Роль эритроцитов и лейкоцитов в поддержании активности тромбоцитов в зависимости от состояния перекисного окисления липидов

Вакулин, Андрей Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль эритроцитов и лейкоцитов в поддержании активности тромбоцитов в зависимости от состояния перекисного окисления липидов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль эритроцитов и лейкоцитов в поддержании активности тромбоцитов в зависимости от состояния перекисного окисления липидов"

На правах рукописи

ВАКУЛИН АНДРЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

РОЛЬ ЭРИТРОЦИТОВ И ЛЕЙКОЦИТОВ В ПОДДЕРЖАНИИ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОСТОЯНИЯ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

03.00.04. - Биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск -1998

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Роль клеток крови в гемостазе несомненна, однако один из трех компонентов гемостаза называют не клеточным, а тромбоцитарным, подчеркивая преимущественный вклад ТЦ в сохранение агрегатного состояния крови [Д.М.Зубаиров, 1978; З.С.Баркаган, 3S88; А.ТП.Бышевский и др., 1993]. Вместе схем, известно, что все клетки крови участвуют в ее стабилизации и свертывании [Б.И.Кузник, В.П.Скипетров, 1974], однако ограничены данные о взаимодействии клеток крови в гемостазе, в частности, о роли эритроцитов и лейкоцитов в активации ТЦ и в высвобождении ими факторов, непосредственно участвующих в гемокоагуляции.

Есть немало свидетельств разносторонней кооперации ТЦ и других клеток крови. Показано, что эритроциты и лейкоциты могут опосредованно участвовать в регуляции гемостаза: при некоторых заболеваниях одновременно активируется агрегация эритроцитов и ТЦ [Н.Р.Иванов и др., 1984; Г.Я.Левин, С.Б.Кораблев, 1984], все виды клеток крови - источники коагулоактивных фрагментов клеточных мембран [Д.М.Зу-баиров и др. 1984; О.А.Терсенов 1984; А.Ш.Бышевский и др., 1993], се-риновая протеаза нейтрофилов усиливает агрегацию ТЦ [Selac et aL 1988], лейкоциты концентрационнозависимо влияют на высвобождение p-тромбоглобулина из ТЦ [Pietersz et aL, 1988], тромбоцитарный про-стагландин Е] влияет на продукцию супероксида нейтрофилами [Umeki, 1994], фосфолипаза А2 биомембран клеток крови активирует процессы образования эндоперекисей в ТЦ и может инициировать "кислородный взрыв" в нейтрофилах [Н.В.Кучник и др., 1994].

Клетки крови вовлекаются во взаимную адгезию [Spangenberg et aL, 1992], протеазы лейкоцитов изменяют активность мембранных рецепторов ТЦ [Meyer et aL, 1993]. Взаимодействуют нейтрофилы и моноциты в культуральной жидкости [Г.П.Адаменко, 1993], а эритроциты и нейтрофилы - в фагоцитарном процессе [В.Ф.Кузнецов, Т.П.Обернебесова, 1994]. Стимулированные лейкоциты синтезируют большие количества фактора активации ТЦ [Naraba et aL, 1993]. Эластаза из нейтрофилов разрушает гликопротеид lb тромбоцитов [Azizet al„ 1993].

Работы, посвященные взаимосвязи между активацией ТЦ и другими клетками крови, единичны. Есть, однако, основания полагать, что процессы ПОЛ, тесно сопряженные с состоянием гемостаза [В.Л.Филатова, 1996], реализуют влияние на тромбиногенез через воздействие на клетки крови, в частности на ТЦ [И.В.Селиванова, 1994], об этом свидетельствует ограничение антиоксидантами агрегации ТЦ [А.Ш.Бышевский и др., 1994], данные о положительной корреляции между активностью ПОЛ и гемостаза [С.А.Ральченко, 1992; С.Л.Галян, 1993; В.А.Полякова, 1994; Т.П.Шевлюкова, 1995].

Отсутствие достаточных сведений о роли эритроцитов и лейкоцитов

Установлено также, что способность эритроцитов активировать ТЦ падает при введении in vivo аспирина или индометацина - факторов, способствующих стабилизации структуры и снижению интенсивности ПОЛ в этих клетках.

Впервые показано, что при экзогенной гипертромбинемии способность эритроцитов и лейкоцитов активировать ТЦ растет пропорционально уровню продуктов ПОЛ в эритроцитах и лейкоцитах. При повышении антиоксидантного потенциала эффект тромбинемии ограничивается.

Высказано предположение, что цепь циклических превращений, обусловливающих аутоактивацию гемостаза при усилении ПОЛ включает следующие звенья: активация ПОЛ-»активация тромбиногене-за->активация эритроцитов и лейкоцитов~»активация ТЦ-»активация ПОЛ (цикл замыкается).

Практическая ценность работы. При выполнении исследований разработан "Способ определения суммарного содержания фибринмономе-ров и ПДФ в плазме крови" (Авторское свидетельство № 1779693, зарегистрировано 17.12.1992 г).

Получен патент на тот же способ (№ 1779693, зарегистрирован в госреестре изобретений 12.01. 1994 г).

При составлении инструкции по клиническому испытанию ВИ-ТАКОМПЛЕКСА (к заявке в Фармакологический Комитет МЗ РФ), наряду с данными, полученными в Московской госакадемии физической культуры, НИ онкологическим институтом, научно-производственным объединением "Витамины" (Москва), Читинским госмединститутом, учтены результаты работ кафедры биохимии Тюменской медицинской академии, в том числе наши данные).

Получено удостоверение на рационализаторское предложение "Способ неспецифической профилактики тромбогеморрагических осложнений у беременных с гестозом" (соавторы Полякова В.А., Бышев-ский А.Ш., Шевлюкова Т.П. и др.). - ТГМА - 1997. - № 269. -

Данные, полученные нами, использованы при написании монографий "Витамины и здоровье женщины" (Красноярск, 1991), "Биохимические сдвиги в диагностике патологических состояний" (Новосибирск, 1993), "Витамины в профилактике тромбогеморрагических осложнений" (Тюмень, 1995), "Тромбоциты" (1996).

На основе полученных данных подготовлены и изданы методические рекомендации для врачей - акушеров и гинекологов:

1. Профилактика тромбогеморрагических осложнений в родах и послеродовом периоде" (Минздравмедпром, ТГМА, 3-я Городская клиническая больница. - 1997)

2. "Антиоксидантная терапия при гестозах" (там же, 1997)

Результаты работы внедрены в практическую деятельность ряда

гемостаза проводились преимущественно на крысах. Минимум крыс в группе нашли по индивидуальным колебаниям определявшихся показателей - математическая обработка методами вариационной статистики для малых рядов наблюдений (обсчет с учетом данных у 10 или 5 крыс) указала минимальное число особей в группе - п = 5. Самок не использовали - состояние гемостаза у них не устойчиво [В.Скипетров и др., 1964]. Учитывая зависимость гемостаза от сезона и метеофакторов [А.Ш.Бы-шевский, В.Н.Кожевников, 1986], во все эксперименты включали контрольную группу.

