Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зависимость интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантности организма к тромбину от гемокоагуляционной активности тромбоцитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Зависимость интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантности организма к тромбину от гемокоагуляционной активности тромбоцитов"

л

км & Mf-*

На правах рукописи

РГб од

L - MAP 1SS9

Лошкарева Лариса Спартаковна

ЗАВИСИМОСТЬ ИНТЕНСИВНОСТИ НЕПРЕРЫВНОГО ВНУТРИСОСУДИСТОГО СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ и ТОЛЕРАНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К ТРОМБИНУ ОТ ГЕМОКОАГУЛЯЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ

03. 00. 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 1999

Работа выполнена в Тюменской государственной медицинско!

академии

Научный руководитель -

доктор медицинских наук профессор А.Ш.Бышевский

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук профессор В.Е. Высокогорский

доктор медицинских наук профессор П.Н.Шараев

Ведущее учреждение

Гематологический научный центр РАМН (г. Москва)

Защита состоится «-----«---------------------1999 г

на заседании специализированного Совета Д.084.04.01 I Челябинской государственной медицинской академии (454092, г Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской медицинской академии.

Автореферат разослан «--------«-------------------1999 г

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук, профессор Л.В.Крнвохижина

Используемые сокращения

АВР - активированное время рекальцификации

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ДВС - диссеменированное внутрисосудистое свертывание

ДК - диеновые конъюгаты (первичные продукты ПОЛ)

ДМ - димефосфон

МА - максимальная агрегация

НС - начальная скорость агрегации (или tg а)

ОКАТ - общая коагулирующая активность тромбоцитов

ПДФ - продукты деградации фибрина (фибриногена)

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ТБК-продукты - продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (вторичные продукты ПОЛ) ф.(фф.) - фактор (факторы) ФГ - фибриноген

[ГОСУДАРСТВЕННАЯ I БИБЛИОТЕКА |

№((>-01 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Обязательный патогенетический момент наклонности к тромбоэмболии - ускоренное тромбинообразование [Д.М.Зубаиров, 1978; З.С.Баркаган, 1988; В.П.Балуда и др., 1994; А.И.Грицюк и др., 1994] и ослабление защитной реакции на рост тромбинемии [Б.А.Кудряшов, 1975; С.А.Георгиева и др., 1993; А.В.Аршинов и др., 1998]. В связи с этим актуальным представляется изучение роли отдельных компонентов гемостаза в формировании толерантности к тромбину. Детально изучена зависимость толерантности к тромбину от биохимического компонента свертывания -уровня антитромбинов всех видов [Д.М.Зубаиров, 1978; А.Ш.Бышевский и др., 1990] и антифибриногенов [А.Ш.Бышев-ский и др., 1987, 1991]. В то же время не ясна роль в этом клеточного гемостаза, в частности, тромбоцитов /ТЦ/. Их гемокоа-гуляционная активность имеет ведущее значение в поддержании гемостатического потенциала [Д.М.Зубаиров, 1978; З.С.Баркаган, 1988; В.П.Балуда и др., 1994], однако есть лишь единичные указания на участие ТЦ в определении интенсивности реакции гемостаза на тромбин [А.А.Вакулин, 1998; И.В.Ральченко, 1998]. Важно и то, что ТЦ не только один из инициаторов активации свертывания, но и важный непосредственный участник образования первичного тромба [В.П.Балуда и др., 1994; А.Ш.Бышевский и др., 1996].

Недавно установлена зависимость активности ТЦ от состояния ПОЛ в них. Показано, что введение антиоксидантов сопровождается снижением уровня продуктов пероксидации в ТЦ и снижении их агрегационной активности и способности высвобождать в окружение факторы с гемокоагуляционной активностью [И.А.Дементьева, 1998; И.В.Ральченко, 1998], что введение прооксидан-тов ведет к противоположным сдвигам [А.А.Вакулин, И.А.Дементьева, 1997; С.Л.Галян и др., 1997]. Это, наряду с участившимися публикациями о связи ПОЛ с гемостазом [А.Ш.Бышевский и др. 1997; И.Н.Баранова и др., 1998; Ю.И.Бородин и др., 1998;Е.А.Бунакова и др., 1998], свидетельствует не только о теоретическом значении этой связи, но и о возможности влиять на состояние гемостаза в организме через изменения активности ТЦ дополнительным введением антиоксидантов. В частности, показано, что изменение активности ТЦ, модифицируемое про- или ан-тиоксидантами сопровождается изменением скорости внутрисо-судистого свертывания крови [Д.С.Марченко, 1998].

Все это определило выбор направления наших исследований. Цель работы: изучить зависимость интенсивности внутрисосуди-стого свертывания крови и толерантности организма к тромбину от уровня гемокоагуляционной активности ТЦ.

Задачи исследований. Для достижения цели мы наметили следующие задачи: 1. Изучить в эксперименте на лабораторных крысах состояние гемокоагуляционной функции ТЦ при воздействиях, повышающих их активность. 2. То же изучить при воздействиях, снижающих коагуляционную активность ТЦ. 3. Изучить частоту гибели и степень гемокоагуляционных сдвигов при тромбинемии, интенсивность противосвертывающей реакции и ее зависимость от состояния гемокоагуляционной функции ТЦ. 4. Оценить интенсивность ПОЛ в ТЦ при изменении их гемокоагуляционной функции. Научная новизна. 1. Впервые установлено, что увеличение общей коагулирующей активности ТЦ, их способности к агрегации и к реакции высвобождения совпадает по времени с интенсификацией непрерывного внутрисосудистого свертывания крови, а с ослаблением перечисленных свойств активность коагуляционного компонента гемостаза снижается. 2. Впервые показано, что инфузия ТЦ с повышенной или пониженной гемокоагуляционной активностью ведет к интенсификации или ослаблению внутрисосудистого свертывания соответственно. 3. Впервые показано, что толерантность животных к гипертромбинемии падает при росте гемокоагуляционной активности ТЦ и повышается при ее снижении. 4. Подтверждена связь гемокоагуляционной активности ТЦ с интенсивностью ПОЛ в них и показано, что изменения интенсивности ПОЛ в ТЦ (рост или ослабление) коррелируют с изменением активности коагуляционного компонента гемостаза в этих клетках. Практическая ценность работы. Полученные данные - дополнительное обоснование целесообразности использования антиокси-дантов как неспецифических средств снижения частоты тромбо-геморрагических осложнений, сопровождающих заболевания, сопряженные с активацией тромбиногенеза.

В процессе выполнения исследований разработаны и внедрены в практику лечебных учреждений г.Тюмени методические рекомендации для врачей по применению комплексного анти-оксиданта (Витакомплекс) в лечении больных с атеросклеротиче-скими поражениями артерий нижних конечностей в период подготовки и после операций аорто-бедренного и аорто-подколенного шунтирования артерий. Рекомендации внедрены для использования в ОКБ г. Тюмени и Облонкодиспансере.

Результаты работы использованы при составлении инструкции по клиническому испытанию Витакомплекса к заявке в Фармко-митет МЗ и МП РФ (препарат под названием Селмевит утвержден для медицинского применения - «Протокол № 10 Фармкоми-тета от 10 сентября 1997 г»).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119

стандартных страницах, содержит 22 табл. и 18 рисунков, включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение и заключение, выводы и список использованной литературы (84 отечественных и 177 иностранных авторов). Основные положения, выносимые на защиту. 1. При увеличении общей коагулирующей активности ТЦ, их способности к агрегации и высвобождению усиливается процесс непрерывного внутрисо-судистого свертывания крови, при ослаблении этих свойств ТЦ активность коагуляционного компонента гемостаза падает. 2. Инфу-зия ТЦ с повышенной или пониженной агрегационной активностью ведет к интенсификации или ослаблению внутрисосудистого свертывания соответственно. 3. Толерантность животных к тромбине-мии падает при росте гемокоагуляционной активности ТЦ и повышается при ее снижении.

