Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние игибиторов превращений арахидоновой кислоты на агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов, на непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние игибиторов превращений арахидоновой кислоты на агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов, на непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину"

ТКАЛЕНКО Илья Александрович

ВЛИЯНИЕ ИГИБИТОРОВ ПРЕВРАЩЕНИЙ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ НА АГРЕГАЦИЮ И РЕАКЦИЮ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ТРОМБОЦИТОВ,

НА НЕПРЕРЫВНОЕ ВНУТРИСОСУДИСТОЕ СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ И ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ТРОМБИНУ

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.01.04-БИОХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2012

005010961

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Шаповалов Пётр Яковлевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Высокогорский Валерий Евгениевич

доктор медицинских наук,

профессор Соловьев Владимир Георгиевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития России.

заседании диссертационного сов ,, ■ ж-_____,________________„___

ном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

у р

Автореферат разослан « ^ 2012 г

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь диссертационного совета

Тишевская Н.В.

Актуальность проблемы

Анализ данных современной литературы позволил сформулировать то, что свидетельствуют о целесообразности избранного нами направления исследований: 1. Состояние гемостаза при разных заболеваниях и внешних воздействиях, в том числе и санологических, обычно оценивают по немногим показателям или их сочетаниям, не позволяющим судить об интенсивности взаимодействия тромбин-фибриноген (ВТФ) в кровотоке, и это не всегда позволяет оценить интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) [Б.А Кудряшов, 1975; А.Ш.Бышевский и др.., 1987; 1990; Б.И.Кузник, 2010: К. Talbot е.а., 2010]. 2. Интенсивность НВСК характеризует степень напряжения в гемостазе [Д.М.Зубаиров, 2000; А.П. Момот, 1990; А.Ш.Бышевский и др., 2001;

З.С.Баркаган, 1998; Т.А.Батрак, 1999; О.Ф.Мысник и др., 2000: В.Ф.Киричук и др., 2002; I.Haszon е.а., 2003; H.M.Spronk е.а., 2003], определяя в значительной мере наклонность к гипер- или гипокоагулемии [З.С.Баркаган, 1998; Д.М Зубаи-ров и др., 1989; И.Н.Бокарев, 2000, 2002; I.Haszon е.а., 2003; М Levi е.а., 2004], что доказано при изучении НВСК в циркадном и сезонном ритмах [В.П.Балуда и др., 1978; А.Ш.Бышевский, В.Н.Кожевников, 1986], а в последние годы - в эксперименте и в клинике [Е.А.Винокурова, 2003; Л.А.Васильев, 2009;

B.В.Кондаков, 2009; Е.М.Шаповалова, 2009: S.Y.Joo е.а., 2010]. 3. Из клеток крови и эндотелиоцитов тромбоциты (ТЦ) важнейшие регуляторы свертывания, будучи полифункциональными, они могут быстро изменять гемокоагуляцию в разных регионах, особенно в микроциркуляции [Д.М.Зубаиров, 1978; Б.И.Кузник и др. 1989; Б.И.Кузник, 1990, 2010; С.А.Шитикова, 2000]; активация ТЦ или снижение их коагулоактивности нередко обусловливает формирование тромбофи-лической или гемофилической наклонности, что подтверждено наблюдениями за состоянием ТЦ при гиперкоагулемии первичной и вторичной [А.Ш.Бышевскии и др., 1996, 2005; G.Caimi е. а., 1995]. 4. Свойство ЦТ изменять гемостатический потенциал связано с их активацией, включающей сдвиги, из которых важны и могут контролироваться их способность к агрегации, к реакции высвобождения (секреция содержимого плотных и а-гранул) [Б.И.Кузник и др. 1989, 1990, 2010;

C.А.Шитикова, 2000; З.С.Баркаган, 1988; 1998; G.Nubile е. а., 1982; R.Nosal е. а.,

1995; F.R.Dembitzer е.а., 2010].

5. Клиницисты используют как лечебные средства соединения, которые тор-

мозят агрегацию ТЦ и реакцию высвобождения, воздействуя на механизмы этих процессов (поиск таких средств воздействия не прекращается); течение агрегации можно модифицировать на разных стадиях трансформации арахидоновой кислоты. Особенно эффективны воздействия на уровне катализируемых цикло-оксигеназой превращений, ведущих к образованию эндоперекисей. К средствам воздействия на агрегацию ТЦ относятся широко применяющиеся (и не только как антиагреганты) ацетилсалициловая кислота (АСК) и индометацин - ингибиторы циклооксигеназы, ингибиторы превращений арахидоновой кислоты на уровне её высвобождения из фосфолипидов мембран (антагонисты Са2+, некоторые местные анестетики, противовоспалительные средства) [К.М.Лакин, 1988; А.И.Грицюк, 1994; А.Ш.Бышевский и др., 1996; С.А.Шитикова, 2000; Т'С-ОНуета е.а., 2010], а также антиоксиданты, способные снижать агрегацию ТЦ - в их числе витамины [С.Л.Галян, 1993; В.Г.Соловьев и др., 2007; Е.М.Шаповалова и др., 2007; А.Ш Бышевский и др., 2009; Л.А.Васильев, 2010; М^ешег, 1993; Б.Х1ао е. а., 1995; К.ТакеБИка е.а., 2009]. ’

Связь агрегационной активности ТЦ с наклонностью к гипо- или гиперкоагу-лемии, и то, что интенсивность НВСК отражает степень напряжения гемостаза, а сдвиги НВСК определяют наклонность к тромбофилии или к кровоточивости, данные о возможности ограничивать агрегационную способность ТЦ ингибиторами образования тромбоксана А2, обосновывают необходимость изучить характер зависимости между коагулоактивностью ТЦ и их способностью осуществлять высвобождение фф. Р3 и Р4, с одной стороны, НВСК и толерантностью к тромбину с другой при введении нередко используемых в клинике ингибиторов циклооксигеназы (АСК, индометацина, делагила, мепакрина, дазоксибена).

