Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные и эпигенетические нарушения генома человека при глиобластоме

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурные и эпигенетические нарушения генома человека при глиобластоме"

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВА Екатерина Александровна

СТРУКТУРНЫЕ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА ПРИ ГЛИОБЛАСТОМЕ

03.02.07 "Генетика"

2 о ДБГ т

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2015

005561671

005561671

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр» (ФГБНУ «МГНЦ»).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Стрельников Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

Абилев Серикбай Каримович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики Н.И.Вавилова Российской академии наук, заместитель директора по научной работе

Климов Евгений Александрович, доктор биологических наук, доцент, Биологический факультет Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», ведущий научный сотрудник кафедры генетики

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 05 октября 2015г. в 12-00 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр» (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1; www.med-gen.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Медико-генетический научный центр» по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан « /3 » 2015 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор . <- Зинченко Репа Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Первичные опухоли головного мозга - исключительно гетерогенная по своим биологическим основам, гистологическим характеристикам и клиническим особенностям группа новообразований (Стрельников В. с соавт., 2011). Они встречаются относительно редко - около 2% среди всех видов опухолей, однако центральная роль головного мозга и функциональные последствия его поражения объясняют тяжесть этой группы новообразований. Несмотря на низкую распространенность первичных опухолей головного мозга в структуре общей онкологии, смертность и инвалидизация вследствие них имеют очень высокие показатели. Первичные опухоли головного мозга входят в 10 наиболее частых причин смертности от онкологии (Gao Н. et al., 2013; Wrensch М. et al., 2002).

Среди всех первичных опухолей головного мозга глиобластома является наиболее злокачественной и распространенной опухолью. Она составляет около 70% первичных опухолей головного мозга (Goussia А. et al., 2011; Ohgaki Н. et al., 2009). За последние десятилетия достигнуты значительные успехи в диагностике и лечении глиобластомы, однако в большинстве случаев опухоль оказывается устойчивой к применяемой терапии и неизбежно рецидивирует. Таким образом, прогноз для пациентов с этой опухолью по-прежнему остается неутешительным, средняя выживаемость составляет 12-14 месяцев (Davis F. et al., 2001; Heroux M. et al., 2014; Newton H„ 2010).

Глиобластома достаточно хорошо изучена на молекулярном уровне и характеризуется большим числом генетических и эпигенетических изменений. Тем не менее, только небольшое число из выявленных изменений при этой опухоли, такие как мутации в гене IDH1 и метилирование промотора гена MGMT, используется в клинической практике в качестве маркеров прогноза течения заболевания и ответа на терапию (Стрельников В. с соавт., 2011; Gupta К. et al., 2012; Meir Е. et al., 2010).

Следовательно, на сегодняшний день существует острая необходимость в более глубоком изучении глиобластомы на молекулярно-генетическом уровне, что даст возможность идентифицировать мишени для разработки новых терапевтических средств и выявить потенциальные маркеры прогноза течения и ответа на терапию, а также в целом позволит расширить знания о молекулярно-генетических изменениях при этом типе опухолей.

Наиболее частым генетическим изменением при глиобластоме, выявляемым с частотой до 80% случаев, является потеря гетерозиготности маркеров длинного плеча 10-й хромосомы (10q). Предполагается, что высокая частота потери гетерозиготности в этом районе может свидетельствовать о расположении в нем ключевых для патогенеза опухоли генов-кандидатов (Ohgaki Н. et al., 2007; Hata N. et al., 2006). Однако потеря гетерозиготности отражает только наличие аллельного дисбаланса в исследуемой области, то есть позволяет выявить лишь факт изменения числа копий геномных локусов, но при этом не уточняет, является ли это изменение увеличением или уменьшением числа копий одного из аллелей (Ohgaki Н. et al., 2007).

Настоящее исследование посвящено комплексной характеристике потери гетерозиготности района 10q23.3-26.3 - наиболее интересного с точки зрения молекулярной онкологии глиобластомы. Проведенная комплексная характеристика заключается в определении потери гетерозиготности и копийности генов-кандидатов,

картированных в этом районе, изучении метилирования промотора гена MGMT и его экспрессии.

Поскольку области потери гетерозиготности могут маркировать участки расположения генов-кандидатов супрессоров опухолевого роста, актуальной является задача выявления новых участков аллельного дисбаланса хромосомных регионов, которая также решается в настоящем исследовании. Изучение участков с потерей гетерозиготности при глиобластоме позволит идентифицировать потенциальные маркеры прогноза течения заболевания и ответа на терапию.

Степень разработанности темы исследования.

Несмотря на то, что потеря гетерозиготности маркеров длинного плеча 10-й хромосомы является наиболее частым генетическим изменением при глиобластоме, исследований по изучению аллельного дисбаланса этого региона методами, позволяющими охарактеризовать изменение копийности генов-кандидатов, расположенных в этой области, в настоящее время достаточно мало (Nord H. et al., 2009). Настоящая работа является первой диссертационной работой в РФ, посвященная исследованию структурных и эпигенетических нарушений генов-кандидатов, расположенных в локусе 10q23.3-26.3 при глиобластоме. Кроме того, в работе исследуется аллельный дисбаланс хромосомных участков 2q31.2, Зр25.1, 5ql4.3, 6р21.1, 7q21.2, 9q21.33, 12q21.33, 16р13.12, 19pl3.2, в которых ранее этого явления при глиобластоме не описано.

Цель исследования.

Комплексная молекулярно-генетическая характеристика хромосомного района 10q23.3-26.3, содержащего гены-кандидаты PTEN, FGFR2, MKI67 и MGMT, и поиск новых, ранее не описанных областей аллельного дисбаланса при глиобластоме.

Задачи исследования.

1. Разработать и охарактеризовать систему микросателлитных маркеров для анализа потери гетерозиготности локуса 10q23.3-26.3, содержащего гены-кандидаты PTEN, FGFR2, MKI67 и MGMT, а также локусов, в которых ранее не выявлено случаев аллельного дисбаланса при глиобластоме.

2. Определить частоту аллельного дисбаланса в локусе 10q23.3-26.3 и охарактеризовать границы областей потери гетерозиготности.

3. Разработать и охарактеризовать систему маркеров для микросателлитного анализа копийности ДНК методом ПЦР в реальном времени (количественного микросателлитного анализа).

4. Для образцов с выявленным аллельным дисбалансом в локусе 10q23.3-26.3 установить количественное изменение числа копий исследуемых участков методом количественного микросателлитного анализа в реальном времени.

5. Разработать систему маркеров для определения метилирования CpG-островка промотора гена MGMT и определить частоты аномального метилирования различных участков этого района в выборке глиобластомы.

6. Валидировать гипотезу о стресс-зависимом характере экспрессии гена MGMT.

Научная новизна.

1. Впервые проведено прицельное изучение частоты потери гетерозиготности и ее границ в локусе 10q23,3-26.3 в выборке глиобластомы. Показано, что наиболее часто

потеря гетерозиготности на длинном плече 10-й хромосомы затрагивает протяженный участок, включающий весь исследованный локус (84,4%), тем не менее, в 15,6% образцов глиобластомы наблюдается потеря гетерозиготности различных более коротких участков.

2. Впервые показано, что потеря гетерозиготности локуса 10q23.3-26.3 при глиобластоме может являться отражением как делеции (37,5%), так и однородительской дисомии (25,0%) на протяжении всего локуса. В 37,5% участки потери гетерозиготности и участки однородительской дисомии чередуются на протяжении 10q23.3-26.3. В этих случаях наибольшая частота делеций характерна для проксимальной части, а однородительской дисомии - для дистальной части локуса. Переход от области делеции к области однородительской дисомии происходит в сегментах 10q26.1 - 10q26.2.

3. Выявлены новые локусы аллельного дисбаланса при глиобластоме: 2q31.2, Зр25.1, 5ql4.3, 6р21.1, 7q21.2, 9q21.33, 12q21.33, 16р13.12, 19pl3.2, представляющие собой потенциальные молекурно-генетические маркеры прогноза течения заболевания и ответа на терапию.

4. Впервые показано, что потеря гетерозиготности области расположения гена MGMT и метилирование его промотора являются независимыми событиями при глиобластоме. Учитывая высокую частоту потери гетерозиготности гена MGMT (60% в настоящем исследовании) и независимый характер ее возникновения, это событие можно рассматривать как потенциальный дополнительный маркер прогноза течения заболевания и ответа на терапию.

5. Впервые показано, что MGMT является стресс-активируемым геном, экспрессия которого меняется под влиянием хирургического вмешательства.

Теоретическая н практическая значимость.

Впервые разработана и охарактеризована система микросателлитных маркеров для исследования потери гетерозиготности в локусе 10q23.3-26.3; информативность системы составила 100%.

