Митохондриальная пальмитат/Ca2+- активируемая циклоспорин A- нечувствительная пора: свойства и возможная физиологическая значимость

Белослудцева, Наталья Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Митохондриальная пальмитат/Ca2+- активируемая циклоспорин A- нечувствительная пора: свойства и возможная физиологическая значимость
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Митохондриальная пальмитат/Ca2+- активируемая циклоспорин A- нечувствительная пора: свойства и возможная физиологическая значимость"

На правах рукописи

БЕЛОСЛУДЦЕВА Наталья Валерьевна

Митохондриальная пальмитат/Са2+- активируемая циклоспорин А- нечувствительная пора: свойства и возможная физиологическая значимость

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003457947

Пущино - 2008

003457947

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Миронова Галина Дмитриевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Звягильская Рената Александровна

доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского при МГУ, Москва.

Защита состоится «25» декабря 2008 г. в «15 ч. 30 мин.» на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу:

142290 Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН.

Автореферат разослан «24» ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Смолихина Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ионы кальция, как известно, являются одним из ключевых регуляторов внутриклеточных, и, в частности, митохондриальных процессов. Однако избыточное накопление этих ионов в митохондриях может привести к появлению неспецифичсской проницаемости внутренней мембраны органелл и последующей клеточной гибели (Zoratti et al., 2005; Bernardi et al.,

2006). Поэтому изучение процессов, связанных с нарушением мембранной проницаемости митохондрий при аккумуляции этими органеллами ионов Са2+, является весьма актуальной проблемой.

Согласно современным представлениям, возникновение неселективной проницаемости мембран митохондрий связано с образованием Са2+-активируемой поры, или MPT (Mitochondrial Permeability Transition pore). Традиционная точка зрения на природу этого процесса состоит в том, в присутствии Са2+ происходит открытие мультибелкового трансмембранного мегаканала, способного пропускать вещества с м.м. < 1.5 кДа, а также ингибироваться циклоспорином А (ЦсА) (Zoratti and Szabo, 1995; Zoratti et al., 2005; Halestrap, 2006; Leung et al., 2008). Однако недавно было показано, что пальмитиновая кислота (ПК) и низкие концентрации Са2+ вызывают открытие ЦсА-нечувствительной митохондриальной поры, механизм образования которой, вероятно, отличается от общепризнанного (Sultan and Sokolove, 2001).

В нашей лаборатории развивается представление о том, что митохондриальная пора, активируемая пальмитатом и Са2+, имеет липидную природу (Mironova et al., 2001, 2004; Белослудцев и др., 2005). В основе этого предположения лежит тот факт, что ПК обладает способностью связывать со сродством, которое на 1-2 порядка выше, чем сродство ненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов и других липидов, и сравнимо со сродством к Са + ряда белков (Mironova et al, 2001). Механизм образования поры может быть объяснен в свете полученных недавно данных о том, что связывание анионов ПК с Са2+ в модельной мембране вызывает фазовую сегрегацию жирной кислоты в твердые мембранные домены. Это ведет к фазовому переходу в липидном бислое и формированию липидных пор (Agafonov et al.,

2007). В соответствии с теорией образования липидных пор, пальмитат/Са2+-активируемая пора способна самопроизвольно закрываться.

Несмотря на весомые доказательства липидной природы пальмитат/Са2+-активируемой поры, механизмы регуляции поры до конца неясны. В связи с этим, особый интерес представляет выяснение вопроса, как липидное окружение влияет на образование поры в мембране.

Актуальность изучения функционирования и регуляции липидной короткоживущей пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях связана с тем, что пора может играть ключевую роль в целом ряде физиологических и патологических процессов. Так, показано, что открытие этой поры в митохондриях может иметь непосредственное отношение к механизму пальмитат-индуцированного апоптоза (Belosludtsev et al., 2006), обнаруженного недавно в культуре клеток (Kong and Rabkin, 2000). Предполагается также, что Са2+-активируемая пора может функционировать и при физиологических

условиях, когда необходим быстрый выброс Са2+ из митохондрий. В этом случае функционирование короткоживущей поры может приводить к колебанию ионных потоков через внутреннюю митохондриальную мембрану, которые наблюдают при добавлении к клеткам и суспензии митохондрий ионов Са2+ или Sr2+ (Evtodienko et al., 1994).

Следует подчеркнуть, что концентрация свободной ПК, необходимая для образования ЦсА-нечувствительной поры в митохондриальных мембранах, близка к таковой при физиологических условиях (Le-Quoc and Le-Quoc, 1989; Mironova et al., 2004). Более того, уровень пальмитата в митохондриях может увеличиваться при изменении физиологического состояния организма и при некоторых патологиях, в частности при ишемическом повреждении тканей (Vork et al., 1993; Mironova et al., 2004), диабете (DeFronzo et al., 2004) и других. Это позволило предположить, что образование пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях может усиливаться при изменении физиологических условий, а также при патологиях.

Целью настоящей работы является изучение свойств митохондриальной пальмитат/Са2+-активируемой циклоспорин А-нечувствительной поры и выяснение ее возможной физиологической значимости. Задачи исследования:

1. Исследовать свойства пальмитат/Са2+-активируемой поры, а именно влияние на процесс образования поры в мембране липидов - холестерина и кардиолипина, а также модификации SH-групп митохондриальных белков.

2. Изучить возможность рециклизации ионов Са2+ в митохондриях при образовании пальмитат/Са2+-активируемой поры как в присутствии добавленной пальмитиновой кислоты, так при накоплении эндогенных жирных кислот в результате активации фосфолипазы А2.

3. Определить возможность выхода из митохондрий апоптоз-идуцирующего фактора (АИФ) в условиях образования пальмитат/Са2+-активируемой поры.

4. Определить влияние ненасыщенных жирных кислот, предупреждающих вызываемый пальмитатом апоптоз в культуре клеток, на образование пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях и липосомах.

5. Исследовать параметры функционирования митохондриальной пальмитат/Са2+-активируемой поры в зависимости от типа ткани, возраста животного, а также его устойчивости к условиям гипоксии.

Научная новизна работы. В работе впервые показано, что формирование в мембране пальмитат/Са2+-активируемой поры усиливается в присутствии кардиолипина, а кардиолипин-связывающий агент, ЮМ-нонил акридиновый оранжевый, ингибирует открытие поры в митохондриях, не оказывая при этом существенного влияния на параметры дыхания и поглощение Са2+ органеллами. Впервые установлено, что холестерин, встроенный в мембраны липосом и митохондрий, облегчает образование в них пальмитат/Са2+-индуцируемой поры, в то время как модификация SH-rpynn митохондриальных белков дитиотреитолом и тимеросалом не влияет на ее открытие. Предложена новая модель функционирования кальциевого цикла в митохондриях, в котором вход иона осуществляется через Са2+-унипортер, а

выход - через временно образующиеся в мембране липидные поры, индуцируемые ПК и Са2+. Рециклизация ионов Са2+ при открытии таких пор может происходить как в условиях добавленной жирной кислоты, так и при ее вероятном образовании в случае активации фосфолипазы А2. Впервые показано, что в результате открытия поры происходит выход из митохондрий апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ), что может быть индикатором участия нальмитат-активируемой поры в механизме каспаз-независимой гибели клетки. Установлено, что чувствительность митохондрий печени крысы к индукторам поры - ПК и Ca2t - усиливается с возрастом и при адаптации животного к условиям гипоксии. Митохондрии сердца крысы также подвергаются ЦсА-нечувствителыюму пальмитат/Са2+-индуцирусмому набуханию, вызванному образованием поры, однако по сравнению с митохондриями печени, это набухание имеет меньшую амплитуду и скорость.

Научно-практическое значение работы. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах функционирования митохондрий в норме и при патологиях, связанных с нарушением кальциевого гомеостаза клетки и накоплением свободных жирных кислот. Результаты диссертации могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в области биоэнергетики, а также в дальнейшем найти применение в медицине при разработке фармакологических препаратов, так как в настоящее время показано, что повышение уровня насыщенных жирных кислот, в первую очередь пальмитиновой, и Са +-зависимая митохондриальная пора вовлечены в индукцию ряда патофизиологических явлений, таких как апоптоз, ишемия, нейродегенеративные заболевания, диабет и другие.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4 и 5-ой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005, 2008); XX Съезде Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); 8 - 12-ой школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2004-2008); на международных конференциях Biological motility (Pushchino, 2008); «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007); FEBS Congress (Poland, 2004; Austria, 2007); International Conference «Mitochondrial Physiology» (Austria, 2005; London, 2007); VIII World Congress International society for adaptive medicine (ISAM) (Moscow, 2006); 2nd Symposium International Nutrition (Paris, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 5 таблицами. Список литературы включает 255 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Митохондрии выделяли из печени и сердца белых крыс линии Wistar общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Среда для выделения митохондрий печени содержала 210 мМ маннитол, 70 мМ сахарозу,

1 мМ ЭДТА, 10 мМ Hepes-KOH (рН 7.4); для выделения митоходрий сердца -220 мМ маннитол, 50 мМ сахарозу, 2 мМ ЭДТА, 0.5 % БСА, 30 мМ Hepes-Tris (рН 7.4).

Оценка функциональных параметров митохондрий. Дыхание митохондрий оценивали с помощью кислородного электрода Кларка и полярографа. Среда инкубации содержала 120 мМ КС1, 5 мМ NaH2P04, 5 мМ сукцинат калия, 2 мкМ ротенон, 10 мМ Hepes-KOH, рН 7.4. Концентрация белка в ячейке ~1 мг/мл.

Мембранный потенциал митохондрий оценивали по перераспределению катионов тетрафенилфосфония (ТФФ+) (1 мкМ) через внутреннюю митохондриальную мембрану с помощью ТФФ+-чувствительного электрода. Концентрацию Са2+ в среде определяли с помощью Са2+-селективного электрода. Измерение [Са ] и [ТФФ+] в среде проводили одномоментно, с помощью многоканальной системы Record 4 в кювете объемом 1 мл при постоянном перемешивании и термостатировании (25 С). Среда инкубации содержала 210 мМ маннитол, 70 мМ сахарозу, 5 мМ янтарную кислоту, 5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенон, 1 мкМ ЦсА, 10 мМ Hepes-KOH, рН 7.4. Концентрация митохондриального белка в кювете была ~1 мг/мл.

Набухание органелл регистрировали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий при длине волны 540 нм при постоянном перемешивании и термостатировании при 25°С на спектрофлуорометрической оптоволоконной оптической системе «Ocean Optics USB 2000». Среда инкубации содержала 210 мМ маннитол, 70 мМ сахарозу, 5 мМ янтарную кислоту, 5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенон, 1 мкМ ЦсА, 10 мМ Hepes-KOH (рН 7.4). Концентрация митохондриального белка в кювете 0.4 мг/мл. Скорость набухания митохондрий (Vmax = ДА54о/мин на 1 мг белка) рассчитывали как изменение поглощения в течение первых 30 с с начала высокоамплитудного набухания. При использовании различных модуляторов скорость набухания выражена в процентах от средней скорости набухания, регистрируемой в контрольных экспериментах.

Электрофорез и иммуноблотинг апоптоз-индуцирующего фактора. Фракционирование белков митохондрий проводили с помощью SDS-PAAG (12% гель) электрофореза с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрана блокировалась 2% обезжиренным молоком в PBS буфере, и инкубировалась затем с антителами к АИФ (1:1000) (Sigma-Aldrich, США). Мембрана отмывалась и инкубировалась со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:1000). После промывки АИФ выявляли с помощью пероксидазной реакции с диаминобензидином в присутствии 0.02% перекиси водорода.

Формирование и измерение проницаемости однослойных липосом, загруженных сульфородамином Б. Однослойные липосомы, загруженные сульфородамином Б, получали общепринятым методом экструзии (Agafonov et al., 2003). Измерение неспецифической проницаемости липосомальной мембраны оценивалось по выходу красителя из липосом методом флуориметрии на спектрофлуориметре «Ocean Optics USB 2000» (длина волны

возбуждения - 565 нм; длина волны флуоресценции - 586 нм). Состав буфера: 10 мМ Трис-HCl (pH 8.5), 5 мкМ ЭГТА, и 40 мМ KCl. Концентрация азолектина в пробах составляла 50 мкМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Свойства поры, активируемо» пальмитатом и Са2+.

1.1. Влияние кардиолипина и кардиолипин-связываютего агента. ION-нонил акридинового оранжевого, на функционирование палыттат/Са2' -активируемой поры

Как известно, кардиолипин является одним из наиболее распространенных липидов внутренней митохондриальной мембраны (20-25 % всей массы мембранных липидов) и играет важную роль в поддержании структуры и функционирования органелл, а также вовлечен в процессы активации апоптоза клеток. В связи с этим, представлялось интересным изучить влияние этого фосфолипида на формирование липидной поры, вызываемой ПК и Са2+, в модельных и митохондриальных мембранах.

Было установлено, что пальмитат/Са2+-индуцируемая проницаемость липосом, сформированных из смеси кардиолипина (25 весовых %) и азолектина, существенно выше, по сравнению с проницаемостью липосом, образованных только из азолектина (рис. i).

В работе было исследовано также влияние агента, способного специфически связывать кардиолипин, 10-Л^нонил-3,6-бис(димстиламино) акридинового оранжевого (НАО), на процесс открытия ЦсА-нечувствительной пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях печени крысы (рис. 2)-Установлено, что кардиолипии-связывающий агент в невысоких концентрациях (2-8 нмоль/мг белка) дозо-зависимо ингибирует скорость набухания митохондрий, индуцированного ПК и Са2+ (рис. 2).

