Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы торможения димефосфоном процессов активации тромбоцитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы торможения димефосфоном процессов активации тромбоцитов"

На правах рукописи

/ -- <л 1

МИНУЛЛИНА ИЗИДА РЕНАТОВНА

МЕХАНИЗМЫ ТОРМОЖЕНИЯ ДИМЕФОСФОНОМ ПРОЦЕССОВ АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ

03.00.04 - биохимия 14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Казань - 1998

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностм Казанской государственной медицинской академии

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор А.П. Цибулькин

доктор медицинских наук, профессор P.C. Гараев

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Ю.А. Зимаков (ВНИВИ, г. Казань)

доктор медицинских наук,

профессор Р.И. Литвинов (КГМУ, г. Казан]

Российская медицинская академия последипломого образования (г. Москва)

Защита состоится «» ^ЦмЖл 1998 г. в 143°часов на заседании диссертационного Совета К 053.29.19 при Казанском государственном университете (420008, Казань, ул. Кремлевская, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке

им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан « /Ч » НОЯ-^С*- 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат биологических наук, доцент Л^сф*-^ А.Н. Аскарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Димефосфон представляет собой диметиловый гр 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты, синтезированный А.О. $елем под руководством Б.А. Арбузова в ИОФХ им. А.Е. Арбузова )бузов Б.А. и др., 1968).

Препарат обладает широким спектром терапевтического действия. Он »являет антидотный эффект при отравлении ингибиторами холинэстера-(Гараев P.C., Студенцова И.А., 1968), эффективно применяется при па-огии нервной системы для нормализации мозгового кровообращения и !ышения устойчивости ткани к гипоксии (Студенцова И.А. с соавт., »5; Данилов В.И. с соавт., 1996 и др.), оказывает кардиопротекторное [ствие (Латфуллин И.А., 1985), нормализует функции вегетативной юной системы (Исмагилов М.Ф. с соавт., 1986), обладает иммуностиму->ующей активностью (Цыремпилов П.Б., 1987; Зернов И.Н., Володина 5., 1988; Курбанов Р.З., 1991), проявляет стресспрогективные свойства ¡физьянова Р.Х., 1991), используется при лечении бронхиальной астмы и [ерреактивности бронхов (Святкина О.Б. с соавт., 1989), имеет выражен-й противовоспалительный эффект с подавлением хемотаксиса нейтронов (Зиганшина Л.Е. с соавт., 1996; Цибулькина В.Н., 1996), оказывает )тивосудорожное действие (Студенцова И.А., Гараев P.C., 1969), а также ивляет секрецию соляной кислоты париетальными клетками желудка 1булькина В.Н. с соавт, 1995).

Тем не менее, существующие представления о механизмах действия дефосфона не обладают универсальностью. Актуальным является поиск санизма, объясняющего если не все, то многие наблюдаемые эффекты ¡парата. Углубление изучения механизма действия димефосфона важно [ обоснования расширения сферы клинического применения препарата и >еделения новых направлений в исследовании его биологических эф-стов. Материал, изложенный в диссертации, получен в исследованиях, вших продолжением совместных работ с проф. В.Н. Цибулькиной и ». Ибрагимовым, предположивших возможность наличия у препарата агонизма кальцийзависимым звеньям внутриклеточной передачи акти->ующего сигнала.

Для выяснения ведущих механизмов действия димефосфона в наших дедованиях в качестве клеточной модели были выбраны тромбоциты.

Их агрегация, воспроизводившаяся на фоне стимуляции различными ш дукторами, рассматривалась как стандартный пример клеточной актив ции. Важным фактором выбора модели агрегации тромбоцитов послужщ наличие у изучаемого препарата антиагрегационного действия (Еналее! Д.Ш., 1981; Мороков B.C., 1988; Фазылов В.Х., 1995; Цибулькина В.Е 1997).

Цель исследования - на модели антиагрегационного действия дим фосфона на тромбоциты раскрыть механизмы реализации влияния прей рата на универсальные процессы клеточной активации.

Задачи исследования: 1. В прямых исследованиях оценить особенности изменения концентрат-внутриклеточных ионов кальция как фактора, определяющего характс антиагрегационного действия димефосфона. I. Изучить возможность подавления димефосфоном клеточной активаци

через влияние на системы внутриклеточных, посредников. 3. Исследовать особенности тромбоцитарной активации при взаимодейс вии димефосфона с соединениями, обладающими свойствами усиленг трансмембранного тока ионов кальция или снижения его внутриклето' ного содержания за счет комплексообразования. V Изучить влияние выявленных универсальных механизмов антиагрег; ционного действия димефосфона на особенности клеточного взаим! действия в системе «тромбоцит - эндотелиальная клетка».

Научная новизна. Проведено углубленное исследование универсал: 1ых механизмов действия димефосфона на модели активации тромбоц] :ов с использованием расширенного комплекса индукторов их агрегаци: Доказано отсутствие прямой связи антиагрегационного эффекта препара: : изменениями в системе аденилатциклаза - цАМФ. Исключена возмо>; ¡ость реализации терапевтического действия препарата через звено ци: юоксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты.

Впервые доказано, что в основе воздействия препарата на процесс легочной активации лежит его способность модулировать движение in юв кальция через клеточные мембраны.

Впервые исследованы механизмы действия димефосфона в ко? шексной системе взаимодействующих компонентов: сосудистый эндот [ий - тромбоциты.

Практическая значимость. Влияние димефосфона на универсальнь: ¡еханизм клеточной активации - трансмембранный перенос ионов кальщ

^следующим изменением его внутриклеточной концентрации - опреде-г широту клинического применения препарата.

Способность димефосфона подавлять кальцийзависимые процессы точной активации позволит прогнозировать еще не выявленные эффек-з области клинического применения препарата.

Выявление разнонаправленных эффектов действия препарата в ком-ксных клеточных системах предполагает проведение клинических исканий с формированием оптимальных схем применения димефосфона с ью получения максимального клинического эффекта.

Положения, выносимые на защиту, дтиагрегационное действие димефосфона реализуется за счет влияния репарата на один из универсальных механизмов клеточной активации -одержание ионизированного внутриклеточного кальция. Торможение величения внутриклеточной концентрации ионов кальция в ответ на 1ДФ определяет подавление агрегации тромбоцитов, егуляция димефосфоном системы внутриклеточного кальция реализу-тся на уровне непосредственного влияния препарата на функциониро-ание кальцийтранспортирующих систем.

> системе эндотелий - тромбоциты антиагрегационное действие диме-юсфона может нивелироваться под влиянием подавления выработки эн-отелием гуморальных кальцийзависимых факторов с антиагрегацион-ой активностью.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на чно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии» зань, 1995); II республиканской научной конференции молодых ученых и циалистов (Казань, 1996); Республиканской научно-практической конфе-ции «Новые методы диагностики и лечения» (Казань, 1996); Российской ференции «Фармакология и токсикология фосфорорганических и других логически активных веществ» (Казань, 1996); научных конференциях юдых ученых Казанской государственной медицинской академии (1997, 8); V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» >сква, 1998); заседании сотрудников кафедры биохимии Казанского госу-ственного университета (1998).

Внедрение результатов исследования. Основные положения диссер-ии внедрены и используются в учебном процессе на кафедре клиниче-

:кой иммунологии с аллергологией, а также на кафедре фармакологии Ка энского государственного медицинского университета.