Кровь брали из v jugularis у наркотизированных (диэтиловый эфир) крыс. Стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия по правилам для гемостазиологических исследований [В.П.Балуда и др., 1980]. Рану закрывали кожным швом. Кровь для выделения клеток (исключая ТЦ) брали в шприц с раствором гепарина (5 ООО ед./мл), соотношение кровьтепарин - 9:1 [В.П.Балуда и др., 1980].

Методы. Агрегацию ТЦ оценивали, определяя: 1. Степень спонтанной агрегации ТЦ (модификация Н.И. Тарасовой [В.П.Балуда и др., 1980]; 2. АДФ-индуцированную агрегацию ТЦ (агрегометр "Биомак", конечная концентрация АДФ - 0,01 мг/мл), на агрегатограммах находили значения максимальной агрегации (МА), время ее достижения (Т), время достижения 1/2 МА (Т/2) и начальную скорость (tg а). [В.П.Балуда и др., 1980]. 3. Содержание ф. Р3 в плазме (по разнице показателей АВР плазмы до и после удаления ТЦ) [Rabiner, Groder, 1980]. 4. Реакцию высвобождение ф. Рз - (по разнице показателей АВР в плазме до и после АДФ-агрегации, предварительно удаляя ТЦ) [В.П.Балуда и др. 1980]. 5. Содержание ф. Р4 плазмы - по влиянию прогретой бедной ТЦ плазмы (источник термостабильного ф. Р4) на тромбин-гепариновое время свертывания субстратной плазмы (источник фибриногена и антитромбина III). Степень укорочение времени свертывания - мера активности ф. Р4. Разница во времени между свертыванием в системе (нормальная обедненная ТЦ плазма+0,14М NaCl+гегарин+тромбин) и системе (нормальная обедненная ТЦ плазма + такая же прогретая исследуемая плазма + гепарин + тромбин) характеризует активность свободного ф. Р4 в плазме. 6. Интенсивность высвобождения ф. Р4 в ходе агрегации ТЦ устанавливали по уровню ф. Р4 в плазме после АДФ-агрегации и удаления ТЦ. 7. Содержание серотонина (ф. Pjo) - в модификации А.П.Соломонова, Э.Г.Ларского [В.П.Балуда и др., 1980] спектрофлуоро-метрически и выражали в нг/109 клеток, для свободного ф. Рю - в нг на мл. Из-за большого объема плазмы для определений ф. Pi0 число крыс в группе удваивали. 8. Содержание ТЦ - унифицированным методом [В.В.Меныпиков, 1987]. 9. Нейтрофилы, моноциты и лимфоциты выделяли в градиенте фиколл/гипак (верографин) по Pandolfi et al., 1981. 10. Разделяли лимфоциты и моноциты изокинетическим методом [Ross,

позволяло судить о механизмах взаимовлияния. Важнейшие кофакторы агрегации ТЦ - тромбоксаны, синтез которых в ТЦ происходит так: 1) фосфолипиды мембраны ТЦ высвобождают при участии фосфолипаз арахидоновую кислоту (и ряд других продуктов), 2) арахидоновая кислота метаболизирует преимущественно по одному из путей (оксигеназному), продуцируя эндоперекиси простагландинов [Г.А.Тол-стиков и др., 1989; Hill, White, 1989], 3) простагландины - наиболее значимые продукты трансформации арахидоновой кислоты - превращаются при участии тромбоксансинтетазы в тромбоксаны, важнейший из них -тромбоксан А2 - кофактор агрегации [А.А.Кубатиев, С.В.Андреев, 1981; А.Ш.Бышевский и др. 1996].

Из модификаторов трансформации арахидоновой кислоты мы выбрали арахидонат - активатор процесса, аспирин и индометацин - его ингибиторы [Ф.И.Комаров, И.Н.Бокарев, 1980; К.М.Лакин, 1981; Glusa, 1984; Honey et. al, 1986; ]. Общие черты этих соединений - достаточная изученность, наиболее выраженная специфичность действия [Ф.И.Комаров, И.Н.Бокарев, 1980, Э.С.Габриэлян, С.Э.Акопов, 1985, К.М.Лакин, 1988], использование в лечебных целях.

В опытах in vivo использовали аспирин и индометацин в дозе, однократное введение которой угнетает агрегацию примерно на 50% (Dlso%)• Для активатора агрегации (арахидоната) эмпирически искали дозу, не вызывающую непосредственно агрегации, но модифицирующую АДФ -агрегацию.

Схема проведения экспериментов варьирует в зависимости от целей и задач и излагается при описании результатов.

В работе использованы: тромбин и фибриноген (Каунас), тромбопластин (г. Киров), эритрофосфатид (г. Минск), АДФ (Reanal), витамины А, Е, С и Р (Алтайский витаминный з-д), индометацин (Chinoin), арахидонат-№ (Sigma), димефосфон (Казань), аспирин и трасилол (Bayer), каолин, соли, основания и кислоты (х.ч.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние комбинации витаминов на активность ТЦ. До изучения влияния эритроцитов и лейкоцитов на активность ТЦ установили активность ТЦ у крыс, получающих комбинацию витаминов-антиоксидантов, димефосфон или прооксидант (ацетат свинца): крысы 1-й группы не получали комбинации витаминов, 2-й - получали ежедневно в составе рациона витамины А, Е, С и Р (0,18, 0,15, 50 и 45 мг/100 г массы в сут), 3-й группы - димефосфон (100 мг/100 г ежедневно), 4-й - ацетат свинца (5 мг/100 г, ежедневно). На 4, 8 и 12-й дни в пробах крови определяли показатели общей свертываемости и активности ТЦ (таблицы 1, 2 и 3).

Под влиянием витаминов CA снизилась на 4-й и еще заметнее на 12-й дни. Так же изменилась и МА. Димефосфон вызвал примерно то же: на 4-й и заметнее на 12-й дни снизились спонтанная и АДФ-

Это не изменило общей свертывающей активности (АВР и АЧТВ). Аналогично подействовал на все показатели димефосфон. При введении свинца выявились признаки ДВС: удлинение АВР, укорочение АЧТВ, снижение числа ТЦ и рост уровня фф. Р3 и Р4.

"Витаминизация" и димефосфон снизили уровень ф. Р!0 в плазме, прооксидант (свинец) вызвал противоположные сдвиги: признаки ДВС, рост уровня ф. Р,0 в плазме и снижение - в ТЦ.