Рис. ¿. Влияние кардиолипина (25 весовых Рис. Д.. Влияние НАО на скорость ЦсА-

%) на образование пальмитат/Са2+- нечувствительного мигохондриального

активируемой поры в липосомах. Липосомы набухания, индуцированного 15 мкМ ПК

сформированы из азолектина (1) и нз смеси (30 нмоль/мг белка) и 30 мкМ Са

азолектин/кардиолипин (2). Добавки: 1 мМ (60 нмоль/мг белка). СаСЬ-

При этом НАО практически не влиял на скорости сукцинат-зависимого (V2) и разобщенного дыхания митохондрий печени крысы, но ингибировал скорость дыхания органелл в состоянии 3 на 30% и незначительно (на 13%) снижал скорость Са2+-стимулированного дыхания митохондрий. Поэтому сильное ингибирующее действие НАО на открытие пальмитат/Са2+-активируемой поры, по-видимому, может быть связано с изменением структуры и физического состояния кардиолипина в мембране при его связывании с агентом.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что изменение состояния и содержания кардиолипина в мембране может являться регуляторным механизмом формирования в ней поры, вызываемой ПК и Са2+. 1.2. Влияние холестерина на образование палъмитат/Са ' -активируемой поры в митохондриях печени крысы и липосомах

В работе исследовано также влияние известного модификатора мембран -холестерина на формирование в липосомах и митохондриях липидной поры, индуцируемой ПК и Са2+. Встраивание холестерина в мембраны митохондрий печени крысы проводилось путем его переноса в мембрану из комплекса холестерин-БСА по методу, разработанному Martinez et al, 1988. Данный метод нагрузки митохондрий холестерином приводит к увеличению его количества в митохондриях до 350-400% (Coleil et al, 2003), что составляет -20 % (моль/моль) от общего количества липида.

Как видно из рис. 3, включение ~20 % (моль/моль) холестерина в мембраны митохондрий и липосом приводит к достоверному увеличению как скорости пальмитат/Са2+-активируемого набухания митохондрий (~ на 15% при концентрации ПК выше 20 мкМ), так и ПК/Са2+-индуцированного выхода сульфородамина Б из липосом (~ на 20% при концентрации ПК выше 25 мкМ).

А Б

[ПК], мкМ

Рис. А. Влияние холестерина (-20 % (моль/моль)) на образование в митохондриях печени крысы (А) и липосомах (Б) пальмитат/Са2+-акгивируемой поры. А) - Зависимость скорости ПК/Са2+-индуцируемого набухания контрольных (без холестерина) (!) и нагруженных холестерином (2) митохондрий печени крысы от [ПК]. Набухание митохондрий индуцировалось 30 мкМ Са2+. Б) - Зависимость ПК/Са2+-индуцированного выхода сульфородамина Б из липосом от [ПК]. Липосомы сформированы из азолектина (1) и из смеси азолектин/холестерин (2). Добавки: 1 мМ СаСЬ.

В то же время, холестерин практически не влиял на параметры дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий в различных функциональных состояниях.

Как известно из литературы, добавление высоких концентраций холестерина (свыше 50%) к бислойной мембране приводит к тому, что точка фазового перехода мембраны «размывается» (Ohvo-Recila, 2002). Однако, фазовые превращения в бислое при хемотропных фазовых переходах могут происходить и при избытке молекул холестерина в результате того, что этому предшествует, как правило, фазовое разделение мембранных липидов (Антонов и др., 1992). Стоит отметить, что в наших экспериментах присутствие холестерина в мембране липосом достоверно увеличивало степень Са2+-индуцированной сегрегации ПК в липидном бислое. Это позволило предположить, что облегчение формирования поры в митохондриальных и липосомальных мембранах, включающих холестерин, по сравнению с мембранами без этого липида, имеет общий механизм, связанный с усилением процессов фазовой сегрегации ПК при добавлении Ca2f. Это предположение коррелирует с литературными данными о том, что липидные смеси, содержащие церамид, холестерин и ПК, остаются гетерогенными: образующиеся в мембране твердокрнсталличсские домены содержат комплексы ПК с Са2+, а жидкая фаза - холестерин и церамид (Arseneault and Lafleur, 2007).

1.3. Влияние SH-агептов на процесс ообразования падьмитат/Са2 ' -активируемой поры в митохондриях

Известно, что модификация SH-групп белковых молекул приводит, как правило, к изменению их активности. Согласно литературным и нашим данным, SH-окисляющие агенты вызывают открытие ЦсА-чувствителыюй белковой поры (МРТ), в то время как SH-восстанавливающие агенты ингибируют ее образование (Zoratti and Szabo, 1995).

В работе показано, что ни SH-окисляющий агент тимеросал (50 мкМ), ни SH-восстанавливающий агент дитиотреитол (2 мМ) не влияют на ЦсА-нсчувствительное набухание митохондрий, вызванное образованием пальмитат/Са2+-активирусмой поры. Таким образом, белки, модифицируемые SH-агентами, не принимают участия в образовании митохондриальной пальмитат/Са2+-активируемой поры.

Па основании данных этого раздела можно сделать вывод о том, что регуляция функционирования пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях будет осуществляться преимущественно за счет модификации липидного бислоя, а не белковых молекул.

2. Пальмитат/Са2+-активируемая пора как система выхода ионов Саг+ из митохондрий: возможная роль в митохондриальном кальциевом цикле

2.1. Активаиия рециклизации Со2* в митохондриях в условиях добавленной пальмитиновой кислоты

Следующей задачей работы являлось выяснение вопроса, может ли пальмитат/Са2+-активируемая пора участвовать в рециклизации ионов Са2+ в митохондриях. Приведенные ниже эксперименты подтверждают, что это так.

Так как открытие пальмитат/Са2+-активируемой поры сопровождается ее самопроизвольным закрытием, то появление неспецифической проницаемости митохондриальной мембраны после образования поры должно быть обратимым. Исследования показали, что после индукции ЦсА-нечувствительной поры небольшими концентрациями пальмитата и Са2+ (15 нмоль и 30 нмоль /мг белка соответственно), органеллы постепенно восстанавливают мембранный потенциал до исходного уровня и поглощают весь кальций из среды. Это указывает на то, что открытие пальмитат/Са2+-активируемой поры носит временный характер (Мтопоуа е1 а1., 2004).

Изменение величины мембранного потенциала митохондрий после открытия в них поры зависит от используемых концентраций жирной кислоты и Са2+. Как видно из рис. 4А, удвоенные количества ПК (30 нмоль/мг белка) и Са2+ (70 нмоль/мг белка) в присутствии ЦсА вызывают стойкую и продолжительную (15 мин) деполяризацию мембраны митохондрий печени. При этом Са2+ сначала быстро (в течение 2 мин) аккумулируется органеллами, а затем спонтанно выбрасывается из них (рис. 4Б). Деполяризация митохондрий сопровождается высокоамплитудным набуханием органелл (рис. 4В). Стоит отметить, что стойкая деполяризация мембраны митохондрий после индукции поры не является полной, так как добавление ДНФ в этих условиях вызывает дальнейшее снижение мембранного потенциала (рис. 4А).

[ТФФ |. мкМ

ПК

1 МММ

|Са: ). мкМ

80 -

РК

1 мин

ПК Са"

Рис. 4. Влияние 1 мкМ рутений красного (РК) на Ду (А), Л[Са2+] (Б), и набухание митохондрий печени крысы (В), индуцированное открытием пальмитат/Са2+-активируемой поры. Добавки: 30 нмоль ПК/мг белка, 70 нмоль Са2+/мг белка, 1 мкМ РК, 50 мкМ ДНФ; курсивом показаны изменения в отсутствие добавленного рутений красного (а).

Мы предположили, что продолжительная деполяризация мембраны и выход Са2+ после индукции поры в таких условиях обусловлены рециклизацией ионов Са2+ в митохондриях, в которой принимает участие пальмитат/Са2+-

активируемая пора. Если это так, то предупреждение образования пальмитат/Са2+-активируемой поры будет приводить к прекращению этой рециклизации и, следовательно, восстановлению мембранного потенциала.

Поскольку для открытия поры необходимо присутствие свободного Са2+ в митохондриапьном матриксе, то ингибировать ее образование можно путем предотвращения входа Са2+ в митохондрии рутений красным.

Добавление к митохондриям рутений красного через 6-10 минут после индукции пальмитат/Са2+-индуцируемой поры в описанных выше условиях приводит к быстрому и почти полному восстановлению ДЧ*, остановке выхода из органелл ионов Са2+ и ингибированию митохондриалыюго набухания (рис. 4). Подобным образом действовал также другой ингибитор Са2+ унипортера -лантан, и хелатор Са2+ - ЭГТА.

Исходя из полученных результатов, можно предположить, что продолжительная деполяризация митохондриальной мембраны после открытия ПК/Са2+ -активируемой поры обусловлена функционированием Са2+ цикла. При этом вход иона осуществляется через кальциевый унипортер, а выход через пальмитат/Са2+-активируемую пору.

2.2. Предполагаемый механизм рециклизации Са2* в митохондриях с участием палыштат/Са2'-активируемой поры

Прежде всего, следует обратить внимание на то, что необходимым фактором для индукции ПК/Са2+-зависимой поры в митохондриях является мембранный потенциал (Sultan and Sokolove, 2001). При наличии происходит перераспределение молекул добавленной ПК, в результате которого депротонированная форма кислоты будет накапливаться на матриксной стороне внутренней мембраны митохондрий. Добавленный в систему Са2+ тоже будет транспортироваться в митохондрии по потенциалу: поглощение катиона через унипортер приведет к его накоплению в митохондриалыюм матриксе. Таким образом, на матриксной стороне внутренней мембраны митохондрий создаются благоприятные условия для образования комплексов Са2+ с ПК и, следовательно, открытия пальмитат/Са2+-активируемой поры.

Кратковременное открытие поры приведет к падению мембранного потенциала и выходу накопленного иона по концентрационному градиенту из митохондрий. Однако, вследствие того, что целостность мембраны быстро восстанавливается вследствие самопроизвольного закрывания образовавшихся липидных пор, мембранный потенциал будет восстанавливаться за счет работы дыхательной цепи, а вышедший Са2+ будет вновь транспортироваться через унипортер в матрикс. Условием для повторного поглощения Са2+ митохондриями после закрытия пор является наличие на внутренней мембране некоторого оставшегося потенциала, который обнаруживается в экспериментах с ДНФ (рис. 4А). Таким образом, закрытие поры приводит цикл к начальному состоянию: митохондрии начнут аккумулировать Са2+ и цикл повторится.

С точки зрения этого механизма, ингибирование входа Са2+ будет предотвращать образование новых пор в митохондриях, тогда как

образующиеся ранее поры быстро закрываются. Это, в свою очередь, приведет к прекращению выхода иона из органелл и быстрому восстановлению Af.

2.3. Активаиия рециклизаиии Са1+ ÍSr2') в условиях образования эндогенных жирных кислот

ПК/Са2+-активируемая рециклизация Са2+ в митохондриях, вероятно, может наблюдаться в условиях образования в митохондриях эндогенных жирных кислот. Известно, что накопление свободных жирных кислот может происходить в результате активации фосфолипазы А2 ионами Са2+ и Sr2+ (Saris, 1994). Чтобы исключить открытие циклоспорин А-чувствитслыюй белковой поры, последующие эксперименты мы проводили с использованием пульсов Sr и в присутствии ЦсА.

Как видно из рис. 5А, добавление к митохондриям Sr2+ (200 нмоль/мг белка) в присутствии 1 мМ Фн приводит к снижению ДТ, что связано с входом иона в органеллы через унипортер, после чего потенциал на мембране восстанавливается до определенного стабильного уровня.

А Б

Рис. 5. Изменение мембранного потенциала (А) и [^г2*] (Б), вызванное дробными добавками Зг21". Добавки: Бг2* (200 нмоль/мг белка), 1 мкМ рутений красный (РК).

После 3-4-х дробных добавок Бг2"1" устойчивый уровень мембранного потенциала начинает постепенно снижаться, и после 7-ой добавки иона наблюдается полная деполяризация митохондрий. Одновременно с этим начинается выход иона (рис. 5Б) и набухание органелл (рис. 6 кривая 1).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что деполяризация митохондриальной мембраны, выход 8г2+ и набухание органелл опосредованы функционированием ЦсА-нечувствительных пор, возможно пальмитат-индуцируемых пор, и рсциклизацией ионов Бг2*. Открытие таких пор может произойти вследствие активации фосфолипазы А2 ионами Б г21". Так как восстановление мембранного потенциала митохондрий до исходного уровня не происходит начиная уже с 3-4 добавки 8г2+, можно предположить, что появление жирных кислот, и вслед за ним открытие пальмитат-активируемой поры, наблюдается уже на этом этапе эксперимента. Происходящую рециклйзацию иона доказывает тот факт, Что добавление рутений красного к

митохондриям, загруженных стронцием, также, как и в случае индукции пальмитат/Са2+-индуцируемой поры, восстанавливает мембранный потенциал и останавливает выход иона из органелл (рис. 5).

Для дальнейшего подтверждения нашего предположения о том, что в основе 5г2+-индуцированной деполяризации мембраны лежит открытие поры, индуцированной эндогенной жирной кислотой, мы провели эти эксперименты в присутствии ингибитора мнтохондриалыюй фосфолипазы А2 -трифлуоперазина (ТФП). Как показано на рис. 6, ТФП значительно снижает скорость и амплитуду -активируемого митохондриального набухания. Подобное действие оказывал также БСА, способный связывать свободные жирные кислоты.

Рис. 6. Влияние 10 мкМ ТФП на набухание митохондрий печени крысы, вызванное дробными добавками (200 нмоль/мг

белка). 1. - контроль, 2. -набухание в присутствии 10 мкМ ТФП.

На основании полученных результатов мы предполагаем, что функционирование в митохондриях «Са2+(8г2+)-цикла» может происходить как в условиях добавленной жирной кислоты, так и при образовании эндогенных жирных кислот в случае перегрузки органелл Ca2+(Sr2+), например при ишемии миокарда и других патологиях. При этом выход катиона может обеспечиваться через короткоживущие пальмитат/Са2+(8г2+)-активируемые поры.