Апробация и публикация. Основные положения диссертации доложены на Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище - нутрицевтики - и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распространенных заболеваниях" (Тюмень, 1995), на международной школе молодых ученых "ФЫолопя та патолопя перекисного окисления лтщ1в, гемостазу та имуногенезу" (Полтава, 1995), Международном симпозиуме "Физиология и патология гемостаза" (Симферополь-Полтава, 1994), Международных симпозиумах "Медицина и охрана здоровья населения" (Тюмень, 1997, 1998). По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследования. Все исследования проведены на беспородных белых крысах (364 особи) массой тела 120±15 г. Выбор животных связан с тем, что работы по изучению гемостаза под влиянием разных воздействий выполнены преимущественно на крысах [Б.А.Кудряшов, 1975; Б.И.Кузник, В.П.Скипетров, 1975; Д.М.Зубаиров, 1978; А.Ш.Бышевский и др., 1990]. Минимальное количество крыс в группе определили, оценив индивидуальные колебания показателей, предусмотренных в исследовании. Важнейшие из них оценили у 10 крыс-самцов, подвергли математической обработке, используя все десять (п = 10) или только пять результатов (п = 5). Степень отличия средней взвешенной и средней ошибки в обоих случаях невелика. Самок в опыт не брали -состояние гемостаза у них лабильно [В.Скипетров и др., 1964]. На этом основании компоновали группы из 5 особей, увеличивая это число при значительных вариациях внутри одной подопытной группы. Принимая во внимание зависимость показателей гемостаза от времени года и метеофакторов [А.Ш.Бышевский, В.Н.Кожевни-

ков, 1986], в эксперименты всегда включали контрольную группу, исключая опыты с небольшим интервалом между ними.

Кровь брали из яремной вены (венесекция у предварительно наркотизированных диэтиловым эфиром животных), следуя правилам для гемостазиопогических исследований [В.П.Бапуда и др., 1980]. В ту же вену вводили тромбин по прекращении наркоза.

Для оценки агрегации ТЦ использовали агрегометр "Био-мак", оценивая значения максимальной агрегации (МА) и начальную скорость агрегации (1д а). Индуктор агрегации - АДФ в конечной концентрации 0,01 мг/мл. Ф. Р3 в определяли по разнице показателей АВР плазмы до и после удаления ТЦ из нее по 1?аЫпег, Эгос1ег [В.П.Балуда и др. 1980], высвобождение - по разнице показателей АВР в плазме после АДФ-агрегации до и после удаления ТЦ. Ф. Р4 плазмы определяли по действию прогретой бедной ТЦ плазмы на тромбин-гепариновое время свертывания субстратной плазмы. Степень укорочение - мера активности ф. Р4. Разница во времени между свертыванием в системе (нормальная обедненная ТЦ плазма+0,14М ЫаС1+ гепарин+тромбин) и системе (нормальная обедненная ТЦ плазма+такая же прогретая исследуемая плазма+гепарин+тромбин) характеризует активность свободного ф. Р4 в плазме. Высвобождение ф. Р4 при агрегации ТЦ оценивали по уровню ф. Р4 после проведения АДФ-агрегации. Общую коагулирующую активность ТЦ /ОКАТ/ определяли по их способности изменять АВР [А.Ш.Бышевский и др., 1996].

В части опытов животным внутривенно вводили тромбин (0,1 мл/100 г, активность - 17 или 25 с - в зависимости от характера опыта), оценивая степень реакции на экзогенную тромбинемию по изменениям (через 1 ч после инъекции) протромбинового индекса, АВР, АЧТВ (показатели общей свертывающей активности крови), фибриногенемии, уровню ПДФ и этаноловому тесту. Совокупность показателей позволяет определить степень изменения внутрисосудистого свертывания крови, протекающего в условиях физиологической нормы с малой интенсивностью [Д.М.Зубаиров, 1988]. АВР и АЧТВ определяли по Г.Н.Детинкиной и др. (1984), количество фибриногена - прямой спектрофотометрией [А.Ш.Бышевский, В.С.Мохнатое, 1969].

Для оценки состояния ПОЛ в ТЦ определяли: 1. Содержание сопряженных диеновых соединений по оптической плотности геп-тановой фазы при X 232 нм. 2. Содержание продуктов окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в гептановом экстракте флуорометрически [В.Н.Ушкалова и др., 1987], интенсивность флуоресценции - при длине волны возбуждения 510 и волне флуоресценции 535 нм (флуориметр "Биан 130"). В гепта-

новом экстракте исследовали кинетические величины прямого инициированного окисления липидов молекулярным кислородом в присутствии инициатора свободнорадикального окисления (дини-трилазобисизомаслянная кислота). Период индукции выражали временем поглощения пробой 25 мм3 02, скорость окисления устанавливали по углу наклона линейного участка кинетической кривой. Детальное описание - в работе С.Н.Ельдецовой (1990).

Димефосфон /ДМ/, уксуснокислый свинец и аспирин крысам вводили с утренней порцией кашицеобразного рациона. Гемокоагуляционные свойства ТЦ при активирующих воздействиях. Для активации ТЦ использовали экзогенную и эндогенную ги-пертромбинемию, а также введение прооксиданта-свинца [С.Л.Га-лян, 1993; Д.С.Марченко, 1998]. В 1-й серии опытов крысам вводили в яремную вену 0,1 мл/100 г раствора тромбина (1 мг/мл 0,14 М раствора №С1, активность 25 с) и через 0,5, 1 и 3 ч брали пробы крови. Такая доза тромбина не вызывает гибели крыс. Контрольным крысам вводили растворитель.

Из данных табл. 1, видно, что через 0,5 ч после инъекции ОКАТ заметно выше контроля (на 22,6 %), не отличаясь от него уже через 1 ч. Через 3 ч она оказалась ниже контроля (на 13 %).

Аналогично изменялась максимальная АДФ-агрегация тромбоцитов /МА/: рост через 0,5 ч (на 25 %), отсутствие отличий от контроля через 1 ч и снижение (на 17 %) - через 3 ч. Сходны изменения начальной скорости агрегации. Высвобождение фф. Р3 и Р4 через 0,5 ч ускорилось, а через 1 ч мало отличалось от контроля, через 3 ч стало заметно ниже контроля (на 11 и на 24 % соответственно). Через 1 ч высвобождение ф. Р4 оставалось достоверно ускоренным относительно контроля, а высвобождение ф. Р3 сохраняло ту же тенденцию.

Таблица 1. Состояние ТЦ в разные сроки после внутривенного введения _ тромбина (0.1 мл/100 г, активность 25 с) _

Характер опыта ОКАТ, % MA, % tg а Р3.% Р4, с

Контроль 89,2±3,0 91,2±2,9 92,0±3,1 67,3±2,1 72,1±2,3 70,4±3,0 5,1±0,3 4,9±0,2 5,3+0,3 95,9±4,5 89,9±3,3 92,3±3,2 2,6+0,02 2,8+0,03 2,5±0.02

Введен тромбин 115±5,9* 102±4,1 70,1±3,4* 89,9±4,1* 75,5±2,2 58,0±1,8* 6,7±0,3* 5,8±0,2* 4,1+0,1* 121±6,2* 101±5,7 82,2+2,8* 3,7+0,04* 3,2±0,03* 1,9+0,02*

Обозначения: 1-я, 2-я и 3-я строки - через 0,5, 1 и 3 ч после инъекции соответственно; * - достоверные отличия относительно соответствующего срока отбора проб в контроле.