Таблица 3. Влияние витаминов, димефосфона и ацетата свинца на содержание серо-тонина (ф. Рю ) в плазме и ТЦ крыс.

Группа Концентрация в плазме ф.Рю, нг/мл Концентрация в тромбоцитах ф. Р10, нг/109 ТЦ

Контроль 8,5+1,1 565±78

Витамины

4 день 7,9±0,6 572±83

8 день 6,8+0,2* 593±91

12 день 6,2+0,3* 659+79

Дим.

4 день 7,5+0,7 569+81

8 день 6,6+0,3* 578+87

12 день 5,9±0,4* 657+89

Ац. св.

4-й 8,1±1,0 571+45

8-й 8,3+1,2 589±51

12-й 9,5±1,1* 498±24*

Как видно из данных табл. 3, витамины и димефосфон ограничивают высвобождение фф, Р3, Р4 и Рю, уменьшают СА и АДФ-агрегацию. Прооксидант влияет в обратном направлении, следовательно, эффект витаминов - следствие антиоксидантной, а не специфической активности.

При оценке динамики фф. Р3, Р4 и Р]0 в ТЦ и плазме при таких же воздействиях выяснилось, что их накопление в ТЦ - следствие замедленного высвобождения.

Последующее возвращения уровня факторов в ТЦ к исходному указало, что рост их содержания связан не с ускоренным синтезом, а с замедленным высвобождением, компенсируемым затем замедлением синтеза.

Итак, "витаминизация", ограничивающая гипокоагулемию потребления при введении тромбина извне [А.Ш.Бышевский и др. 1991], эффективна, в частности потому, что она снижает активность ТЦ, т.е. способность участвовать в тромбиногенезе по внутреннему механизму (ф. Рз), ограничивает эффект гепарина (ф. Р4) и вазоконстрикцию (ф. Рю). Адекватно снижается СА и АДФ-агрегация. В целом, ограничивается вклад ТЦ в поддержание гемокоагуляционной активности. Связано ли изменение активности ТЦ с влиянием витаминов на их противоокисли-

Рис. 2. Высвобождение фактора Рз и Р4 при экспозиции с эритроцитами "невитаминизированных" (ЭН) и "витаминизированных" (ЭВ) крыс в зависимости от концентрации эритроцитов в млн/мкл (абсцисса).

Таблица 4. Изменения МА ТЦ после экспозиции с эритроцитами или лейкоцитами (конечная концентрация = 1/12, 1/8, 1/6 и 1/4 от физиологической)

Показатель Контроль (без клеток) Экспозиция кле "невитаминизированных" крыс гок, полученных от: "витаминизированных" крыс

эритроциты

МА,% 55,5+3,2 78+4,1(40)* 65,2+3,1(17)* 58,3+2,2(5) 55,3+2,1(0) 66,0+2,1(19)*" 60,0+2,3(8)* 55,5±2,2(0) 53,4+2,4(0)

лейкоциты

МА, % 55,5+3,2 98,3 ±2,4(76)* 76,3±2,7(35)* 62,4±2,7(12)* 56,8+1,4(2,3) 86,9±3,1(57)* 67,3±2.3(21)* 57,4±2,1(3,4) 5 5,1 ±2,4(0)

В колонках 3-й и 4-й - 1-я строка - 1/4, 2-я -1/6, 3-я - 1/8 и 4-я - 1/12 физиологической концентрации клеток; в скобках - сдвиг от контроля в %.

Влияние комбинации витаминов на изменения активности ТЦ, вызываемые нейтрофилами: 1-я группа - "невитаминизированные", 2-я - крысы, получавшие 12 дней комбинацию витаминов. Конечная концентрация нейтрофилов в реакционной смеси: 6,0, 3,0 и 1,5 тыс клеток/мкл (первое значение близко к физиологическому).

Из данных табл. 5 видно, что экспозиция с нейтрофилами усиливает агрегацию концентрационнозависимо, нейтрофилы "витаминизированных" крыс увеличивают агрегацию заметно слабее.

Высвобождение фф Рз, и Рю также изменялось заметнее при экспозиции с нейтрофилами "невитаминизированных" крыс и меньше -

Таблица 6. АДФ- МА ТЦ, содержание в плазме фф Рз, Р4 и Рю после инкубации с фракцией лимфоциты+моноциты "невитаминизированных" и "витаминизированных" крыс.

Показатель Контроль (без Экспонировали с фракцией лимфоци-

клеток) ты+моноциты, полученной от:

"невитаминизиро- "витаминизиро-

ванных" крыс ванных" крыс

МА,% 55,1+4,2 95,3+3,8* 76+3,1"

87,0 ±4,4* 63,2±3,2"

60,2+3,3* 52,9±3,3

89,9±4,1 123±6,2* 98+3,3"

Ф. Р3% 112±4,2* 90,1+3,6

92,7+2,7 92,1+2,4

2,9±0,03 6,7+0,04* 3,2+0,01"

Ф.Р4с 5,3±0,03* 3,2±0,03

4,2+0,03* 2,8±0,02

8,9±0,11 13,7±0,22* 9,6±0,05"

Ф.Рц) нг/мл 11,0±0,14 8,6+0,07

9,2+0,28 9,2±0,20

В 1-й, 2-й и 3-й строках данные, полученные в плазме, экспонированной с фракцией лимфоциты+моноциты в концентрации (по лимфоцитам) 2,5, 1,25 и 0,75 тыс кле-ток/мкл (близкая к физиологической, равная 1/2 и 1/4 от нее).

Сопоставляя изменения МА под влиянием клеток крови "невитаминизированных" и "витаминизированных" крыс, выбрали данные, полученные при добавлении к субстратной плазме клеток, в концентрации примерно равной физиологической. Это позволило сравнить вклад разных клеток в поддержание агрегационной активности ТЦ. Приводим (табл. 7) степень изменения агрегантной активности (в % от исходной величины - контроля). Оказалось, что все виды клеток повышают МА примерно в одинаковой степени. Эти же данные позволяют ориентировочно установить, какой тип клеток крови в сильнее активирует агрегацию после "витаминизации": проагрегантная активность эритроцитов "витаминизированных" крыс падает в 2,7 раза, нейтрофилов - в 1,4 раза, фракции лимфоциты+моноциты - в 1,9 раза. Следовательно, наибольшей проагрегантной активностью обладают у интактных животных нейтро-филы и фракция лимфоциты+моноциты. При "витаминизации" проагрегантная активность нейтрофилов снижается лишь на 40%, а фракции лимфоциты+моноциты - на 90%, однако и в этом случае их вклад в агрегатную активность ТЦ остается высоким, поскольку проагрегантная активность эритроцитов после "витаминизации" падает на 170% и вновь оказывается ниже, чем у других исследованных клеток. Вместе с тем, можно предположить, что роль антиоксидантов в ограничении коагуля-ционных сдвигов при тромбинемии в значительной степени реализуется через их влияние на проагрегантную активность эритроцитов и, в меньшей степени, - нейтрофилов и фракции лимфоциты+моноциты.