Публикации, По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзор штературы, описания материалов и методов исследования, трех глав соб лвснных исследований, обсуждения результатов, выводов, практически рекомендаций и указателя литературы (90 отечественных и 169 иностраг 1ых источников). Работа объемом 132 страницы включает 23 таблицы иллюстрирована 10 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение влияния димефосфона на универсальные процессы клето> ной активности проводили на модели агрегации тромбоцитов. В диссерт; ции представлен материал, полученный в экспериментах на 32 нелинейнь крысах-самцах и в исследованиях на 1098 образцах тромбоцитарной плазм] полученной из цитратной крови здоровых доноров.

Исследование агрегационной активности тромбоцитов проводилось образцах богатой тромбоцитами плазмы и в суспензии отмытых от плазм тромбоцитов. В обоих вариантах концентрация клеток составляла 2( тыс/мкл. Запись агрегатограмм осуществлялась турбидиметрическим мет дом G.Born (1962) с помощью лазерного анализатора агрегации "Bioli Процесс агрегации моделировался в атромбогенных условиях с термост тированием (37°С) и перемешиванием со скоростью 800 об/мин. В качест индукторов агрегации использовались АДФ (Sigma) в конечной конце трации 0.5,1, 2.5 и 5 мкМ, адреналин в концентрации 1 мкМ, арахидонов кислота (Sigma) - 1 мМ, тромбин (Bio-Mark, Львов) - 0.5 и 1 ед.МН/мл кальциевый ионофор А23187 (Sigma) в концентрациях 0.1, 0.2, 0.5 и 1 мк] димефосфон вносили в реакционную среду в виде раствора в 0.9% NaC! концентрациях от 10'6 до 10"3 М. Внутриклеточный кальциевый хелат БАФТА-АМ (Sigma) применяли в концентрациях 1,10, 25, 50 и 100 мкМ.

Измерение концентрации свободного цитоплазматического кальц ([Ca2+]j) осуществлялось с помощью флуоресцентного индикатора Fur: AM (Fluka) на спектрофлуориметре Perkin-Elmer MPF-44B. Флуоресц« цию возбуждали при длинах волн 340 и 380 нм и регистрировали излу1 ние при 490 нм. Повышение [Ca2+]i в тромбоцитах индуцировали AJ.

мкМ). Расчет [Са2*]] проводили по формуле, предложенной ЗгупЫе\у1с7 и соавт. (1985).

Содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в тромбо-гах определяли радиоиммунологическим методом с помощью набора тентов «Радиохим» Российского научного центра «Прикладная химия».

Эффект димефосфона в условиях взаимодействия с эндотелием изу-ш в экспериментах на нелинейных крысах-самцах. Выделенный у жи-:ных сегмент грудной аорты инкубировали в среде 199 с димефосфоном шцентрации 1 мМ при 37°С в газовой среде, содержащей 95% углеки->го газа и 5% кислорода. Об антиагрегационной активности судили по лени торможения агрегации донорских тромбоцитов, индуцированной [Ф в концентрации 5 мкМ (Балуда В.П. и др., 1980).

Статистическая обработка результатов исследований производилась с числением критерия достоверности по Стьюденту.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Антиагрегационный эффект димефосфона в системе сильных и слабых индукторов активации тромбоцитов Как известно, активация тромбоцитов является многокомпонентным деухступенчатым процессом. Применяемая нами методика исследования зволяла фиксировать отдельные ступени агрегации. Первичная агрега-я, вызванная слабыми индукторами - АДФ и адреналином, связана с по-шением аффинности мембранных рецепторов а11Ь(33 к фибриногену и эатимым формированием тромбоцитарных комплексов. Вторичная агре-шя свидетельствует о подключении секреторных процессов в виде экс-гссии на мембране клеток добавочных порций интегрина аНЬрЗ, высво-кдении таких активаторов как АДФ, серотонин и мобилизации из плотя тубулярной системы ионов кальция (АбЬЬу В. а1., 1990; С. СтасИег ^ 1997). Данная стадия является уже необратимой.

Нами проведено исследование по выявлению степени антиагрегаци-яого действия димефосфона на указанных этапах агрегации. С этой це-о в образце исследуемой плазмы вначале индуцировалась агрегация шбоцитов адреналином либо АДФ, а затем через различные интервалы ;мени в опытную пробу вносили испытуемый препарат.

Проведенные эксперименты показали, что димефосфон обладает ярко сраженным антиагрегационным действием даже при добавлении на фоне 1звивающейся агрегации. Эффект препарата проявляется в чрезвычайно зроткие интервалы времени, которые не превышают нескольких десятков :кунд. Испытуемый препарат способен подавить выраженность тромбо-итарного ответа на слабые агонисты в период первичной агрегации и на-альные моменты вторичной. В то же время, добавление препарата в мо-ент, когда скорость развивающейся агрегации достигала максимальной еличины, оказывалось неэффективным и его антиагрегационный эффект рактически отсутствовал (табл. 1).

Таблица 1

Антиагрегационный эффект димефосфона (500 мкМ) при внесении на различных сроках агрегации, индуцированной слабыми индукторами

Индуктор Время внесения димефосфона Амплитуда Скорость

^ * * * агрегации (%) агрегации (%)

Адреналин 1 мкМ

в фазе первичной агрегации

на 10 с 70.54±8.34 ** 60.52±9.44 ** на 20 с 69.11±9.45 * 59.06±10.82 **

на 40 с 62.83±10.55 ** 63.56±13.01*

в фазе вторичной после достижения агрегации макс, скорости

96.73±5.91

91.52±4.86

АДФ 5 мкМ

в фазе первичной агрегации

на 10 с на 20 с на 40 с

79.10±8.52* 71.28±9.б5 * 84.25±3.21 *

в фазе вторичной после достижения Ц250±1450 агрегации макс, скорости

90.33±2.74 * 88.14±3.94 * 86.83±6.52

105.50±15.50

Статистическая достоверность различий по сравнению с исходными показателями

* Р<0.05; ** Р<0.01

Очевидно, что на ранних сроках агрегации тромбоцитов испытуем! препарат снижает скорость экспресии высокоаффинных рецепторов к фи риногену, и становится неактивным, когда комплексы рецептор-фибрин ген уже сформированы. Для установления механизмов действия димеф( фона, приводящих к подавлению активации тромбоцитов, необходимо I следовать возможное влияние препарата на основные системы вторичн посредников тромбоцитарной активации: аденилатциклазную, циклоою геназную, фосфоинозитоловую и кальциевую.

Хорошо известно, что выраженность агрегационного ответа тромбо-гов, в особенности на слабые агонисты типа АДФ и адреналина, может пролироваться изменениями цигоплазматического уровня цАМФ. В 1зи с вышеуказанным нами проводилось прямое исследование влияния мефосфона на уровень цАМФ, а также сопоставление его антиагрегаци-ной активности с препаратом «Фосфаден», способным воздействовать на знилатциклазную систему (Вопкай А.Е. егаЬ, 1993).

Хотя внешне проявление антиагрегационного действия димефосфона {юсфадена напоминали друг друга, однако при их одновременной инку-ции обнаруживалась аддитивность их эффектов, проявляющееся в даль-йшем ингибировании основных характеристик тромбоцитарного ответа 16л. 2). Поскольку антиагрегационный эффект фосфадена реализуется рез увеличение уровня цАМФ, а его совместное использование с диме-юфоном характеризуется аддитивностью действия, можно предполо-1ть, что сравниваемые препараты имеют различные точки приложения в гуляции клеточной активности.