Цель работы

Экспериментально изучить эффекты АСК, индометацина, делагила, мепакрина и дазоксибена - ингибиторов трансформации арахидоновой кислоты биомембран - на агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов, на интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантность к тромбину, оценить связи между динамикой сдвигов коагулоактивности тромбоцитов,

НВСК и ТкТР при введении этих ингибиторов порознь и на фоне антиоксидантов.

Задачи исследования

1. Оценить дозазависимость эффектов АСК и индометацина (ингибиторы пре-

вращений арахидоновой кислоты на этапах, катализируемых циклооксигеназой), на агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ, на НВСК и ТкТР;

2. Изучить дозазависимость эффектов делагила и мепакрина (ингибиторы высвобождения арахидоновой кислоты, инициируемого фосфолипазами) на агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов, на НВСК и ТкТР;

3. Изучить дозазависимость эффекта дазоксибена (ингибитор превращений арахидоновой кислоты на уровне тромбоксансинтетазы) на агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ, а также на НВСК и ТкТР;

4. Охарактеризовать длительность эффектов этих антиагрегантов (в В15о%) на агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ, на НВСК и ТкТР;

5. Изучить эффекты ретинола и токоферола, эффект АСК на их фоне (по тем же показателям); 6. Оценить ассоциативные связи сдвигов агрегационной и высвобождающей способности ТЦ между собой и с динамикой сдвигов НВСК и ТкТР.

Дизайн экспериментов

Оценить агрегабельность и реакцию высвобождения тромбоцитов, уровень маркеров НВСК и ТкТР при введении разных доз АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена, охарактеризовать динамику сдвигов этих величин при введении перечисленных антиагрегантов в дозе, ин-гибируюшей максимальную агрегацию на 50% (О150%), оценить эффекты антиагрегантов на фоне предварительного введения антиоксидантов:

>1. При питании сбалансированным рационом без добавок (контроль, 15 животных),

2. При однократном введении антигрегантов в составе рациона в Ш5о% и в дозах, превышающих или недостигающих О15о%;(15 животных).

3. При однократном введении в составе рациона В150% АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена и отбором проб крови через 4, 24, 48 и 72 ча-са(15 животных);

4. При введении антиагрегантов животным, получавшим предварительно димефофсон или витамины антиоксиданты (ретинол и токоферол, 15 животных). Научная новизна

1. Впервые выявлена линейная зависимость между дозой и степенью снижения агрегационных свойств ТЦ, плазменного уровня фф. Р3, Р4 и маркеров НВСК, показано (ранговая корреляция), что связи между дозой и изменениями показателей коагулоактивности ТЦ, их способности к реакции высвобождения и интенсивностью НВСК тесно положительно ассоциированы (значения вг везде не ниже 0.88).

2. Впервые обнаружено, что при введении этих антиагрегантов сдвиги показателей коагулоактивности и высвобождающей активности ТЦ, интенсивности НВСК ассоциированы тесно отрицательно со сдвигами толерантности к тромбину при разных дозах и в разные сроки после введения препаратов (значения ^. между 0.88 и 0,92), что влияние АСК, индометацина, делагила, мепакрина и да-зоксибена в Ш50% на все величины сохраняется до 72 ч, постепенно ослабляясь (исключение: эффекты дазоксибена - они ослабляются быстрее, чем действие четырёх других антиагрегантов).

3. Так же установлено, что в О150% АСК и индометацин (ингибиторы превращений арахидоната, катализируемых циклооксигеназой), делагил и мепакрин (ингибиторы высвобождения арахидоната) и дазоксибен (ингибитор тромбоксан-синтетазы), вводимые со сбалансированным по микро- и макронутриентам пищевым рационом, через 4 ч заметно ограничивают спонтанную и АДФ-инду-цируемую агрегацию тромбоцитов (достоверно уменьшают МА, Т, 1/2Т и 1§а), замедляют реакцию высвобождения факторов Р3 и Р4, вызывают снижение плазменного уровня маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) и повышают толерантность к тромбину (ТкТР).

4. Доказано, что витамины-антиоксиданты ретинол и токоферол, вводимые одновременно в дозах, адекватных лечебным, вызывают за две недели такое же снижение агрегационных и высвобождающих свойств ТЦ, интенсивности НВСК и повышение толерантности к тромбину, какое наблюдается после введения АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена в О150%, и что эффекты АСК на фоне предварительного обогащения рациона ретинолом и токоферолом суммируются с их эффектами.

Теоретическая и практическая значимость

Значимость полученных результатов заключается в обнаружении тесной положительной ассоциации между способностью исследованных антиагрегантов угнетать агрегацию ТЦ (особенно спонтанную), их реакцию высвобождения и снижать интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови. Это подтверждает пока ещё недостаточно обоснованные представления, согласно которым агрегация ТЦ инициирует ускорение реакции высвобождения, а также представление об инициирующей роли ТЦ в ускорении непрерывного внутрисосудистого свертывания. Полученные данные подтверждают также целесооб-

разность использовать антиоксиданты как средства, позволяющие уменьшать дозу антиагрегантов.