лили их агрегацию на 27% (концентрация 1/4 от физиологической), на 16% (1/6 от физиологической), а фракция лимфоциты+моноциты в тех же концентрациях на 42 и 27 %, т.е. в 1,7 и в 1,5 раза больше.

Таким образом, суммарный вклад лимфоцитов и моноцитов в поддержание агрегации ТЦ выше, чем у нейтрофилов на 50-70%. Вклад в поддержание агрегации ниже у клеток "витаминизированных" крыс: при концентрации нейтрофилов 1/4 от физиологической - 9%., при концентрации 1/6 - 3,6%, что ниже величин, найденных у "невитаминизированных" крыс в 3 и в 4,4 раза. Вклад фракции лимфоциты+моноциты в агрегантную активность ТЦ также снижен после "витаминизации" - соответственно в 1,5 и 1,7 раза.

Влияние комбинации витаминов на интенсивность изменений активности ТЦ, вызываемых моноцитами и фракцией лимфоциты+моноциты. Используемые методы позволяют выделить фракцию лимфоциты+моноциты, содержащую на 2 части лимфоцитов 1 часть моноцитов и около 1% нейтрофилов (количество, которым можно пренебречь при концентрациях в 1/4 и ниже от физиологической). В связи с этим для дифференциации эффекта моноцитов и лимфоцитов изучили: 1) влияние на агрегацию разных концентраций моноцитов (получены с чистотой 89%), 2) фракции лимфоциты+моноциты, 3) моноциты с добавлением фракции лимфоциты+моноциты в таком объеме, чтобы концентрация моноцитов стала равной одной из испытанных в индивидуальном виде. Так мы надеялись выяснить, какие из клеток (лимфоциты или моноциты) - носители проагрегантной активности и модифицируют ли лимфоциты проагрегантную активность моноцитов. Проагрегантная активность фракции лимфоциты+моноциты оказалась в этом эксперименте такой же, как это было установлено ранее. В той же степени, что и ранее, отразилась на проагрегантных свойствах клеток "витаминизация" (табл. 9). Увеличение доли лимфоцитов при прежних концентрациях моноцитов не изменило проагрегантной активности смеси лимфоциты+моноциты "невитаминизированных" и "витаминизированных" крыс. Следовательно, ответственны за проагрегантный эффект смеси моноциты, а не лимфоциты (напомним, что проагрегантная активность исследуемых клеток крови концентрационнозависима). Видимо, лимфоциты не обладают проагрегантными свойствами. Отметим также, что проагрегантная активность моноцитов выше, чем у других клеток: эритроциты и нейтрофилы при концентрациях 1/4 и 1/6 от физиологической ускоряют агрегацию "невитаминизированных" крыс на 40 и 17%, 27 и 16 соответственно. Моноциты при тех же концентрациях ускоряют агрегацию на 55 и 41%. Эритроциты и нейтрофилы "витаминизированных" животных повышают агрегацию ТЦ при этих же концентрациях слабее, чем моноциты.

Рис. 4. Максимальная АДФ-агрегация ТЦ (ордината, в %) после экспозиции с эритроцитами, нейтрофилами или моноцитами "витаминизированных" крыс в концентрациях 0,25, 0,16 и 0,125 от физиологической (абсцисса).

На рис. 5 видно, что вклад моноцитов "невитаминизированных" крыс в агрегантную активность ТЦ выше вклада других клеток. На втором месте эритроциты и за тем - нейтрофилы.

Рис. 5. Доля клеток "невитаминизированных" животных в поддержании агрегант-ной активности ТЦ. Сумма проагрегантных эффектов всех клеток - 100% (полный круг), секторы - вклад отдельного вида клеток (в % от общего).

На рис. 6 видно, что и после " витаминизации" вклад моноцитов в поддержании агрегантной активности ТЦ остается самым высоким, однако вклад эритроцитов ниже только в 1,5 раза (51/33), а не в 3,2 раза, как до "витаминизации". Вклад нейтрофилов остается наименьшим и отличается от вклада моноцитов в 3,2 раза как и ранее. Следовательно, "витаминизация" снижает в наибольшей степени вклад моноцитов и эритроцитов, вклад нейтрофилов в меньшей мере изменяется при введении витаминов-антиоксидантов.

Влияние комбинации витаминов на интенсивность изменений активности ТЦ, вызываемых эозинофилами. Использованные методы фракционирования клеток крови позволили выделить эозинофилы с чистотой (91%). По прежней схеме изучили их влияние на агрегантную активность ТЦ "невитаминизированных" и "витаминизированных" животных. Ни в одной концентрации эозинофилы не влияли на агрегацию. Поэтому изучили эффект эозинофилов в физиологической и удвоенной отнцентрациях. И в этом случае экспозиция эозинофилов ТЦ не влияла 1а АДФ-агрегацию: контроль - 59,4±2,8%, после экспозиции -

дает эти изменения.

Таблица 10. МА ТЦ в присутствии супернатанта, полученного после экспонирования клеток крови в забуференном растворе (п=5)

Показатель Контроль с рас- Введен супернатант после экспозиции с

творителем эритроцитами от:

"невитамянизиро- "витаминизированных"

ванных" крыс крыс

МА,% 59,4±2,8 75,0±и 64.3+1,2

Введен супернатант после экспозиции , с нейтрофилами от-

"невитаминизиро- "витаминизированных"

ванных" крыс крыс

МА,% 59,4+2,8 68,0+1,0 55,2+0,8

Введен супернатант после экспозиции , с

фракцией лимфоциты+моноциты от:

"невитаминизиро- "витаминизированных"

ванных" крыс крыс

МА,% 59,4±2.8 62.0+1.1 63.3+1.2

2. Повышенная активность ТЦ сопутствует активации процессов ПОЛ, вызываемой прооксидантом.

3. Экспозиция богатой ТЦ плазмы с клетками крови концентраци-оннозависимо усиливает АДФ-агрегацию ТЦ. По силе проагрегантного эффекта клетки можно расположить так:

нефракционированные лейкоциты >эритроциты или

эритроциты>лимфовдты+моноциты>нейтрофилы.

Уточнение эффекта лимфоцитов позволило (с учетом данных о про-агрегантной активности моноцитов) изменить ранжировку: моноциты>эритроциты>нейтрофилы

4. Лимфоциты и эозинофилы, видимо, не обладают проагрегантны-ми свойствами.