В целом на экзогенную гипертромбинемию ТЦ реагировали активацией, что не является неожиданностью, так как тромбин -

один из агонистов агрегации и высвобождения [Jndrot-Perrus е.а., 1990; Ruda е.а., 1990]. В свете наших задач важно, что тромбин активирует агрегацию и высвобождение гемокоагуляционных тромбоцитарных факторов вскоре после введения, и что активация ТЦ сменяется спустя некоторое время признаками истощения.

Во 2-й серии опытов моделировали эндогенную тромбинемию двумя способами.

1. У крыс вызывали кровопотерю (v. jugularis) на 6-й, 8-й и 11-й дни от начала опыта (соответственно 7,5, 10,0 и 10,0% от объема циркулирующей крови). На 12-й день брали пробы, определяя одновременно исходные показатели у интактных крыс Кро-вопотеря привела к росту общей коагуляционной активности ТЦ (на 20 %) и их АДФ-агрегации (на 22% по значению МА и на 18 % - по tg а). С этими сдвигами согласуется повышение уровня фф. Рз и Р4 в плазме на 17 и 31% соответственно.

Кровопотеря в наших опытах - процесс не одномоментный, поэтому не определяли изменений в динамике, кроме того, в соответствие с задачей нас устраивало то, что характер сдвигов был близок к вызванным экзогенной тромбинемией. Оценивая изменения, мы могли считать, что кровопотеря - удовлетворительная модель эндогенной гипертромбинемии, как это показано ранее в нашей лаборатории [В.Г.Соловьев, 1997; И.А.Дементьева, 1998].

2. В качестве дополнительного контроля мы провели еще одну серию опытов, моделируя эндогенную тромбинемию с помощью травматического токсикоза. На 12 ч накладывали сдавливающую лигатуру на бедро задней конечности крысы, что приводит (после удаления лигатуры) к гипокоагулемии потребления [В.Г.Соловьев, 1993, 1997]. Лигатуру накладывали на бедро задней конечности, через 4 ч удаляли и спустя 1 ч брали пробы крови.

Таблица 2. Состояние ТЦ через 1 ч после удаления сдавливающей бедро __лигатуры____

Показатели Контроль Через 1 ч после снятия лигатуры

ОКАТ, % 91,3+2,9 123±5,7*

МА, % 63,1±5,0 78,1±2,2*

tg а 4,8+0,1 6,2±0,2*

Ф. Р3,% 81,9+2,7 99,8±3,4*

Ф. P¿, с 2,7+0,02 4,0±0,03*

Обозначения: * достоверные отличия от контроля

Как видно из табл. 2 данных, удаление лигатуры сопровождалось повышением ОКАТ, их агрегационной активности и усиленным высвобождением фф. Р3 и Рд. Таким образом, при гипер-

тромбинемии, разного происхождения гемокоагуляционная активность ТЦ изменяется принципиально одинаково.

В следующей серии для активации ТЦ использовали свинец (уксуснокислая соль, 5 мг/100 массы), вызывающий за 12 дней начальные признаки нарушения порфиринового обмена [А.А.Мкр-тумян, 1994], повышающий уровень продуктов ПОЛ в них [С.Н.Ельдецова, 1990] и, в связи с этим, агрегационную и «высвобождающую» активность [И.А.Дементьева, 1998].

Оказалось, что при введении свинца, примерно в той же степени как при гипертромбинемии экзо- или эндогенной, повысилась ОКАТ, агрегационная активность и интенсивность высвобождения.

Таблица 3. Состояние ТЦ после 12-дневного введения уксуснокислого свинца _ (5 мг/100 г)_

Показатели Контроль Вводили свинец

ОКАТ, % 91,8± 2,7 111+6,0*

МА, % 62,4±3,2 71,2±2,9*

<д а 4,9+0,07 5,7±0,06*

Ф. Р3,% 82,1±2,4 102±3,5*

Ф. Р4. с 2,8±0,03 4,2+0,04*

В целом, изученные воздействия мы могли использовать для анализа взаимосвязи уровня активности ТЦ и уровня активности коагуляционного гемостаза.

Состояние гемокоагуляционного потенциала при активации ТЦ. В

этой части работы изучали общую свертывающую активность крови (АВР и АЧТВ) и показатели интенсивности тромбинемии (частота положительного ЭТ, уровень ПДФ и уровень фибриногена). Проведены четыре серии опытов, которые по характеру постановки повторяли представленные выше, с той разницей, что в пробах крови определяли перечисленные показатели

В опытах с экзогенной тромбинемией пробы отбирали на высоте тромбинемии - через 0,5 ч после инъекции тромбина.

Таблица 4. Гемокоагуляция в разные сроки после внутривенного введения _тромбина (0,1 мл/100 г, активность 12 с)_

Показатели Контроль Опыт

АВР, с 51,3+1,3 72,1±2,3*

АЧТВ, с 38,2+1,0 48,9+1,2*

ФГ, г/л 3,3±0,3 2,1+0,1*

ПДФ, мг% 15,7±1,7 28,8±2,7*

ЭТ, частота % 0,0 50,0

Обозначения: * - достоверные отличия относительно контроля

Через 0,5 ч после инъекции тромбина (табл. 4) обнаружились признаки гипокоагулемии потребления - удлинение АВР и

АЧТВ, гипофибриногенемия, рост уровня ПДФ и частоты ЭТ: тромбинемия вызвала гиперкоагуляцию, приведшую к потреблению факторов свертывания. Эти изменения синхронны с моментом выявления активации ТЦ (сравнить с табл. 1).

Таблица 5. Гемокоагуляция на 12-й день повторной кровопотери; п=5

Показатели Контроль Опыт

АВР, с 52,6±1,4 62,0+2,2*

АЧТВ, с 37,0±1,9 47,2±1,1*

ФГ, г/л 3,4±0,3 2,6+0,08*

ПДФ, мг% 17,1±1,8 24,8±1,3*

ЭТ, частота % 0,0 25,0

Обозначения: * - достоверные отличия при сравнении с контролем При повторной кровопотере найдены принципиально те же изменения (табл. 5).

После удаления лигатуры с бедра (травматический токсикоз) вновь выявили гипокоагулемию потребления (табл. 6).

Таблица 6. Гемокоагуляция через 1 ч после удаления лигатуры

Показатели Контроль Опыт

АВР, с 53,4±1,5 79,0±2,8*

АЧТВ, с 38,4±1,8 49,9±1,3*

ФГ, г/л 3,1 ±0,2 1,8+0,07*

ПДФ, мг% 16,2+1,7 35,9±1,4*

ЭТ, частота % 0,0 25,0

Обозначения: * - достоверные отличия при сравнении с контролем

При активации тромбоцитов введением свинца ускорилось внутрисосудистое свертывание (рост ПДФ и ЭТ), рассогласова-лись показатели общей свертываемости: АВР удлинено, АЧТВ укорочено - переходная стадия ДВС [З.С.Баркаган, 1988].

Таблица 7. Гемокоагуляция после 12-дневного введения уксуснокислого _свинца (5 мг/100 г); л=5_

Показатели Контроль Опыт

АВР, с 55,1+1,7 63,3±2,1*

АЧТВ, с 36,8±1,1 29,9±1,3*

ФГ, г/л 3,3±0,3 2,9+0,07

ПДФ, мг% 14,8±1,2 20,9+1,1*

ЭТ, частота % 0,0 12,0*

Обозначения: * - достоверные отличия при сравнении с контролем

На диаграмме (рис. 1) видно, что изменения фибриногенемии и ПДФ тем заметнее, чем значительнее сдвиги ОКАТ и агрегации тромбоцитов - степень сдвигов в коагуляционном компоненте гемостаза зависит от степени сдвигов активности тромбоцитов.