Таблица 2.

Ингибиторный эффект димефосфона и фосфадена на адреналин-индуцированную агрегацию тромбоцитов

Адреналин Фосфаден Димефосфон Амплитуда агрегации (%) Скорость агрегации (%)

1 мкМ 100 100

1 мкМ 500 мкМ 47.81±9.64** 61.63±10.65*

1 мкМ 500 мкМ 45.lli7.24** 58.00±8.45**

1 мкМ 500 мкМ 500 мкМ 12.25±1.35** 13.63±2.23**

Статистическая достоверность различий по сравнению с исходными показателями: * Р<0.05; ** Р<0.01

Более убедительно об отсутствии влияния димефосфона на аденилат-[клазную систему свидетельствовали результаты прямого определенш ШФ в тромбоцитах. Его содержание в тромбоцитах, инкубировавшихс5 присутствии стандартных концентраций димефосфона в течение 5 минут »стоверно не изменялось и составляло 99.50+7.55%, а при 30-минутной об ¡ботке - 89.50±6.57% от его уровня в «интактных» тромбоцитах. Таким об

пазом, антиагрегационное действие димефосфона не связано с изменение /ровня внутриклеточного цАМФ.

В отличие от рассмотренных выше слабых тромбоцитарных индукп зов, действие сильных агонистов, таких как тромбин и арахидоновая ю ;лота, связано с мощной активацией кровяных пластинок и их необрат] мой агрегацией. Тромбин известен своей способностью активировать кр< зяные пластинки по различным путям, однако в концентрациях более 2 н. ;го действие осуществляется по АДФ-независимому механизму (Со1т: Е1Ж, 1991). Установлено, что в этом случае действие агониста опосред зано рецепторами с умеренной аффинностью, связанными с фосфолипазс С, и реализуется уже через 10-20 секунд после их оккупации. Поскольку яаших экспериментах агрегационный ответ кровяных пластинок на прим иение тромбина в концентрациях 0.5 ед.МН/мл наступал практически н медленно, можно заключить, что при таком воздействии действителы имела место активация через фосфолипазу С фосфоинозитидного обмена образованием инозитолтрисфосфата и диацилглицерина. В ходе исслед ваний нами было установлено, что антиагрегационное действие димефо фона на фоне стимуляции кровяных пластинок тромбином оказывается н достаточно выраженным (табл. 3). Полученные результаты не отршш вероятность того, что димефосфон может реализовывать свой эффект чер систему инозитолфосфатов. Испытуемый препарат может оказывать на э систему мягкое ингибирующее воздействие, которое не проявляется на ф не необратимого действия сильного индуктора тромбина.

Таблица

Влияние димефосфона на тромбин-индуцированную агрегацию

Тромбин Димефосфон Амплитуда агрегации (%) Скорость агрегации (%)

■ 0.5 ед.ЖН/мл 0.5 ед.Ы1Н/мл 1 мМ 100 91.25±6.77 100 96.06±6.80

Другим звеном возможного действия димефосфона могла быть цепочка а] хидоновая кислота - тромбоксан А2. Введение арахидоновой кислоты в трс боцитарную плазму приводит к развитию агрегационного ответа, котор: опосредован действием высокоактивных продуктов ее метаболизма: прост ландинов йг и Нг и в наибольшей степени тромбоксана Аг. Под воздействи

хефосфона агрегационный ответ тромбоцитов на арахидонат не снижался амплитуде, а лишь незначительно замедлялся во времени. При этом измене показателей агрегации составляло в среднем 15-19% и было недосто-ным. При увеличении продолжительности воздействия димефосфона на мбоциты выраженность его антиагрегационного эффекта не усиливалась, гако, стандартный блокатор циклооксигеназного пути - ацетилсалициловая лота, применяемая в качестве препарата сравнения, - полностью подавляла витие агрегации на данный индуктор (рис. 1). Поэтому следует предполо-гь, что участок клеточной активации, связанный с метаболизмом арахидо-,ой кислоты, находится вне сферы действия димефосфона.

. 1. Пример влияния димефосфона (Дф) и ацетилсалициловой кислоты (АСК) на агрегацию тромбоцитов, индуцированную арахидоновой кислотой (АК): а - АК (1 мМ), б - АК (1 мМ)+Дф (500 мкМ), в - АК (1 мМ)+АСК (500 мкМ).

Таким образом, антиагрегационная активность димефосфона, изучен-нами с применением различных индукторов агрегации, как сильных, и слабых, оказалась не связаной ни с угнетением циклооксигеназного азования сильных эндогенных индукторов агрегации из арахидоновой лоты, ни с активацией аденилатциклазной системы, хотя не исключа-ь возможность реализации его антиагрегационного эффекта на уровне фоинозитидного обмена.

Сальцийзависимые процессы клеточной активации как основное звено реализации антиагрегационного эффекта димефосфона Очередной участок клеточной активации, который потенциально мо-■ быть вовлечен в механизм действия димефосфона, связан с внутрикле-

очным кальциевым обменом. Активация тромбоцитов обычно являете ледствием повышения [Са2+} за счет их поступления по ионным каналаг наружи и из внутриклеточных хранилищ.

Само по себе повышение [Са2+]] без оккупирована поверхностны: ецепторов напрямую с помощью ионофоров способно индуцироват олыпинство тромбоцитарных ответов. Применение кальциевого ионофор 123187 в концентрации 1мкМ обеспечивало развитие выраженной тром оцитарной агрегации, при этом активация тромбоцитов осуществлялас реимущественно за счет потока через плазматическую мембрану клето онов Са2+, присутствующих во внешней среде. Предварительное внесени имефосфона в суспензию тромбоцитов, инкубировавшихся в присутстви шзиологических концентраций Са24 приводило к достоверному сниженш мплитуды и скорости их агрегационного ответа (табл. 4). Обнаруженны ффект свидетельствует в пользу того, что антиагрегационная активност имефосфона может быть связана с блокированием увеличения [Са24^ з чет подавления его транспорта через проницаемые для дивалентных кг ионов каналы во внешней клеточной мембране.

Таблица <■

Влияние димефосфона на агрегацию тромбоцитов, индуцированную ионофором А23187

Концентрация Са в среде инкубации А23187 Димефосфон Амплитуда агрегации (%) Скорость агрегации (%)

2 мМ 1 мкМ 100 100

2 мМ 1 мкМ 1 мМ 73.00±4.86 * 73.57±5.05 *

без Са2+ 0.2 мкМ 100 100

без Са2+ 0.2 мкМ 1 мМ 60.80±2.38 ** 68.80±3.56 **

Статистическая достоверность различий по сравнению с исходными показателями: * Р<0.05; ** Р<0.01

Однако, такая постановка эксперимента не позволяла судить о спс обности димефосфона воздействовать на поступление ионов Са2+ в щш лазму клеток из их эндогенного пула. В связи с этим была проведена дс олнительная серия экспериментов с использованием ионофора А23187 ескальциевой среде, содержащей не более 2 мкМ ионизированного Са2 (ля обеспечения полноценного тромбоцитарного ответа за счет мобилиз;

ги внутриклеточных запасов Са2+ было достаточно применение кальцие-го ионофора в концентрации 0.2 мкМ. Когда тромбоциты инкубирова-:сь в бескальциевой среде совместно с димефосфоном, выраженность их регационного ответа была значительно ослаблена (табл. 4). Скорее всего, нный эффект объясняется способностью испытуемого препарата подав-ть выход ионов Са2+ из внутриклеточного депо.