Совместно с кафедрой биологической химии ЧелГМА, с сотрудниками кафедр биологической химии, гигиены с основами экологии ТюмГМА разработаны и внедрены для обучения студентов и для использования в лечебных учреждениях г. Тюмени (ГЛПУ ТО ОКБ № 1) и области (ГЛПУ ТО ОКБ №11 р.п. Голыш-маново) методические рекомендации, оформленные актами: «Влияние ингибиторов превращений арахидоновой кислоты на агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов, на непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину».

Результаты, полученные при выполнении работы, используются в обучении

студентов по курсам «Гигиена с основами экологии» и «Биохимия»

Положения, выносимые на защиту

1. Антиагреганты, тормозящие трансформацию арахидоновой кислоты тром-боцитарных мембран (АСК и индометацин - ингибиторы циклооксигеназы, дела-гил и мепакрин - ингибиторы превращений арахидоната, и дазоксибен - ингибитор превращений арахидоновой кислоты на уровне тромбоксансинтетазы) при однократном введении 0150% со сбалансированным рационом питания достоверно снижают через 4 ч агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ и повышают толерантность к тромбину в примерно одинаковой степени.

2. Эффекты АСК, индометацина, делагила, мепакрина и дазоксибена на агрегацию и реакцию высвобождения ТЦ, на интенсивность непрерывного внутрисо-судистого свертывания крови дозазависимы и тесно положительно ассоциированы между собой (величины коэффициента $г находятся между 0,85 и 1,00). Сдвиги агрегационной и высвобождающей способности ТЦ, сдвиги скорости НВСК за время, прошедшее после введения АСК, индометацина или делагила носят близкий к линейному характер, сохраняют положительную связь между собой (коэффициенты Я2 и бг. не ниже 0,87 и 0,86 соответственно).

3. Избыток ретинола и токоферола, вводимых в течение двух недель, влияет на агрегацию, реакцию высвобождения, НВСК и толерантность к тромбину в том же направлении, что и все изученные нами антиагреганты, а эффект АСК на гемостаз на фоне этих витаминов-антиоксидантов суммируется с их эффектом.

4. При введении АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена, ретинола с токоферолом или АСК на их фоне сдвиги агрегации, реакции высво-

вождения тромбоцитов, интенсивности НВСК ассоциированы тесно отрицательно со сдвигами толерантности к тромбину (вг не ниже -0,83 во всех парах). Апробация

Основные положения диссертации доложены на III Международной научнопрактической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2010), на Всероссийской научнопрактической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 статей, из них 4 в журналах рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций, 4 - в других медико-биологических журналах, опубликована 1 глава в монография (Москва: издательство «Медицина» - 2006. - 96 с)

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 120 листах печатного текста, включает «Введение», «Обзор литературы», разделы «Материалы и методы исследований», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы» и список литературы (103 отечественных и 212 зарубежных источника).

Содержание работы Материалы и методы исследования

Опыты проведены на неинбредных взрослых белых крысах-самцах (п - 600 особей, 153±16 г): 1) для крыс разработан сбалансированный пищевой рацион, содержащий макро- и микронутриенты в соответствии с суточной потребностью [Б. А. Лавров, Е. Л.Терентьева, 1963], неоднократно апробированный

[Г.В.Андреенко и др., 1967-1969; Е.М.Шаповалова и др., 2008, 2010]; 2) у крыс из яремной вены можно за 1 мин получить 30-40 мл/кг крови, соблюдая требования гемостазиологии [В.П.Балуда и др., 1995]. Всегда включали контрольную группу. Опыты на самках не проводили - состояние гемостаза у них изменчиво [В.П.Скипетров, 2002].

Использованные методы

1. Агрегационную способность тромбоцитов оценивали с помощью агрегометра “Биомак”, устанавливая значения максимальной агрегации (МА), время ее достижения (Т) и его 'Л (1/2 Т), начальную скорость агрегации Ода). Индуктором аг-

регации служила АДФ (конечная концентрация 0,01 мг/мл) [В.П.Балуда и др., 1980].

2. Спонтанную агрегацию определяли в модификации Н.И.Тарасовой [В.П.Балуда и др., 1980].

3. Фф. Р3 и Р4 в плазме определяли по Rabiner, Groder [В.П.Балуда и др. 1980]. 4. Подсчет количества ТЦ проводили в камере с 3,8% раствором лимоннокислого натрия [В.В.Меньшиков, 1987].

Выбор антиагрегантов и их доз.

Как антиагреганты выбрали соединения, блокирующие продукцию тромбок-санов - факторов агрегации тромбоцитов. Их синтез в тромбоцитах происходит следующим образом: а) фосфолипиды тромбоцитарной мембраны под действием фосфолипаз высвобождают арахидоновую кислоту, фосфатидные кислоты и фактор, активирующий тромбоциты (ФАТ); б)высвобождающаяся арахидоновая кислота метаболизирует по оксигеназному и липооксигеназному путям, образуя эндоперекиси простагландинов и 12-НЕТЕ [Г.А.Толстиков и др., 1989; T.D.Hil е.а., 1989]; в) простагландины - наиболее значимые продукты превращения ара-хидоната - трансформируются тромбоксансинтетазой в тромбоксаны (важнейший из них - тромбоксан А2 - кофактор агрегации [А.А.Кубатиев и др, 1981, 1993; А.Ш.Бышевский и др. 1996]). Среди лекарственных веществ, ингибирующих высвобождение и превращения арахидоната, следовательно, являющихся антиагрегантами, различают ингибиторы высвобождения арахидоновой кислоты (ингибиторы фосфолипаз), ингибиторы циклооксигеназы и тром-боксансинтетазы. Мы для исследований выбрали представителей каждой груп пы: ингибиторы циклооксигеназы (АСК и индометацин), фосфолипаз (делагил и мепакрин) и тромбоксансинтетазы - дазоксибен, отличающийся избирательностью действия (другие ингибиторы этого энзима характеризуются многосторонним эффектом на метаболизм клетки) [К.М.Лакин, 1981; E.Glusa, 1984, А.С. Honey е. а., 1986]. Отличает их и достаточно выраженная специфичность действия [Э.С.Габриэлян, С.Э.Акопов, 1985]. Использовали дозы (от 10 до 250 мг/кг) -их однократное введение через 4 ч заметно и не чрезмерно угнетает агрегацию [А.Ш.Бышевский и др. и др., 1996; С.Л.Галян, и др., 1996]).

