Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые микросателлитные маркеры хромосомы 19 человека: молекулярно-генетическая характеристика и использование в популяционных исследованиях

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Новые микросателлитные маркеры хромосомы 19 человека: молекулярно-генетическая характеристика и использование в популяционных исследованиях"

На правах рукописи УДК 575.1.577.1

Беляева Ольга Валерьевна

Новые микро са теллитные маркеры хромосомы 19 человека: молекулярно-генетическая характеристика и использование в популяционных исследованиях

03.00.26 - Молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Райогя выполнена в Отделе толекулирной генетики человека Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор С. А. Лнмборская

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, доктор мед. наук, профессор Л. И. Корочкип доктор бнол. наук Г. Е. Сулимова

Ведущая организации: Медико-генетический научный центр РАМН

'Зашита состоится « 27 » ноябри 1998 г. в 11 часов

на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: I I 7334, Москва, ул. Вавилова, 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного сов кандидат фарм. паук

С. Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Генетические маркеры на основе микросателлитов все более активно используют в картировании генома, при оценке степени сходства или различия между популяциями, в медико-генетических исследованиях с целью установления ассоциации или сцепления с генами наследственных заболеваний. Одним из направлений международного проекта «Геном человека» является насыщение генетической карты маркерами, с равной частотой распределенными по геному. Среднее разрешение карты для решения задач генетического картирования должно составлять 100 т. п. н (Guyer, Colins, 1995). В настоящее время достигнуты значительные успехи в создании карт высокого разрешения всего генома человека и отдельных хромосом (Uddhav, Ketan, 1998). Значительная часть маркеров, используемых для построения генетических карт высокого разрешения, представлена STS (sequenced-tagged sites) (Sheffield et al, 1995, Gastier et al, 1995, Dib et al, 1996). Информативность того или иного класса маркеров зависит от частоты их встречаемости, равномерности распределения по геному и от удобства типирования.

Быстрое получение высокоинформативных маркеров для решения задач генетического картирования, анализа сцепления, популяционных исследований стало возможным благодаря активному использованию коротких тандемно повторяющихся последовательностей (STR - short tandem repeats), или микросателлитов (Hearne at al, Silver 1992). Преимущество микросателлитов перед другим классом гипервариабельных последовательностей, ранее нашедшим применение в качестве маркеров - минисателлитами - состоит в том, что частота их

встречаемости в геноме значительно выше и их легче анализировать с использованием ПЦР.

Цель и задачи работы.

Целью данной работы было получение новых микросателлитных маркеров 19 хромосомы человека и оценка их информативности для генетического картирования и популяционных исследований.

Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- получение серии рекомбинантных плазмидных клонов, содержащих микросателлитные локусы 19 хромосомы человека;

- определение первичной структуры микросателлитных локусов и оптимальных условий для их ПЦР-амлификации;

- внутрихромосомное картирование микросателлитных локусов путем локализации в контигах космидных клонов 19 хромосомы человека;

- определение спектра и частоты аллельных вариантов микросателлитных локусов в популяциях России и сопредельных стран;

- анализ показателей полиморфизма и определение его информативности.

Научная новизна и практическая значимость работы. Получена серия рекомбинантных плазмид, содержащих микросателлитные локусы хромосомы 19 человека и определена первичная структура 10 новых микросателлитных локусов. Проведена тонкая локализация двух локусов, САс1б85 и ОАс1б63, на хромосоме 19 человека в области 113.1 вблизи гена вР1 и в области 19ч 13.4 вблизи гена КЬК1 соответственно. Показан высокий уровень межиндивидуального полиморфизма САс1б85 и ОАаббЗ и их аллельного разнообразия в ряде популяций России и сопредельных стран. Продемонстрирована высокая

информативная ценность CAct685 и GAct663 как генетических маркеров.

Полученные микросателлитные локусы 19 хромосомы могут быть использованы в медико-генетических исследованиях в качестве полиморфных маркеров для анализа сцепления, в популяционно-генетических работах для анализа взаимоотношений между популяциями, а также при создании панелей высокоинформативных маркеров для идентификации личности.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на Международном симпозиуме по эволюции человека (Колд Спринг Харбор, США, 1997), на VIII отчетной конференции «Геном человека» (Черноголовка, 1998), на Ежегодном конгрессе Организации но изучению генома человека (Турин, Италия, 1998), на IV Двойном конгрессе Международной ассоциации по изучению палеонтологии человека и Международной ассоциации по изучению биологии человека (Сан-Сити, ЮАР, 1998), на 1 Международной конференции «Раса: миф или реальность» (Москва, 1998).