Полученные нами результаты с высокой долей вероятности свиде-льствуют в пользу того, что антиагрегационный эффект димефосфона в ачительной степени обусловлен его способностью подавлять кальцийза-:симые процессы клеточной активации.

Столь серьезное предположение сделало необходимым проведение следований с привлечением добавочных моделей опосредованной и пря-)й оценки вероятности функционирования [Са2+]; в качестве основной плени для реализации действия димефосфона. В следующей серии нами юводилось сравнительное исследование эффектов димефосфона и веще-ва, известного своей способностью воздействовать на внутриклеточное держание Са2+, у .которого предполагалось существование антиагрегаци-[ного эффекта, схожего по характеру с описанным для димефосфона. В честве такого соединения был выбран внутриклеточный Са2+-хелатор \ФТА-АМ (ацетоксиметильный эфир 1,2 бис(2-амино-фенокси)-этан-К,1\г',1\т'-тетраацетагной кислоты).

При моделировании АДФ-индуцированной агрегации соединение \.ФТА-АМ демонстрировало значительное ингибирование тромбоцитар-(го ответа на стимул, аналогичное тому, что наблюдалось в эксперимен-х с димефосфоном. Средние показатели агрегационного ответа тромбо-гтов на 2.5 мкМ АДФ в присутствии 50 мкМ БАФТА-АМ составляли .02±8.95% по амплитуде и 50.93±6.85% по скорости (р<0.01). Агрегации овяных пластинок в ответ на другой слабый индуктор - адреналин также |фективно подавлялась Са2+-хелатором, при этом величина антиагрегаци-:ного эффекта 25 мкМ БАФТА-АМ и 500 мкМ димефосфона практически юностью совпадала (табл. 5). При одновременном использовании дву> авниваемых соединений наблюдалось взаимное усиление их антиагрега-[онного действия, свидетельствовавшее об отсутствии между ними конку-нтного взаимодействия на внутриклеточном уровне. Последнее обуслов-но тем, что конечное снижение [Са2+} при использовании БАФТА-АМ I [мефосфона достигалось различными способами. В первом случае - за счел

5разования комплексов с ионами Са2+, во втором - скорее всего за счет из-знения скорости потоков Са2' внутрь клетки.

Таблица 5.

Сравнение антиагрегационных эффектов БАФТА-АМ и димефосфона при индуцировании агрегации тромбоцитов адреналином (1 мкМ)

БАФТА-АМ Димефосфон Степень ингибирования агрегации (%)

по амплитуде по скорости

25 мкМ 58.30±17.45 * 59.60±17.37 *

500 мкМ 54.89±7.24 ** 42.00±8.45 **

25 мкМ 500 мкМ 78.60±11.88 ** 83.50±9.53 **

Статистическая достоверность различий по сравнению с контролем: * Р<0.05; ** Р<0.01

Тестируемое соединение демонстрировало эффективное подавлен!« :регации, напрямую индуцированной за счет повышения [Са2+]; при по ощи ионофора А23187. При этом способность БАФТА-АМ ингибиросап регацшо тромбоцитов в Са2+ -содержащей среде по интенсивности совпа ала с антиагрегационной активностью димефосфона и превосходила ее 1 ескальциевых условиях (табл. 6).

Таблица 6

Влияние БАФТА-АМ на агрегацию тромбоцитов, индуцированную ионофором А23187

Концентрация Са + в среде инкубации А23187 БАФТА-АМ Амплит>'да агрегации (%) Скорость агрегации (%)

2 мМ 1 мкМ 100 100

2 мМ 1 мкМ 100 мкМ 72.38±13.34 46.33±6.34 **

без Са2+ 0.1 мкМ 100 100

без Са2+ 0.1 мкМ 50 мкМ 16.3Ш.86 ** 16.19±6.80 **

Статистическая достоверность различий по сравнению с контролем: ** Р<0.01

Вещество БАФТА-АМ также, как и димефосфон, не влияло на участо леточной активации, связанный с образованием эйкозаноидов. Подобно включение было основано на результатах, полученных в экспериментал! ой серии с арахидонатом. При использовании в опытной пробе раствор

\Ф'ГА-АМ с рабочей концентрацией 100 мкМ/л значения амплитуды и юрости агрегации в среднем составляли 92.43^9.78% и 84.40±12.43%, их аличие с контрольными показателями являлось статистически недостойным. Наконец, в серии экспериментов с использованием для активации юмбоцитов сильного индуктора - тромбина в концентрации 1 ед.МН/м; >шо установлено, что БАФТА-АМ подобно димефосфону не подавляет вы-окенность агрегационного ответа кровяных пластинок на данный стимул мплитудные и скоростные показатели агрегации оказались одинаково ус-)йчивы к действию Са2+-хелатора в концентрации до 100 мкМ и составлял! )3.40+3.39 и 95.00±7.18% по сравнению с контрольными значениями.

Таким образом, в сравнительных экспериментах с использование!» ■андартного Са2+ -хелатора БАФТА-АМ и димефосфона на фоне arpera-ля, индуцированной различными агонистами, нами обнаружено сходствс ггиагрегационного профиля данных соединений (рис. 2), характеризовав-ееся коэффициентом корреляции 0.83. Обнаруженная закономерност! ¡идетельствовала о том, что механизм действия тестируемых соединение {алогичен, и, скорее всего, основной характеристикой в реализации дей вия димефосфона является модуляция внутриклеточного Са2+ обмена.

с. 2. Сравнение антиагрегационного профиля димефосфона и БАФТА-АМ. Цифрами обозначены индукторы: 1 - А23187 в среде с Са2+; 2 - А23187 в среде бе-Са2+; 3 - арахидоновая кислота; 4 - АДФ; 5 - адреналин; 6 - тромбин.

Последнее и решающее подтверждение тому, что антиагрегационньп )фект димефосфона связан именно с угнетением Са2+ обмена, было полу

ено в ходе прямого измерения [Са2'], в цитоплазме тромбоцитов при по ющи флуоресцентной метки Гига-2 АМ.

Проведенные эксперименты показали, что действительно активации грегационной активности тромбоцитов под влиянием агонистов (в част ости, слабого агониста АДФ) связана с ростом [Са2+]1 (рис. 3). Использо ание димефосфона подавляло одновременно как степень агрегации, так 1 ровень повышения [Са2+]^ Добавление к суспензии тромбоцитов диме юсфона в концентрации 1 мМ за 3 минуты до введения туда 10 мкМ АД<3 ызывало более чем двукратное ингибирование повышения [Са2+]; (рис. 3).