3. Возможная роль мнтохондриалыюй пальмитат/Са2+-активируемой поры в механизме пальмнтат-индуцированного апоптоза

Недавно было показано, что ПК является природным индуктором апоптоза. Развитие апоптоза, вызываемого этой жирной кислотой, происходит как по каспаз-зависимому, так и каспаспаз-независимому пути (Ulloth et al., 2003). Ранее мы предположили, что образование в митохондриях ЦсА-нечувствительной Са2+-зависимой поры лежит в основе механизма проапоптотического действия ПК. Было установлено, что открытие этой поры приводит к высвобождению из митохондрий цитохрома с (Belosludtsev et al., 2006), который может запускать апоптоз по каспаз-зависимому механизму.

В настоящей работе была исследована возможность выхода из митохондрий при образовании поры апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ), запукающего каспаз-независимую гибель клеток (Lorenso and Susin, 2004).

Из рис. 7 видно, что открытие пальмитат/Са2+-активируемой поры приводит к ЦсА-нечувствительному выходу АИФ из органелл. Таким образом, открытие пальмитат/Са2'-активируемой поры может являться триггерным

механизмом в индукции пальмитатом апоптоза как по каспаз-зависимому, так и по каспаз-независимому пути,

MX контр ПК/Са2+

ЩШШШШ р: шгаиг.шг

Рис. 7. Выход АИФ из митохондрий печени мыши, индуцированный открытием ЦсА-нечувствительнои

ПК/Са2+ -активируемой поры. Добавки: ПК (30 нмоль/мг белка) и Ca2t (60

нмоль/мг белка).

Дополнительным доказательством этого предположения являются наши данные о том, что ненасыщенные жирные кислоты - олеиновая и линолевая, которые, как известно, предотвращают пальмитат-индуцированный апоптоз в культуре клеток (Hardy et al., 2003), существенно снижают способность пальмитиновой кислоты вызывать набухание митохондрий в присутствии Са2+ (рис. 8). При этом сами ненасыщенные жирные кислоты не способны ни вызывать образование ЦсА-нечувствительной поры в митохондриях (рис. 8), ни индуцировать апоптоз (Ostrander et al., 2001; Hardy et al., 2003).

Рис. 8. Влияние олеиновой кислоты (ОлК) на ЦсА-нечувствительное митохондрии-альное набухание, индуцированное ПК и Са2+. Добавки: 1) 30 нмоль/мг белка ПК и 60 нмоль/мг белка Са2+; 2) 30 нмоль/мг белка ОлК и 60 нмоль/мг белка Са2+; 3) 30 нмоль/мг белка ПК + 30 нмоль/мг белка ОлК, 60 нмоль/мг белка Са2+.

4. Функционирование циклоспорин А -нечувствительной пальмитат/Са2+-активируемой поры при различных физиологических условиях

Известно, что свойства и состав митохондриальных мембран меняются в зависимости от возраста (Daum, 1985). Кроме того, при старении наблюдается значительное усиление апоптотической гибели клеток (Lopes et al., 2004), одним из индукторов которой, как известно, является ПК. Учитывая возможную роль митохондриальной пальмитат/Са2+-активируемой поры в клеточной патофизиологии, и в частности апоптоза, мы предположили, что с возрастом могут происходить изменения в функционировании этой поры в органеллах.

В связи с этим, в работе были изучены параметры функционирования пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях печени крыс 4-х

120 ■ 100

20 0 ■

ПЮ'Са2»

ОлК/Саг+

■4s

ПК+ОпК/Саг-

возрастных групп: 1, 3, 8 и 18 месяцев (рис. 9). Полученные результаты указывают на существенное снижение резистентности митохондрий к индукторам поры с возрастом, что может быть связано со структурными изменениями мембран, облегчающими образование этой поры, в частности, с

Рис. 9. Сравнение зависимостей скорости ЦсА-нечувствительного пальмитат/Са2+-индуциро ванного набухания митохондрий печени крыс в возрасте ], 3, 8 и 18 месяцев от концентрации ПК. Набухание индуцнровалось 30 мкМ СаСЬ

[ПК], мкМ

увеличением содержания свободных жирных кислот и холестерина в митохондриальных мембранах при старении (Daum, 1985).

В работе было проведено также сравнение параметров образования пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях сердца и митохондриях печени половозрелых крыс. Установлено, что митохондрии сердца более резистентны к индукторам поры, чем митохондрии печени крыс, что, вероятно, может быть обусловлено разным как липидным, так и белковым составом митохондриальных мембран этих двух тканей. В частности, в митохондриях печени крыс, по сравнению с митохондриями сердца, увеличено соотношение кардиолипина к общим фосфолипидам (Daum, 1985), который, как обсуждалось ранее, облегчает образование пальмитат/Са2+-активируемой поры в мембране.

Следующей задачей работы было определение параметров функционирования поры в митохондриях печени крыс, обладающих разной устойчивостью к условиям гипоксии (рис. 10).

20 25 30 [ПК], мкМ

Рис. 10. Зависимость скорости ПК/Са2+ -индуцированного набухания митохондрий печени высокоустойчивых (ВУ), низкоустойчивых (НУ) и адаптированных (А) к гипоксии крыс от концентрации ПК. Набухание индуцировалось 30 мкМ СаС12.

Известно, что лабораторные животные различаются по чувствительности к условиям гипоксии, которая закрепляется генетически (Лукьянова и др., 1999). Высокоустойчивые (ВУ) крысы переносили нормобарическую гипоксию в течении 10-12 мин до 2-го атонального вдоха, а низкоустойчивые (НУ) животные выдерживали не более 1 мин. Исследование этих групп животных показало, что в митохондриях печени крыс, обладающих низкой устойчивостью к гипоксии, скорость пальмитат/Са2+-индуцированного набухания ниже, чем таковая у ВУ животных. Адаптация НУ крыс к гипоксии методом интервальной нормобарической гипоксии способствует увеличению скорости пальмитат/Са2+-индуцированного митохондриалыюго набухания до показателей ВУ животных.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что формирование устойчивости животных к недостатку кислорода сопровождается сопряжением дыхательной цепи и активацией калиевого цикла в митохондриях. Согласно полученным в настоящей работе результатам, другим возможным механизмом адаптации животных к гипоксии может быть индукция короткоживущей пальмитат/Са2+-активируемой норы. Функционирование этой поры вместе в Са2+-унипортером способно вызывать мягкое разобщение, и за счет этого предупредить критическое образование активных форм кислорода в митохондриях, которое наблюдается при гипоксии.

Таким образом, функционирование митохондриальной короткоживущей поры, образующейся при связывании пальмитата с Са2+, судя по всему, может иметь разнообразные последствия, связанные как непосредственно с разобщением окислительного фосфорилирования, так и с пересечением двух физиологических путей, а именно Са2+-зависимой передачей сигнала и запуском каскада реакций, приводящих к апоптозу.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что формирование в мембране пальмитат/Са2+-активируемой поры усиливается в присутствии холестерина и кардиолипина. При этом специфически связывающий кардиолипин агент, ЮДО-нонил акридиновый оранжевый, ингибирует открытие поры в митохондриях печени крысы.

2. Подобраны условия рециклизации Са2+ в митохондриях, при которых вход ионов в органеллы осуществляется посредством Са2+-унипортера, а выход -через временно образующиеся пальмитат-индуцируемые поры. Показано, что выброс Са2+ из митохондрий происходит как в присутствии добавленной пальмитиновой кислоты, так и при ее вероятном образовании в случае активации фосфолипазы Аг избыточными концентрациями стронция.

3. Обнаружено, что при открытии пальмитат/Са2+-активируемой поры происходит выход из митохондрий апоптоз-индуцирующего фактора.

4. Показано, что в митохондриях печени крысы образование ЦсА-нечувствителыгой пальмитат/Са2+-индуцируемой поры усиливается с возрастом и при адаптации животного к условиям гипоксии.

5. Установлено, что по сравнению с митохондриями печени, митохондрии сердца характеризуются относительно небольшой максимальной амплитудой и скоростью ЦсА-нсчувствительного пальмитат/Са2+-индуцируемого набухания.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В.. Миронова Г.Д. (2005) Возможный механизм образования и регуляции пальмитат-индуцировалной циклоспорин А-нечувствительной митохондриальной поры. Биохимия, 70, стр. 987-994.

2. Belosludtsev K.N., Saris N.-E. L., Andersson L.C., Belosludtseva N.V.. Agafonov A.V., Sharma A., Moshkov D.A., Mironova G.D. (2006) On the mechanism of palmitic acid-induced apoptosis; the role of a pore induced by palmitic acid and Ca2+ in mitochondria J. Bioenerg. Biomembr., 38, p. 113-120.

3. Mironova G.D., Belosludtsev K.N., Belosludtseva N.V.. Gritsenko E.N., Khodorov B.I., Saris Nils-Erik L. (2007) Mitochondrial Ca cycle mediated by the palmitate-activated cyclosporin A-insensitive pore. J. Bioenerg. Biomembr., 39, p. 167-174.

4. Agafonov A.V., Gritsenko E.N., Shlyapnikova E.N., Kharakoz D.P., Belosludtseva N.V.. Lezhnev E.I., Saris Nils-Erik L., Mironova G.D. (2007) Ca2+-induced phase separation in the membrane of palmitate-containing liposomes and its possible relation to membrane permeabilization. J. Membr. Biol, 215 (1), p. 57-68.

5. Белослудцев K.H., Белослудцева H.B.. Миронова Г.Д. (2008) Роль митохондриальной пальмитатат/Са2+-активируемой поры в пальмитат-индуцируемом апоптозе. Биофизика, 6, стр. 6-11.

6. Мурзаева С.В., Белослудцева Н.В.. Гавровская Л., Миронова Г.Д. (2008) Влияние таурина на системы транспорта ионов в митохондриях. Биофизика, 6, стр. 11-17.

7. Миронова Г.Д., Шигаева М. И., Белослудцева Н.В.. Гриценко Е.Н., Белослудцев К.Н., Германова Э.Л., Лукьянова Л.Д. (2008) Влияние некоторых флавоноидсодержащих препаратов растительного происхождения на активность митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала. Бюлл. Эксп. Биол. и Мед., 8, стр. 95-99.

8. Белослудцева Н.В.. Белослудцев К.Н., Агафонов А.В., Миронова Г.Д. (2009) Влияние холестерина на образование в митохондриях и липосомах пальмитатат/Са2+-активируемой поры. Биофизика, принята в печать.

Тезисы докладов:

1. Белослудцева Н.В.. Агафонов А.В., Миронова Г.Д. (2005) Роль кардиолипина в образовании пальмитат/Са2+-активируемой митохондриальной поры. 4-ая Российская конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва), стр. 12.

2. Белослудцева Н.В. (2006) Пальмитат/Са2+-активируемая пора как неспецифическая система выхода кальция из митохондрий. 10-ая школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино), стр. 67-68.

3. Belosludtseva N.V.. Belosludtsev K.N., Gritsenko E.N., Mironova G.D. (2007). The palmitate/Ca2+-activated cyclosporin A-insensitive pore: the possible role in mitochondrial Ca2+-cycle. 32'h FEBS Congress (Austria), p. 123.

4. Белослудцева H.B.. Белослудцев K.H., Лукьянова Л.Д., Миронова Г.Д. (2007). Митохондриальная пальмитаг/Са2+-активируемая пора: возможная роль при апоптозе и в условиях адаптации к гипоксии. XX Съезд Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Москва), стр. 17.

5. Белослудцева Н.В.. Белослудцев К.Н. (2007) Влияние холестерина и SH-агентов на открытие циклоспорин А-нечувствительной пальмитат/Са2+-активирусмой поры в митохондриях. 11-ая школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино), стр. 130.

6. Белослудцева Н.В.. Белослудцев К.Н., Миронова Г.Д. (2007). Пальмитат/Са2+-активируемая циклоспорин А-нечувствительная пора и ее возможная роль в митохондриальном кальциевом цикле. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино), стр. 166-168.

7. Belosludtseva N.V.. Mironova G.D. (2008) A possible role of the mitochondrial palmitate/Ca2+-activated pore in caspase-depcndent and independent apoptosis. Biological motility (Pushchino), V. I, p. 135-138.

8. Белослудцева H.B.. Белослудцсв K.H., Лукьянова Л.Д., Миронова Г.Д. (2008). Митохондриальная пальмитат/Са2 "-активируемая пора: физиологическая роль и функционирование в условиях адаптации к гипоксии. 5-ая Российская конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва), стр. 46.

9. Белослудцева Н.В. (2008) Изучение параметров функционирования циклоспорин А-нечувствительной пальмитат/Са2'-активируемой поры в митохондриях печени сусликов, находящихся в различных метаболических состояниях. 12-я школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино), стр. 71.

10. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В. (2004) Пальмитиновая кислота как индуктор CsA-нечувствительной митохондриальной поры: возможные пути регуляции. 8-я школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино), стр. 47.

11. Belosludtsev K.N., Belosludtseva N.V.. and Mironova G.D. (2004) A Cyclosporin A-Insensitive Pore and Possible Ways of its Regulation. FEES Congress (Poland), p. 177.

12. Белослудцев K.H., Гриценко E.H., Агафонов A.B., Белослудцева Н.В.. Негода Е.А., Сарис Н.-Э., Миронова Г.Д. (2005) Пальмигат/Са2+-активируемая митохондриальная пора и ее возможная роль в активации апоптоза. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино), стр. 226-228.

13. Saris N.-E., Belosludtsev К., Gritsenko Е., Agafonov A., Ovize М., Belosludtseva N.. Gateau-Roesh О., and Mironova G.D. (2005) The permeabilisation of mitochondria and bilayer phospholipid membranes by palmitic acid and Ca2+. 4Л Conference «Mitochondrial Physiology» (Austria), p. 72.