Публикации. По материалам работы опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список цитируемой литературы». Работа изложена на /<£^2стр. машинописного текста, содержит т^таблиц и ¿^рисунков. Список литературы включает ^¿Чюточникяв.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Получение_коллекции_клонов. содержащих

микросателлитные локусы 19 хромосомы человека. Первый этап данной работы состоял в скрининге космидной библиотеки 19 хромосомы человека с помощью олигонуклеотидных зондов трех типов: (СА)|2, (САС)5 и (ТСС)з, с целью отбора клонов, содержащих ДНК микросателлитных локусов. Всего было проанализировано 6000 индивидуальных космидных клонов. При гибридизации колоний космидной библиотеки с каждым из зондов производили отбор позитивных клонов. Культуры космидных клонов, гибридизующиеся с каждым из трех типов зондов, помещали соответственно в лунки трех иммунологических планшетов, содержащих глицерин, для хранения и консервации. Около половины клонов космидной библиотеки содержали вставки ДНК хомячка, что значительно осложнило скрининг. Микросателлитные локусы широко представлены как в геноме человека, так и в геноме грызунов, и это потребовало дополнительного отбора клонов, содержащих ДНК человека, с помощью гибридизации колоний с интер-А1и-ПЦР-фрагментами 19 хромосомы человека. После переклонирования была получена серия рекомбинантных плазм ид, содержащих микросателлитные локусы 19 хромосомы человека. Бактериальные культуры клонов этой коллекции законсервированы.

Секвенирование ДНК микросателлитных локусов 19 хромосомы.

Для 10 рекомбинантных плазмидных клонов проведено определение первичной последовательности. Для пяти из них определение ограничено лишь одним фланкирующим участком

Рис. I. Первичная структура микросателлитного локусл САс1б85. Жирным шрифтом выделены последовательность микросатсллнтнго повтора (СЛ)П. Жирным курсивом выделена последовательность, соответствующая 265-нуклеотидному зонду, использованому для внутрихромосомной локализации САс1б85.

1 АбГйАГГГСГ СААААвСТвС АССТААТвТв СТАТССАТТС 41 АвАСАвАСАТ АСТСАСвТТА вСАААТвТТТ вТТОАвССАв 81 САСТСАвТвО САвАТТСТвТ вСТАвавСвТ вССАвАвТвС 121 АйАСАСАСвТ ТТвССААвАС АСАвввТСАС АТвТвСАТСС 161 АСАСТСАвАС ТТССАввСТТ АСАССАвТвТ ТСАвССТвСА 201 ТСССААТССС АввСАвСТСС АвСвАСОАСА вАСАвААТСТ 241 САСААСАССС ААССССТССС АСТССАТвСТ АСАвТССАСТ 281 ТСССАСАТАС ССТСССАССС ААСАССАТСв СССААСбССС 321 АСССТСТСТС ТССАСЙАССТ СССТАСАСАА ТТ(СА) 29 411 ССААСАССАТ СТСССТТвТТ САСАТАТАСА ТАААССАТАС 451 ССАТССССАА ТТСССТСССТ бТСССТССТС ССАССАвАСТ 491 ТТССТСГСАТ САСОСГСАСА ТСССССАССТ СТССТСТТСТ 531 ССТСССТСТ

Рис. 2. Первичная структура микросателлитного локуса ОАс(б63. Жирным шрифтом выделены последовательности микросателлитных повторов сложной структуры, курсивом и подчеркиванием - последовательности прямых повторов 112-нуклеотидноП последовательности, фланкирующих микросателлитные повторы, жирным курсивом выделена последовательность, соответствующая зонду, использованому для внутрихромосомной локализации ОАс1б63.

1 САТААСААТА ТбТТТбСГТС ТСССАСАТТС СТССАТССАС 41 ААСАСССССТ ТССССАТСАС АССТССТССС ССАССАСССС 81 ССАССАТТАА САСАСССТСТ ССГСТСССАТ СССГССТТАА 121 ТСААТАТТТТ СС(<ЗААА)3 (ССАА)2 (СввАА) 2 (ОТССА) 7 АСевА (СвбвА) 3АС(ЗААА(5С(ЗААСС(ЗА ((ЗСААА) 2 (СААА) 2вАА СААА (сггА) зСсааасаабсаа (ггсА) 5ССАТ (ССАА) 6ССА (СААА) бвААв (СААА) 15СА (СААА) 3 ГGGGCДGДЛGДДGДGЛGG 441 АТАААСввСА ССАСТАЛвТв АвТАвСАвАС ССТССввССА 481 CAGGCДГGCД СвТввТСТАТ вТССТТТАвС СТвТвТССАС 521 Д ТССАвСТвСТАСАСТ ССААСЗААССААСССААС (СвСА) 5 ((ЗввАА) « (АССА) 2ААС (ССААА) 4С(ЗАА (СССАА) 3САССА ((ЗАА) 3СА6АААСААСА ((ЗАААСАА) 3бА (вАА) 3СА (САА) 13 (С(ЗАА) гбАААСбАА (БААА) 2САСААА (СА) 2 (СААА) 2 (ССАА) 2 861 ГGGGCДGAДG ААСАвАССАТ АДДGGGG■4gG АСТААвТСАв 900 ТАвСАвССТС GGGCCДCДGG CДr"CДGGГG ГGГДCGГGGГ 941 ТТАвССТаТв ТС.САСАТССА ССТАСвТАвА GTGG^V^:GG^G 981 СССТССАССС АССАТССАСА СССССТССТС СААСТТбТТС 1021 АСССААТСТТ ТСТСАвТТвС ТСТССАТСТв ААТСТвСвСА 1061 САССССАСГС СТТАбСААСв ТАСАСАТС