Анализ результатов, выраженных количественно, проводили при помощи медико-биологической программы Biostat 4.03 [С.А.Гланц, 1998], используя вариационную статистику для малых рядов наблюдений и вычисляя среднюю

арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической (т) и среднеквадратическое отклонение (о). Достоверность отличий устанавливали, использую доверительный коэффициент Сгьюдента (t) и степень вероятности (р). В анализе интенсивных показателей применяли альтернативное варьирование, рассчитывая те же статистические величины. Различия считали достоверными при степени вероятности < 0.05. Графический анализ проводили в Microsoft Graf (приложение MS Word 2003), корректность аппроксимации оценивали по её коэффициентам (R2). Взаимосвязи переменных анализировали методом ранговой корреляции Спирмена, определяя для оценки характера и тесноты связей коэффициент sr. Оценивая одновременное действие двух факторов, дифференцировали суммацию, потенцирование или антагонизм по описанию [М.Диксон, Э.Уэбб, 1966]: ниже представлено уравнение, отличающееся знаками (= < >), связывающими левую и правую части: I. i„2= (i, + i2). (i, x i2); ц. jb2 < (i| + ;2). (i) x

*2); HI. lj.2> 0. + i2) - Oi X i2), Где

ii . парциальные эффекты одного фактора, i2 - второго фактора, i1>2 _ эффект одновременного воздействия двух факторов. Результат, соответствующий уравнению I, - признак суммации, уравнению II - антагонизма и III - синергизма. Результаты собственных исследований и заключение

На рис. 1 представлены графики зависимости эффекта АСК на все оценивавшиеся в опытах показатели.

Степень влияния АСК согласуется с данными о действии ее однократного введения на агрегацию у человека и у лабораторных крыс. Видна и корректность использования линейных трендов: коэффициенты аппроксимации каждого из них свидетельствует о строгой линейной зависимости всех сдвигов от дозы (коэффициент R2 во всех случаях близок к 1,0). Отклоняются несущественно лишь максимальная агрегация (МА) и связанные с ней величины (Т, 1/2Т и tga).

Строго линейно (отклонения не более, чем на +3%) снижается с увеличением дозы АСК уровень фф. Р3, Р4 и всех маркеров НВСК, т.е. ослабляются реакция высвобождения ТЦ и НВСК. Толерантность к тромбину (ТкТР) также линейно зависит от дозы АСК, возрастая с её повышением.

(использованы для аппроксимации линейные тренды)

150 200 250 мг/кг

Рисунок 1.

Сдвиги (в % к контролю) агрегационной способности тромбоцитов, реакции высвобождения фф. Рз и Р4, маркеров НВСК (ПДФ, РКМФ, D-димеров) и ТкТР при разных дозах АСК. В верхней части поля обозначены коэффициенты аппроксимации (R“) всех трендов (их принадлежность обозначена против каждого коэффициента R')

Дозазависимые сдвиги показателей, характеризующих способность ТЦ к агрегации и к реакции высвобождения друг с другом, и с показателями скорости НВСК при по-парном сопоставлении связаны тесно положительно (значения sr колеблются от 0,85 до 1,00). Дозазависимость каждого из них ассоциирован отрицательно с динамикой ТкТР (более тесная отрицательная связь у пар показателей ПДФ, РКМФ и D-димеров с ТкТР - sr равны соответственно -0,92, -0,90 и 0,96; ниже теснота связи динамики уровня фф. Р3 и Р4 с одной стороны и ТкТР - sr = -0,87 и -0,89 соответственно, и ещё ниже - между сдвигами показателей агрегации ТЦ и ТкТР - sr от -0,76 до -0, 81 соответственно для сравниваемых пар СА, МА, Т, 1/2Т и tga с одной стороны и ТкТР - с другой: sr равны соответственно -

0,76, -0,77, -0,65, -0,70 и -0,63).

Итак, при однократном введении АСК в дозах ниже и выше DIso% через 4 ч наблюдается четкая положительная зависимость изменений способности ТЦ к агрегации и к реакции высвобождения со сдвигами скорсти НВСК, и отрицательная зависимость между двумя первыми группами показателей и ТкТР - чем выше доза АСК, тем заметнее ограничивается агрегационная и высвобождающая активность ТЦ, замедляется НВСК и растет ТкТР - способность организма реагировать на гипертромбинемию.

ОТ ОТ/2 «Тда 0Р-3 ИР-4 ОПДФ ШРКМФ В Р-димеры [ЭТкТР

Эффекты АСК на те же показатели через 1, 24, 48 и 72 ч после введения АСК

гисунок а. сдвиги (в 7о к контролю) агрегационной способности ТЦ, реакции высвобождения фф. Р3 и Р4, маркеров НВСК и ТкТР, вызванные АСК (О150%) в разные сроки после введения. В верхней части поля - коэффициенты аппроксимации (К2) всех трендов (принадлежность обозначена против каждого из них)

Диаграммы свидетельствуют, что степень сдвигов снижается со временем -через 24 ч эффект слабее, чем спустя 4; через 48 и 72 ч сдвиги ещё ниже, но достоверно отличны от контрольных значений (исключение - сдвиги ТкТР: не отличаясь достоверно от контроля через 72 ч, сохранена тенденция к росту - на 9%). Как и при анализе дозазависимости эффекта АСК, при оценке временной зависимости выявлена корректность применения линейных трендов - Л2 колеблются от 0,79 до 0,95. Линейно уменьшается во времени, прошедшим после введения АСК, и степень прироста ТкТР - К2 = 0,89.