Жя*ш£

окат ма фг пдф

Рис. 1. Сдвиги показателей (%) относительно контроля при экзогенной тромбинемии (белый столбик), кровопотере (светпо-серый), травматическом токсикозе (темно-серый) и введении свинца (черный). Обозначения: ОКАТ -общая коагуляционная активность тромбоцитов, МА - максимальная агрегация, ФГ - фибриноген.

Итак, при воздействиях, повышающих активность тромбоцитов, растет гемокоагуляционный потенциал пропорционально степени активации тромбоцитов.

Гемокоагуляционные свойства тромбоцитов при воздействиях, ограничивающих их активность. Для снижения агрегационной и высвобождающей способности тромбоцитов использовали анти-оксидант ДМ первоначально 50 мг/100 г массы в сут. Эта доза в 2 раза ниже заметно снижающей ПОЛ в тромбоцитах [С.Н.Ель-децова, 1990; А.А.Вакулин, 1998]. После 12 дней введения брали пробы, ориентируясь на сроки, описанные выше упомянутыми исследователями (к этому сроку падает активность ПОЛ).

Таблица 8. Состояние ТЦ и коагуляционного гемостаза на 12-й день введения

Показа- Интактный контроль Животные получали ди-

тели мефосфон

ОКАТ, % 81,8+3,2 77,3±2,3

МА, % 72,2±3,1 65,7+3,2

а 4,9±0,2 4,5+0,3

Ф. Р3,% 84,3±2,1 79,9±2,4

Ф. Р4, с 2,8+0,02 2,4+0,02

АВР, с 57,0+1,6 61,0+2,8

АЧТВ, с 38,9±1,6 45,9+3,2

ФГ, г/л 3,1±0,3 2,9±0,08

ПДФ, мг% 16,7+1,6 14,1+1,0

ЭТ, частота % 0,0 0,0

Из данных табл. 8 видно, что активность ТЦ крыс, получавших ДМ, судя по направлению сдвигов всех показателей, имеет тенденцию к снижению неподтверждаемую статистически, но несо-

мненную - мала вероятность случайного изменения всех показателей в одном направлении. Сдвиги гемокоагуляции у тех же крыс указывают на тенденцию к снижению гемокоагуляционного потенциала также статистически неподтвержденную.

Далее изучали те же показатели при введении ДМ (12 дней, 100, 200 и 400 мг/100 г массы), предполагая выявить изменение эффекта при увеличении дозы. По данным табл. 9 ОКАТ, МА, 1д а и высвобождение фф. Р3 и Р4 снижаются с увеличением дозы ДМ. Гемокоагуляционный потенциал при дозе 100 мг/100 г снизился достоверно, степень снижения выше с увеличением дозы.

Таблица 9. Состояние ТЦ и гемокоагуляции на 12-й день введения ДМ (100, _ 200 или 400 мг/ г)_

Показатели Интактный контроль Опыт

ОКАТ, % 83,0+2,4 74,1±2,2* 68,1+1,6* 53,4+1,3*

МА, % 74,1+3,0 62,1+2,2* 57,0+2,1* 49,3+1,9*

+д а 4,5+0,2 4,0+0,1* 3,7+0,2* 3,1+0,1*

Ф. Р3,% Ф. Р4> с 83,5±2,0 3,2±0,03 75,2±1,8* 69,3+1,3* 61,2+1,0* 2,3+0,02* 2,0+0,02* 1,7±0,01 *

АВР, с 58,0±1,7 64,9+2,6* 67,8±2,6* 72,3+2,8*

АЧТВ, с 37,2±1,4 46,9±1,2* 50,1+1,4* 56,2±1,7*

ФГ, г/л 3,3±0,4 2,8±0,09 2,9±0,10 3,2±0,11

ПДФ, мг% 15,1+1,4 12,1+1,1 10,2±1,0* 8,3±0,9*

ЭТ, частота % 0,0 0,0 0,0 0,0

Обозначения: 1-я, 2-я и 3-я строки - дозы в 100, 200 и 400 мг/100 г соответственно; * - достоверные отличия от контроля

Таким образом, активность коагуляционного гемостаза растет с повышением и падает с понижением способности ТЦ к агрегации и к высвобождению важнейших гемокоагуляционных фф. Р3 и Р4, ускоряющих образование тромбина, взаимодействие тромбин-фибриноген и самосборку фибрина [Б.А.Кудряшов, 1975; Д.М.Зубаиров, 1978; А.Ш.Бышевский и др., 1991, 1997]. Частота гибели животных и степень гемокоагуляционных сдвигов при дозированной тромбинемии на фоне измененной активности ТЦ. Выше показано, что при активации ТЦ растет потенциал коагуляционного гемостаза, а при снижении их активности гемокоа-гуляционный потенциал падает. Вполне обосновано представление о том, что выживаемость животных при введении тромбина зависит от состояния противосвертывающего механизма [Б.А.Кудряшов, 1975] и может изменяться под влиянием ряда внешних воздействий [А.Ш.Бышевский, В.Н.Кожевников, 1986]. Изучена зависимость противосвертывающей реакции от уровня повреждения нервной системы [Б.А.Кудряшов, 1975]. Вклад ТЦ в этом плане не изучался, хотя их гиперагрегабельность - одна из причин наклонности к тромбозам [З.С.Баркаган, 1988; В.П.Балуда и др., 1994].

Мы пытались выявить, как активность ТЦ отражается на «готовности» животных к аварийному ускорению внутрисосуди-стого свертывания, на способности перенести гипертромбинемию.

В 1-й серии соответствующих исследований группа животных получала свинец (12 дней), контрольная свинца не получала. На 13-й день всем животным ввели в яремную вену раствор тромбина (0,1 мл/100 г, активность - 17 с), учли гибель крыс в течение 1-го ч. У выживших брали пробы крови, определяя АВР и АЧТВ, уровень фибриногена, ПДФ и ЭТ.

После введения тромбина крысам, не получавшим свинца, из 20 выжили 13 (65±3,2 %). Из 20 крыс, которым тромбин ввели на фоне свинца, выжило 6 (30±2,8%, Р <0,05).

Таблица 10. Состояние ТЦ через 1 ч после введения тромбина (0,1 мл/100 г, активность 17 с) животным, получавшим в течение 12 дней свинец (5

мг/100 г); п=6

Показа- Контроль интактный Свинца не по- Получали сви-

тели лучали нец

ОКАТ, %+ 81,2±3,1 97,3+5,3* 137,3±7,3**

МА, % 73,2±3,1 85,7+3,2* 97,2±1,9**

»д а 4,8+0,3 6,7±0,3* 7,8±0,4"

Ф. Р3,% 85,0±2,2 92,9±2,7* 108±2,7**

Ф. с 2,6±0,03 5,2±0,03* 6,4±0,03**

Обозначения: * - достоверные отличия при сравнении с контролем; ** -

при сравнении с контролем и колонкой 3-й.

Как видно из данных табл. 10, после введения тромбина с активностью, обусловливающей гибель части животных, у выживших крыс растет ОКАТ. То же произошло и с другими показателями активности ТЦ: степень агрегации, ее начальная скорость, высвобождение тромбоцитарных факторов. Интенсивность изменения активности ТЦ выше на фоне свинца, что совпадает с низкой выживаемостью (высокой частотой гибели).

Таким образом, толерантность животных к тромбину падает при повышенной активности ТЦ (выше показано, что свинец активирует ТЦ - табл. 3).

Из данных табл. 11 видно, что гипертромбинемия вызвала выраженную гипокоагулемию потребления у животных, неполу-чавших свинца - удлинение АВР и АЧТВ, снижение фибриногене-мии в 1,77 раза, рост уровня ПДФ в 1,54 раза и появление положительных ЭТ в 75% наблюдений.