микросателлитного повтора, для пяти рекомбинантных плазмид первичная структура клонированных фрагментов определена полностью, включая оба фланкирующих участка. Среди них два фрагмента содержат микросателлитные повторы типа (СА)П, два - повторы типа (ТСС)„, и один - микросателлитный локус сложной структуры. Сравнение последовательностей ДНК всех локусов, для которых проведено полное или частичное секвенирование, с банком данных ЕМВЬ не выявило существенной гомологии ни с одной из ранее описанных последовательностей. На рис. 1 приведена последовательность микросателлитного локуса САс1б85, содержащий микросателлитный повтор типа (СА)„; фрагмент, выделенный из рекомбинантной плазмиды, содержит 29 повторяющихся единиц СА.

Заслуживает внимания сложная структура локуса САаббЗ (рис.2). Этот локус был выделен из космидный библиотеки при гибридизации с зондом (ТСС)5, однако он содержит различные мотивы, образованные сЮ и <1А, включая повторы три-, тетра- и пентануклеотидов. Локус содержит два таких микросателлитных кластера, с З'-конца фланкированных прямым повтором 114-нуклеотидной последовательности.

ПЦР-амплификация ДНК микросателлитных локусов.

Для четырех новых микросателлитных локусов на оснований установленной первичной структуры фланкирующих участков подобраны специфические праймеры и условия амплификации из геномной ДНК. Анализ продуктов амплификации локусов САс1685 и САс1663 на ДНК случайной выборки индивидуумов показал наличие различных аллелей, высокий уровень полиморфизма этих локусов в геноме человека, что позволило предположить их высокую ценность как маркеров 19 хромосомы.

Тонкое картирование локусов CAct685 и GAct663.

Для локусов CAct685 и GAct663 проведено тонкое картирование на 19 хромосоме человека для получения на их основе полноценных генетических маркеров. Для внутрихромосомной локализации микросателлитных локусов были использованы фильтры высокой плотности, содержащие ДНК космидных библиотек 19 хромосомы человека. Зонд для локализации CAct685 соотвествовал уникальной 265-нуклеотидной последовательности одного из фланкирующих микросателлитный повтор участков (рис. 1). Гибридизация зонда с фильтрами высокой плотности выявила 10 позитивных сигналов. Расшифровка позиций гибридизующихся космид позволила определить их идентификационные номера и положение в космидных контигах 19 хромосомы человека (табл1).

8 из 10 позитивных космидных клонов входят в состав контига 685, один - в состав контига 1631 и один не отнесен ни к одному из контиго». Эти данные позволили считать, что с наибольшей вероятностью локус CAct685 локализован в области, перекрываемой контигом 685.

Космидный контиг 685 содержит космидные клоны F12288 и F8434, являющиеся FISH-маркерами и картированные соответственно на расстоянии 39,2 и 39,3 Mb от р-теломеры в области 19ql3.1, (Gordon et al, 1996). Ряд космидных клонов, входящих в контиг 685, включены также в рестрикционную карту 19 хромосомы, созданную Центром по изучению генома человека Ливерморской национальной лаборатории, США (рис. 3). В рестрикционную карту (фрагмент протяженностью 352 т. п. н.) включены и 4 позитивных космидных клона: F24907, R28819, R26798, R29337. ПЦР на ДНК космидных клонов, включенных в рестрикционную карту, подтверждает присутствие локуса CAct685

Космидный клон Локализация

7089 контиг 685

7987 контиг 685

10204 контиг 631

22110 контиг 685

24907* контиг 685

24343 контиг 685

26798*'+ контиг 685

27342 локализация неизвестна

28819* контиг 685

контиг 685

Табл. I. Локализация позитивных клонов в космидных контигах хромосомы 19 (для локуса САс1685).

* - космидныс к лопы, включенные з ЕсоШ рестрикционную карту.

+ - клоны, для которых присутствие САс(685 подтверждено с использованием ПЦР.

Г24907 1127262

К28819

_1_I_1_11_

I 1-1

Ш-

Р21733 Р13279

Р25188

Р19595

1*28380

Р2825 Р8434 1129337

I I__I_1Ш1_

1... И I.

I I .11-

Л-

1100 т.п.н.

протяженность фрагмента рсстрикционной карты

200 т.п.н.

Рис. 3. Фрагмент ЕсоШ рестрикционной карты хромосомы 19. Выделены номера космид, позитивных при гибридизации зонда с фильтвами высокой плотности.