5. Проагрегантная способность всех изучавшихся клеток при росте антиоксидантного потенциала витаминами падает. Степень снижения у всех клеток при концентрациях, заметно удаленных от насыщающих, практически одинакова. Следовательно, все клетки, отличаясь по проаг-регантной активности, в равной мере утрачивают ее при повышении антиокислительного потенциала, т.е. все они опосредуют защитное действие антиоксидантов на ТЦ.

6. Проагрегантный эффект всех изученных клеток опосредуется соединениями, выделяемыми ими в среду.

Влияние на АДФ-агрегацию продуктов ПОЛ, содержащихся в плазме или в среде инкубации клеток крови. Зависимость между активностью ТЦ (усиление СА, АДФ-агрегадии и реакции высвобождения) и со-

Супернатант среды экспозиции клеток животных, получавших про-оксидант, активирует АДФ-агрегацию. С увеличением дозы прооксидан-та, следовательно и содержания продуктов ПОЛ, проагрегантный эффект усиливается. Видимо, клетки, обнаруживавшие в наших опытах проагре-гантную активность, реализуют ее путем повышения уровня продуктов ПОЛ в среде экспозиции.

Задача следующей серии опытов - выяснить, зависит ли проагрегантный эффект от концентрации продуктов ПОЛ. В пулированной бесклеточной плазме крови крыс, получавших прооксидант 20 дней (10 мг ацетата свинца/100 г ежедневно) обнаружена высокая концентрация ДК (2,21+0,001 А/мг липида) и ТБК-активных продуктов (1,32+0,0005 ед./мг липида). Обработка сефадексом G-10 позволила сконцентрировать продукты ПОЛ без больших потерь: при удалении 50% воды с пропорциональным удалением солей концентрация ДК и ТБК-активных продуктов равна соответственно 3,08 А/мг липида и 2,04 ед./мг липида.

Получили разведения, содержащие ДК и ТБК-активные продукты в концентрациях - 3,08 и 2,04; 1,54 и 1,02; 1,26 и 0,68; 0,77 и 0,51; 0,51 и 0,34 А/мг липида и ед./ мг липида соответственно. Равные объемы каждого разведения экспонировали с субстратной плазмой, определив затем АДФ-агрегацию и содержание в плазме фф. Р3, Р^ и Р]0. Контроль - за-буференный 0,14 М раствор NaCl.

На рис. 7 видно, что между концентрацией продуктов ПОЛ и МА ТЦ есть прямая зависимость, близкая к линейной в области физиологических концентраций продуктов ПОЛ,. С ростом концентрации кривая уплощается.

Таким образом, подтвердилось предположение о реализации эффекта антиоксидантов или прооксидантов на агрегационную активность ТЦ

Рис. 7. Зависимость МА ТЦ от концентрации продуктов ПОЛ. Абсцисса - концентрация: ] - исходная концентрация (ДК - 3,08 А/мг липида) + ТБК - 2,04 ед./мг липида), 0,5 и далее - доля исходной концентрации. Ордината - МА,%. Стрелка указывает на контрольный уровень МА.

Сдвиги уровня тромбоцитарных факторов в плазме (табл. 12) напоминают изменения агрегации: рост концентрации продуктов ПОЛ, пре-инкубируемых с ТЦ, усиливает реакцию высвобождения.

виях. Выявив проагрегантные свойства лейкоцитов, мы сочли необходимым выяснить, изменяется ли они при ситуации, характеризующейся напряжением гемостаза. Принимая во внимание связь между интенсивностью процессов ПОЛ и проагрегантной активностью эритроцитов и лейкоцитов, одновременно оценивали содержание ДК и ТБК-продуктов в этих клетках. Моделировали тромбинемию введением в яремную вену р-ра тромбина, концентрация и объем которого для этой цели описаны ранее [В.М.Шафер, 1989; С.Л.Галян, 1994]. Контрольным крысам вводили растворитель (0,14 М раствор ИаС1), подопытным - тромбин (0,! мл/100 г массы тела, активность - 25 с). Через 1 и 24 ч в пробах крови определяли гемокоагуляционные показатели.

Через 1 ч после инъекции тромбина (табл. 13) развилась гипокоагу-лемия потребления (удлинены АВР и АЧТВ, снижены ПИ и фибриноге-немия, содержание ТЦ). К 24 ч. показатели почти нормализовались. Содержание продуктов ПОЛ повысилось, что согласуется с эффектом при тромбопластинемии [С.Н.Ельдецова, 1990;]. В следующей серии исследований тромбинемию вызывали у крыс "невитаминизированных" и "витаминизированных". Через 1 ч после введения тромбина выделяли эритроциты и фракции лейкоцитов, и изучали их влияние на агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ.

Таблица 13 Реакция гемостаза на тромбин: 1-я строка -контрольные крысы - 2-я -крысам ввели тромбин.

Показатели Исходные Через 1 ч Через 24 ч

ПИ,% 99,2±4,4 95,7±3,4 95,1±3,9

38,2+1,1* 71,5±2,3*

АВР, с 69,0±3,9 65±1,4 63,2±3,3*

79+2,9* 74,8+3,1

АЧТВ, с 58,9+2,0 57,9+2,1 62,2+3,3

85,3±2,2* 60,0±3,2 (4)

Содержание ФГ, 2,12+0,02 2,10+0,001* 2,31±0,01

г/л 0,14±0,002* 1,7+0,01*

К-во ТЦ, 1096+38 869±22 899+29

тыс/мкл 511+21* 757±24*

Эритроциты

ДК, А/мг липида 0,042±0,0003 0,046+0,0004 0,039±0,0003

0,068±0,005* 0,044+0,0003

ТБК, ед./мг ли- 0,73±0,04 0,62±0,04 0,069+0,05

пида 089+0,05* 0,074±0,04

Лейкоциты нефракционированные

ДК, А/мг липида 0,053+0,0004 0,056+0,0003 0,054±0,003

0,076+0,0004* 0,059+0,0005

ТБК, ед./мг ли- 0,82+0,015 0,78+0,011 0,081+0,010

пида 1,10+0,022* 0,079±0,021

Диаграмма (рис. 9) иллюстрирует степень изменения реакции высвобождения тромбоцитарных факторов при тромбинемии у "невита-минизированных" крысы) - высвобождение усилено в наибольшей мере при экспозиции с моноцитами, затем с нейтрофилами. На фоне "витаминизации" высвобождение факторов уменьшено.

На рис. 10 сопоставлены эффекты тромбина на реакцию высвобождения на фоне витаминов и без них: "витаминизация" заметно снижает способность высвобождать факторы ТЦ у моноцитов, которые при тромбинемии отличаются высокой проагрегантной активностью. Видимо, их роль в эффекте антиоксидантов важна.

