отпечатано с оригинала-макета в Объединенном научно-техническом издательстве Пущинского научного центра РАН.

142290, г.Пущина Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ.

s

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лимаренко, Елена Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ионы кальция — как универсальный регулятор внутриклеточных процессов.

1.2. Са как вторичный мессенжер в передачи информации.

1.3. Участие митохондрий в контролировании внутриклеточной концентрации ионов кальция.

1.4. Системы транспорта кальция в митохондриях.

1.4.1. Электрогенная система входа кальция в митохондрии.

1.4.2. Системы выхода кальция из митохондрий.

1.4.2.1. Электронейтралъный обмен кальция на натрий.

1.4.2.2. Электронейтралъный обмен кальция на протон.

1.5. Митохондриальная циклоспорин А-чувствительная пора.

1.6. Митохондриальная циклоспорин А-нечувствительная пора.

1.7. Физиологическая значимость свободных жирных кислот.

1.8. Роль жирных кислот в функционировании митохондрий.

1.9. Апоптоз и некроз — два варианта гибели клеток.

1.9.1. Морфологические критерии.

1.9.2. Молекулярно-биохимические критерии.

1.10. Участие митохондрий в развитии апоптоза.

1.11. Пальмитиновая кислота как природный активатор апоптоза.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Метод выделения митохондрий из печени крыс.

2.2. Метод выделения митопластов из митохондрий печени крыс.

2.3. Метод получения внутренней мембраны митохондрий и межмембранных контактных участков.

2.4. Определение концентрации митохондриального белка.

2.5. Экстракция липидов из мембраны митопластов с помощью этанола.

2.6. Разделение гидрофобных и гидрофильных компонентов митопластов.

2.6.1. Модификация метода Фолча.

2.6.2. Выделение Са2+-связывающего компонента и жирных кислот модифицированным методом Фолча из малых количеств митопластов.

2.6.3. Выделение жирных кислот по методу Блайя и Дайэра.

2.6.4. Выделение жирных кислот по методу Боумену и Берозы.

2.7. Очистка гидрофобного экстракта на колонке с кремниевой кислотой.

2.8. Аналитическая и препаративная тонкослойная хроматография.

2.9. Определение Са -связывающих свойств.

2.10. Разделение митохондриальных липидов на классы на колонке с аминопропилсиликагелем (Sep-PAK, Waters).

2.11. Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента.

2.12. Определение химической природы вещества.

2.12.1. Ультрафиолетовая спектроскопия.

2.12.2. Инфракрасная спектроскопия.

2.12.3.1Н+-ЯМР-спектрометрия.

2.12.4. Газожидкостная хроматография жирных кислот.

2.13. Определение содержания пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в митохондриях.

ГЛАВА 3 . РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

3.1. Очистка митохондриального низкомолекулярного гидрофобного Са2+-связывающего компонента.

3.2. Са2+-связывающие параметры изучаемого компонента.

3.3. Влияние различных ионов на способность связывать Са2+изучаемым веществом.

3.4. Локализация гидрофобного Са2+-связывающего компонента в митохондриях.

3.5. Изучение ион-транспортирующих свойств гидрофобного Са -связывающего компонента.

3.6. Определение химической природы Са2+ -связывающего компонента.

3.6.1. Ультрафиолетовая спектроскопия Са -связывающего компонента.

3.6.2. Инфракрасная спектроскопия Са2+-связывающего компонента.

3.6.3. Спектры 'Н-ЯМР СаГ

-связывающего гидрофобного компонента.

3.6.4. Газожидкостная хроматография Са2+-связывающего компонента.

3.7. Инфракрасная спектроскопия пальмитиновой кислоты, пальмитиновой кислоты в комплексе с кальцием и пальмитата натрия.

3.8. Сравнение методов выделения свободных жирных кислот.

3.9. Определение Са -связывающих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот.

3.10. Влияние различных катионов на Са2+ -связывающие свойства пальмитиновой кислоты.

3.11. Определение ион-транспортирующих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот.

3.12. Сравнение Са -связывающих свойств различных липидов.

3.13. Влияние Са2+ и ингибитора фосфолипазы А2 - аристолоховой кислоты на содержание пальмитиновой и стеариновой жирных кислот в митохондриях печени крысы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ca2+-связывающие свойства пальмитиновой и стеариновой кислот и роль комплекса этих кислот с Ca2+ в регуляции проницаемости митохондриальной мембраны"

Биологические мембраны играют ключевую роль в процессах регуляции и, в частности, в регуляции ионного гомеостаза клеток. Поддержание ионного гомеостаза является необходимым условием выживания клеток. В связи с этим, изучение механизма регуляции целостности одного из типов мембран клеток, а именно митохондриальной, является актуальной задачей.

Как известно, ионы Са2+ являются наиболее активными регуляторами биологических процессов в организме. Они выступают в качестве сопрягающего фактора между возбуждением и сокращением в мышцах, участвуют в тромбообразовании, выбросе нейротрансмиттеров, образовании микротрубочек, в гормональных ответах, экзоцитозе, делении клеток, адгезии, росте и апоптозе клеток. Уровень кальция в цитоплазме контролируется работой Са2+-транспортирующих систем, локализованных в плазматической мембране и в мембранах клеточных органелл. Митохондрии являются органеллами способными аккумулировать избыточный кальций цитоплазмы, что в свою очередь, активирует Са2+ -чувствительные ферменты их матрикса.

В последнее время большое внимание стали уделять изучению Са -зависимой митохондриальной поры, так как она активируется при ряде патологий: ишемия, болезнь Рефсума (Schonfeld, Struy, 1999), ожирение (Shimabukuro et al., 1998; Perez et al., 1997; Zhou et al., 2000), диабет (Shimabukuro et al., 1998; Gremlich et al., 1997) и тиреотоксикозе (Sliepchevich et al., 1973; Turakulov et al., 1973). Эта пора чувствительна к циклоспорину A (Kimberly et al., 1989; Zoratti, Szabo, 1995) и ее у . появление в мембране связывают с

-зависимым изменением конформации различных митохондриальных белков (Halestrap et al., 2002). Механизм этой поры широко изучается, так как показано, что циклоспорин А предупреждает развитие в клетке ряда патологических состояний (Nazareth et al., 1991).

В настоящее время, уже в процессе выполнения работы, появились данные о существовании в митохондриях другой Са2+-активируемой поры, так называемой, циклоспорин - нечувствительной митохондриальной поры (Sultan and Sokolove, 2001а). Предполагается, что ее образование в митохондриях не связано с формированием белковой поры. Однако, механизм образования циклоспорин -нечувствительной поры до сих пор не ясен. Поэтому выяснение природы, обнаруженного в нашей лаборатории низкомолекулярного гидрофобного компонента (Mironova et al., 1997), который связывает Са2+, увеличивая при этом проницаемость бислойной липидной мембраны, может пролить свет в понимании молекулярного механизма этой Са2+-зависимой поры.