Сдвиги во времени показателей агрегации положительно ассоциированы между собой во всех парах. Теснота связи, как и при оценке дозазависимости высока: в, не ниже 0,88 во всех парах. Менее тесно связаны СА и МА с другими показателями аг-

регации (кг ниже 0,90), и более тесна связь между маркерами НВСК, а также с уровнем фф. Р3 и Р4 (маркеры высвобождения) - коэффициенты $г для всех пар > 0,90. Отрицательно ассоциирована динамика сдвигов показателей агрегационной и высвобождающей активности ТЦ, а также показателей уровня маркеров НВСК с одной стороны и толерантностью к тромбину с другой: связи каждого из них с ТкТР имеют значением 8Г для всех пар > 0,90 (исключение - связи между динамикой уровня фф. Р3 и Р4 с одной стороны и ТкТР с другой - «г = -0,85 и -0,87 соответственно).

Таким образом, в двух вариантах наблюдений над эффектами АСК воспроизводится характер зависимости между оцениваемыми сдвигами: 1) положительная связь агрегационной и высвобождающей способностью тромбоцитов, а также между ними и НВСК; 2) отрицательная зависимость между сдвигами агрегации, реакции высвобождения и НВСК (с одной стороны) и ТкТР - с другой.

Сопоставив данные об эффектах О150% АСК и остальных антиагрегантов, мы нашли, что они вызывают не только однонаправленные сдвиги агрегации, реакции высвобождения, интенсивности НВСК и ТкТР, но и то, что через 4 ч после введения выраженность этих сдвигов (относительно контроля) достаточно близка. Это позволяет не представлять здесь все трудно читаемые рисунки с полным графическим анализом всех полученных данных - они рассмотрены в тексте диссертации как данные о влиянии индометацина, делагила, мепакрина и дазоксибена на весь комплекс показателей. Но учитывая некоторые различия в степени изменения отдельных величин при введении разных антиагрегантов, проанализируем их, чтобы выявить и оценить достоверность отличий. На рис. 3 представлены диаграммы, отражающие степень отклонения от контроля показателей СА, ф.Р4, О-димеров и ТкТР через 1 ч после введения Ш5о АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена (величины эти сопоставляются потому, что они отражают соответственно способность к агрегации, к высвобождению, скорость НВСК и ТкТР через 1 ч после введения О150 каждого из антиагрегантов. Здесь заметна меньшая эффективность 0150%, (напомним, что эта дозы установлена для всех антиагрегантов по их влиянию на МЛ) ингибиторов оксигеназы (АСК и индометациона), и ингибитора высвобождения арахидоната (делагила): они примерно одинаково ослабляют СА, снижают уровень ф. Р4, уровень О-димеров, и повышают ТкТР.

□ СА Иф.Р-4 СЮ-димеры □ ТкТР 48

-ъ- - 37 _Г£-|_

п- п п

4 уши У-Ьс у.и У 1

‘и

У %

Аспирин Индометацин Делагил Мепакрин Дазоксибен

Рисунок 3. Сдвиги (в % от контроля) СА, Ф.Р4, Б-димеров и ТкТР

через 4 ч после введения О150% одного из антиагрегантов - АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена.

Эффекты мепакрина (ингибитор высвобождения арахидоната, катализируемого фосфолипазами) и дазоксибена (ингибитор превращений арахидоната на уровне тромбоксансинтетазы) таковы: а) оба ингибитора уменьшают С А в условиях опыта одинаково (на 19 и 20% соответственно, р > 0,05), причем, как и АСК (19%), индометацин (20 %) и делагил (18%); несущественно отличается и торможение СА да-зоксибеном (22%, р >0,05), б) эффекты мепакрина и дазоксибена на высвобождение и на НВСК более выражены, чем эффекты АСК, индометацина и делагила - высвобождение замедлилось на 66 и 61%, что примерно в два раза значительнее, чем эффект АСК, индометацина или делагила, которые замедлили высвобождение соответственно на 32, 35 и 30% (р < 0,01 во всех трёх случаях).

Итак, однократное введение с рационом 0150% АСК, индометацина, делагила и дазоксибена через 4 ч одинаково снижает СА тромбоцитов. Степень снижения реакции высвобождения (по ф. Р4) и степень замедления НВСК (по уровню маркеров) одинакова при введении трёх первых антиагрегантов и в два раза выше при введении мепакрина или дазоксибена. Прирост ТкТР одинаков после введения трёх первых, и в два раза выше, после введения мепакрина и дазоксибена.

При рассмотрении длительности эффектов всех изучаемых антиагрегантов, мы нашли принципиальное сходство в изменениях во времени степени их влияния на агрегацию, реакцию высвобождения, НВСК и ТкТР - по мере увеличения интервала между введением (в О15оо/о) и взятием пробы степень сдвига относительно контроля уменьшалась.