Прирост

'ис. 3. Увеличение концентрации внутриклеточного кальция на фоне активации тро.\ боцитов АДФ (10 мкМ) и АДФ (10 мкМ) + димефосфон (1 мМ). За 100% пр! нята величина АДФ-шщуцированного увеличения [Са2+]( в интактных тромб* цитах. * Р<0.05

Полученный нами результат мог быть следствием одного из двух п) ей развития событий. Первый мог быть связан со снижением под влияго :м димефосфона исходного уровня ионов Са2+ в покоящихся тромбоцита: Это автоматически приводит к повышению порога клеточной активации ( шшем случае - порога для развития агрегации) и, как следствие, подавл< шю выраженности ответа на стандартный раздражитель (рис. 4). На гр; шке описанная ситуация отображается в снижении функционального с< таяния клетки из А] в положение А2. При этом использование стандар-юй дозы активатора окажется недостаточным, чтобы перевести клетку »стояние активации, соответствующее в точке Вь Реально клетка окаже' ;я в состоянии, обозначенном точкой В2, что выразится в уменьшена Са ]; и снижении степени агрегационной активности тромбоцитов. Нес<

тешго, что в качестве контрольного исследования необходимо было оце-1ть влияние димефосфона на базальный уровень Са + в тромбоцитах, роведенные эксперименты показали, что под воздействием димефосфона в шцентрации 1 мМ [Са2+]; в покоящихся тромбоцитах практически не изме-гется и составляет 101.8516.74% по отношению к базальному уровню.

Таким образом, в отношении димефосфона способ подавления агре-ционной активности, связанный с повышением порога клеточной актива-га, может быть исключен. Следовательно, реально возможен лишь второй пь, при котором исходное состояние клетки будет соответствовать преж-:му уровню Аь а точка конечного эффекта будет располагаться ниже 5ычного значения В, - в положении В3. Указанная ситуация может являть: следствием подавления функций вторичных посредников, передающих :тивирующие сигналы внутрь клетки.

Выраженность

агрегации тромбоцитов, %

100

50

Покоящаяся клетка

_В2 В3 ® ?

: 0,8 г 0,6 0,4 0,2 0,1

[Са2+]1, мкМ

А,

О А,

с. 4. Взаимосвязь внутриклеточного содержания ионов кальция и функционального состояния клеточной активности. Незакрашенные кружочки (А) - исходная [Са2+]1 клеток, находящихся в состоянии покоя; закрашеные кружочки (В) -[Са2+]1, клеток, стимулированных стандартной дозой агониста.

Результаты экспериментов, приведенные выше, показали, что из суще-вующих систем внутриклеточных посредников, контролирующих внутри-еточный Са2+ обмен, аденилатциклазная и циклооксигеназная не прини-1ют участия в реализации функционального эффекта димефосфона. Воз->жный механизм действия препарата на [Са2+];, отражающийся на выра-:нности процессов клеточной активации, также не связан с хелаторным эф-

|>ектом. Таким образом, установленное нами в прямых экспериментах сниж ine [Ca2+]j в тромбоцитах под воздействием димефосфона может быть еле, явием как непосредственного влияния препарата на пропускную способное' слеточных мембран, так и его эффекта на систему фосфоинозитидов.

Антиагрегационный потенциал димефосфона в условиях его взаимодействия с эндотелием

Вышеизложенный материал был получен нами в экспериментах : /itro, когда в однородной суспензии моделируется процесс агрегации кр< зяных пластинок, не испытывающих каких-либо дополнительных возде! ггвий, кроме влияния самих индукторов. Однако, в условиях организма а зегационная способность тромбоцитов находится под многокомпонентны злиянием. Наиболее важным аспектом является взаимодействие тромбощ гов с внутренней оболочкой сосудистой стенки.

Литературные данные свидетельствуют, что уровень выделения энд! гелиальных факторов с антиагрегационной активностью в значительнс ¡тепени регулируется [Ca2+]j (Himmel Н.М. et al., 1993; Gurubhagavatula I. iL, 1998). Поэтому не исключалась возможность снижения под влияние щмефосфона [Ca ]j в клетках эндотелия и последующего угнетения в ш 5иосинтеза факторов дезагрегации.

В предварительных исследованиях нами было выявлено, что опт) лальный выход эндотелиальных факторов с антиагрегационной активн< :тью происходит в среде с содержанием 95% С02 и 5% 02. Антиагрегащ >нная активность сосудистой стенки, инкубированной без димефосфона, •акже совместно с димефосфоном в концентрациях 500 и 100 мкМ, onpi (елялась по степени ингибирования АДФ-индуцированной агрегации д< юрских тромбоцитов, принимавшейся за 100% .

Следует отметить, что в используемой нами модели тромбоциты |дной стороны испытывали стимулирующее влияние индуктора агрегаци с другой стороны - ингибирующее воздействие антиагрегационных фа] оров, вырабатывающихся в эндотелии (рис. 5). В свою очередь, димефа юн был способен одновременно оказывать действие как на тромбоцит! ак и на эндотелиальные клетки аорты.

Для возможности дальнейшей интерпретации конечного эффекта Д1 1ефосфона была введена отдельная экспериментальная группа, в которс оздействие эндотелиальных факторов нивелировалось. Многократное yci

не агрегационной способности тромбоцитов, на фоне которого можно ю пренебречь антиагрегационным воздействием эндотелия, индуцирова-ь АДФ при кратковременном охлаждении тромбоцитарной плазмы.

Тромбоциты

о О

. 5. Факторы, влияющие на агреганионнуго активность тромбоцитов. Сплошные стрелки - проагрегационное, пунктирные - антиагрегационное воздействие.

В группе с нормальной агрегационной активностью тромбоцитов [ствие димефосфона в концентрации 100 мкМ проявлялось в усилении ,Ф-индуцированной тромбоцитарной агрегации и было результатом по-ления антиагрегационной активности сосудистой стенки, поскольку в м случае его действие распространялось только на клетки эндотелия 5л. 7). Очевидно, что димефосфон в концентрации 500 мкМ угнетал жциональную активность как тромбоцитов, так и эндотелиальных кле-:, вследствие чего оба эффекта препарата нивелировали друг друга и ре-ьтирующая агрегация тромбоцитов оставалась на прежнем уровне.

Таблица 7.

Влияние димефосфона (Дф) на агрегационную активность тромбоцитов в условиях взаимодействия с эндотелиальными факторами дезагрегации

годная ак- Показа-ивность тели аг-мбоцитов регации

Тромбоцитарный ответ в присутствии Контроль сосудистых факторов дезагрегации

-_без Дф с Дф 500 мкМ с Дф 100 мкМ

мереная

зышенная

Ампл,% Скор,%

Ампл,% Скор,%

100 100

100 100

39.59±3.53** 28.52±2.63**

201.67i24.84'1'* 229.73±27.71**

40.77±5.17 30.9б±3.90

107.79±12.51' 116.61±22.12'

72.16±11.38 + 57.81±8.71 + +

196.07±27.65 205.39±34.19

-татистическая достоверность различии:

* Р<0.01 - по сравнению с контролем;

+ Р<0.01; + Р<0.05 - в присутствии димефосфона и без него.

Таким образом, в многокомпонентных системах, включающих функ-ионирующие тромбоциты, эндотелиальные клетки, агонисты агрегации \ спытуемый препарат, выраженность антиагрегационного действия диме осфона может оказаться сниженной по сравнению с гомогенной тромбо-итарной популяцией. Суммарный эффект димефосфона на агрегацик оомбоцитов будет определяться степенью гиперагрегации, временем раз-ития его влияния как на сами тромбоциты, так и на клетки сосудисто? генки, а также состоянием функциональной активности клеток-мишеней г гепенью ее зависимости от [Са2']; (рис. 6).