Впервые разработана и охарактеризована система мультилокусной метил-чувствительной ПЦР для анализа статуса метилирования промотора гена MGMT, включающая внутренние контроли эффективности ПЦР и полноты гидролиза ДНК.

Разработанная система микросателлитных маркеров для анализа потери гетерозиготности в локусе 10q23.3-26.3 и система метилчувствительной ПЦР для изучения метилирования промоторной области гена MGMT подробно охарактеризованы и могут быть использованы в дальнейшем в других исследованиях.

Впервые разработан метод количественного микросателлитного анализа в реальном времени для определения копийности геномных локусов при глиобластоме. Особенностью разработанного метода по сравнению с ранее опубликованными подходами является обоснованный выбор системы эндогенных контролей копийности ДНК в опухолевых образцах. Метод количественного микросателлитного анализа является универсальным и гибким, более простым, доступным и дешевым по сравнению с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) и сравнительной геномной гибридизацией.

Разработаны и охарактеризованы микросателлитные маркеры для исследования потери гетерозиготности в локусах 2q31.2, Зр25.1, 5ql4.3, 6р21.1, 7q21.2, 9q21.33, 12q21.33, 16р13.12, 18ql 1.2, 19p 13.2 и 21 q21.1. Выявленные новые локусы аллельного дисбаланса при глиобластоме - 2q31.2, Зр25.1, 5ql4.3, 6р21.1, 7q21.2, 9q21.33, 12q21.33, 16p 13.12, 19p 13.2 - представляют собой потенциальные молекулярно-генетические маркеры прогноза течения заболевания и ответа на терапию. Кроме того, они определяют

участки хромосом, в которых может быть продолжен поиск генов-кандидатов опухолевых супрессоров, вовлеченных в этиопатогенез глиобластомы.

Показано, что определение статуса гена МСМТ путем исследования его экспрессии не может применяться в клинической практике, в связи с риском неправильного принятия решения об эффективности использования темозоломида при лечении конкретного пациента, поскольку экспрессия этого гена изменяется под влиянием хирургического вмешательства.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Потеря гетерозиготности хромосомного локуса 1СЦ23.3-26.3, содержащего гены-кандидаты РТЕЫ, РСРК2, МК167 и МСМТ, - частое молекулярное событие в патогенезе глиобластомы, выявляемое с частотой 62%; система из 20 микросателлитных маркеров локуса 10ц23.3-26.3 позволяет определять границы потери гетерозиготности.

2. Разработана и охарактеризована система для количественного микросателлитного анализа в реальном времени, позволяющая установить количественное изменение числа копий локуса 10ц23.3-26.3; потеря гетерозиготности локуса 10q23.3-26.3 при глиобластоме является отражением как делеции, так и однородительской дисомии.

3. Обнаружены новые хромосомные участки аллельного дисбаланса при глиобластоме: 2я31.2, Зр25.1, 5ц14.3, 6р21.1, 7я21.2, 9я21.33, 12я21.33, 16р13.12, 19р13.2, указывающие на области дальнейшего поиска генов, вовлеченных в этиопатогенез заболевания.

4. Аномальное метилирование ДНК неравномерно распределено по Срв-островку гена МвМТ - наибольшей частоте метилирования при глиобластоме подвержены Срв-динуклеотиды 38, 40, 43; общая частота метилирования промотора гена МСМТ сос тавляет 39%.

5. Потеря гетерозиготности области расположения гена МСМТ и метилирование его промотора являются независимыми событиями.

6. Уровень экспрессии гена МСМТ изменяется под влиянием хирургических манипуляций, что ставит под вопрос адекватность использования оценки экспрессии МСМТ как молекулярного маркера в клинической практике.

Степень достоверности результатов.

Достоверность полученных в ходе исследования результатов определяется значительным объемом материала, современными молекулярно-генетическими методами исследования, использованными в его обработке. Результаты исследования соответствуют данным зарубежной литературы. Разработанные новые технологии и предложенные гипотезы валидированы автором в экспериментах лично. Проведенный статистический анализ подтверждает достоверность сделанных выводов.

Апробация работы.

Материалы работы докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2012 г. (г. Нюрнберг, Германия), 2013 г. (г. Париж, Франция), 2014 г. (г. Милан, Италия); на Ежегодной конференции молодых ученых ФГБНУ «МГНЦ» в 2011 г., 2013 г. и 2014 г. (г. Москва, Россия); на I Международном российско-американском симпозиуме «Инновационные технологии в генетике и детской эпилептологии» в 2011 г. (г. Москва, Россия); на I Междисциплинарном конгрессе по заболеваниям органов головы и шеи в 2013 г. (г. Москва, Россия); на Всероссийской научно-практической школе-конференции для молодых ученых РАМН по онкологии

«Современная онкология: достижения и перспективы» в 2013 г. (г. Новосибирск, Россия), на конференции «Достижения и перспективы развития лабораторной службы России» в 2015 г. (г. Москва, Россия), на VII съезде Российского общества медицинских генетиков в 2015 г. (г. Санкт-Петербург, Россия).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности:

В соответствии с формулой специальности «03.02.07 - Генетика (биологические науки)», охватывающей проблемы изменчивости и наследственности, закономерности процессов хранения, передачи и реализации генетической информации на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровнях в области «Эпигенетика».

Личный вклад автора.

Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении молекулярно-генетических исследований, анализе клинических и лабораторных данных, статистической обработке полученных результатов. Автором лично разработаны: система микросателлитных маркеров для исследования потери гетерозиготности в локусе 10q23.3-26.3; система мультилокусной метил-чувствительной ПЦР для анализа статуса метилирования промотора гена MGMT; микросателлитные маркеры для исследования потери гетерозиготности в локусах 2q31.2, Зр25.1, 5ql4.3, 6р21.1, 7q21.2, 9q21.33, 12q21.33, 16pl3.12, 18ql 1.2, 19pl3.2 и 21q21.1 и метод количественного микросателлитного анализа в реальном времени для определения копийности геномных локусов при глиобластоме. Автором проанализированы современные данные отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации. Написание глав собственных исследований, обсуждение результатов и формулировка выводов выполнены автором самостоятельно.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 5 статей в центральных медицинских журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ, 7 работ в материалах конгрессов и конференций в РФ и 4 за рубежом.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 20 иллюстраций и состоит из следующих разделов: оглавление, список используемых сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, список используемой литературы. Библиографический указатель включает 153 источника, из них 4 отечественных и 149 - зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал для исследования.

Образцы ткани глиобластомы (ГБ) и образцы периферической крови получены от 163 пациентов с ГБ, прооперированных в ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» и ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздрава России.

Образцы периферической крови до операции, во время операции и через 7 дней после операции получены от 10 пациентов с ГБ и от 10 пациентов с раком молочной

железы (РМЖ), прооперированных в ФГБУ «Российский онкологический центр им. Н.Н. Блохина». Все пациенты при обследовании подписали письменное информированное согласие на добровольное участие в обследовании, на забор биологического материала и на публикацию данных о них в печати. Настоящее исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ «МГНЦ».

Методы исследования.

Экстракция геномной ДНК. Выделение геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили с помощью высаливания (Aljanabi S. et al., 1997). Геномную ДНК из свежезамороженного материала опухоли выделяли стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (Sambrook J. et al., 1989). Выделение геномной ДНК из архивного материала проводили с использованием коммерческого набора «QIAamp DNA FFPE Tissue Kit» («QIAGEN», Германия) по протоколу, рекомендованному производителем.

Экстракция РНК из лимфоцитов периферической крови проводилась методом кислофенольной экстракции с использованием набора «РИБО-золь-А» (ИнтерЛабСервис, г. Москва) по протоколу, рекомендованному производителем.

Реакцию обратной транскрипции (синтез кДНК) проводили методом случайного праймирования с использованием High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CIIIA) по протоколу, рекомендованному фирмой-производителем.

Микросателлитный анализ проводили с помощью ПЦР по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 2 мкМ MgCl2, 1 е.а. Taq-полимеразы, 2,5 мкл десятикратного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,4), деионизированной воды до 25 мкл. На смесь наслаивали 30 мкл вазелинового масла. Реакционную смесь прогревали 95°С в течение 5 минут и проводили 33 цикла ПЦР с параметрами: 94°С - 40 секунд, Т,™ - 40 секунд, 72°С - 40 секунд. Финальную элонгацию проводили при 72°С в течение 10 минут. Продукты ПЦР разделяли с помощью вертикального электрофореза в 8% ПААГ и окрашивали нитратом серебра.

Обработка геномной ДНК метилчувствительными рестриктазами Hpall и Hhal. Обработка геномной ДНК рестриктазами Hpall или Hhal проводилась по следующей схеме: к 1,5 мкг геномной ДНК добавляли 10 е.а. фермента и 2 мкл соответствующего 10х буфера, доводили до 20 мкл деионизированной водой и инкубировали 14-16 часов в термостате при температуре 37°С (для Hpall) и 56 °С (для Hhal).