19ql3.1

Контиги космидных клонов

F22885 Fl0000

Fl 2288

F8434

GPI

D19S739 ZNF

D19S791 ZNF

контиг 685

F32579I

_39.0 Mb

ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АНЕМИЯ

С Act 68 5

39.5 Mb

D19S587 ZNF»

Рис. 4. Локализация маркера САс(685 на карте хромосомы 19. Представлен фрагмент метрической карты хромосомы 19. Стрелка показывает положение САс1685 в контиге 685, содержащем также два маркера, Р12288 и Р8434. Полная метрическая карта хромосомы 19 человека, созданная Центром по изучению генома человека Ливерморской национальной лаборатории, доступна на Ьир://\у\у\у-bio.llnl.gov/genome/htnil/chrom_map.htrril

в перекрывающихся космидах R26798 и R29337 (гибридизующихся с зондом на фильтрах высокой плотности), Также ПЦР подтверждает присутствие локуса CAct685 в четырех космидах, расположенных между R26798 и R29337 на рестрикционной карте (Fl 9595, R28380, F8225, F8434). 6 названных ПЦР-позитивных космидных клонов имеют общий EcoRI-фрагмент протяженностью 1, 7 т. п. н. ПЦР-позитивный клон F8434 является также FISH маркером 19 хромосомы, что подтверждает локализацию маркера CAct685 на расстоянии 300 т. п. н. от гена GPI между D19S739 и D19S79J (рис.4).

Космидный клон

27204

31216*-

31333*+

30497

31745

30499*'+

30510

30630

34289

34371

Локализация контиг 1128 контиг 17 контиг 663

локализация неизвестна локализация неизвестна

контиг 663 локализация неизвестна контиг1128 контиг]128 локализация неизвестна

Табл. 4. Локализация позитивных клонов в космидных контигах хромосомы 19 (для локуса САс^ббЗ).

* - космидные клоны, включенные в ЕсоИ рестрикционную карту.

+ - клоны, для которых присутствие ОАс1ббЗ подтверждено с использованием ПЦР. - - ПЦР-негативный клон

Р22702

1

юшз

А

Р12033

Й30499

1

I

60 т.п.н.

100 т.п.н.

Рис. 5. Фрагмент ЕсоШ рестрикционной карты хромосомы 19. Выделены номера космид, позитивных при гибридизации зонда с фильтвами высокой плотности.

Контиги

космчдиых

клонов

Fl 9395

19ql3.3 19ql3.4,

F25235

Fl 7053

Fl 8306 F22702

F29285

D19S317 DI9S292

D19S246 D19S754

КОНТИГ 1128

KL Kl

50.0 Mb "KCNC3

POLD1 SPIB

55.5 Mb

GAct663

RPSS6

КОНТИГ 663

Рис. 6. Локализация маркера GAct663 на карте хромосомы 19. Представлен фрагмент метрической карты хромосомы 19. Стрелка показывает положение GAct663 в контиге 663, содержащем также два FISH маркеры, F18306, F22702 и F29285. Также обозначен контиг 1128. Полная метрическая карта хромосомы 19 человека, созданная Центром по изучению генома человека Ливерморской национальной лаборатории, доступна на http://www-bio.ilnl.gov/genome/html/chrom_map.html

Для локализации GAct663 использовали 39-нуклеотидный зонд, соответствующий фрагменту одного из фланкирующих зондов с фильтрами высокой плотности было выявлено 10 позитивных сигналов, однако картина их распределения в контигах оказалась сложнее, чем для локуса CAct685 (табл. 2).

4 из 10 клонов не отнесены ни к одному из контигов и поэтому были исключены из рассмотрения.

3 клона входят в состав контига 1128. Контиг 1128 содержит также ряд космид, F19395, F25235 и Fl7053, являющихся FISH-маркерами с локализацией 54,9 Mb 55,1 Mb и 55.3 Mb от р-теломеры. Данные о локализации клонов 27204, 30630 и 34289 в контиге 1128, полученные на основании анализа методом автоматического фингерпринтинга, позволяют локализовать их дистальнее FISH-маркера Fl7053 (55.3 Mb).

2 позитивных клона, R30499 и R31333 (контиг 663), входят в один фрагмент рестрикционной карты и имеют общий участок протяженностью 30 т. п. н. (рис. 5). Клон R31216 (контиг 17) включен в другой фрагмент EcoRI-карты 19 хромосомы. ПЦР-амплификация ДНК локуса GAct663 подтвердило его присутствие в клонах R30499 и R31333, и исключило в клоне R31216. Это позволяет локализовать маркер GAct663 в контиге 663 в области перекрывания клонов R30499 и R31333 протяженностью 30 т. п. н. Контиг 663 содержит FISH-маркер F22702, локализованный на расстоянии Mb от р-теломеры, и и имеющий значительную область перекрывания с позитивными клонами R30499 и R31333. Это позволяет локализовать GAct663 также на расстоянии около 55,5 Mb от р-теломеры в области локализации гена KLK1 между D19S754 и геном RPSS6 (рис. 6). Можно также считать, что данные о расположении позитивных клонов 27204, 30630 и 34289 в контиге 1128 дистальнее Fl9395 указывают на этот же сайт локализации GAct663.