1С. б. Эффект димефосфона на агрегацонную активность тромбоцитов в условиях одновременного воздействия с эндотелиальными факторами дезагрегации. Сплошные стрелки - проагрегационное, пунктирные - антиагрегационное влияние.

Подводя итоги проведенным экспериментальным исследованиям, )жно выделить следующие основные положения. Ярко выраженный анти-регационный эффект димефосфона, проявляемый им на фоне активации омбоцитов слабыми индукторами, обусловлен способностью испытуемого епарата препятствовать накоплению Са2+ в цитозоле. Димефосфон спосо-н не только тормозить поступление ионов Са2+ через плазматическую мбрану, но также проникать внутрь клетки и воздействовать на процессы креции Са2+ из эндоплазматического ретикулума. Способность препарата окировать трансмембранный перенос ионизированного Са2+ считается •кным средством регуляции функциональной активности тромбоцитов, скольку контролирует в конечном итоге практически все пути клеточной гивации.

ВЫВОДЫ

Универсальный механизм влияния димефосфона, определяющий его ши-ий терапевтический эффект, связан со снижением степени нарастания триклеточного содержания ионов кальция в стимулированных клетках. Димефосфон не оказывает влияния на внутриклеточную концентрацию жированного кальция в нестимулированных тромбоцитах. Система аденилатциклаза - цАМФ и метаболиты арахидоновой кислоты входят в число вторичных посредников, через которые может реализо-ься эффект препарата на активированные клетки.

Результаты проведенных исследований не позволяют исключить систему зитолфосфатов в качестве пути реализации антиагрегационного действия [ефосфона на тромбоциты.

Спектр антиагрегационной активности димефосфона, исследованный с ользованием расширенного комплекса тромбоцитарных индукторов, логичен спектру вещества БАФТА-АМ, снижающего уровень внутрикле-ного кальция.

Димефосфон препятствует активации тромбоцитов ионофором А23187, уве-нвагощим внутриклеточную концентрацию ионизированного кальция, однако действие не обусловлено связыванием ионов Са2+ в неактивные комплексы. ЕСальцийзависимые механизмы выработки эндотелиальных факторов с гагрегационной активностью также подавляются димефосфоном, что сет видоизменить характер и степень выраженности действия препарата в эвиях целого организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Способность димефосфона оказывать антиагрегационное воздействие на е развивающегося процесса агрегации может служить обоснованием для данения препарата в период острых стадий заболеваний, сопровождаю-:ся гиперагрегацией тромбоцитов.

3 ситуациях, связанных с массированным тромбообразованием, сопря-ным с появлением тромбина в кровотоке, применение димефосфона несообразно.

Три терапевтическом применении димефосфона следует учитывать воз-ность видоизменения конечного эффекта его действия за счет подавле-выработки эндотелиальных кальцийзависимых факторов с антиагрега-гаой активностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цибулькина В.Н., Минуллина И.Р., Цибулькин А.П. // Пули реализации анпк егационного действия димефосфона на уровне внутриклеточных посредников. Т( ;окл. Российской конф. "Фармакология и токсикология фосфорорганических и др их биологически активных веществ". Вып.З.-Казань, 1996.-С. 150.

2. Цибулькина В. Н., Ибрагимов О. Б., Минуллина И. Р. // Дезагрегационная £ ивность препарата димефосфон in vitro. Тез. докл. республ. науч.-практ. кон Новые методы диагностики и лечения". - Казань, 1996. - Т.2. - С. 191-192.

3. Соловьева И. 3., Цибулькина В. Н., Ибрагимов О. Б., Минуллина И. Р., Мотина !. // Дезагрегационное действие препарата димефосфон у больных ИБС и больньо индромом гиперагрегации тромбоцитов. Тез. докл. республ. науч.-практ. кон Новые методы диагностики и лечения". - Казань, 1996. - Т.2. - С. 73-74.

4. Мотина Н. В., Минуллина И. Р., Соловьева И. 3. У/ Новый препарат для ле^ :ия претромботических состояний. Тез. докл. II республ. науч. конф. молод! ченых и специалистов. - Казань, 1996. - С. 42.

5. Минуллина И.Р. // Димефосфон - препарат для быстрого купирования тро офилии у больных ишемической болезнью сердца. Тез. докл. науч.-практ. кон юлодых ученых. - Казань, 1997. - С. 65.

6. Ибрагимов О.Б., Минуллина И.Р., Мотина Н.В., Соловьева И.З. // Димефосфог оставе комплексной эндотелиопрогекторной терапии может обеспечивать корреюд эсудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ишемической болезнью сердца. Т окл. науч.-практ. конф. молодых ученых. - Казань, 1997. - С. 67.

7. Минуллина И.Р. //Механизм дезагрегационного действия димефосфона. Ti окл. науч.-практ. конф. молодых ученых. - Казань, 1997. - С. 68.

8. Ибрагимов О.Б., Минуллина И.Р. Влияние кальциевого хелатора ВАРТА-А а агрегационную активность тромбоцитов // Тез. докл. науч.-практ. конф. мол ых ученых. - Казань, 1998. - С. 25-26.

9. Минуллина И.Р. // Влияние димефосфона на дезагрегационную активность з этелия. Тез. докл. науч.-практ. конф. молодых ученых. - Казань, 1998. - С. 31-32.

10.Цибулькин А.П., МинуллинаИ.Р., ЦибулькинаВ.Н. //Влияние димефосфо 1 кальцийзависимые процессы клеточной активации. Тез. докл. V Российско ационального конгресса "Человек и лекарство". М., 1998. - С. 633.

11.Ибрагимов О.Б., Цибулькин А.П,, Минуллина И.Р., Мотина Н.В., Габбас А., Позин Е.Я., Попов Е.Г. И Определение активности фактора Виллебранда п эмощи лазерного анализатора агрегации тромбоцитов, - Клиническая лабор >рная диагностика. - 1998. - №3. - С. 13-15. ,,

О

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Минуллина, Изида Ренатовна, Казань

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

МИНУЛЛИНА ИЗИДА РЕНАТОВНА

МЕХАНИЗМЫ ТОРМОЖЕНИЯ ДИМЕФОСФОНОМ ПРОЦЕССОВ АКТИВАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ

03.00.04 - биохимия 14.00.25 - фармакология

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

На правах рукописи

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор А.П. Цибулькин

доктор медицинских наук профессор Р.С. Гараев

Казань - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ:

Стр.