Для количественной оценки процесса рассмотрим графики, позволяющие сопоставить состояние НВСК (по уровню О-димеров) и ТкТР через 48 и 72 ч после введения антиагрегантов в О15о%. На рис. 4 видно, что уже через 48 ч после введения су-

щественно ограничены эффекты всех антнагрегантов в сравнении с найденными через 4 ч (сравнить с рис. 3). Через 72 ч ограничение сдвига всех показателей усугубилось. Ослабли в разной мере также эффекты индометацина, делагила, мепакрина и дазоксибена.

ЮСА ШР-4 □ Д-димеры ШТкТР

Рисунок 4. Сдвиги (в % к контролю) СА, уровня Р4, уровня Э-димеров и толерантности к тромбину через 48 и 72 ч после введения ОІ50% АСК, индометацина (ИНД), делагила (ДЛГ), мепакрина (МПК) или дазоксибена (ДОБ)

Таблица (см. ниже) демонстрирует эти различия. Здесь видно, что сдвиги СА, уровня ф. Р4, О-димера и ТкТР через 48 ч после введения АСК или индометацина к 72 ч уменьшились примерно одинаково - в 1,35-1,70 раза. За то же время после введения делагила, мепакрина или дазоксибена сдвиги СА, ф. Р4 и Б-димера уменьшились в среднем в 2,1 раза, т.е. на величину, заметно отличающуюся от величин 1,35 и 1,70 (р < 0,05), найденных в этом интервале времени при приведении АСК и индометацина (в меньшей степени это распространяется на изменения уровня ф. Р4 при введении мепакрина и на уровне Б-димеров при введении дазоксибена).

Кратность снижения эффекта антиагрегантов на агрегационную и высвобождающую способности ТЦ в интервале от 48 до 72 ч после их введения в О15о%.

Тест АСК Индометацин Делагил Мепакрин Дазоксибен

СА -1.8 -1,70 -2.45 -2,20 -3,33

Ф.Рд -2.0 -1,54 -2.46 -1,16 -3.17

D-димео -1.35 -1,35 -2.60 -ЗЛО -1.23

ТкТР +1.88 + 1.62 +1,42 +1,31 +2.00

Обозначения: знак минус - уменьшение, плюс - увеличение эффекта, найденного через 72 ч относительно обнаруженного через 48 ч

Сдвиги ТкТР подтверждают общую тенденцию - длительный период сохранения

эффекта после введения ингибиторов циклооксигеназы, и меньшую продолжительность эффекта делагила, мепакрина и дазоксибена, ингибирующих трансформацию арахидоната, высвобождающегося из фосфолипидов бислоя тромбоцитарных мембран. Возможно следующее объяснение этого феномена:

АСК и индометацин тормозят накопление арахидоната, превращения которого ускоряют образование тромбоксанов, поддерживающих адгезию и агрегацию; делагил, мепакрин и дазоксибен тормозят трансформацию высвободившегося арахидоната [А.С.Шитикова, 2000; М.R.Buchanan е.а., 1985, 1986; J.Y. Hahn е.а., 2010]; замедление дальнейшей трансформации арахидоната отчасти преодолевается постоянным в физиологических условиях его высвобождением из бислоя [А.Ш.Бышевский и др., 1996; Б.И.Кузник, 2010; V. Selake е. а., 2010].

Сформировав затем две группы животных (одна не получала дополнений к рациону, а другая получала димефосфон), мы выясняли, зависят ли эффекты АСК от предварительного ведения этого антиоксиданта. На рис. 5 видно, что влияние АСК на все показатели более заметно на фоне димефосфона.

ОСА ОМА QTV2 ffltga ИР-3 ИР-4 ОПДФ ЯРКМФ □ D-димсры РТкТР |

35

Рисунок 5. Изменения (в % относительно контроля) агрегации и реакции высвобождения ТЦ, НВСК иТкТР при введении АСК или АСК на фоне предварительного

введения димефосфона (ДМ).

Обогащение рациона димефосфоном усилило угнетение АСК СА (в 3,8 раза),

максимальной АДФ-агрегации (в 1,2 раза), Т, 'ЛТ и начальную скорость ^а) - в

1,1-1,5 раза), а также прироста уровня маркеров НВСК (в целом ограничение в 1,3 -1,6 раза). Наряду с этим при введении АСК на фоне димефосфона толерантность к тромбину (ТкТР) возросла в 1,7 раза.

Листаж автореферата не позволяет привести графики изменения реакции со стороны ТЦ, НВСК и ТкТР при введении индометацина, делагила, мепакрина и дазок-сибена на фоне рациона, обогащенного антиоксидантом. Вместе с тем, опыты выявили, что степень различий между эффектами этих антиагрегантов без димефосфона и на его фоне близка к продемонстрированной на рис. 5: усилены все их эффекты. Всё это и явилось основанием для оценки влияния комбинации витаминов-антиоксидантов на вызываемые АСК сдвиги агрегационных и высвобождающих свойств ТЦ, на интенсивность НВСК и ТкТР.

Мы выбрали ретинол и токоферол - они являются антиоксидантами, которые в лечебных дозах модифицируют свертывающую активность крови (впрочем,, как и их исключение из сбалансированного рациона) [В.А. Полякова и др., 2007; Е.М.Шаповалова и др., 2009; Т. УовЫока е.а., 1987; Н.Уавиёа е.а., 1989].

На рис. 6 видно, что показатели агрегации ТЦ (СА и АДФ-агрегация) изменяются при введении с рационом О150% АСК или ретинола с токоферолом. АСК на фоне избытка этих витаминов действует заметнее, чем при сбалансированном питании. Анализ влияния АСК и витаминов по М.Диксону и Э.Уэббу [1966] выявил неполную суммацию эффектов. При расчете степени сдвигов каждого из одиннадцати показателей то же установлено и для остальных антиагрегантов (отклонения от средней взвешенной - от ±2,7 до ±3,8%).