Целью настоящей работы являлась очистка, обнаруженного ранее гидрофобного низкомолекулярного Са2+-связывающего и ион-транспортирующего компонента, выяснение его химической природы и локализации в мембране, изучение параметров его Са -связывающих свойств. После выяснения химической природы гидрофобного компонента провести сравнение выше упомянутых свойств с таковыми у коммерческого аналога.

В диссертации были поставлены и решены следующие задачи:

1. Очистить низкомолекулярный гидрофобный Са2+-связывающий компонент внутренней мембраны митохондрий и исследовать его ион-транспортирующие свойства в бислойной липидной мембране.

2. Измерить параметры связывания кальция изучаемым компонентом и исследовать влияние различных ионов на способность связывать

Са2+ изучаемым веществом.

2+

3. Определить локализацию гидрофобного Са -связывающего компонента в митохондриях.

4. Выяснить химическую природу Са -связывающего компонента, используя различные физико-химические методы.

5. Определить Са -связывающие свойства различных классов липидов.

2+

6. Измерить параметры Са -связывающих свойств пальмитиновой и стеариновой кислот.

7. Проанализировать влияние

Са2+ и ингибитора фосфолипазы А2 -аристолоховой кислоты на содержание пальмитиновой и стеариновой кислот в экспериментах на интактных митохондриях, печени крысы. Научная новизна работы. I

Выяснена химическая природа низкомолекулярного гидрофобного Са -связывающего компонента внутренней мембраны митохондрий обладающего ион-транспортирующими свойствами в бислойной липидной мембране, который, главным образом, состоит из пальмитиновой и стеариновой жирных кислот. Определены параметры связывания Са2+ этим компонентом.

Обнаружено уникальное свойство пальмитиновой и стеариновой жирных кислот связывать кальций с высоким сродством. Липиды других классов таким свойством не обладают. Это позволяет по-новому взглянуть на механизмы индуцируемой пальмитиновой кислотой проницаемости митохондриальной мембраны и пальмитат-активируемого апоптоза. Научно-практическое значение работы.

Результаты могут быть использованы для исследований в области биоэнергетики, а также найти применение в медицине при разработке фармакологических препаратов, поскольку показано, что свободные жирные кислоты вовлечены в развитие ряда таких патологических явлений как ишемия, болезнь Рефсума, ожирение, диабет, тиреотоксикоз и другие. Ш

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Лимаренко, Елена Анатольевна

выводы

1. Проведена очистка и идентификация низкомолекулярного гидрофобного Са2+-связывающего компонента внутренней мембраны митохондрий. Показано, что данный компонент состоит из длинноцепочечных насыщенных жирных кислот, преимущественно пальмитиновой, стеариновой и локализован в контактных участках между внутренней и наружной мембраной митохондрий.

2. Показано, что пальмитиновая и стеариновая кислоты связывают Са2+ с высоким сродством (Кд = 5 мкМ, при рН 8.5) и в условиях образования в мембране комплекса, этих кислот с

Са , в БЛМ формируются неселективные ионные каналы.

3. Сравнительный анализ параметров связывания

Са2+ различными липидами (как коммерческими препаратами, так и выделенными из митохондрий) и жирными кислотами показал, что способностью связывать

Са2+ с высоким сродством обладают только насыщенные жирные кислоты с длиной цепи от 16 до 22 атомов углерода.

4. Показано, что увеличение содержание пальмитиновой и стеариновой кислот может быть следствием активации в митохондриях Са2+-зависимой фосфолипазы.

Диссертационная работа была выполнена при поддержки грантов Российского Фонда Фундаментальных Исследований № 01-04-48551 и № 98-04-48210,19982003 год, а также грантов INSERM, РЕСО Института здоровья Франции, 2000 г.

Считаю приятным долгом выразить глубокую благодарность своим руководителям Г.Д. Мироновой и А.В. Лазаревой за предложенную тему, постоянное внимание к работе и ценные указания, а также всем сотрудникам лаборатории «Митохондриального транспорта» за помощь при проведении отдельных экспериментов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В работе проведена очистка, определение химической природы и свойств

9+ выделенного ранее в нашей лаборатории гидрофобного низкомолекулярного Са -связывающего компонента митохондриальной мембраны. Вещество было очищено до гомогенного состояния, что видно по результатам тонкослойной аналитической хроматографии. В задачу работы входило также накопление очищенного вещества в количестве, достаточном для снятия спектральных и химических анализов, необходимых для определения химической природы изучаемого компонента, а также определения параметров его связывания с кальцием (Кд Вмах) (рис. 6). Полученные в работе экспериментальные данные указывают на то, что митохондриальный гидрофобный компонент, который имеет высокое сродство к Са2+ (Кд = 8мкМ), состоит из длинноцепочечных насыщенных жирные кислот, преимущественно пальмитиновой и стеариновой.

Наши исследования показали, что среди митохондриальных липидов, длинноцепочечные насыщенные жирные кислоты: пальмитиновая и стеариновая имеют наиболее высокое сродство к Са2+ (Кд = 5 мкМ при рН 8.5). Насыщенные жирные кислоты с короткой и средней длиной алифатической цепью, все ненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды, включая кардиолипин, лизофосфолипиды, холестерин, сфинголипиды и другие, не обладают этим свойством (таблица 4). Обнаружено, что пальмитиновая и стеариновая кислоты имеют оптимальную длину цепи для связывания Са2+ и увеличение длины алифатической цепи приводит к снижению Са2+-связывающих свойств жирных кислот.

Л й ft Л Л „ft л- Jo" чЯэ' Л' oV & & & & & & &

Насыщенные жирные кислоты о

X ш S а 2 к ш о о Я н о

JV Л с

4О «vO \TJ /ОО

О4 с4 о4 с>

Ненасыщенные жирные кислоты

5 к я , я fe

X S т ю £

03 я ^

Л о ь Я u J ъ

О. < О К U О ft Л Kft , ft ft ft 4v ч^' Jo' Л- rft'

C4 C> О4 О4 C4 C>

Насыщенные жирные кислоты й is

8 1 ае S ч

D. <3 О

Ьй и

2

1 О

Лу" Лу" Л? рй^

О4 О4 О4 О4 С> &

Ненасыщенные жирные кислоты

Рис. 20. Прямая корреляция между Са2+ -связывающими и порообразующими свойствами жирных кислот.

В работе установлено, что пальмитиновая, стеариновая и арахиновая жирные кислоты имеют наивысшее сродство к Са2+, по сравнению с другими липидами. Как известно, из литературы и последним данным полученных в нашей лаборатории, в митохондриях содержание пальмитиновой кислоты в 2 - 3 раза выше, чем стеариновой кислоты, тогда как арахиновая кислота присутствует только в следовых количествах. Следовательно, в митохондриях пальмитиновая кислота является, вероятно, основным гидрофобным компонентом чьи Са2+ -связывающие и ион-транспортирующие свойства, могут реально влиять на функцию митохондрий.