3 р и т р о ц . Нейтрофилы Моноциты

| ОР -з MP ■■» ШР-1 с~]

Рис. 10. Степень снижения способности высвобождать фф. P3iP4 иРю на фоне тромбинемии после "витаминизации".

Влияние ex vivo активатора и ингибитора превращений арахидоно-вой кислоты на проагрегантную активность лейкоцитов. Активация мембранных фосфолипаз лейкоцитов, как у ТЦ, высвобождает арахидо-новую кислоту - субстрат образования эндоперекисей, превращения ко- -торых ведут к появлению метаболитов, вызывающих агрегацию [Э.С.Габриелян, С.Э.Акопов, 1985]. Агрегацию лейкоцитов можно вызвать экзогенной арахидоновой кислотой (арахидонатом) ex vivo [Jakubowski et al. 1983; Rodrigues, 1995]. Это связано с ускорением в ее присутствии синтеза тромбоксанов [Bossia et al., 1988; Nordvi et al.,1995],

В связи со способностью лейкоцитов стимулировать АДФ-аг-регацию ТЦ и ее сопряженностью с активацией ПОЛ в клетках, требовалось установить, как влияет экспозиция арахидоната с лейкоцитами на их проагрегантную активность. По тем же причинам следовало изучить влияние ингибитора превращений арахидоната в лейкоцитах на их агрегацию. С этой целью использовали индометацин - ингибитор циклоокси-геназы в лейкоцитах [Ford-Hutchinson., Bray., Doigg. et al., 1979; 1980].

Экспонировали арахидонат или индометацин 15 мин со взвесью лейкоцитов в забуференном 0,14 М растворе NaCl (за это время арахидонат успевает внедриться в фосфолипиды мембран и изменить скорость превращений в циклооксигеназном пути). За тот же срок сказывается на превращениях арахидоната в циклооксигеназном пути индаметацин [Lapetina et al., 1981; Xhu et al., 1995].

Влияние арахидоната на проагрегантную активность лейкоцитов

Таблица 16. АДФ-агрегация (ex vivo) в зависимости от добавок арахидоната

Конечная концентрация Максимальная агрегация,

арахидоната, мкМ %

0,0 61,2+1,4

0,5 65,3+2,1

0,75 72,2+1,4*

1,0 77,3+2,0*

1,5 89,9+2,1*

2,0 98,7+4,2*

Для дальнейших экспериментов выбрали концентрацию 0,75 мкМ -при ее использовании достоверно растет АДФ-агрегация в степени, позволяющей оценивать эффект дополнительных воздействий (ингибиторов или активаторов), при этой концентрации арахидонат непосредственно не вызывает агрегации ТЦ (рис. 9). Не имея данных о влиянии этой концентрации на агрегацию лейкоцитов мы для гарантии уменьшили ее в экспериментах до 0,5 мкМ.

Влияние арахидоната на проагрегантный эффект лейкоцитов при "витаминизации" и без нее. Арахидонат (конечная концентрация 0,5 мкМ) вносили во взвесь лейкоцитов "невитаминизированных" и "витаминизированных" крыс на 15 мин, затем переносили лейкоциты (центрифугирование и отмывание) в субстратную плазму и через 15 мин определяли МА АДФ-агрегацию. В этом эксперименте изучали и лимфоциты, допуская, что активация каскада арахидоновой кислоты может изменить их влияние на агрегацию ТЦ (табл. 17).

Оказалось, что: 1. Неикубированные с арахидонатом лейкоциты обнаруживают проагрегантную активность, близкую к установленной ранее; 2. "Витаминизация" ограничивает, как это уже было показано проагрегантную активность; 3. Инкубация с арахидонатом повышает проагрегантную способность лейкоцитов в большей степени в опытах с клетками "невитаминизированных" крыс; 4. Интенсивнее растут при инкубации с арахидонатом проагрегантные свойства нейтрофилов и особенно моноцитов. Фракция лимфоцитов обнаруживает слабую проагрегантную активность, возможно, за счет примеси моноцитов; 5. "Витаминизации" ограничивает рост проагрегантной активности сильнее у нейтрофилов, преинкубированных с арахидонатом - разница между проагрегантной активностью нейтрофилов "невитаминизированных" и "витаминизированных" крыс - 26, у моноцитов - 6 %, у лимфоцитов несущественна.

Влияние индометацина на агрегацию ТЦ. Исследования начали с поиска дозы, тормозящей агрегацию in vivo примерно на 50%, ориентируясь на следующее. Эффективная доза аспирина для крысы (15 мг/100 г) примерно в 83 раза больше соответствующей дозы для человека (0,18 мг/100 г) [К.М.Лакин, В.П.Балуда, 1981]. Разовая доза индометацина для человека - 0,04-0,08 мг/100 г массы. Можно ожидать, что при увеличении этой дозы в 83 раза будет найдена эффективная антиагрегатная доза. Так как аспирин и индометацин различаются по антиагрегантной активности, так как аспирин сильнее индометацина угнетает фосфолипазу Аг, обладая свойствами антагониста кальция, дозы могут существенно отличаться. Поэтому, начали поиск в широком диапазоне доз, поставив в центр диапазона дозу индометацина для человека, умноженную на 83 (0,04 или 0,08 мг/100 г, умноженные на 83), т.е. 3,3 и 6,6 мг/100 г массы соответственно. Заметим, что есть сведения о том, индометацин в дозе 0,3 мг/100 г не влияет на тромбоцитопению, индуцированную у животных введением АДФ от 3 до 300 мкг/кг [Honey et al., 1986]

Индометацин вводили однократно в суточной порции рациона (хорошо усваивается в желудочно-кишечном тракте), отбирая пробы через 1 день. Влияние на агрегацию наблюдали, начиная с дозы 2,0 мг/100 г (табл. 18), а при дозе 5,5 мг торможение равнялось 46%, при дозе 6,5 мг/100 г - 54%. При дозе DI5o (6 мг/100 г), индометацин на высоте всасывания присутствует в крови в концентрации примерно равной 0,3 мг/мл (5 мл крови на 100 г массы, следовательно, 6 мг/20). От этой концентрации мы исходили в опытах ex vivo, расширив ее в обоих направлениях. ТЦ инкубировали с индометацином при разных конечных концентрациях препарата в субстратной плазме.

Таблица 18. Влияние индометацина на агрегационную активность ТЦ in vivo

Индометацин, Максимальная агре-

мг/100 г гация, %

0, контр. 59,5+3,4

1,5 мг 59,1±4,3

2,0 мг 48,1+2,9*

3,0 мг 43,1±3,4*

3,5 мг 39,1±3,1*

4,0 мг 34,9±5,5

5,5 мг 33,1+2,3*

6,5 мг 27,1±3,4*

7,5 мг 21,1±1,7*

* - достоверные отличия от контроля.