Таблица 11. Гемокоагуляция у крыс через 1 ч после введения тромбина (0,1 мл/100 г, активность 17 с) животным, получавшим в течение 12 дней свинец __(5 мг/100 г); п=5__

Показатели Контроль Без свинца Вводили свинец

АВР, с 58,7±1,6 94,9±2,9* 143+10,1**

АЧТВ, с 37,9±1,3 76,1±4,2* 101 ±8,2**

ФГ, г/л 3,2±0,3 1,8±0,11 * 0,92+0,003**

ПДФ, мг% 16,2+1,6 25,1+1,1* 34,3+3,Г*

ЭТ, частота % 0,0 75,0 100

Обозначения: * - достоверные отличия при сравнении с контролем; ** -при сравнении с контролем и колонкой 3-й.

Значительнее гипокоагулемия потребления при введении тромбина на фоне свинца: в 2,4 раза удлинилось АВР, в 2,66 -АЧТВ, в 2,47 раза упала фибриногенемия и в 2,11 раза повысился уровень ПДФ. Частота положительных ЭТ стала равна 100%.

В следующей серии увеличили в 2 раза дозу свинца, чтобы усилить активацию ТЦ, зависимую от дозы прооксиданта [И.А.Дементьева, 1998]. На фоне этой дозы тромбинемия проявила себя еще заметнее: упала толерантность к тромбину (выживаемость -20%), углубилась гипокоагулемия потребления. Так, при дозе 5 мг/100 г ОКАТ увеличилась на 69%, при дозе 10 мг/100 г-на 84%, начальная скорость агрегации - на 62 и на 68 % соответственно. АВР при дозе 5 мг/100 г удлинилось на 142 %, АЧТВ - на 165, при дозе 10 мг/100 г-на 169 и 210% соответственно.

Фибриногенемия при введении тромбина на фоне свинца в дозе 5 и 10 мг/100 г упала на 71 и на 76%, уровень ПДФ возрос на 112 и на 162 %. Следовательно, высокой активности ТЦ соответствует высокий гемокоагуляционный потенциал и низкая толе-

рантность к тромбину (рост частоты гибели и ослабление проти-восвертывающей реакции на тромбин) .

Таблица 12. Состояние ТЦ и гемокоагуляции через 1 ч после введения тромбина (0,1 мл/100 г, активность 17 с) животным, получавшим в течение 12 _дней свинец (10 мг/100 г)_

Показатели Контроль (из табл. 13 и 14) Свинца не получали (из табл. 13 и 14) Получали свинец (10 г/100 г)

ОКАТ, % 81,2±3,1 97,3±5,3* 148,9±7,8"

МА, % 73,2+3,1 85,7±3,2* 98,2±1,9"

1д а 4,8±0,3 6,7+0,3* 8,1±0,5"

Ф. Р3,% 85,0±2,2 92,9±2,7* 115+3,7**

Ф. Р4. с 2,6±0,03 5,2+0,03* 8,5±0,04"

АВР, с 58,7±1,6 94,9±2,9* 159+11,0**

АЧТВ, с 37,9±1,3 76,1 ±4,2* 122±8,4**

ФГ, г/л 3,2±0,3 1,8±0,11* 0,76±0,004**

ПДФ, мг% 16,2±1,6 25,1±1,1* 42,5±3,2**

ЭТ, частота % 0,0 75,0 100

Обозначения: * - достоверные отличия при сравнении с контролем; ** -при сравнении с контролем и колонкой 3-й.

В следующей серии снижение активности ТЦ вызывали введением ДМ (100, 200 или 400 мг/100 г) или аспирина (15 мг/100 г -Р15о% [И.В.Ральченко, 1998]). Вводя ДМ, повторили опыт, описанный в табл. 9, с той разницей, что части животных из каждой группы вводили на 12-й день тромбин (0,1 мл/100 г, активность 17 с), учитывая частоту гибели за 1 ч. У выживших оценивали ТЦ и коагуляционный гемостаз.

Выживаемость животных при введении тромбина на фоне ДМ составила: при дозе 100 мг/100 г - 14 (70±7,3%), при дозе 200 мг/100 г - 15 (75±6,2%) и при дозе 400 мг/100 г - 17 из 20 (85±6,1%). Достоверно отличается выживаемость при дозе 400 мг/100 г массы. Выживаемость в контрольной группе - 65%±3,2.

Из данных табл. 13 видно, что реакция на тромбин на фоне ДМ менее выражена, чем в контроле: ограничена степень изменения показателей активности ТЦ и коагуляционного компонента гемостаза. Прослеживается, как и ранее, следующая зависимость: чем выше значения активности ТЦ, тем выше интенсивность изменений, вызываемых тромбином в коагуляционном компоненте гемостаза, выше и частота гибели животных от тромби-немии. Особенно важно, что с увеличением дозы ДМ, когда в большей степени падает активность ТЦ, наблюдается более выраженное ослабление реакции на тромбинемию.

Таблица 13. Состояние ТЦ и гемокоагуляции через 1 ч после введения тромбина (0,1 мл/100 г, активность 17 с) крысам, получавшим 12 дней ДМ (100, __200 или 400 мг/100 г)_

Тесты Контроль Тромбин Тромбин на фоне ДМ

ОКАТ, % 83,0±2,4 96,2±5,1* 95,5+2,1* 89,1+1,6*+ 85,3+1,2+

МА, % 74,1+3,0 88,0+3,0* 79,9±2,2*+ 78,0±2,1 + 73,3±1,9+

(д а 4,5+0,2 6,8±0,3* 6,1±0,1*+ 5,7+0,2*+ 4,9 ,1±0,1*+

Ф. Р3,% 83,5±2,0 91,7±2,5* 87,7±1,1*+ 86,0+1,0*+ 84,2±1,0+

Ф. Р4, с 3,2±0,03 5,4±0,04* 5,0±0,02* 4,8±0,01*+ 3,9±0,01*+

АВР, с 58,0±1,7 95,1+2,7* 87,9±2,3*+ 81,0±2,1*+ 72,5±2,3*+

АЧТВ, с 37,2±1,4 75,9±4,1* 66,9±1,0*+ 59,3±1,2*+ 48,3+1,2*+

ФГ, г/л 3,3±0,4 1,7+0,10* 1,9±0,08* 2,3±0,0*+ 3,0±0,10*+

ПДФ, мг% 15,1±1,1 24,6±1,0* 20,0±1,1*+ 17,5±0,9*+ 15,3±0,9+

ЭТ, частота % 0,0 75,0 0,0+ 60,0+ 25,0+

Обозначения: 1-я, 2-я и 3-я строки - ДМ 100, 200 и 400 мг/100 г соответственно; * - достоверные отличия от контроля, + - достоверные отличия

между 3-й и 2-й колонками цифр В следующей серии опытов активность ТЦ модифицировали аспирином, исходя из данных о его способности тормозить превращения арахидоновой кислоты [А.А.Кубатиев, С.В.Андреев, 1981] и высвобождение фф. Р3 и Р4 [И.В.Ральченко, 1998]. В опытах использовали дозу 015о<%, (15 мг/100 г массы) [А.А.Вакулин, 1998]. Через 1 сут вводили тромбин, пробы брали через 1 ч.

Тромбин вызывал резкую активацию ТЦ и признаки глубокой гипокоагулемии потребления (как это было обнаружено в выше рассмотренных экспериментах). При введении тромбина на фоне аспирина все эти сдвиги значительно ослаблены (табл. 14).

Выживаемость животных после введения тромбина на фоне аспирина - 85+3,7% (Р<0,05 при сравнении с выживаемостью контрольных животных - 65%±3,2).