14. Belosludtsev K.N., Kopylov A.T., Balina M.I., Belosludtseva N.V.. Lukyanova L.D., Mironova G.D. (2006) Effect of flavonoid-containing preparations from plants on ATP-dependent potassium channel and Ca2+-activated pores in mitochondria. VIII World Congress International society for adaptive medicine (ISAM) (Moscow), p.l 78.

15. Belosludtsev K.N., Gritsenko E.N., Belosludtseva N.V.. Shigaeva M.I., Lukyanova L.D., Mironova G.D. (2007). The mitochondrial ATP-dependent K+ channel and palmitate/Ca2+-activated pore in adaptation of animals to hypoxia. 32'1' FEBS Congress (Austria), p. 124.

16. Шигаева М.И., Белослудцева H.B., Белослудцев K.H., Чернохвостой Ю.В., Миронова Г.Д. (2007) Возрастные изменения в функционировании митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала и пальмитат/Са2"-активируемой поры. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино), стр. 202-204.

17. Белослудцев К.Н., Гриценко Е.Н., Белослудцева Н.В.. Шигаева М.И., Лукьянова Л.Д., Миронова Г.Д. (2007). Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал и резистентность животных к гипоксии. XX Съезд Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Москва), стр. 17.

18. Гриценко Е.Н., Шигаева М.И., Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В.. Тихонов B.IL, Лукьянова Л.Д., Миронова Г.Д. (2007). Влияние препаратов курильского чая на и чая «Амла» на АТФ-зависимый калиевый канал и Са2+-активируемые поры в митохондриях. XXСъезд Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Москва), стр. 203.

19. Saris Nils-Erik L., Belosludtsev K.N., Belosludtseva N.V.. Gritsenko E.N., Mironova G.D. (2007). Oxidative stress due to opening of a mitochondrial palmitate/Ca2+-activated, cyclosporin A-insensitive pore. Td Symposium International Nutrition (Paris), p. 31.

20. Galina D. Mironova, Konstantin N. Belosludtsev, Natalia V. Belosludtseva. Elena N. Gritsenko, Nils-Erik L. Saris (2007) The cyclosporin A-insensitive palmitate/Ca2t-activated pore - role in the mitochondrial Ca2+ cycle. 64'h Harden Conference/MIP2007 "Mitochondrial Physiology " (London), p. 20.

Диссертационная работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 07-04-00759-а), Минпром РФФИ (№ 04-04-97281) и ISTC #3301 для проф. Мироновой Г.Д.

Подписано в печать 20.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1274 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белослудцева, Наталья Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Са -транспортирующие системы митохондрий.

1.1.1. Митохондриальные системы входа Са2+.

1.1.2. Митохондриальные системы выхода Са2+.

1.1.3. Физиологическая роль Са -транспортирующих систем митохондрий.

1.2. Са2+-зависимая циклоспорин А-чувствительная митохондриальная пора (МРТ).

1.2.1. Общая характеристика МРТ.

1.2.2. Предполагаемый механизм образования циклоспорин А-чувствительной митохопдриальной поры.

1.2.3. Возможная роль МРТ при патофизиологических условиях.

1.3. Циклоспорин А-нечувствительная митохондриальная пора. Жирные кислоты как индукторы Са2+-зависимой ЦсА-нечувствительной поры.

1.3.1. Общая характеристика циклосорин А-нечувствительной поры, индуцированной пальмитиновой кислотой и Са

1.3.2. Возможная физиологическая роль митохопдриальной пальмитат/Са -активируемой поры.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Подготовка животных.

2.2. Выделение митохондрий из печени животных.

2.3. Выделение митохондрий из сердца крыс.

2.4. Оценка функциональных параметров митохондрий.

2.5. Встраивание холестерина в мембраны митохондрий.

2.6. Электрофорез и иммуноблоттинг.

2.7. Приготовление однослойных липосом, загруженных сульфородамином Б.

2.8. Измерение выхода сульфородамина Б из однослойных липосом.

2.9. Определение фазовой сепарации в мембранах липосом.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Свойства поры, активируемой пальмитатом и С а

3.1.1. Влияние кардиолипина и кардиолипин-связывающего агента, 1(W-нонил акридинового оранжевого, на функционирование пальмитат/Са -активируемой поры в мембране.

3.1.2. Влияние холестерина на образование пальмитат/Са -активируемой поры в митохондриях печени крысы и липосомах.

3.1.3. Влияние SH-агентов на процесс образования в митохондриях пальмитат/Са2+-активируемой поры.

3.2. Пальмитат/Са -активируемая пора как система выхода ионов митохондрий: возможная роль в митохондриальном кальциевом цикле.

3.2.1. Активация рециклизации Са в митохондриях в условиях добавленной пальмитиновой кислоты.

3.2.2. Возможная активация рециклизации

Са2+ (Sr2+) в условиях образования эндогенных жирных кислот.

3.2.3. Предполагаемый механизм рециклизации Са2+ в митохондриях с участием пальмитат/Са2+-активируемой поры.

3.3 Возможная роль митохондриальной пальмитат/Са -активируемой поры в механизме пальмитат-индуцированного апоптоза.

3.3.1. Открытие пальмитат/Са2+-активируемой поры приводит к выходу апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ) из митохондрий.

3.3.2. Ненасыщенные жирные кислоты, предупреждающие пальмитат-индуцированный апоптоз, ингибируют образование пальмитат/Са2+-активируемой поры.

3.4. Функционирование циклоспорин А-нечувствительной пальмитат/Са -активируемой поры при различных физиологических условиях.

3.4.1. Сравнение параметров функционирования циклоспорин А -нечувствительной пальмитат/Са -активируемой поры в митохондриях печени и сердца крыс.

3.4.2. Функционирование пальмитат/Са2+-активируемой поры в зависимости от возраста животного.

3.4.3. Функционирование пальмитат/Са - активируемой поры в митохондриях печени крыс с различной устойчивостью к гипоксии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Митохондриальная пальмитат/Ca2+- активируемая циклоспорин A- нечувствительная пора: свойства и возможная физиологическая значимость"

Ионы кальция, как известно, являются одним из ключевых регуляторов внутриклеточных, и, в частности, митохондриальных процессов. Однако избыточное накопление этих ионов в митохондриях может привести к появлению неспецифической проницаемости внутренней мембраны органелл и последующей клеточной гибели (Zoratti et al., 2005; Bernardi et al., 2006). Поэтому изучение процессов, связанных с нарушением мембранной проницаемости митохондрий при аккумуляции этими органеллами ионов Са2+, является весьма актуальной проблемой.

Согласно современным представлениям, возникновение неселективной проницаемости мембран митохондрий связано с образованием Са" -активируемой поры, или MPT (Mitochondrial Permeability Transition роге). Традиционная точка зрения на природу этого процесса состоит в том, в присутствии Са2+ происходит открытие мультибелкового трансмембранного мегаканала, способного пропускать вещества с м.м. <1.5 кДа, а также ингибироваться циклоспорином А (ЦсА) (Zoratti and Szabo, 1995; Zoratti et al., 2005; Iialestrap, 2006; Leung et al., 2008). Однако недавно было показано, что пальмитиновая кислота (ПК) и низкие концентрации Са2+ вызывают открытие ЦсА-нечувствительной митохондриальной поры, механизм образования которой, вероятно, отличается от общепризнанного (Sultan and Sokolove, 2001).

В нашей лаборатории развивается представление о том, что митохондриальная пора, активируемая пальмитатом и Са2+, имеет липидную природу (Mironova et al., 2001, 2004; Белослудцев и др., 2005). В основе этого предположения лежит тот факт, что ПК обладает способностью связывать Са со сродством, которое на 1-2 порядка выше, чем сродство ненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов и других липидов (Mironova et al., 2001), и сравнимо со сродством к Са ряда белков (Пермяков, 1993). Механизм образования поры может быть объяснен в свете недавно полученных данных о том, что связывание анионов ПК с Са в модельной мембране вызывает фазовую сегрегацию жирной кислоты в твердые мембранные домены. Это ведет к фазовому переходу в липидном бислое и формированию липидных пор (Agafonov et al., 2007). В соответствии с теорией образования липидных пор, пальмитат/Са -активируемая пора способна самопроизвольно закрываться.

Актуальность изучения функционирования и регуляции липидной

94короткоживущей пальмитат/Са -активируемой поры в митохондриях связана с тем, что пора может играть ключевую роль в целом ряде физиологических и патологических процессов. Так, показано, что открытие этой поры в митохондриях может иметь непосредственное отношение к механизму пальмитат-индуцированного апоптоза (Belosludtsev et al., 2006), обнаруженного недавно в

94культуре клеток (Kong and Rabkin, 2000). Предполагается также, что Са -активируемая пора может функционировать и при физиологических условиях, когда необходим быстрый выброс Са2+ из митохондрий. В этом случае функционирование короткоживущей поры может приводить к колебанию ионных потоков через внутреннюю митохондриальную мембрану, которые наблюдают при добавлении к клеткам и суспензии митохондрий ионов Са или Sr (Shalbuyeva et al., 2006; Evtodienko et al., 1994).

Целью настоящей работы является изучение свойств митохондриальной

94пальмитат/Са -активируемой циклоспорин А-нечувствительной поры и выяснение ее возможной физиологической значимости.

Задачи исследования:

1. Исследовать свойства пальмитат/Са2+-активируемой поры, а именно влияние на процесс образования поры в мембране липидов -холестерина и кардиолипина, а также модификации SH-rpynn митохондриальных белков.

2. Изучить возможность рециклизации ионов Са2+ в митохондриях при образовании пальмитат/Са -активируемой поры как в присутствии добавленной пальмитиновой кислоты, так при накоплении эндогенных жирных кислот в результате активации фосфолипазы А2.

3. Определить возможность выхода из митохондрий апоптоз-идуцирующего фактора (АИФ) в условиях образования пальмитат/Са -активируемой поры.

4. Определить влияние ненасыщенных жирных кислот, предупреждающих вызываемый пальмитатом апоптоз в культуре

94клеток, на образование пальмитат/Са -активируемой поры в митохондриях и липосомах.

5. Исследовать параметры функционирования митохондриальиой пальмитат/Са2+-активируемой поры в зависимости от типа ткани, возраста животного, а также его устойчивости к условиям гипоксии.

Научная новизна работы.

В работе впервые показано, что формирование в мембране пальмитат/Са -активируемой поры усиливается в присутствии кардиолипина, а кардиолипин-связывающий агент, KW-нонил акридиновый оранжевый, ингибирует открытие поры в митохондриях, не оказывая при этом существенного влияния на параметры дыхания и поглощение Са2+ органеллами. Впервые установлено, что холестерин, встроенный в мембраны липосом и митохондрий, облегчает образование в них пальмитат/Са -индуцируемой поры, в то время как модификация SH-rpynn митохондриальных белков дитиотреитолом и тимеросалом не влияет на ее открытие. Предложена новая модель функционирования кальциевого цикла в митохондриях, в котором вход иона осуществляется через Са2+-унипортер, а выход - через временно образующиеся в мембране липидные поры, индуцируемые ПК и

Са2+. Рециклизация ионов Са2+ при открытии таких пор может происходить как в условиях добавленной жирной кислоты, так и при ее вероятном образовании в случае активации фосфолипазы А2. Впервые показано, что в результате открытия поры происходит выход из митохондрий апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ), что может быть индикатором участия пальмитат-активируемой поры в механизме каспаз-независимой гибели клетки. Установлено, что чувствительность митохондрий печени крысы к индукторам поры - ПК и Са2+ - усиливается с возрастом и при адаптации животного к условиям гипоксии. Митохондрии сердца крысы также подвергаются ЦсА-нечувствительному пальмитат/Са -индуцируемому набуханию, вызванному образованием поры, однако по сравнению с митохондриями печени, это набухание имеет меньшую амплитуду и скорость.

Научно-практическое значение работы.

Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах функционирования митохондрий в норме и при патологиях, связанных с нарушением кальциевого гомеостаза клетки и накоплением свободных жирных кислот. Результаты диссертации могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в области биоэнергетики, а также в дальнейшем найти применение в медицине при разработке фармакологических препаратов, так как в настоящее время показано, что повышение уровня насыщенных жирных кислот, в первую очередь пальмитиновой, и Са2+-зависимая митохондриальная пора вовлечены в индукцию ряда патофизиологических явлений, таких как апоптоз, ишемия, нейродегенеративные заболевания, диабет и другие.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Са2+-транспортирующие системы митохондрий

Кроме хорошо известной роли в качестве основного источника АТФ в клетке, митохондрии принимают также непосредственное участие в регуляции концентрации свободного цитоплазматического Са2+ (Franzini-Armstrong, 2007) и функционируют как внутриклеточное депо этих ионов (Nicholls and Chalmers, 2004).

Ионы Са , как известно, являются одним из ключевых регуляторов клеточных процессов (Berridge, 1993). Вовлечение Са в многочисленные сигнальные пути обусловлено наличием высокого концентрационного градиента между цитозолем, где концентрация этого иона в покоящихся клетках поддерживается на субмикромолярном уровне

10"? М), и межклеточной жидкостью, где она может превышать 10"J М (O'Doherty et al., 1980; Blinks et al., 1982). Основную роль в поддержании такого градиента играют специфические Са -транспортирующие системы плазматической и внутриклеточных мембран, в

9+ том числе Са -транспортирующие системы внутренней мембраны митохондрий (Bernardi, 1999; Gunter et al, 2004; Rizzuto et al., 2000; Сарис и Карафоли, 2005).