Метил-чувствительная ПЦР (МЧ-ПЦР). Матрицей для МЧ-ПЦР служат продукты рестрикции Hpall или Hhal. Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ходе исследования разработаны мультилокусные ПЦР для трех пар праймеров, где один фрагмент принадлежал исследуемому гену, а два других служили в качестве положительного и отрицательного контроля. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 2 мкМ MgCl2, 1 е.а. Taq-полимеразы, 2,5 мкл десятикратного буфера ПЦР следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,4), 10% DMSO, 0,005 М p-меркаптоэтанола, деионизированной воды до 25мкл. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла. Реакционную смесь прогревали при 95°С в течение 10 минут и проводили 33 цикла ПЦР с параметрами: 94°С - 30 секунд, Тогж - 2 минуты 30 секунд. Финальную элонгацию проводили при 72°С в течение 10 минут. Продукты ПЦР

разделяли с помощью вертикального электрофореза в 8% ПААГ и окрашивали нитратом серебра.

ПЦР в режиме реального времени (Real-time ПЦР). Реакции ПЦР проводили в 96-луночных оптических плашках. Смесь для ПЦР объемом 30 мкл готовили с использованием 2Х TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) и зондов TaqMan (MGMT и внутренние контроли В2М и АСТВ) по протоколу, рекомендованному производителем. Все реакции проводились в трех повторностях при следующем температурном режиме: 50 °С - 2 мин; 95 °С - 10 мин; 40 циклов с параметрами 95 °С - 15 сек, 60 °С - 1 мин. Анализ результатов проводился методом ДДСТ с использованием программного обеспечения, предоставленного фирмой Bio-Rad (США).

Количественный микросателлитный аначиз в реальном времени - новый подход для определения числа копий геномных локусов. Принцип этого метода основан на ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan. В состав системы, так же как в классическом методе TaqMan ПЦР, входят специфические праймеры для амплификации исследуемого геномного локуса и зонд для детекции количества копий амплифицированного продукта. Однако в новом подходе в качестве зонда для детекции продукта используется олигомер, состоящий из 21 нуклеотида, комплементарный к (СА)п-повтору, а не к специфической последовательности ДНК. Следовательно, зонд способен к гибридизации с микросателлитными локусами, которые с достаточно высокой частотой распределены по всему геному, что позволяет исследовать практически любой геномный регион. Для всех исследуемых локусов зонд является одинаковым, специфическими являются только фланкирующие праймеры. Использование такого подхода позволяет изучать копийность ДНК различных локусов, содержащих микросателлитные (СА)п-повторы, используя при этом единственный универсальный TaqMan-зонд. Эндогенным контролем служит одновременная амплификация в одной лунке набора пар праймеров к 5-6 геномным локусам, содержащим микросателлитные (СА)п-повторы, и расположенным на различных хромосомах, нарушения копийности которых не характерны для исследуемой опухоли. Реакции ПЦР проводили в 96-луночных оптических плашках в термоциклере для ПЦР в реальном времени (Bio-Rad, USA) с использованием 5'-TGTGTGTGTGTGTGT-3'-зонда TaqMan, меченого флуоресцентным красителем VIC. Зонд синтезирован фирмой IDT, США. Конечный объем реакционной смеси для каждой реакции составлял 25 мкл, в том числе: 2Х TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) - 12,5 мкл, 0,2 мкМ каждого олигопраймера, 0,06 мкМ зонда, 0,1 мкг геномной ДНК. Эндогенный контроль и каждый из изучаемых локусов для каждого образца ДНК амплифицировали в отдельной лунке. Таким образом, для всех локусов для конкретного образца ДНК реакцию на эндогенный контроль проводили один раз. Все реакции проводили не менее чем в трех повторностях при следующем температурном режиме: 95 °С - 10 минут; 40 циклов с параметрами: 95 "С - 20 секунд, 55 °С - 20 секунд, 72 °С - 45 секунд. В качестве референсного образца использовалась смесь из ДНК лимфоцитов периферической крови 50 пациентов без злокачественных новообразований. Анализ результатов проводился методом ДДСТ с использованием программного обеспечения, предоставленного Bio-Rad (Ginzinger D. et al., 2000; Nigro J. et al., 2001).

Статистическая обработка результатов. Для изучения ассоциации между метилированием промотора гена MGMT и потерей гетерозиготности области его расположения использовали двухсторонний точный критерий Фишера. Для оценки значимости различий частот молекулярных событий в локусе 10q23.3-26.3 использовали критерий хи-квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование ПГ в локусе 1(Ц23.3-26.3, содержащем гены-кандидаты РТЕ1Ч, РСП*2, МК167 и МСМТ, при ГБ

Потеря гетерозиготности (ПГ) различных участков длинного плеча 10-й хромосомы является наиболее частым генетическим изменением при ГБ, выявляемым до 80% случаев. В локусах с ПГ предполагается наличие важных генов-супрессоров, вовлеченных в развитие опухоли. ПГ приводит к инактивации генов-супрессоров и, следовательно, является важным событием в канцерогенезе (На1а N. й а1., 2006; М1го§исЫ М. й а1., 2011). Кроме того, ПГ может сама по себе являться молекулярным маркером прогноза течения заболевания и ответа на терапию (Кузнецова Е. с соавт., 2013).

Особый интерес с точки зрения молекулярной генетики глиобластомы (ГБ) и возможности использования в качестве прогностического маркера представляют молекулярно-генетические изменения в локусе 10ч23.3-26.3, содержащем гены-кандидаты РТЕ.М, ГвРЯ2, МК167 и МСМТ.

Для исследования аллельного состояния локуса 10я23.3-26.3, содержащего гены-кандидаты /ТОЛ', FGF^f2, МК167 и МСМТ, разработана система микросателлитных маркеров (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика и расположение микросателлитных маркеров для анализа аллельного состояния локуса 10q23.3-26.3-

Микросателлитный маркер Единица повтора Расстояние до маркера Гетерозиготность маркера

РТЕ.\' (10ч23.3) 0105579 АС -193 тыс. п.н. проксимальнее РТЕЫ 12,1% (15/124)

01081765 АС -21 тыс. п.н. проксимальнее РТЕЫ 56,5% (70/124)

РТЕК-П АС 1интрон гена РТЕЫ 4,8% (6/124)

0108541 АС -263 тыс. п.н. дистальнее РТЕЫ 57,3 (71/124)

РТЕЫ-АСх24 АС -314 тыс. п.н. дистальнее РТЕЫ 52,4% (65/124)

0108185 АС -5,5 млн. п.н. дистальнее РТЕЫ 57,3% (71/124)

ЕОЕЯ2 (Щ26.13) РСР112-АСх16 АС 16интрон (последний) ЕСИН2 44,4% (55/124)

РОРК2-СТх19 СТ 4интрон ЕС1'К2 28,2% (35/124)

РОРК2-п)гЫ АС -126 тыс. п.н. дистальнее FGFЛ2 32,3% (40/124)

МК167 МК167 ААСТ -7 тыс. п.н. дистальнее МК167 53,2% (66/124)_

\fGMT (Щ26.3) 01081655 АС -309 тыс. п.н.проксиматьнее МСМТ 23,4% (29/124)

01081248 ССТТ -173 тыс. п.н.проксиматьнее МСМТ 32,3% (40/124)

МОМТ-АСх24 АС -161 тыс. п.н.проксиматьнее МСМТ 33,1% (41/124)

МвМТ-АС-П п(АС)-Т-т(АС) 1интрон МСМТ 55,6% (69/124)

\1GMT-GTX22 АС 2интрон МСМТ 40,3% (50/124)

1УЮМТ-АТх18 ТА 2интрон МСМТ 33,1% (41/124)

МОМТ-АС-21 п(АС)-С-т(АС) 2ннтрон МСМТ 46,8% (58/124)

\lGMT-TGxl9 АС -79 тыс. п.н. дистальнее МСМТ 48,4% (60/124)

0108505 АААТ -350 тыс. п.н.дистальнее МСМТ 46,0% (57/124)

0108169 АС -956 тыс. п.н. дистальнее МСМТ 58,1% (72/124)

Примечание: зеленым цветом выделены микросателлитные маркеры, относящиеся к области расположения гена РТЕЫ, оранжевым цветом - к области расположения гена FGFД2, фиолетовым - к области расположения гена МК167, синим - к области расположения гена МСМТ.