Анализ популяционного полиморфизма локуса CAct685.

Определение генотипов индивидуумов по анализируемым микросателлитным локусам проводили с помощью ПЦР-амплификации данного локуса с последующим разделением аллелей в денатурирующем ПААГ. В качестве маркера

Лингвистическая семья Этнос

популяции

ИНДО -

ЕВРОПЕЙСКАЯ

АЛТАЙСКАЯ

УРАЛЬСКАЯ

ЧУКОТСКО-КАМЧАТСКАЯ-

БЕЛОРУСЫ

МОЛДАВАНЕ-

БАШКИРЫ"

УДМУРТЫ КОМИ ЧУКЧИ -

Несвижский р-н Хойникский р-н г. Бобруйск Гродненский р-н г. Кишинев

Абчелиловский р-н Илишевский р-н Стерлибашевский г. Воткинск пос. Малая Пурга Сысольский р-н

Экмелен

Табл. 3. Этно-лингвистическая классификация изученных популяций.

молекулярного веса использовали лестницу фрагментов, получающихсяся при секвенировании ДНК бактериофага М13шр18.

В данной работе определен спектр и частоты аллелей локуса САа685 в 12 популяциях, относящихся к шести этносам четырех лингвистических семей (табл. 3). Всего были определены генотипы 696 индивидуумов. Выявлено 14 аллельных вариантов микросателлитного повтора в локусе САс1б85, Частоты аллелей представлены в (табл. 4).

— Популяции

Аллель

{количество Белорусы Белорусы Белорусы Белорусь: Мзлдааане Коми Удмурты Удмурты Башкиры Башкиры Башкиры Чукчи

повторов СА) Хойникск. Несвижск. Гродненск. Бобруйск Кишинев Сысапьск Мал. Пурга Воткикск Абзелил. Илишевск. Стерлибаш Зкмелен

16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.009 0 0

18 0 0 0 0 0 0 0 0 0.009 0.009 0 0

19 0.229 0.227 0.19 0.189 0.245 0.171 0.205 0.194 0.223 0.198 0.24 0.108

20 0 0 0.012 0 0 0.014 0 0 0.063 0.009 0.021 0

и 0.073 0.033 0.033 0.042 о.а; 0.048 0.082 0.041 0.027 0.043 0.083 0.0!

22 0.115 0.159 0.262 0.263 0.173 0.274 0.143 0.255 0.232 0.164 0.281 0.02

23 0.104 0.068 0.024 0.042 0092 0.062 0.049 0.041 0.089 0.095 0.042 0.216

24 0.034 0.068 0.071 0.063 0.032 0.055 0.09 G.122 0.107 0.129 0.042 0.412

25 0.021 0.053 0.024 0.028 0.041 0.041 O.OSS 0.041 0.045 0,06 0.042 0.078

26 0.083 0.038 0.048 0037 0.061 0.02 0.041 0.02 0.027 0.08S 0.021 0.049

27 0.177 0.197 0.226 0.232 0.214 0.164 0.098 0.173 0.107 0.095 0.135 0.059

23 0.063 0.083 0.083 0.047 0.051 О.082 0.09 0.082 0.03S 0.043 0.042 0.039

29 0.031 0.068 0.024 0.058 0.031 0.068 0.041 0,01 0.038 0.06 0.052 0.01

30 0.01 0 0 0 0 0 0.057 0.031 0 0 0 0

N 48 66 42 95 49 73 61 49 56 58 48 51

Наблюдаемая

гетерозиготность 0.83 0.S8 0.83 0.62 0.38 0.9 0.84 0.59 0.89 0.88 0.92 0.67

Ожидаемая

гетерозиготность 0.87 0.86 0.83 0.83 0.84 0.88 0.84 0.85 0.86 0.88 0.83 0.76

№¡'5 (1973)

Соответствие Х2=91.22 Х2=53.06 *2=37.7] *2=35.79 •¿2=51.92 Х2=53.42 Х2=55.58 Х2=59.60 ¡(2=39.30 *2=63.48 Х2»36.36 Х2=46.46

равновесию р=0.00 р-0.19 р-0.964 р=0.835 р=0.222 р=0.535 р=0.453 Р=0.31 р=1.00 р=0.88 р=0.98 р=0.41

Харди-Вайнбеога v=55 v-45 v=55 v=4S v=45 v=55 v=55 v=55 v=66 v-78 v=5J v=45

Таблица 4. Частоты аллелей маркера САс1685, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность и соответствие

распределения генотипов равновесию Харди _Вайнберга.