Здесь, как и в предыдущем эксперименте, снижение активности тромбоцитов сопровождается ослаблением интенсивности сдвигов, вызываемых введением тромбина в кровоток. Одновременно обнаруживается и увеличение выживаемости животных.

Таким образом, активация тромбоцитов сопровождается активацией коагуляционного гемостаза и снижением толерантности к внезапному появлению избытка тромбина в кровотоке.

Снижение активности ТЦ влечет за собой снижение интенсивности внутрисосудистого свертывания крови, а также ослабляет интенсивность гемокоагуляционных сдвигов, возникающих при внезапном росте уровня тромбинемии.

Таблица 14. Состояние ТЦ и гемокоагуляции через 1 ч после введения тромбина (0,1 мл/100 г, активность 17 с) крысам, получившим за сутки до

этого аспирин 1 15 мг/100 г); п=5.

Показа- Контроль Тромбин Тромбин на фоне

тели аспирина

ОКАТ, % 82,0+2,1 95,9±4,9* 87,6±1,2+

МА, % 75,2±2,9 89,9±3,1* 78,1+2,2+

♦д а 4,7+0,3 6,9±0,2* 5,7±0,1*+

Ф. Р3,% 84,7+1,8 94,3+2,6* 87,0±1,0*+

Ф- Р4. с 3,4±0,02 5,7+0,03* 4,8+0,01*+

АВР, с 57,1±1,9 98,1+2,4* 82,0+2,0*+

АЧТВ, с 38,5±1,5 77,3±3,8* 59,3+1,2*+

ФГ, г/л 3,5±0,3 ГТ, 6±0,09* 2,3+0,0*+

ПДФ, мг% 16,1 ±1,2 25,7+1,1* 18,0±1,1*+

ЭТ, частота % 0,0 85,0 50,0+

Обозначения: 1-я, 2-я и 3-я строки - дозы 100, 200 и 400 мг/100 г соответственно; * - достоверные отличия от контроля, + - достоверные отличия между 3-й и 2-й колонками цифр

Эти наблюдения указывают на существенную зависимость коагуляционного гемостаза от уровня гемокоагуляционной активности ТЦ. В связи с этим возникает вопрос о степени этой зависимости: в какой мере активация ТЦ определяет возможность усиления внутрисосудистого свертывания крови, или же в какой мере снижение активности ТЦ ограничивает эту возможность?

И еще один вопрос: связана ли активация внутрисосудистого свертывания с активацией ТЦ, или их активация - компонент активации внутрисосудистого свертывания крови, т.е. следствие повышения интенсивности коагуляционного гемостаза? Эксперименты следующей части работы - попытка ответить на эти вопросы.

Зависимость состояния коагуляционного гемостаза от активности тромбоцитов (прямые наблюдения). В этой части работы изучали влияние инфузии в разной степени активированных ТЦ на коагуля-ционный гемостаз. Группе крыс вводили свинец (10 мг/100 г в течение 12 дней), другой - ДМ (400 мг/100 г в течение 12 дней). На 13-й день у крыс (15 в группе) забирали из яремной вены (под эфирным наркозом) по 3 мл крови. Это количество у крысы с массой ~100 г можно взять в шприц со стабилизатором без нарушения правил отбора для гемостазиологических исследований.

Из пула крови одной группы крыс получали богатую ТЦ плазму, осаждали ТЦ центрифугированием, отмывали их и ресус-пендировали в 0,14 М растворе №С1 в объеме, составляющем 0,1 от исходного. Аликвоту разбавляли тем же раствором в 10 раз, определяли активность ТЦ по ОКАТ и МА.

Интактным крысам инъецировали взвесь ТЦ из расчета: на 100 г массы вводили взвесь, полученную из 2,5 мл плазмы (адекватно 5 мл крови). Учитывая, что ТЦ сконцентрированы в 10 раз, их инфузия не влияла существенно на гематокрит, так как вводили 0,5 мл/100 г массы тела. Объем циркулирующей крови составляет примерно 5% от массы тела крысы, следовательно, после введения концентрация ТЦ у крысы-реципиента увеличивалась примерно в 2 раза - достаточно для выявления эффекта.

Через 10, 30 и 60 мин у реципиентов брали пробы для оценки коагуляционного гемостаза. Контроль - крысы, которым вводили ТЦ животных, не подвергавшихся каким-либо воздействиям («нормальные" ТЦ). Предварительно концентрат ТЦ с нормальной активностью (пул от 10 крыс) вводили в количестве от 0,2 до 0,5 мл (с шагом в 0,1 мл) на 100 г массы, чтобы выявить, зависит ли гемокоагуляционная активность от числа перфузированных ТЦ.

Из данных табл. 15 видно, что при введении концентрата ТЦ в объеме 0,2 мл/100 г массы (увеличение их расчетной концентрации примерно на 50%) выявляется едва заметная тенденция к активации коагуляционного гемостаза.

Таблица 15. Влияние инфузии взвеси «нормальных» ТЦ на активность коагу-_ляционного компонента гемостаза_

Показатели Концентрат (в 10 раз) ТЦ ввели (мл/100 г):

0,0 0,2 0,3 0,4 0,5

АВР, с 57,3±1,8 55,3±2,4 49,9±2,3* 44,2+2,7* 41,4±2,8*

АЧТВ, с 36,9+1,1 34,8±1,2 31,9±1,0* 30,0±1,1* 28,3±1,2*

ФГ, г/л 3,2+0,3 3,1 ±0,2 3,0±0,3 3,4±0,4 3,5±0,4

ПДФ, мг% 16,0+1,2 18,9+1,0 18,9+1,1* 21,2±1,Г 23,7±1,3*

ЭТ, % 0,0 0,0 10,0* 25,0* 35,0*

* - достоверное отличие от контроля (введено 0,0 мл)

Тенденция подтвердилась статистически при увеличении объема концентрата до 0,3 мл и особенно - до 0,4 мл/100 г (расчетное увеличение концентрации ТЦ у реципиента ~ в 2 раза). С увеличением концентрации ТЦ у реципиента в 2,5 раза (0,5 мл концентрата/100 г) сдвиг показателей в том же направлении несколько увеличился. Предполагая, что степень сдвига может зависеть от активности ТЦ, мы выбрали дозу в 0,5 мл, чтобы иметь возможность выявить усиление эффекта или его ослабление.

В очередной серии исследований крысы (9 в группе) получали в течение 12 дней уксуснокислый свинец - 5 или 10 мг/100 г массы тела. На 13-й день взята кровь, получена взвесь ТЦ обеих групп раздельно в указанной концентрации. Такую же взвесь получили из крови контрольных крыс. Обе взвеси ТЦ ввели по 0,5 мл 6 крысам каждую. Через 10, 30 и 60 мин у реципиентов взяты пробы. Результаты - в табл. 16. Им мы предпосылаем данные о состоянии ТЦ по результатам определения ОКАТ и МА: у неподвергавшихся воздействиям ОКАТ - 83,4±2,2, МА -76,3±2,1; у получавших 5 мг свинца на 100 г ОКАТ - 91,4+2,3* МА - 82,1±2,3*; у получавших 10 мг свинца на 100 г ОКАТ -98,7+2,4", МА - 87,9±2,1"

Таблица 16. Влияние инфузии взвеси «активированных» свинцом ТЦ на коагу-_ляционный компонент гемостаза_

Показатели Крысам ввели концентрат (по 0,5 мл) ТЦ

от интактных крыс получавших свинец, 5 мг/100 г получавших свинец, 10 мг/100 г

АВР, с 42,3+1,6 37,2+1,2* 32,4±1,1*+

44,1+1,2 31,9+1,1*+ 28,1+1,2*

41,9+1,6 39,3+1,2 42,4+1,0

АЧТВ, с 29,1+1,1 24,2±0,9* 21,0+0,7*+

30,0+1,0 21,1+1,0*+ 18,0+0,5*+

28,9±1,2 28,4±1,1 29,1±0,8

ФГ, г/л 3,4±0,3 3,4±0,2 3,1±0,4

3,3±0,4 3,3±0,3 3,5±0,5

3,2±0,1 3,1±0,2 3,3±0,3

ПДФ, мг% 23,7+1,3 28,9±1,1* 33,2±1,0*+

24,1+1,7 33,0+1,4*+ 38,1+1,1*+

25,1+1,8 24,1±1,3 22,9±1,1*

ЭТ, % 25,0 50,0* 65,0*+

30,0 75,0* 80,0*+

25,0 50,0* 35,0*'

Обозначения: * - достоверные отличия от контроля, + - достоверные отличия между 3-й и 2-й колонками цифр; 1-я, 2-я и 3-я строка - через 10, 30 и 60 мин после введения взвеси.

В табл. 16 видна зависимость сдвигов на 10-й мин после инъекции ТЦ от их активности. Характер зависимости свидетельствует

об ускорении внутрисосудистого свертывания с ростом активности инъецированных ТЦ: укорочение АВР и АЧТВ, рост уровня ПДФ и частоты положительных ЭТ с увеличением активности ТЦ.

Рост коагуляционного потенциала стал еще заметнее через 30 мин после инъекции и не выявлялся спустя 1 ч.

В следующей серии опытов крысы получали в течение 12 дней ДМ - 400 мг/100 г массы тела. На 13-й день взята кровь, выделены ТЦ, приготовлен их концентрат, который вводили ин-тактным крысам внутривенно, отбирая пробы крови через 10, 20 и 30 мин после инфузии.

Инфузия ТЦ с пониженной активностью сопровождалась снижением гемокоагуляционного потенциала: удлинились АВР и АЧТВ не только по отношению к крысами, которым ввели ТЦ с повышенной активностью, но и к крысам, получившим «нормальные» ТЦ. Уменьшились содержание ПДФ, частота положительных ЭТ. Выявленный сдвиг наблюдался в течение часа (табл. 17).

Таблица 17. Влияние инфузии взвеси ТЦ крыс, получавших ДМ, на коагуля-_ционный компонент гемостаза; п=5._

Крысам ввели концентрат (по 0,5 мл)

тромбоцитов от:

Показатели «Нормальные» интактных крыс, получавших ДМ

тромбоциты крыс (400 мг/100 г)

АВР, с 57,3±1,8 42,3±1,6 63,9±1,3*+

44,1±1,2 59,9±1,2+

41,9±1,6 56,3+1,2+

АЧТВ, с 36,9±1,1 29,1+1,1 39,9+0,7*+

30,0±1,0 41,8±1,0*+

28,9±1,2 40,1+1,0*+

ФГ, г/л 3,2±0,3 3,4+0,3 3,1±0,1

3,3±0,4 3,4±0,3

3,2±0,1 3,0±0,1

ПДФ, мг% 16, 0± 1,2 23,7+1,3 15,0±1,1 +

24,1±1,7 13,1±1,4*+

25,1±1,8 14,7±1,2+

ЭТ, % 0,0 25,0 0,0+

30,0 0,0+

25,0 0,0+

Обозначения: * - достоверные отличия от контроля; 1-я, 2-я и 3-я строка -через 10, 30 и 60 мин после введения. Данные в графе «от интактных крыс» взяты из табл. 15 , в графе «Нормальные тромбоциты» - из табл. 16 (опыты проводились с интервалом в 4-5 дней).

Таким образом, инфузия ТЦ с повышенной активностью усиливает гемокоагуляционный потенциал, инфузия ТЦ со сниженной активностью - уменьшает. Сказанное подтверждает приведенные нами выше данные, согласно которым состояние коагуляционного

компонента гемостаза зависит от степени активности ТЦ. Связь между гемокоагуляционной активностью ТЦ и интенсивностью ПОЛ в них. Малочисленные указания на связь между интенсивностью ПОЛ в ТЦ и их гемокоагуляционной активностью. [С.Н.Ельдецова, 1990; И.В.Селиванова, 1994; Д.С.Марченко, 1998] могут служить основанием для испытания антиоксидантоЕ как средства ограничения угрозы тромбообразования при ряде патологических состояний. Практическое значение этих указаний е случае подтверждения, возможность раскрытия с помощью этих данных механизмов связи ПОЛ-гемостаз побудили нас проследить зависимость между активностью ТЦ и ПОЛ в них, т.е. связь ПОЛ в ТЦ с интенсивностью коагуляционного гемостаза.

Мы повторили эксперименты с активацией и ограничением активности ТЦ, определяя интенсивность ПОЛ в ТЦ подопытных животных: 1) на 12-й день введения свинца в дозах 5 и 10 мг/100 г; 2) на 12-й день введения ДМ (100, 200 и 400 мг/100 г массы).

Таблица 18. Активность ПОЛ в ТЦ после введения свинца в течение 12

дней

Показатели Контроль Свинец, 5 мг/100 г Свинец, 10 мг/100 г

ДК, А/мг 0,12±0,03 0,20±0,03* 0,25+0,02*+

ТБК, ед/мг 0,54±0,06 0,70±0,04* 0,78±0,03*+

Период индукции, мин/мл 50,0+3,04 42,1 ±2,0* 34,6±2,3*+

Скорость окисления, мм3/мл в мин 0,72±0,07 1,11±0,03* 1,43+0,03*+

Обозначения: * достоверное отличие от контроля, + - достоверное отличие цифр колонки 3-й от 2-й

Согласно данным табл. 18, введение прооксиданта (свинца) сопровождалось активацией ПОЛ (прирост уровня ДК и ТБК) и снижением антиоксидантного потенциала тромбоцитов (укорочение ПИ и повышение скорости окисления). Активация ПОЛ соответствует росту прокоагулянтной активности ТЦ (сопоставить с табл. 3). Активация ПОЛ становится заметнее при увеличении дозы прооксиданта, как и прирост активности ТЦ.

Введение ДМ вызывало снижение уровня первичных и вторичных продуктов пероксидации, удлиняло ПИ и снижало скорость окисления (табл. 19). С увеличением дозы степень этих изменений оказывалась выше.

При сопоставлении обсуждаемых данных с характеристиками ТЦ в аналогичном эксперименте (табл. 9) видно, что их активность падает одновременно со снижением интенсивности ПОЛ.

Таблица 19. Влияние ДМ на ПОЛ в ТЦ (введение в течение 12 дней, 100, 200

и 400 мг/100 г)

Показатели Контроль Димефосфон вводили (мг/100 г)

100 200 400

ДК, А/мг 0,13±0,04 0,07±0,0Г 0,05±0,02* 0,03+0,0*+

ТБК, ед/мг 0,57+0,08 0,34±0,02* 0,28±0,03*+ 0,23±0,03*+

Период индукции, мин/мл 40,1+2,04 56,4±3,2* 59,9±3,12* 64,7+2,11*+

Скорость окисления, м3/мл/мин 0,74±0,06 0,67±0,06* 0,60±0,04*+ 0,53+0,02*+

Обозначения: * достоверные отличия от контроля, + - достоверные отличия цифр колонки 3-й от 2-й и 4-й от 3-й

Это видно на графиках (рис. 2), где приведены наиболее четко изменявшиеся показатели (в качестве характеристики ПОЛ -содержание ДК и ТБК-продуктов пероксидации в ТЦ, а в качестве характеристики активности ТЦ - а). Здесь видно, что с ростом дозы ДМ падает содержание в ТЦ продуктов ПОЛ. Примерно с тем же углом наклона снижается показатель МА и показатель начальной скорости агрегации (НС).

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

« ДК, А/мг

к. ' "Л - — т —ТБК,ед/мг

»4 — _ —- - __ —'МА.%/100

—---- —- ■

■- , —Х- НС/10

-,-!-

Рис. 2. Характер изменения уровня ДК и ТБК-продуктов, МА и начальной скорости агрегации /НС/ ТЦ в зависимости от дозы ДМ (абсцисса, в мг/100 г массы тела). Примечание: показатели МА и НС уменьшены в 100 и 10 раз соответственно для представления данных в единой системе ординат

Рис. 3 иллюстрирует динамику изменений МА, уровня ДК и ПДФ: снижение уровня ДК и МА при увеличении дозы ДМ сопровождается снижением уровня ПДФ. Уровень этих продуктов - показатель интенсивности внутрисосудистого свертывания крови. Следовательно, ослабление ПОЛ, вызывая спад активности ТЦ, ведет к спаду активности коагуляционного компонента гемостаза.

Эти данные подтверждают представление [И.В.Селиванова, 1994] о роли ТЦ в связи между ПОЛ и гемостазом.

0,8

ЕГ

—а — __

- - -л- -

-ДК, А/мг

3 —МА, %/100

Л - ПДФ, мг%/100

Рис. 3. Характер изменения уровня ДК, МА ТЦ и уровня ПДФ в зависимости от дозы антиоксиданта (абсцисса, в мг/100 г массы тела). Примечание: Показатели МА и ПДФ уменьшены в 100 каждый для представления данных в единой системе ординат

В заключение выделим основное. В процессе исследований установлено, что гипертромбинемия, вызываемая введением тромбина или активацией тромбинообразования в организме, сопровождается повышением агрегационных свойств ТЦ и усилением реакции высвобождения гемокоагуляционных тромбоцитарных факторов, повышением ОКАТ, т.е. их способности сокращать АВР. Такой же эффект вызывает и активация ТЦ прооксидантом.

Обратные изменения наблюдаются при введении крысам антиоксиданта ДМ или ингибитора циклооксигеназы ТЦ - аспирина.

Активация ТЦ сопровождается появлением признаков ускоренного внутрисосудистого свертывания крови, свидетельствующих об усиленном взаимодействии тромбин-фибриноген.

Между степенью активации ТЦ или степенью снижения их активности с одной стороны, и степенью изменения интенсивности внутрисосудистого свертывания крови - с другой, выявляется пропорциональность: падение активности ТЦ сопровождается снижением интенсивности внутрисосудистого свертывания крови, рост их активности - интенсификацией внутрисосудистого свертывания.

Способность животных выживать при экзогенной тромбине-мии в условиях нормального состояния ТЦ (65%) повышается в случае снижения и падает - при повышении активности ТЦ. Чем выше активность ТЦ, тем более заметные гемокоагуляционные сдвиги вызывает инъекция тромбина, и наоборот, - чем ниже активность ТЦ, тем менее заметны изменения коагуляционного компонента гемостаза при введении тромбина в кровоток. Следовательно, от состояния активности ТЦ в известной степени зависят и толерантность животных к тромбину (степень выживаемости), и интенсивность изменений коагуляционного компонента гемостаза.

Представление о направленности связи от ТЦ к коагуляцион-

ному гемостазу подтверждено опытами с инфузией интактным крысам ТЦ с различной степенью активации.

Активность ТЦ пропорциональна интенсивности ПОЛ в них, следовательно, интенсивность внутрисосудистого свертывания крови зависит (через ТЦ, в частности) от состояния процессов пе-роксидации в организме. Это - дополнительное подтверждение роли ТЦ как промежуточного звена связи в цепи событий, определяющих зависимость состояния гемостаза от процессов ПОЛ.

ВЫВОДЫ

1. Рост общей коагулирующей активности тромбоцитов, их способности к агрегации и к реакции высвобождения сопровождается ускорением внутрисосудистого свертывания крови, протекающего в условиях нормы с малой интенсивностью.

2. Снижение общей коагулирующей активности тромбоцитов, их агрегантных и «высвобождающих» свойств сопровождается уменьшением интенсивности внутрисосудистого свертывания крови.

3. Инфузия тромбоцитов с активностью выше физиологической ведет к ускорению внутрисосудистого свертывания крови, а тромбоцитов с активностью ниже физиологической - к уменьшению интенсивности этого процесса.

4. У экспериментальных животных с повышенной гемокоагу-ляционной активностью тромбоцитов падает толерантность к ги-пертромбинемии, а у животных с пониженной активностью тромбоцитов толерантность к гипертромбинемии увеличивается.

5. Наряду с изменением частоты гибели (выживаемости) животных при гипертромбинемии, изменение толерантности к тромбину проявляется изменением интенсивности гемокоагуляционных сдвигов в ответ на рост уровня тромбина в кровотоке.

6. Одним из механизмов связи ПОЛ —> гемостаз является повышение интенсивности ПОЛ в тромбоцитах, сопровождающееся ростом их гемокоагуляционной активности, определяющей активность функционирования коагуляционного компонента гемостаза.

Полученные данные - дополнительное обоснование целесообразности использования антиоксидантов для неспецифической профилактики тромбогеморрагических осложнений при состояниях, сопровождающихся интенсификацией тромбиногенеза, так как нами подтверждено, что использование ДМ, снижающего активность ТЦ, и свинца, повышающего их активность, сопровождается ослаблением или усилением процессов пероксидации в этих клетках.

Список публикаций по теме диссертации

1. Гемокоагуляционный потенциал при активации тромбоцитов //Матер, междун. симпозиума «Медицина и охрана здоровья» -Тюмень, 1998. - С. 390 (соавт. И.В.Ральченко, А.Ю.Рудзевич,

A.Е.Вронских).

2.Влияние на гемокоагуляцию воздействий, снижающих активность тромбоцитов // Там же. - С. 391 (соавт. С.Л.Галян, Д.С.Марченко, И.В.Ральченко, А.Ю.Рудзевич).

3. Выживаемость животных и гемокоагуляционные сдвиги при дозированной тромбинемии в зависимости от коагуляционной активности тромбоцитов // Там же. - С. 392 (соавт. A.LLI. Бышев-ский, С.Л.Галян, А.Ю.Рудзевич и др.).

4. Неспецифическая медикаментозная профилактика тромбоге-моррагических осложнений (обзор) // Ж. Научн. вестник ТГУ. -1998. 4. - С. 3-11 (соавт. А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, В.А.Полякова и др.).

5. Профилактика гиперкоагулемии потребления в послеоперационном периоде, интраоперационных кровотечений, ранних тромбозов шунтов у больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей // Методич. указания для врачей. Минздрав РФ, ТГМА, ОКБ. - 1998. - 24 с (соавт. Горбатиков К.В., Бы-шевский А.Ш., Нелаев B.C. и др.)

6. Применение комплексного антиоксиданта Селмевит в лечении больных с атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей до и после операции аорто-бедренного шунтирования // Методич. указания для врачей. Минздрав РФ, ТГМА, ОКБ. -1998. - С. 23 (соавт. Горбатиков К.В., Бышевский А.Ш., Нелаев

B.C. и др.).

7. О зависимости коагуляционного гемостаза от уровня коагуло-активнрости его тромбоцитарного компонента // «Медицина и охрана здоровья» - Тюмень, 1998. - С. 331 (соавт.

A.Ш.Бышевский, В.А.Полякова, Е.А.Винокурова и др.)

8. Агрегация тромбоцитов в предоперационном и послеоперационном периодах у женщин, родоразрешающихся кесаревым сечением, при нгазначении Селмевита и без него // «Медицина у охрана здоровья» - Тюмень, 1998. - С. 337 (соавт. А.Ю.Рудзевич,

B.Ф.Игошев)