Особый физиологический интерес вызывает, обнаруженное в работе увеличение сродства пальмитиновой кислоты к кальцию в диапазоне рН 7.0-8.5. Как известно, поглощение Са2+ митохондриями сопровождается защелачиванием матрикса (Saris, 1963), которое может способствовать индукции классической Са -активируемой поры (Bernardi, 1999; Haworth and Hunter, 1980). Считается, что вероятность открытия этой поры определяется двумя ключевыми факторами, а именно значением рН и уровнем кальция в матриксе (Petronilli et al., 1993).

Л I

Значение 5max для связывания Са пальмитиновой кислотой (0.48 ммоль/г). Оценка параметров связывания Са2+ с пальмитиновой кислотой, показала, что в наших условиях соотношение между количеством связанного Са2+ и пальмитиновой кислоты равно 1:8. Следует заметить, что Са2+в координационных комплексах, как правило, имеет от 6 до 8 связей (Williams, 1975). Следовательно, можно говорить об образовании координационных комплексов между пальмитиновой кислотой и кальцием. Аналогичные результаты были получены и для стеариновой кислоты. ИК-спектр сухих пленок пальмитиновой кислоты, пальмитата натрия и комплекса Са2+-пальмитиновая кислота в гидрофобных растворителях (рис. 16) также подтверждает вывод, что связи между Са2+ и молекулами жирных кислот являются координационными.

Образование таких комплексов Са2+ -пальмитиновая кислота может вызывать появление неоднородности в мембране и увеличение ее ионной проводимости. В работе установлено, что коммерческие препараты пальмитиновой и стеариновой кислот, в присутствии Са2+ увеличивают проводимость искусственной мембраны к ионам. Как, в настоящее время, показано в нашей лаборатории Агафоновым А.В. и Гриценко Е.Н. образование комплексов Са2+ с пальмитиновой и стеариновой жирными кислотами приводит к увеличению проводимости мембраны не только к ионам, но и к низкомолекулярному соединению, такому как сульфородамину Б (Agafonov et al., 2003).

Обнаруженное свойство пальмитиновой кислоты увеличивать проводимость мембраны может иметь прямое отношение к известному феномену повышения неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны в присутствии больших концентраций Са2+. Действие кальция можно объяснить активацией Са2+ -зависимой фосфолипазы А2 (Pfeiffer et al., 1979), в результате чего в митохондриях появляются свободные жирные кислоты. Показано, что в липосомах активация этого фермента вызывает увеличение проницаемости липосомальной

• • 2+ мембраны (Eriksson and Saris, 1989). В наших экспериментах, Са -индуцируемое увеличение содержания пальмитиновой и стеариновой кислот в митохондриях, вероятно, в результате активации фосфолипазы Аг, предотвращалось использованием ингибитора фосфолипазы А2 - аристолоховой кислоты (табл. 7).

Недавно было обнаружено, что добавленная в митохондрии пальмитиновая кислота открывает циклоспорин А - нечувствительную пору во внутренней митохондриальной мембране (Sutlan and Sokolove, 2001 а) и в присутствии умеренной концентрации Са2+ (75 нмоль/мг белка), длинноцепочечные насыщенные жирные кислоты с длиной цепи (С(14:0) - С(16:0)) были более эффективны, чем жирные кислоты с более короткой или длинной алимфатической цепью (Sutlan and

Sokolove, 2001 б). Это хорошо согласуется с нашими данными, представленными в

2+ таблице 4, на рисунке 20 и указывает на то, что Са -связывающие свойства насыщеных жирных кислот важны, вероятно, для формирования в митохондриях циклоспорин А-нечувствительной поры. Данные по действию жирных кислот и кальция на проницаемость мембраны подтверждены в нашей лаборатории Белослудцевым К.Н., которым, в настоящее время, изучаются механизмы регуляции пальмитин-индуцированной поры в митохондриях.

Обнаруженные нами Са2+ -связывающие свойства пальмитиновои и стеариновой жирных кислот могут играть, вероятно, роль и в формировании циклоспорин А-чувствительной поры. Так Шонфельдом и Боненсаком (Schonfeld and Bohnensack, 1997) обнаружено, что пальмитиновая кислота соперничает с 3Н-атрактилозидом за связывание с ADP/ATP антипортером, тогда как лауриновая кислота менее эффективна в этом отношении. Это означает, что пальмитиновая кислота связываясь с антипортером может влиять на циклоспорин А-чувствительную пору путем стабилизации цитозольной конформации ADP/ATP антипортера - одного из основных кандидатов в компоненты С sА-чувствительной поры (Halestrap et al., 1998). Изучение белок-липидных взаимодействий в ADP/ATP антипортере показало, что стеариновая кислота связывается с ADP/ATP антипортером с более высокой специфичностью, чем фосфолипиды (Horvath et al., 1990). Высокое сродство Са2+ к пальмитиновой и стеариновой кислотам и их способность связываться с ADP/ATP антипортером, могут создать условия, при которых конформация ADP/ATP антипортера становится чувствительной к изменениям концентрации Са2+. Эти свободные жирные кислоты могут, таким образом, являться потенциальными Са2+ сенсором для классической поры. В этой связи представляет интерес тот факт, что Mg ингибирует как связывание пальмитиновой кислотой, так и открытие классической поры (Zoratti and Szabo,

1995). Кардиолипин также связан с ADP/ATP антипортером и как предполагается, является потенциальным

Са2+ датчиком для MPT (Brustovetsky and Klingenberg,

1996). Однако, более высокое сродство к Са2+ пальмитиновой и стеариновой кислот по сравнению с кардиолипином (табл. 4) делает эти кислоты более вероятными, потенциальными кандидатами для такой функции. Кардиолипин, в свою очередь, может быть более вероятным источником свободной пальмитиновой кислоты в клетке, по сравнению с другими фосфолипидами, как, в настоящее время, показано в нашей лаборатории. (Mironova G.D. et al., в печати)

Хорошо известно, что свободные жирные кислоты обладают большим набором биологически важных свойств, часть из которых проявляется на митохондриях. Недавно было показано, что пальмитиновая кислота вызывает выход из митохондрий проапоптотических факторов (цитохрома с и других индуцирующих апоптоз факторов), которые вызывают апоптоз (Pablo and Kromer, 1999; Kong and Rabkin, 2000; Sparagna et al., 2000; Listenberger et al., 2001).

Полученные нами данные позволяют приблизиться к пониманию механизма проапоптотического действия пальмитиновой кислоты. Мы предполагаем, что эта кислота образуя в мембране комплекс с кальцием приводит к увеличению неспецифической проводимости мембраны и, как следствие, выбросу проапоптотических белков из митохондрий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лимаренко, Елена Анатольевна, Пущино

1. Генис Р. // Биомембраны. Москва «Мир», 1997, стр 64-66.

2. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. «Наука», Москва, 1981, стр. 25-28.

3. Курский М.Д., Михайленко Е.Г., Федоров А.Н. Транспорт кальция и функция гладких мышц. Киев. «Наукова думка», 1981, стр. 172.

4. Лемешко В.В. Митохондриальные Са -транспортирующие системы и их роль в регуляции окислительного метаболизма. // Биохимия животных и человека, 1990, 14, стр. 45-55.

5. Ленинджер А. Биохимия. Москва «Мир», 1974, стр. 222.

6. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. Москва. «Мир», 1965, стр. 174.1. О А

7. Павлов Е.В. Изучение свойств и функции Са -активируемого канала митохондрий. 1999.

8. Пермяков Е.А. Кальцийсвязывающие белки. Москва «Наука», 1993, стр. 190.

9. Чулаковский В.М. Инфракрасные спектры поглащения полимеров и вспомогательных веществ. Ленинградское отделение «Химия», 1969, стр. 255.

10. Agafonov A, Gritsenko E, Belosludtsev K, Kovalev A, Gateau-Roesch O, Saris NE, Mironova GD. A permeability transition in liposomes induced by the formation of Ca2+/palmitic acid complexes. // Biochim. Biophys. Acta, 2003, V. 1609, pp. 153-160.

11. Albina JE, Reichner JS. Role of nitric oxide in mediation of macrophage cytotoxicity and apoptosis. // Cancer Metastasis Rev., 1998, V. 17, pp. 39-53

12. Allshire A., Bernardi P., Saris N.-E. Manganese stimulates calcium flux through the mitochondrial uniporter. // Biochim. Biophys. Acta, 1985, V. 807, pp. 202-209.

13. Andreeva L., Crompton M. An ADP-sensitive cyclosporin-A-binding protein in rat liver mitochondria. // Eur. J. Biochem., 1994, V. 221, pp. 261-268.

14. Ardail D, Privat JP, Egret-Charlier M, Levrat C, Lerme F, Louisot P. Mitochondrial contact sites. Lipid composition and dynamics. // J. Biol. Chem., 1990, V. 265, pp. 18797-18802.

15. Asimakis G.K., Sordahl L.A. Effects of atractyloside and palmitoyl coenzyme A on calcium transport in cardiac mitochondria. // Arch. Biochem. Biophys., 1977, V. 179, pp. 200-210.

16. Azzi A., Azzone G.F. Swelling and shrinkage phenomena in liver mitochondria. Irreversible swelling induced by inorganic phosphate and Ca2+. // Biochim. Biophys. Acta., 1966, V. 113, pp. 438-444.

17. Bal-Price A, Brown GC. Nitric-oxide-induced necrosis and apoptosis in PC 12 cells mediated by mitochondria. // J. Neurochem., 2000, V. 75, pp.1455-1464.

18. Becker G.L., Fiskum G., Lehninger H.L. Regulation of free Ca2+ by liver mitochondria and endoplasmic reticulum. // J. Biol. Chem., 1980, V. 255, pp. 90099012.

19. Beeker G.L. Steady state regulation of extramitochondrial Ca2+ by rat liver mitochondria. // Biochim. Biophis. Acta, 1980, V. 591, pp. 234-239.

20. Beltran В, Mathur A, Duchen MR, Erusalimsky JD, Moncada S. The effect of nitric oxide on cell respiration: A key to understanding its role in cell survival or death. // Proc. Natl. Acad. Sci USA , 2000, V. 97, pp. 14602-14607.

21. Bernardi P. Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability transition. // Physiol. Rev., 1999, V. 79, pp. 1127-1155.

22. Bernardi P., Vassanelli S., Veronese P., Colonna R., Szabo I., Zoratti M. Modulation of the mitochondrial permeability transition pore. Effect of protons and divalent cations. // J. Biol. Chem., 1992, V. 267, pp. 2934-2939.

23. Bernardi P., Veronese P., Petronilli V. Modulation of the mitochondrial cyclosporin2+ •

24. A-sensitive permeability transition pore. I. Evidence for two separate Me binding sites with opposing effects on the pore open probability. // J. Biol. Chem., 1993, V. 268, pp. 1005-1010.

25. Blackmore P.E., Hughes B.P., Shuman E.A., Exton J.H. a-Adrenergic activation of phosphorylase in liver cells involves mobilization of intracellular calcium without influx of extracellular calcium. // J. Biol. Chem., 1982, V. 257, pp. 190-197.

26. Bligh E.G. and Dyer W.I. // Can. J. Biochem. Physiol., 1959, V. 37, pp. 911-916.

27. Blinks JR, Wier WG, Hess P, Prendergast FG. Measurement of Ca2+ concentrations in living cells. // Prog. Biophys. Mol. Biol., 1982, V. 40, pp. 1-114.

28. Boime I., Smith E.E., Hunter F.E. Jr. The role of fatty acids in mitochondrial changes during liver ischemia. // Arch. Biochem. Biophys., 1970, V. 139, pp.425443.

29. Boime I., Smith E.E., Hunter F.E. Jr. Stability of oxidative phosphorylation and structural changes of mitochondria in ischemic rat liver. // Arcii. Biochem. Biophys., 1968, V. 128, pp. 704-715.

30. BowmanM.S. and Beroza M. // Anal. Chem., 1966, V. 38, pp. 1544-1550.

31. Broekemeier K.M., Dempsey M.E., Pfeiffer D.R. Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria. // J. Biol. Chem., 1989, V. 264, pp. 7826-7830.

32. Brustovetsky N, Klingenberg M. Mitochondrial ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large channel by Ca2+. // Biochemistry, 1996, V. 35, pp. 84838488.

33. Caman R.E., et al., Caman M.W., Hunt J.M., and Smith M.S. // J. Neurochem.,1965, V. 12, pp. 15-23.

34. Carafoli E., Cromton M. Calcium ions and mitochondrial. In: Calcium in Biological Systems (ed. C.S. Dancan). Cambridge, 1976, pp. 89-115.

35. Carafoli E., Malmstrom К., Capano M., Sigel E., Cromton M. Mitochondrial and regulation of cell calcium. In: Calcium transport in cotraction and secretion, Carafoli (Ed.) North-Holland Publishing Company, 1975, pp. 53-64.

36. Caroni P, Schwerzmann K, Carafoli E. Separate pathways for Ca2+ uptake and release in liver mitochondrial. // FEBS Lett., 1978, V. 96, pp. 339-342.

37. Chavez E., Zazueta C., Garcia N. Carboxyatractyloside increases the effect of oleate on mitochondrial permeability transition. // FEBS Lett., 1999, V. 445, pp. 189-191.

38. Cockrel R.S. The influence of nupercaine on Ca2+ transport by rat liver and ehrlich ascites cell mitochondria. //FEBS Lett., 1982, V. 144, pp. 279-282.