Система маркеров для выявления ПГ области расположения гена РТЕЫ включает 1 внутригенный (РТЕ№П) и 5 фланкирующих маркеров, 2 из которых расположены проксимальнее РТЕЫ (Ш08579, 01081765) и 3 дистальнее гена (0108541, РТГ:Ы-АСх24, 0108185). Система маркеров для анализа аллельного состояния области расположения

гена FGFЛ2 включает 2 внутригенных (РОГЯ2-АСх16 и ГОРЯ2-С'Гх19) и 1 фланкирующий маркер, расположенный дистальнее (FGFR2-right). Система

маркеров для выявления ПГ области расположения гена МК167 состоит из 1 маркера, расположенного дистальнее гена (МК167). Система маркеров для выявления ПГ области расположения гена \ЮШ включает 4 внутригенных (МОМТ-АС-П, МОМТ-ОТх22, МСМТ-АТх18, МОМТ-АС-21) и 6 фланкирующих, 3 из которых расположены проксимальнее гена (Ш0Я1655, 01081248, МОМТ-АСх24) и 3 дистальнее (1УЮМТ-ТОх19, 0108505,0108169).

Микросателлитный анализ проведен для образцов, полученных от 124 пациентов с ГБ. В качестве контроля использовалась геномная ДНК из лимфоцитов периферической крови пациентов. Вывод о наличии или отсутствии ПГ по каждому маркеру делали на основе разделения аллелей исследуемых микросателлитных повторов в ПААГ и сравнения интенсивностей сигналов ПЦР между ДНК опухоли и контроля. При использовании микросателлитного анализа информацию о ПГ можно получить только в случае, если исследуемый образец гетерозиготен (информативен) по нужному микросателлитному маркеру. На рис. 1 представлена электрофореграмма, демонстрирующая результаты микросателлитного анализа внутригенного маркера МОМТ-АС-2к

1н 1в 2к 2о Зи 3*

Примечание: в случае 1 в образцах нормы и опухоли в ПААГ присутствует только один фрагмент, соответствующий одному аллелю и свидетельствующий о неинформативном состоянии микросателлитного маркера. В случае 2 в ПЦР-пролуктах, полученных из ДНК крови и опухоли, детектируются по 2 аллеля сравнимой интенсивности, что говорит о гетерозиготном состоянии маркера и отсутствии ПГ. В 3 случае выявляется явное снижение интенсивности одного аллеля в опухолевом образце по сравнению с нормой, что указывает на ПГ.

Показатель гетерозиготности для каждого маркера определялся как отношение количества информативных случаев к общему числу образцов. Экспериментально определенные показатели гетерозиготности выбранных маркеров представлены в табл. 1 и на гистограмме на рис. 2.

Информативность микросателлитного анализа аллельного статуса определяется показателями гетерозиготности используемых микросателлитных маркеров. Информативность панели маркеров рассчитывалась как отношение количества образцов, в которых хотя бы один маркер из панели находится в гетерозиготном состоянии, к общему количеству образцов. Так 2 образца ГБ из 124 исследованных оказались гомозиготны по всем 6 микросателлитным маркерам для определения ПГ области расположения гена РТЕК Таким образом, информативность полной панели 6 микросателлитных маркеров для определения аллельного состояния области расположения гена РТЕИ составила 98,4%

н - ДНК нормальной ткани (из лимфоцитов периферической крови); о - ДНК опухоли; стрелкой указан ПЦР-продукт, ослабление интенсивности сигнала с одного из аллелей которого свидетельствует

о ПГ.

Рисунок 1. Пример электрофореграммы, демонстрирующей результаты микросателлитного анализа внутригенного маркера МОМТ-АС-2к

(122/124).

Рисунок 2. Гистограмма, отражающая показатели гетерозиготности микросателлитных маркеров для анализа аллельного состояния локуса 1(Ц23.3-26.3.

Примечание: зеленым цветом отмечены маркеры, использующиеся для выявления ПГ области расположения гена РТЕЩ оранжевым - гена РСРЯ2, фиолетовым - гена МК1-67 и синим - гена МСМТ.

Неинформативны по всем 3 маркерам для анализа аллельного состояния области расположения гена РСРЯ2 оказались 33 образца, следовательно, информативность полной панели маркеров составила 73,4% (91/124). Информативность панели 2 внутригенных маркеров для исследования аллельного статуса области расположения гена составила 59,7% (74/124).

Информативность маркера для определения ПГ области гена МК167 составила 53,2% (66/124). Информативность полной панели маркеров для анализа ПГ области расположения гена МСМТ составила 99,2% (123/124). Информативность панели 4 внутригенных микросателлитных маркеров - 84,7% (105/124). Информативность полной панели микросателлитных маркеров для исследования ПГ в локусе 10я23.3-26.3 составила 100% (табл. 2).

Таблица 2. Информативность панелей микросателлитных маркеров для исследования аллельного состояния областей расположения генов РТЕМ, РСРК2, МК167 и МСМТ.

Ген/локус Информативность панели внутригенных маркеров Информативность полной панели маркеров

РТЕИ{ 10я23.3) 4,8% (6/124) 98,4% (122/124)

59,7% (74/124) 73,4% (91/124)

МК167 (10я26.2) - 53,2% (66/124)

МСМТ (\0q26.3) 84,7% (105/124) 99,2% (123/124)

10я23.3-26.3 - 100% (124/124)

На рис. 3 представлены результаты микросателлитного анализа ПГ локуса 10а23 326.3.

Доля образцов с ПГ, относительно числа информативных (гетерозиготных в нормальных парах) образцов, составила для области расположения гена РТЕИ 53,3% (65/122); области расположения гена РвРК2 - 56,0% (51/91), области расположения гена МК167 - 60,6% (40/66) и области расположения гена МвМТ - 60,2% (74/123). Доля образцов с выявленной ПГ в локусе 10ц23.3-26.3 составила 62,1% (77/124) (табл. 3).

Рисунок 3. Состояние микросателлитных маркеров в исследованной выборке ГБ. Примечание: белым цветом отмечено гетерозиготное состояние маркера в опухоли, серым -неинформативное (гомозиготное в лимфоцитах периферической крови), черным - ПГ по конкретному маркеру.

Таблица 3. Частоты ПГ областей расположения генов РТЕЫ, МК167 и МОМТ при

глиобластоме.

Ген/локус Частота ПГ

Р7ЕУ(10Ч23.3) 53,3% (65/122)

ТОта2(10ч26.13) 56,0% (51/91)

МК167 (10я26.2) 60,6% (40/66)

МЗМГ (10я26.3) 60,2% (74/123)

10я23.3-26.3 62,1% (77/124)

Для образцов с выявленной ПГ в локусе 10я23.3-26.3 охарактеризованы следующие особенности границ ПГ. В 84,4% (65/77) образцов с выявленной ПГ размер участка ПГ содержал области расположения всех 4 изучаемых генов, то есть включал весь исследуемый локус 10я23.3-26.3 (около 43 млн. п.н.). В 10,4% (8/77) случаев размер участка ПГ включал области расположения генов РОЕК2, МК167 и МОМТ (около 9 млн. п.н.) и не включал область расположения гена РТЕЫ. В 2,6% (2/77) случаев участок ПГ включал области расположения генов РТЕЫ, РОРВ.2 и МК167 и не включал маркеры области расположения гена МОМТ. В 2,3% (2/77) случаев выявлена ПГ только области

расположения гена МСМТ (около 1,6 млн. п.н.). Таким образом, наиболее часто ПГ на длинном плече 10-й хромосомы при ГБ затрагивает протяженный участок, включающий локус 10я23.3-26.3, однако с меньшей частотой может происходить потеря различных более коротких участков хромосомы. Другими авторами на 10я при ГБ выделено два региона, в которых наиболее часто выявляется потеря: 10я23-24 и 10я25-р1сг (Ри]Чза\\'а Н. е1 а1„ 1999; На1а N. й а1„ 2006).

Исследование числа копий локуса 10я23.3-26.3 в образцах с выявленной ПГ.

Определение ПГ с помощью микросателлитного анализа является доступным и надежным подходом. Однако ПГ отражает только наличие аллельного дисбаланса в исследуемой области, то есть констатирует изменение числа копий аллелей, но при этом не уточняет, является ли это увеличением или уменьшением копийности одного из аллелей (Mizoguchi М. е1 а1., 2011).

Для установления количественного изменения числа копий локуса 10я23.3-26.3 в образцах с выявленной ПГ в этом районе разработана система для количественного микросателлитного анализа (КМА) в реальном времени.

Разработка системы эндогенного контроля для КМА в реальном времени.

При выборе микросателлитных маркеров, которые могут использоваться в качестве эндогенных контролей копийности ДНК в ГБ при использовании КМА в реальном времени применяли два основных критерия:

1) Микросателлитный повтор должен находиться в хромосомном сегменте, для которого ранее не описана ПГ при ГБ;

2) Повтор должен иметь структуру (СА)п, где п>14, причем структура повтора должна быть совершенной на всем протяжении и не содержать перебивок для эффективного отжига зонда.