Следовательно, эффекты антиоксидантов ретинола и токоферола суммируются с эффектами АСК. Степень суммации ниже полной и составляет для каждого из оценивавшихся показателей от 38 до 46% от той величины, которая соответствовала бы 100-процентной суммации.

Таким образом, можно утверждать, что эффекты АСК и витаминов-антиоксидантов суммируются, хотя и не полностью. Это находили и другие исследователи при изучении совместного эффекта антиоксидантов и других воздействий на гемостаз при разных состояниях, сопровождающихся гипертромбинемией [С.Л.Галян, 1993; И.А.Карпова и др., 2001]. Особенно интересно то, что тренды (рис. 6), усредняющие эффекты влияния на все изучавшиеся величины только АСК, и только витаминов-антиоксидантов (или тех и других вместе), идеально линейны - везде коэффициенты Я2 предельно близки к единице.

вводили Вводили ввели

АСК РТ и ТФ АСК на

фоне РТ и ТФ

Рисунок 6. Степень сдвигов (в % к контролю) СА, МА, Т, 1/2Т, tga, ПДФ, РКМФ, D-димеров и ТкТР после введения АСК на фоне полноценного рациона питания, на фоне рациона с избытком ретинола (РТ) и токоферола (ТФ). В правой части поля рисунка сверху вниз расположены величины R2 для каждого тренда.

Это доказывает, что во всех трёх случаях сдвиги агрегации ТЦ, их способности к высвобождению, и изменения уровня маркеров НВСК тесно положительно ассоциированы. То же подтверждает оценка связи между всеми возможными парами исследуемых показателей методом ранговой корреляции - значения rs колебались от

0,89 до 0,98, не выходя за эти пределы. Следовательно, все показатели агрегацион-ной, а также высвобождающей способности ТЦ и интенсивности НВСК ассоциированы тесно положительно. Вместе с тем, каждый из них столь же тесно, но отрицательно ассоциирован с толерантность к тромбину (ТкТР).

Заключая обсуждение, выделим основные положения, которые можно сформулировать на основе полученных нами данных. .

Все рассмотренные нами соединения с антиагрегантными свойствами, будучи однократно введенными в DI50o/„ животным, содержащимся в равных условиях, ограничивают агрегацию ТЦ и реакцию высвобождения, что сопровождается замедлением НВСК. Влияние всех исследованных нами антиагрегантов в DI5o% на агрегацию ТЦ, на их реакцию высвобождения и на НВСК сходно по степени изменения

показателей коагулоактивности ТЦ и показателей, характеризующих плазменный уровень маркеров НВСК.

Эффекты всех изученных нами антиагрегантов линейно дозазависимы. Выраженность эффектов (степень сдвигов относительно контроля) всех изученных нами антиагрегантов на коагулоактивность ТЦ и на скорость НВСК во времени прогрессивно убывает. Менее продолжительно сохраняются эти сдвиги лишь при введении ингибиторов тромбоксансинтетазы (мепакрина и дазоксибена).

Наряду со снижением коагулоактивности ТЦ и скорости НВСК все изучавшиеся антиагреганты повышают ТкТР.

Предварительное введение (в течении 2 недель) антиоксиданта димефосфона, усугубляет ограничение сдвигов коагулоактивности ТЦ, НВСК и рост ТкТР, вызываемые АСК, индометацином, делагилом, мепакрином или дазоксибеном в О150%.

Введение АСК в В15о%.животным, получавшим в течение двух недель ретинол и токоферол в дозах, адекватных лечебным, оказывает влияние на все определявшиеся величины, превосходящее (по степени сдвигов) влияние витаминов или АСК, вводимых порознь (эффект неполной суммации).

Существует тесная положительная связь между сдвигами всех изучавшихся нами показателей агрегации ТЦ (у контрольных и у животных, получавших антиагреганты) и отрицательная зависимость между этими показателями и толерантностью к тромбину. Это указывает на тесную зависимость, а может быть и на взаимозаменяемость тестов, которое позволяет говорить о возможности выбора из них такого, который заслуживает наименование маркера коагулоактивности ТЦ. Естественно, необходимо провести доказательные их исследования в большом числе разнообразных экспериментальных ситуаций.

Всё сказанное - свидетельство целесообразности продолжать изучение в том же плане всех используемых клиницистами антиагрегантов (или, по крайней мере, положительно себя проявивших в практической медицине). Наиболее перспективно, с нашей точки зрения, продолжить изучение совместного влияния антиагрегантов и антиоксидантов на коагулоактивность ТЦ, процессы НВСК и на ТкТР. Особо желаемыми объектами исследований можно рассматривать витамины, единственным противопоказанием к применению которых является их индивидуальная непереносимость.

ВЫВОДЫ

1. Используемые в медицинской практике (в частности, как антиагреганты) АСК, индометацин, делагил, мепакрин и дазоксибен при однократном введении в О150% со

сбалансированным рационом питания, вызывают через 4 ч достоверное и значимое (> 20±0,91 %, р < 0,05) снижение спонтанной и АДФ-индуцируемой агрегации (максимальной, времени её достижения, 1А этого времени, начальной скорости агрегации

- 1§а) и реакции высвобождения факторов Р3 и Р4, замедляют непрерывное внутри-сосудистое свертывания и повышают толерантность к тромбину, (р < 0,05)

2. Степень влияния В150о/„ на агрегационную и высвобождающую способность тромбоцитов, на непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и на толерантность к тромбину АСК, индометацина, делагила, мепакрина и дазоксибена существенно не различается (р = или < 0,05).