Согласно современным представлениям, в митохондриях существует несколько систем входа Са2\ к которым относятся Са-унипортер, система «быстрого поглощения» иона. митохондриальный рианодиновый рецептор, также, вероятно. обеспечивающий вход Са2+ в митохондрии, и несколько независимых систем выхода иона:

Ca2+fNa

- и Са +/Н+-обменники, а также Са2+-зависимая митохондриалышя пора. Функционирование Са2+-транспортирующих систем в энергизованных митохондриях обеспечивает циклический вход и выход катиона, способствуя поддержанию устойчивой концентрации свободного Са как в цитоплазме, так и в матриксном пространстве митохондрий (Bernardi, 1999).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Белослудцева, Наталья Валерьевна

выводы л I

1. Установлено, что формирование в мембране пальмитат/Са -активируемой поры усиливается в присутствии холестерина и кардиолипина. При этом специфически связывающий кардиолипин агент, 1 (W-нонил акридиновый оранжевый, ингибирует открытие поры в митохондриях печени крысы.

2. Подобраны условия рециклизации Са в митохондриях, при которых вход

2+ ионов в органеллы осуществляется посредством Са -унипортера, а выход — через временно образующиеся пальмитат-индуцируемые поры. Показано, что выброс Са из митохондрий происходит как в присутствии добавленной пальмитиновой кислоты, так и при ее вероятном образовании в случае активации фосфолипазы А2 избыточными концентрациями стронция.

3. Обнаружено, что при открытии пальмитат/Са2+-активируемой поры происходит выход из митохондрий апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ).

4. Показано, что в митохондриях печени крысы образование ЦсА-нечувствительной пальмитат/Са2+-индуцируемой поры усиливается с возрастом и при адаптации животного к условиям гипоксии.

5. Митохондрии сердца крысы также подвергаются ЦсА-нечувствительному пальмитат/Са2+-индуцируемому набуханию, связанному с образованием поры, однако по сравнению с митохондриями печени, это набухание имеет меньшую амплитуду и скорость.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена изучению физиологической роли митохондриальной поры, индуцируемой пальмитиновой кислотой и Са2+, а также возможных путей регуляции образования этой поры во внутренней мембране органелл. Данное исследование является продолжением цикла работ, проводимых в нашей лаборатории с середины 90-х годов прошлого века, и направленных на

9-4изучение природы и свойств пальмитат/Са -активируемой поры.

Как было упомянуто в разделе «Обзор литературы», циклоспорин А-нечувствительная Са2+-зависимая пора, индуцируемая пальмитатом, была обнаружена сравнительно недавно (Sultan and Sokolove, 2001а). В исследованиях, проведенных в нашей лаборатории на модельных мембранах, было установлено, что пора имеет липидную природу, и в основе механизма ее образования лежит явление хемотропного фазового перехода в липидном бислое (Agafonov et al., 2003; 2007). При этом основным свойством этой поры является способность самопроизвольно затекать (Sultan and Sokolove, 2001а; Mironova et al., 2004).

Исходя из вышесказанного, в настоящей работе было предположено, что именно липидный состав мембран играет важную роль в формировании пальмитат/Са -активируемой поры. Полученные в работе данные подтвердили это предположение. Было показано, что присутствие кардиолипина в мембране липосом (~ 25 весовых %) благоприятствует открытию пальмитат/Са -активируемой поры (рис. 3). В работе был найден ингибитор поры, ЮА^-нонил акридиновый оранжевый (НАО) - мембранный агент, специфически связывающий кардиолипин. Добавление микромолярных концентраций кардиолипин-связывающего агента предотвращало набухание митохондрий, индуцированное пальмитиновой кислотой и Са (рис. 4), но не влияло на скорости дыхания в состоянии 4 и разобщенного дыхания митохондрий печени крысы, а также поглощение Са органеллами (таблица 1).

В работе было также изучено влияние такого известного модификатора биологических мембран, как холестерин. Было показано, что встраивание холестерина (около 20 мольных %) в митохондриальные и модельные мембраны

9-4облегчало образование в них пальмитат/Са -активируемой поры (рис. 6, 7). Таким

94образом, липидное окружение существенно для образования пальмитат/Са активируемой поры в митохондриях. Основываясь на полученных результатах можно предположить, что механизм образования изучаемой поры является универсальным, и ее открытие будет происходить в различных биологических мембранах, например, плазматической мембране клетки. Так, было показано, что в случае экзоцитоза также происходит образование липидной поры (Takahashi et al., 2002), а при транспорте белков через клеточные мембраны необходимым условием является их пальмитилирование (El-Husseini and Bredt, 2002; Kanaani et al., 2008).

Основная часть настоящей работы посвящена выяснению возможной физиологической роли формирования пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях. В середине 90-х годов прошлого века было сделано предположение,

94что МРТ может являться неспецифической системой выхода ионов Са из митохондрий (Ichas ct al., 1994; Bernardi and Petronilli, 1996). Можно предположить, что такую же функцию может выполнять и короткоживущая циклоспорин А

94нечувствительная пальмитат/Са -активируемая пора. Кроме того, существуют данные, что жирные кислоты способствуют выбросу Са2+ из органелл (Pfeiffer et al., 1979; Medvedev et al., 1985; De Villiers and Lochner, 1986), однако механизм этого выброса до конца не установлен. На основании полученных в работе результатов, была предложена новая модель рециклизации Са в митохондриях: поглощение органеллами этого иона осуществляется через Са -унипортер, а выход иона опосредуется через короткоживущую пальмитат/Са2+-активируемую пору

раздел 3.2.). В работе было показано, что выброс Са из митохондрий через такую пору может осуществляться как в присутствии добавленной пальмитиновой кислоты, так и при ее вероятном эндогенном накоплении в случае активации фосфолипазы А2. Последнее может наблюдаться, например, в условиях избыточной аккумуляции ионов Са2+ в митохондриях при ишемии миокарда и других патологиях, а также, возможно, при индукции стронцием колебаний ионных потоков в митохондриях (Холмухамедов и др., 1991).

Рассматривая системы выхода Са из митохондрий, принято считать, что выброс иона в физиологических условиях в митохондриях невозбудимых тканей осуществляется по механизму Са^/иН^-обмена (Gunter et al., 1994; Bernardi, 1999). Однако определенный белок, ответственный за этот процесс, до сих пор не найден. Исходя из литературных данных о роли жирных кислот в выбросе Са2+ из митохондрий и полученных в данной работе результатов, можно предположить,

2~Ь + что такой системой Са /пН -обмена в органеллах может являться временно образующаяся в мембране липидная пора, индуцируемая пальмитиновой кислотой и Са2+. Частично, на это указывают наши данные на рис. 15: выброс Са2+ из митохондрий, вызываемый добавкой рутений красного, происходит как в присутствии пальмитиновой кислоты, так и в ее отсутствие, однако, в присутствии жирной кислоты скорость выхода иона значительно выше. Можно предположить, что в отсутствии добавленной жирной кислоты, процесс образования поры в митохондриях идет за счет эндогенного пальмитата.

Другой физиологической функцией пальмитат/Са -активируемой поры в митохондриях может являться ее участие в механизме запуска апоптоза, вызываемого пальмитиновой кислотой. Как показано в нашей лаборатории ранее, в результате открытия пальмитат/Са2+-активируемой поры происходит выход из митохондрий цитохрома с, который может индуцировать апоптотическую гибель клеток по каспаз-зависимому механизму (Belosludtsev et al., 2006). В настоящей работе было продемонстрировано, что открытие поры приводит к выходу из митохондрий другого проапоптотического белка - апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ) (рис. 21), запускающего программируемую гибель клетки без участия каспаз. Следовательно, открытие пальмитат/Са -активируемой поры может лежать в основе механизма запуска апоптоза как по каспаз-зависимому, так и по каспаз-независимому пути. Это соответствует литературным данным о том, что в культуре клеток пальмитиновая кислота вызывает апоптоз, происходящий по обоим этим механизмам (Ulloth et al., 2003).

Косвенным доказательством участия поры в активации апоптоза могут являться данные о том, что ненасыщенные жирные кислоты, которые подавляют пальмитат-индуцированный апоптоз в культуре клеток, ингибируют и образование

94пальмитат/Са -активируемой поры в митохондриях (рис. 22). При этом, стоит также еще раз обратить внимание на способность пальмитат/Са2+-активируемой поры самопроизвольно закрываться с сохранением мембранного потенциала органелл (рис. 11). Это может играть важную роль в развитии программируемой клеточной гибели, поскольку для всех этапов апоптоза необходимо сохранение как структуры митохондрий, так и их способности поддерживать определенный уровень АТФ в клетке.

Учитывая возможную роль пальмитат/Са -активируемой поры в клеточной патофизиологии, и в частности в инициации апоптоза, в работе были изучены параметры функционирования поры в митохондриях в зависимости от физиологического состояния организма, а именно возраста, генетически закрепленной устойчивости животного к условиям гипоксии, а также типа ткани. Установлено, что образование поры в митохондриях печени крысы существенно облегчается с возрастом (рис. 25), что коррелирует с литературными данными об активации апоптотической гибели клеток при старении (Lopes et al., 2004). Сравнение параметров образования пальмитат/Са2+-активируемой поры в митохондриях сердца и печени половозрелых крыс показало, что митохондрии сердца более резистентны к индукторам поры, чем митохондрии печени крыс. Это отличие, вероятно, может быть обусловлено разным как липидным, так и белковым составом митохондриальных мембран этих двух тканей. В работе показано также, что формирование поры усиливается в митохондриях печени адаптированных и высокоустойчивых к гипоксии крыс, по отношению к показателям низкоустойчивых к недостатку кислорода животных (рис. 27). В связи с этим, функционирование пальмитат/Са -активируемой поры в митохондриях может являться механизмом адаптации животных к условиям гипоксии, которое за счет "мягкого" разобщения предупреждает критическое образование активных форм кислорода, наблюдаемое при гипоксии (Korshunov et al., 1997).

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о возможности физиологической регуляции образования в митохондриях короткоживущей липидной поры, индуцируемой пальмитиновой кислотой и Са2+, а также позволяют говорить об участии изучаемой поры в различных клеточных процессах. При этом

94физиологическая роль митохондриальной пальмитат/Са -активируемой поры будет определяться, по-видимому, пересечением путей, которые связаны с Са2+-зависимой передачей сигнала и запуском каскада реакций, приводящих к апоптозу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белослудцева, Наталья Валерьевна, Пущино

1. Антонов В.Ф., Иванов А.С., Корепанова ЕА. (1976) О влиянии жирных кислот на ионную проницаемость в бислойных мембранах / Свободнорадикалъное окисление в норме и патологии. Наука, Москва.

2. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. (1992) Липидные мембраны при фазовых превращениях. Наука, Москва.

3. Антонов В.Ф., Шевченко Е.В. (1995) Липидные поры и стабильность клеточных мембран. Вестн. РАМН, 10, 48-55,

4. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В., Миронова Г.Д. (2005) Возможный механизм образования и регуляции пальмитат-индуцированной циклоспорин А-нечувствительной митохондриальной поры. Биохимия, 70, 987-994.

5. Геннис Р. (1997) Биомембраны: молекулярная структура и функции. Мир,1. Москва.

6. Дерябина Ю.И., Исакова Е.П., Звягильская Р.А. (2004) Са -транспортирующие системы митохондрий: свойства, регуляция, таксономические особенности. Биохимия, 69, 114-127.

7. Дятловицкая Э.В., Безуглов В.В. (1998) Липиды как биоэффекторы. Введение. Биохимия, 63, 1, 3-5.

8. Карпунин Д.В., Акимов С.А., Фролов В.А. (2005) Формирование пор в плоских липидных мембранах, содержащих лизолипиды и холестерин. Биологические мембраны, 22 (5), 429-432.

9. Касумов Х.М. и Либерман Е.А. (1972) Ионная проницаемость бимолекулярных мембран в присутствии полиеновых антибиотиков. I. Нистатин и амфотерицин В. Биофизика, 17 (6), 1024-1031.

10. Клебанов Г.И., Иванова Л.И., Туркменова Э.М., Владимиров Ю.А. (1986) Влияние холестерина на физическое состояние и функционирование мембран лимфоцитов. Биофизика. XXXI (1), 73-77.

11. Ленинджер А. (1966) Митохондрия. Молекулярные основы структуры и функции. Мир, Москва.

12. Лукьянова Л.Д. (2004) Функционально-метаболические особенности животных с различной индивидуальной резистентностью к гипоксии.

13. Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты, с. 156-170.

14. Лукьянова Л.Д., Дудченко A.M., Чернобаева Г.Н. и др. (1999) Прерывистая нормобарическая гипоксия. Москва.

15. Лукьянова Л.Д., Коробков А.В. (1981) Физиологические и клинические проблемы адаптации к гипоксии, гиподинамии, гипотермии. Под ред. А.В. Коробкова. т. 2, Медицина, Москва.

16. Миронова Г.Д., Качаева Е.В., Крылова И.Б., Родионова О.М., Балина М.И., Евдокимова Н.Р., Сапронов Н.С. (2007) Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал. 2. Роль канала в защите сердца от ишемии. Весник Рос. Акад. Наук, 2, 44-50.

17. Мохова Е.Н., Хайлова Л.С. (2005) Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот. Биохимия, 70, 197-202.

18. Пермяков Е.А. (1993) Калъций-связывающие белки. Наука, Москва.

19. Самарцев В.Н. (2000) Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилировапия Биохимия, 65, 991-1005.

20. Сарис Н.-Э., Карафоли Э. (2005) Роль митохондрий в перераспределении внутриклеточного кальция: исторический обзор. Биохимия, 70, 231-239.

21. Сидаш С.С., Евтодиенко Ю.В., Холмухамедов Э.Л., Теплова В.В. (1994) Характеристики 8г2+-индуцированного увеличения проницаемости внутренней мембраны митохондрий. Биологические мембраны, 11, 429-436.

22. Скулачев В.П. (1989) Энергетика биологических мембран. Наука, Москва.

23. Холмухамедов Э.Л., Теплова В.В., Чухлова Э.А. (1991) Возбудимость внутренней мембраны митохондрий. II. Обратимый 8г2+-индуцированный выход Sr2+ из митохондрий. Биологические мембраны, 8 (6), 612-620.