Таким образом, для разработки системы эндогенного контроля для КМА в реальном времени отобрано 11 микросателлитных повторов, расположенных в следующих хромосомных локусах: 2я31.2, Зр25.1, 5я14.3, 6р21.1, 7я21.2, 9я21.33, 12ч21.33, 16р13.12, 18ц11.2, 19р 13.2, 21ц21Л, в которых ранее не описано случаев нарушения копийности при ГБ. Ни один из выбранных локусов не связан с развитием ГБ согласно ОМ1М. Также, для контроля репрезентативности выборки, проанализированы дополнительно 2 хромосомных сегмента: 8ц21.3 и 14ц 13.3, случаи аллельного дисбаланса в которых описаны в работах других авторов (Ригпап Б. ^ а1., 2007).

С помощью микросателлитного анализа исследовано аллельное состояние всех 13 выбранных микросателлитных маркеров в выборке ГБ из 124 образцов. Результаты исследования представлены на рис. 4.

Случаев аллельного дисбаланса не выявлено лишь для 2 из 13 исследованных маркеров, расположенных в локусах 18я11.2 и 21ц2\.\, во всех остальных геномных участках выявлены случаи аллельного дисбаланса с различными частотами (табл. 4). Частота аллельного дисбаланса для каждого маркера рассчитывалась как отношение количества образцов с аллельным дисбалансом к числу информативных образцов (гетерозиготных в нормальных парах). Наибольшие частоты дисбаланса выявлены в локусах Зр25.1 (16,3%), 5Я14.3 (10,3%), 7Ч21.2 (29,0%), 16р13.12 (10,3%), 19р13.2 (16,7%). В локусах 8я21.3 и 113.3 аллельный дисбаланс определен с частотами 15,6% и 36,7%, соответственно, что совпадает с результатами других авторов (Ригпап Б. е1 а1., 2007).

Примечание: белым цветом отмечено гетерозиготное состояние маркера в опухоли, серым -неинформативное (гомозиготное в лимфоцитах периферической крови), черный цвет обозначает аллельный дисбаланс по конкретному маркеру.

Таблица 4. Частоты аллельного дисбаланса в хромосомных локусах, выбранных для эндогенного контроля для КМА в реальном времени, и предполагаемые гены-кандидаты, расположенные в этих участках.

Микросателлитный маркер Частота аллельного дисбаланса в информативных образцах Возможные гены-кандидаты Расстояние до микросателлитного маркера

2я31.2-18хТС 5,0% (1/20) ТТЫ Внутригенный повтор

Зр25.1-22хТО 16,3% (8/49) БЬСбАб 125 тыс. п.н.

5я14.3-17хАС 10,3% (3/29) - —

6р21.1-16хОТ 4,5% (4/89) БиРТЗН Внутригенный повтор

7я21.2-15хТС 29,0% (18/62) АКАР9 Внутригенный повтор

9я21.33-15хвТ 6,3% (4/64) гсснсб 335 тыс. п.н.

12я21.33-АС 5,6% (1/18) осы 500 тыс. п.н.

16р13.12-19хТО 10,3% (6/58) МКЬ2 50 тыс. п.н.

18с]П.2-17хАС 0% (0/23) - -

19р13.2-19хСТ 16,7,0% (10/60) РШ1 2 тыс. п.н.

21ч21.1 -15хТй 0% (0/21) - -

Для каждого маркера определена его полезность в качестве эндогенного контроля, определяемая по следующей формуле: (Кол-во инф. случаев - Кол-во случаев ПГ)/ Общее кол-во образцов.

Наибольшая полезность выявлена для 6 микросателлитных маркеров: Зр25.1-22хТО (33,1%), 6р21.1-!6хОТ (68,5%), 7ч21.2-15хТС (35,5%), 9Ч21.33-15хОТ (48,4%), 16р13.12-19хТС (41,9%), 19р13.2-19хСТ (40,3%). Таким образом, вышеперечисленные 6 маркеров отобраны для системы эндогенного контроля КМА в реальном времени (рис. 5).

68,50%

48,40%

Рисунок 5. Полезность микросателлитного маркера в качестве эндогенного контроля для КМА в реальном времени.

Примечание: красным цветом отмечены маркеры, отобранные для эндогенного контроля, синим цветом - маркеры, которые не выбраны для эндогенного контроля.

Как показывают результаты исследования аллельного дисбаланса в локусах, отобранных для эндогенного контроля, недостаточная изученность изменения копийности хромосомных участков при ГБ делает задачу поиска областей конститутивно нормальной копийности нетривиальной, поскольку не описанные ранее участки генома могут характеризоваться довольно выраженными частотами аллельного дисбаланса, ассоциированного с ГБ. Аллельный дисбаланс в исследованных локусах может быть как самостоятельным маркером нестабильности генома при ГБ, так и указанием на возможную вовлеченность генов, расположенных в этих регионах или находящихся рядом с этими областями, в процессы канцерогенеза.

Отбор генов-кандидатов в новых областях аллельного дисбаланса при ГБ проводили исходя из расстояния между генами и изученными микросателлитнымм повторами, с учетом известных функций генов (участие в сигнальных путях, вовлеченных в онкогенез, регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки, экспрессии генов) и анализа публикаций, указывающих на возможную роль генов в развитии злокачественных новообразований. В качестве максимального расстояния между микросателлитным маркером, для которого показан аллельный дисбаланс, до возможного гена-кандидата выбрали 500 тыс. п.н., исходя из того, что протяженность участков аллельного дисбаланса в опухолевых геномах, как правило, превышает 1 млн. п.н. (Abkevich V. et al., 2012; Cairncross J. et al., 1998; Harris T. et al., 2011). Возможные гены-кандидаты, расположенные в областях с выявленным аллельным дисбалансом представлены в табл. 4.

Таким образом, обнаружено 9 новых локусов аллельного дисбаланса при ГБ: 2q31.2, Зр25.1, 5ql4.3, 6р21.1, 7q21.2, 9q21.33, 12q21.33, 16р13.12 и 19pl3.2, в которых другими

авторами прежде не было описано этого явления. Также выявлен аллельный дисбаланс в локусах 8ц21.3 и 14с"] 13.3 с частотами, соответствующими результатам других исследователей, что говорит о репрезентативности выборки, исследованной в настоящей работе. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения ГБ на молекулярно-генетнческом уровне. Выявленные новые участки аллельного дисбаланса при ГБ представляют собой потенциальные молекулярно-генетические маркеры прогноза течения заболевания и ответа на терапию, а также могут содержать гены-кандидаты, играющие роль в этиопатогенезе ГБ.

Определение числа копий локуса Юс/23.3-26.3 методом КМА в реальном времени.

КМА в реальном времени проведен для 64 образцов с выявленной ПГ. Для проведения КМА выбрано 6 микросателлитных маркеров: 01081765, 0108185, ГСРЯ2-АСх16, 01081655, МОМТ-ТОх19 и ОЮ8169, использованных ранее для микросателлитного анализа (табл. 1). Выбор маркеров для исследования копийности локуса 10я23.3-26.3 определялся, как и для маркеров эндогенного контроля, исходя из наличия повтора структуры (СА)п, где п>14. Результаты КМА в реальном времени приведены на рис. 6.

№МОТ Тб»1!

Рисунок 6. Результаты КМА в реальном времени.

Примечание: синим цветом отмечены локусы с делецией; оранжевым цветом - локусы с неизмененной копийностью (ОРД), зеленым цветом отмечены локусы, в которых с помощью микросателлитного анализа не выявлено ПГ в образце.

Для определения значения копийности, отличающейся от копийности нормальной ДНК, для каждого из выбранных локусов рассчитали порог. Выборку образцов с нормальной копийностью в локусе сформировали на основе образцов, которые по результатам микросателлитного анализа показали отсутствие аллельного дисбаланса. На основании значений КМА в реальном времени в этой выборке образцов определили

толерантный интервал значений, соответствующих нормальной копийности (Оишгщег О. е1 а1„ 2000).

С помощью КМА в реальном времени в 37,5% (24/64) образцов с выявленной ПГ определена одна копия ДНК по всем исследованным микросателлитным маркерам, то есть, определена делеция локуса 10q23.3-26.3- В 25,0% (16/64) образцов с выявленной ПГ выявлено две копии ДНК по всем исследованным микросателлитным маркерам, то есть, определена однородительская дисомия (ОРД) в исследуемом локусе. В остальных 37,5% (24/64) образцов выявлены локусы как с одной копией ДНК, так и с двумя копиями (рис. 6).

80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00%

У

- Делеция

■Г

-ОРД

лХГ

Рисунок 7. График, отражающий изменение частоты делеции и ОРД в исследованных микросателлитных локусах.

В табл. 5 приведены частоты делеции и ОРД для каждого из исследованных микросателлитных локусов.

Таблица 5. Частоты делеции и ОРД для исследованных микросателлитных локусов.