3. Эффекты АСК, индометацина, делагила, мепакрина и дазоксибена на способность тромбоцитов к агрегации, к реакции высвобождения, на уровень маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) дозазависимы и попарно ассоциированы тесной положительной связью (во всех возможных парах коэффициенты вг изменяются 0,85 до 1,00, р < 0,05).

4. Изменения агрегационной высвобождающей способности тромбоцитов, уровня маркеров НВСК в зависимости от времени после введения Б15о% АСК, индометацина или делагила практически линейны и тесно положительно ассоциированы (коэффициенты Я2 и бг. не ниже 0,87 и 0,86 соответственно, р < 0,05).

5. Изменения агрегационной и высвобождающей способности тромбоцитов и уровня маркеров НВСК через 48 и особенно через 72 ч после введения В150% делагила, мепакрина или дазоксибена, менее выражены в сравнении с изменениями, вызываемыми 0150% АСК или индометацина (р = или < 0,05).

6. Введение в течение двух недель синтетического антиоксиданта димефосфона или витаминов-антиоксидантов ретинола и токоферола в дозах, адекватных лечебным, вызывает такие же по направленности сдвиги, которые вызывали испытанные антиагреганты.

7. Введение О15о% АСК после двухнедельного введения ретинола и токоферола сопровождается неполной суммацией эффектов на коагулоактивность тромбоцитов, на их способность к реакции высвобождения, на интенсивность НВСК и на толерантность к тромбину (р = или < 0,05).

8. При всех экспериментальных ситуациях (введение БЬо АСК, индометацина, делагила, мепакрина или дазоксибена, ретинола с токоферолом или АСК на их фоне) снижение показателей агрегации, реакции высвобождения тромбоцитов, интенсивности НВСК ассоциированы тесно отрицательно с толерантностью к тромбину («г не ниже - 0,81 во всех парах)

Публикации по теме диссертации

1. Бышевский А.Ш., Связь между влиянием витаминов на гемостаз и их ан-тиоксидантной активностью / И.А.Ткаленко, А.Ш. Бышевский, П.Я. Шаповалов,

С.В. Миневцев и др.// Медицинская наука и образование Урала. - 2005. - №5 (39).

- С.90-91.

2. Шаповалов П.Я., Влияние на гемокоагуляцию донатора метальных групп витамина В15/ И.А.Ткаленко, П.Я. Шаповалов, Е.М. Шаповалова, Е.П. Шаповалова // В кн. «Витамины, внутрисосудистое свертывание крови и липидперокси-дация» Москва: Медицина. - 2006. - С. 51-55.

3. Бышевский А.Ш., Гемостаз, перекисное окисление липидов и витамины / И.А. Ткаленко, А.Ш. Бышевский, П.Я. Шаповалов, М.А. Самойлов, С.Л. Галян и др. // Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды : Материалы III международной научно-практической конференции. -2010. - Челябинск.: изд-во Челяб. Гос.пед.ун-та - С.40-43.

4. Ткаленко И.А., Влияние ингибитров циклоксигеназы на агрегацион-ные свойства тромбоцитов, непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину / И.А. Ткаленко, Е.П. Шаповалова, М.А. Самойлов, А.Ю. Рудзевич и др. // Медицинская наука и образование Урала. -

2010. - №4 (64). - С.53-56.

5.Ткаленко И.А., Роль тромбоцитов в реакции на гипертермию / И.А. Ткаленко, А.Ш. Бышевский, И.А.Карпова, А.Ю. Рудзевич и др.// Медицинская наука и образование Урала. - 2011. - № 1(65).- С.59-61.

6. Ткаленко И.А., Влияние аспирина на коагулоактивность тромбоцитов и толерантность к тромбину / И.А. Ткаленко, М.А. Самойлов //Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований. - Материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине ОмГМА . -

2011. - С.283-288.

7. Ткаленко И.А.,Эффекты сочетания ниацин-аспирин на коагулоактивность тромбоцитов, толерантность к тромбину и фибринолиз / И.А.Ткаленко, М.А.Самойлов // Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований. Материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине ОмГМА . -2011. - С.260-265.

8. Ткалепко И.А., Влияние эстрогенов и гестагенов на коагуляционный и тромбоцитарный гемостаз, непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину, их коррекция антиоксидантами / И.А.Ткаленко, А.Ш.Бышевский, П.Я.Шаповалов, М.А.Самойлов, И.А.Карпова // Омский научный вестник. - 2011. - № 1 (104). - С. 105-109

9. Ткаленко И.А., Влияние ниацина и аспирина (порознь и одновременно) на частоту выживания животных при экзогенной тромбинемии / И.А.Ткаленко, М.А. Самойлов // Медицинская наука и образование Урала. -

2011. - № 2 (66). - С.95-97.

Используемые сокращения

ВТФ Взаимодействие тромбин-фибриноген

двск Диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови

РТ Ретинол

МДА Малоновый диальдегид

тц Тромбоцит (ы)

ТФ Токоферол

ТкТР Толерантность к тромбину

РКМФ Растворимые комплексы мономерного фибрина

ПДФ Продукты деградации фибрина

ф.(фф-) Фактор (факторы)

ФАТ Фактор активации тромбоцитов

Ср Гликопротеин (ы)

01-50% Доза, вызывающая 50-процентное торможение

АСК Ацетилсалициловая кислота

Ткаленко Илья Александрович

Влияние ингибиторов превращений арахидоновой кислоты на агрегацию и реакцию высвобождения тромбоцитов, на непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.01.04-БИОХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Отпечатано: ООО «Прессто» г. Челябинск, ул. Труда, д. 82А, офис 103 тел.: +7 919 301 3530

www.pressto74.ru