39. Cockrell R.S. The influence of nupercaine on Ca2+ transport by rat liver and Ehrlich ascites cell mitochondria. // FEBS Lett., 1982, V. 144, pp. 279-282.

40. Cohen P. The hormonal control of glycogen metabolism in mammalian muscle by multivalent phosphorylation. // Biochem. Soc. Trans., 1979, V. 7, pp. 459-480.

41. Cox J.A., Comte M., Malnoe A. Mode of action of the regulatory protein calmodulin. // Metal ions in biological systems. NY.: Basel, 1984, V. 17, pp. 215273.

42. Crompton M., Capano M., Carafoli E. The sodium-induced efflux of calcium from heart mitochondria. A possible mechanism for the regulation of mitochondrial calcium. // Eur. J. Biochem., 1976, V. 69, pp. 453-462.

43. Crompton M., Ellinger H., Costi A. Inhibition by cyclosporin A of a Ca2+-dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress. // Biochem. J., 1988, V. 255, pp. 357-360.

44. Deamer D.W. and Cornwell D.G. Calcium action on fatty acid and phospolipid monolayers and its relation to the cell membrane. // Biochim. Biophys. Acta., 1966, V. 116, pp. 555-562.

45. DePaoli-Roach AA, Roach PJ, Lamer J. Rabbit skeletal muscle phosphorylase kinase. Comparison of glycogen synthase and phosphorylase as substrates. // J Biol Chem., 1979, V. 254, pp. 4212-4219.

46. Earnshaw WC, Martins LM, Kaufmann SH. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. // Annu. Rev. Biochem., 1999, V. 68, pp. 383-424

47. Epps D.E., Palmer J.W., Schmid H.H., Pfeiffer D.R. Inhibition of permeability-dependent Ca2+ release from mitochondria by N-acylethanolamines, a class of lipids synthesized in ischemic heart tissue. // J. Biol. Chem., 1982, V. 257, pp. 1383-1391.

48. Eriksson O, Saris NE. The phospholipase A2-induced increase in the permeability of phospholipid membranes to Ca2+ and H+ ions. // Biol. Chem. Hoppe Seyler, 1989, V. 370, pp. 1315-1320.

49. Farber J.L. Biology of disease: membrane injury and calcium homeostasis in the pathogenesis of coagulative necrosis. // Lab. Invest, 1982, V. 47, pp. 114-123.

50. Fiskum G., Lehninger A.L. The mechanism and regulition of mitochondrial Ca2+ transport. //Fed. Proc., 1980, V. 39, pp. 2433-2436.

51. Fiskum G., Reynafarye В., Lehninger A.L. The electric charge stechiometry of respiration-dependent Ca2+ uptake by mitochondria. // J. Biol. Chem., 1979, V. 251, pp. 6288-6295.

52. Folch I., Lees M., Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. // J.Biol. Chem., 1957, V. 226, pp. 497-509.

53. Gasnier F, Louisot P, Gateau-Roesch O. Galactosyltransferase activities in mitochondria outer membrane: biosynthesis of galactosylated proteins. // Int. J. Biochem., 1989, V. 21, pp. 173-181.

54. Gateau-Roesch O, Pavlov E, Lazareva AV, Limarenko EA, Levrat C, Saris NE, Louisot P, Mironova GD. Calcium-binding properties of the mitochondrial channel-forming hydrophobic component. // J. Bioenerg.Biomembr., 2000, V. 32, pp.105-110.

55. Gillis J.M. Relaxation of vertebrate skeletal muscle: A synthesis of the biochemical and physiological approaches. // BBA, 1985, V. 811, pp. 97-145.

56. Gogvadze V.G., Brustovetsky N.N., Zhukova A.A. The role of phospholipase A2 in lipid peroxidation-induced fall of membrane potential of rat liver mitochondria. // FEBS Lett., 1990, V. 264, pp. 168-170.

57. Greehavalt I.W., Rossi C.S., Lehninger A.L. Effect of active accumulation of calcium and phosphate ions on the structure of rat liver mitochondria. // J. Cell Biol., 1964, V. 23, pp. 21-38.

58. Gunter Т.Е., Pfeiffer D.R. Mechanisms by which mitochondria transport calcium. // Am. J. Physiol., 1990, V. 258, C755-786.

59. Halestrap A.P. Interactions between oxidative stress and calcium overload on mitochondrial function. In: Mitochondria: DNA, proteins and disease. London: Portland press., 1994, pp. 113-142.

60. Halestrap A.P. The regulation of the matrix volume of mammalian mitochondria in vivo and in vitro and its role in the control of mitochondrial metabolism. // Biochim. Biophys. Acta., 1989, V. 973, pp. 355-382.

61. Halestrap Andrew P, Gavin P. McStay, Samantha J. Clarke. The permeability transition pore complex: another view // Biochemie, 2002, V. 84, pp. 153-166.

62. Halestrap AP. Regulation of mitochondrial metabolism through changes in matrix volume. // Biochem. Soc. Trans., 1994, V. 22, pp. 522-529.

63. Hallaq H., Smith T.W., Leaf A. Modulation of dihydropyridine-sensitive calcium channels in heart cells by fish oil fatty acids. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, V. 89, pp. 1760-1764.

64. Haunstetter A, Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease. // Circ Res., 1998, V. 82, pp. 1111-1129.

65. Haworth R.A., Hunter D.R., Berkoff H.A. Na+ release Ca2+ from liver kidney and lung mitochondria. // FEBS Lett., 1980, V. 110, pp. 216-218.

66. Haworth RA, Hunter DR. Allosteric inhibition of the Ca2+-activated hydrophilic channel of the mitochondrial inner membrane by nucleotides. // J. Membr. Biol., 1980, V. 54, pp. 231-2316.

67. Hefford M.A., Evans R.M., Oda G., Kaplan H. Unusual chemical properties of N-terminal histidine residues of glucagon and vasoactive intestinal peptide. // Biochemistry, 1985, V. 24, pp. 867-874.

68. Hille B. In: Ionic channels of exitable membranes, 2nd ed. Sinauer Ass., Sunderland, Mass., 1992.

69. Horvath LI, Drees M, Beyer K, Klingenberg M, Marsh D. Lipid-protein interactions in ADP-ATP carrier/egg phosphatidylcholine recombinants studied by spin-label ESR spectroscopy. // Biochemistry, 1990, V. 29, pp. 10664-10669.

70. Hunter D.R., Haworth R.A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. // Arch. Biochem. Biophys., 1979, V. 195, pp. 453-459.

71. Hunter D.R., Haworth R.A., Southard J.H. Relationship between configuration, function, and permeability in calcium-treated mitochondria. // J. Biol. Chem., 1976, V. 251, pp. 5069-5077.