Локус 01 ОБ 1765 0105185 РОРК2-АСх16 01Ов1655 МОМТ-ТОх19 О108169

Частота 71,4% 66,1% 68,4% 55,7% 47,6% 46,0%

делеции (40/56) (37/56) (41/60) (34/61) (30/63) (29/63)

Частота 28,6% 33,9% 31,7% 44,3% 52,4% 54,0%

ОРД (16/56) (19/56) (19/60) (27/61) (33/63) (34/63)

Таким образом, с помощью КМА в реальном времени показано, что ПГ в локусе 10ц23.3-26.3 может быть отражением как делеции, так и ОРД. Кроме того, делеции и ОРД может подвергаться не только целый локус 10ц23.3-26.3, но в нем могут присутствовать как участки с делецией, так и участки с ОРД. Наибольшая частота делеций характерна для участков, расположенных в проксимальной части локуса \0q23.3-26.3 (01081765, 0105185, РОРЯ2-АСх16), а наибольшая частота ОРД - для маркеров 01081655, МвМТ-Твх19 и 0108169, расположенных в дистальной его части (рис. 7). Различие распределений частот молекулярных событий в проксимальном и дистальном районах достоверно (р=0,00002). Обнаружено также достоверное различие частот встречаемости делеций и ОРД в проксимальном и дистальном районах изучаемого локуса (р=0,0002).

В случае ПГ ОРД в области расположения гена MGMT наблюдается достоверно чаще, чем в области расположения гена PTEN и FGFR2, где, в свою очередь, достоверно чаще наблюдается деления (р=0,00002).

Следовательно, в локусе 10q23.3-26.3 происходит переход от делении в областях расположения генов PTEN и FGFR2 к однородительской дисомии в области расположения гена MGMT {рис. 7).

Согласно двухударной модели Knudson А., делеция может быть одним из двух событий, приводящих к инактивации генов-супрессоров опухолевого роста (Залетаев Д. с соавт., 2009). Считается, что при ОРД, как правило, делегируется нормальный аллель, а измененный аллель удваивается, что приводит к инактивации генов-супрессоров, расположенных в таких участках.

Анализ метилирования промотора гена MGMT.

Метилирование CpG-островка промотора гена MGMT является наиболее важным и хорошо изученным способом его инактивации (Стрельников В. с соавт., 2011). В настоящее время метилирование промоторной области гена MGMT считается основным клиническим маркером благоприятного ответа пациентов с ГБ на терапию темозоломидом (Bady P. et al„ 2012; Gilbert М. et al„ 2011).

CpG-островок промотора гена MGMT имеет длину 777 п.н., состоит из 97 CpG-динуклеотидов (рис. 8) (Burgess R. et al., 2008; Cankovic M. et al., 2013).

Рисунок. 8. Схема СрО-островка гена A/GAЯ'(Nakagawachi Т. е1 а1., 2003, с изменениями). Примечание: фиолетовым цветом отмечены СрО-динуклеотиды, анализируемые при использовании рестриктазы Нра11\ СрО: 35, 39, 45, 49, 55, 71, зеленым цветом отмечены СрО-динуклеотиды, анализируемые при использовании рестриктазы НИак Срв: 38, 40, 43, 53, 54, 58, 59, 70, 73, 81. МОМТ-Ь, МОМТ-М, МОМТ-Я - области СрО-островка гена МСМТ, выбранные для исследования с помощью рестриктазы НИа1.

Несмотря на то, что метилирование СрО-островка гена МСМТ при ГБ подробно изучалось, до сих пор не известно, какие конкретно СрО-динуклеотиды оказывают наибольшее влияние на функциональную активность гена и, следовательно, должны исследоваться в клинических тестах (Ма11еу О.Б. й а1., 2011).

Для анализа статуса метилирования СрО-островка промотора гена МСМТ разработана система мультилокусной метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР) с использованием рестриктазы НраП. Метод МЧ-ПЦР достаточно прост в исполнении и не

Промотор с максимальной активностью

требует обработки ДНК бисульфитом натрия, что позволяет работать с материалом из парафиновых блоков. Большим достоинством метода является высокая, позволяющая анализировать метилированные аллели в присутствии большого избытка аллелей дикого типа, чувствительность (аналитическая чувствительность - 1 метилированная последовательность на 2000 неметилированных). Единственным недостатком этого метода является то, что могут быть проанализированы только СрО-динуклеотиды, попадающие в сайт узнавания конкретной рестриктазы (Залетаев Д. с соавт., 2009). В качестве внутреннего контроля МЧ-ПЦР используется констутивно метилированный участок гена СиХ1. Для контроля полноты гидролиза используется констутивно неметилированный фрагмент гена 57МЯК (рис. 9).

К 1а 1р 2н 2р Зн Зр М

Рисунок 9. Определение статуса метилирования CpG-островка промотора гена MGMT. Примечание: М - маркер молекулярного веса PUC19/MspI; р - ДНК после гидролиза рестриктазой Hpall, н - ДНК, не гидролизованная Hpall. Выявлено метилирование промотора гена MGMT в образце №1 и отсутствие метилирования в остальных образцах.

Область CpG-островка гена MGMT, выбранная для исследования с помощью МЧ-ПЦР, содержит 6 CpG-динуклеотидов, входящих в сайт узнавания рестриктазы Hpall (CpG: 35, 39, 45, 49, 55, 71) (рис. 8). С помощью МЧ-ПЦР исследован статус метилирования промоторной области гена MGMT 163 образцов ГБ. Частота метилирования в исследованной выборке ГБ составила 12,9% (21/163). Обнаруженная частота метилирования ниже частот, приводимых в работах других авторов, которые составляют от 35% до 75% (Brandes A. et al., 2008; Dunn J. Et al., 2000; Esteller M. et al., 2000; Hegi M. et al., 2005; Zawlik I. et al., 2009). Причина может быть связана с тем, что в разных исследованиях анализируются разные CpG-динуклеотиды, входящие в состав CpG-островка гена MGMT. Кроме того, это может отражать гетерогенность паттерна метилирования промотора гена MGMT при ГБ (Riemenschneider М. et al., 2010).

Для проверки предположения выбрана другая метилчувствительная рестриктаза -Hhal. В исследуемом участке промотора гена MGMT число CpG-динуклеотидов, входящих в сайт узнавания этой рестриктазы, составило 10 штук: CpG: 38, 40, 43, 53, 54, 58, 59, 70, 73, 81. Поскольку наличие хотя бы одного неметилированного CpG-динуклеотида в составе сайтов узнавания используемой рестриктазы приведет к гидролизу матрицы, было решено разбить исследуемый участок промотора гена MGMT на более короткие участки, для того, чтобы в каждый из них попало меньше сайтов рестрикции Hhal: MGMT-L (CpG: 38, 40, 43), MGMT-M (CpG: 53, 54, 58, 59) и MGMT-R (70, 73, 81) (рис. 8). В качестве внутреннего контроля МЧ-ПЦР используется констутивно метилированный участок гена CUX1. Для контроля полноты гидролиза используется констутивно неметилированный фрагмент гена ING1.

При использовании такой системы метилирование обнаружено в 41 образце из 142, в которых не выявлено метилирование промотора гена MGMT, с помощью системы с использованием Hpall. В 9 образцах из 21, в которых выявлено метилирование с

использованием Нра11, при использовании новой системы метилирования не обнаружено. В 12 образцах выявлено метилирование при использовании обеих рестриктаз.

В исследованной выборке ГБ частота метилирования области МОМТ-Г. составила 24,5% (40/163), области МСМТ-М - 16,6% (27/163), области МОМТ-К - 15,3% (25/163). В целом, частота метилирования исследуемой области составила 39,3% (64/163), что сопоставимо с результатами других авторов (табл. 6). Таким образом, при разработке генетического теста для определения метилирования промоторной области гена МСКТТ значение имеет выбор конкретных СрО-динуклеотидов.

Таблица 6. Частота метилирования Срв-островка гена МСМТ.

MGMT (Hpall) MGMT-L (Hhal) MGMT-M (Hhal) MGMT-R (Hhal) MGMT (в целом)

Частота метилирования 12,9% (21/163) 24,5% (40/163) 16,6% (27/163) 15,3% (25/163) 39,3% (64/163)

Комплексная оценка молекулярных повреждений гена MGMT при ГБ.

Метилирование промоторной области гена MGMT является важнейшим и наиболее ранним механизмом его инактивации (Стрельников В. с соавт., 2011). Показано, что частота метилирования CpG-островка промотора MGMT в исследованной выборке ГБ составила 39,3%. Согласно модифицированной двухударной модели Knudson А. метилирование может быть одним из событий, приводящих к инактивации генов-супрессоров опухолевого роста (Залетаев Д. с соавт., 2009). Другим событием, приводящим к инактивации гена MGMT, может быть ПГ области его расположения. Частота ПГ области расположения гена MGMT в исследованной выборке составила 60,2%. При этом в 30 образцах из 63 (47,6%) исследованных с помощью КМА в реальном времени ПГ области гена MGMT являлась делецией (то есть утрата копии одного из аллелей), а в 33 образцах из 63 (52,4%) - ОРД (утрата копии одного из аллелей и восстановление нормальной копийности за счет дупликации участка оставшегося аллеля).