24. Холмухамедов Э.Л., Чухлова Э.А., Зинченко В.П., Евтодиенко Ю.В. (1988) Возбудимость внутренней мембраны митохондрий. I. Обратимое увеличение К+-проницаемости мембраны митохондрий двухвалентными катионами. Биологические мембраны, 5 (8), 866-870.

25. Agafonov A., Gritsenko Е., Belosludtsev К., Kovalev A., Gateau-Roesch О., Saris N.-E.L. and Mironova G.D. (2003) A permeability transition in liposomes induced94by the formation of Ca /palmitic acid complexes. Biochim. Biophys. Acta, 1609, 2, 153-160.

26. Ardail D., Privats J.-P., Egret-Charlierg M., Levratg C., Lerme F., Louisot P. (1990) Mitochondrial contact sites: Lipid composition and dynamis. J. Biol Chem., 265 (31), 18797-18802.

27. Arseneault M. and Lafleur M. (2007) Cholesterol sulfate and Ca2+ modulate the mixing properties of lipids in stratum corneum model mixtures. Biophys. J., 92, 99-114.

28. Azzi A., and Azzone G. (1965) Swelling and shrinkage phenomena in liver mitochondria. I. Large amplitude swelling induced by inorganic phosphate and by ATP. Biochim. Biophys. Acta, 105, 253-264.

29. Basso E., Fante L., Fowlkes J., Petronilli V., Forte M.A., Bernardi P. (2005) Properties of the permeability transition pore in mitochondria devoid of Cyclophilin D. J. Biol. Chem., 280 (19), 18558-18561.

30. Bazhenova E.N., Saris N.-E.L., and Zvjagilskaya R.A. (1998) Stimulation of the yeast mitochondrial calcium uniporter by hypotonicity and by ruthenium red. Biochem. Biophys. Acta, 1371, 96-100.

31. Beatrice M.C., Palmer J.W., Pfeiffer D.R. (1980) The relationship between mitochondrial membrane permeability, membrane potential, and the retention of Ca2+ by mitochondria. J. Biol. Chem., 255, 8663-8671.

32. Bernardi P. (1992) Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pre by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. J. Biol. Chem., 267, 88348839.

33. Bernardi P. (1999) Mitochondrial transport of cations: channels, exchengers, and permeability transition. Physiol. Rev., 79, 1127-1155.

34. Bernardi P. and Petronilli V. (1996) The permeability transition pore as a mitochondrial calcium release channel: a critical appraisal. J. Bioenerg. Biomembr., IS, 131-138.

35. Bernardi P., Krauskopf A., Basso E., Petronilli V., Blalchy-Dyson E., Di Lisa F., Forte M.A. (2006) The mitochondrial permeability transition from in vitro artifact to disease target. The FEBSJ., 273, 2077-2099.

36. Bernardi P., Petronilli V., Di Lisa F., Forte M. (2001) A mitochondrial perspective on cell death. TRENDS in Biochemical Sciences, 26 (2), 112-117.9439. Berridge M.J. (1993) Inositol triphosphate and Ca signaling. Nature, 361, 315325.

37. Beutner G., Sharma V.K., Giovannucci D.R., Yule D.I., and Sheu S.S. (2001) Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J. Biol. Chem., 276,21482-21488.

38. Beyer K. and Nuscher B. (1996) Specific cardiolipin binding interferes with labeling of sulfhydryl residues in the adenosine diphosphate/adenosine triphosphate carrier protein from beef heart mitochondria. Biochemistry, 35 (49), 15784-15790.

39. Blazquez C., Galve-Roperh I., and Guzman M. (2000) De «ovo-synthesized ceramide signals apoptosis in astrocytes via extracellular signal-regulated kinase. FASEBJ., 14, 2315-2322.

40. Blinks J.R., Wier W.G., Hess P., and Prendergast F.G. (1982) Measurement of94

41. Ca concentration in living cells. Prog. Biophys. Mol. Biol., 40, 1-114.

42. Bodrova M., Dedukhova V., Samartsev V., and Mokhova E. (2000) Role of the7 4

43. ADP/ATP antiporter in fatty acid-induced uncoupling of Ca -loaded rat liver mitochondria. IUBMB Life, 50, 189-194.

44. Bragadin M., Pozzan Т., and Azzone G. (1979) Kinetics of Ca2+ carrier in rat liver mitochondria. Biochemistry, 18, 5972-5978.

45. Brdiczka D.G., Zorov D.B., Sheu S. (2006) Mitochondrial contact sites: their role in energy metabolism and apoptosis. Biochim. Biophys. Acta, 1762, 148-163.

46. Brierley G.P., Baysal K., Jung D.W. (1994) Cation transport systems in mitochondria: Na+ and K+ uniports and exchangers. J. Bioenerg. Biomembr., 26 (5), 519-526.

47. Broekemeier K., and Pfeiffer D. (1989) Cyclosporin A-sensitive mechanisms produce the permeability transition in mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 561-566.

48. Broekemeier K., Dempsey M., and Pfeiffer D. (1989) Cyclosporin A is a potent inhibitor of the inner membrane permeability transition in liver mitochondria. J. Biol. Chem., 264, 7826-7830.

49. Broekemeier K.M., Schmid P.C., Schmid H.H.O. and Pfeiffer D.R. (1985) Effects7 4of phospholipase A2 inhibitors on ruthenium red-induced Ca release from mitochondria. J. Biol. Chem., 260, 105-113.

50. Brookes P.S. (2005) Mitochondrial H+ leak and ROS generation: an odd couple. Free Radic. Biol. Med., 38 (1), 12-23.

51. Brookes P.S., Yoon Y., Robotham J.L., Anders M. W., Sheu S. (2004) Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 287,817-833.

52. Brown D. A., London E. (1998) Functions of lipid rafts of biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 14, 111-136.

53. Brustovetsky N., Klingenberg M. (1996) Mitochondrial ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large channel by Ca2+. Biochemistry, 35 (26), 84838488.

54. Brustovetsky N.N., Amerkanov Z.G., Yegorova M.E., Mokhova E.N., Skulachev V.P. (1990) Carboxyatractylate-sensitive uncoupling in liver mitochondria from ground squirrels during hibernation and arousal. FEBSLett., 272, 190-192.

55. Buntinas L., Gunter K.K., Sparagna G.C., Gunter Т.Е. (2001) The rapid mode of calcium uptake into heart mitochondria (RaM): comparison to RaM in liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta., 1504 (2-3), 248-261.

56. Carafoli E. (1987) Intracellular calcium homeostasis. Ann. Rev. Biochem., 56, 395433.

57. Carafoli E. (2003) Historical reviews: mitochondria and calcium: ups and downs of an unusual relationship. Trends Biochem. Sci., 28, 175-181.

58. Carreira R.S., Miyamoto S., Di Mascio P., Gon9alves L.M., Monteiro P., Providencia L.A., Kowaltowski A.J. (2007) Ischemic preconditioning enhances fatty acid-dependent mitochondrial uncoupling. J. Bioenerg. Biomembr., 39, 313— 320.

59. Chalmers S., and Nicholls D. (2003) The relationship between free and total calcium concentrations in the matrix of liver and brain mitochondria. J. Biol. Chem., 278, 19062-19070.

60. Cornelius F., Skou J.C. (1984) Reconstitution of (Na+/K+)-ATPase into phospholipid vesicles with full recovery of its specific activity. Biochim. Biophys. Acta, 772 (3), 357-73.

61. Costantini P., Chernyak B.V., Petronilli V., Bernardi P. (1996) Modulation of the mitochondrial permeability transition pore by pyridine nucleotides and dithiol oxidation at two separate sites. J. Biol. Chem., 271 (12), 6746-6751.

62. Crompton M. (1999) The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death. Biochem. J., 341, 233-249.

63. Crompton M. (2000) Mitochondrial intermembrane junctional complexes and their role in cell death. J. Physiol, 529, 11-21.

64. Crompton M., Ellinger H., and Costi A. (1988) Inhibition by cyclosporin A of a Ca -dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress. Biochem J., 255, 357-360.

65. Crompton M., Heid I. (1978) The cycling of calcium, sodium, and protons across the inner membrane of cardiac mitochondria. Eur. J. Biochem., 91 (2), 599-608.

66. Crompton M., Heid I., Baschera C., Carafoli E. (1979) The resolution of calcium fluxes in heart and liver mitochondria using the lanthanide series. FEBS Lett., 104 (2), 352-354.

67. Crompton M., Moser R., Ludi H., and Carafoli E. (1978) The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. Eur. J. Biochem., 82, 25-31.

68. Daum G. (1985) Lipids of mitochondria. Biochem. Biophys. Acta, 822 (1), 1-42.

69. Davidson A., and Halestrap A. (1990) Partial inhibition by cyclosporin A of theswelling of liver mitochondria in vivo and in vitro induced by sub-micromolar2+

70. СаП, but not by butyrate. Evidence for two distinct swelling mechanisms. Biochem. J., 268, 147-152.

71. De Villiers M., Lochner A. (1986) Mitochondrial Ca2+ fluxes: role of free fatty acids, acyl-CoA and acylcarnitine. Biochim. Biophys. Acta, 876 (2), 309-317.

72. Dedukhova V.J., Mokhova E.N., Skulachev V.P., Starkov A.A. Arrigoni-Martelli E., and Bobyleva V.A. (1991) Uncoupling effect of fatty acids on heart muscle mitochondria and submitochondrial particles. FEBS Lett., 295, 51-54.

73. DeFronzo R.A. (2004) Dysfunctional fat cells, lipotoxicity and type 2 diabetes. Int. J. Clin. Pract., 58, 9-21.

74. DePablo M., Susin S., Jacotot E., Larocette, Costantini P., Ravagnan L., Zamzani N., and Kroemer G. (1999) Palmitate induces apoptosis via a direct effect on mitochondria. Apoptosis, 4, 81-87.

75. Di Paola M. and Lorusso M. (2006) Interaction of free fatty acids with mitochondria: Coupling, uncoupling and permeability transition. Biochem. et Biophys. Acta, 1757 (9-10), 1330-1337.

76. Di Paola M., Zaccagnino P., Oliveros-Celis C., Lorusso M. (2006) Arachidonic acid induces specific membrane permeability increase in heart mitochondria. FEBS Letters, 580, 775-781.

77. Diano S., Matthews R.T., Patrylo P., Yang L., Beal M.F., Barnstable С J., Horvath T.L. (2003) Uncoupling protein 2 prevents neuronal death including that occurring during seizures: a mechanism for preconditioning. Endocrinology, 144 (11), 50145021.

78. El-Husseini A., and Bredt D. (2002) Protein palmitoylation: a regulator of neuronal development and function. Nature Rev., 3, 791-802.

79. Ermishkin L.N., Kasumov K.M., Potzeluyev V.M. (1976) Single ionic channels induced in lipid bilayers by polyene antibiotics amphotericin В and nystatine. Nature, 262 (5570), 698-699.

80. Evtodienko Yu.V., Teplova V., Khawaja J., Saris N.-E. L. (1994) The Ca2+9+induced permeability transition pore is involved in Ca -induced mitochondrialoscillations. A study on permeabilised Ehrlich ascites tumour cells. Cell Calcium, 15, 143-152.

81. Fernandez M.I., Ceccarelli D., Muscatello U. (2004) Use of the fluorescent dye 10-N-nonyl acridine orange in quantitative and location assays of cardiolipin: a study on different experimental models. Anal. Biochem., 328 (2), 174-180.

82. Fleischer S., Rouser G., Fleischer В., Casu A., Kritchevsky G. (1967) Lipid composition of mitochondria from bovine heart, liver, and kidney. J. Lipid. Res., 8 (3), 170-80.

83. Franzini-Armstrong C. (2007) ER-Mitochondria communication. How privileged? Physiology, 22, 261-268.

84. Galat A. (1993) Peptidyleproline cis-trans-isomerases-immunophilins. Eur. J. Biochem., 216, 689-707.

85. Gallet P.F., Maftah A., Petit J.M., Denis-Gay M., Julien R. (1995) Direct cardiolipin assay in yeast using the red fluorescence emission of 10-N-nonyl acridine orange. Eur. J. Biochem., 228 (1), 113-119.

86. Garlid K., Dos Santos P., Xie Z., Paucek P. (2003) Mitochondrial potassium transport: the role of the mitochondrial ATP-sensitive K+ channel in cardiac function and cardioprotection. Biochim. Biophys. Acta, 1606 (1-3), 1-21.

87. Gateau-Roesch O., Pavlov E., Lazareva A.V., Limarenko E.A., Levrat C., Saris N.-E.L, Louisot P. and Mironova G.D. (2000) Calcium-binding properties of the mitochondrial channel-forming hydrophobic component. J. Bioenerg. Biomembr., 32, 105-110.

88. Gincel D., Zaid H., Shoshshan-Barmatz V. (2001) Calcium binding and translocation by the voltage-dependent anion channel :a possible regulatory mechanism in mitochondrial function. Biochem. J., 358, 147-155.

89. Gunter Т., and Pfeiffer D. (1990) Mechanisms by which mitochondria transport calcium. Am. J. Physiol., 258, C755-C786.

90. Gunter Т., Gunter К., Sheu S.-S., and Gavin C. (1994) Mitochondrial calcium transport: physiological and pathological relevance. Am. J. Physiol., 255, 313-339.

91. Gunter Т.Е., Buntinas L., Sparagna G., Eliseev R., and Gunter K. (2000) Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium, 28, 285-296.

92. Gunter Т.Е., Chace J.H., Pushkin J.S., and Gunter K.K. (1983) Mechanism of sodium independent calcium efflux from rat liver mitochondria. Biochemistry, 22, 6341-6351.