Обнаружены аллели, содержащие любое количество повторяющихся единиц (СА) в диапазоне от 16 до 30, за исключением аллеля, содержащего 17 повторов.

Распределение генотипов по локусу САс1б85 соответствовало равновесию Харди-Вайнберга во всех популяциях, кроме Хойникского района Белоруссии; оценку проводили с использованием х2"кРитеРия- значения представлены в таблице 4. Значения ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности, как меры внутрипопуляционного разнообразия, также представлены в таблице 4. Попарное сравнение распределения аллелей и генотипов между популяциями, относящимися к одной лингвистической семье, не выявило статистически достоверных различий ни для одной пары популяций. Это позволило рассчитать средние значения частот аллелей для каждой лингвистической семьи, представленные в таблице 5.

Диаграмма (рис. 7) иллюстрирует распределение средних частот для индо-европейской, уральской и алтайской лингвистических семей и чукотской популяции. Профили частот аллелей для восточно-европейских популяций, относящихся к трем лингвистическим семьям, сходны: на них хорошо выражены три пика, соответствующих трем мажорным аллелям. Во всех популяциях индо-европейской, уральской и алтайской лингвистических семей наиболее частыми являются аллели, содержащие 19, 22 и 27 повторяющихся единиц СА. Суммарная частота всех остальных 11 аллелей составляет менее половины -45%. Для аллеля 27 отмечена тенденция постепенного уменьшения от индо-европейской к алтайской семье, а для аллеля 24 - постепенного увеличения в этом направлении. Попарное сравнение средних аллельных частот локуса САс1б85

Лингвистические семьи

Аллель

(количество

повторов СА Индо- Уральская Алтайская Средние Чукотско-

Европейская частоты* Камчатская

16 0 0 0.003 0.001 0

18 0 0 0.006 0.002 0

19 0.216 0.19 0.22 0.208 0.108

20 0.002 0.005 0.031 0.01 0

21 0.04 0.057 0.051 0.047 0.01

22 0.194 0.226 0.226 0.215 0.002

23 0.066 0.051 0.075 0.064 0.216

24 0.076 0.089 0.093 0.081 0.412

25 0.033 0.06 0.049 0.045 0.078

26 0.053 0.027 0.045 0.043 0.049

27 0.209 0.145 0.112 0.167 0.059

28 0.065 0.085 0.04 0.064 0.039

29 0.042 0.04 0.049 0.046 0.01

30 0.002 0.029 0 0.009 0

* - Средние аллельные частоты для Индо-Европейской, Уральской и Алтайской лингвистичеких семей

Таблица 5. Средние частоты аллелей маркера САс1б85 для популяций четырех лингвистических семей.

между индо-европейской, уральской и алтайской лингвистическими семьями не выявило статистически достоверных различий между ними. Для пары индо-европейская - уральская языковые семьи = 8.1001, р = 0.7346, n = 11, индоевропейская - алтайская - %2 =9.1671, р = 0.6546, п= 13, алтайская - уральская - %2 = 9.2245, р = 0.7148, п = 13. Средние частоты аллелей локуса CAct685 для лингвистических семей представлены в таблице 5.

Подобное сходство в распределении аллельных частот представляется весьма интересным. Ранее считалось, что микросателлитные локусы с их высокой скоростью мутирования пригодны лишь для анализа наиболее генетически близких популяций (Cavalli-Sforza, Piazza, 1993). В цитируемой работе авторы говорили о возможности использования микросателлитных маркеров лишь в популяциях Западной Европы, генетически очень близких - именно в таких группах целесообразно использовать высокополиморфные локусы с их высокой разрешающей способностью. Народонаселение Восточной Европы, рассматриваемое в данной работе, значительно более разнородно, и для него можно было бы ожидать столь высокую изменчивость микросателлитных локусов, что их использование было бы просто нецелесообразно. В последнее время, однако, накоплены данные о стабильности многих микросателлитных маркеров и их успешном использовании в анализе отдаленных групп. Вместе с тем, показанное сходство профилей аллельных частот CAct685 для таких генетически отдаленных групп, как коренное население Белоруссии и сельских районов Башкирии, представляется неожиданным. Возможным объяснением могло бы стать существование отбора в пользу определенных аллелей какого-либо локуса, сцепленного с CAct685. Наличие такого

Частоты аллелей локуса САс1535 для популяций четырех лингвистических

семей

ПИндо- Европейская □ Уральская Р Алтайская СЧукотс;;о- Камчатская 0,45

частоты аллелей

размер аллеля, количество повторов СА

отбора является классическим объяснением низких популяционных различий (Алтухов, 1998). Однако в области локализации САс1б85 локус, подверженный жесткому отбору, в настоящее время неизвестен.

Популяция береговых чукчей поселка Экмелен была выбрана для анализа как группа, очень удаленная от 11 других популяций и генетически, и территориально. Время расхождения предковых популяций Чукотско-Камчатской языковой семьи и трех других составляет не менее 15 тысяч лет. Представлялось интересным установить, обусловлено ли выявленное сходство распределений общностью происхождения, или действием стабилизирующего отбора. Последнее объяснение, как отмечено выше, представляется маловероятным. Диаграмма (рис. 7) наглядно отражает отличия профиля частот аллелей чукотско-камчатской языковой семьи от трех других: профиль имеет один пик. Сравнение распределения аллельных частот локуса САс1б85 в чукотской популяции со средними частотами для трех лингвистических семей выявило статистически достоверные различия между этими группами: %2 =71.1658, р = 0.0000, п= 13. Наиболее частым в чукотской популяции является аллель 24 (0,412), а также аллель 23 (0,216).

Трудно предположить наличие отбора по какому-либо сцепленному с САс1б85 локусу, действующему принципиально различно в Восточной Европе и Северо-Восточной Евразии.

Возможно, профиль аллельных частот чукотской популяции отражает распределение, характерное для монголоидных популяций Азии. Генофонд удмуртских популяций уральской семьи и, в большей степени, башкирских популяций алтайской семьи содержит монголоидный компонент. Для этих групп можно отметить некоторые черты, промежуточные между европеоидными популяциями Индо-

Европейской семьи и типичными монголоидами Чукотско-Камчатской семьи. В частности, частота аллеля 27 составляет 0,209 для белорусских и молдавской популяций, 0,112 для башкирских популяций, и 0,059 для чукчей. Частоты аллелей 23 и 24 выше в Алтайской лингвистической семье, чем в ИндоЕвропейской. В этнической истории чукотской популяции могли иметь место события, также отразившиеся на распределение частот аллелей, в том числе периоды малой численности, сопровождающиеся усилением генетического дрейфа, и эффект основателя.

Анализ внутри- и межпопуляционного разнообразия

САсГб85

Мерой внутрипопуляционного разнообразия является гетерозиготность, пространственную изменчивость которой анализировали с помощью карты гетерозиготности. На карте гетерозиготности выявляется ядро высоких значений в районе Южного Урала и Поволжья и область минимальных значений в северной Белоруссии. В северном и западном направлении значения гетерозиготности закономерно убывают, что подтверждается их корреляцией с географическими координатами. В соответствии с картографическим прогнозом среднее значение гетерозиготности САс1б85 для популяций Восточной Европы составило 0,858, максимальное и минимальное - соответственно 0,831 и 0,881. Таким образом, локус САа685 в данном регионе характеризуется высоким уровнем гетерозиготности.

В чукотской популяции гетерозиготность оказалась намного ниже - 0,700. Это является следствием преобладания у чукчей всего двух аллелей с 23 и 24 повторами. Такое преобладание всего двух аллелей можно объяснить двояко:

значительным дрейфом генов в непосредственно изученной популяции (береговые чукчи, пос. Экмелен) или эффектом основателя - тоже дрейфом, но имевшим место в тысячелетием формировании столь изолированной чукотско-камчатской языковой семьи. Достоверно вопрос о том, что в большей степени определило своеобразие чукотской популяции: принадлежность к монголоидной расе или события этнической истории - может быть решен при анализе других азиатских групп.

В качестве меры межпопуляционного разнообразия использовалась стандартная мера - Ся^статистика Нея (Ые1, 1975). Для сравнения была проведена оценка межпопуляционного разнообразия для иммуно-биохимических маркеров - по 100 аллелям 30 полиморфных локусоп (с использованием данных Банка "СЕЫЕРООЬ"). Это значение наиболее близко к истинной межпопуляционной изменчивости в пределах Восточной Европы (Рычков и др., 1997) и соответствует межпопуляционной изменчивости "среднего гена". Результат оказался противоположным традиционно ожидаемому: межпопуляционная изменчивость

микросателлитного локуса в популяциях Восточной Европы оказалась в два раза меньше, чем "классических" маркеров. Но в то же время отличие чукотской популяции от всех европейских популяций по САс1б85 оказалось настолько велико, что межпопуляционная изменчивость всех популяций (включая чукчей) превысила межпопуляционную изменчивость по классическим маркерам.

Анализ популяционного полиморфизма локуса СА^ббЗ.

Анализ полиморфизма локуса САс1663 проведен в четырех белорусских популяциях и чукотской популяции. Выявлено 14аллельных вариантов локуса (табл. 6). Поскольку

Аллель Белорусы Средние частоты для белорусских популяций Чукчи пос. Экмелен

Хойникский район Несвижский район Гродненский район г. Бобруйск

А 0,283 0,337 0,341 0,342 0,33 0,283

В 0,098 0,067 0,073 0,079 0,079 0,216

С 0,217 0,183 0,183 0,184 0,19 0,216

D 0,185 0,183 0,195 0,195 0,19 0,1

Е 0,087 0.077 0,098 0,084 0,086 V Р,1

F 0,033 0,058 0,073 0,032 0,045 0,017

G 0,011 0,029 0 0,011 ' 0,013. • 0

Н 0 0 0 0,005 0,002 0

1 0,032 0,019 0,012 0,021 0.021 0,033

J 0,011 0 0 0,005 0,004 0

К 0,011 0 0.012 0,011 0,009 0

L 0,022 0,019 0 0,016 0,015 0,017

М 0,011 0 0 0,011 0,006 0

N 0 0,029 0,012 0,005 0,011 0

N 48 66 42 95 251 30

Таблица 7. Частоты аллелей локуса GAct663. N - размер выборки.

микросателлитный повтор в локусе имеет сложную структуру (рис. 2), то невозможно определить, какой именно повторяющийся элемент варьирует в данном локусе. Сопоставление продуктов амплификации аллелей локуса с лестницей фрагментов, получающихся при секвенировании ДНК бактериофага М13, позволяет заключить, что аллели различаются вследствие изменения количества повторов тетрануклеотидного звена.

Распределение аллелей локуса в четырех белорусских популяциях достоверно не различалось. Сопоставление средних частот аллелей для белорусского этноса с распределением для чукотской популяции выявило статистически значимые отличия. Наибольшую частоту в белорусских популяциях имеют аллели

А, С, и И, а в чукотской популяции - аллели А, В, и С. (табл. 7). Полученные данные о полиморфизме локуса вА^ббЗ позволяют заключить, что он эффективно выявляет различия между отдаленными популяциями, имеет высокую гетерозш отность и, как и САс1б85, является высокоинформативным генетическим маркером.

ВЫВОДЫ

1. В результате скрининга космидной библиотеки 19 хромосомы человека получена серия рекомбинантных плазмид, содержащих микросателлитные локусы; из них для 10 новых микросателлитных локусов 19 хромосомы человека определена первичная структура.

2. Путем локализации в контигах космидных клонов 19 хромосомы человека проведено тонкое картирование микросателлитного локуса САс1б85 на расстоянии 300 т.п.н. от гена ОР1 между 0198739 и 0198791, и микросателлитного локуса ОАс1663 в области локализации гена К1.К1 между О198754 и геном РГ^Бб.

3. Для микросателлитных локусов САс1б85 и САс(663 показан высокий уровень межиндивидуального полиморфизма; проведенный анализ аллельного разнообразия САс(685 в 12 популяциях России и прилежащих стран, и ОАс(663 в четырех локальных популяциях одного этноса выявил существенную межпопуляционную изменчивость.

4. Выявленная популяционная изменчивость САс1б85 и ОАс1663 свидетельствует о их высокой информативной ценности как генетических маркеров.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Prosniak М. I., Belyaeva О. V., Poiukarova L. G., Limborska S. А., 1994. «Isolation of mini- and microsatellite loci from chromosome 19 library», Abstracts of 3th Intern. Conf. on DNA fingerprinting, Hyderabad, India, 1994, p.95

2. Беляева O.B., Шаброва E.B., Просняк М.И., Спицын В.А., Хуснутдинова Э.К., Лимборская С. А., 1997. «Новый высокополиморфный » Мол. биол., т. 31. стр. 795-800.

3. S.A. Limborska, Р.А. Slominsky, М. I. Shadrina, S. N. Popova, O.V. Belyaeva, E. V. Shabrova, Т. V. Pogoda, M. V. Khorte, E. K. Khusnutdinova, V. A. Spitsyn, A. I. Mikulich, «DNA diversity in east European populations», Abstracts of the 1997 Meeting on Human Evolution, Cold Spring Harbor, USA, 1997, p. 100.

4. S.A. Limborska, P.A. Slominsky, E.V. Balanovskaya, M. I. Shadrina, S. N. Popova, O.V. Belyaeva, T.V. Pogoda, O.P. Balanovsky, D.A. Verbenko, E. K. Khusnutdinova, V. A. Spitsyn, A. I. Mikulich, 1998. "Nuclear DNA polymorphism and evolutionary history of East European populations", Abstracts of the Human Genome Meeting'98, Turin, Italy, 1998, p. 36.

5. O.V. Belyaeva, O.P. Balanovsky, L.K. Ashworth, Y.B. Lebedev, V.A. Spitsyn, N.A. Guseva, S. Erdes, A.I. Mikulich, E.K. Khusnutdinova, S.A. Limborska, 1998. "Fine mapping of a polymorphic CA repeat marker on human chromosome 19 and its use in population studies", Amer. J. Human Genet., v. 63, p245.

6. O.V. Belyaeva, O.P. Balanovsky, L.K. Ashworth, Y.B. Lebedev, V.A. Spitsyn, N.A. Guseva, S. Erdes, A.I. Mikulich, E.K. Khusnutdinova, S.A. Limborska, "Highly informative marker CAct685: fine localization on human chromosome 19 and population polymorphism." Gene, (submitted)

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Заказ ¿/О

Тираж 100 экз.