С помощью двустороннего тест Фишера проведена оценка ассоциации между метилированием промотора гена MGMT и ПГ области его расположения. Ассоциации между этими двумя величинами не обнаружено. Также не выявлено ассоциации между метилированием промотора гена MGMT и делецией области его расположения или ОРД.

Таким образом, метилирование промоторной области гена MGMT и делеция области его расположения являются независимыми событиями, приводящими к инактивации этого гена.

Считается, что, как правило, при ОРД делегируется нормальный аллель, а измененный аллель удваивается, что приводит к инактивации генов-супрессоров, расположенных в таких участках (Makishima H. et al., 2011; Yin D. et al., 2009). Поскольку никаких других форм молекулярной патологии в гене MGMT, кроме метилирования его промоторной области, не описано при ГБ и не выявлено ассоциации между метилированием промотора этого гена и ОРД области его расположения, вероятно, ОРД нельзя рассматривать как один из механизмов инактивации гена MGMT.

Исследование влияния хирургического вмешательства на экспрессию гена MGMT.

Известно, что хирургические манипуляции приводят к повышению экспрессии ряда, так называемых, стресс-активируемых генов (Dash A. et al., 2002; Li J. et al., 2012; Lin D. et al., 2006). В настоящее время в «золотой стандарт» лечения пациентов с глиобластомой

входит максимально возможная хирургическая резекция опухоли (Clarke J. et al., 2009; Minniti G. et al., 2011). Поскольку уровень экспрессии мРНК гена MGMT, наряду с метилированием промотора гена, на сегодняшний день является одним из общепризнанных критериев для определения генетического статуса MGMT, актуальным является исследование влияния хирургического вмешательства на уровень экспрессии этого гена (Preusser М., 2009).

В настоящее время показано, что экспрессия MGMT в лимфоцитах крови здоровых людей непостоянна и подчиняется циркадным ритмам (Marchenay С. et al., 2001).

Для исследования влияния хирургического вмешательства на экспрессию гена MGMT проведена оценка и сравнение уровня экспрессии гена в лимфоцитах периферической крови пациентов с ГБ, а также РМЖ в динамике: до операции, интраоперационно и через 7 дней после операции. В качестве материала исследования использована периферическая венозная кровь пациентов, поскольку получить материал мозга и молочной железы в исследуемые временные промежутки не представляется возможным. Однако можно предположить, что под действием хирургического вмешательства (стресса) активация «хирургически-индуцируемых» генов происходит во всех клетках организма в той или иной степени. Забор крови пациентов до операции проводился приблизительно в одно время - между 9 и 10 часами утра.

Анализ экспрессии гена MGMT методом ПЦР в реальном времени в лимфоцитах периферической крови до операции, интраоперационно и через 7 дней после операции проведен для 10 пациентов с ГБ, а также для 10 пациентов с РМЖ. Для стандартизации уровня экспрессии MGMT в каждом отдельно взятом образце в качестве эндогенного контроля использовали гены «домашнего хозяйства» В2М и АСТВ, имеющие стабильную экспрессию в процессе жизнедеятельности клетки. Количественное определение уровня экспрессии мРНК гена MGMT в лимфоцитах периферической крови в образцах, взятых интраоперационно и после операции, для каждого пациента проводили относительно уровня экспрессии мРНК MGMT в образце до операции. Каждый образец исследовали в трех повторностях.

Уровень экспрессии гена MGMT в образцах лимфоцитов периферической крови пациентов с ГБ и пациентов с РМЖ до операции приведены на рис 10 и рис. 11, соответственно.

' 1.||||||||

123456789 10 № образца

Рисунок 10. Гистограмма, отражающая уровень экспрессии транскриптов гена МСМТ в лимфоцитах периферической крови пациентов с ГБ за 1 час до операции. Примечание: количественное определение уровня экспрессии мРНК гена проводили относительно уровня экспрессии мРНК гена МСМТ в образце № 1.

л а « ■

Рисунок 11. Гистограмма, отражающая уровень экспрессии транскриптов гена МСМТ в лимфоцитах периферической крови пациентов с РМЖ за 1 час до операции. Примечание: количественное определение уровня экспрессии мРНК гена проводили относительно уровня экспрессии мРНК гена МСМТ в образце № 1.

Анализ уровня экспрессии мРНК гена МСМТ за 1 час до операции выявил его колебания в образцах лимфоцитов периферической крови пациентов с ГБ и пациентов с РМЖ в пределах, значительно превышающих уровни суточных различий в экспрессии гена (МагсЬепау С. й а1., 2001). Начальный уровень экспрессии гена МСМТ в лимфоцитах периферической крови пациентов с РМЖ, в среднем, в 2 раза выше уровня экспрессии гена в лимфоцитах периферической крови пациентов с ГБ. Такую картину, вероятно, можно объяснить влиянием гормонального фона у больных с РМЖ, поскольку все пациенты в исследованной группе с РМЖ женского пола, а в группе с ГБ - только мужского.

На гистограмме (рис. 12) представлены значения уровней экспрессии транскриптов гена МСМТ у пациентов с ГБ за 1 час до операции, интраоперационно и через 7 дней после операции. Анализ экспрессии МСМТ показал у всех 10 исследованных пациентов с ГБ повышение экспрессии гена МСМТ в среднем почти в 3 раза уже в процессе операции по сравнению с экспрессией гена до операции. Анализ экспрессии гена МСМТ через 7 дней после операции выявил у 8 из 10 пациентов дальнейшее повышение экспрессии гена, а у 2 пациентов снижение его экспрессии, относительно интраоперационной экспрессии гена.

пил

1 23456789 10

№ образца

Рисунок 12. Гистограмма, отражающая изменение уровня экспрессии мРНК гена МСМТ в лимфоцитах периферической крови пациентов с ГБ за 1 час до операции (зеленый цвет), во время операции (синий цвет) и через 7 дней после операции (красный цвет).

Анализ экспрессии гена МСМТ у 10 пациентов, оперированных по поводу РМЖ, показал у 4 пациентов повышение экспрессии мРНК транскриптов МСМТ в крови и у 6

пациентов снижение экспрессии гена в процессе операции по сравнению с экспрессией гена до операции. Через 7 дней после операции у 5 пациентов наблюдалось повышение экспрессии гена, у остальных 5 - снижение по сравнению с экспрессией во время операции (рис. 13).

Рисунок 13. Гистограмма, отражающая изменение уровня экспрессии мРНК гена МОИТ в лимфоцитах периферической крови пациентов с РМЖ за 1 час до операции (зеленый цвет), во время операции (синий цвет) и после операции (красный цвет).

Такие различия в картинах экспрессии гена М7МГ у пациентов с ГБ и РМЖ могут быть связаны, во-первых, с различиями в хирургических манипуляциях при резекции этих двух типов опухолей, а, во-вторых, с влиянием гормонального фона у больных с РМЖ. Все пациенты в исследованной группе с РМЖ женского пола, а в группе с ГБ - только мужского.

Таким образом, МСМТ является стресс-активируемым геном, экспрессия которого изменяется под влиянием хирургических манипуляций. Полученные результаты могут ставить вопрос об адекватности использования определения статуса гена МСМТ путем исследования его экспрессии, в связи с риском неправильного принятия решения об эффективности использования темозоломида при лечении конкретного пациента. Более точным генетическим тестом, не зависящим от хирургического вмешательства, служит исследование метилирования промотора гена МСМТ.

ВЫВОДЫ

1. Потеря гетерозиготности хромосомного локуса 10ц23.3-26.3, содержащего гены-кандидаты РТЕЫ, РСРЯ2. МК167 и МСМТ. - частое молекулярное событие в патогенезе глиобластомы, выявляемое с частотой 62%. В подавляющем большинстве случаев (84%) область потери гетерозиготности охватывает весь исследованный локус, в 16% образцов глиобластомы наблюдается потеря гетерозиготности более коротких участков.

2. При глиобластоме потеря гетерозиготности хромосомного локуса 10я23.3-26.3 может являться как отражением его делеции (37,5%), так и однородительской дисомии (25%). В 37,5% опухолей участки делеции и однородительской дисомии чередуются на протяжении исследованного локуса, причём в его проксимальной части (гены РТЕЫ, РСРЯ2) выше частота делеций, в дистальной (ген МСМТ) -однородительской дисомии. Переход от области делеции к области однородительской дисомии происходит в сегментах 10я26.1 - 10я26.2.