93. Gunter Т.Е., Yule D.I., Gunter K.K., Eliseev R.I., and Salter J.D. (2004) Calcium and mitochondria. FEBSLett., 567, 96-102.

94. Gzub J. and Baginski M. (2006) Comparative molecular dynamics study of lipid membranes containing cholesterol and ergosterol. Biophys. J., 90, 2368-2382.

95. Halestrap A., Clarke S., and Javadov S. (2004) Mitochondrial permeability transition pore opening during myocardial reperfusion a target for cardioprotection. Cardiovasc. Res., 61, 372-385.

96. Halestrap A., Kerr P., Javadov S., and Woodfield K. (1998) Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in repefusion injury of the heart. Biochim. Biophys. Acta, 1366, 79-94.

97. Halestrap A., McStay G., and Clarke S. (2002) The permeability transition pore complex: another view. Biochimie, 84, 153-166.

98. Halestrap A.P. (2006) Calcium, mitochondria and reperfusion injury: a pore way to day. Biochemical Society Transactions, 34 (2), 232-237.

99. Hallaq H., Smith Т., and Leaf A. (1992) Modulation of dihydropyridine-sensitive calcium channels in heart cells by fish oil fatty acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82,1760-1764.

100. Hansford R.G. and Zorov D. (1998) Role of mitochondrial calcium transport in the control of substrate oxidation. Mol. Cell. Biochem., 184, 359-369.

101. Hardy S., Langelier Y., and Prentki M. (2000) Oleate activates Phosphatidylinositol 3-kinase and promotes proliferation and reduces apoptosis of MDA-MB-231 breast cancer cells whereas palmitate has opposite effects. Cancer Res., 60, 6353-6358.

102. Hardy, S., El-Assaad, W., Przybytkowsky, E., Joly, E., Prentki, M., and Langelier, Y. (2003) Saturated fatty acid-induced apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cells. J. Biol. Chem., 278, 31861-31870.

103. Harris E.J., Cooper M.B. (1981) Calcium and magnesium ion losses in response to stimulants of efflux applied to heart, liver and kidney mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun., 103 (2), 788-796.1. У I

104. Haworth R., and Hunter D. (1979) The Ca -induced membrane transition in9.4mitochondria. II. Nature of the Ca trigger site. Arch. Biochem. Biophys., 195, 460-467.

105. Haworth R., and Hunter D. (1980) Allosteric inhibition of the Сa2+-activated hydrophilic channel of the mitochondrial inner membrane by nucleotides. J. Membrane Biol., 54, 213-236.

106. He L., and Lemasters J. (2002) Regulated and unregulated mitochondrial permeability transition pores: a new paradigm of pore structure and function? FEBS Lett., 512, 1-7.

107. Hickson-Bick D., Sparagna G., Buja L., McMillan J. (2002) Palmitate-induced apoptosis in neonatal cardiomyocytes is not dependent on the generation of ROS. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 282, 656-664.

108. Hoekstra D. (1982) (a) Role of lipid phase separations and membrane hydration in phospholipid vesicle fusion. Biochemistry, 21, 2833-2840.9+

109. Hoekstra D. (1982) Fluorescence method for measuring the kinetics of Ca -induced phase separations in phosphatidylserine-containing lipid vesicles. Biochemistry, 21, 1055-1061.

110. Hunter D., and Haworth R. (1979b) The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. III. Transitional Ca release. Arch. Biochem. Biophys., 195, 468477.

111. Hunter D., Haworth R., and Southard J. (1976) Relationship between configuration, function, and permeability in calcium-treated mitochondria. J. Biol. Chem., 251, 5069-5077.

112. I-Iutson S., Berkich D., Williams G., LaNoue K., and Briggs R. (1989) 31P-NMR visibility and characterization of rat liver mitochondrial matrix adenine nucleotides. Biochemistry, 28, 4325-4332.

113. Ichas F., Jouaville L.S., Sidash S.S., Mazat J.-P., Holmuhamedov E.L. (1994) Mitochondrial calcium spiking: a transduction mechanism based on calcium-induced permeability transition involved in cell calcium signaling. FEBS Letters, 348,211-215.

114. Igbavboa U., and Pfeiffer D.R. (1988) EGTA inhibits reverse uniport-dependent2+

115. Ca release from uncoupled mitochondria. Possible regulation of the Ca94uniporter by a Ca binding site on cytoplasmic side of the inner membrane. J. Biol. Chem., 263, 1405-1412.

116. Jacobson K., Papahadjopoulos D. (1975) Phase transitions and phase separations in phospholipid membranes induced by changes in temperature, pH, and concentration of bivalent cations. Biochemistry, 14 (1), 152-161.

117. Jezek P., and Jezek J. (2003) Sequence anatomy of mitochondrial anion carriers. FEBS Lett., 534, 15-25.

118. Johnston J.D. and Brand M.D. (1990) The mechanism of Ca2+ stimulation of citrulline and jV-acetylglutamate synthesis by mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1033, 85-90.

119. Jung D.W., Baysal K., Brierley G.P. (1995) The sodium-calcium antiport of heart mitochondria is not electroneutral. J. Biol. Chem., 270 (2), 672-678.

120. Jurkowitz M.S., Geisbuhler Т., Jung D.W., Brierley G.P. (1983) Ruthenium red-sensitive and -insensitive release of Ca from uncoupled heart mitochondria. Arch. Biochem. Biophys., 223 (1), 120-128.

121. Kamp F. and Hamilton J.A. (1993) Movement of fatty acids, fatty acid analogues, and bile acids across phospholipid bilayers. Biochemistry, 32, 11074-11086.

122. Kamp F., Zakim D., Zhang F., Noy N. and Hamilton J.A. (1995) Fatty acid flip-flop in phospholipid bilayers is extremely fast. Biochemistry, 34, 11928-11937.

123. Kapus A., Szaszi K., Kaldi K., Ligeti E., and Fonyo A. (1991) Is the mitochondrial2+

124. Ca uniporter a voltage-modulated transport pathway? FEBSLett., 282, 61-64.

125. Kenno K.A., Severson D.L. (1985) Lipolysis in isolated myocardial cells from diabetic rat hearts. Am. J. Physiol., 249, 1024-1030.

126. Kirichok Y., Krapivinsky G., and Clapham D.E. (2004) The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature, 427, 360-364.

127. Klug G.A., Krause J., Ostlund A.K., Knoll G., Brdiczka D. (1984) Alterations in liver mitochondrial function as a result of fasting and exhaustive exercise. Biochim. Biophys. Acta, 764 (3), 272-82.

128. Kokoszka J., Waymire K., Levy S., Sligh J., Gai J., Jones D., MacGregor G., and Wallace D. (2004) The ADP/ATP translocator is not essential for the mitochondrial permeability transition pore. Nature, 427, 461-465.

129. Kolesnick R.N., Kronke M. (1998) Regulation of ceramide production and apoptosis. Annu. Rev. Physiol., 60, 643-665.

130. Kong J., and Rabkin S. (2000) Palmitate-induced apoptosis in cardiomyocytes is mediated through alterations in mitochondria: prevention by cyclosporin A. Biochim. Biophys. Acta, 1485, 45-55.

131. ICorshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. (1997) High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Lett., 416(1), 15-18.

132. Koshkin and Greenberg (2002) Cardiolipin prevents rate-dependent uncoupling and provides osmotic stability in yeast mitochondria. Biochem. J., 364 (1), 317-22.

133. Kristal В., and Brown A. (1999) Apoptogenic ganglioside GD3 directly induces the mitochondrial permeability transition. J. Biol. Chem., 274, 23169-23175.

134. Kristian Т., Bernardi P., Siesjo B.K. (2001) Acidosis promotes the permeability transition in energized mitochondria: implications for reperfusion injury. J. Neurotrauma, 18 (10), 1059-74.

135. Kroemer G., Dallaporta В., and Resche-Rigon M. (1998) The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol., 60, 619-642.

136. Kuo Т.Н., Moore K.H., Giacomelli F., Wiener J. (1983) Defective oxidative metabolism of heart mitochondria from genetically diabetic mice. Diabetes, 32 (9), 781-787.

137. Kushnareva Y.E., Sokolove P.M. (2000) Prooxidants open both the mitochondrial permeability transition pore and a low-conductance channel in the inner mitochondrial membrane. Arch. Biochem. Biophys. Ъ1в (2), 377-388.

138. Lafont F., van der Goot F.G. (2005) Bacterial invasion via lipid rafts. Cell Microbiol., 7 (5), 613-620.

139. Laposata E.A., Lange L.G. (1986) Presence of nonoxidative ethanol metabolism in human organs commonly damaged by ethanol abuse. Science, 231, 497-499.

140. Lemasters J.J., Nieminen A.L., Qian Т., Trost L.C., Herman B. (1997) The mitochondrial permeability transition in toxic, hypoxic and reperfusion injury. Mol. Cell Biochem., 174 (1-2), 159-165.

141. Lenartowicz E., Bernardi P., Azzone G.F. (1991) Phenylarsine oxide induces the cyclosporin A-sensitive membrane permeability transition in rat liver mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 23 (4), 679-688.

142. Le-Quoc D. and Le-Quoc K. (1989) Relationships between the NAD(P) redox state, fatty acid oxidation, and inner membrane permeability in rat liver mitochondria. Arch. Biochem. Biophys., 273, 466-478.

143. Leung A., Varanyuwatana P. and Halestrap A.P. (2008) The Mitochondrial phosphate carrier interacts with cyclophilin D and may play a key role in the permeability transition. J. Biol. Chem., 283, 26312-26323.

144. Li Y., Johnson N., Capano M., Edwards M., and Crompton M. (2004) Cyclophilin-D promotes the mitochondrial permeability transition but has opposite effects on apoptosis and necrosis. Biochem. J., 383, 101-109.

145. Listenberger L., Ory D., and Schaffer J. (2001) Palmitate-induced apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway. J. Biol. Chem., 276, 1489014895.

146. Litsky M.L., and Pfeiffer D.R. (1997) Regulation of the mitochondrial Ca2+ uniporter by external adenine nucleotides: the uniporter behaves like a gated channel which is regulated by nucleotides and divalent cations. Biochemistry, 36, 7071-7080.

147. Liu X., Kim C., Yang J., Jemmerson R., and Wang X. (1996) Induction of apoptosis program in cell-free extracts: requirement for ATP and cytochrome c. Cell, 86, 147-157.

148. Lopes G.S., Mora O.A., Cerri P., Faria F.P., Jurkiewicz N.H., Jurkiewicz A., Smaili S.S. (2004) Mitochondrial alterations and apoptosis in smooth muscle from aged rats. Biochem. Biophys. Acta, 1658 (3), 187-94.

149. Lopes G.S., Mora O.A., Cerri P., Faria F.P., Jurkiewicz N.H., Jurkiewicz A., Smaili S.S. (2004) Mitochondrial alterations and apoptosis in smooth muscle from aged rats. Biochim. Biophys. Acta, 1658 (3), 187-194.

150. Lorenzo H., and Susin S. (2004) Mitochondrial effectors in caspase-independent cell death. FEBSLett., 557, 14-20.

151. Lorenzo H.K., Susin S.A., Penninger J. and Kroemer G. (1999) Apoptosis inducing factor (AIF): a phylogenetically old, caspase-independent effector of cell death. Cell Death and Differentiation, 6, 516-524.

152. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 1, 265-275.

153. Maftah A., Petit J.M., Julien R. (1990) Specific interaction of the new fluorescent dye 10-N-nonyl acridine orange with inner mitochondrial membrane. A lipid-mediated inhibition of oxidative phosphorylation. FEBS Lett., 260 (2), 236-240.

154. Malkevitch N., Dedukhova V., Simonian R., Skulachev V, and Starkov A. (1997) Thyroxine induces cyclosporin A-insensitive, Ca -dependent reversible permeability transition pore in rat liver mitochondria FEBS Lett., 412, 173-178.

155. Martinez F., Eschegoyen S., Driones R., Cuellar A. (1988) Cholesterol increase in mitochondria: a new method of cholesterol incorporation. J. Lipid Res., 29, 10051011.

156. Mathiasen IS, Jaattela M. (2002) Triggering caspase-independent cell death to combat cancer. Trends Mol Med., 8 (5), 212-220.

157. McCormack J.G. and Denton R.M. (1993) Mitochondrial Ca2+ transport and the9+role of intramitochondrial Ca in the regulation of energy metabolism. Dev. Neurosci., 15, 165-173.

158. McMullen T.W. and McElhaney R. N. (1996) Physical studies of cholesterol-phospholipid interactions. Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 1, 83-90.

159. Medvedev B.I., Severina E.P., Gogvadze V.G., Chulova E.A., and Evtodienko94. •

160. Y.V. (1985) Participation of endogenous free fatty acids in Ca release activation from mitochondria. Gen. Phisiol. Biophys., 4, 549-556.

161. Mironova G.D., Belosludtsev K.N., Belosludtseva N.V., Gritsenko E.N., Khodorov B.I., Saris N.-E. L. (2007) Mitochondrial Ca2+ cycle mediated by the palmitate-activated cyclosporin A-insensitive pore. J. Bioenerg. Biomembr., 39, p. 167-174.

162. Mironova G.D., Gritsenko E., Gateau-Roesch O., Levrat C., Agafonov A., Belosludtsev K., Prigent A., Muntean D., Dubois M., and Ovize M. (2004)9ч

163. Formation of Palmitic Acid/Ca Complexes in the Mitochondrial Membrane: A Possible Role in the Cyclosporin-Insensitive Permeability Transition. J. Bioener. Biomembr., 36, 171-178.

164. Mironova G.D., Lazareva A., Gateau-Roesch O., Tyynela J., Pavlov Y., Vanier M.94and Saris N.-E.L. (1997) Oscillating Ca -induced channel activity obtained in BLM with a mitochondrial membrane component. J. Bioenerg. Biomembr29, 6, 561-569.