72. Hunter F.E. Jr., Ford L. // J. Biol. Chim., 1955, V. 216, pp. 357-369.

73. Hutson S.M., Berkich D„ Williams G.D., LaNoue K.F., Briggs R.W. 31P NMR visibility and characterization of rat liver mitochondrial matrix adenine nucleotides. // Biochemistry, 1989, V. 28, pp. 4325-4332.

74. Jacobus W.E., Tiozzo R., Lugli G., Lehninger A.L., Carafoli E. Aspects of energy-linked influx of calcium into heart mitochondria. // Eur. J. Biochem., 1976, V. 69, pp. 429-434.

75. Kagan VE, Fabisiak JP, Shvedova AA, Tyurina YY, Tyurin VA, Schor NF, Kawai K. Oxidative signaling pathway for externalization of plasma membrane phosphatidylserine during apoptosis. // FEBS Lett., 2000, V. 477, pp. 1-7.

76. Кос EC, Burkhart W, Blackburn K, Moyer MB, Schlatzer DM, Moseley A, Spremulli LL. The large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Analysis of the complement of ribosomal proteins present. // J. Biol. Chem., 2001, V. 276, pp. 43958-43969

77. Kong J.Y., Rabkin S.W. Palmitate-induced apoptosis in cardiomyocytes is mediated through alterations in mitochondria: prevention by cyclosporin A. // Biochim. Biophys. Acta, 2000, V. 1485, pp. 45-55.

78. Kowaltowski AJ, Castilho RF, Vercesi AE. Mitochondrial permeability transition and oxidative stress. // FEBS Lett., 2001, V. 495, pp. 12-15.

79. Kretsinger R.H., Nelson D.J. Calcium in biological systems. // Coord. Chem. Rev., 1979, V. 18, pp. 29-124.

80. Kroemer G, Dallaporta B, Resche-Rigon M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. // Annu. Rev. Physiol., 1998, V. 60, pp. 619-642

81. Kroemer G, Reed JC. Mitochondrial control of cell death. // Nat. Med., 2000, V.6, pp. 513-519.

82. Kuo Т.Н., Moore K.H., Giacomelli F., Wiener J. Defective oxidative metabolism of heart mitochondria from genetically diabetic mice. // Diabetes, 1983, V. 32, pp. 781-787.

83. Lapidus R.G., Sokolove P.M. The mitochondrial permeability transition. Interactions of spermine, ADP, and inorganic phosphate. // J. Biol. Chem., 1994, V. 269, pp. 18931-18936.

84. Leavis P.C., Gergely J. Thin filament proteins and thin filament-linked regulation of vertebrate muscle contraction. // CRC Crit. Rev. Biochem., 1984, V. 16, pp. 235303.

85. Lehninger A.L. Ca2+ transport by mitochondria and its possible role in the cardiac contraction, relaxation cycle. // Supplement to Circulation Research, 1974, V. 34, 35, pp. 83-90.

86. Lehninger A.L., Carafoli E., Rossi C.S. Energy-linked ion movements in mitochondrial systems. // Adv. Enzymol., 1967, V. 29, pp. 259-320.

87. Lemasters J.J., Nieminen A.L., Qian Т., Trost L.C., Herman B. The mitochondrial permeability transition in toxic, hypoxic and reperfusion injury. // Mol. Cell. Biochem., 1997, V. 174, pp. 159-165.

88. Levrat C, Louisot P. Increase of mitochondrial PLA2-released fatty acids is an early event in tumor necrosis factor alpha-treated WEHI-164 cells. // Biochem Biophys Res Commun., 1996, V. 221, pp. 531-538

89. Li J, Gao H, Guo Z. Laryngeal function preserving surgery in hypopharyngeal carcinoma. // Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi., 1999, V. 34, pp. 311-313.

90. Listenberger L.L., Ory D.S., Schaffer J.E. Palmitate-induced apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway. // J. Biol. Chem., 2001, V. 276, pp. 14890-14895.

91. Lutz W.K., Wipf H.-K., Simon W. Alkalikationen-spezifitat und trager-eigenshaften der antibiotica nagericin unt monensin. // Helvetica chimica acta, 1970, V. 53, pp. 17411746.

92. Malkevitch N.V., Dedukhova V.I.,Simonian R.A., Skulachev V.P. and Starkov A.A. Thyroxine induces cyclosporin A-insensitive, Ca2+ -dependent reversible permeability transition pore in rat liver mitochondria. // FEBS Lett., 1997, V. 412, pp. 173-178.

93. Martin B. Bioinorganic chemistry of calcium. // Metal ions in biological systems. N.Y. Basel, 1984, V. 17, pp. 2-28.

94. McCormack J.G., Halestrap A.P., Denton R.M. Role of calcium ions in regulation of mammalian intramitochondrial metabolism. // Physiol. Rev., 1990, V. 70, pp. 391-425.

95. Mela L. Inhibition and activation of calcium transport in mitochondria. Effect of lantanides and local anesthetic drugs. // Biochemistry, 1969, V. 8, pp. 2481-2486.

96. Messineo F.C. The possible role of endogenous amphiphiles in the membrane abnormalities of ischemic and reperfused myocardium. // Am. J. Emerg. Med., 1983, V. l,pp. 162-167.

97. Mironova G.D, Lazareva A, Gateau-Roesch O, Tyynela J, Pavlov Y, Vanier M, Saris NE. Oscillating Ca2+-induced channel activity obtained in BLM with a mitochondrial membrane component. // J. Bioenerg. Biomembr., 1997, V. 29, 561569.

98. Mironova G.D. Planar lipid bilayers (BLMs) and their applications. 2003, pp. 489515.

99. Mironova GD, Sirota TV, Pronevich LA, Trofimenko NV, Mironov GP, Grigorjev PA, Kondrashova MN. Isolation and properties of Ca2+-transporting glycoprotein and peptide from beef heart mitochondria. // J. Bioenerg. Biomembr., 1982, V. 14, pp.213-225.

100. Motulsky H, "The GraphPad Guide to Analyzing Radioligand Binding Data". Publ.: GraphPad software, Inc. 1995.

101. Natarajan V., Schmid P.C., Schmid H.H. N-acylethanolamine phospholipid metabolism in normal and ischemic rat brain. // Biochim. Biophys. Acta, 1986, V. 878, pp. 32-41.

102. Nazareth W, Yafei N, Crompton M. Inhibition of anoxia-induced injury in heart myocytes by cyclosporin A. // J. Mol. Cell Cardiol., 1991, V. 23, pp. 1351-1354.

103. Nepomuceno M.F., Pereira-da-Silva L. Effect of cyclosporin A and trifluoperazine on rat liver mitochondria swelling and lipid peroxidation. // Braz. J. Med. Biol. Res., 1993, V. 26, pp. 1019-1023.

104. Nicholls D.G. The regulation of extramitochondrial free calcium ion concentration by rat liver mitochondria. // Biochem. J., 1978, V. 176, pp. 463-474.

105. Nixon M., Chan S.H. A simple and sensitive colorimetric method for the determination of long-chain free fatty acids in subcellular organelles. // Anal. Biochem., 1979, V. 97, pp. 403-409.

106. Novgorodov S.A., Gudz T.I., Milgrom Y.M., Brierley G.P. The permeability transition in heart mitochondria is regulated synergistically by ADP and cyclosporin A. // J. Biol. Chem., 1992, V. 267, pp. 16274-16282.

107. O'Doherty J., Youmans S.J., Armstrong W., Stark R.J. Calcium regulation during stimulus secretion coupling: Continious measurement of intracellular calcium activities. // Science, 1980, V. 209, pp. 510-513.

108. Okayasu Т., Curtis M.T., Farber J.L. Structural alterations of the inner mitochondrial membrane in ischemic liver cell injury. // Arch. Biochem. Biophys., 1985, V. 236, pp. 638-645.

109. Ostrander DB, Sparagna GC, Amoscato AA, McMillin JB, Dowhan W. Decreased cardiolipin synthesis corresponds with cytochrome с release in palmitate-induced cardiomyocyte apoptosis. // J. Biol. Chem., 2001, V. 276, pp. 38061-38067.

110. Owens К., Pang D.C., Weglicki W.B. Production of lysophospholipids and free fatty acids by a sarcolemmal fraction from canine myocardium. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, V. 89, pp. 368-373.

111. Pedersen PL, Coty WA. Energy-dependent accumulation of calcium and phosphate by purified inner membrane vesicles of rat liver mitochondria. // J. Biol. Chem., 1972, V. 247, pp. 3107-3113.

112. Petronilli V., Cola C., Massari S., Colonna R., Bernardi P. Physiological effectors modify voltage sensing by the cyclosporin A-sensitive permeability transition pore of mitochondria. // J. Biol. Chem., 1993, V. 268, pp. 21939-21945.

113. Pfeiffer DR, Schmid PC, Beatrice MC, Schmid HH. Intramitochondrial phospholipase activity and the effects of Ca2+ plus N-ethylmaleimide on mitochondrial function. // J. Biol. Chem., 1979, V. 254, pp. 11485-11494.

114. Phillips M. C. The physical state of phospholipids and cholesterol in monolayers, bilayers and membranes. In: Progress in surface and membrane science N. Y.: Acad. Press, 1972, V. 5, pp. 139.

115. Pietsch A. and Lorenz R.L. Rapid separation of the major phospholipid classes on a single aminopropyl cartridge. // Lipids, 1993, V. 28, pp. 945-947.

116. Puskin J.S., Gunter Т.Е., Gunter K.K., Russell P.R. Evidence for more than one2+

117. Ca transport mechanism in mitochondria. // Biochemistry, 1976, V. 15, pp. 38343842.

118. Raaflaub J. // Helv. Physiol. Acta, 1953, V. 11, pp. 142-156.

119. Racker E. Fluxes of Ca2+ and concepts. // Federation proceedings, 1980, V. 39, pp. 2422-2426.

120. Rasmussen H. Cell communication, calcium ion, and cyclic adenosine monophosphate. // Science, 1970, V. 170, pp. 404-412.

121. Rasmussen H., Waisman D.M. Modulation of cell function in the calcium messenger system. // Rev. Physiol. Biochem. and Pharmacol., 1983, V. 95, pp. 111148.

122. Rasmussen H., Waisman D.M. The messenger function of calcium in endocrine systems. // Biochem. Act. Horm., 1981, V. 8, pp. 111-115.

123. Ray Т.К., Skipski V.P., Barclay M., Essner E., Archibald F.M. Lipid composition of rat liver plasma membranes. // J. Biol. Chem., 1969, V. 244, pp. 5528-5536.

124. Reed JC, Kroemer G. Mechanisms of mitochondrial membrane permeabilization. // Cell Death. Differ., 2000, V. 7, pp. 1145.

125. Renkonen O. Mono- and dimethyl phoshatidates from different subtypes of choline and ethanolamine glycerophosphatides. // BBA, 1968, V. 152, pp. 114-135.

126. Richter C. In: Molecular mechanisms in bioenergetics. L. Ersner (Ed.), Elsevier science publishers B.V., 1992, pp. 349-358.

127. Rizzuto R., Pitton G., Azzone G.F. Effect of Ca2+, peroxides, SH reagents, phosphate and aging on the permeability of mitochondrial membranes. // Eur. J. Biochem., 1987, V. 162, pp. 239-249.

128. Roman I., Gmaj P., Nowicka C., Angielski S. Regulation of Ca2+ efflux from kidney and liver mitochondria by unsaturated fatty acids and Na+ ions. // Eur. J. Biochem., 1979, V. 102, pp. 615-623.

129. Rossi G.S., Vasington F.D., Carafoli E. The effect of ruthenium red on the uptake and release of Ca2+ by mitochondria. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1973, V. 50, pp. 846-852.

130. Rustenbeck I., Munster W., Lenzen S. Relation between accumulation of phospholipase A2 reaction products and Ca2+ release in isolated liver mitochondria. // Biochim. Biophys. Acta, 1996, V. 1304, pp. 129-138.

131. Ryffel В., Donatsch P., Gotz U., Tschopp M. Cyclosporin receptor on mouse lymphocytes. // Immunology, 1980, V. 41, pp. 913-919.

132. Saltarelli M.D., Yamada K., Coyle J.T. Phospholipase A2 and 3H-hemicholinium-3 binding sites in rat brain: a potential second-messenger role for fatty acids in the regulation of high-affinity choline uptake. // J. Neurosci., 1990, V. 10, pp. 62-72.

133. Saris N.-E., Sirota T.V., Virtanen I., Niva K., Penttila Т., Dolgachova L.P., Mironova G.D. Inhibition of the mitochondrial calcium uniporter by antibodies against a 40 kDa glycoprotein. // Bioenerg. Biomembr., 1993, V. 25, pp. 307-312.

134. Scarpa A., Azzone G.F. The mechanism of ion translocation in mitochondria. 4. Coupling of K+ efflux with Ca2+ uptake. // Eur. J. Biochem., 1970, V. 12, pp. 328335.

135. Schonfeld P, Bohnensack R. Fatty acid-promoted mitochondrial permeability transition by membrane depolarization and binding to the ADP/ATP carrier. // FEBS Lett., 1997, V. 420, pp. 167-170.

136. Schonfeld P., Struy H. Refsum disease diagnostic marker phytanic acid alters the physical state of membrane proteins of liver mitochondria. // FEBS Lett., 1999, V. 457, pp. 179-183.

137. Sharpe М., Perin I., Tattrie В., Nicholls P. Ligation, inhibition, and activation of cytochrome с oxidase by fatty acids. // Biochem. Cell. Biol., 1997, V. 75, pp. 7179.

138. Sharpe M., Perin I., Wrigglesworth J., Nicholls P. Fatty acids as modulators of cytochrome с oxidase in proteoliposomes. // Biochem. J., 1996, V. 320, pp. 557561.

139. Shears S.B. The thyroid gland and the liver mitochondrial protonic electrochemical potential difference: a novel hormone action? // J. Theor. Biol., 1980, V. 82, pp. 113.

140. Shimabukuro M., Zhou Y.T., Levi M., Unger R.H. Fatty acid-induced beta cell apoptosis: a link between obesity and diabetes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, V. 95, pp. 2498-2502.

141. Shimojo T. and Ohno K. Colomn chromatography of different cationic forms of cardiolipin. // J. Biochimistry, 1966, V. 60, pp. 462-466.

142. Skulachev V.P. Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation. // FEBS Lett., 1991, V. 294, pp. 158-162.

143. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. // Biochim. Biophys. Acta., 1998, V. 1363, pp. 100-124.

144. Sliepchevich D, Kriukova IV, Kandror VI, Gol'ber LM. Role of the increase in the free fatty acid level of blood in the pathogenesis of certain manifestations of thyrotoxicosis. // Patol Fiziol Eksp Ter., 1973, V. 17, pp. 51-56.

145. Sokolove P.M., Haley L.M. Butylated hydroxytoluene and inorganic phosphate plus Ca2+ increase mitochondrial permeability via mutually exclusive mechanisms. // J. Bioenerg. Biomembr., 1996, V. 28, pp. 199-206.

146. Sokolove P.M., Kinnally K.W. A mitochondrial signal peptide from Neurospora crassa increases the permeability of isolated rat liver mitochondria. // Arch. Biochem. Biophys., 1996, V. 336, pp. 69-76.

147. Solem L.E., Wallace K.B. Selective activation of the sodium-independent, cyclosporin A-sensitive calcium pore of cardiac mitochondria by doxorubicin. // Toxicol. Appl. Pharmacol., 1993, V. 121, pp. 50-57.

148. Sparagna G.C., Hickson-Bick D.L., Buja L.M., McMillin J.B. A metabolic role for mitochondria in palmitate-induced cardiac myocyte apoptosis. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2000, V. 279, pp. 2124-2132.

149. Sultan A., Sokolove P.M. Free fatty acid effects on mitochondrial permeability: an overview. //Arch. Biochem. Biophys., 20016, V. 386, pp. 52-61.

150. Sultan A., Sokolove P.M. Palmitic acid opens a novel cyclosporin A-insensitive pore in the inner mitochondrial membrane. // Arch. Biochem. Biophys., 2001a, V. 386, pp. 37-51.

151. Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I, Brenner C, Larochette N, Prevost MC, Alzari PM, Kroemer G. Mitochondrial release of caspase-2 and -9 during the apoptotic process. // J. Exp. Med., 1999, V. 189, pp. 381-394.

152. Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I, Snow BE, Brothers GM, Mangion J, Jacotot E, Costantini P, Loeffler M, Larochette N, Goodlett DR, Aebersold R,

153. Siderovski DP, Penninger JM, Kroemer G. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. //Nature 1999, V. 397, pp. 441-446.

154. Szabo I., Bernardi P., Zoratti M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. // J. Biol. Chem., 1992, V. 267, pp. 2940-2946.

155. Tsokos J., Cornwell Т.Е., Volsuk G. Ca2+ efflux from liver mitochondria induced by a decrease in extramitochondrial pH. // FEBS Lett., 1980, V. 119, pp. 297-300.

156. Turakulov IaKh, Abidov AA, Rakhimdzhanova MT. Free fatty acid metabolism in the myocardium in thyrotoxicosis. // Vopr. Med. Khim., 1973, V. 19, pp. 212-214.

157. Ulloth JE, Casiano С A, De Leon M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC 12 cells. // J. Neurochem., 2003, V. 84, pp. 655-668.

158. Usher J.R., Epand R.M., Papahadjopoulos D. The effect of free fatty acids on the thermotropic phase transition of dimyristoyl glycerophosphocholine. // Chem. Phys. Lipids, 1978, V. 22, pp. 245-253.

159. Vasington F.D., Murphy J.V. Ca2+ uptake by rat kidney mitochondria and its dependence on respiration and phosphorylation. // J. Biol. Chem., 1962, V. 237, pp. 2670-2672.

160. Vik-Mo H, Mjos OD. Influence of free fatty acids on myocardial oxygen consumption and ischemic injury. // Am. J. Cardiol., 1981, V. 48, pp. 361-365

161. Villallonga F. Surface chemistry of L-a-dipalmithoyl lecithin at the air-water interface. // Biochim. Biophys. Acta., 1968, V. 163, pp. 290-300.

162. Vork M.M., Glatz J.F., van der Vusse G.J. Release of fatty acid-binding protein and long chain fatty acids from isolated rat heart after ischemia and subsequent calcium paradox. // Mol. Cell. Biochem., 1993, V. 123, pp. 175-184.

163. Wharton, D.C. and Tzagoloff, A. Cytochrome oxidase from beef heart mitochondria. // Methods in Enzymology, 1967, V. 10, pp. 245-250

164. Wieckowski M.R., Wojtczak L. Fatty acid-induced uncoupling of oxidative phosphorylation is partly due to opening of the mitochondrial permeability transition pore. // FEBS Lett .,1998, V. 423, pp. 339-342.

165. Williams R. J. P. // Biological membranes, Clarendon Press, Oxford, 1975, pp. 107120.

166. Wojtczak A.B. Inhibitory action of oxaloacetate on succinate oxidation in rat-liver mitochondria and the mechanism of its reversal. // Biochim. Biophys. Acta, 1969, V. 172, pp. 52-65.

167. Wojtczak L., Schonfeld P. Effect of fatty acids on energy coupling processes in mitochondria. //Biochim. Biophys. Acta, 1993, V. 1183, pp. 41-57.

168. Wojtczak L., Wieckowski M.R., Schonfeld P. Protonophoric activity of fatty acid analogs and derivatives in the inner mitochondrial membrane: a further argument for the fatty acid cycling model. // Arch. Biochem. Biophys., 1998, V. 357, pp. 7684.

169. Zaloga G.P., Willey S., Tomasic P., Chernow B. Free fatty acids alter calcium binding: a cause for misinterpretation of serum calcium values and hypocalcemia in critical illness. // J. Clin. Endocrinol. Metab., 1987, V. 64, pp. 1010-1014.

170. Zhou YT, Grayburn P, Karim A, Shimabukuro M, Higa M, Baetens D, Orci L, Unger R.H. Lipotoxic heart disease in obese rats: implications for human obesity. // Proc Natl Acad Sci U S A., 2000, V. 97, pp. 1784-1789.

171. Zoratti M., Szabo I. The mitochondrial permeability transition. // Biochim. Biophys. Acta., 1995, V. 1241, pp. 139-176.