3. Впервые для глиобластомы обнаружен аллельный дисбаланс хромосомных участков 2q31.2, Зр25.1, 5ql4.3, 6р21.1, 7q21.2, 9q21.33, 12q21.33, 16р13.12, 19pl3.2, с частотами от 5% до 29%, что свидетельствует о недостаточной изученности глиобластомы на молекулярно-генетическом уровне и указывает на области поиска новых генов, вовлеченных в этиопатогенез заболевания.

4. Частота аномального метилирования CpG-островка гена MGMT при глиобластоме составила 39%. Аномальное метилирование ДНК распределено по CpG-островку гена MGMT неравномерно. Наибольшая частота метилирования отдельных CpG-динуклеотидов при глиобластоме составляет 25%.

5. Потеря гетерозиготности области расположения гена MGMT и метилирование его промотора являются независимыми событиями, что позволяет рассматривать потерю гетерозиготности гена MGMT как потенциальный дополнительный маркер прогноза течения заболевания и ответа на терапию.

6. Экспрессия гена MGMT изменяется под влиянием хирургического лечения, что ставит под вопрос адекватность использования оценки экспрессии MGMT как молекулярного маркера в клинической онкологической практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявленные новые участки аллельного дисбаланса при глиобластоме представляют собой потенциальные молекурно-генетические маркеры прогноза течения заболевания и ответа на терапию, а также могут содержать гены-кандидаты, играющие роль в этиопатогенезе этой опухоли. Определение новых локусов аллельного дисбаланса при глиобластоме свидетельствует об актуальности продолжения изучения этой опухоли на молекулярно-генетическом уровне для лучшего понимания изменений, лежащих в основе развития этого злокачественного новообразования.

2. Высокая частота потери гетерозиготности гена MGMT и независимость событий потери гетерозиготности и аномального метилирования промотора MGMT при глиобластоме требуют подробного изучения потери гетерозиготности как потенциального маркера чувствительности опухоли к алкилирующим химиопрепаратам.

3. Продемонстрированная зависимость экспрессии MGMT от хирургических манипуляций, ставит вопрос об адекватности использования этого показателя для оценки статуса гена в клинической практике, в связи с риском неправильного принятия решения об эффективности использования темозоломида при лечении конкретного пациента. Более точным генетическим тестом, не зависящим от факта хирургического вмешательства, является исследование метилирования промотора гена MGMT.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Стрельников В.В. Делеции области расположения гена MGMT на хромосоме 10q26.3 в глиомах /В.В. Стрельников, A.C. Малышева, В.В. Землякова, Е.Б. Кузнецова, Е.А. Алексеева, A.B. Смолин, Е.В. Прозоренко, Д.В. Залетаев // Молекулярная медицина. -2011.-№ 2.-С. 28-31.

2. Алексеева Е.А. Молекулярно-генетическая дифференциальная диагностика опухолей головного мозга / Е.А. Алексеева, Ю.В. Горбачева, О.В. Бабенко, В.В. Землякова, Е.Б. Кузнецова, A.B. Смолин, Е.В. Прозоренко, Д.В. Залетаев, В.В. Стрельников // Медицинская генетика.-2012.-Т. 11.-№ 1.-С. 10-14.

3. Алексеева Е.А. Молекулярно-генетическая диагностика в таргетной терапии опухолей головного мозга / Е.А. Алексеева, М.В. Шубина, Ю.В. Горбачева, О.В. Бабенко,

B.B. Землякова, Е.Б. Кузнецова, A.B. Смолин, Е.В. Прозоренко, Д.В. Залетаев, В.В. Стрельников //Медицинская генетика. -2012.-Т. 11. -№ 2.-С. 3-10.

4. Алексеева Е.А. Анализ аллельного дисбаланса при глиобластоме: новые хромосомные участки потери гетерозиготности и новые гены-кандидаты / Е.А. Алексеева,

A.C. Танас, Е.В. Прозоренко, A.M. Зайцев, О.Н. Кирсанова, А.Е. Самарин, Д.В. Залетаев,

B.В. Стрельников // Медицинская генетика. - 2014. -№11. - С. 41-46.

5. Алексеева Е.А. Влияние хирургического вмешательства на экспрессию гена Об-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) / Е.А. Алексеева, A.C. Танас, Е.В. Прозоренко, Е.В. Подцубская, О.П. Сотникова, С.С. Степаненкова, Д.В. Залетаев, В.В. Стрельников // Медицинская генетика. - 2015. - №6. - Т. 14. - С. 3-8.

Публикации в других изданиях:

6. Алексеева Е.А. Молекулярно-генетическая диагностика опухолей головного мозга / Е.А. Алексеева, М.В. Шубина, В.В. Землякова, Е.Б. Кузнецова, A.B. Смолин, Е.В. Прозоренко, Д.В. Залетаев, В.В. Стрельников. Молекулярно-генетическая диагностика опухолей головного мозга // Сборник научных работ по материалам I Международного российско-американского симпозиума «Инновационные технологии в генетике и детской эпилептологии». - 2011. - С. 72-84.

7. Алексеева Е.А. Молекулярная патология гена MGMT при опухолях головного мозга / Е.А. Алексеева // Сборник тезисов конференции молодых ученых МГНЦ РАМН.-2011.- С. 2-3.

8. Алексеева Е.А. Влияние хирургического вмешательства при лечении глиобластомы на экспрессию гена Об-метилгуанин-ДНК-метитрансферазы (MGMT) / Е.А. Алексеева, A.C. Танас, В.В. Стрельников, Д.В. Залетаев // Материалы I Междисциплинарного конгресса по заболеваниям органов головы и шеи. -2013. - С. 162.

9. Алексеева Е.А. Определение генетического статуса гена Об-метилгуанин-метилтрансферазы (MGMT) в глиобластомах / Е.А. Алексеева, A.C. Танас, В.В. Стрельников, Д.В. Залетаев // Сборник материалов Всероссийской научно-практической школы-конференции для молодых ученых РАМН по онкологии «Современная онкология: достижения и перспективы», г. Новосибирск. - 2013. - С. 5.

10. Алексеева Е.А. Влияние хирургического вмешательства на экспрессию гена 06-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) // Е.А. Алексеева, A.C. Танас // Сборник тезисов конференции молодых ученых МГНЦ РАМН. - 2013. - С. 1.

11. Алексеева Е.А. Комплексная молекулярно-генетическая характеристика хромосомного района 10q23.3-26.3 при глиобластоме / Е.А. Алексеева // Сборник тезисов конференции молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН. - 2014. - С. 4.

12. Алексеева Е.А. Анализ копийности хромосомного локуса 10q23.3-26.3 при глиобластоме / Е.А. Алексеева, A.C. Танас, Е.В. Прозоренко, A.M. Зайцев, О.Н. Кирсанова, В.В. Стрельников, Д.В. Залетаев // Материалы VII съезда Российского общества медицинских генетиков, г.Санкт-Петербург. - 2015. - С. 7.

13. Alekseeva Е. Deletions of the MGMT gene region on chromosome 10q26.3 in gliomas // E. Alekseeva, O. Babenko, V. Zemlyakova, E. Kuznetsova, A. Smolin, E. Prozorenko, D. Zaletayev, V. Strelnikov // European Journal of Human Genetics. - 2012. - V. 20.- Sup. 1 -P. 186.

14. Alekseeva E.A. Об-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) is a surgery-activated gene // E.A. Alekseeva, A.S. Tanas, E.V. Prozorenko, D.V. Zaletaev, V.V. Strelnikov // European Journal of Human Genetics. - 2013. - V. 21. - Sup. 2. - P.307.

15. Alekseeva E. New loci of loss of heterozygosity (LOH) in glioblastoma / E. Alekseeva, A. Tanas, E. Prozorenko, A. Zaytsev, V. Strelnikov, D. Zaletayev // European Journal of Human Genetics.-2014.-V. 22. - Sup. l.-P. 250.

16. Alekseeva E. Copy number characteristics of the 10q26.3 chromosome region containing the MGMT gene in glioblastoma / E. Alekseeva, A. Tanas, E. Prozorenko, A. Zaytsev, O. Kirsanova, V. Strelnikov, D. Zaletayev // European Journal of Human Genetics. - 2015. - Vol. 23. - Sup. l.-P. 445-446.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГБ - глиобластома

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КМА - количественный микросателлитный анализ

МЧ-ПЦР - метил-чувствительная ПЦР

ОДР - однородительская дисомия

п.н. — пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГ - потеря гетерозиготности

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

APS - аммония персульфат

MGMT - 06-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза

Real time ПЦР - ПЦР в режиме реального времени

ТВЕ - трис-боратный буфер: 89 мМ трис-борат, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА TEMED - тетраметилэтилендиамин

Подписано в печать 11.08.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 3560-15-КЦ Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39