165. Mironova G.D., Sirota T.V., Pronevich L.A., Trofimenko N.V., Mironov G.P.,94

166. Grigorjev P.A., and Kondrashova M.N. (1982) Isolation and properties of Ca -transporting glycoprotein and peptide from beef heart mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 14, 213-225.

167. Nicholls D.G. (1978) The regulation of extramitochondrial free calcium ion concentration by rat liver mitochondria. Biochem. J., 176, 463-474.

168. Nicholls D.G. and Chalmers S. (2004) The integration of mitochondrial calcium transport and storage. J. Bioener. Biomembr., 36 (4), 277-281.

169. Novgorodov S.A., Gudz Т., Brierley G., and Pfeiffer D. (1994) Magnesium ion modulates the sensitivity of the mitochondrial permeability transition pore to cyclosporine A and ADP. Arch. Biochem. Biophys., 311, 219-228.

170. Novgorodov S.A., Gudz Т., Kushnareva Yu., Eriksson O., and Leikin Yu. (1991) Effects of membrane potential upon the Ca2+- and cumene hydroperoxide-induced permeabilization of the inner mitochondrial membrane. FEBS Lett., 295, 77-80.

171. Novgorodov S.A., Gudz Т., Milgrom Y., and Brierley G. (1992) The permeability transition in heart mitochondria is regulated synergistically by ADP and cyclosporin A. J. Biol. Chem., 267, 16274-16282.

172. O'Doherty J., Younmans S.J., Armstrong W„ and Stark R.J. (1980) Calcium regulation during stimulus secretion coupling: Continuous measurement of intracellular calcium activities. Science, 209, 510-513.

173. Ohvo-Rekila H., Ramstedt В., Leppimaki P., Slotte J.P. (2002) Cholesterol interactions with phospholipids in membranes. Prog. Lipid Res., 41, 66-97.

174. Ostrander D., Sparagna G., Amoscato A., McMillin J., and Dowhan W. (2001) Decreased cardiolipin synthesis corresponds with cytochrome с release in palmitate-induced cardiomyocyte apoptosis. J. Biol. Chem., 276, 38061-38067.

175. Papa S. (1996) Mitochondrial oxidative phosphorylation changes in the life span. Molecular aspects and physiological implifications. Biochim. Biophys. Acta, 1276, 87-105.

176. Paumen M., Ishida Y., Muramatsu M., Yamamoto M., and Honjo T. (1997) Inhibition of carnitine palmitoyltransferase I augments sphingolipid synthesis and palmitate-induced apoptosis. J. Biol. Chem., 272, 3324-3329.

177. Petit J.M., Maftah A., Ratinaud M.H., Julien R. (1992) lON-nonyl acridine orange interacts with cardiolipin and allows the quantification of this phospholipid in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem., 209 (1), 267-273.

178. Petronilli V., Cola C., Massari S., Colonna R., and Bernardi P. (1993) Physiological effectors modify voltage sensing by the cyclosporin A-sensitive permeability transition pore of mitochondria. J. Biol. Chem., 268, 21939-21945.

179. Petrosillo G., Casanova G., Matera M., Ruggiero F.M., Paradies G. (2006) Interaction of peroxidized cardiolipin with rat-heart mitochondrial membranes: induction of permeability transition and cytochrome с release. FEBS Lett., 580, 6311-6316.

180. Pfeiffer D, Gudz Т., Novgorodov S., and Erdalh W. (1995) The peptide mastoparan is a potent facilitator of the mitochondrial permeability trasition. J. Biol. Chem., 270, 4923-4932.

181. Pfeiffer D.R., Kauffmann R.F. and Lardy H.A. (1978) Effects of N-ethylmaleimide on the limited uptake of Ca2+, Mn2+, and Sr2+ by rat liver mitochondria. J. Biol. Chem., 253, 4165-4171.

182. Pfeiffer D.R., Schmid P.C., Beatrice M.C., Schmid H.H.O. (1979) Intramitochondrial phospholipase activity and the effects of Ca2+ plus N-ethylmaleimide on mitochondrial function. J. Biol. Chem., 254, 11485-11494.

183. Piper H., and Das A. (1986) The role of fatty acids in ischemic tissue injury: difference between oleic and palmitic acid. Basic. Res. Cardiol., 81, 373-383.

184. Porter RK, Brand MD. (1995) Cellular oxygen consumption depends on body mass. Am. J. Physiol., 269 (1, Pt 2), 226-228.

185. Pressman B.C., and Lardy H.A. (1956) Effect of surface activt agentson the latent ATPase of mitochondria Biochim. Biophys. Acta, 21, 458-466.

186. Ramsey J.J., Laatsch J.L., Kemnitz J.W. (2000) Age and gender differences in body composition, energy expenditure, and glucoregulation of adult rhesus monkeys. J. Med. Primatol., 29 (1), 11-19.

187. Rizzuto R., Bernardi P., and Pozzan T. (2000) Mitochondria as all-round players of the calcium game. J. Physiol., 529, 37-47.

188. Rizzuto R., Bernardi P., Favaron M., Azzone G.F. (1987) Pathways for Ca2+ efflux in heart and liver mitochondria. Biochem. J., 246 (2), 271-277.

189. Rizzuto R., Brini M., Murgia M. and Pozzan T. (1993) Microdomains with high Ca concentration that are sensed by neighboring mitochondria. Science, 262, 744-747.

190. Rustenbeck I., Munster W., and Lenzen S. (1996) Relation between accumulation of phospholipase A2 reaction products and Ca2+ release in isolated liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1304, 129-138.

191. Saltarelli M., Yamada K., and Coyle J. (1990) Phospholipase A2 and 3H-hemicholinium-3 binding sites in rat brain: a potential second-messenger role for fatty acids in the regulation of high-affinity choline uptake. J. Neurosci., 10, 6272.

192. Saris N.-E. and Bernardi P. (1983) Inhibition by Sr2+ of specific mitochondrial94

193. Ca -efflux pathways. Biochim. Biophys. Acta, 725, 19-24.

194. Saris N.E., Niva K. (1994) Is Zn2+ transported by the mitochondrial calcium uniporter? FEBS Lett., 356 (2-3), 195-198.

195. Saris N.-E.L. (1994) Stimulation of phospholipase A2 activity in mitochondria by magnesium and polyamines. Magnesium Res., 7(1), 5-10.

196. Saris N.-E.L., Sirota T.V., Virtanen I., Niva K., Penttila Т., Dolgachova L.P., and Mironova G.D. (1993) Inhibition of the mitochondrial calcium uniporter by antibodies againt a 40 kDa glycoprotein. J. Bioenerg. Biomembr., 25, 307-312.

197. Schlame M., Rua D., Greenberg M.L. (2000) The biosynthesis and functional role of cardiolipin. Prog Lipid Res., 39 (3), 257-288.

198. Schmidt G. and Knoll W. (1985) Densitometric characterization of aqueous lipid dispersions. Ber. Bunsenges. Phys. Chem., 89, 36-43.

199. Schonfeld P., and Bohnensack R. (1997) Fatty acid-promoted mitochondrial permeability transition by membrane depolarization and biding to the ADP/ATP carrier. FEBS Lett., 420, 167-170.

200. Schonfeld P., Struy H. (1999) Refsum disease diagnostic marker phytanic acid alters the physical state of membrane proteins of liver mitochondria. FEBS Lett., 457, 179-183.

201. Schwarz G. and Arbuzova A. (1995) Pore kinetics reflected in the dequenching of a lipid vesicle entrapped fluorescent dye. Biochim. Biophys, Acta, 1239, 51-57.

202. Shalbuyeva N., Brustovetsky Т., Bolshakov A., Brustovetsky N. (2006) Calcium-dependent spontaneously reversible remodeling of brain mitochondria. J. Biol. Chem., 281(49), 37547-37558.

203. Sharpe M., Perin I., Tattrie В., and Nicholls P. (1997) Ligation, inhibition, and activation of cytochrome с oxidase by fatty acids. Biochem. Cell. Biol., 75, 71-79.

204. Shimabukuro M., Zhou Y., Levi M., and Unger R. (1998) Fatty acid-induced beta cell apoptosis: a link between obesity and diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2498-2502.

205. Silvius J.R., McMillen D.A., Saley N.D., Jost P.C., Griffith O.H. (1984) Competition between cholesterol and phosphatidylcholine for the hydrophobic surface of sarcoplasmic reticulum Ca -ATPase. Biochemistry, 23 (3), 538-47.

206. Simons K., Ikonen E. (1997) Functional rafts in cell membranes. Nature, 387, 569-572.

207. Skulachev V.P. (1998a) Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. Biochim. Biophys. Acta, 1363, 100-124.

208. Skulachev V.P. (1998b) Cytochrome с in the apoptotic and antioxidant cascades. FEBS Lett., 423, 275-280.

209. Skulachev V.P. (1999) Anion carriers in fatty acid-mediated physiological uncoupling. J. Bioenerg. Biomembr., 31, 5, 431-45.

210. Solem L., and Wallace K. (1993) Selective activation of the sodium-independent, cyclosporin A-sensitive calcium pore of cardiac mitochondria by doxorubicin. Toxicol Appl. Pharmacol, 121, 50-57.

211. Sparagna G., Hickson-Bick D., Buja L., and McMillin J. (2000) A metabolic role for mitochondria in palmitate-iinduced cardiac myocyte apoptosis. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol, 279, 2124-2132.

212. Sparanga G., Gunter K., Sheu S.-S., and Gunter Т.Е. (1995) Mitochondrial calcium uptake from physiological-type pulses of calcium. A description of the rapid uptake mode. J. Biol Chem., 270, 27510-27515.

213. Speer О., Back N., Buerklen Т., Brdiczka D. Koretsky A. Walliinann Т., Eriksson O. (2005) Octameric mitochondrial creatine kinase induces and stabilizes contact sites between the inner and outer membrane. Biochem. J., 385, 445-450.

214. Sultan A., and Sokolove P. (2001a) Palmitic acid opens a novel cyclosporin A-insensitive pore in the inner mitochondrial membrane. Arch. Biochem. Biophys., 386, 31-51.

215. Sultan A., and Sokolove P. (2001b) Free fatty acid effects on mitochondrial permeability: an overview. Arch. Biochem. Biophys., 386, 52-61.

216. Takahashi N., Kishimoto Т., Nemoto Т., kadowaki Т., and Kasai H. (2002) Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science, 297, 1349-1352.

217. Tsujimoto Y. (1997) Apoptosis and necrosis: Intracellular ATP level as a determinant for cell death modes. Cell Death Differ., 4, 429-434.

218. Ulloth J., Casiano C., and De Leon M. (2003) Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J. Neurochem., 84, 655-668.

219. Vinogradov A., Scarpa A., Chance B. (1972) Calcium and pyridine nucleotide interaction in mitochondrial membranes. Arch. Biochem. Biophys., 152 (2), 646654.

220. Vork M.M., Glatz J.F., van der Vusse G.J. (1993) Release of fatty acid-binding protein and long chain fatty acids from isolated rat heart after ischemia and subsequent calcium paradox. Mol. Cell Biochem., 123 (1-2), 175-184.

221. Waisman D.M., Rasmussen H. (1983) A reexamination of the chelex competitive calcium binding assay. Cell Calcium, 4(2), 89-105.

222. Waite M., Van Deenen L., Ruigrok Т., and Elbers P. (1969) Relation of mitochondrial phospholipase A activity to mitochondrial swelling. J. Lipid Res., 10, 599-608.

223. Wang X., Yang С., Chai J., Shi Y., Xue D. (2002) Mechanisms of AIF-mediated apoptotic DNA degradation in Caenorhabditis elegans. Science, 298 (5598), 15871592.

224. Wieckowski M., and Wojtczak L. (1998) Fatty acid-induced uncoupling of oxidative phosphorylation is partly due to opening of the mitochondrial permeability transition pore. FEBS Lett., 423, 339-342.

225. Wieckowski M., Brdiczka D., and Woj'tczak L. (2000) Long-chain fatty acids opening of the reconstituted mitochondrial permeability transition pore. FEBS Lett., 484, 61-64.

226. Wingrove D.E. and Gunter Т.Е. (1986a) Kinetics of mitochondrial calcium transport. I. Characteristics of the sodium-independent calcium efflux mechanism of liver mitochondria. J. Biol. Chem., 261, 15159-15165.

227. Wojtczak A. B. (1969) Inhibitory action of oxaloacetate on succinate oxidation in rat-liver mitochondria and the mechanism of its reversal. Biochim. Biophys. Acta, 172, 52-65.

228. Ying W.L., Emerson J., Clarke M.J., and Sanadi D.R. (1991) Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry, 30, 4949-4952.

229. Zamzami N., Kroemer G. (2001) The mitochondrion in apoptosis: how Pandora's box opens. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2(1), 67-71.

230. Zazueta C., Zafra G., Vera G., Sanchez C., Chavez E. (1998) Advances in the purification of the mitochondrial Ca uniporter using the labeled inhibitor 103Ru360. J. Bioenerg. Biomembr., 30 (5), 489-498.

231. Zhu C., Wang X., Xu F., Bahr B.A., Shibata M., Uchiyama Y., Iiagberg H., Blomgren K. (2005) The influence of age on apoptotic and other mechanisms of cell death after cerebral hypoxia-ischemia. Cell Death and Differentiation, 12, 162-176.

232. Zoratti M., and Szabo I. (1995) Mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta, 1241, 139-176.

233. Zoratti M., Szabo I., De Marchi U. (2005) Mitochondrial permeability transitions: how many doors to the house? Biochim. Biophys. Acta, 1706, 40-52.I

Информация о работе

Белослудцева, Наталья Валерьевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Митохондриальная пальмитат/Ca2+- активируемая циклоспорин A- нечувствительная пора: свойства и возможная физиологическая значимость - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Митохондриальная пальмитат/Ca2+- активируемая циклоспорин A- нечувствительная пора: свойства и возможная физиологическая значимость - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы