Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Построение генетической карты хромосомы 10 крысы и анализ локусов, содержащих гены, регулирующие уровень кровяного давления

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Построение генетической карты хромосомы 10 крысы и анализ локусов, содержащих гены, регулирующие уровень кровяного давления"

уф

На правах рукописи

ДУХАНИНА ОКСАНА ИГОРЕВНА 1—

ПОСТРОЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КАРТЫ ХРОМОСОМЫ 10 КРЫСЫ И АНАЛИЗ ЛОКУСОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГЕНЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ УРОВЕНЬ КРОВЯНОГО ДАВЛЕНИЯ

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онкогенеза Института молекулярной биологии им. В.Л. Энгельгардта РАН и отделе физиологии и молекулярной медицины Медицинского колледжа штата Огайо, США.

Научные руководители: профессор Дж.П. Рэпп член-корреспондент РАН, профессор Л.Л. Киселев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.А. Лимборская кандидат химических наук Э А. Брага

Ведущая организация: Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗМП

Защита диссертации состоится "ААг СЫ-ШС$\ 1997 г. в 1 ( часов на заседании Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, д. 32, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь ДиссертационногаЖэ: кандидат химических наук У// У

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Для изучения многих заболеваний человека широко используют крысу Rattus norvégiens в качестве экспериментальной модели. Лёгкость скрещивания, короткий репродуктивный период и возможность получения инбредных линий позволяют использовать крысу для генетических и физиологических исследований. Однако, по сравнению с генетическими картами человека (Dib étal., 1996) и мыши (Dietrich et al., 1996), существующая генетическая карта крыш недостаточно подробна (Jacob et al., 1995; Pravenec et al., 1996). Поэтому получение новых маркёров генома крысы и построение более подробных генетических карт отдельных хромосом весьма актуальны.

В данной работе крысу использовали в качестве модели для изучения гипертонии человека. Гипертония - широко распространённое заболевание, затрагивающее 15-20% человеческой популяции. Исследования на животных могут помочь в обнаружении генов, контролирующих и регулирующих уровень кровяного давления у человека. Ранее с использованием расщепляющихся популяций, полученных скрещиванием гипертегоивных и нормотензивных линий крыс, на различных хромосомах крысы выявили локусы, несущие гены, регулирующие уровень кровяного давления (см. обзор Schork etal., 1996), в том числе обнаружили один или два таких генетических локуса на хромосоме 10 (Jacob et al, 1991; Hilbert et al, 1991; Deng & Rapp, 1992; Deng & Rapp, 1995). Такие локусы называются локусами количественного признака (quantitative trait loci, QTL). Для более точной локализации выявленных на хромосоме 10 районов требовалось обнаружить и них новые информативные маркёры, построить достаточно подробную генетическую карту этой хромосомы и получить для неё конгенные линии.

Пели и задачи работы. Целью данной работы было обнаружение новых мик[ххлтеллитных маркёров для хромосомы 10 крыш, построение болте подробной обшей генетической карты этой х|ючосомы и генетических карт для отдельных популяций, а также анализ локусов, несущих гены, регулирующие уровень кровяного давления у крысы, с помошыо генетического сцепления и путём конструирования конгенных линий.

Научная новизна. Найдено 89 уникальных микросателлитных повто|юв генома крысы и определена их нуклеогодная последовательность. Выявлено 34 новых маркёра хромосомы 10 крысы, из них 12 маркёров располагаются в районе между локусами Асе (ген превращающего ангиотензин фермента) и Nos2 (ген индуцибелыгой синтетазы окиси азота), предположительно содержащем геп(н). контролирующий^} уровень кровяного давления крыш. Построена генетическая карта хромосомы 10 крыш, имеющая длину 88.9 сМ и содержащая 64 маркёра. Полученная в ]>езультате :яой работы карта, на сегодняшний момент является наиболее точной и подробной картой хромосомы 10 крысы Rattus nor\-egicus. Проведённый анализ генешческош сцепления с использованием двух расщепляющихся популяций F2 позволил граничить район, наиболее вероятно

-3-

содержащий ген(ы), контролирующий(е) уровень систолического кровяного давления, 13 и 17,5 сантиморганидами, соответственна Путём переноса фрагментов хромосомы нормотензивной линии Milan Normotensive (MNS) в генетическое окружение гипертензивной инбредной линии Dahl Salt-Sensitive (S) получено 4 конгенных линии. Подтверждено существование локуса хромосомы 10 размером 31 сМ, содержащего ген(ы), контролирующий(е) уровень систолического кровяного давления крыш Ген индуцибельной синтетазы окиси азота (Nasi) исключен как возможный QTL«a хромосоме 10.

Практическая значимость. Выявленные маркёры, микросателлиты и карты могут быть использованы для генетических исследований других заболеваний, для которых различные инбредные линии Rattus norvegicus служат модельными системами. Сконструированные конгенные линии в совокупности с улучшенной генетической картой хромосомы 10, полученной в данной работе, позволяют начать конструирование субконгенных линий с целью более тонкого картирования генов, контролирующих кровяное давление. Структура работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов, Обсуждения, Выводов и Списка литературы; она изложена на 124 страницах, включает 11 рисунков и 8 таблиц. Список литературы содержит 104 источника.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 работ Материалы диссертации доложены на 16-ой научной конференции Международного Гипертонического общества (Глазго, Шотландия, 1996), на 50-ой ежегодной осенней научной конференции по гипертонии (Чикаго, США, 1996), на семинаре отдела физиологии и молекулярной медицины Медицинского колледжа штата Огайо, США (1997) и на семинаре лаборатории молекулярных основ канцерогенеза ИМБ РАН (1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение, скрининг и анализ геномных кпонотек

Для построения генетических карт удобно использовать в качестве маркёров микросателлиты (относительно короткие фрагменты ДНК, состоящие из тандемно повторяющихся моно-, ди-, три- и тетрануклеотидов). Преимущество использования таких повторов заключается в их частой встречаемости в геноме, в высокой степени полиморфизма и в том, что полиморфизм может быть быстро выявлен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Поскольку геном насыщен микросателлитными повторами, для их поиска обычно скринируют клонотеку геномной ДНК, фрашенгированную случайным образом в условиях, дающих короткие фрагменты (примерно 500 п.н.). Полученную смесь фрагментов клонируют в плазмилный вектор. При атом общее количество рекомбииантиых клонов может быть относительно небольшим. Такую клонотеку удобно скринировать с помощью олигонуклеотидных проб и быстро анализировать найденные клоны, что существенно при масштабном картировании генома.

-4-

Поскольку задача заключалась в нахождении микросателлитных маркёров хромосомы 10, необходимо было иметь хромосомо-спенифичную клонотеку. Амплифицированная ДНК хртмосомы 10 крысы была предоставлена доктором В. Hoebee (Голландия). Хромосомы 10 выделяли в виде индивидуальной фракции из первичной культуры фибробластов самца Wistar RIV: ТОХ двойной сортировкой в потоке. ДНК амплифицировали с использованием частично вырожденных олигонуклеотидов CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG (6-MW), содержащих ш 5' конце сайт узнавания для рестриктазы Xhol. Затем ДНК («амплифицировали и использовали в последующих опытах.

Реамплифицированную ДНК расщепляли Xhol и клонировали в Sail- сайг лифазмилного вектора pT7T3U18. Рекомбинантные плазмиды трансформировали в Е. coli штамм DH5«, и |ш:севали с плотностью 400-500 колоний на чашку Петри диаметром 90 мм. Клоны, содержащие плазмиды с микросателлитными повторами, отбирали гибридизацией со смесью Щ?- меченных олигонуклеотидов (СА)15 и (CT)]j. В результате скрининга отобран 121 клон, что составляет примерно 0,5% от общего количества анализированных клонов.

Несмотря на то, что теоретически ПЦР с частично вырожденными затравками должна давать равномерную амплификацию хромосомной ДНК, на практике разные участки генома амплифицируются с различной эффективностью (Hui et al., 1995). Это может приводить к преимущественной амплификации определенных участков хромосомы, и, как следствие, значительной доле клонов, содержащих плазмиды с идентичными вставками. Чтобы уменьшить количество секвенируемых вставок, была от[ибогана щюиедура отбора уникальных последовательностей ДНК.

Первичный анализ щхжодили следующим образом: у отобранных клонов вставку вышепляли из плазмидноп ДНК совместным действием (хзстриктаз Hindi 11 и Xbal по сайтам, находящимся в полилинкере вектора. Размер вставки определяли по её элект|юфорстической подвижности. Если две или больше плазмид содержали вставку одинакового размера или имели похожую физическую карту, секвенирова;ш вставку в одной ллазмиде из этой ipyimw. На основании полученной нуклеотидной последовательности выбирали затравки вокруг микросателлита и вое плазмиды этой группы анализировали с помощью ПЦР. lie™ какая-либо плазмида из группы при амплификации давала фрагмент той же длины, что и секвенированная контрольная плазмида, эту плазмиду далее не анализировали. ДНК оставшихся вставок частично или полностью секвенировали. Каждую последовательность сравнивали с полученными ранее. Определение нуклеотидной последовательности проводили модифицированным методом Слп'ера на двухцепочечной плазмидной ДНК с использованием SequiTherm Long-Read Cycle Sequencing Kit (Epicentre Technologies, USA) на автоматическом ДНК-ссквенаторс (модель 4000L, LI-COR, USA).

Из 121 отобранной плазмиды только 81 (67%) содержала уникальные вставки. Размер вегавки в полученных плазмидах варьирует от 100 н.н. до 1300 п.н. Около 90% плазмид содержат панику размером от 200 ilh. до ¡ООО н.н.

-5-

Более 80% вставок содержат (СА)де.2з-повггор, в отдельных случаях длина СА-повтора варьирует от 6 до 54 динуклеотидов. Около 12% вставок содержат (CT)i2-27 -повторы. Около 8% вставок содержат комбинированный (СА)п(ТА)т -или (СА)п(СТ)т -повтор. Около 10% вставок содержат больше одного микросателлита.

Из 81 уникальной вставки для 59 выбраны и синтезированы затравки для амплификации микросателлитного повтора, дающие продукт размером от 100 ан. до 400 П.Н. Выбор затравок проводили с использованием программы PrimerSelect из пакета программ Lasergene (DNASTAR Inc., USA). У оставшихся 22 вставок микросателлитный повтор расположен или слишком близко к сайту клонирования (<20 п.н.), или программа не могла выбрать затравок из-за особенностей нуклеотидной последовательности вокруг повтора. Перед выбором затравок последовательности ДНК 59 вставок сравнивали с известными последовательностями базы данных GenBank. Для большинства нуклеотидных последовательностей не найдено гомологов в GenBank. Некоторые проанализированные последовательности имеют разную степень сходства с последовательностями, имеющимися в GenBank. Последовательность ДНК маркёра D10Mcol7 имеет 95% гомологию с STS (sequence tagged site) генома человека (GenBank F00344). Эта последовательность может быть использована как STS генома крыт Процент сходства нуклеотидных последовательностей ДНК других вставок с последовательностями, находящимися в GenBank, существенно ниже. 13 вставок содержат последовательности, гомологичные LINE, В2 и ГО семействам повторяющихся элементов генома крысы В двух случаях удалось выбрать затравки вне района, содержащего такие повторы, в 11 случаях по крайней мере одна затравка находится в районе таких повторяющихся элементов.

Полученные затравки использовали для амплификации геномной ДНК крысы. Каждую пару затравок проверяли при разных температурах отжига (45, 50,55,60,65°С) для достижения максимальной специфичной амплификации. Амплификацию проводили в MJ Thermocycler (M.J. Research, USA). Продукт амплификации анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле. В 49 случаях (83%) получен продукт ожидаемого размера. Анализ последовательностей 10 вставок, выбранные затравки из которых не дали продукта амплификации, показал, что 6 из них гомологичны LINE, В2 и ГО семействам повторяющихся элементов генома крысы. В результате, из 11 случаев, когда хотя бы одну из пары затравок, выбирали внутри последовательностей повторяющихся элементов, в 6 случаях не получили ожидаемого продукта, в 2 сиучаях получили продукт-амплификации с большим несиецифическим фоном, и только в 3 случаях получили специфичный продукт амплификации. Эти результаты согласуются с данными, полученными для затравок, выбранных сходным образом для амплификации мик])осатоллитов генома крупного рогатого скота (Stone et al., 1995).

49 nap затравок, давших при амплификации геномной ДНК специфичный продукт, использовали для анализа полиморфизма в 6 инбредных линиях крысы. ПЦР с

-6-

использованием одной меченой затравки проводили на геномной ДНК, выделенной из особой линий Dahl Salt -Sensitive (SS/Jr), Dahl Salt -Resistant (SR/Jr), Lewis

(LEW), Wistar- Kyoto (WKY), Brown Norway (BN) и Milan Normontensive (MNS). П[юдукты реакции анализировали электрофорезом в 8% денатурирующем полиакриламидном геле с последующей радиоавтографией. Если размер фрагмента, полученного при амплификации ДНК особи линии S, сильно отличался от размера фрагментов, полученных при амплификации ДНК особей других линий, то в дальнейших опытах с этими затравками щхмукты амплификации анализировали в 4% агарозном геле. Во всех остальных случаях проводили ПЦР с одной меченой затравкой, и продукты анализировали в 8% денатурирующем полиакриламидном геле. Показано, что 35 (71,5%) микросателлитов полиморфны по крайней мерс в двух ипбредных линиях (табл. 1 ) и могут быть использованы в качестве новых маркёров генома крысы В последующих опытах использовали 34 маркёра, информативных в трёх исследуемых популяциях.

Для работы с новыми маркёрами, построения карт и анализа локусов, содержащих гены, регулирующие кровяное давление, использовали геномную ДНК, выделенную из печени самцов грех популяций крыс F2 (SxMNS), F2 (SxLEW) и F2 (SxBN), состоящих из 171,151 и 96 особей, соответственно. Эти расщепляющиеся популяции получены доктором I. Rapp следующим образом: особей поколения Fl, полученного в результате скрещивания самиов гипертензивпой линии S с самками нормотензивных линий MNS, LEW или BN, скрещивали между собой для получения большой популяции F2. Кровяное давление измерили у самцов .-mix популяций, содержавшихся на диете г. 8% NaCl. Ранее для популяций F2 (SxMNS) и F2 (SxLEW) показано, что аллели в некоторых маркерных локусах хромосомы 10ассоциирую!' с уровнем систолического давления. Использование популяции К (SxBN) обусловлено наибольшим количеством (61%) полученных для неё информативных маркё|юв.

Поскольку при работе с сортированными хромосомами всегда есть вероятность загрязнения другими хромосомами, каждый новый маркёр проверяли на генетическое сцепление с маркёрами, ранее локализованными на хромосоме 10 крысы. Анализ генетического сцепления проводили с использованием 30-40 особей определенной популяцииF2. В результате 28 маркёров локализовано на хромосоме 10, но одному маркёру локализовано на хромосомах 5,9,12 и 19 (табл. 1). Для двух маркёров локализация ешё не определена.

Получение новых маркёров между локусами Асе и Rosi

Участок хромосомы 10 размером около 30 г.М между локусами Асе (превращающий ангиочензим фермен т) и Nos2 (индуцибелшая синтетаза окиси азота) предположительно содержит ген(ы), контролирующий:) уровень кровяного давления у крысы. Для поиска новых информативных для популяций F2 (SxMNS) и V2 (SxLEW) маркёров и .»том районе использовали два подхода.

Во-первых, иснолизонали известный факт сингеничной гомологии

-7-

Таблица 1.

Новые маркёры хромосомы 10 крыш и новые микросателлиты, полученные при скринингах геномных клонотек

Шифр маркёра/ Структура затравочных Кодовый N в олигонуклеотидов

(ЗепВапк

Р10Мсо1 ТТвАССАСАСГССАСТАТС

1153217 ССТТСААСТТСетСТССТС

Б10Мсо2 САТСГСССАСАТСТТСТС

Ш3503 АТвТСС АССАААСАААС С

ШОМсоЗ ТСССТАТСАТСГССАААС

Ш3504 АСТСТАСТССАССТТТСв

ОЮМсо4 САСССТСАСААСАТССАС

и53349 ССАССТСАААССАТАСТС

Ш0Мсо5 ААТАСАСАСТССССАААСААТ

1153350 ТССААССТСАССТСААААТАСТ ЭММсоб АСТСАСТССАААСААСС

1153351 ССАТСАСГССТСТАТССС ОЮМсо7 АТТОЗТСССАТАТСССТОТСАТ

1153352 САССАТССАТССАССАСТТТСТ БЮМсов* САОЗЗААСААТТСАТССАСАС Ш3353 ААССАТСТСТССААСААСААСС Ш0Мсо9 СССТССААСТСССТТТАТй и53354 АССАССТССАСАТСТСССТТС БЮМсоМ САСАООТСАСАСОСХЗТТСС 453355 ТАТССССТТААТОТСТТСТТТС Ш0Мсо11 СССАСАТОААСАСТТАСАС и53356 ТСГТСТТААСССТТСАСС Ш0Мсо12 ССАССТАААСАТСТСССТСАА и53357 АСССАСАААААСАСбААСАТСТ Э10Мсо13* СТСАТСАТСССССТСАСАС Ш3358 ТССССАТТТАСАСТСАСАТАСАТ 1)10Мсо14 ААСТАТСТССТТССТАААТС

1153359 ТСТСТАТАСТСТСТАСТААСТО ОЮМсо15 ССТСССАТССССТАСТТА

1153360 СССАССССТАТАТССТСАСА ОЮМсо16 ССАТТССССТАСААСТСАСС

1153361 СААТССАСТССТТСТССТСТО Ш0Мсо17 ТТССОАССАССАТСАААСАСА 1153396 СТСССЛАСССССАСТАТСААТС Ш0Мсо18 СТССОТССССАСААСАСААСА Ш3397 АСТССАССТССААСССГСАСАСТ

Полиморфизм в линиях крысы

М№=ЬЕ\У>\УКУ=В№>8

S=BN>MNS>LEW=WKY

BN>S=LEW=MNS=WKY

LEW>WKY>MNS>S=R>BN

\УКУ=5>11=ШМ5>ЬЕ\У>ВН

WKY>MNS=LEW=BN>S=R

S=R=LEW>WKY>BN>MNS

BN>S=WKY>R=LEW=MNS

LEW=WKY>MNS>S=R=BN

S=R>LEW>MNS=WKY>BN

S=R=LEW=MNS=WKY>BN S=R=LEW=MNS=WKY>BN BN>MNS>S=R=LEW=WKY LEW=BN>S=R>MNS>WKY LEW>S=BN>R=MNS=WKY BN>S=R=WKY>LEW>MNS

Шифр маркёра/ Структура затравочных Полиморфизм в линиях

(Содовый N в олигонуклсотндов крысы

ОепВапк

010Мсо19* АССАСАСТСААСЗССАТТСТСТА BN>S=R=LEW=MNS=WKY

1153398 САТСАОТСТСССТСОСТСТТТТА

Ш0Мсо20 ТТСССТСССТСССТАТТТСТТТ 5=Н>ВГ4>ЬЕ\У=МК5>\УКУ

Ш3399 САТССАООСТТТТАОСАСАОТТС

ОЮМсо21 ТСТАСЗСААССТССТТАССАТСТ MNS>WKY>S=R>BN>LEW

и53400 САТССТАССССАСТТААСАААСТС

Ш0Мсо22 АССАТСТССОСАСТТТАСТТТС MNS>BN>S=R=LEW>WKY

и53401 ССТТС^ССТ.ЛССТСДСАСА

шом«»2з ССТбТСОвг^ТСТАСТТТСА

1153402 АТТТСАТССССАТАСТСТАСАС

М0Мсо24 ССТСССССТСАСССТСАСТАТС WKY>BN>LEW>MNS>S=R

И53403 ТССТвССАТССТССАССТТ

М0Мсо25 СТАСААСТСАААСАСААС S=R=LEW=MNS=WKY>BN

1153404 ТАТАТСАСАСТААТССТААС

Ш0Мсо26 АСАСАТТТТСССАТССТТТСАС S=R=LEW=MNS=WKY>BN

1153405 СТАССААТССАССССААСАС

П10Мсо27 ТССТССАСААААвАССТАСАС ВМ>Я=К=ЬЕ\У=МНЗ=\УКУ

Ш3406 АССАТССТСТТСТСАССТТАСТ

1)10Мсо28 ОТТСАТОТЕСАТТАТТСС

1153407 ССАССТАСТАСССТТААСС

05Мсо1 ТТССТАТТТСАСАСАССС

и54616 СССТТАСТССАСАААСТС

1)9Мсо1 АСОСТССТССТСТСАТТАТС LEW=WKY>BN=S=R>MNS

и53522 ААСССТССТСТССТТСТТТТ

В12Мсо1 САСбСТАТССААТТСТТТСТСТ 8=К> В N > ЬI :ЛV=М N 8=V/ К У

и53525 ОТОАСТСАТТТСССТСТСТСС

П19Мсо1 ССАСТТААСАТТАТАТССАСТС

Ш3524 ТТСАСААТССТССТАААСТ

Б0Мсо5 АСААТТСАСАСТТССАСС 5=^=ЕЕ\У=М^=\УКУ=ВН

и53909 АСТббСААСТСТАСССГС

БОМсоб ТССААТСТООТСССАСТС S=R=LEW=MNS=WKY=BN

Ш3910 ТОТССТССААССАТТААС

П0Мсо7 ААТССТААТТААСАСАССАС S=R=LEW=MNS=WKY=BN

и53911 АССГССАССТТАСАТАСС

ООМсо8 СТАСАОТССАСССАААТО

1153912 ССТССТСТТССТСТТСАС

Г)0Мсо9 САТТСТСАТТСТСАССАСАТОС S=R=LEW=MNS=WKY=BN

1153913 АСАСАССАССААТААТССТТСС

ЭОМсоЮ СТССТТСТТСАСССТТТТСАСО

1153914 АТСАТССАТСГТСГСТСАСС -9-

Шифр маркёра/ Структура затравочных Полиморфизм в линиях

Кодовый N в олигонуклеотидов крысы

GenBank

DOMcoll GAGAAGTCCTCTGAGAGTTTGG

U53915 CTAAGCTCTCCTTTAGTCCTGG

D0Mcol2 TGGGAATTGAACTCAGAACCTT

U53916 ATGGATGGAACTAGAAAATACC

D0Mcol3 CACAAGCCCTAAATTAAGTG

U53917 ATCAGTCTGCCACATCTG

D0Mcol4 TGTACTGAGCCATCTTCTTAGC

U54500 GAGTTGAGGTCCATTCTGTAGG

DOMcolS GCTCCCTCAAGTCATTCTGTCAAG

U53918 GTGGCAATCAATAAGCAAATGGA

D0Mcol6 ACCTGAATGAAGCCTGTC

U53919 ACTCGAGTCCTGAATGTG

D0Mcol7 GAGGTGGGTGATGTGGTA

U53920 AAGTGAGGGTTTTTGAGTGA

D0Mcol8** GCAGTGGGCTCAATG

U53521 TGGTACTTTTCACTGGTTT

D0Mco20** AGTGATTCATGTGGTGGCTGTT

U53523 GACTTCTCGCCAACTCAGAGTG

D0MCO22 CGAGGTTCCAATGTGTCC

U54501 CGGGCGGCAATGTGGTA

D0Mco23 CGAGCCTACACAGAGAACTAC

U54502 CGATCGAGACCTAAATGTG

S=R=LEW=MNS=WKY=BN S=R=LEW=MNS=WKY=BN S=R=LEW=MNS=WKY=BN S=R=LEW=MNS=BN>WKY S=R=LEW=MNS=WKY=BN S=R=LEW=MNS=WKY=BN S=R=LEW=MNS=WKY=BN MNS>BN>LEW>S=R=WKY MNS=WKY=BN>S=R=LEW S=R=LEW=MNS=WKY=BN S=R=LEW=MNS=WKY=BN

* Для выявления полиморфизма в этих случаях ПЦР проводили с мечеными праймерами (прямой для Б10Мсо8 и обратный для Б10Мсо13и ОЮМсо19) и полученные фрагменты расщепляли НИа 1, Вга 1 и ЕсоШ, соответственно.

** Генетического сцепления с хромосомой 10 не обнаружено.

хромосомы 10 крыш и хромосомы 11 мыши. Показано, что 5-10% маркёров генома мыши могут быть использованы в качестве маркёров генома крыш, и наоборот. Поскольку генетическая карта мыши намного подробнее генетической карты крысы, были выбраны и тестированы 26 маркёров между локусами Асе и Nos2 хромосомы 11 мыши. Три пары затравок дали специфичные продукты при амплификации ДНК крысы. Маркёр D10MllMit221 оказался полиморфным в линиях S, MNS и LEW, маркёр D10MllMit222 - только в линиях S и LEW. Третий маркёр не полиморфен в анализированных линиях. Оба полиморфных маркёра локализованы на хромосоме 10 крысы между локусами Асе и Nos2 (рис 2 иЗ).

Второй подход использует "прогулку" от известной иуклтотидной последовательности. Для этого применяли GenomeWalker Kit для крысы (Clontech Laboratories, USA; Sicbert et al., 1995). Кит состоит из геномной Д1ПС, расщеплённой по отдельности |)естриктазами £c«RV, Sea 1, Dra 1, Pvu 11 и Si/H, лигировшшой после этого со стандартными адаптерами, и двух затравок, комплементарных стандартному адаптер;,, одну из которых используют в первой ГТЦР, а вторую - в ПЦР с внутренними затравками. Приготовленная таким образом ДНК будет далее условно называться "библиотекой". Для проведения "прогулки" проводят ПЦР в условиях получения максимально длинного продукта с использованием одной специфичной затравки и второй затравки, комплементарной внешней части стандартного адаптера. После первой ПЦР проводят вторую ПЦР с использованием внутренней пары затравок (специфичной и комплементарной стандартному адаптеру). Специфичные затравки имеют длину 25-35 п.н. и G/C состав 40-60%. В зависимости от расположения ресгриктных сайтов на прилегающем участке хромосомы, каждый "шаг" может достигать 4-6 т.п.н. Для проведения такой "прогулки" достаточно знать только короткую нуклеотщную последовательность для выбора затравок.

Новые маркёры искали в двух районах: между маркёрами D10MllMit221 и D10Wox6, расстояние между которыми на генетической карте популяции F2 (SxMNS) около 8,2 сМ; и между маркёрами D10Mco31(Wg/>-) и D10Mco8, расстояние между которыми на генетической карте популяции F2 (SxMNS) около 7,9 сМ. Для этого проводили "прогулки" от маркеров D10Mcol2, D10Mgh5,D10Mghl5 и D10MllMii222. В зависимости от маркёра длина известной нуклеотидной последовательности варьирует от 100 п.н. до 350 п.н. (рис 1).

Первую пару специфичных затравок выбрали из последовательности вокруг микросателлита D10Mcol2. Этот маркёр полиморфен в линиях SuBN, но не полиморфен в линиях S, MNS и LEW. Для облегчения последующею анализа затравки выбирали таким образом, чтобы получаемый продукт амплификации не включал известный микросателлит. Полученные продукты амплификации анализировали методом блот-габридизации со смесью Замеченных (СА)]з и (СТ)[5 олигонуклеотщов. Наименьший фрагмент, давший положительный сигнал гибридизации (|шмер 1,6 т.п.н.), клонировали с использованием ТА Cloning Kit (Invitrogen, Inc., USA) и определили его полную нуклеотидную последовательность (GenBank U53908). Обнаруженный в этом фрагаенте (СА)^ микросателлитный повтор оказался полиморфным в линиях S и MNS, S и LEW. Этот маркёр D10Mco30 (табл. 2) локализовали в районе D10M1 LMit221 - DlOWox.6 на карлах популяций 1;2 (SxMNS) и F2 (SxLEW) (рис. 2).

Для получения маркёров, полиморфных п линиях S и MNS. в районе D10Mco31- DIOMcoS проводили "прогулки" от маркёров DIOMghS, DIOMghlS и D10M1 !Mit222, полиморфных to.ilko в лилиях Sii LEW.

В качестве первою маркёра, от которого проводили "прогулки"

-11-

А.

ССАТССАССТАААСАТСТСССТСААСССССТСТСТТТТАААСАТАТТТТТСТТСТТТТСТ ТААСССТСССТОТСАСТССТСТТТТАТТТТАААААСАТТТТАССАСТТТСТСТСТТАААТ СТТТТТАТТАССТТТТСДДТСТСТССТСТТСТСТТДДДССДДТСТТТТАСДСтеТ0Т<зте ТСТОТОТОТОТвТОТСТвТОТОТОТОТОТОТТССАСАСААССТССТСССАСАТСТАСССТ ГАПСТАСАТСТТССТСТТТТТСТаГСТТСТГ,РАТСАПАССТГАТСАПАТОСТОААПААГ,С АСТОТТСССОССССССССТСТСООААСТТТТКТСАСССТСАСТТСТССА

Б.

ГПТПТПГТСТПГССТПТСПРАППТАТАПАСТАРАГАТС^ПТППГААППАОЯСАППАПАПС СТаААОАААААСАССТТТАГ,АТСАаГ:АПОС!ГАС;АССТСЙАПГ;ТС:ТГ;Г;АОТТГ:ТАСАСАСА САСАСАСАСАСАСАССАТАСАССТССССАСАААСАААСАТАТАТССАСАСАСАССААСАТ АССААТССАСАТАССАССАСАСАСССАТСААСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАС АСААТСТССААСАСАТАТАПАСАСАТАаААПСТТТААЙЙСТАОАТСтАААТААСТТАТТ СТСТССТСв

а

ТТГТАПАПТЯГГА^ГОССГТСТТПАЙЯАТТГТТСОАОААТТаСАСТТСТСОТетЮТОТд

татствтетвтвтототвтотототствтстстстотвтстствтототтстстссттсс

АССТСТОТТСС

г.

ПСГГОАПААтТСТТТСТТАТПТАТТАТТАТТАТТСТССЙТСТСТОТОТетОТеТСТОТО ТСТСТВССТСТТССТОТСТСТОСССАССССАСТССАСАСТТСА

Рисунок 1. Известные нуклеотидные последовательности вокруг микросателлитов: (А) 010Мсо12, (Б) Ш01^Ь5, (В) БШМНМ^гг и (Г) ОЮМ^15. Подчёркнуты последовательности, использованные для синтеза первой и второй (внутренней) затравок для "прогулки". Некоторые последовательность использовали для синтеза затравок для "прогулок" в двух направлениях. Повторы выделены жирным шрифтом.

использовали маркёр БЮК^Ъб. В результате трёх "прогулок" (одной в одном направлении и двух последовательных в другом направлении) получили в клонированном виде участок хромосомы размером около 4,7 т.п.н. Амплифицированные фрапиенгы анализировали методом блот-гибридизации со смесью 32Р-меченных (СА)15, (СТ)15, (АААО)10, (АААС)10, (АААТ)10, (АОС)10, (ДАОС)]о и (А)^ олигонуклеотидов. Фрагменты, давшие положительный сигнал гибридизации, частично или полностью секвенировали. Анализ полученных микросателлитных повторов (СА)17 (ОЮМсо29), (СА)7 (ОЮМсо32) и С(ТТТ)п(ССТТ)з (БЮМсоЗЗ) показал, что они не полиморфны в линиях 8 и МШ(табл. 2). Маркёр ВШМсоЗЗ локализовали в районе В1 ОМсоЗ 1 - Ш0Мсо8 на карте популяции ¥2 (БхЬЕМО (рис. 2).

После этого определили полную нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента 4,7 тлн. для ДНК крыс линии 8 и линии ЛШЭ в надежде обнаружения единичных нуклеотидных замен (ОепВапк и77632). Наш

Таблица 2.

Маркёры хромосомы 10 крысы, полученные в результате "щюгулки" от известной нуклеотидной последовательности

Шифр маркёр/ Структура затравочных Полиморфизм в линиях

Кодопый N олигонуклеотщш крысы в ОепЬапк

Щ0Мсо29 АССССССОЗйСТССТСТС 8^=ВМ=ЬЕ\У=М№=\УКУ

и77б32 ССТСАССТССССОАССТАСТАТСО

ШОМсоЗО АССАТТТТСТОТСССТТСТСТСАС 3=Н=ВК>1.Е\У=МЬ'3=\УКУ

Ц53908 Т(}6ТТТАССТАССТСТСССАТСТ6

Ш0МСО32 САССССТСССОТТАСТАСТСАС S=R=B№=LEW=MNS=WKY

1177632 ССАССССССАОТТТСАСАО

ИЮМсоЗЗ ССАТАСТАССТСССССАССТСАСС ЬЕ\У>8=К=ВН=МК8=\УКЛГ

1177632 СССАСАТССАТОАСАСАСТТ

Ш0Мсо34 СССССАСССАСАТАСГТТТА LEW>S=R=BN=MNS=WKY

Ш7633 САСТССТТТССТОТССТСТТСА

ШОМсоЗа * СЮСССССАСТАСАССТСАСААСС MNS=R=BN>S=WKY=LEW

1177634 АТСЗОСОССССССААТСАС

ШОМсоЗб вСААСАССССТСАСССТАС WKY>S=LEW>MNS=R=BN

1377635 СТССАААТААССССАСАСГТС

ОЮМсо37 ССС,ССАС,САССАССА6Т S=R=BN=LEW=MNS=WKY

и77636 ТСААТТСААТСССАССААСС

* Для выявления полиморфизма в этом случае ПЦР проводи;«! с меченым обратным нраймером, и полученный продукт расщепляли Ava\\.

предыдущий опыт позволял ожидать присутствия по крайней мере одной нуклеотидной замены во фрагаенте такого размера. В секвенированных фрагментах этих линий не обнаружено ни одной нуклеотидной замены.

Следующие "прогулки" провели от маркёров и ОЮМ1ШН222.

В результате "прогулки" в одном направлении от маркёра В10\^Ы5 получили фрагмент около 1 т.н.н. Две "прогулки" в противоположных направлениях, от маркёра Ш0М11Мк222 позволили клонировать участок хромосомы размером около 7 т.п.н. Анализ фрагментов проводили так же, как при "прогулках" от маркёра В10М§Ь5. Фрашенты, давшие положительный сигнал гибридизации, частично или полностью секвенировали (ОспВапк 1177633,1177634,1177635, 1177636). И.? микросателпптов - (Д)12(ЛААОО)4 (В10Мсо34), (Т)25С(Т)3 р!0Мсо35), (СЛ)20 (ОЮМсоЗб) и (С'ПТ)21.0аТТ)3 (ШОМсо37)два (ОЮМсо35 и ИЮМсоЗб) оказались полимо|)фными в линиях Б и МЫв (табл. 2). Для последующих опытов использовали маркёр ОЮМсоЗб, который локализован на

карте популяции F2 (SxMNS) в районе D10Mco31(Afe/"r) -D10Mco8, на расстоянии 0,9 gM от локуса Ngfr(pnc. 2). Маркёр D10Mco34, полиморфный в линиях S и LEW, локализовали в районе D10Mco31-D10Mco8 на карте популяции F2 (SxLEW) (рис 2).

Анализ полиморфизма известных маркёров хромосомы 10. Построение генетических карт

Для получения генетических карт популяций F2 (SxMNS), F2 (SxLEW), F2 (SxBN) и их комбинированной карты, каждый маркёр использовали для анализа всех особей популяции. Для построения карт использовали программу МАРМА KER/EXP. Маркёры, локализованные на генетической карте хромосомы 10 для популяции F2 (SxMNS) ранее, опубликованы в работе Deng and Rapp (1995).Маркёр D10Mco31 (Ngfr) получен доктором A.Deng.

Двадцать восемь маркёров, полученных в результате скрининга геномных клонотек, составляют основу построенных для всех трех популяций карт. Расстояние между двумя наиболее удаленными маркёрами (на комбинированной карте) около 85 сантиморганиа (сМ). Распределение маркёров по хромосоме оказалось неравномерным. Так в районе размером около 2,5 сМ между маркёрами D10Mcol4 и D10Mco4 локализовано 10 новых маркёров, тогда как в районе размером около 16сМ между маркёрами D10Mco8 и D10Mcol2 не получили ни одного маркёра. Это может быть связано как с неравномерным распределением микросателлитов вдоль хромосомы, так и с неравномерной амплификацией хромосомной ДНК, использованной для приготовления клонотеки.

Для локализации дополнительных маркёров в определённых районах хромосомы 10 на картах для популяций F2 (SxMNS), F2 (SxLEW) анализировали полиморфизм в ранее опубликованных маркёрах этой хромосомы Обнаружено 15 маркёров, которые оказались полиморфными у линий S и MNS, S и LEW, или у S и обеих линий. Эти маркёры также использованы для построения генетических карг хромосомы 10 для популяций F2 (SxMNS), F2 (SxLEW).

Полученные генетические карты популяций F2 (SxMNS), F2 (SxLEW), F2 (SxBN) и их комбинированная карта показаны на рисунках 2 и 3. Наиболее подробная генетическая карта популяции F2 (SxMNS) имеет размер 82,4 сМ и содержит наибольшее количество маркёров - 48. Генетическая карта популяции F2 (SxLEW) имеет размер 88,4 сМ и содержит 26 маркёров. Генетическая карта популяции F2 (SxBN) имеет размер 86,6 сМ и содержит 18 маркёров. Карта популяции F2 (SxBN) наименее подробна, поскольку после построения предварительной карты, эту популяцию использовали только для локализации маркёров, не полиморфных в линиях S, MNS и LEW. Комбинированная карга покрывает 88,9 сМ и содержит 64 маркёра. Из них, 6 локализованы на картах всех трёх популяций, 16- но крайней мере на двух. 10 маркёров находятся в локусах известных генов, 54 маркёра представляют собой анонимные последовательности. Среднее расстояние между маркёрами на комбинированной карте составляет 1,4 сМ. Максимальное расстояние между соседними маркёрами

-14-

ОЮМсоЮ - -

ОЮМсоЮ - -

ОЮМсо27 ОЮМсоИ

ОЮМсо26 _ Ш0Мсо25 -Н1

ГМОМсо!«)- -

ОЮМсо4— 0ЮМсо13

ОЮ Мео14

Эуьг -1. ЭЮМИММб " -

Г)10Мсо28 ОЮМеоЗ'

ЭЮМиб . ОЮМсо2

ОЮМ11МН175 - -010МвЫ01

Оттб IX

010М10 010Мсо22 ОЮМсо24 Э10Мсо23 О10Мсо18 Э10Мсо21 010Мсо20 ЭЮМсоП ОЮМПМ>(28

вуьг

О10Мсо9

шомиз'

АМос томсо1б;

0\1>МсоГ

томпмиц?'

Ш0МПМИ221 ' ОЮМсоЗО'"

БЮМсоЛ

ПЮМсоЗб '

010Мсо8 Асе!

010М11МК58|

ОЮМсо 15" ОЮМсо7~ ММ 023».

ОЮМсоб -ОЮМ11М1С168 -Ш0\Уох7 ~

ОЮМсоЮ" "

О гт 6 Р10Мсо4

ВДАСЯШЬ ОЮМИМШ I

ШОМПМиПО ПЮМсоЗО

ОЮУ/охбч. ШОМсоЗ! О^^й-) ^^^ СЮМеЬ5 I П10МПМИ222 ОЮМсоЗЗ I

оюм&ыз!

тОМсо34

томим«5в ОЮМсо15

ОЮМсоб

О! ом им и| 68

Р2 (БхВМ)

N -96

Р2 (БхМ^)

N -- 171

Б2 (ЕхЬЕЧ^ N - 151

Рисунок 2. Генетические каргы хромосомы 10 крысы для трёх популяций. Расстояния даны и санттюргашшх.

О\0Мсо2

ОЮМсо21

№1023 ОЮМсоб -ОЮМПМШб! -

[)|0№ох7 ■

Рисунок 3. Комбинированная генетическая карта хромосомы 10 крысы для популяций ¥2 (БхВИ), Г2 (БхМКБ) и Р2 (SxLEW). Расстояния даны в сантиморганидах.

- 6,8 сМ.

Использование больших популяций позволило локализовать маркёры, расстояние между которыми на генетической карте меньше одной саптиморганиды. Порядок маркёров, указанный на картах, представляет собой наиболее вероятный порядок их расположения, определённый программой M АРМ AKER/EXP. Во всех случаях, когда позиции маркёров на генетической карте различаются, в популяции была обнаружена по крайней мере одна особь с кроссинговером между ними Правильность расположения маркёров на генетической карте популяции F2 (SxMNS) была подтверждена при анализе особой возвратных популяций в процессе конструирования конгснных линий (см. ниже).

Между локусами Асе и Nos2 на комбинированной карте хромосомы 10 локализовано 16 дополнительных маркёров, что значительно улучшило карту этого района (рис. 3). Из них 4 маркёра известны (DIOWoxö, D10Arb305, D10Mghl5,D10Mgh5), 12 получены в данной работе. Из новых - 6 маркёров (DIOMcol, D10Mco3, D10Mco8, D10Mcol2, D10Mcol6, D10Mco28) получены при скринингах геномных клонотек, 2 маркёра (D10MllMit221,D10MllMit222) -крысиные гомологи маркёров генома мыши и 4 маркёра (ШОМсоЗО, D10Mcc33, D10Mco34, D10Mco36) получены при проведении "прогулок" от известной нуклеотидной последовательности.

Наиболее подробные генетические карты хромосомы 10, опубликованные ранее, содержат 26 (Jacob et al. 1995) или 30 (Pravenec et al., 1996) маркёров. Эти карты построены для популяции, состоящей всего из 46 особей (Jacob et al, 1995), mu лля 36 рекомбинантных инбрелных линий (Pravenec et al., 1996), что существенно меньше разме|юн популяции, использованных в данной работе.

Уровень кровяного давлении ведёт себя как количественный признак, то есть гетерогенная популяция состоит из особей, кровяное давление которых варьирует в широких пределах. В случае качественного признака гетерогенная популяция состоит из особей, имеющих ограниченный набор дискретных неперекрывающихся фенотипов. Участки хромосомы, содержащие ген или гены, влияющие на количественный признак, называются локусами количественного признака и далее в тексте будут называться QTL (quantitative trait loci).

Одним из основных методов исследования индивидуальных QTL с использованием модельных животных служит анализ генетического сцепления у расщепляющихся популяций. В расщепляющихся популяциях аллели маркерных локусов, являющиеся QTL или тесно сцепленные с ними, генетически коррелируют с повышенным уровнем к|юннного давления в случае "плюс" аллели. Маркёры, не сцепленные с QTL (расположенные на другой хромосоме или па большом расстоянии от QTL), распределяются в таких популяциях независимо от QTL. и статистически достоверной кор|>елщии такого аллели с уровнем

-17-

кровяного давления не наблюдается. Для оценки сцепления заданного маркёра с локусом, контролирующим признак, используют величины LOD и Р. Значение LOD представляет собой десятичный логарифм соотношения вероятностей при гипотезе о существующем сцеплении и при гипотезе об отсутствии сцепления. Р-вероятносгь получения данного значения для сцепления в результате статистической флуктуации (гипотеза об отсутствии сцепления).

Анализ 14 маркерных локусов в популяции F2 (SxMNS), проведённый Deng and Rapp (1995), выявил район размером около 67 сМ достоверно шепленный с QTL (LOD > 3,3). Максимальное значение для сцепления получили в локуое индуцибельной синтетазы окиси азота (Nos2) (LOD=6,4). На основании этих данных и данных анализа популяции F2 (SxWKY) выдвинули гипотезу о возможной роли гена Nos2 в регуляции уровня кровяного давления и о присутствии на хромосоме 10 двух близко расположенных локусов, влияющих на уровень кровяного давления; первого - в районе гена превращающего ангиотензин фермента (Асе) (LOD=4,8), и второго - в районе гена индуцибельной синтетазы окиси азота (Nos2).

Вое маркёры, локализованные на генетических картах популяций F2 (SxMNS) и F2 (SxLEW) (48 и 26 маркёров, соответственно) проверили на их генетическую корреляцию с уровнем кровяного давления. Для оценки достоверности сцепления маркёра с локусом, контролирующим признак, использовали критерии, предложенные Lander и Kruglyak(1995), которые предлагают применять термины "достоверное сцепление" (вероятность получения ложного QTL-5%, что соответствует LOD=3,3 и Р= 1,0x10^) и "возможное сцепление" (приблизительно один ложный QTL на каждое геномное сканирование, что соответствует LOD=I,9 и Р=3,4х10"3). Анализ QTLпроводили с использованием программы MAPMAKER/QTL Анализ вариаций по одному параметру (one-way ANOVA) для сравнения кровяного давления особей с разными генотипами проводили с использованием программы SPSS (SPSS, USA).

Максимальная разница кровяного давления между особями, гомозиготными по S аллелю и гомозиготными по MNS аллелю составляет около 23 мм рт. столба. Данные анализа QTL для популяшш F2 (SxMNS) показаны на рисунке 4а. Для этой популяции достоверное сцепление с QTL, контролирующим уровень систолического давления (LOD>3,3), получено в районе между маркёрами D10Wox7-D10MllMitl75 (размер около 65 сМ). В районе между маркёрами Асе -D10MU3, не включая сам локус Асе (размер района около 38 сМ), значение LOD находится между 5,0 и 7,5, что означает высокую достоверность. Исходя из максимальных значений LOD=7,5 +/-1 для сцепления с локусом, контролирующим уровень систолического давления, наиболее вероятно, что QTL находится в районе между маркёрами D10Mco8-D10MllMit221. Размер этого района около 17,5 сМ и он не включает локусов Асе и Nosl.

Максимальная разница кровяного давления между особями, гомозиготными по S аллелю и гомозиготными по LEW аллелю составляет 37 мм рт. столба. Данные анализа QTL для популяции F2 (SxLEW) показаны на рисунке 46. Для

-18-

Рисунок 4. Локализация QTL, влияющего на у[ювень систолического давления, с использованием популяции F2 (SxMNS) (а) и популяции F2 (SxLEW) (о). Пунктирной линией отмечено значение LOD=3,3.

-19-

этой популяции достоверное сцепление (LOD>3,3) получено в районе размером около 25 сМ между маркёрами D10MllMit58-№«2 (по генетической карте маркёр D10MllMit58 тесно сцеплен с локусом Асе), не включая ни один из этих маркёров. Исходя из максимальных значений LOD=5,9 +/-1 для сцепления с локусом, контролирующим уровень кровяного давления, вероятно, что QTL находится в районе между маркёрами D10Mghl5 -D10Mco30(He включая сам маркёр D10Mco30), размером около 13 сМ.

Несмотря на то, что при использовании двух популяций размер районов, достоверно содержащих QTL различается больше чем в два раза, районы, максимально вероятно несущие QTL практически совпадают. Ранее двумя группами, в результате геномного сканирования другой популяции, независимо показано присутствие QTL приблизительно в том же районе (Jacob et ai, 1991; Hilbert et al, 1991). Все эти данные подтверждают результаты по полученному сцеплению.

Получение конгенных линий дпя хромосомы 10

Для подтверждения присутствия QTL в данном районе и его тонкого картирования необходимо получение конгенных и субконгешшх линий. Генетически, конгенная линия отличается от реципиентной инбредной линии только участком хромосомы, перенесённым серией последовательных возвратных скрещиваний из донорной линии. На первом этапе конструирования конгенных линий из одной линии в другую переносят большие фрагменты хромосомы, а затем, для линий, содержащих QTL, получают серию субконгешшх линий (Rapp and Deng, 1995). Необходимость перенесения больших фрагментов хромосомы на первом этапе связана с недостаточной точностью локализации QTL программой MAPMAKER/QTL (Rapp, персональное сообщение).

Конгенные линии для хромосомы 10 получены путём переноса участков хромосомы нормотензивной линии MNS (содержат "минус" аллели на основании анализа генетического сцепления) в генетическое окружение гипертензивной линии S. Конгенные линии получены совместно с доктором J. Rapp и при технической помощи членов его лаборатории по схеме, описанной ранее (Rapp and Deng, 1995). Поскольку проведённый анализ генетического сцепления с использованием популяции F2 (SxMNS) выявил широкий район достоверно генетически коррелирующий с уровнем кровяного давления, в первом раунде получения конгенных линий переносили большие фрагменты хромосомы линии MNS, чтобы гарантированно перенести локуй(ы), содержащий(е) гены, влияющие на кровяное давление. Всего получено 4 линии: S.M (10а), S.M (10b), S.M (10с) и S.M (lOd) (рис 5). Линия S.M(lOd) сконструирована специально для проверки гипотезы о возможном участии гена Nos2 в системе, регулирующей уровень кровяного давления у крысы. Данные сравнения кровяного давления особей конгенных линий с контрольными особями линии S показаны в таблице 3. Из этих данных видно, что искомый QTL содержат конгенные линии S.M(lOa) и S.M( 10b). Кровяное давление особей этих линий значительно снижено (на 42+/-

-20-

-35 -42

Рисунок 5. Схематическая генетическая ка|гга хромосомы 10 крысы для популяции Р2 (БхЛШЗ) и четыре конгешше линии: Б.М (10а), Б.М (10Ь), 5.М (Юс) и Б.М (10с1). Для каждой конгенной линии жирной линией обозначен участок хромосомы, перенесённый из линии МЫБ в генетическое окружение линии Э. Тонкие линии на концах перенесённых фрагаентов обозначают районы, в которых произошёл кроссинговер. График в нижней части рисунка показывает разницу кровяного давления (в мм рт. столба) у особей конгеной линии и у особей контрольной линии Б.

4,3 мм рт. столба и 35+/-4.5 мм рт. столба, соответственно) (Р < 0,0001) по сравнению с контрольными особями линии Б. Полученная разница для кровяного давления коррелирует с уменьшением относительного веса сердца особей этих линий (Р < 0,0001) по сравнению с контрольными особями линии Б. Изменение

Таблица 3.

Сравнение величин кровяного давления и относительного веса сердца особей конгенных линий, несущих замещённые участки хромосомы 10 из линии в генетическом окружении линии 8, и особей линии Э

Кровяное давление Относительный количество

(в мм ртутного столба) вес сердца особей в

(вес сердца/вес эксперименте особи, мг/г) Эксперимент 1

S 217 +/- 4,0 4,3+/-0,061 18

S.M(lOa) 175 +/-1,7 3,80+/-0,034 20

S.M(10b) 182 +/- 2,2 3,84+/-0,043 20

One-Way ANOVA <0,0001 <0,0001

S и S.M(lOa) <0,0001 <0,0005

S и S.M(10b) <0,0001 <0,0005

S.M(lOa) и S.M(10b) >0,05 >0,05

Эксперимент 2

S 205 +/- 2,9 3,95+/-0,054 20

S.M(lOc) 214 +/- 3,6 4,06 +/- 0,048 20

г-тесг 0,016 >0,05

Эксперимент 3

S 205 +/- 2,6 4,06+/-0,043 41

S.M(10d) 210+/-2,7 4,09+/-0,039 38

/-тест >0,05 >0,05

Для кровяного давления приведены средние значения (мм. рт. столба) плюс/минус стандартная ошибка. В эксперименте 1 вероятности получены с использованием теста на анализ вариаций с одним параметром (One-Way ANOVA). Вероятности получены при сравнении трёх линий одновременно и попарно. В экспериментах 2 и 3 вероятности получены с использованием t-теста. Р> 0,05 статистически недостоверна.

давления этих линий получено в ожидаемом направлениии, так как переносили "минус" аллель нормотензивной линии MNS в генетическое окружение гипертензивной линии S. У особей конгенных линий S.M(10c) и S.M(lOd) систолическое давление незначительно повышено (9+/-4,7 (Р=0,016) и 5+/-3.7 (Р>0,05), соответственно) по сравнению с особами линии S. Наблюдаемая разница (статистически недостоверная в случае линии S.M(lOd)) не сопровождается достоверными изменениями в относительном весе сердца. На основании этих данных ген индуцибельной синтетазы окиси азота (Nos!) исключен как

возможный QTLua хромосоме 10. Кроме того, показано, что фрагмент хромосомы между маркёрам» DIOMcol и DIOMcolO не несёт QTL, влияющий на понижение уровня кровяного давления у крыс линии MNS по сравнению с линией S.

Таким образом, на хромосоме 10 нами локализован QTL, влияющий на кровяное давление, в районе размером 31 аМ между маркёрами D10Mco6 и DIOMcol. Один из известных генов-кандидатов (ген превращающего ангиотензин фермента. Лее) находится в этом районе, что согласуется с предположением о его потенциальном участии в системе регулирования кровяного давления. Однако, этот район не включает гена индуцибелыюй синтетазы окиси азота (Nos2), что исключает этот ген из возможных кандидатов. Для последующего более тонкого картирования QTL на хромосоме 10 необходимо получение субконгешшх линий.

ВЫВОДЫ

1.В результате скрининга геномных клонотек хромосомы 10 крысы и "прогулок" от известных районов найдено 89 уникальных микросателлитных повторов и определена их нуклеотидная последовательность.

2. Обнаружено 34 новых маркёра хромосомы 10 крысы. Из них 12 маркёров находятся в районе между локусами Асе (ген превращающего ангиотензин фермента) и Nos2 (ген индуцибельной синтетазы окиси азота), предположительно содержащем ген(ы), контролируюший(е) уровень кровяного давления крысы.

3. С использованием трёх популяций F2, состоящих из 418 особей, построена генетическая карта хромосомы 10 крысы, имеющая длину 88,9 сМ и содержащая 64 маркёра. Среднее расстояние между маркёрами составляет 1,4 сМ.

4. Анализ генетического сцепления с использованием популяции 1-2 (SxMNS) показал, что участок хромосомы размером около 17,5 сМ, ограниченный маркёрами DIOMcoS-DIOMI lMit221, вероятно содержи! доку; количественного признака (QTL), контролирующий уровень систолического давления. С использованием популяции F2 (SxLEW) этот QTL локализован в ¡шюне размером около 13 сМ между маркёрами DlOMghlS -D10Mco30.

5. Путём переноса фрагментов хромосомы линии MNS в ^нстичслсое окружение линии S получено 4 кош енных линии - S.M (10а), S.M (10b), S.M (Юс) и S.M UOd). Подтверждено присутствие QTL па хромосоме 10 в районе, ограниченном маркёрами DIOMcol и ШОМсоб. Ген индуцибельной синтетазы окиси азота (Nos!) исключен как возможный QTLua хромосоме 10.

Список цитированной в автореферате литературы

Dib, С. et al. Nature 380,152-154 (1996).

Dietrich, W. F. et al. Nature 380,149-152 (1996).

Jacob, H. J. et al. Nature Genet. 9, 63-69 (1995).

Pravenec, M. et al. Mamm. Genome 7,117-127 (1996).

Schork, N. J. et al. Hypertension 28,1104-1111 (1996).

Jacob, H. J. et al. Cell 67,213-224 (1991).

Hilbert, P. et al. Nature 353,521-529 (1991).

Deng, У. and Rapp, J. P. Nature Genet. 1, 267-272 (1992).

Deng, A. Y. and Rapp, J. P. J. Clin. Invest. 95,2170-2177 (1995).

Hui, S. M. Genomics 26,364-371 (1995).

Stone, R. T. et al. Mamm. Genome 6,714-724 (1995).

Siebert, P. D. et al. Nucl. Acids Res. 23,1087-1088 (1995).

Lander, E. and Kiuglyak, L. Nature Genet. 11,241-247 (1995).

Rapp, J. P. and Deng, A. Y. Hypertension 25,1121-1128 (1995).

Спитк работ, опубликованных по теме лиспдтгяпии 1. O.I. Dukhanina, H. Dene, A.Y. Deng, C.R. Choi, B. Hoebee and J.P. Rapp. 1997. Linkage Map and Congenic Strains to Localize Blood Pressure QTL on Rat Chromosome 10. Mammalian Genome 8,229-235.

2.0. И. Духанина, X. Дене и Д IL Рэшт. 1997. Получение новых микросателлитных маркёров хромосомы 10 крысы в районе, содержащем гены, регулирующие уровень кровяного давления. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. Находится в печати.

Автор благодарит научных руководителей профессора J. Rapp за предоставленную возможность выполнить работу в его лаборатории, за участие в планировании опытов и обсуждении результатов, а также за работу с инбредными и конгенными животными, и профессора Jl JI Киселёва за помощь на начальных этапах работы и большую помощь и критические замечания при написании автореферата и диссертации.

Автор благодарит членов лаборатории доктора J. Rapp доктора Н. Dene и С. Choi за участие в некоторых опытах, К. Farms, М. Garrett и С. Petretich за техническую помощь при получении конгенных линий; В. Е. Свердлова и Г. С Монастырскую за большую помощь и поддержку на всех этапах проведения работы; О. О. Фаворову за помощь и критическое чтение автореферата.