Из данных табл. 19 следует, что при конечной концентрации 0,050 мг/мл достаточно заметно тормозится агрегация, т.е. превращения ара-хидоновой кислоты. Эту концентрацию использовали.

ментов таков: ускорение превращений арахидоновой кислоты в лейкоцитах повышает их проагрегантную активность, а торможение - ограничивает. Ограничение вызывает и специфический антиагрегант - индомета-цин, и комбинация антиоксидантов-витаминов. Эффекты индометацина и витаминов ex vivo суммируются.

Заключая работу, мы изучали влияние in vivo ингибиторов каскада арахидоновой кислоты на проагрегантную активность лейкоцитов и эритроцитов, и уровень продуктов ПОЛ в них.

Влияние in vivo ингибиторов трансформации арахидоновой кислоты на проагрегантную активность эритроцитов и лейкоцитов и интенсивность ПОЛ в них . Изучали два ингибитора трансформации арахидоновой кислоты, действующие на ее превращения на разных уровнях: 1. Аспирин - необратимый ингибитор циклооксигеназы, снижающий тромбопластическую активность эритроцитов путем ограничения интенсивности процессов ПОЛ в них и подавления адгезивности эритроцитов к сосудистой стенке [Э.С.Габриелян, С.Э.Акопов, 1985]; 2. Индометацин обратимый ингибитор циклооксигеназы, протектор мембран (особенно эритроцитарных), уменьшающий разрушительный эффект свободных радикалов [А.1Н.Бышевский и др., 1996]. Общая точка их действия - угнетение фосфолипазы А2, вовлекающей арахидонат в превращения, ведущие к образованию активных простагландинов [Bollinger, Rhyner, 1983].

Аспирин. Эффективная доза аспирина по данным литературы для крысы - 15 мг/100 г массы [К.МЛакин, ВИБалуда, 1981]. Мы изменяли эту дозу в поисковом опыте, чтобы найти DIso%.

Таблица 21. Влияние аспирина /АС/ в разных дозах на агрегацию ТЦ in vivo.

АС в мг/100 г МА, % светопропускания

0, контр. 57,1+5,4

1 56,2+1,3

5 52,9±2,2

10 49,9+5,3

15 28,1+3,2*

20 23,1+3,5*

25 19,1+2,7*

АС - аспирин, МА - максимальная агрегация ТЦ;

О15о% аспирина оказалась равной 15 мг/100 г (табл. 21), ее увеличение существенно не влияет на агрегацию, а эффект согласуется с данными у человека [К.М.Лакин, В.П.Балуда, 1981]. В этой дозе аспирин вводили "невитаминизированным" и "витаминизированным" крысам, через 1 ч получали эритроциты и лейкоциты, определяя содержание продуктов ПОЛ в них и влияние клеток на агрегацию ТЦ. Те же исследования провели в контроле.

Таблица 23. АДФ-агрегация интактных ТЦ после экспозиции с нейтрофилами "невитаминизированных" и "витаминизированных" крыс, получивших аспирин, продукты ПОЛ в нейтрофилах.

Нейтрофилы взяты из крови: МА,% ДК, А/мг липида ТБК, ед/мг липида

Интактных крыс 68,1+1,1* 0,034+0,001 0,43±0,03

Получивших АС "невитаминизированных" "витаминизированных"

63,2+1,2** 0,02710,0009* 0,37±0,02*

59,5+0,4** 0,022±0,0007** 0,28±0,01**

МА ТЦ плазмы без экспозиции с эритроцитами -57,1+0,9

Обозначения - как в табл. 21.

Таблица 24. АДФ-агрегация интактных ТЦ после экспозиции с моноцитами "невитаминизированных" и "витаминизированных" крыс, получивших аспирин, ПОЛ в моноцитах.

Моноциты взяты от: МА,% ДК, А/мг липида ТБК, ед/мг липида

Интактных крыс 91,1±1,6* 0,065+0,003 1,03+0,03

Получивших АС "невитаминизированных" "витаминизированных"

79,-0±1,2** 0,051 ±0,003* 0,84±0,04*

63,1+1,1** 0,042±0,002** 0,69+0,02**

МА ТЦ плазмы без экспозиции с эритроцитами -57,2±0,9

Обозначен^ - как в табл. 22.

Влияние индометацина на проагрегантную активность эритроцитов и лейкоцитов. Опыты проведены как с аспирином. Индометацин вводили в дозе DI50, установленной ранее - 6 мг/100 г.

Выявлены (табл.'25) изменения эритроцитов той же направленности, что и при введении аспирина. Различие - выраженное снижение проагрегантной активности на фоне индометацина (по сравнению с аспирином) и на фоне индометацина после "витаминизации". Это объясняется тем, что индометацин - протектор мембраны эритроцитов (упомянуто выше) и подтверждается более глубоким, по сравнению с аспирином, торможением процессов ПОЛ.

связь между ПОЛ и изучавшимися функциями лейкоцитов.

Таблица 27. АДФ-агрегация интактных ТЦ после экспозиции с моноцитами "невитаминизированных" и "витаминизированных" крыс, получивших индомета-цин, продукты ПОЛ в моноцитах.

Моноциты взяты из крови: МА,% ДК, А/мг липида ТБК, ед/мг липида

Интактных крыс 93,01+1,7* 0,069+0,0004 1,10±0,06

Получивших ИМ "невитаминизированных" "витаминизированных"

88,9+1,2* 0,061±0,0003 0,89±0,04

79,2±1,1** 0,056+0,0003** 0,79+0,03*

МА тромбоцитов плазмы без экспозиции с моноцитами -58,6±1,3

Обозначения: ИМ - индометацин, остальное - как в бал. 21.

Заключая анализ всех исследований, отметим основное.

Эритроциты и лейкоциты активируют ТЦ в концентрациях 1/2 и 1/4 от физиологической, при физиологической концентрации агрегация ТЦ близка к предельной - около 100% (не агрегированная часть ТЦ, видимо, представлена рефрактерными формами).

Существует связь между влиянием эритроцитов и лейкоцитов на активность ТЦ и состоянием процессов ПОЛ в них.

Опосредуют эффект эритроцитов и лейкоцитов соединения, выделяемые ими в окружение. Эти соединения представлены, в частности, продуктами ПОЛ: торможение процессов ПОЛ сопровождается снижением вклада эритроцитов и лейкоцитов в активацию ТЦ, интенсификация процессов ПОЛ увеличивает вклад.