Список сокращений............................................................................................4

Введение................................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы. Механизмы активации и ингибирования

тромбоцитов............................................................................................10

1.1. Механизмы активации тромбоцитов..................................................10

1.1.1. Адгезия тромбоцитов. Рецепторный аппарат, опосредующий процесс адгезии..............................................................................11

1.1.2. Агрегация тромбоцитов. Рецепторный аппарат, опосредующй агрегацию................................................................13

1.1.3. Система вторичных посредников в активации тромбоцитов 18

1.1.3.1. Активация фосфолипазы С........................................................19

1.1.3.2. Система инозитолфосфатов......................................................20

1.1.3.3. Обмен внутриклеточного кальция............................................20

1.1.3.4. Система диацилглицерин - протеинкиназа С..........................23

1.1.3.5. Активация тромбоцитарной фосфолипазы А2........................24

1.2. Механизмы ингибирования тромбоцитов..........................................25

1.2.1. Регуляция метаболизма и роль цАМФ........................................28

1.2.2. Регуляция метаболизма и роль цГМФ........................................29

Глава 2. Материалы и методы исследования....................................................32

Глава 3. Антиагрегационный эффект димефосфона в системе сильных и

слабых агонистов..............................................................40

3.1. Выраженность антиагрегационного эффекта димефосфона при использовании АДФ и адреналина в качестве активаторов тромбоцитов........................................................................................41

3.2. Влияние димефосфона на звено аденилатциклаза - цАМФ............50

3.2.1. Активность аденилатциклазной системы и влияние на нее

димефосфона, определяемые в функциональных тестах..... 50

3.2.2. Прямое определение внутриклеточного содержания цАМФ и

влияние на него димефосфона........................... 52

3.3. Влияние димефосфона на путь активации арахидоновая кислота

- тромбоксан А2.......................................... 53

3.4. Влияние димефосфона на метаболизм фосфоинозитолов....... 56

Глава 4. Кальцийзависимые процессы клеточной активации как основное

звено реализации антиагрегационного эффекта димефосфона ... 60

4.1. Эффект димефосфона на агрегацию тромбоцитов, индуцированную кальциевым ионофором А23187 ............. 60

4.2. Сравнительная активность димефосфона и кальциевого хелатора БАФТА-АМ по отношению к агрегации тромбоцитов......... 63

4.3. Изучение влияния димефосфона на базальный и АДФ-стимулированный уровень кальция в тромбоцитах............ 72

Глава 5. Антиагрегационный потенциал димефосфона в условиях

взаимодействия с эндотелием.............................. 78

5.1. Факторы, обусловливающие антиагрегационную активность сосудистой стенки........................................ 78

5.2. Влияние димефосфона на выраженность антиагрегационного действия эндотелиальных факторов........................ 82

Глава 6. Обсуждение результатов................................... 89

Выводы........................................................ 104

Практические рекомендации....................................... 105

Список литературы.............................................. 106

Приложение.................................................... 131

Список сокращений, использованных в диссертации:

АДФ - аденозиндифосфат АК - арахидоновая кислота АСК - ацетилсалициловая кислота

БАФТА-АМ - 1,2 бис(2-аминофенокси)-этан-М,К,К,Н'-тетраацетатной кислоты

ацетоксиметильный эфир БТП - богатая тромбоцитами плазма ГП - гликопротеин ДАГ - диацилглицерин Дф - димефосфон Кд - константа диссоциации ОТП - обедненная тромбоцитами плазма ПК С - протеинкиназа С РОК - рецептороперируемые каналы ФАТ - фактор активации тромбоцитов ФВ - фактор Виллебранда ФДЭ - фосфодиэстераза цАМФ - циклический аденозинмонофосфат цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат ЭД50 - 50-процентная эффективная доза

[Са2+][ - внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция 1Р3 - инозитолтрисфосфат РО - простагландин

Введение

Актуальность проблемы. Димефосфон представляет собой диметило-вый эфир 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты, синтезированный А.О. Визелем под руководством Б.А. Арбузова в ИОФХ им. А.Е. Арбузова (Арбузов Б.А. и соавт., 1968).

Препарат обладает широким спектром терапевтического действия. Он проявляет антидотный эффект при отравлении ингибиторами холинэстеразы (Гараев P.C., Студенцова И.А., 1968), эффективно применяется при патологии нервной системы для нормализации мозгового кровообращения и повышения устойчивости ткани к гипоксии (Хафизьянова Р.Х., 1991; Гараев P.C., Студенцова И.А., 1995; Данилов В.И. и соавт., 1996 и др.), оказывает кардиопротек-торное действие (Латфуллин И.А., 1985), нормализует функции вегетативной нервной системы (Исмагилов М.Ф., 1986 и др.), обладает иммуностимулирующей активностью (Цыремпилов П.Б., 1987; Зернов И.Н., Володина Н.В., 1988; Курбанов Р.З., 1991), проявляет стресспротективные свойства (Хафизьянова Р.Х., 1991), применяется при лечении бронхиальной астмы и гиперреактивности бронхов (Святкина О.Б. и соавт., 1989; Цибулькина В.Н., 1995), имеет выраженный противовоспалительный эффект с подавлением хемотаксиса ней-трофилов (Зиганшина Л.Е., 1988; Цибулькина В.Н. и соавт., 1996), оказывает противосудорожное действие (Студенцова И.А., Гараев P.C., 1969), а также подавляет секрецию соляной кислоты париетальными клетками желудка (Цибулькина В.Н. и соавт, 1995).

Тем не менее, существующие представления о механизмах действия ди-мефосфона чаще всего могут объяснить какой-то один или группу его эффектов, но не обладают универсальностью (Зиганшина Л.Е. и соавт., 1992; Гараев P.C., 1993; Хафизьянова Р.Х., 1993). Актуальным является поиск механизма, объясняющего если не все, то многие наблюдаемые эффекты препарата. Углубление изучения механизма действия димефосфона важно для расширения сферы клинического применения препарата и опредения новых направлений в исследовании его биологических эффектов.

Оптимальная модель для поиска универсального механизма терапевтического эффекта димефосфона должна отвечать определенным требованиям: 1) исследования должны проводиться на гомогенной клеточной популяции, 2) желательно, чтобы для получения ее не приходилось применять физические и химические методы выделения, которые могут активировать клетку, 3) физиологические факторы и основные механизмы активации этих клеток должны быть хорошо изучены, 4) необходимо иметь воспроизводимую методику регистрации степени клеточной активации, 5) должны существовать изученные варианты патологии, связанные с нарушенной или чрезмерной активацией этой группы клеток; 6) желательно также получить клинические подтверждения эффективности применения димефосфона при данных видах патологии.

После тщательного анализа существующих моделей было обнаружено, что модель стимулированной агрегации тромбоцитов человека соответствует всем перечисленным выше требованиям: 1) тромбоциты представляют собой достаточно гомогенную популяцию (Маркосян A.A., 1970); 2) методы их выделения обеспечивают сохранность функциональных, метаболических и морфологических свойств тромбоцитов (Самаль А.Б. и соавт., 1990); 3) за последние 10-15 лет был достигнут большой прогресс в изучении механизмов активации и функционирования тромбоцитов (Kroll М.Н., Schafer A.I., 1989; Ashby В. et al., 1990; Ruggeri Z.M., 1994); 4) разработаны методики, позволяющие воспроизвести и количественно оценить в условиях in vitro все последовательные этапы в развитии ответной реакции тромбоцитов на разнообразные физиологические стимулы (Габбасов З.А. и соавт., 1989; Hohnsen Н., 1994); 5) нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза могут быть причиной либо кровоточивости, либо повышенного тромбообразования (Баркаган З.С., 1988; Гаврилов O.K., 1981; Белоусов Ю.Б., 1986); 6) важным фактором выбора модели агрегации тромбоцитов послужила клиническая эффективность препарата в состояниях с гиперагрегационной активностью последних (данные по антиагрегационному эффекту препарата были получены в работах Д.Ш. Еналеевой (1981, 1996), В.И. Покровского и соавт. (1982), B.C. Морокова (1988), В.Х. Фазылова (1995),

а также в наших совместных работах с В.Н. Цибулькиной и О.Б. Ибрагимовым (1996)).

В связи с вышеперечисленным мы выбрали указанную модель с использованием разнообразных групп агонистов, реализующих свой эффект через различные биохимические пути активации тромбоцитов, для выполнения запланированного исследования. Изложенный в диссертации материал представляет собой логическое продолжение совместных работ с В.Н. Цибулькиной и

0.Б. Ибрагимовым, предположивших возможность наличия у препарата антагонизма кальцийзависимым звеньям активации.

Цель исследования - на модели антиагрегационного действия димефос-фона на тромбоциты раскрыть механизмы реализации влияния препарата на универсальные процессы клеточной активации.

Задачи исследования:

1. В прямых исследованиях оценить особенности изменения концентрации внутриклеточных ионов кальция как фактора, определяющего характер антиагрегационного действия димефосфона.

2. Изучить возможность подавления димефосфоном клеточной активации через влияние на системы внутриклеточных посредников.

3. Исследовать особенности тромбоцитарной активации при взаимодействии димефосфона с соединениями, обладающими свойствами усиления трансмембранного тока ионов кальция или снижения его внутриклеточного содержания за счет комплексообразования.

4. Изучить влияние выявленных универсальных механизмов антиагрегационного действия димефосфона на особенности клеточного взаимодействия в системе «тромбоцит - эндотелиальная клетка».

Научная новизна. Проведено углубленное исследование универсальных механизмов действия димефосфона на модели активации тромбоцитов с использованием расширенного комплекса индукторов их агрегации. Доказано отсутствие прямой связи антиагрегационного эффекта препарата с изменениями в системе аденилатциклаза - цАМФ. Исключена возможность реализации тера-

певтического действия препарата через звено циклооксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты.

Впервые доказано, что в основе воздействия препарата на процессы клеточной активации лежит его способность модулировать движение ионов кальция через клеточные мембраны.

Впервые исследованы механизмы действия димефосфона в комплексной системе взаимодействующих компонентов: сосудистая стенка - тромбоциты.

Практическая значимость. Влияние димефосфона на универсальный механизм клеточной активации - трансмембранный перенос ионов кальция с последующим изменением его внутриклеточной концентрации - определяет широту клинического применения препарата.

Способность димефосфона подавлять кальцийзависимые процессы клеточной активации позволит прогнозировать еще не выявленные эффекты в области клинического применения препарата.

Выявление разнонаправленных эффектов действия препарата в комплексных клеточных системах предполагает проведение клинических испытаний с формированием оптимальных схем применения димефосфона с целью получения максимального клинического эффекта.

Положения, выносимые на защиту.

1. Антиагрегационное действие димефосфона реализуется за счет влияния препарата на один из универсальных механизмов клеточной активации - содержание ионизированного внутриклеточного кальция. Торможение увеличения внутриклеточной концентрации ионов кальция в ответ на АДФ определяет подавление агрегации тромбоцитов.

2. Регуляция димефосфоном системы внутриклеточного кальция реализуется на уровне непосредственного влияния препарата на функционирование кальцийтранспортирующих систем.

3. В системе эндотелий - тромбоциты антиагрегационное действие димефосфона может нивелироваться под влиянием подавления выработки эндотелием гуморальных кальцийзависимых факторов с антиагрегационной активностью.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии», г.

Казань, 1995;

- II республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов, г.

Казань, 1996;

- Республиканской научно-практической конференции «Новые методы диагно-

стики и лечения», г. Казань, 1996;

- Российской конференции «Фармакология и токсикология фосфорорганиче-ских и других биологически активных веществ», г. Казань, 1996;

- научных конференциях молодых ученых Казанской государственной медицинской академии, 1997, 1998;

- V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» г. Москва,

1998;

- заседании сотрудников кафедры биохимии Казанскогогосударственного уни-

верситета (1998).

Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертации внедрены и используются в учебном процессе на кафедре клинической иммунологии с аллергологией, а также на кафедре фармакологии Казанского государственного медицинского университета.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы (90 отечественных и 169 иностранных источников). Работа объемом 132 страницы включает 23 таблицы и иллюстрирована 10 рисунками.

10

Глава 1 Обзор литературы Механизмы активации и ингибирования тромбоцитов

Тромбоциты представляют собой безъядерные клетки, в цитозоле которых располагаются характерные органеллы: ос-гранулы, плотные гранулы и ли-зосомы, а также митохондрии, вакуоли, пероксисомы, аппарат Гольджи и структуры, не имеющие мембран: гранулы гликогена, микротрубочки и мик-рофиламенты. Кроме того, тромбоциты содержат систему открытых каналов и плотную тубулярную систему, функционирование которых связано с секреторными процессами (Самаль А.Б. и др., 1990).

К основным свойствам тромбоцитов относится способность к адгезии, изменению формы, агрегации и реакции высвобождения содержимого их внутриклеточных гранул. Кроме того, тромбоциты секретируют некоторые белки, участвующие в процессе коагуляции, а также факторы роста, задействованные в репарации повреждений. Все эти биологические реакции тромбоцитов запускаются в ответ на разнообразные экзогенные стимулы и являются частью гемо-статического процесса. Развитию тромбообразования противостоит другая группа агентов, предотвращающих секрецию и агрегацию кровяных пластинок. Для реализации соответствующих тромбоцитарных ответов как на стимулирующие, так и на ингибиторные воздействия необходимо наличие определенных механизмов передачи сигнала с активированных поверхностных рецепторов во внутриклеточное пространство. Слаженное функционирование всех внутриклеточных систем обеспечивает нормальное выполнение тромбоцитами своих биологических функций.

1.1. Механизмы активации тромбоцитов

В состоянии покоя тромбоциты имеют форму гладких двояковыпуклых дисков и не взаимодействуют ни друг с другом, ни с другими клетками крови, ни с поверхностью сосуда, покрытой сплошным слоем эндотелиальных клеток (Мазуров A.B., Васильев С.А., 1994). Сохранение эндотелия является важней-

тттим условием атромбогенности сосудистой стенки (Долгов В.В., 1988). Повреждение сосудистого эндотелия механическими факторами либо в результате патологических процессов приводит к потере им своих атромбогенных свойств, в этом случае тромбоциты подвергаются воздействию различных активирующих стимулов.

1.1.1. Адгезия тромбоцитов. Рецепторный аппарат, опосредующий процесс адгезии Формирование тромбоцитарной пробки начинается с изменения формы кровяных пластинок от дисковидной к сферической (Шитикова A.C. и др., 1997) и их адгезии к субэндотелиальным структурам сосудистой стенки. В участках с медленным током крови и низкой скоростью сдвига (в крупных венах) адгезия тромбоцитов происходит при их взаимодействии с коллагеном, фибро-нектином и ламинином (Bennett J.S., Kolodziej М.А., 1992).

Фибронектин, часто называемый главным адгезирующим фактором, вызывает прилипание и распластывание клеток на фибрине и коллагене (Литвинов Р.И. и др., 1987). Домен молекулы фибронектина, взаимодействующий с клеточными рецепторами тромбоцитов и других клеток, имеет в своем составе аминокислтную последовательность RGD (Arg-Gly-Asp), которая является общей для ряда адгезирующих белков (Юранек И.О. и др., 1989). Не исключено, что фибронектин выступает в роли регионального регулятора взаимодействия тромбоцитов с поврежденной сосудистой с