В конечном счете, эритроциты и лейкоциты (нейтрофилы и в большей степени моноциты) участвуют в поддержании активности ТЦ в кровотоке. Ранее высказывавшееся предположение о роли ТЦ как основного звена связи между процессами ПОЛ и гемостазом дополняется представлением о промежуточной роли эритроцитов, нейтрофилов и моноцитов. При тромбинемии различного происхождения проагрегантная и "высвобождающая" активность этих клеток заметно увеличивается, следовательно, они могут рассматриваться как промежуточное звено в замкнутом цикле "активация тромбиногенеза активация ПОЛ активация тромбиногенеза", который можно на основании наших данных представить следующим образом:

активация тромбиногенеза активация ПОЛ в эритроцитах и лейкоцитах (нейтрофильных и моноцитах) активация тромбоцитов активация тромбиногенеза.

Способность гидроперекисей, представляющих в совокупности продукты ПОЛ, активировать ТЦ, установлена ранее - они давно рассматриваются как индукторы активации ТЦ, функциональная активность которых определяется двумя группами факторов:

ФОСФОЛИПИДЫ МЕМБРАН (Фосфатидилинозитол. Фосфатидилэтаноламин. Фосфатидилхолин) 1] <~<-фосфолипаза С фосфолипаза Аз —>-» У

Диглицерид

<~диглицеридлипаза

Арахидоновая кислота

У <—<—липооксигеназа

5-НРЕТЕ *-<-пероксидаза V «-дегидраза 5-НЕТЕ + Лейкотриен А4 К <г-<- Глутатионтранс-11 фераза и гидролазы

Арахидоновая кислота У <-циклооксигеназа ЖК

эндопероксид РС2 У <- пероксидаза эндопероксид РСН2

У <- простациклинситетаза У изомераза, редуктаза У <- тромбоксансинтетаза (1

МДА + гидроксигептадекатрие-У новая кислота, 6-кето РОЕ2,

и 6-15-дикето РСР,.

Лейкотриены

В4, С4 и В4

Обозначения к схеме: У - превращения, - воздействие, выделены субстраты и продукты, обычный шрифт - ферменты.

ВЫВОДЫ:

1. Введение в организм животных антиоксидантов снижает активность тромбоцитов, ограничивая их агрегацию и высвобождение факторов Р3, Р4 и Р,0.

2. Эритроциты, нейтрофилы и моноциты при экспозиции с тромбоцитами нормальной плазмы повышают их активность, что выражается увеличением способности кровяных пластинок к агрегации и высвобождению факторов Р3, Р4 и Р10. По способности активировать тромбоциты на первом месте - моноциты, затем эритроциты и нейтрофилы. Эозино-филы и лимфоциты не активируют тромбоциты при экспозиции с ними.

3. Способность эритроцитов и лейкоцитов активировать тромбоциты усиливается при ускорении процессов перекисного окисления липидов и ослабляется - при повышении антиоксидантного потенциала введением витаминов-антиоксидантов или синтетического антиоксидан-та димефосфона.

4. Для реализации активирующего влияния эритроцитов и лейкоцитов на тромбоциты не требуется их непосредственный контакт - эффект может быть реализован соединениями, высвобождаемыми клетками в среду.

5. Способность активировать тромбоциты увеличивается при стимуляции и ослабляется при торможении в лейкоцитах каскада превращений арахидоновой кислоты, вызываемых соответственно избытком субстрата или угнетением циклооксигеназы.

логии. - Тюмень, 1992. - С. 75 (соавт.: В.АЛолякова, Т.В.Соболь, В.Н.Кожевников и др.)

5.Способ определения суммарного содержания фибринмономеров и ПДФ в плазме крови // A.C. 1779693. - Бюлл. № 45 07.12.92

6.Неспецифическая профилактика гемокоагуляционных сдвигов витаминами // Международный симпозиум "Биологически активные добавки к пище - нутрицевтики - и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях". Тюмень,

1995. - С. 30-31 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, В.Г.Соловьев др.).

7.Антиагрегационный эффект аспирина на фоне витаминов-анти-оксидантов // Медико-биологический вестник им. Я.Д.Витебского. -

1996. - 2 (6). - С. 21-22. (соавт.: С.Л.Галян, И.А.Дементъева, А.Х.Сабиров).

8.Витамины-антиоксиданты снижают угрозу тромбоза // Международный симпозиум "Медицина и охрана здоровья": тез. докл. Тюмень, 1996.

- С. 19 (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, И.А.Дементьева и др.)

9.Влияние эритроцитов и лейкоцитов на активацию тромбоцитов in vitro // Доктор Лэндинг. Регистр. № 012186. - 1996. - 6 (15). - 1997. - 1 (16).

- 1. - С. 37-40. (соавт.: А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, И.А.Дементьева и др.)

Ю.Влияние витаминов А, Е, С и Р на антаагрегантный эффект делагила // Медико-биологический вестник им. Я.Д.Витебского. - 1997. Регистр. № Е-0527. - 1. - С. 8-9. (соавт.: С.Л.Галян, И.А.Дементьева, И.В.Ральченко и ДР-)

11.Влияние на АДФ-агрегацию продуктов перекисного окисления ли-пидов, содержащихся в плазме или среде инкубации клеток крови // Медико-биологический вестник им. Я.Д.Витебского. Регистр. № Е-0527. -

1997. - 1. - С. 10-12 (соавт.: А.Ш.Бышевский, И.А.Дементьева, Д.С.Марченко и др.)

12.Механизм защитного эффекта витаминов-антиоксидантов на гемостаз // Тез. докл. Научно-практич. Конф. "Актуальные проблемы медицины: ТНЦ СО РАЕН, ТГМА. - Тюмень, 1996. - С.21 (соавт.: В.М.Ша-фер,, К.В. Горбатиков, И.А.Дементьева и др.)

13.0 целесообразности применения витаминов-антиоксидантов при угрозе тромбообразования // Там же. - С. 16 (А.А.Нелаева, В.АЛолякова, В.М.Шафер и др.)

14.Коррекция функционального состояния тромбоцитов (обзор) // Научный вестник ТГУ. ISBN 5-88081-46-1. Биология. - 1997. - 2. С. 42-49 (соавт.: А.Ш.Бышевский, СЛ.Галян, И.А.Дементьева и др.)

15.Защитный эффект аспирина на фоне введения витаминов-антиоксидантов // Научный вестник ТГУ. ISBN 5-88081-46-1. Биология. -1997. - 2. С. 50-52 (соавт.: С.Л.Галян, И.А.Дементьева)

Используемые в работе сокращения

АВР - активированное время рекальцификации

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ДК диеновые конъюгаты (первичные продукты ПОЛ)

МА - максимальная агрегация

МДА - малоновый диальдегид

ПИ - протромбиновый индекс

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СА - спонтанная агрегация

ТБК -активные - продукты, реагирующие с тиобарбитуро-вой кислотой (вторичные продукты ПОЛ) ТЦ - тромбоциты ф. - фактор

ФАТ - фактора активации тромбоцитов фф. - факторы ФГ - фибриноген

Вакулин Андрей Анатольевич